KR20060129163A

KR20060129163A - 로소니아 인트라셀룰라리스 서브유닛 백신

Info

Publication number: KR20060129163A
Application number: KR1020067004981A
Authority: KR
Inventors: 폴 베르메이지
Original assignee: 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2006-12-15
Also published as: BRPI0413857A; US7662390B2; WO2005026200A2; MXPA06002850A; EP1664100B1; AU2004272246A1; US20060286118A1; CN1849334A; ES2335668T3; DE602004024423D1; JP4773962B2; DK1664100T3; CA2536989A1; JP2007527706A; ATE450545T1; WO2005026200A3; EP1664100A2

Abstract

본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 서열을 포함하는 DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산, DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질 및 백신 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA의 검출, 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 검출 및 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 테스트에 관한 것이다.

Description

로소니아 인트라셀룰라리스 서브유닛 백신{LAWSONIA INTRACELLULARIS SUBUNIT VACCINE}

본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 이 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체, 상기 핵산 서열, DNA 단편, 재조합 DNA 분자 및 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질 및 백신 제조 시의 이의 용도, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신 및 이의 제조 방법, 및 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA의 검출, 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 검출 및 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 테스트에 관한 것이다.

돼지 증식성 회장염(porcine proliferative enteropathy: PPE 또는 PE)은 현재 전세계의 돼지 산업에서 중요한 질환이 되었다. 성장 중인 가축의 15∼50%와 성장이 끝난 가축 중 최대 30%의 동물이 이 질환에 감염된다. 오늘날, 감염된 돼지 1마리 당 추가 사료 및 설비 시간 비용으로 약 US$ 5∼10 정도의 연간 경제적 손실이 발생하고 있다. PPE는 전세계적으로 상이한 임상 징후(사망, 허약하고 빈혈인 동물, 미약한 설사, 암적색 또는 선홍색 설사, 우울증, 식욕 감퇴 및 움직임 둔화, 성장 지연 및 증가된 FCR)를 보이는 만성 및 급성 병태의 군이다. 그러나 여기에는 2가지 일치되는 특성이 있다. 첫째로, 부검 시에만 볼 수 있는 병리적 변화인 소장 및 결장 점막의 비후증이다. 둘째로, 감염된 장의 장세포에서 발견되는, 세포질 내에서 기생하는 작은 만곡형 박테리아이다. 현재, 이 박테리아는 PPE의 병인체(etiological agent)로 밝혀졌으며, 로소니아 인트라셀룰라리스라 불린다.

여러 해에 걸쳐, 로소니아 인트라셀룰라리스는 원숭이, 토끼, 흰족제비, 햄스터, 여우, 말, 및 타조와 에뮤와 같은 다양한 기타 동물을 비롯하여 실질적으로 모든 동물에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 로소니아 인트라셀룰라리스는 진핵생물 장세포에만 증식하는 그람 음성의 편모형 박테리아이며, 무세포 배양에 대해서는 설명된 바가 없다. 세포에서 살아남고 증식하기 위해, 로소니아 인트라셀룰라리스는 분열하는 선와 세포(crypt cell)에 침투해야 한다. 박테리아는 세포막과 회합한 뒤, 유입 액포(entry vacuole)를 통해 빠르게 장세포로 들어간다. 그 뒤 장세포는 (3시간 내에) 빠르게 파괴되며, 박테리아는 세포질에서 생장하여 다량으로 증식한다. 박테리아가 감염된 세포의 성숙을 저해하여 유사 분열이 계속 일어나게 하고, 이로 인해 형성부전성 선와 세포가 형성되는 메커니즘은 아직 이해되지 않았다.

현재 로소니아 인트라셀룰라리스의 감염, 치료 및 이 질환의 조절에 대한 이해는, 로소니아 인트라셀룰라리스가 무세포 배지에서 배양될 수 없다는 사실로 인해 제한되어 왔다. 래트 장세포에서 로소니아 인트라셀룰라리스를 성공적으로 공배양했다는 보고가 있었지만, 로소니아 인트라셀룰라리스와 싸우기 위한 비활성화된 백신에 대한 개발을 이끌어내지는 못했다. 그러나 이러한 백신에 대한 요구는 명백하게 존재한다.

본 발명의 목적은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신을 제공하는 것에 있다.

놀랍게도, 현재 로소니아 인트라셀룰라리스는, 단독으로 또는 조합으로, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 방어 면역성을 유도할 수 있는 6개의 신규한 단백질을 생산하는 것으로 밝혀졌다.

이 신규한 단백질은 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질로 언급될 것이다. 이 신규한 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별자에서 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12로 나타나 있다. 이들 단백질을 코딩하는 유전자는 서열화되어 있으며, 이의 핵산 서열은 서열 식별자에서 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11로 나타나 있다.

다수의 상이한 핵산 서열이 한 단백질 및 동일한 단백질을 코딩할 수 있음은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 현상은 대개 아미노산을 코딩하는 각 트리플릿의 2번째 염기, 특히 3번째 염기의 워블(wobble)로서 알려져 있다. 이 현상으로 인해 동일한 단백질을 코딩하는 2개의 핵산 서열에 대한 이종성이 약 30%가 될 수 있다. 따라서, 서열 상동성이 약 70%인 2개의 핵산 서열은 한 단백질 및 동일한 단백질을 코딩할 수 있다.

따라서, 한 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 상기 핵산 서열 또는 이의 일부분은 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 이 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 1의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 95%의 상동성을 보인다. 더 바람직한 상동성 수준은 98% 또는 100%이다.

뉴클레오티드 상동성 수준은 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html에서 찾을 수 있는 하위프로그램 "BLASTN"을 선택하여 컴퓨터 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES"로 측정할 수 있다. 이 프로그램은 문헌 [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250(1999)]을 참조한다. 사용된 파라미터는 디폴트 파라미터이다: 일치도 가산점(Reward for a match): + 1. 불일치도 감산점(Penalty for a mismatch): -2. 오픈 갭(Open gap): 5. 익스텐션 갭(Extension gap): 2. 갭 x_드롭오프(Gap x_dropoff): 50.

특정 핵산 서열이 본 발명에 따른 핵산 서열인지 아닌지를 결정하기 위한 다른 접근법은, 특정 핵산 서열이 엄중한 조건 하에 서열 번호 1(또는 서열 번호 3, 5, 7, 9 또는 11, 하기 참조)에 도시된 뉴클레오티드 서열과 하이브리드하는지에 대한 문제에 관한 것이다. 핵산 서열이 엄중한 조건 하에 서열 번호 1, 또는 서열 번호 3, 5, 7, 9 및 11에도 도시된 뉴클레오티드 서열과 하이브리드하는 경우, 본 발명에 따른 핵산 서열인 것으로 간주한다.

엄중한 조건의 정의는 하기 Meinkoth 및 Wahl의 화학식에 따른다(1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138: 267-284).

Tm = [81.5℃ + 16.6(log M) + 0.41(GC(%)) - 0.61(포름아미드(%)) - 500/L] - 1℃/1% 불일치도

상기 화학식에서, M은 1가 양이온의 몰 농도이고; GC(%)는 DNA 중 구아노신 및 사이토신 뉴클레오티드의 백분율이며; L은 염기쌍에서 하이브리드의 길이이다.

엄중한 조건이란, 핵산 서열 또는 이의 단편이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나에 도시된 핵산 서열에 대해 많아야 10%의 불일치도를 보이는 경우에도, 상기 핵산 서열 또는 이의 단편이 여전히 하이브리드하고 있는 조건을 말한다.

또한, 본 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 3의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

또한, 본 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 5의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 5의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

또한, 본 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 7의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 7의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

또한, 본 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 9의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 9의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

또한, 본 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질 및 이 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 이는 서열 번호 11의 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성 수준을 보인다.

바람직하게는, 이 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열의 일부분은 서열 번호 11의 핵산 서열과 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96%의 상동성을 보인다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본 발명은 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 개시하기 때문에, 처음으로 상기 단백질을 충분한 양으로 얻을 수 있다. 이는 예컨대 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 발현 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.

따라서, 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편에 관한 것이다. 상기 DNA 단편은, 예컨대 본 발명에 따른 핵산 서열을 클로닝하는 플라스미드일 수 있다. 상기 DNA 단편은, 예컨대 후술되는 바와 같이 프라이머로 사용하기 위한 DNA의 양을 증가시키는 데 유용하다.

핵산 서열의 발현을 위해 반드시 필요한 것은, 적절한 프로모터를 핵산 서열에 기능적으로 연결시켜 이 핵산 서열이 프로모터의 조절 하에 있는 것이다. 이 프로모터는 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되는 세포에서 유전자 번역을 유도할 수 있는 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 바이러스 프로모터에 이르는 범위에서 선택되는다는 사실은 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 본 구체예의 더 바람직한 형태는 기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 있는, 본 발명에 따른 DNA 단편 또는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 이는, 예컨대, 표준 분자 생물학 기법[Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6)]을 사용하여 얻을 수 있다. 기능적으로 연결된 프로모터는 이들이 연결되어 있는 핵산 서열의 번역을 조절할 수 있는 프로모터이다. 이러한 프로모터는 로소니아 프로모터, 예컨대 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 또는 31.4 kD 유전자를 코딩하는 유전자의 생체내 발현과 관련된 프로모터일 수 있으며, 단, 이 프로모터는 발현에 사용되는 세포에서 기능성이다. 또한, 상기 프로모터는 이종성 프로모터일 수 있다. 숙주 세포가 박테리아인 경우, 사용될 수 있는 적절한 발현 조절 서열은 Trp 프로모터 및 오퍼레이터(Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); lac 프로모터 및 오퍼레이터(Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); 외막 단백질 프로모터(Nakamura, K. and Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); 박테리오파지 람다 프로모터 및 오퍼레이터(Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); α-아밀라제(B. subtilis) 프로모터 및 오퍼레이터, 종결 서열, 및 선별된 숙주 세포와 융화성이 있는 기타 발현 증강 및 조절 서열을 포함한다.

숙주 세포가 효모인 경우, 유용한 발현 조절 서열은, 예컨대, α- 교배 인자를 포함한다. 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스의 p10 프로모터 또는 폴리헤드린을 사용할 수 있다(Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). 숙주 세포가 포유류 세포인 경우, 예시적인 유용한 발현 조절 서열은 SV-40 프로모터(Berman, P. W. et al., Science, 222, 524-527, 1983) 또는 메탈로티오네인 프로모터(Brinster, R. L., Nature, 296, 39-42, 1982) 또는 열 충격 프로모터(Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985)를 포함한다.

박테리아, 효모, 진균류, 곤충 및 포유류 세포 발현 시스템은 매우 흔하게 사용되는 시스템이다. 이 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대 Clontech Laboratories사(미국 캘리포니아주 94303-4607 팔로 알토 파비안 웨이 4030)를 통해 일반적으로 시판되고 있다. 상기 발현 시스템 다음으로는 기생충계 발현 시스템이 매우 매력적인 발현 시스템이다. 이 시스템은, 예컨대 프랑스 특허 출원 번호 제2,714,074호, 및 US NTIS 공개 번호 US 08/043109(Hoffman, S. and Rogers, W.: Public. Date 1 December 1993)에 기술되어 있다.

본 발명의 본 구체예의 좀 더 바람직한 형태는, 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 본 발명에 따른 DNA 단편 또는 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 생 재조합 운반체(LRC)에 관한 것이다. 상기 운반체는, 예컨대, 박테리아 및 바이러스이다. 이들 LRC는 추가 유전 정보, 이 경우는 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 클로닝하는 미생물 또는 바이러스이다. 상기 LRC로 감염된 동물은 운반체의 면역원에 대해서 뿐만 아니라, 유전자 코드가 LRC, 예컨대 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질로 추가 클로닝되기 위한 단백질(들)의 면역원성 부분에 대한 면역원성 반응을 생성할 것이다. 박테리아 LRC의 예로서, 당업자에게 공지되어 있는 감독된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용할 수 있다.

