VACUNA DE SUBUNIDAD DE LA WSONIA IN TRA CEL LULA RIS
La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para nuevas proteínas de Lawsonia intracellularis, a fragmentos de ADN, a moléculas de ADN recombinante y a portadores recombinantes vivos que comprenden estas secuencias, a células huésped que comprenden tales secuencias de ácido nucleico, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y portadores recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos y a su uso para la manufactura de vacunas, a vacunas para combatir infecciones causadas por Lawsonia intracellularis y a métodos para la preparación de las mismas, y a pruebas de diagnóstico para la detección de ADN de Lawsonia intracellularis, para la detección de antígenos de Lawsonia intracellularis y para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. La enteropatía proliferativa porcina (EPP o EP) se ha vuelto una enfermedad importante de la industria porcícola moderna a nivel mundial. La enfermedad afecta a una cantidad del 15 al 50% de los hatos en crecimiento y hasta 30% de los animales individuales en hatos con el problema establecido. Actualmente las pérdidas económicas anuales se han estimado en US$5-10 en alimento extra y costos de tiempo de instalaciones por cerdo afectado. La EPP es un grupo de trastornos crónicos y agudos con signos clínicos ampliamente diferentes (muerte, palidez y anemia de los animales, diarrea acuosa, oscura o de color rojo brillante, depresión, apetito reducido y renuencia a moverse, crecimiento retardado y aumento de FCR). Sin embargo, hay dos características consistentes. La primera, es un cambio patológico únicamente visible a la necropsia, es un engrosamiento de la mucosa del intestino delgado y del colon. El segundo es la presencia de pequeñas bacterias curvadas intracitoplasmáticas en los enterocitos del intestino afectado. Estas bacterias ahora se han establecido como el agente etiológico de la EPP y se denominan Lawsonia ¡ntracellularis. Con el transcurso de los años, se ha encontrado que Lawsonia ¡ntracellularis afecta virtualmente a todos los animales, incluyendo monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos y otros animales tan diversos como avestruces y emúes. Lawsonia ¡ntracellularis es una bacteria gram-negativa, flagelada, que se multiplica únicamente en enterocitos eucarióticos y no se ha descrito ningún cultivo libre de células. Con el fin de persistir y multiplicarse en la célula, Lawsonia ¡ntracellularis debe penetrar en las células de las criptas en división. La bacteria se asocia con la membrana celular y rápidamente ingresa al enterocito a través de una vacuola de entrada. Después, esta vacuola rápidamente se rompe (en un periodo de 3 horas) y la bacteria florece y se multiplica libremente en el citoplasma. Los mecanismos por los cuales la bacteria causa que las células infectadas fallen en madurar, que continúen sufriendo mitosis y formen células de cripta hipoplásicas, todavía no se entiende. El entendimiento actual de la infección por Lawsonia ¡ntracellularis, el tratamiento y el control de la enfermedad, se han visto obstaculizados por el hecho de que Lawsonia ¡ntracellularis no puede ser cultivada en medios libres de células. Aunque existen reportes de cocultivos exitosos de Lawsonia intracellularis en enterocitos de rata, todavía no se ha llegado al desarrollo de vacunas inactivadas para combatir Lawsonia intracellularis, aunque claramente hay la necesidad de tales vacunas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna para combatir la infección por Lawsonia intracellularis. Sorprendentemente se encontró que Lawsonia intracellularis produce seis nuevas proteínas que, solas o en combinación, son capaces de inducir inmunidad protectora contra Lawsonia intracellularis. Las nuevas proteínas serán denominadas como las proteínas 31.0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD. Las secuencias de aminoácido de las nuevas proteínas se presentan en las identificaciones de secuencia SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 y 12. Los genes que codifican para estas proteínas han sido secuenciados y sus secuencias de ácidos nucleicos se muestran en las identificaciones de secuencia SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9 y 1 1 . En la técnica es bien sabido que muchas diferentes secuencias de ácido nucleico pueden codificar una misma proteína. Este fenómeno comúnmente se conoce como balanceo en la segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete (codón) que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente 30% para dos secuencias de ácido nucleico que todavía codifican para la misma proteína. Sin embargo, dos secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de aproximadamente 70%, todavía pueden codificar la misma proteína. Así pues, una modalidad se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifica para un fragmento inmunogénico de esa proteína, en donde estas secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas tienen un nivel de homolog ía con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 de cuando menos 90%. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene cuando menos 92, de preferencia 94 ó más preferiblemente 95% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 . Todavía más preferiblemente, un nivel de homología del 98% o incluso del 100%. El nivel de homología de nucleótidos se puede determinar con el programa de computadora "BLAST 2 SEQUENCES", seleccionando el subprograma: "BLASTN", que se puede encontrar en el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seg/byl2.html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. adden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Los parámetros utilizados son los parámetros por default: "Reward for a match: +1 . Penalty for a mismatch: -2. Open gap: 5.
Extensión gap: 2. Gap x_dropoff: 50". Otro enfoque para decidir si cierta secuencia de ácido nucleico es o no una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención, se refiere a la cuestión de si esa secuencia de ácido nucleico se hibridiza, bajo condiciones estrictas, con la secuencia de nucleotidos que se ilustra en la SEQ ID NO: 1 (o en la SEQ I D NO: 3, 5, 7, 9 u 1 1 , véase más adelante). Si una secuencia de ácido nucleico se hibridiza bajo condiciones estrictas con la secuencia de nucleotidos tal como se ilustra en la SEQ ID NO: 1 , o, por supuesto, tal como se ¡lustra en las SEQ I D NOS: 3, 5, 7, 9 y 1 1 , se considera que es una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención. La definición de condiciones estrictas, está dada por la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138: 267-284). Tm = [81.5°C + 16.6(log M)+0.41 (%GC) - 0.61 (%formamide) - 500/L]-1 °C/1 % mismatch En esta fórmula, M es la molaridad de cationes monovalentes; %GC es el porcentaje de nucleotidos guanosina y citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares de bases. Las condiciones estrictas son aquellas bajo las cuales las secuencias de ácido nucleico o fragmentos de las mismas todavía se hibridizan, aunque tengan una no coincidencia del 10%, cuando mucho, con la secuencia de ácido nucleico que se ilustra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9 u 1 1 . También, esta modalidad se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifica para un fragmento inmunogénico de esa proteína, que tienen un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 3 de cuando menos 90% . De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico tiene cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 3. Más preferiblemente, el nivel de homolog ía es del 98% o incluso del 100% . Asimismo, esta modalidad se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifican para un fragmento inmunogénico de esa proteína, que tienen un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 5 de cuando menos 90% . De preferencia, la secuencia de ácido nucleico q ue codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico, tiene la menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 5. I ncluso más preferiblemente, el nivel de homolog ía es del 98% o incluso del 100%. Asimismo, esta modalidad se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifican para un fragmento inmunogénico de esa proteína, que tiene un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7 de cuando menos 90%. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico, tiene al menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7. Más preferiblemente, el nivel de homología es del 98% o incluso del 100%. También, esta modalidad se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifican para un fragmento inmunogénico de esa proteína, que tiene un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 9 de cuando menos 90%. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico, tiene al menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, el nivel de homología es del 98% o incluso del 100%. Asimismo, esta modalidad se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de esa secuencia de ácido nucleico que codifican para un fragmento inmunogénico de esa proteína, que tiene un nivel de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 1 de cuando menos 90%.