생 재조합 운반체 기생충은 문헌 [Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121-1130(1998))]에 기재되어 있다.

또한, LRC 바이러스는 핵산 서열을 표적 세포로 전달하는 방식으로 사용될 수 있다. 생 재조합 운반체 바이러스는 벡터 바이러스라고도 불린다. 종종 벡터로 사용되는 바이러스는 백시니아 바이러스(Panicali et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927(1982)), 헤르페스바이러스(E.P.A. 0473210 A2) 및 레트로바이러스(Valerio, D. et al; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. and Pluznik, D.H.(Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag, New York: pp. 92-99(1989))이다.

당업자에게 잘 알려져 있는 생체내 상동 재조합 기법을 사용하여, 숙주 동물에서 본 발명에 따른 삽입된 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 소정의 박테리아, 기생충 또는 바이러스의 게놈으로 재조합 핵산 서열을 도입할 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편, 또는 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 이 형태는 또한 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 단편을 포함하는 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 종과 함께, pBR322와 같은 박테리아계 플라스미드, 또는 pGEX와 같은 박테리아 발현 벡터, 또는 박테리오 파지일 수 있다. 또한 숙주 세포는 진핵 생물의 세포일 수 있는데, 예를 들어, 효모-특이적 벡터 분자와 효모-세포, 또는 벡터 또는 재조합 배큘로바이러스와, 곤충 세포와 같은 고등 진핵 생물의 세포(Luckow et al; Bio-technology 6: 47-55(1988)), 예컨대, Ti-플라스미드계 벡터 또는 식물 바이러스 벡터와 식물 세포(Barton, K.A. et al; Cell 32: 1033(1983)), 또한 적절한 벡터 또는 재조합 바이러스와, Hela 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 Crandell Feline 신장 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따른 신규한 단백질 및 이의 면역원성 단편에 관한 것이다.

면역원성 단편의 개념은 하기에 정의되어 있다.

본 구체예의 한 형태는 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태에서, 본 구체예는 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

단백질 상동성 수준은 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html에서 찾을 수 있는 하위프로그램 "BLASTP"로 선택하여 컴퓨터 프로그램 "BLAST 2 SEQUENCES"로 측정할 수 있다. 이 프로그램은 문헌 [Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250(1999)]을 참조한다. 사용된 매트릭스: "blosum62". 사용된 파라미터는 디폴트 파라미터이다: 오픈 갭: 11. 익스텐션 갭: 1. 갭 x_드롭오프: 50.

본 구체예의 다른 형태는 서열 번호 4에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태는 서열 번호 4에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본 구체예의 다른 형태는 서열 번호 6에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태는 서열 번호 6에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본 구체예의 다른 형태는 서열 번호 8에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태는 서열 번호 8에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본 구체예의 다른 형태는 서열 번호 10에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태는 서열 번호 10에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본 구체예의 다른 형태는 서열 번호 12에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 가지는 로소니아 인트라세룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다.

바람직한 형태는 서열 번호 12에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 92%, 바람직하게는 94%, 더 바람직하게는 96% 상동성의 서열 상동성을 보이는 상기 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 단편에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 98% 또는 100%의 상동성 수준을 보인다.

본원에 포함되는 특정 단백질에 대해, 자연 변이가 개별 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 사이에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 이들 변이는 전체 서열에서 아미노산 차이(들)에 의해, 또는 상기 서열에서 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 부가에 의해 입증될 수 있다. 실질적으로 생물학적 활성 및 면역학적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환은 Neurath 등의 문헌 ["The Proteins" Academic Press New York(1979)]에 기재되어 있다. 그 중에서도 특히, 관련된 아미노산 간의 아미노산 치환 또는 진화 중에 흔히 발생하는 치환은 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다(문헌 [Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3] 참조). 다른 아미노산 치환은 Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val 및 Ala/Glu를 포함한다. 이 정보에 기초하여, Lipman 및 Pearson은 상동성 단백질 간의 기능적 유사성을 결정하는, 빠르고 감수성이 있는 단백질 비교법을 개발하였다(Science, 227, 1435-1441, 1985). 생성된 단백질이 이의 면역 반응성을 보유하고 있는 한, 본 발명의 예시적인 구체예의 상기 아미노산 치환 뿐 아니라 결실 및/또는 삽입을 비롯한 변이는 본 발명의 범위에 속한다. 이는 본 발명에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질이 상이한 장 분리체(field isolate)로부터 분리될 경우의 상동성 수준은 약 90%이지만, 여전히 동일한 면역 특성이 있는 동일한 단백질을 나타내는 지에 대한 이유를 설명하는 것이다. 로소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염에 대해, 또는 적어도 임상적인 감염 징후에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 제공하는, 본 발명에 따른 특정 단백질의 아미노산 서열 중의 이러한 변이는 "실질적으로 면역원성에 영향을 주지 않는 것"으로 간주된다.

그러나, 예컨대, 단백질을 백신 접종의 목적 또는 항체를 배양할 목적으로 사용할 경우, 전체 단백질을 사용할 필요는 없다. 또한, 상기한 바와 같거나 또는 운반체(예, KLH)에 커플링된, 소위 면역원성 단편이라 불리는 단백질에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질의 단편을 사용할 수 있다. "면역원성 단편"은 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 보유하고 있는, 즉, B 세포 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 전장 단백질의 단편이라고 이해된다. 이 경우, 다양한 기법을 사용하여 항원 단편(결정소)을 코딩하는 DNA 단편을 쉽게 동정할 수 있다. 소위 PEPSCAN 방법이라 불리는, Geysen 등에 의해 설명되는 방법(특허 출원 WO 84/03564, 특허 출원 WO 86/06487, US 특허 NR. 4,833,092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002(1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274(1987))이 수행하기 쉬운 방법으로서, 이는 에피토프(면역적으로 중요한 단백질의 영역)를 검출하기 위한 빠르고 잘 확립된 방법이다. 이 방법은 전세계적으로 사용되고 있으며, 당업자에게도 잘 알려져 있다. 특히 이 (실험) 방법은 B 세포 에피토프를 검출하는 데 적합하다. 또한, 임의의 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 경우, 컴퓨터 알고리즘은 현재 공지되어 있는 에피토프와의 서열적 및/또는 구조적 일치성에 기초하여 특이적인 단백질 단편을 면역적으로 중요한 에피토프로서 지정할 수 있다.

이들 영역의 결정은 Hopp 및 Woods(Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828(1981))에 따른 친수성 기준, 및 Chou 및 Fasman(Advances in Enzymology 47: 45-148(1987) 및 US 특허 4,554,101)에 따른 2차 구조 양상을 조합한 것에 기초한다. 이와 유사하게, T 세포 에피토프는 Berzofsky의 양친매성 기준(Science 235, 1059-1062(1987) 및 US 특허 출원 NTIS US 07/005,885)의 도움으로 컴퓨터에 의한 서열로부터 예측할 수 있다. 요약된 개요는 문헌 [Shan Lu on common principles: Tibtech 9: 238-242(1991), Good et al on Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062(1987), Lu for a review; Vaccine 10: 3-7(1992), Berzowsky for HIV-epitopes; The FASEB Journal 5: 2412-2418(1991)]에서 찾을 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예의 한 형태는, 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 하나 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 함께 약학적 허용 담체를 포함하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 돼지를 보호할 수 있는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 백신에 사용하기 위한 본 발명에 따른 단백질에 관한 것이다.

다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 단백질의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백신의 제조 방법 중 하나는 감염된 장벽으로부터의 점막 스크랩핑(mucosal scraping)을 통해 얻은 박테리아 유래의, 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 생화학적으로 정제하는 것이다. 그러나, 이 방법은 백신 제조에 많은 시간이 걸린다.

따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 유전자의 발현 생성물을 백신에 사용하는 것이 더 편리하다. 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 본 발명에 제시되어 있다.

이들 유전자의 발현 생성물에 기초한 상기 백신은 본 발명에 따른 하나 이상의 단백질 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편과 후술되는 약학적 허용 담체를 혼합하여 쉽게 제조할 수 있다.

또는, 본 발명에 따른 백신은 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편을 발현할 수 있는, 상기한 생 재조합 운반체를 포함할 수 있다. 예컨대 장 상피 또는 예컨대 호흡 상피에 감염되는 살모넬라 운반체 또는 바이러스 운반체에 기초한 상기 백신은 서브유닛 백신에 대해 로소니아 인트라셀룰라리스의 자연 감염 경로를 더 잘 모방한다는 장점을 가진다. 또한, 이는 자가 증식한다는 점이 장점인데, 이는 소량의 재조합 운반체만이 면역화에 필요하기 때문이다.

상기한 백신은 모두 백신 접종을 활성화시키는 데, 즉, 숙주의 면역 시스템을 본 발명에 따른 하나 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단백질에 의해 유발시켜, 이들 단백질에 대한 항체를 만드는 데 기여한다.

또는, 상기 항체를 토끼 등에서 생산할 수 있거나, 또는 후술되는 항체-생성 세포주로부터 수득할 수 있다. 그 뒤, 상기 항체는 숙주 세포에 투여할 수 있다. 이 백신 접종 방법, 즉 수동 백신 접종 방법은 동물이 이미 감염되어 자연 면역 반응을 유발할 수 있는 시간이 없는 경우에 선택할 수 있는 백신 접종 방법이다. 또한, 이는 면역 반응이 제대로 일어나지 않는 동물을 백신 접종하기에 바람직한 방법이다. 이 경우, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대해 투여되는 항체는 박테리아에 직접 결합할 수 있다. 이는 로소니아 인트라셀룰라리스의 성장을 감소시키거나 정지시킨다는 장점을 가진다.

따라서, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 6개의 로소니아 인트라셀룰라리스 중 어느 하나에 대한 항체를 포함하는 백신에 관한 것이다.

또한 백신은 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는, 상기한 숙주 세포에 기초할 수 있다.

백신 접종의 대안 방법 및 효율적인 방법은 적절한 항원을 코딩하는 DNA로 직접 백신 접종하는 것이다. 단백질을 코딩하는 DNA로 직접 백신 접종하는 것은 다수의 상이한 단백질에 대해 성공적이어 왔다(예, Donnelly 등의 문헌 [The Immunologist 2: 20-26(1993)]에 리뷰된 바와 같음).

이 백신 접종 방법은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 돼지를 백신 접종시킬 경우에 매우 매력적인 방법이다.

따라서, 본 발명의 본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 본 발명에 따른 이의 면역원성 단편을 포함하는 백신, 및 상기 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 구체예의 다른 형태는 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다.

DNA 백신은, 예컨대, 무침 주사기를 사용하여 피내를 통해 쉽게 투여할 수 있다. 이러한 투여 방법으로 백신 접종할 동물의 세포에 DNA를 직접 전달한다. 1∼100 ㎍ 범위의 DNA 양을 투여할 경우, 매우 좋은 결과를 얻을 수 있다.

추가 구체예에서, 본 발명에 따른 백신은 기타 돼지 병원성 유기체 및 바이러스 유래의 하나 이상의 항원, 또는 상기 항원을 코딩하는 유전 정보를 추가로 포함한다.

상기 유기체 및 바이러스는 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Porcine influenza virus), 돼지 파르보 바이러스(Porcine parvo virus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastro-enteritis virus), 로타바이러스(Rotavirus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 미코플라즈마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 모든 백신은 약학적 허용 담체를 포함한다. 약학적 허용 담체는, 예컨대, 멸균수 또는 멸균 생리식염수일 수 있다. 더 복잡한 형태로 담체는, 예컨대, 완충액일 수 있다.

백신의 제조 방법은 본 발명에 따른 단백질, 또는 이의 면역원성 단편 및 약학적 허용 담체를 혼합하는 단계를 포함한다.

또한 바람직하게 본 발명에 따른 백신은 면역 보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 일반적으로 면역 보조제는 비특이적인 방식으로 숙주의 면역 반응을 증가시키는 성분을 포함한다. 다수의 상이한 면역 보조제가 당업자에게 공지되어 있다. 예시적인 면역 보조제로는 프로인트 완전 면역 보조제, 프로인트 불완전 면역 보조제, 비타민 E, 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀디펩티드, Quill A^(R), 광유(예, Bayol^(R) 또는 Markol^(R)), 식물성 유지, 및 Carbopol^(R)(단독 중합체) 또는 Diluvac^(R) Forte가 있다. 또한 백신은 소위 "비히클"을 포함할 수도 있다. 비히클은 폴리펩티드에 공유 결합된 것이 아니라 부착되어 있는 화합물이다. 종종 사용되는 비히클 화합물은, 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 실리카, 카올린 및 벤토나이트이다.

항원이 부분적으로 포매되어 있는 이러한 비히클의 특수 형태는 소위 ISCOM이라 불린다(EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).

또한, 백신은 하나 이상의 적합한 표면-활성 화합물 또는 유화제(예, Span 또는 Tween)를 포함할 수 있다.

종종 백신은, 예컨대, 분해되기 쉬운 폴리펩티드가 분해되는 것을 막고, 백신의 저장 수명을 증가시키거나, 또는 동결 건조 효율을 개선하기 위해 안정화제와 혼합시킨다. 유용한 안정화제로는 SPGA(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509(1950)), 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 수크로스, 덱스트란 또는 글루코스), 단백질(예, 알부민 또는 카세인) 또는 이의 분해 산물, 및 완충액(예, 알칼리 금속 인산염)이 있다.

또한, 백신은 생리적 허용 희석제에 현탁시킬 수 있다.

면역 보조화시키고, 비히클 화합물 또는 희석제를 첨가하며, 폴리펩티드를 유화시키거나 안정화시키는 다른 방법들도 본 발명에 포함된다는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명에 따른 백신은 1∼100 ㎍ 범위의 양으로 투여하는 것이 매우 적합하지만, 원칙상으로 더 적은 양을 사용할 수도 있다. 면역학적으로 매우 적합하다 하더라도, 100 ㎍을 초과하는 투여량은 상업적 이유로 매력적이지 않을 것이다.

감독된 생 재조합 운반체(예, 상술한 LRC-바이러스 및 박테리아)에 기초한 백신은 훨씬 더 적은 양으로 투여될 수 있는데, 이는 상기 백신이 감염 도중 스스로 증식하기 때문이다. 따라서, 각각의 박테리아 및 바이러스에 대해 매우 적합한 양은 10³∼10⁹ CFU/PFU 범위일 것이다.

다양한 투여 방법을 적용할 수 있다. 경구 투여가 매우 매력적인 투여 방법인데, 이는 상기한 감염이 소화관 감염이기 때문이다. 바람직한 경구 투여 방법은, 당업자에게 공지되어 있으며 흔히 사용되는 방법인, 캡슐에 백신을 패키징하는 것으로서, 이는 산도가 높은 위를 통과한 후에만 분해된다. 또한, 위의 pH를 일시적으로 높이기 위해, 당업자에게 공지되어 있는 화합물과 백신을 혼합할 수 있다.

전신 투여, 예컨대, 백신의 근내 투여도 적합하다. 이 경로를 따를 경우, 전신 투여에 대해 당업자에게 알려져 있는 표준 절차가 매우 적절하다.

질환에 대한 보호라는 관점에서, 로소니아 인트라셀룰라리스의 감염을 빠르고 정확하게 진단하는 것이 중요하다. 따라서 본 발명에 따른 다른 목적은 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 검출하는 데 적합한 진단 도구(diagnostic tool)를 제공하는 것에 있다.

로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하기 위한 진단 테스트는, 예컨대, 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질을 코딩하는 유전자의 코딩 서열에 기초하는 특이적인 프로브 또는 PCR 프라이머와, 테스트할 동물로부터 분리한 박테리아 DNA를 반응시키는 것에 기초를 둔다. 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA가 동물 중에 존재하는 경우, 이는 예컨대 특이적 PCR 프라이머에 특이적으로 결합한 뒤, PCR 반응에서 증폭될 것이다. 그 뒤 PCR 반응 생성물은 DNA 겔 전기영동으로 쉽게 검출할 수 있다.

DNA는 테스트할 동물의 소화관을 면봉을 이용하여 채취했을 때, 이 면봉에 존재하는 미생물로부터 쉽게 분리할 수 있다. 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA와의 선택적인 PCR 반응을 위한 프라이머의 길이를 측정하는 방법은 표준 PCR 교본에 나타나 있다. 적어도 12 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프라이머를 흔히 사용하지만, 15 이상, 더 바람직하게는 18 뉴클레오티드의 프라이머가 좀 더 선택성이 있다. 특히 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30 뉴클레오티드 길이를 가지는 프라이머를 일반적으로 사용할 수 있다. PCR 기법은 문헌 [Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5(1995)]에 광범위하게 기재되어 있다.

따라서 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 적어도 12, 바람직하게는 15, 더 바람직하게는 18, 좀 더 바람직하게는 (선호도순에 따라) 20, 22, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드 길이를 가지는 상기 핵산 서열의 일부분도 본 발명의 한 부분으로서, 상기 핵산 서열 또는 이의 일부분은 서열 번호 1 또는 3에 도시되어 있는 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성을 보인다. 상기 핵산 서열은 PCR 반응에서 프라이머로 사용하여, 이들이 코딩하는 DNA의 양을 증가시킬 수 있다. 이로 인해, 예컨대, 상기한 바와 같이 조직 내에서 로소니아를 검출하기 위한 진단 도구로서 사용하기 위한 특이적 뉴클레오티드 서열을 빠르게 증폭시킬 수 있다.

다른 DNA계 테스트는 면봉으로부터 채취한 박테리아 물질을 성장시킨 뒤, 방사성 또는 색-표지된 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질-특이적 DNA-단편과의 종래 하이브리드화에 따른 종래의 DNA 정제 방법에 기초한다. 상기 PCR 반응 및 하이브리드화 반응은 모두 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌 [Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6)]에 기재되어 있다.

따라서, 본 발명의 한 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA를 검출하기 위한 진단 테스트에 관한 것이다. 이러한 테스트는 본 발명에 따른 핵산 서열, 또는 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질을 코딩하는 DNA에 대해 특이적인 이의 단편을 포함한다. 상기 DNA에 대해 특이적인 단편은, 유사한 조건 하에, 다른 박테리아의 DNA보다 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA에 더 잘 결합하는 단편으로 이해되는데, 이는 로소니아 인트라셀룰라리스 DNA, 예컨대 상술한 적어도 12 뉴클레오티드의 프라이머와의 상동성이 더 크기 때문이다.

혈청 내 로소니아 인트라셀룰라리스 항체를 검출하기 위한 진단 테스트는, 예컨대, 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 ELISA-플레이트의 웰 벽에 코팅시킨 간단한 표준 샌드위치-ELISA-테스트일 수 있다. 상기 항체의 검출 방법은, 예컨대, 테스트할 포유동물로부터 얻은 혈청과 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 항온배양한 뒤, 예컨대, 적절한 포유동물 항체에 대해 표지된 항체를 항온배양하는 것이다다. 항온배양 후, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 존재 또는 부재가 색 반응으로 드러날 수 있다. 진단 테스트 시스템의 다른 예로는, 예컨대, 테스트할 포유동물의 혈청과, 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하는 웨스턴 블롯을 항온배양한 뒤, 이 블롯을 분석하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위한 진단 테스트에 관한 것이다. 이러한 테스트는 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

또한, 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 혈청에서 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편과 혈청을 항온배양하는 것을 포함한다.

로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 특이적인 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질의 항원성 물질의 검출에 기초하며, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 검출하는 데 적합한 진단 테스트는, 예컨대, 표준 ELISA 테스트일 수도 있다. 상기 테스트의 한 예로서, ELISA 플레이트의 웰 벽을 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질에 대한 항체로 코팅할 수 있다. 테스트할 물질과 항온배양한 뒤, 표지된 항-로소니아 인트라셀룰라리스 항체를 웰에 첨가한다. 그 뒤, 로소니아 인트라셀룰라리스로부터의 항원성 물질의 존재는 색 반응으로 드러난다.

따라서, 본 발명의 다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스의 항원성 물질을 검출하기 위한 진단 테스트에 관한 것이다. 이 테스트는 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함한다.

상술한 바와 같이 발현된 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 사용하여, 폴리클로날, 모노클로날 특이적 또는 모노클로날(또는 이의 유도체)일 수 있는 항체를 생산할 수 있다. 폴리클로날 항체가 바람직한 경우, 폴리클로날 혈청을 생산하고 처리하기 위한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예, 문헌 [Mayer and Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987] 참조).

본 발명에 따른 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따른 이의 변이체 또는 단편에 대해 반응성이 있는 모노클로날 항체는 당업자에게 공지되어 있는 기법으로 동종 번식된 마우스에 면역성을 부여하여 제조할 수 있다(Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).

본 발명에 따른 항체를 대량 생산하기 위한 방법 역시 당업자에게 알려져 있다. 이러한 방법은 파지 디스플레이용 필라멘트형 파지에서 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 유전 정보(의 단편)의 클로닝에 의존적이다. 이러한 기법은 "http://aximt1.imt.unimarburg.de/~rek/aepphaze.html."에서 "필라멘트성 파지 디스플레이"라는 제목 하의 "항체 공학 페이지"에 기재되어 있으며, 문헌 [Trends Biotechn. 12: 262-267(1994)]에서 Cortese, R. 등에 의한 리뷰 논문, 문헌 [Trends Biotechn. 12: 173-183(1994)]에서 Clackson, T. 및 Wells, J.A.에 의한 리뷰 논문, 문헌 [J. Biol. Chem. 267: 16007-16010(1992)]에서 Marks, J.D. 등에 의한 리뷰 논문, 문헌 [Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455(1994)]에서 Winter, G. 등에 의한 리뷰 논문, 및 문헌 [Biotechn. Adv. 12: 539-555(1994)]에서 Little, M. 등에 의한 리뷰 논문에 기재되어 있다. 그 뒤 낙타과(camelid) 중쇄 항체를 발현하는 낙타과 발현 라이브러리를 스크리닝하는 데 파지를 사용한다(문헌 [Muyldermans, S. and Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140(1999)] 및 [Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters 414: 512-526(1997)]). 소정의 항체를 발현하는 라이브러리로부터의 세포는 복제한 뒤, 항체를 대량으로 발현하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스로부터의 항원성 물질을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명에 따른 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD 및 31.4 kD 단백질 또는 이의 항원성 단편에 대한 항체와 조직의 체액, 혈청을 항온배양하는 것을 포함한다.

마지막으로, 본 발명의 구체예는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 적어도 20, 바람직하게는 (선호도순에 따라) 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드의 길이를 가지는 상기 핵산 서열의 일부분에 관한 것으로서, 상기 핵산 서열 또는 이의 일부분은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 도시되어 있는 핵산 서열과 적어도 90%의 상동성을 보인다. 상기 핵산 서열을 PCR 반응에서 프라이머로 사용하여, 이들이 코딩하는 DNA의 양을 증가시킬 수 있다. 이로 인해, 예컨대, 상술한 바와 같이 조직 내에서 로소니아를 검출하기 위한 진단 도구로서 사용하기 위한 특이적인 뉴클레오티드 서열을 빠르게 증폭시킬 수 있다.