De preferencia, la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicha secuencia de ácido nucleico, tiene cuando menos 92% , de preferencia 94%, más preferiblemente 96% de homología con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 1 1 . Más preferiblemente, el nivel de homología es del 98% o incluso del 1 00%. Puesto que la presente invención describe secuencias de ácido nucleico que codifican para nuevas proteínas de Lawsonia intracellularis, ahora por primera vez es posible obtener estas proteínas en cantidades suficientes. Esto se puede realizar, por ejemplo, utilizando sistemas de expresión para expresar los genes que codifican las proteínas. Por lo tanto, en una modalidad más preferida, la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la presente invención . Tales fragmentos de ADN pueden ser plásmidos, en los cuales se clona una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención . Tales fragmentos de ADN son útiles e.g. para incrementar la cantidad de ADN para utilizarse como cebador, tal como se describe más adelante. U n req uerimiento esencial para la expresión de la secuencia de ácido nucleico, es un promotor ligado de manera funcional con la secuencia de ácido nucleico, para que dicha secuencia quede bajo el control del promotor. Para los técnicos en la materia es obvio que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariótico, procariótico o viral , capaz de dirigir la transcripción génica en las células utilizadas como huésped para la expresión de la proteína. Por lo tanto, una forma incluso más preferida de esta modalidad , se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN o una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención , que se coloca bajo el control de un promotor ligado de manera funcional. Esto se puede obtener por medio de, por ejemplo, técnicas de biología molecular estándar (Maniatis/Sambrook (Sam brook, J . Molecular cloning: a laboratory manual, 1 989. ISBN 0-87969-309-6)). Los promotores ligados de manera funcional son promotores capaces de controlar la transcripción de las secuencias de ácido n ucleico con las cuales se ligan. Tales promotores pueden ser un promotor de Lawsonia, e.g . el promotor involucrado en la expresión in vivo del gen que codifica para las proteínas 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD ó 31 .4 kD, siempre y cuando el promotor sea funcional en la célula utilizada para la expresión. También puede ser un promotor heterólogo. Cuando la célula huésped es una bacteria, se pueden utilizar secuencias de control de expresión útiles, incluyendo el promotor y operador de Trp (Goedde, et al. , Nucí. Acids Res. , 8, 4057, 1980); el promotor y operador lac (Chang , et al. , Nature, 275, 61 5, 1978); el promotor de proteína de membrana externa (Nakamura , K. e Inouge, M. , EMBO J . , 771 -775, 1982), los promotores y operadores lambda de bacteriófago (Remaut, E. et al. , Nucí. Acids Res. , 1 1 , 4677-4688, 1983); el promotor y operador de la cc-amilasa (B. subtilis), secuencias de terminación y otras secuencias de intensificación de expresión y de control compatibles con la célula huésped seleccionada. Cuando la célula huésped es una levadura, las secuencias de control de expresión útiles incluyen , e.g . , el factor de a- apareamiento. Para células de insecto, se puede utilizar la polihedrina o promotores p1 0 de baculovirus (Smith , G. E. , et al. , Mol . Cell. Bíol . 3, 21 56-65, 1 983) . Cuando la célula huésped es de origen mamífero, las secuencias de control de expresión útiles ilustrativas incluyen el promotor SV-40 (Berman , P.W. et al. , Science, 222, 524-527, 1 983) o el promotor de la metalotioneína (Brinster, R. L. , Nature, 296, 39-42, 1982) o el promotor de choque térmico (Voellmy eí al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82, 4949-53, 1 985). Los sistemas de expresión bacterianos, de levadura , hongos, de células de insecto y de mamífero, son utilizados con mucha frecuencia. Tales sistemas son conocidos en la técnica y están generalmente disponibles en el comercio, e.g. en Clontech Laboratories, I nc. 4030 Fabián Way, Palo Alto, California 94303-4607, EUA. Después de estos sistemas de expresión, los sistemas de expresión basados en parásitos son sistemas de expresión muy atractivos. Tales sistemas se describen , e.g . en la Solicitud de Patente Francesa con No. de Publicación 2 714 074, y la Publicación Norteamericana NTIS No . US 08/0431 09 (Hoffman, S . y Rogers, W. : Fecha de publicación 1 de diciembre de 1 993). Una forma incluso más preferida de esta modalidad de la invención, se refiere a los Portadores Recombinantes Vivos (PRVs) que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD o un fragmento inmunogénico de la misma, de conformidad con la invención, un fragmento de ADN de conformidad con la invención o una molécula de ADN recombinante de conformidad con la invención . Tales vehículos son por ejemplo bacterias y virus. Estos PRVs son microorganismos o virus en los cuales se puede clonar información genética adicional, en este caso una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD o un fragmento inmunogénico de la misma, de conformidad con la presente invención. Los animales infectados con tales PRVs producirán una respuesta ¡nmunogénica no sólo contra los inmunógenos del portador, sino q ue también contra las partes inmunogénicas de las proteínas para las cuales se clonó adicionalmente el código genético en el PRV, e.g. , la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D , 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD . Como ejemplo de PRVs bacterianos, se pueden utilizar de manera atractiva cepas de Salmonelía atenuadas conocidas . Los parásitos portadores recombinantes vivos han sido descritos por Vermeulen , a. N . (Int. Journ. Parasitol. 28: 1 121 -1 130 (1 998)). Asimismo, se pueden utilizar virus PRV a manera de transporte de secuencias de ácido nucleico hacia el interior de una célula blanco. Los virus portadores recombinantes vivos también se denominan virus vectores. Los virus a menudo utilizados como vectores son los virus Vaccinia (Panicali ef al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 79: 4927 ( 1 982), Herpesvirus (E.P.A. 0473210A2) y Retrovirus (Valerio, D. et al. , en Baum, S.J. , Dicke, K.A. , Lotzova, E. y Pluznik, D. H. (Eds.), Experimental Haematology today - 1 988. Springer Verlag, Nueva York. págs. 92-99 ( 1 989)). La técnica de recombinación homologa in vivo, bien conocida en este campo, se puede utilizar para introducir una secuencia de ácido nucleico recombinante en el genoma de una bacteria, parásito o virus de elección, capaz de inducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico insertada de conformidad con la invención, en el animal huésped. Finalmente, otra forma de esta modalidad de la invención se refiere a una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de conformidad con la invención, a un fragmento de ADN que comprende tal secuencia de ácido nucleico o a un molécula de ADN recombinante que comprende tal secuencia de ácido nucleico, bajo el control de un promotor ligado de manera funcional. Esta forma también se refiere a una célula huésped que contiene un portador recombinante vivo que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31.4 kD o un fragmento de la misma, de conformidad con la invención. Una célula huésped puede ser una célula de origen bacteriano, e.