실시예 1

감염된 돼지 회장으로부터 로소니아 인트라셀룰라리스의 분리

조직 병리학 및 항산성(acid-fast)의 Ziehl-Neelsen 염색법으로 확인되는 로소니아 인트라셀룰라리스 감염성 회장은 PE로 죽은 돼지로부터 수거하여, -80℃에서 저장하였다. 로소니아 인트라셀룰라리스를 해동시킨 뒤, 감염된 소장벽으로부터 얻은 점막 스크래핑에서 박테리아를 분리하였다. 회장 스크래핑은 옴니믹서(omnimixer)에서 PBS로 반복적으로 균질화시켜, Lawson 등에 의한 문헌 [Vet. Microbiol. 10: 303-323(1985)]에 기재된 바와 같이 세포내 박테리아를 방출시켰다. 세포 잔해를 제거하기 위해 저속 원심 분리를 한 뒤 얻은 상청액은 5.0 ㎛, 3.0 ㎛, 1.2 ㎛ 및 0.8 ㎛ 여과기(Millipore)를 통해 여과시켰다. 그 뒤, 여과액은 30분간 8,000 g에서 원심분리하여, 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아의 소형 펠릿을 얻었다. 이들 박테리아는 Percoll 구배를 사용하여 추가 정제하였다. 정제된 박테리아는 PCR로 평가하여 확인하는 반면(Jones et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2611-2615(1993)), 존재하는 임의의 오염된 박테리아 또는 장 잔해물을 확인하기 위해서는 위상차 현미경으로 분리된 박테리아의 순도(> 95%)를 평가하였다.

박테리아 균주 및 플라스미드

벡터 pLysSrare 및 플라스미드 pET22b를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) 숙주 균주 BL21star(DE3)는 Novagen사(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 구입하였다. pET-HIS1(1)은 Schaller 등의 문헌 [Microbiology 145: 2105-2116(1999)]에 기재된 바와 같이 구성하였다. 이. 콜라이 균주 TOP1OF'는 Invitrogen사(네덜란드 그로닝겐)로부터 구입하였다. 30% 글리세롤을 함유하는 모든 박테리아 균주의 저장물(stock)은 -70℃에서 저장하였다.

로소니아 인트라셀룰라리스 세포는 상기한 바와 같이 감염된 회장 물질로부터 분리하였다.

배양 매질, 완충액 및 항생제

Luria Bertani(LB) 배양액은 표준 절차에 따라 제조하였다. LB 플레이트는 표준 절차에 따라 전자레인지로 LB 매질 + 1.5% 아가를 용해시켜 제조하였다. 이 용액을 45℃로 냉각시킨 뒤 플레이트에 붓고, 필요하다면, 암피실린(네덜란드, 라암스동크스비에르, ACS-Dophar)을 첨가하였다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)는 Biosynth Ag사(스위스, 스타아드)로부터 구입하였다.

PCR 증폭

PCR 증폭은 Geneamp 9700 PCR 시스템(미국 캘리포니아주 Applied Biosystems 사)을 사용하여 수행하였다. PCR은 Expand High Fidelity PCR 시스템(독일 만하임 Roche Diagnostics GmbH사)을 사용하여 수행하였다. PCR 혼합물에는 Expand High Fidelity 효소 믹스 52 U/㎖, MgCl₂ 2.5 mM과 Expand HF 완충액, dNTP 16 mM(미국 위스콘신주 Promega사), 프라이머 20 pmole, 및 주형으로서의 로소니아 인트라셀룰라리스 염색체 DNA 15 ng이 포함되어 있다. DNA의 증폭을 위해 사용된 모든 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.

DNA 분리

고도로 정제된 로소니아 염색체 DNA를 얻기 위해, Biorad사의 염색체 DNA 분리 키트(네덜란드 베넨달 Biorad사)를 제조사의 사용 설명서에 따라 사용하여 DNA를 제조하였다.

DNA 서열화

DNA는 ABI310 자동화 서열 결정기(미국 캘리포니아주 Perkin Elmer사)로 서열화하였다. 서열 혼합물은 PCR 생성물 100 ng, Terminator Ready Reaction Mix(미국 캘리포니아주 Perkin Elmer사) 2 ㎕, 프라이머 2.4 pmole, 완충액(Tris-HCl 200 mM, pH 8.5; MgCl₂ 5 mM) 6 ㎕ 및 주사용 증류수(aqua dest) 최대 20 ㎕를 포함하고 있다. 이 혼합물은 Geneamp 9700 상에서 순환시켰다. 이 프로그램은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 2분으로 이루어진 25회 사이클로 구성되어 있다. 사이클 서열 생성물은 제조사의 사용 설명서에 따라 Dye-Ex 컬럼(미국 캘리포니아주 Qiagen사)으로 정제한 뒤, ABI310 자동화 서열 결정기를 작동시켰다. 서열화 결과 는 ABI310 Collection Software 버전 1.0.4(미국 캘리포니아주 Perkin Elmer사)를 사용하여 수거하고, Sequence Analysis 버전 3.1(미국 캘리포니아주 Perkin Elmer사)로 분석하였다. 서열은 Sequence Navigator 버전 1.0.1(미국 캘리포니아주 Perkin Elmer사)을 사용하여 정렬시켰다. 서열 분석은 Sequencer 4.1.4(미국 캘리포니아주 GeneCodes Ann Arbor사)를 사용하여 수행하였다.

결찰 및 형질변환

결찰은 밤새 16℃에서 결찰 효소(미국 Gibco BRL Life Technologies사) 1 단위가 있는 1 x 결찰 완충액 중에서 수행하였다. 결찰 반응액 1 ㎕로 이. 콜라이 반응능 세포(competent cell)를 열 충격으로 형질변환시켰다. BL21star(DE3) 이. 콜라이 반응능 세포 및 TOP1OF' 이. 콜라이 반응능 세포는 Maniatis/Sambrook의 방법에 의해 완충액 TFB1(KOAc 30 mM, RbCl 1OO mM, CaCl₂ 1O mM, MnCl₂ 50 mM, 15% 글리세롤) 및 TFB2(RbCl 10 mM, CaCl₂ 75 mM, MES 10 mM, 15% 글리세롤)를 사용하여 항체 반응 능력이 있도록 만들었다. 37℃에서 MgS0₄ 10 mM 및 글루코스 20 mM이 보충된 SOC-배지에서 수거한지 1시간 후, 적절한 항생제가 있는 LB 플레이트에 세포를 플레이팅하였다.

10 × HIS 융합 단백질의 발현

pLysSrare 및 발현 벡터를 포함하는 이. 콜라이 균주 BL21star(DE3)는 암피실린이 있는 LB 5 ㎖ 중에서 37℃, 200 rpm에서 밤새 성장시켰다. 이. 콜라이 균주를 밤새 성장시킨 배양액은 암피실린이 있는 LB 50 ㎖ 중에서 1:100으로 희석시켰 다. 이 배양액은 NovaspecII 분광광도계(네덜란드 웨르덴 Pharmacia사)로 측정한 OD₆₀₀이 0.5에 다다를 때까지 동일한 조건 하에서 성장시켰다. 이 지점(t = 0)에서, 배양액을 최종 농도 1 mM로 IPTG로 유도한 뒤, 3시간(t = 3) 동안 계속 성장시켰다. 분석을 위해 샘플 100 ㎕를 취하였다. pLysSrare를 포함하는 이. 콜라이 균주 BL21star(DE3)는 동일한 조건 하에서 성장시키고 유도하고, 샘플은 음성 대조군으로서 취하였다. 이 샘플은 SDS 페이지로 분석한 뒤, 후술되는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 잔여 배양액은 5,000 rpm에서 원심분리하고, 추가로 사용할 때까지 펠릿은 -20℃에서 저장하였다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯

NuPAGE 전기영동 시스템(미국 샌디에고주 Novex사)으로부터의 4∼12% Bis-Tris 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 분리하기 전, β-메르캅토 에탄올의 존재 하에 샘플을 샘플 완충액(샘플:완충액 = 2:1)과 함께 5분간 끓였다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하거나, 또는 표준 반건조 웨스턴 블롯 절차에 따라 Immobulon-P-막(미국 베드포드 Millipore사) 상에 블로팅하였다.

n-GNE(물:오일 = 45:55)에서 닭 항-로소니아 폴리클로날 혈청을 전체 세포 제조물에 대해 생장시켰다. 혈청 E2-839는 통상적으로 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대한 사후 상해 및 전개된 임상 징후를 보이는 돼지로부터 수득하였다. 혈청은 벡터 pLysSrare를 포함하는 BL21star(DE3)로부터의 등부피 미정질 세포 추출물을 사용하여 4℃에서 4시간 동안 사전 흡착시켰다.

결과

T7계 발현 벡터에서 로소니아 유전자의 클로닝

로소니아 유전자는 표 1에 열거되어 있는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 수득한 PCR 생성물은 제한 효소 NcoI 및 BamHI을 사용하여 침지시켰다. 그 뒤 침지된 PCR 생성물은 표 2에 나타나 있는 동일한 2개의 제한 효소로 절단시킨 pET22b 또는 pET-HIS1에 결찰시켰다. 결찰 혼합물은 이. 콜라이 TOP10F로 형질변환시키고, 37℃에서 밤새 항온배양하였다. 추정되는 형질변환체는 콜로니 PCR을 사용하여 적절한 플라스미드에 대해 확인하였다. 이로써 6개의 상이한 발현 플라스미드가 생성되었다. 이들 플라스미드는 뉴클레오티드 서열 분석으로 확인하였으며, 서열은 클로닝 방법에 기초하여 예상한 바와 같았다.

에스케리치아 콜라이에서 T7 프로모터로부터 얻은 로소니아 유전자의 발현

표 2에 열거되어 있는 모든 플라스미드를 재조합 단백질 생성에 대해 테스트하였다. 플라스미드는 BL21star(DE3) pLysSrare로 형질변환시킨 뒤, 유도하였다. 유도 배양물은 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 CBB 염색법으로 분석하였다(도 1). 모든 6개 유전자는 이. 콜라이 BL21star(DE3) pLysSrare에서 충분하게 발현되었다. 발현 수준은 150 ㎍/㎖에 이르렀다.

웨스턴 블롯에 의한 발현 생성물의 분석

발현 생성물은 전체 로소니아 세포로 백신 접종한 닭의 혈청, 및 로소니아 인트라셀룰라리스에 대해 통상적인 임상 징후 및 사후 상해를 나타내는 돼지로부터의 혈청을 사용하여, 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 2). 재조합 로소니아 단백질은 닭 및 돼지 혈청에 의해 정확하게 동정되었다.

도 1. 에스케리치아 콜라이 BL21STAR/pLysSRARE에서 로소니아 인트라셀룰라리스 유전자 과발현에 대한 NuPAGE에 의한 분석.

레인 1, 분자량 마커; 레인 2, pET76.7 T=0; 레인 3, pET76.7 T=3; 레인 4, pET56.8 T=0; 레인 5, pET56.8 T=3; 레인 6, pET24.8 T=0; 레인 7, pET24.8 T=3; 레인 8, pET28.8 T=0; 레인 9, pET28.8 T=3; 레인 10, pET31.0 T=0; 레인 11, pET31.0 T=3; 레인 12, pET31.4 T=0; 레인 13, pET31.4 T=3; 레인 14, T=3 발현 벡터 없음.

화살표는 발현 생성물의 위치를 나타낸다.

도 2. 에스케리치아 콜라이 BL21STAR/pLysSRARE에서 로소니아 인트라셀룰라리스 유전자 발현 생성물에 대한 웨스턴 블롯.

레인 1, pET31.4; 레인 2, pET28.8; 레인 3, pET31.0; 레인 4, pET24.8; 레인 5, pET 76.7; 레인 6, pET56.8; 레인 7, 발현 벡터 없음.