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis y especies de Lactobacillus, en combinación con plásmidos basados en bacterias como pBR322 ó vectores de expresión bacteriana como pGEX, o con bacteriófagos. La céiuia huésped también puede ser de origen eucariótico, e.g . células de levadura, en combinación con moléculas vectores específicos de levadura, o células de insecto similares a células eucarióticas superiores (Luckow eí al. , Bio-technology 6: 47-55 (1988)), en combinación con vectores o baculovirus recombinantes, células de planta en combinación con e.g. vectores basados en el plásmido Ti o vectores virales de plantas (Barton, K.A. eí al. ; Cell 32: 1033 (1983), células HeLa similares a células de mamífero, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de Riñon Felino Crandell, también con vectores o virus recombinantes apropiados. Otra modalidad de la invención se refiere a nuevas proteínas y a fragmentos inmunogénicos de las mismas, de conformidad con la invención. El concepto de fragmentos inmunogénicos se describirá más adelante. Una forma de esta modalidad se refiere a proteínas de
Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos que se ¡lustra en la SEQ ID NO: 2 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. En una forma preferida, la modalidad se refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homolog ía de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente de 96% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la
SEQ ID NO: 2 y con los fragmentos inmunogénicos de tales proteínas.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98% o incluso del
100% . El nivel de homología de la proteína se puede determinar con el programa de computadora "BLAST 2 SEQUENCES", seleccionando el subprograma: "BLASTP", que se puede encontrar en el sitio web www. ncbi-nlm. nih.gov/blast/bl2seq/bi2. html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Matriz utilizada: "blosum62". Los parámetros utilizados son los parámetros por default:
Open gap: 1 1 . Extensión gap: 1 . Gap x_dropoff: 50. Otra forma de esta modalidad se refiere a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 4 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Una forma preferida se refiere a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 4 y con fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Se prefiere más un nivel de homología del 98% o incluso del 100%. Otra forma de esta modalidad se refiere a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos con una homología de cuando menos 90% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 6 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Una forma preferida se refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 6 y con fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Se prefiere más un nivel de homología del 98% o incluso del 100%. Otra forma de esta modalidad se refiere a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 8 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Una forma preferida se refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 8 y con fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Se prefiere más un nivel de homología del 98% o incluso del 100%. Otra forma de esta modalidad se refiere a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos con una homología de cuando menos 90% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 10 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Una forma preferida se refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 10 y con fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Se prefiere más un nivel de homología del 98% o incluso del 100%. Otra forma de esta modalidad se refiere a proteínas de
Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 12 y con fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Una forma preferida se refiere a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de cuando menos 92%, de preferencia 94%, más preferiblemente 96% con la secuencia de aminoácidos ¡lustrada en la SEQ ID NO: 12 y con fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Se prefiere más un nivel de homología del 98% o incluso del 1 00%. Se entenderá que, para las proteínas particulares abarcadas en la presente, pueden existir variaciones naturales entre cepas individuales de Lawsonia intracellularis. Estas variaciones se pueden demostrar por una o más diferencias en uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia global, o por deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más aminoácidos en dicha secuencia. Sustituciones de aminoácidos que esencialmente no alteran la actividad biológica e inmunologica han sido descritas, por ejemplo, por Neurath et al. en "The Proteins" Academic Press Nueva York (1979). Reemplazos de aminoácidos entre aminoácidos relacionados, o reemplazos que han ocurrido con frecuencia en la evolución, son Inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, He/Val (véase Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. , 1978, vol. 5, suppl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/He, Leu/Val y Ala/Glu. Basándose en esta información, Upan y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227, 1435-1441 , 1 985) y determinar la similitud funcional entre proteínas homologas. Tales sustituciones de aminoácidos de las modalidades de ejemplo de la presente invención, así como las variaciones que presenten deleciones y/o inserciones, están dentro de los alcances de la invención, en tanto las proteínas resultantes retengan su actividad inmunitaria. Esto explica por qué las proteínas de Lawsonia intracellularis de conformidad con la invención, cuando se aislan de diferentes aislamientos de campo, pueden tener niveles de homología de hasta 90%, mientras que todavía representan la misma proteína con las mismas características ¡nmunológicas. Estas variaciones en la secuencia de aminoácidos de cierta proteína de conformidad con la invención, que proporcionará una proteína capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra infecciones por Lawsonia intracellularis o al menos contra las manifestaciones clínicas de la infección, se considera que "no influencian esencialmente la inmunogenicidad". Cuando una proteína se emplea, e.g. , para propósitos de vacunación o para inducir anticuerpos, no es necesario utilizar la proteína completa. También es posible utilizar un fragmento de esa proteína que sea capaz, como tal o acoplado con un vehículo, tal como e.g. KLH, de inducir una respuesta inmunitaria contra esa proteína, a la cual se le denomina fragmento inmunogénico. Un "fragmento inmunogénico" se entiende que es un fragmento de la proteína de longitud completa que todavía retiene su capacidad de inducir una respuesta inmunitaria en el huésped; es decir, que comprende un epítopo para células B o células T. En la actualidad se dispone de una variedad de técnicas para identificar con facilidad fragmentos de ADN que codifican para fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito por Geysen et al. (Publicación Internacional de Patente WO 84/03564, Publicación Internacional de Patente WO 86/06487, Patente Norteamericana No. 4,833,092, Proc. Nat'l Acad. Scí. 81 :3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), denominado método PEPSCAN, es un método fácil de realizar, rápido y bien establecido, para la detección de epítopos, que son regiones inmunológicamente importantes de una proteína. El método se utiliza a nivel mundial y, como tal, es bien conocido para los técnicos en la materia. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopos de células B. Asimismo, dada la secuencia del gen que codifica para cualquier proteína, hay algoritmos de computadora que son capaces de designar algunos fragmentos de proteína específicos como epítopos inmunológicamente importantes, basándose en su concordancia secuencial y/o estructural con epítopos conocidos. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de hidrofilia según Hopp y Woods (Proc. Nat'l Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981 )), y los aspectos de la estructura secundaria de conformidad con Chow y Fasman (Advances ¡n Enzymology 47: 45-148 (1987) y la Patente Norteamericana No. US 4,554, 101 ). De manera similar, los epítopos de células T se pueden predecir a partir de la secuencia, por computadora, con la ayuda del criterio de anfifilia de Berzofsky (Science 235, 1 059-1 062 (1987) y Solicitud Norteamericana de Patente NTIS US 07/005,885). Una revisión condensada se encuentra en: Shan Lu, en fundamentos comunes: Tibtech 9: 238-242 (1991 ), Good et al. en Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu para una revisión; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzowsky para epítopos de HIV;
The FASEB Journal 5:2412-2418 (1991 ). Por lo tanto, una forma de todavía otra modalidad de la invención, se refiere a vacunas capaces de proteger cerdos contra infecciones por Lawsonia intracellularis, que comprenden una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas, de conformidad con la invención, tal como se describió anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todavía otra modalidad de la presente invención, se refiere a proteínas de conformidad con la invención para utilizarse en una vacuna. Todavía otra modalidad se refiere al uso de una proteína de conformidad con la invención, para la manufactura de una vacuna para combatir infecciones causadas por Lawsonia intracellularis. Una manera de preparar una vacuna de conformidad con la invención, es mediante la purificación bioquímica de las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de conformidad con la invención, a partir de bacterias obtenidas en exudados mucosales de la pared intestinal infectada. Sin embargo, esta es una manera muy tardada de preparar la vacuna. Por lo tanto, es mucho más conveniente utilizar los productos de expresión de los genes que codifican para las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas, de conformidad con la invención, en vacunas. Las secuencias de ácido nucleico de los genes que codifican para las proteínas 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD, se presentan en la presente invención. Tales vacunas, basadas en los productos de expresión de estos genes, se pueden preparar fácilmente mezclando una o más proteínas de conformidad con la invención, o fragmentos inmunogénicos de las mismas de conformidad con la invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se describe más adelante. Alternativamente, una vacuna de conformidad con la invención puede comprender portadores recombinantes vivos, como se describió anteriormente, capaces de expresar la proteína de conformidad con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma de conformidad con la invención. Tales vacunas, e.g . basadas en un portador de Salmonella o un portador viral que infecte el epitelio entérico, o e.g. el epitelio respiratorio, tienen la ventaja sobre las vacunas hechas con subunidades, de que imitan mejor la manera natural de infección de Lawsonia intracellularis. Además, su autopropagación es una ventaja, ya que sólo una pequeña cantidad del portador recombinante es necesaria para la inmunización. Todas las vacunas anteriormente descritas contribuyen a la vacunación activa; es decir, el sistema inmunitario del huésped es inducido por una o más proteínas de conformidad con la invención, o fragmentos inmunogénicos de las mismas, para fabricar anticuerpos contra estas proteínas. Alternativamente, tales anticuerpos se pueden inducir, por ejemplo, en conejos, o se pueden obtener a partir de líneas celulares productoras de anticuerpos, tal como se describirá más adelante. Tales anticuerpos, entonces, se pueden administrar al animal huésped. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la vacunación de elección cuando un animal ya está infectado, y no hay tiempo de permitir que se induzca una respuesta inmunitaria natural. También se prefiere el método para la vacunación de animales inmunocomprometidos. Los anticuerpos administrados contra Lawsonia ¡ntracellularis, en estos casos, pueden unirse directamente a las bacterias. Esto tiene la ventaja de que inmediatamente se disminuye o se detiene el crecimiento de Lawsonia ¡ntracellularis. Por lo tanto, otra forma de esta modalidad de la invención se refiere a vacunas que comprenden anticuerpos contra cualquiera de las seis proteínas de Lawsonia ¡ntracellularis de conformidad con la invención. Las vacunas también se pueden basar en células huésped tal como se describió anteriormente, que comprenden las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de conformidad con la invención. Una manera alternativa y eficiente de vacunación, es la vacunación directa con ADN que codifica para el antígeno relevante. La vacunación directa con ADN que codifica proteínas ha tenido éxito para numerosas proteínas distintas (tal como se revisa en e.g. Donnelly et al. , The Immunologist 2: 20-26 (1993)). Esta manera de vacunación es muy atractiva para la vacunación de cerdos contra la infección causada por Lawsonia ¡ntracellularis. Por lo tanto, otras formas de esta modalidad de la invención se refieren a vacunas que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de conformidad con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma de conformidad con la invención, y a vacunas que comprenden fragmentos de ADN que comprenden tales secuencias de ácido nucleico. Todavía otras formas de esta modalidad se refieren a vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinante de conformidad con la invención. Las vacunas de ADN se pueden administrar con facilidad mediante aplicación intradérmica, e.g . utilizando un inyector sin aguja. Esta vía de administración distribuye el ADN directamente en las células del animal por ser vacunado. Cantidades de ADN del orden de microgramos, entre 1 y 100 pg, proporcionan muy buenos resultados. En otra modalidad, la vacuna de conformidad con la presente invención adicionalmente comprende uno o más antígenos derivados de otros organismos y virus patógenos para cerdos, o la información genética que codifica para tales antígenos. Tales organismos y virus de preferencia se seleccionan del grupo que consiste de virus de la pseudorabia, virus de la influenza porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothríx rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae. Todas las vacunas de conformidad con la presente invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, e.g . , agua estéril o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más compleja, el vehículo puede ser, e.g. , una solución reguladora. Los métodos para la preparación de una vacuna comprenden la mezcla de una proteína de conformidad con la invención, o un fragmento inmunogénico de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las vacunas de conformidad con la presente invención pueden, en una presentación preferida, también contener un adyuvante. Los adyuvantes en general comprenden sustancias que refuerzan la respuesta inmunitaria del huésped, de una manera no específica. Un número de diferentes adyuvantes son conocidos en la técnica. Ejemplos de adyuvantes son el adyuvante completo e incompleto de Freund, la vitamina E, polímeros de bloques no iónicos, muramildipéptidos, Quill A®, aceite mineral e.g., Bayol® o Markol®, aceite vegetal y Carbopol® (que es un homopolímero) o Diluvac® Forte. La vacuna también puede comprender un denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto ai cual se adhiere el polipéptido, sin enlazarse covalentemente con él. Los compuestos de vehículo que a menudo se utilizan son, e.g., hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, sílice, kaolín y Bentonita. Una forma especial de tal vehículo, en el cual el antígeno está parcialmente embebido en el vehículo, es el denominado ISCOM (Patentes Europeas 109.942, EP 180.564, EP 242.380). Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos tensoactivos adecuados o emulsificantes, e.g., Span o Tween. A menudo, la vacuna se mezcla con agentes estabilizantes, e.g. para proteger polipéptidos susceptibles a degradación para que no sean degradados, para mejorar la vida de anaquel de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de la deshidratación por congelamiento. Los estabilizantes útiles son por ejemplo SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos, e.g. sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrán o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de las mismas, y soluciones reguladoras, tales como fosfatos de metales alcalinos. Además, la vacuna se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. No hace falta mencionar que otras maneras de adyuvar, agregar compuestos de vehículo o diluyentes, emulsificar o estabilizar un polipéptido, también están abarcadas en la presente invención. Las vacunas de conformidad con la invención, pueden, de manera muy adecuada, ser administradas en cantidades que varían entre 1 y 100 microgramos, aunq ue se pueden utilizar, en principio, cantidades menores. Una dosis que exceda los 100 microgramos será menos atractiva, aunque inmunológ icamente muy adecuada, por razones comerciales. Las vacunas basadas en portadores recombinantes atenuados, tales como los virus PRV y bacterias anteriormente descritas, se pueden administrar en dosis mucho más bajas, debido a que se multiplican ellas mismas durante la infección. Por lo tanto, cantidades muy adecuadas estarían en el rango entre 103 y 1 09 U FC/UFP para bacterias y virus, respectivamente. Se pueden aplicar m uchas maneras de administración. La administración oral es una manera muy atractiva de administración , debido a que la infección es una infección del tracto digestivo. Una manera preferida de administración oral es empacar la vacuna en cápsulas , conocidas y frecuentemente utilizadas en la técnica, que se desintegren sólo después de que hayan pasado el ambiente altamente ácido del estómago. Asimismo, la vacuna se podría mezclar con compuestos que en la técnica se sabe que mejoran temporalmente el pH del estómago. El sistema de aplicación también es adecuado, por ejemplo, por aplicación intramuscular de la vacuna. Si se sigue esta vía, son muy adecuados los procedimientos estándar conocidos en la técnica para aplicación sistémica. Desde un punto de vista de protección contra la enfermedad, es importante un diagnóstico rápido y correcto de la infección por Lawsonia intracellularis. Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la detección de una infección por Lawsonia intracellularis. Una prueba de diagnóstico para la detección de Lawsonia intracellularis, por ejemplo, se basa en la reacción de ADN bacteriano aislado del animal por ser probado, con sondas o cebadores de RCP específicos de las secuencias codificadoras de los genes que codifican para las proteínas 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD. Si hay presente ADN de Lawsonia intracellularis en el animal, éste específicamente se unirá a los cebadores de RCP específicos y subsecuentemente será amplificado en la reacción en cadena catalizada con polimerasa (RCP). El producto de la reacción de RCP, posteriormente, puede ser fácilmente detectado mediante una electroforesis en gel. El ADN puede ser fácilmente aislado de los microorganismos presentes, en hisopos tomados del tracto digestivo del animal por ser probado. Los libros de texto normales de RCP proporcionan métodos para determinar la longitud de los cebadores para reacciones de RCP selectivas con ADN de Lawsonia intracellularis. Con frecuencia se utilizan cebadores con una secuencia de nucleótidos de cuando menos 1 2 nucleótidos, pero cebadores de más de 15, de preferencia más de 1 8 nucleótidos, son algo más selectivos. Especialmente son muy aplicables cebadores con una longitud de cuando menos 20, de preferencia cuando menos 30 nucleótidos. Las técnicas de RCP se describen extensamente en (Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1 995)). Se prefieren secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de Lawsonia intracellularis, o partes de esas secuencias de ácido nucleico, con una longitud de cuando menos 12, de preferencia 1 5, más preferiblemente 1 8, incluso más preferiblemente 20, 22, 25, 30, 35 ó 40 nucleótidos, en ese orden de preferencia, en donde las secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas tienen una homolog ía de cuando menos 90% con la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 1 ó 3. Por lo tanto, también son parte de la invención. Tales secuencias de ácido nucleico se pueden utilizar como cebadores en reacciones de RCP, con el fin de incrementar la cantidad de ADN q ue codifican . Esto permite la rápida amplificación de secuencias nucleotídicas específicas para utilizarse como herramienta de diagnóstico, por ejemplo para la detección de Lawsonia en tejidos, tal como se indicó anteriormente. Otra prueba basada en ADN , se fundamenta en el crecimiento de material bacteriano obtenido a partir de un hisopo, seg uido por una purificación clásica de ADN , seguida por una hibridación clásica con fragmentos de ADN específicos de las proteínas 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD marcados radioactivamente o marcados con un color. Tanto las reacciones de CP como las de hibridación son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J . et al. , Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Así pues, una modalidad de la invención se refiere a una prueba de diagnóstico para la detección de ADN de Lawsonia intracellularis. Tal prueba comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la invención o un fragmento de la misma, que es específica para el ADN que codifica para la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31.4 kD. Un fragmento que es específico para ese ADN, se entiende que es un fragmento que, bajo condiciones comparables, se une mejor al ADN de Lawsonia intracellularis que el ADN de otra bacteria, debido a su mayor homología con el ADN de Lawsonia intracellularis, por ejemplo un cebador de cuando menos 12 nucleótidos, tal como se describió anteriormente. Una prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra Lawsonia Intracellularis en el suero, puede ser por ejemplo una prueba de ELISA en emparedado estándar simple, en la cual la proteína o fragmentos antigénicos de la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD de conformidad con la invención, se aplican como revestimiento a la pared de los pozos de una placa de ELISA. Un método para la detección de tales anticuerpos es por ejemplo la incubación de la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD o fragmentos antigénicos de las mismas, con suero proveniente de mamíferos a ser probados, seguido por e.g. la incubación con un anticuerpo marcado contra el anticuerpo de mamífero relevante. Después una reacción productora de color revela la presencia o ausencia de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Otro ejemplo de un sistema de prueba de diagnóstico es e.g. la incubación de una inmunoelectrotransferencia tipo Western (Western blot) que comprende la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD, o un fragmento antigénico de la misma, de conformidad con la invención, con un suero del mamífero por ser probado, seguido por un análisis de la inmunoelectrotransferencia. Así pues, otra modalidad de la presente invención se refiere a pruebas de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Tales pruebas comprenden una proteína o un fragmento de la misma de conformidad con la invención. Asimismo, la invención se refiere a métodos para la detección, en suero, de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis, en donde el método comprende la incubación del suero con la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD o fragmentos antigénicos de la misma, de conformidad con la invención. Una prueba de diagnóstico basada en la detección de material antigénico de las proteínas específicas 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD de Lawsonia intracellularis y, por lo tanto, adecuada para la detección de la infección por Lawsonia intracellularis, también puede ser una prueba de ELISA estándar. En un ejemplo de tal prueba, las paredes de los pozos de una placa de ELISA se reviste con anticuerpos dirigidos contra la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD. Después de incubar con el material por ser probado, se agregan a los pozos anticuerpos contra Lawsonia intracellularis marcados. Después, una reacción colorida revela la presencia del material antigénico de Lawsonia intracellularis. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a pruebas de diag nóstico para la detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis. Tales pruebas comprenden anticuerpos contra una proteína o un fragmento de la misma de conformidad con la invención. Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de los mismos de conformidad con la invención, expresados de la manera caracterizada anteriormente, se pueden utilizar para producir anticuerpos que pueden ser policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los mismos) . Si se desean anticuerpos policlonales, las técnicas para producir y procesar sueros policlonales son conocidas en este campo (e.g. , ayer y Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1 987). Los anticuerpos monoclonales que reaccionan contra el polipéptido de conformidad con la invención (o variantes o fragmentos de los mismos) de conformidad con la presente invención, se pueden preparar mediante la inmunización de ratones criados por técnicas también conocidas en este campo (Kohler y Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Los métodos para la producción a gran escala de anticuerpos de conformidad con la invención, también son conocidos en la técnica.