화살표는 발현 생성물의 위치를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> AKZO Nobel N.V. <120> Lawsonia intracellularis subunit vaccine <130> 2003.011 <160> 12 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1004 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (55)..(939) <400> 1 tggtatatcc attgcatgat ttatggtaac caaccatttc aggaggtttg ccat atg 57 Met 1 tct ttg gtc att aac aac aac atg atg gct gca aat gca gcc cgt aac 105 Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg Asn 5 10 15 ctc aat gaa agt tat tca cga ctt agc caa tca aca aga cgt cta tct 153 Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu Ser 20 25 30 tct gga ctt cgt gtt ggg aca gca gct gat gat tca gca ggg ctt gct 201 Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu Ala 35 40 45 att aga gaa ctt atg cga gcc gat att aaa aca ttt caa caa ggt gca 249 Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly Ala 50 55 60 65 aga aat gca aat gat gct att tca tta gta caa gtt gca gat ggg gca 297 Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly Ala 70 75 80 cta ggt gtt ata gat gaa aag ctt atc cga atg aaa gag ctt gct gaa 345 Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala Glu 85 90 95 caa gct gct aca ggt act tat aat tca aca caa cgc ttg att att gaa 393 Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile Glu 100 105 110 tct gaa tat caa gca atg gct tca gaa att aca cgt att tct gtt gca 441 Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val Ala 115 120 125 aca gaa ttt aat ggt ata aaa tta tta gat ggt tct cta tct gga cct 489 Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly Pro 130 135 140 145 cat aaa gga act aat cta caa caa aca gga gct cta aga gta cat ttt 537 His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His Phe 150 155 160 ggt cca ggg aat agt tca gca gaa gac tat tat gaa att agc ata cat 585 Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile His 165 170 175 tcc gct aca gct tct gca cta ggc ctt gga aat gga act act ggt cct 633 Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly Pro 180 185 190 ggt gct aca atc tct act caa gct gca gca caa gca gcg tta gac gcc 681 Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Ala 195 200 205 atc aat gat gct atc gtt tct aaa gat aat att cgt gct agc ctt ggt 729 Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu Gly 210 215 220 225 acg cta caa aat agg tta gaa gca aca att aca aac tta aat acc caa 777 Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr Gln 230 235 240 gct gaa aac ctc cag gct gca gaa tca cga att tct gat ata gac gtt 825 Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp Val 245 250 255 tca aca gaa atg act gaa ttt gta aga aat caa att tta aca caa tct 873 Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln Ser 260 265 270 gga gta gca atg ctt tca cag gca aac tca ctg cca aag atg gca agc 921 Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala Ser 275 280 285 caa ctc att agt ggc taa tccatcacta cataatatgg ttaaggcaga 969 Gln Leu Ile Ser Gly 290 ccaaagacac atggcttgga ggaaagaagt tgttg 1004 <210> 2 <211> 294 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 2 Met Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Asn Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu 35 40 45 Ala Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly 50 55 60 Ala Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala 85 90 95 Glu Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile 100 105 110 Glu Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val 115 120 125 Ala Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly 130 135 140 Pro His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His 145 150 155 160 Phe Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile 165 170 175 His Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly 180 185 190 Pro Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu 210 215 220 Gly Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr 225 230 235 240 Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp 245 250 255 Val Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln 260 265 270 Ser Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala 275 280 285 Ser Gln Leu Ile Ser Gly 290 <210> 3 <211> 764 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (25)..(717) <400> 3 acgctaacgt attggaaacc catt atg aaa aaa tta ctc ttt act tca ggc 51 Met Lys Lys Leu Leu Phe Thr Ser Gly 1 5 tgt att ctt att tta aca ggt tgt tct gct cca aac aaa act cct gtt 99 Cys Ile Leu Ile Leu Thr Gly Cys Ser Ala Pro Asn Lys Thr Pro Val 10 15 20 25 gtt gct cct cct ata aca cct cct cca gca tat gta gaa cct gaa gac 147 Val Ala Pro Pro Ile Thr Pro Pro Pro Ala Tyr Val Glu Pro Glu Asp 30 35 40 tcc tat agt aat cct ggc tct ctt tac tca tct gct gaa tct gat ggt 195 Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Ser Asp Gly 45 50 55 ctt ttt gct gat act cgt gct cga cgt gta ggt gat att gtt atg gta 243 Leu Phe Ala Asp Thr Arg Ala Arg Arg Val Gly Asp Ile Val Met Val 60 65 70 aaa att gta gaa aat aat act gct aaa aat aaa gca gat aca aca gct 291 Lys Ile Val Glu Asn Asn Thr Ala Lys Asn Lys Ala Asp Thr Thr Ala 75 80 85 gat aaa aaa act gca aat aca tac gga att gat gcg ttt ttt ggt aga 339 Asp Lys Lys Thr Ala Asn Thr Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Gly Arg 90 95 100 105 caa tat att ggt gga gga tca aca aaa att cct gta ggt agt gtt gct 387 Gln Tyr Ile Gly Gly Gly Ser Thr Lys Ile Pro Val Gly Ser Val Ala 110 115 120 ttt gat aca acc tct gaa agt gga acc act agt aca gga gaa aca aaa 435 Phe Asp Thr Thr Ser Glu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Gly Glu Thr Lys 125 130 135 cgt gaa gga gct ata aat gga aca att gct gct cgt gta tta cga gtt 483 Arg Glu Gly Ala Ile Asn Gly Thr Ile Ala Ala Arg Val Leu Arg Val 140 145 150 atg cca ggt gga tta tta gaa ata gaa ggc gtc cgt gaa aca cgt gta 531 Met Pro Gly Gly Leu Leu Glu Ile Glu Gly Val Arg Glu Thr Arg Val 155 160 165 aat aat gaa aca cag tat att gtt atc aca gga ctt ata cga cca atg 579 Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Ile Val Ile Thr Gly Leu Ile Arg Pro Met 170 175 180 185 gat ata gag cca gac aac tcc att atg tca aat aga atc tct gat gca 627 Asp Ile Glu Pro Asp Asn Ser Ile Met Ser Asn Arg Ile Ser Asp Ala 190 195 200 aaa att gct tat tat ggt caa ggt gtt ctt tcc gag aaa caa aaa cct 675 Lys Ile Ala Tyr Tyr Gly Gln Gly Val Leu Ser Glu Lys Gln Lys Pro 205 210 215 ggt tgg ttt aca cgc ttt atg gat acc ctc tgg cct ttc tag 717 Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met Asp Thr Leu Trp Pro Phe 220 225 230 tagtctaata tactaagtat aactcaatat ctataaggta aacgtat 764 <210> 4 <211> 230 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 4 Met Lys Lys Leu Leu Phe Thr Ser Gly Cys Ile Leu Ile Leu Thr Gly 1 5 10 15 Cys Ser Ala Pro Asn Lys Thr Pro Val Val Ala Pro Pro Ile Thr Pro 20 25 30 Pro Pro Ala Tyr Val Glu Pro Glu Asp Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ser 35 40 45 Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Ser Asp Gly Leu Phe Ala Asp Thr Arg Ala 50 55 60 Arg Arg Val Gly Asp Ile Val Met Val Lys Ile Val Glu Asn Asn Thr 65 70 75 80 Ala Lys Asn Lys Ala Asp Thr Thr Ala Asp Lys Lys Thr Ala Asn Thr 85 90 95 Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Gly Arg Gln Tyr Ile Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Thr Lys Ile Pro Val Gly Ser Val Ala Phe Asp Thr Thr Ser Glu Ser 115 120 125 Gly Thr Thr Ser Thr Gly Glu Thr Lys Arg Glu Gly Ala Ile Asn Gly 130 135 140 Thr Ile Ala Ala Arg Val Leu Arg Val Met Pro Gly Gly Leu Leu Glu 145 150 155 160 Ile Glu Gly Val Arg Glu Thr Arg Val Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Ile 165 170 175 Val Ile Thr Gly Leu Ile Arg Pro Met Asp Ile Glu Pro Asp Asn Ser 180 185 190 Ile Met Ser Asn Arg Ile Ser Asp Ala Lys Ile Ala Tyr Tyr Gly Gln 195 200 205 Gly Val Leu Ser Glu Lys Gln Lys Pro Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met 210 215 220 Asp Thr Leu Trp Pro Phe 225 230 <210> 5 <211> 2200 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (47)..(2164) <400> 5 atcaccattc acgtcctgag ggcacccttc tttctgggag attgta atg tcg atc 55 Met Ser Ile 1 aat aca ctt ttc ggt att ggg aaa agt gca ata gct gga aac cag aca 103 Asn Thr Leu Phe Gly Ile Gly Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asn Gln Thr 5 10 15 gct cta aac gtt act ggt aat aat ata gca aat gtt aat aca caa gga 151 Ala Leu Asn Val Thr Gly Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn Thr Gln Gly 20 25 30 35 tat tcc cgc caa agt gta cgc ttc gaa gat agg tat gga ctt aat caa 199 Tyr Ser Arg Gln Ser Val Arg Phe Glu Asp Arg Tyr Gly Leu Asn Gln 40 45 50 act cca gga atg ctt ggg cag ggt gtc cat aca gct gaa ata tac cgc 247 Thr Pro Gly Met Leu Gly Gln Gly Val His Thr Ala Glu Ile Tyr Arg 55 60 65 aat ttt aat aga ttt gta gaa gat gct tac ctt aat cgt ttt tcc caa 295 Asn Phe Asn Arg Phe Val Glu Asp Ala Tyr Leu Asn Arg Phe Ser Gln 70 75 80 aat act cga tgg gac gaa caa agt gct att atg aac tct ata gaa agc 343 Asn Thr Arg Trp Asp Glu Gln Ser Ala Ile Met Asn Ser Ile Glu Ser 85 90 95 att ttt aac gaa tca aac cgt aca gga att agt tca cta cta gga gaa 391 Ile Phe Asn Glu Ser Asn Arg Thr Gly Ile Ser Ser Leu Leu Gly Glu 100 105 110 115 ttt ttt aaa gga tgg caa aat ctt tcc tta cgt cca gaa gat gca gct 439 Phe Phe Lys Gly Trp Gln Asn Leu Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ala Ala 120 125 130 act cgt gaa gca gtg ctc tct aca gct aaa aat ctc aca caa ctt att 487 Thr Arg Glu Ala Val Leu Ser Thr Ala Lys Asn Leu Thr Gln Leu Ile 135 140 145 aac gat gca aaa tca agt cta caa aaa acc caa caa gaa atg gat ctc 535 Asn Asp Ala Lys Ser Ser Leu Gln Lys Thr Gln Gln Glu Met Asp Leu 150 155 160 tac atc caa caa agt gtt aat aaa gtt aat gag tta gta gat gct att 583 Tyr Ile Gln Gln Ser Val Asn Lys Val Asn Glu Leu Val Asp Ala Ile 165 170 175 aaa aac att aat aaa caa atc tca gca act tat att cct ggt caa caa 631 Lys Asn Ile Asn Lys Gln Ile Ser Ala Thr Tyr Ile Pro Gly Gln Gln 180 185 190 195 aac cct aat caa tta ctt gat caa cga gat caa ctt gtt cga gaa tta 679 Asn Pro Asn Gln Leu Leu Asp Gln Arg Asp Gln Leu Val Arg Glu Leu 200 205 210 gca aac ctg gta gat ata gaa gta aag gat aaa ggt gga gga aat ttt 727 Ala Asn Leu Val Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Gly Gly Gly Asn Phe 215 220 225 gat ata caa tta aaa tct gga caa cct ctc ctg gaa gga caa ata ggt 775 Asp Ile Gln Leu Lys Ser Gly Gln Pro Leu Leu Glu Gly Gln Ile Gly 230 235 240 tat aca ctt agc gtt ggg gga caa cga gtt gaa aac tat tta aaa caa 823 Tyr Thr Leu Ser Val Gly Gly Gln Arg Val Glu Asn Tyr Leu Lys Gln 245 250 255 gat tca aaa tat aca ggc act ata acc tct agt ggt tca gac tcc cat 871 Asp Ser Lys Tyr Thr Gly Thr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Asp Ser His 260 265 270 275 gaa tat tca ttt gaa att att aat cct cct tct ggt gga gca cct ggg 919 Glu Tyr Ser Phe Glu Ile Ile Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ala Pro Gly 280 285 290 agt atg cgt gta tca ctt gat gga gga aaa act tgg ctt cgt aac gaa 967 Ser Met Arg Val Ser Leu Asp Gly Gly Lys Thr Trp Leu Arg Asn Glu 295 300 305 gat gga tct gaa ctt aac gta cct att cct act acg cct ggt gaa act 1015 Asp Gly Ser Glu Leu Asn Val Pro Ile Pro Thr Thr Pro Gly Glu Thr 310 315 320 atc aaa gta aaa aat ctt gaa ata tct ttt gat caa gat cct tcg caa 1063 Ile Lys Val Lys Asn Leu Glu Ile Ser Phe Asp Gln Asp Pro Ser Gln 325 330 335 tta gtt tca gga gac agg ttt gat gtt att cca aaa aca ggt tta tac 1111 Leu Val Ser Gly Asp Arg Phe Asp Val Ile Pro Lys Thr Gly Leu Tyr 340 345 350 355 tgg aat tca ccc aca aga cct ccg atc aat att act ccc caa aca cta 1159 Trp Asn Ser Pro Thr Arg Pro Pro Ile Asn Ile Thr Pro Gln Thr Leu 360 365 370 aat gat ggt aca gaa aat aca ggg cgt ctc act gga gga aaa ctt act 1207 