Tales métodos se basan en la clonación de (fragmentos de) la información genética que codifica para la proteína de conformidad con la invención, en un fago filamentoso para despliegue de fagos. Tales técnicas se describen por ejemplo en "Antibody Engineering Page", bajo el encabezado "filamentous phage display", en el sitio web http://aximt1 .imt. uni-marburg .de/~rek/aeppriaqe. ritmi., y en los documentos de revisión de Córtese, R. et al. , (1 994) en Trends Biotechn. 12: 262-267. , por Clackson, T. & Wells , J .A. ( 1 994) en Trends Biotechn . 1 2: 173-1 83, por Marks, J. D. et al. , (1992) en J. Biol. Chem., 267: 16007-1601 0, por Winter, G. et al. (1 994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. et al. , ( 1994) Biotechn . Adv. 1 2: 539-555. Subsecuentemente, los fagos se utilizan para seleccionar bibliotecas de expresión en camélidos, expresando anticuerpos de cadena pesada de camélidos ( uyldermans, S. y Lauwereys, M. , Journ. Molec. Recogn. 12: 131 -140 (1 999) y Ghahroudi, .A. et al. , FEBS Letters 414: 51 2-526 (1 997)) . Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados, se pueden replicar y subsecuentemente utilizar para la expresión a gran escala de anticuerpos. Todavía otra modalidad de la invención , se refiere a métodos para la detección del material antigénico de Lawsonia intracellularis, en donde el método comprende la incubación de suero, tejido o fluidos corporales, con anticuerpos contra la proteína 31 .0 kD, 24.8 kD, 76.7 D, 56.8 kD, 28.8 kD y 31 .4 kD, o un fragmento antigénico de la misma, de conformidad con la invención . Finalmente, una modalidad de la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de Lawsonia intracellularis, o partes de esas secuencias de ácido nucleico, que tienen una longitud de cuando menos 20, de preferencia 25, 30, 35 ó 40 nucleótidos, en ese orden de preferencia, en donde las secuencias de ácido nucleico o partes de las mismas tienen una homolog ía de cuando menos 90% con la secuencia de ácido nucleico que se ilustra en la SEQ I D NO: , 3, 5, 7, 9 u 1 1 . Tales secuencias de ácido nucleico se pueden utilizar como cebadores en reacciones de RCP, con el fin de aumentar la cantidad de ADN que codifica . Esto permite la rápida am plificación de secuencias de nucleótidos específicas para utilizarse como herramienta de diagnóstico, por ejemplo, para la detección de Lawsonia, en tejidos, tal como se indicó anteriormente. Ejemplos Ejemplo 1 : Aislamiento de L. intracellularis de íleons de cerdo infectados Se reunieron íleons infectados por L. intracellularis, confirmado por histopatolog ía y por tinción ácido-resistente de Ziehl-Neelsen, de cerdos que murieron con EP, y se almacenaron a -80°C. Después de descongelar, se aislaron bacterias L. intracellularis de raspados mucosaíes tomados de la pared intestinal infectada. Los raspados de íleon se homogeneizaron repetidas veces en PBS, en una licuadora para liberar las bacterias intracelulares, de la manera descrita por Lawson et al. (Vet. Microbiol . 1 0: 303-323 (1 985)). El sobrenadante obtenido después de una centrifugación a baja velocidad para remover los restos celulares, se filtró a través de filtros de 5.0, 3.0, 1 .2 y 0.8 m (Millipore) . El filtrado, posteriormente, se centrifugó a 8000 g , durante 30 minutos, obteniéndose una pequeña pella de bacterias L. intracellularis. Estas bacterias se purificaron adicionalmente con el uso de un gradiente de Percoll . La identidad de las bacterias purificadas se ensayó por RCP (Jones eí al. , J . Clin. Microbiol. 31 : 261 1 -261 5 (1 993)), mientras que la pureza de las bacterias aisladas (>95%) se ensayó por microscopía de contraste de fases, para revelar cualquier bacteria contaminante o restos intestinales presentes. Tinciones bacterianas y plásmidos Se adquirió la cepa huésped E. coli BL21 starf DE3) que conten ía el vector pLysSrare y el plásmido pET22b, en Novagen Madison, Wisconsin , EUA. Se construyó el plásmido pET-H IS 1 (1 ) de la manera descrita en Schaller eí al. , Microbiology 145: 2105-21 16 ( 1 999). Se adquirió la cepa de E. coli TOP 10F' en I nvitrogen (Groningen, Los Países Bajos). Todos los concentrados de las cepas bacterianas, q ue contenían 30% de glicerol, se almacenaron a -70°C. Se aislaron células de Lawsonia intracellularis de los íleons infectados de la manera anteriormente descrita. Medios de cultivo, soluciones reguiadoras y antibióticos Se preparó caldo Luria Bertani (LB) de conformidad con los procedimientos estándar. Se prepararon placas de LB fundiendo medio LB + 1 .5% de agar en un horno de microondas, de conformidad con los procedimientos estándar. Las placas se vaciaron después de enfriar la solución a 45°C y, si era necesario, se adicionó ampicilina (ACS-Dophar, Raamsdonksveer, Los Países Bajos). Se adquirió isopropil-p-D- tiogalactopiranósido (IPTG) en Biosynth Ag (Síaad, Suiza). Amplificación por RCP La amplificación por reacción en cadena catalizada con polimerasa (RCP) se realizó utilizando un sistema de RCP Geneamp 9700 (Applied Biosystems, California, EUA). La RCP se llevó a cabo con el Sistema de RCP de Alta Fidelidad Expand (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). La mezcla de RCP conten ía 52 U/mL de Mezcla Enzimática de Alta Fidelidad Expand, solución reguladora HF Expand con Mg CI2 2.5 mM, d NTPs 16 mm (Promega, Wisconsin, EUA), 20 pmoles de cebadores y 15 ng de ADN cromosómico de Lawsonia intracellularis como plantilla. Todos los cebadores utilizados para la am plificación del ADN se listan en la Tabla 1 . Aislamiento de ADN Con el fin de obtener ADN cromosómico de Lawsonia altamente purificado , se preparó ADN con el uso de un paquete de aislamiento de ADN cromosómico Biorad (Biorad, Veenendaal, Los Países Bajos), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Secuenciación de ADN El ADN fue secuenciado en un secuenciador automático ABI 31 0 (Perkin Elmer, California , EUA) . La mezcla de secuencias contenía: 1 00 ng de prod ucto de RCP, 2 p L de mezcla de reacción lista con terminador (Perkin Elmer, California, EUA), 2.4 pmoles de cebador, 6 pL de solución reg uladora (Tris HCI 200 mM, pH 8.5; MgCI2 5 mM) y agua destilada hasta 20 pL. Esta mezcla se sometió a ciclos en un equipo Geneamp 9700. El programa estuvo compuesto de 25 ciclos con 10 segundos a 96°C, 5 segundos a 50°C y 2 minutos a 60°C. Los productos de la secuencia de ciclos se purificaron en columnas Dye-Ex (Qiagen Inc. , California, EUA) según las instrucciones del fabricante, y se aplicaron a un secuenciador automático ABI 310. Las secuencias resultantes se reunieron utilizando el Software de Colección ABI 310 versión 1.0.4 (Perkin Elmer, California, EUA) y se analizaron con el programa Sequence Analysis versión 3.1 (Perkin Elmer, California, EUA). Las alineaciones se realizaron con el programa Sequence Navigator versión 1 .0.1 (Perkin Elmer, California, EUA). El análisis de secuencia se realizó utilizando el Secuenciador 4.1 .4 (GeneCodes Ann Arbor, CA, EUA). Ligamiento y Transformación Los ligamientos se realizaron en 1 x de solución reguladora de ligamiento, con 1 unidad de enzima ligadora (Gibco BRL Life Technologies, Inc. , EUA) a 16°C durante una noche. 1 pL de la reacción de ligamiento se transformó en células de E. cotí competentes, por choque térmico. Las células de E. coli competentes de cepa BL21 star(DE3) y las células de E. coli de cepa TOP10F' se hicieron competentes por un método de aniatis/Sambrook, utilizando las soluciones reguladoras TFB1 (KOAc 30 mM, RbCI 100 mM, CaCI2 10 m , MnCI2 50 mM, glicerol 1 5%) y TFB2 (RbCI 1 0 mM, CaCI2 75 mM, MES 10 mM, glicerol 15%). Después de 1 hora de recuperación en medio SOC suplementado con MgS04 10 mM y glucosa 20 mM, a 37°C, las células se inocularon en placas de medio LB con los antibióticos apropiados.