Asn Asp Gly Thr Glu Asn Thr Gly Arg Leu Thr Gly Gly Lys Leu Thr 375 380 385 gca tat ttt agt act cgt gat tat aat gca gga aga tat att gat aaa 1255 Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Asn Ala Gly Arg Tyr Ile Asp Lys 390 395 400 ctt gat gca tta gca aac tct att gta tgg gaa gta aac cga atc cac 1303 Leu Asp Ala Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Glu Val Asn Arg Ile His 405 410 415 agt caa ggt gct gga gaa caa aaa atg act tac tct tta ggg agt agt 1351 Ser Gln Gly Ala Gly Glu Gln Lys Met Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 420 425 430 435 caa gta aat cgt aca gat gta cca ctg gga aca tct caa tct ggt ctt 1399 Gln Val Asn Arg Thr Asp Val Pro Leu Gly Thr Ser Gln Ser Gly Leu 440 445 450 gcc tat gga aac cgt ctt aca act ggg aac tta tca ttc caa atc tat 1447 Ala Tyr Gly Asn Arg Leu Thr Thr Gly Asn Leu Ser Phe Gln Ile Tyr 455 460 465 gat gaa aat gga aaa cct tta cct gta ggc aca cct cca aat gga atc 1495 Asp Glu Asn Gly Lys Pro Leu Pro Val Gly Thr Pro Pro Asn Gly Ile 470 475 480 cca gaa tct tta gat ctt gat cca ggt acg cct gga gtt caa aac ttt 1543 Pro Glu Ser Leu Asp Leu Asp Pro Gly Thr Pro Gly Val Gln Asn Phe 485 490 495 gat cct tca att cat agt ctt gaa gat cta gtt aat gcc att aac cac 1591 Asp Pro Ser Ile His Ser Leu Glu Asp Leu Val Asn Ala Ile Asn His 500 505 510 515 cct aat aac tat ggt gaa ttt atg aaa gct tct att gtt aat gga agt 1639 Pro Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Met Lys Ala Ser Ile Val Asn Gly Ser 520 525 530 ctc caa ctt acc agt cgt cct gga aca tca ttt gca gca aaa aca gat 1687 Leu Gln Leu Thr Ser Arg Pro Gly Thr Ser Phe Ala Ala Lys Thr Asp 535 540 545 aca aca ggt tta ctt gca gcc ctt gga atc aat act ttt ttc caa ggt 1735 Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ile Asn Thr Phe Phe Gln Gly 550 555 560 tca gat gct aca gat atg gct ata aaa cct gat gtt att caa aat aca 1783 Ser Asp Ala Thr Asp Met Ala Ile Lys Pro Asp Val Ile Gln Asn Thr 565 570 575 aat ttt att aat gct gga aag gtt aat gct aat ggt gaa gtt tct aca 1831 Asn Phe Ile Asn Ala Gly Lys Val Asn Ala Asn Gly Glu Val Ser Thr 580 585 590 595 ggt gat aat agt ata gct aaa gaa ctt gct gac ctt gct aca aaa gaa 1879 Gly Asp Asn Ser Ile Ala Lys Glu Leu Ala Asp Leu Ala Thr Lys Glu 600 605 610 gta aca att tct act gga tgg gaa act aca cac caa aca tta ggt gct 1927 Val Thr Ile Ser Thr Gly Trp Glu Thr Thr His Gln Thr Leu Gly Ala 615 620 625 tat tat ggt gca cta gtt ggt ctt gta gga tct gat act cgt aca gca 1975 Tyr Tyr Gly Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Ser Asp Thr Arg Thr Ala 630 635 640 aaa ttt aat gct gat tat aat aaa aca ctt tca aac gaa cta gaa caa 2023 Lys Phe Asn Ala Asp Tyr Asn Lys Thr Leu Ser Asn Glu Leu Glu Gln 645 650 655 caa gct tta tct att aca ggc gtt aac cta gat gaa gaa atg act cag 2071 Gln Ala Leu Ser Ile Thr Gly Val Asn Leu Asp Glu Glu Met Thr Gln 660 665 670 675 ctt att aaa ttt caa cat tca tat act gca gca gca aaa ctc att aca 2119 Leu Ile Lys Phe Gln His Ser Tyr Thr Ala Ala Ala Lys Leu Ile Thr 680 685 690 aca gca gat caa atg ctg caa act tta ctt tct tta aaa cag tag 2164 Thr Ala Asp Gln Met Leu Gln Thr Leu Leu Ser Leu Lys Gln 695 700 705 ggagtaaaca tgagggttac ccaccaatca atgtat 2200 <210> 6 <211> 705 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 6 Met Ser Ile Asn Thr Leu Phe Gly Ile Gly Lys Ser Ala Ile Ala Gly 1 5 10 15 Asn Gln Thr Ala Leu Asn Val Thr Gly Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn 20 25 30 Thr Gln Gly Tyr Ser Arg Gln Ser Val Arg Phe Glu Asp Arg Tyr Gly 35 40 45 Leu Asn Gln Thr Pro Gly Met Leu Gly Gln Gly Val His Thr Ala Glu 50 55 60 Ile Tyr Arg Asn Phe Asn Arg Phe Val Glu Asp Ala Tyr Leu Asn Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gln Asn Thr Arg Trp Asp Glu Gln Ser Ala Ile Met Asn Ser 85 90 95 Ile Glu Ser Ile Phe Asn Glu Ser Asn Arg Thr Gly Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Leu Gly Glu Phe Phe Lys Gly Trp Gln Asn Leu Ser Leu Arg Pro Glu 115 120 125 Asp Ala Ala Thr Arg Glu Ala Val Leu Ser Thr Ala Lys Asn Leu Thr 130 135 140 Gln Leu Ile Asn Asp Ala Lys Ser Ser Leu Gln Lys Thr Gln Gln Glu 145 150 155 160 Met Asp Leu Tyr Ile Gln Gln Ser Val Asn Lys Val Asn Glu Leu Val 165 170 175 Asp Ala Ile Lys Asn Ile Asn Lys Gln Ile Ser Ala Thr Tyr Ile Pro 180 185 190 Gly Gln Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Asp Gln Arg Asp Gln Leu Val 195 200 205 Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Gly Gly 210 215 220 Gly Asn Phe Asp Ile Gln Leu Lys Ser Gly Gln Pro Leu Leu Glu Gly 225 230 235 240 Gln Ile Gly Tyr Thr Leu Ser Val Gly Gly Gln Arg Val Glu Asn Tyr 245 250 255 Leu Lys Gln Asp Ser Lys Tyr Thr Gly Thr Ile Thr Ser Ser Gly Ser 260 265 270 Asp Ser His Glu Tyr Ser Phe Glu Ile Ile Asn Pro Pro Ser Gly Gly 275 280 285 Ala Pro Gly Ser Met Arg Val Ser Leu Asp Gly Gly Lys Thr Trp Leu 290 295 300 Arg Asn Glu Asp Gly Ser Glu Leu Asn Val Pro Ile Pro Thr Thr Pro 305 310 315 320 Gly Glu Thr Ile Lys Val Lys Asn Leu Glu Ile Ser Phe Asp Gln Asp 325 330 335 Pro Ser Gln Leu Val Ser Gly Asp Arg Phe Asp Val Ile Pro Lys Thr 340 345 350 Gly Leu Tyr Trp Asn Ser Pro Thr Arg Pro Pro Ile Asn Ile Thr Pro 355 360 365 Gln Thr Leu Asn Asp Gly Thr Glu Asn Thr Gly Arg Leu Thr Gly Gly 370 375 380 Lys Leu Thr Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Asn Ala Gly Arg Tyr 385 390 395 400 Ile Asp Lys Leu Asp Ala Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Glu Val Asn 405 410 415 Arg Ile His Ser Gln Gly Ala Gly Glu Gln Lys Met Thr Tyr Ser Leu 420 425 430 Gly Ser Ser Gln Val Asn Arg Thr Asp Val Pro Leu Gly Thr Ser Gln 435 440 445 Ser Gly Leu Ala Tyr Gly Asn Arg Leu Thr Thr Gly Asn Leu Ser Phe 450 455 460 Gln Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Lys Pro Leu Pro Val Gly Thr Pro Pro 465 470 475 480 Asn Gly Ile Pro Glu Ser Leu Asp Leu Asp Pro Gly Thr Pro Gly Val 485 490 495 Gln Asn Phe Asp Pro Ser Ile His Ser Leu Glu Asp Leu Val Asn Ala 500 505 510 Ile Asn His Pro Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Met Lys Ala Ser Ile Val 515 520 525 Asn Gly Ser Leu Gln Leu Thr Ser Arg Pro Gly Thr Ser Phe Ala Ala 530 535 540 Lys Thr Asp Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ile Asn Thr Phe 545 550 555 560 Phe Gln Gly Ser Asp Ala Thr Asp Met Ala Ile Lys Pro Asp Val Ile 565 570 575 Gln Asn Thr Asn Phe Ile Asn Ala Gly Lys Val Asn Ala Asn Gly Glu 580 585 590 Val Ser Thr Gly Asp Asn Ser Ile Ala Lys Glu Leu Ala Asp Leu Ala 595 600 605 Thr Lys Glu Val Thr Ile Ser Thr Gly Trp Glu Thr Thr His Gln Thr 610 615 620 Leu Gly Ala Tyr Tyr Gly Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Ser Asp Thr 625 630 635 640 Arg Thr Ala Lys Phe Asn Ala Asp Tyr Asn Lys Thr Leu Ser Asn Glu 645 650 655 Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ser Ile Thr Gly Val Asn Leu Asp Glu Glu 660 665 670 Met Thr Gln Leu Ile Lys Phe Gln His Ser Tyr Thr Ala Ala Ala Lys 675 680 685 Leu Ile Thr Thr Ala Asp Gln Met Leu Gln Thr Leu Leu Ser Leu Lys 690 695 700 Gln 705 <210> 7 <211> 1740 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (54)..(1631) <400> 7 cagcagatca aatgctgcaa actttacttt ctttaaaaca gtagggagta aac atg 56 Met 1 agg gtt acc cac caa tca atg tat tct ggc atg atc agt cag atg aac 104 Arg Val Thr His Gln Ser Met Tyr Ser Gly Met Ile Ser Gln Met Asn 5 10 15 aaa agt tta tct gac tat atg gag act aat ata caa ggc ggt aca atg 152 Lys Ser Leu Ser Asp Tyr Met Glu Thr Asn Ile Gln Gly Gly Thr Met 20 25 30 aaa aga ata aac cgt cct tct gat gat cct gca ggt aca gct aga atc 200 Lys Arg Ile Asn Arg Pro Ser Asp Asp Pro Ala Gly Thr Ala Arg Ile 35 40 45 ctc tct tat cgt gga agt att ggt gga ata gaa caa ttt aaa aca aat 248 Leu Ser Tyr Arg Gly Ser Ile Gly Gly Ile Glu Gln Phe Lys Thr Asn 50 55 60 65 act gat aca gct atg gga tgg tta tct ctt gca gat gaa aca ctt aat 296 Thr Asp Thr Ala Met Gly Trp Leu Ser Leu Ala Asp Glu Thr Leu Asn 70 75 80 caa gtt tca aca gtt gtt act aaa att aaa gaa ctt gcc gaa caa gct 344 Gln Val Ser Thr Val Val Thr Lys Ile Lys Glu Leu Ala Glu Gln Ala 85 90 95 gct aca gat aca tat acc cct gac caa cgt gaa gct att ggt ttc caa 392 Ala Thr Asp Thr Tyr Thr Pro Asp Gln Arg Glu Ala Ile Gly Phe Gln 100 105 110 ctc cgc caa ctt atg gga act ctt ata aac ctt tca aat aat caa ttt 440 Leu Arg Gln Leu Met Gly Thr Leu Ile Asn Leu Ser Asn Asn Gln Phe 115 120 125 gaa ggc aaa cat att ttt tct ggg caa gat tat aat aaa tca tcc ttt 488 Glu Gly Lys His Ile Phe Ser Gly Gln Asp Tyr Asn Lys Ser Ser Phe 130 135 140 145 cta gaa gga ctc aca gtc aca agc gga gat ccc aat gtt aac cct aat 536 Leu Glu Gly Leu Thr Val Thr Ser Gly Asp Pro Asn Val Asn Pro Asn 150 155 160 cca cca atg cag gtt act gga aca ctt gaa aaa act gga ctt att cgc 584 Pro Pro Met Gln Val Thr Gly Thr Leu Glu Lys Thr Gly Leu Ile Arg 165 170 175 ttt gaa aaa gat gaa aca atc cct cca gca gca gat cta aat tat cag 632 Phe Glu Lys Asp Glu Thr Ile Pro Pro Ala Ala Asp Leu Asn Tyr Gln 180 185 190 tgg tca act gat ggt ggt aaa act tgg caa act gca acc atc cct gct 680 Trp Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Gln Thr Ala Thr Ile Pro Ala 195 200 205 ggg gga cga gaa ata act ata ggt ggt gca gtc gta act gtt cct gct 728 Gly Gly Arg Glu Ile Thr Ile Gly Gly Ala Val Val Thr Val Pro Ala 210 215 220 225 cca gct aca aca aat gta aca gca ttt gac cca gat aaa cct ctt gga 776 Pro Ala Thr Thr Asn Val Thr Ala Phe Asp Pro Asp Lys Pro Leu Gly 230 235 240 gat act aat ggt tcc tta cta tat gta cgt cct aca gct ata tac caa 824 Asp Thr Asn Gly Ser Leu Leu Tyr Val Arg Pro Thr Ala Ile Tyr Gln 245 250 255 ggg agt gat aat aac tca aaa cct att gta gac aga tat ggc act gta 872 Gly Ser Asp Asn Asn Ser Lys Pro Ile Val Asp Arg Tyr Gly Thr Val 260 265 270 cca atg cct cca ctt aat acc aat aca gta ggg act ttt tct gat aat 920 Pro Met Pro Pro Leu Asn Thr Asn Thr Val Gly Thr Phe Ser Asp Asn 275 280 285 gtc gtt gta aaa ttc cct aat ggt gtt gat tta tca act cct gga tca 968 Val Val Val Lys Phe Pro Asn Gly Val Asp Leu Ser Thr Pro Gly Ser 290 295 300 305 ttt gat ttc tct tat agt aca gat gga ggc aaa aca tgg aca gca gga 1016 Phe Asp Phe Ser Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Thr Ala Gly 310 315 320 aac tct gaa gtc att gtt tct cct gga cca cca tca act agt act gca 1064 Asn Ser Glu Val Ile Val Ser Pro Gly Pro Pro Ser Thr Ser Thr Ala 325 330 335 aga ctc att ctg cct ggt ggc tat atg gat ata ggt tct gct gat act 1112 Arg Leu Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Met Asp Ile Gly Ser Ala Asp Thr 340 345 350 aca agt cca aat aat act att cct cct gat gga caa ctt atc ctt cgc 1160 Thr Ser Pro Asn Asn Thr Ile Pro Pro Asp Gly Gln Leu Ile Leu Arg 355 360 365 ccc caa cga aca gat ctt agt ttt gaa atc atg gaa gga caa aat att 1208 Pro Gln Arg Thr Asp Leu Ser Phe Glu Ile Met Glu Gly Gln Asn Ile 370 375 380 385 act gtc aca aat gta gga aaa gat att ttt ggt gga ata tat tct aca 1256 Thr Val Thr Asn Val Gly Lys Asp Ile Phe Gly Gly Ile Tyr Ser Thr 390 395 400 aat ggc tca tct aat ttg gaa cct atg ttt gga caa aat gat gga cgt 1304 Asn Gly Ser Ser Asn Leu Glu Pro Met Phe Gly Gln Asn Asp Gly Arg 405 410 415 aat tta ttt gaa aca gtt gga aat ctt att gcg tac act gaa aca aat 1352 Asn Leu Phe Glu Thr Val Gly Asn Leu Ile Ala Tyr Thr Glu Thr Asn 420 425 430 aat caa gaa ggc att gca aac gcc ctt aaa gat ctt gaa tta gca caa 1400 Asn Gln Glu Gly Ile Ala Asn Ala Leu Lys Asp Leu Glu Leu Ala Gln 435 440 445 aaa aat atc cta act caa gct gca cgt att gga ggt aaa gaa aac cgt 1448 Lys Asn Ile Leu Thr Gln Ala Ala Arg Ile Gly Gly Lys Glu Asn Arg 450 455 460 465 ctt gaa atc aca aaa gaa gct ctt gat aca aat aaa tat gat caa aca 1496 Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ala Leu Asp Thr Asn Lys Tyr Asp Gln Thr 470 475 480 caa cgc tta agt ggt gtt gaa gat gca gac ctt aca gaa cta gta agc 1544 Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Asp Ala Asp Leu Thr Glu Leu Val Ser 485 490 495 cgc tta gca caa caa caa atg gct tat tct act ata tta aaa tct tct 1592 Arg Leu Ala Gln Gln Gln Met Ala Tyr Ser Thr Ile Leu Lys Ser Ser 500 505 510 tct atg att atg cag tta aat tta aca aaa tac att taa tctattacta 1641 Ser Met Ile Met Gln Leu Asn Leu Thr Lys Tyr Ile 515 520 525 aatagcaata gtatgaaaaa attctataat taattatcag atggtttaat gatagtacct 1701 ctatgccttt taataattag taaatggagt tgtccatgc 1740 <210> 8 <211> 525 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 8 Met Arg Val Thr His Gln Ser Met Tyr Ser Gly Met Ile Ser Gln Met 1 5 10 15 Asn Lys Ser Leu Ser Asp Tyr Met Glu Thr Asn Ile Gln Gly Gly Thr 20 25 30 Met Lys Arg Ile Asn Arg Pro Ser Asp Asp Pro Ala Gly Thr Ala Arg 35 40 45 Ile Leu Ser Tyr Arg Gly Ser Ile Gly Gly Ile Glu Gln Phe Lys Thr 50 55 60 Asn Thr Asp Thr Ala Met Gly Trp Leu Ser Leu Ala Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Asn Gln Val Ser Thr Val Val Thr Lys Ile Lys Glu Leu Ala Glu Gln 85 90 95 Ala Ala Thr Asp Thr Tyr Thr Pro Asp Gln Arg Glu Ala Ile Gly Phe 100 105 110 Gln Leu Arg Gln Leu Met Gly Thr Leu Ile Asn Leu Ser Asn Asn Gln 115 120 125 Phe Glu Gly Lys His Ile Phe Ser Gly Gln Asp Tyr Asn Lys Ser Ser 130 135 140 Phe Leu Glu Gly Leu Thr Val Thr Ser Gly Asp Pro Asn Val Asn Pro 145 150 155 160 Asn Pro Pro Met Gln Val Thr Gly Thr Leu Glu Lys Thr Gly Leu Ile 165 170 175 Arg Phe Glu Lys Asp Glu Thr Ile Pro Pro Ala Ala Asp Leu Asn Tyr 180 185 190 Gln Trp Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Gln Thr Ala Thr Ile Pro 195 200 205 Ala Gly Gly Arg Glu Ile Thr Ile Gly Gly Ala Val Val Thr Val Pro 210 215 220 Ala Pro Ala Thr Thr Asn Val Thr Ala Phe Asp Pro Asp Lys Pro Leu 225 230 235 240 Gly Asp Thr Asn Gly Ser Leu Leu Tyr Val Arg Pro Thr Ala Ile Tyr 245 250 255 Gln Gly Ser Asp Asn Asn Ser Lys Pro Ile Val Asp Arg Tyr Gly Thr 260 265 270 Val Pro Met Pro Pro Leu Asn Thr Asn Thr Val Gly Thr Phe Ser Asp 275 280 285 Asn Val Val Val Lys Phe Pro Asn Gly Val Asp Leu Ser Thr Pro Gly 290 295 300 Ser Phe Asp Phe Ser Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Thr Ala 305 310 315 320 Gly Asn Ser Glu Val Ile Val Ser Pro Gly Pro Pro Ser Thr Ser Thr 325 330 335 Ala Arg Leu Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Met Asp Ile Gly Ser Ala Asp 340 345 350 Thr Thr Ser Pro Asn Asn Thr Ile Pro Pro Asp Gly Gln Leu Ile Leu 355 360 365 Arg Pro Gln Arg Thr Asp Leu Ser Phe Glu Ile Met Glu Gly Gln Asn 370 375 380 Ile Thr Val Thr Asn Val Gly Lys Asp Ile Phe Gly Gly Ile Tyr Ser 385 390 395 400 Thr Asn Gly Ser Ser Asn Leu Glu Pro Met Phe Gly Gln Asn Asp Gly 405 410 415 Arg Asn Leu Phe Glu Thr Val Gly Asn Leu Ile Ala Tyr Thr Glu Thr 420 425 430 Asn Asn Gln Glu Gly Ile Ala Asn Ala Leu Lys Asp Leu Glu Leu Ala 435 440 445 Gln Lys Asn Ile Leu Thr Gln Ala Ala Arg Ile Gly Gly Lys Glu Asn 450 455 460 Arg Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ala Leu Asp Thr Asn Lys Tyr Asp Gln 465 470 475 480 Thr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Asp Ala Asp Leu Thr Glu Leu Val 485 490 495 Ser Arg Leu Ala Gln Gln Gln Met Ala Tyr Ser Thr Ile Leu Lys Ser 500 505 510 Ser Ser Met Ile Met Gln Leu Asn Leu Thr Lys Tyr Ile 515 520 525 <210> 9 <211> 902 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (63)..(842) <400> 9 ctttagtaaa tacagtgact atactataat atataaatta ataaattttg gagaagacta 60 tc atg att tca tta aat aat tca tca att caa ata cca caa caa aat 107 Met Ile Ser Leu Asn Asn Ser Ser Ile Gln Ile Pro Gln Gln Asn 1 5 10 15 ata gaa gaa agt acc tca caa gaa gta act tcc tcc tct ggt gga caa 155 Ile Glu Glu Ser Thr Ser Gln Glu Val Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gln 20 25 30 cct gct aaa gtt gat ggt gta tca atc caa gcc cct aag gct cct gtt 203 Pro Ala Lys Val Asp Gly Val Ser Ile Gln Ala Pro Lys Ala Pro Val 35 40 45 act tct gca gct agt aac tta gaa gga gta cag caa aga gaa gct caa 251 Thr Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Gly Val Gln Gln Arg Glu Ala Gln 50 55 60 gaa aat gtt aca aaa atg ggc tta cct gag cta tca gct cct aaa ggt 299 Glu Asn Val Thr Lys Met Gly Leu Pro Glu Leu Ser Ala Pro Lys Gly 65 70 75 ggt ggt tat gtt cag tca aca gca gct atg ttt gca gaa gtt aca gtt 347 Gly Gly Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Met Phe Ala Glu Val Thr Val 80 85 90 95 gat gct atg aat cag caa cgt aaa gct gcg caa gac gta caa aat agt 395 Asp Ala Met Asn Gln Gln Arg Lys Ala Ala Gln Asp Val Gln Asn Ser 100 105 110 gct ctt gaa gga atg gtt aat aag atg ctg gaa gca gct aaa gat ata 443 Ala Leu Glu Gly Met Val Asn Lys Met Leu Glu Ala Ala Lys Asp Ile 115 120 125 aaa gaa caa tct aaa tta atg atg ggg tta ggt ata gca agt tct gtt 491 Lys Glu Gln Ser Lys Leu Met Met Gly Leu Gly Ile Ala Ser Ser Val 130 135 140 atg acc act gca atg gga ttt ggg ggt act ata ggt ggt gta aaa agt 539 Met Thr Thr Ala Met Gly Phe Gly Gly Thr Ile Gly Gly Val Lys Ser 145 150 155 atg aca gct aac cct gga gta gga aca aca cct caa gca caa gtt act 587 Met Thr Ala Asn Pro Gly Val Gly Thr Thr Pro Gln Ala Gln Val Thr 160 165 170 175 tca aac aag ctt act tta ggt aag gag att gct gaa ggt ata aga ggt 635 Ser Asn Lys Leu Thr Leu Gly Lys Glu Ile Ala Glu Gly Ile Arg Gly 180 185 190 ggt atg gat act ggt aaa gag agt caa gtg aaa tct ata gat gct gat 683 Gly Met Asp Thr Gly Lys Glu Ser Gln Val Lys Ser Ile Asp Ala Asp 195 200 205 ata aga aca act caa gca gaa gaa aag aaa cta gaa gca caa atg gaa 731 Ile Arg Thr Thr Gln Ala Glu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Gln Met Glu 210 215 220 cta gta aag caa ttt gct gaa aat tca aag aac ctt gct cag caa gct 779 Leu Val Lys Gln Phe Ala Glu Asn Ser Lys Asn Leu Ala Gln Gln Ala 225 230 235 ctg cag att atg tca gaa gtt act agg gat gct aat gca aca aca cag 827 Leu Gln Ile Met Ser Glu Val Thr Arg Asp Ala Asn Ala Thr Thr Gln 240 245 250 255 cgt att ctg gcg taa taatttatag aacaactaat atgaagttat tgagaaataa 882 Arg Ile Leu Ala atatagattg taatatatag 902 <210> 10 <211> 259 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 10 Met Ile Ser Leu Asn Asn Ser Ser Ile Gln Ile Pro Gln Gln Asn Ile 1 5 10 15 Glu Glu Ser Thr Ser Gln Glu Val Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gln Pro 20 25 30 Ala Lys Val Asp Gly Val Ser Ile Gln Ala Pro Lys Ala Pro Val Thr 35 40 45 Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Gly Val Gln Gln Arg Glu Ala Gln Glu 50 55 60 Asn Val Thr Lys Met Gly Leu Pro Glu Leu Ser Ala Pro Lys Gly Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Met Phe Ala Glu Val Thr Val Asp 85 90 95 Ala Met Asn Gln Gln Arg Lys Ala Ala Gln Asp Val Gln Asn Ser Ala 100 105 110 Leu Glu Gly Met Val Asn Lys Met Leu Glu Ala Ala Lys Asp Ile Lys 115 120 125 Glu Gln Ser Lys Leu Met Met Gly Leu Gly Ile Ala Ser Ser Val Met 130 135 140 Thr Thr Ala Met Gly Phe Gly Gly Thr Ile Gly Gly Val Lys Ser Met 145 150 155 160 Thr Ala Asn Pro Gly Val Gly Thr Thr Pro Gln Ala Gln Val Thr Ser 165 170 175 Asn Lys Leu Thr Leu Gly Lys Glu Ile Ala Glu Gly Ile Arg Gly Gly 180 185 190 Met Asp Thr Gly Lys Glu Ser Gln Val Lys Ser Ile Asp Ala Asp Ile 195 200 205 Arg Thr Thr Gln Ala Glu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Gln Met Glu Leu 210 215 220 Val Lys Gln Phe Ala Glu Asn Ser Lys Asn Leu Ala Gln Gln Ala Leu 225 230 235 240 Gln Ile Met Ser Glu Val Thr Arg Asp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Arg 245 250 255 Ile Leu Ala <210> 11 <211> 951 <212> DNA <213> Lawsonia intracellularis <220> <221> CDS <222> (50)..(877) <400> 11 tgcattaact ttctaaattt ttatttagaa aaacacagag gtaaagata atg ctc ttt 58 Met Leu Phe 1 tct ttt cgt ttt att acc tat ccc ctc ata aca att ttt ata tta tat 106 Ser Phe Arg Phe Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Ile Phe Ile Leu Tyr 5 10 15 act tgt cat aat gcg ctt gct agt aat aat gat tca atg att acc tct 154 Thr Cys His Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asp Ser Met Ile Thr Ser 20 25 30 35 gaa aat ttt gaa agc caa tta cga ctt ctt ctt cat aac cat cct gag 202 Glu Asn Phe Glu Ser Gln Leu Arg Leu Leu Leu His Asn His Pro Glu 40 45 50 ctt gtc ctt gat gta cta aga gag cat agc gaa ctt gtc ctt gaa att 250 Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val Leu Glu Ile 55 60 65 gcc caa caa ggt tct aaa cag cgt caa cat aaa tcc ctt ata gca cag 298 Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu Ile Ala Gln 70 75 80 tgg aaa aaa gac ata act act cca aaa aat atg cat ctg gaa aat aga 346 Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu Glu Asn Arg 85 90 95 cca atc cga ggg aat cca aaa gca ccc gta act att gta gca ttt tca 394 Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val Ala Phe Ser 100 105 110 115 gac ttt aca tgt ttg tac tgt tca caa gct tct aaa act gta caa caa 442 Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr Val Gln Gln 120 125 130 atg ctt att gat tat aaa gat aat gta aaa tat att ttt aaa cac ttc 490 Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe Lys His Phe 135 140 145 ccg ctt aaa gga cat act att tca caa caa gcg gca ata tat ttc att 538 Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile Tyr Phe Ile 150 155 160 gct gca tct ttc caa agt aat gaa aaa gca tgg gca ctt tat gat ctt 586 Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu Tyr Asp Leu 165 170 175 ctt ttt caa aaa aga gat gag cta tta caa aac ggt gaa cag act ctt 634 Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu Gln Thr Leu 180 185 190 195 aaa caa gca gta aaa gaa gtg gga cta gat ata aaa aag tta atg agt 682 Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys Leu Met Ser 200 205 210 gac ctc aac aaa gca gaa gta aac aat att ctt gga caa gac ata aaa 730 Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln Asp Ile Lys 215 220 225 gat gct gca caa ctt gat att agt ggt act cca tac ttt att gtt aat 778 Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe Ile Val Asn 230 235 240 aac ctt atc ctt cgt ggt gca tta cct cct gaa tta ttc aca gaa gca 826 Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe Thr Glu Ala 245 250 255 att aat atg gcc tta aaa aat aca aaa gaa gtg tca aca tct cca aaa 874 Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr Ser Pro Lys 260 265 270 275 taa attctaaaag gtgtcataac tacaacacat tactatataa tgaaacctat 927 gctagtatat ttattacaat actt 951 <210> 12 <211> 275 <212> PRT <213> Lawsonia intracellularis <400> 12 Met Leu Phe Ser Phe Arg Phe Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Ile Phe 1 5 10 15 Ile Leu Tyr Thr Cys His Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asp Ser Met 20 25 30 Ile Thr Ser Glu Asn Phe Glu Ser Gln Leu Arg Leu Leu Leu His Asn 35 40 45 His Pro Glu Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val 50 55 60 Leu Glu Ile Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu 65 70 75 80 Ile Ala Gln Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu 85 90 95 Glu Asn Arg Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val 100 105 110 Ala Phe Ser Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr 115 120 125 Val Gln Gln Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe 130 135 140 Lys His Phe Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile 145 150 155 160 Tyr Phe Ile Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu 165 170 175 Tyr Asp Leu Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu 180 185 190 Gln Thr Leu Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys 195 200 205 Leu Met Ser Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln 210 215 220 Asp Ile Lys Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe 225 230 235 240 Ile Val Asn Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe 245 250 255 Thr Glu Ala Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr 260 265 270 Ser Pro Lys 275