Expresión de las proteínas de fusión 10xHIS La cepa de E. coli BL21 star(DE3) que contenía el plásmido pLysSrare y el vector de expresión, se cultivó durante una noche a 37°C, a 200 rpm, en 5 ml_ de LB con ampicilina. El cultivo de una noche se diluyó 1 : 1 00 en 50 mL de medio LB con ampicilina. Este cultivo se hizo crecer bajo las mismas condiciones, hasta que la D060o alcanzara un valor de 0.5, medida en un espectrofotómetro Novaspecl l (Pharmacia, Woerden, Los Países Bajos) . En este punto (t=0), el cultivo fue inducido con I PTG a una concentración final de 1 mM y continuó creciendo durante otras 3 horas (t=3). Se tomaron muestras de 100 pL para análisis. La cepa de E. coli BL21 star(DE3) que contenía el plásmido pLysSrare, se cultivó y se indujo bajo las mismas condiciones y se tomaron muestras como controles negativos. Las muestras se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS) , seguida por una tinción con azul brillante de Coomassie, de la manera que se describe a continuación. El resto del cultivo se centrifugó a 5, 000 rpm y la pella se almacenó a -20°C hasta su futuro uso. Electroforesis en gel de poliacrilam ida e inmunoelectrotransferencia tipo Western La EGPA-DSS se realizó empleando geles Bis-Tris 4-12% en un sistema de electroforesis NuPAGE (Novex, San Diego, EUA). Antes de la separación, las muestras se sometieron a ebullición durante 5 minutos con la solución reguladora de muestra (muestra/solución reguladora = 2: 1 ) en presencia de ß-mercaptoetanol. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie o se sometieron a inmunoelectrotransferencia en una membrana Immobulon-P (Millipore, Bedford, EUA) mediante los procedimientos estándar de inmunoelectrotransferencia tipo Western en condiciones semideshidratadas. Se obtuvo un suero policlonal anti-Lawsonia de pollo contra una preparación de células completas en n-GNE (agua/aceite = 45:55). Se obtuvo suero E2-839 de un cerdo que había desarrollado signos clínicos y lesiones post mortem típicas de una infección por L. intracellularis. Los sueros se sometieron a una adsorción previa utilizando un volumen igual de extractos celulares crudos de la cepa de E. coli BL21 star(DE3) que contenía el vector pLysSrare, a 4°C durante 4 horas. Tabla 1. Cebadores util izados para la amplificación y clonación de los genes de Lawsonia intracellularis.
tamaño gen cebador de avance cebador de retroceso del producto de RCP
1 1 CATGCCATGGATAGTAATAATGATTCAATGATTA CGCGGATCCTTATTTTGGAGATGTTGACA 750 pb
3 CATGCCATGGCTAAAAAATTACTCTTTACTTC CGCGGATCCGAAAGGCCAGAGGGTATCCA 692 pb
5 CATGCCATGGCTTCGATCAATACACTTTTCGG CGCGGATCCCTG I I I I AAAGAAAGTAAAG 21 17 pb
7 CATGCCATGGCTAGGGTTACCCACCAATCAAT CGCGGATCCAATGTA I I I I GTTAAATTTA 1577 pb
9 CATGCCATGGCTATTTCATTAAATAATTCATC CGCGGATCCCGCCAGAATACGCTGTGTTG 779 pb
1 CATGCCATGGCTTCTTTGGTCATTAACAACAA CGCGGATCCGCCACTAATGAGTTGGCTTG 884 pb Tabla 2. Revisión de plásmidos que comprenden los genes de Lawsonia ¡ntracellularis clonados.
gen vector de sitios de masa plásmido expresión T7 clonación molecular calculada SEQ ID NO: 11 pET22b A/col Bam \ 30.7 kDa pET 31.4
SEQ ID NO: 3 PETHIS1 Nco\ Bam \ 26.4 kDa pET 24.8
SEQ ID NO: 5 PETHIS1 Ncol BamHl 78.3 kDa pET 76.7
SEQ ID NO: 7 pETHIS1 Ncol BamHl 58.4 kDa pET 56.8
SEQ ID NO: 9 pETHIS1 Ncol BamHl 28.8 kDa pET 28.8
SEQ ID NO: 1 pETHIS1 Ncol BamHl 32.6 kDa pET 31.0
Resultados Clonación de genes de Lawsonia en vectores de expresión basados en T7 Se amplificaron genes de Lawsonia por RCP utilizando los cebadores que se listan en la Tabla 1. Los productos de RCP obtenidos se sometieron a digestión con el uso de las enzimas de restricción Ncol y BamHl. Los productos de RCP digeridos, subsecuentemente, se ligaron al plásmido pET22b ó pET-HIS1 que habían sido cortados con las mismas dos enzimas de restricción, tal como se indica en la Tabla 2. Las mezclas ligadas se transformaron en células de E. coli TOP10F y se incubaron durante una noche a 37°C. Las transformantes putativas se verificó que tuvieran el plásmido correcto, utilizando RCP de colonias. Esto dio como resultado 6 diferentes plásmidos de expresión. Estos plásmidos se verificaron mediante un análisis de secuencia de nucleótídos y las secuencias fueron como las esperadas, con base en la estrategia de clonación. Expresión de genes de Lawsonia del promotor T7 en Escherichia coli
Todos los plásmidos listados en la Tabla 2 se probaron con respecto a la producción de proteína recombinante. Los plásmidos se transformaron en células BL21 star(DE3) pLysSrare y se realizó una inducción. Los cultivos inducidos se analizaron por EGPA-DSS y por tinción con azul brillante de Coomassie (ABC) (Figura 1 ). Los seis genes produjeron una suficiente expresión en células de E. coli BL21 star(DE3) pLysSrare. Se alcanzaron niveles de expresión de 150 pg/mL. Análisis de productos de expresión por inmu noeiectrotransferencia tipo western Los productos de expresión se analizaron por inmunoeiectrotransferencia tipo Western (Western blot), utilizando suero de pollos vacunados con células completas de Lawsonia y suero de un cerdo que mostró signos clínicos y lesiones post mortem típicas de L. intracellularis (Figura 2). Las proteínas de Lawsonia recombinantes fueron identificadas positivamente por los sueros de pollo y de cerdo. Leyendas de las Figuras Fig. 1 . Análisis de la sobreexpresión de genes de Lawsonia intracellularis en Escherichia coli BL21 STAR/pLysSRARE por NuPAGE. Carril 1 , marcador de peso molecular; carril 2, pET76.7 T=0; carril 3, pET76.7 T=3; carril 4, pET56.8 T=0; carril 5, pET56.8 T=3; carril 6, pET24.8 T=0; carril 7, pET24.8 T=3; carril 8, pET28.8 T=0; carril 9, pET28.8 T=3; carril 10, pET31.0 T=0; carril 1 1 , pET31.0 T=3; carril 12, pET31 .4 T=0; carril 13, pET31 .4 T=3; carril 14, T=3 sin vector de expresión . Las flechas indican la ubicación de los productos de expresión. Fig . 2. Inmunoelectrotransferencia tipo Western de los productos de expresión de genes de Lawsonia intracellularís en Escherichia coli BL21 STAR/pLysSRARE. Carril 1 , pET31 .4; carril 2, pET28.8; carril 3, pET31 .0; carril 4, pET24.8; carril 5, pET76.7; carril 6, pET56.8; carril 7 sin vector de expresión. Las flechas indican la ubicación de los productos de expresión.