Claims

로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 1에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 3에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 5에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 7에 도시 된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 9에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
로소니아 인트라셀룰라리스 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 상기 핵산 서열의 일부분으로서, 서열 번호 11에 도시된 핵산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 핵산 서열 또는 이의 일부분.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 DNA 단편.
기능적으로 연결된 프로모터의 조절 하에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 제7항에 따른 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 제7항에 따른 DNA 단편 또는 제8항에 따른 재조합 DNA 분자를 포함하는 생 재조합 운반체(live recombinant carrier).
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 제7항에 따른 DNA 단편, 제8항에 따른 재조합 DNA 분자 또는 제9항에 따른 생 재조합 운반체를 포함하는 숙주 세포.
서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
서열 번호 4에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
서열 번호 6에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
서열 번호 8에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
서열 번호 10에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
서열 번호 12에 도시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 92%, 더 바람직하게는 94%, 좀 더 바람직하게는 96% 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 단편.
백신으로 사용하기 위한, 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질.
로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신의 제조 시, 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 로소니아 인트라셀룰라리스 단백질의 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 제7항에 따른 DNA 단편, 제8항에 따른 재조합 DNA 분자, 제9항에 따른 생 재조합 운반체, 제10항에 따른 숙 주 세포, 또는 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신.
제19항에 있어서, 면역 보조제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제19항 또는 제20항에 있어서, 돼지에 대해 병원성인 미생물 또는 바이러스 유래의 추가 항원, 또는 상기 항원을 코딩하는 유전 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제21항에 있어서, 돼지에 대해 병원성인 상기 미생물 또는 바이러스는 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Porcine influenza virus), 돼지 파르보 바이러스(Porcine parvo virus), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastro-enteritis virus), 로타바이러스(Rotavirus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 미코플라즈마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 감염을 치료하기 위한 백신.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 백신의 제조 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 제7항에 따른 DNA 단편, 제8항에 따른 재조합 DNA 분자, 제9항에 따른 생 재조합 운반체, 제10항에 따른 숙주 세포, 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 또는 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질에 대한 항체, 및 약학적 허용 담체를 혼합하는 것을 포함하는 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 또는 적어도 12, 바람직하게는 15, 더 바람직하게는 18 뉴클레오티드 길이를 가지는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 특이적인 DNA를 검출하기 위한 진단 테스트.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위한 진단 테스트.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스의 항원성 물질을 검출하기 위한 진단 테스트.