CN1849334A

CN1849334A - 胞内劳森氏菌亚单位疫苗

Info

Publication number: CN1849334A
Application number: CNA200480026174XA
Authority: CN
Inventors: P·韦尔梅杰
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2006-10-18
Also published as: WO2005026200A3; MXPA06002850A; US7662390B2; EP1664100B1; BRPI0413857A; WO2005026200A2; US20060286118A1; JP4773962B2; KR20060129163A; ATE450545T1; EP1664100A2; JP2007527706A; DK1664100T3; ES2335668T3; AU2004272246A1; DE602004024423D1; CA2536989A1

Abstract

本发明涉及编码新型胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)蛋白质的核酸序列。本发明还涉及包含这些序列的DNA片段、重组DNA分子、和活体重组载体。本发明还涉及包含这些核酸序列、DNA片段、重组DNA分子、和活体重组载体的宿主细胞。此外，本发明涉及由这些核酸序列编码的蛋白质及其用于制造疫苗的用途。本发明还涉及用于抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗及其制备方法。最后，本发明涉及用于检测胞内劳森氏菌DNA以及检测胞内劳森氏菌抗原和针对胞内劳森氏菌的抗体的诊断性测试。

Description

胞内劳森氏菌亚单位疫苗

发明领域

本发明涉及编码新型胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)蛋白质的核酸序列，包含这些序列的DNA片段、重组DNA分子、和活体重组载体，包含这些核酸序列、DNA片段、重组DNA分子、和活体重组载体的宿主细胞，由这些核酸序列编码的蛋白质及其用于制造疫苗的用途，用于抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗及其制备方法，以及用于检测胞内劳森氏菌DNA、用于检测胞内劳森氏菌抗原、和用于检测针对胞内劳森氏菌的抗体的的诊断性测试，等等。

发明背景

猪增生性肠病(PPE或PE)已经在世界范围成为现代猪养殖业的一种重要疾病。它影响15％-50％的成长畜群，和确认存在问题的畜群中高达30％的动物个体。目前，每头病猪的额外饲料和设备时间成本的年度经济损失估算是5-10美元。PPE是临床症候相差很大的一组慢性和急性病况(死亡、苍白和贫血、流口水、暗红或鲜红腹泻、萎靡、食欲降低和不愿移动、生长迟缓、和FCR升高)。然而，存在两种一致的特征。第一种是只在尸检时才看得见的病理学变化，即小肠和结肠粘膜变厚。第二种是病肠的肠细胞中存在胞质内小型弯曲细菌。这些细菌现在已经确认是PPE的病因，而且已经命名为胞内劳森氏菌。

几年来，已经发现胞内劳森氏菌侵袭近乎所有动物，包括猴、兔、雪貂、仓鼠、狐狸、马，并广至鸵鸟和鸸鹋等其它动物。胞内劳森氏菌是有鞭毛的革兰氏阴性细菌，只在真核肠细胞中繁殖，尚无无细胞培养的描述。为了在细胞中驻扎和繁殖，胞内劳森氏菌必需穿透分隔的囊细胞。细菌结合细胞膜，并经由进入性液泡快速进入肠细胞。然后这个进入液泡快速破裂(3小时内)，而细菌开始活跃并在胞质中自由繁殖。尚未理解细菌致使受感染细胞不能成熟、继续进行有丝分裂、并形成发育不全囊细胞的机制。

目前对胞内劳森氏菌感染的理解、对该疾病的治疗和控制由于无法在无细胞培养基中培养胞内劳森氏菌这一事实而受阻。虽然有在大鼠肠细胞中成功共培养胞内劳森氏菌的报导，但是这尚未导致用于抗击胞内劳森氏菌的灭活疫苗的开发，尽管显然需要这样的疫苗。

本发明的一个目的是提供用于抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗。

现在令人惊讶的发现胞内劳森氏菌产生六种新型蛋白质，它们能够单独或联合诱导针对胞内劳森氏菌的保护性免疫。

将这些新型蛋白质称为31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白。它们的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12中。编码这些蛋白质的基因已经测序，它们的核酸序列显示于SEQID NO：1、3、5、7、9和11中。

本领域众所周知，许多不同的核酸序列能够编码同一种蛋白质。这种现象常常称为每个编码氨基酸的三联体中第二个、并且尤其是第三个碱基的摇摆现象。该现象可以导致异源性约30％的两种核酸序列仍然编码相同的蛋白质。因此，序列同源性约70％的两种核酸序列仍然能够编码同一种蛋白质。

由此，本发明的一个实施方案涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，其中所述核酸序列或其部分与SEQ ID NO：1所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：1所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选95％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

核苷酸同源性水平可以使用计算机程序“BLAST 2 SEQUENCES”、选择子程序“BLASTN”测定，所述程序可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html上找到。该程序的一篇参考文献是：Tatiana A.Tatusova、Thomas L.Madden，FEMSMicrobiol.Letters 174：247-250，1999。所用参数是默认参数：匹配奖分+1，错配罚分：-2，开放缺口：5，延伸缺口：2，缺口x_dropoff50。

用于判定某种核酸序列是否是依照本发明的核酸序列的另一种方法涉及所述核酸序列是否与SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：3、5、7、9、或11，见下文)所示核苷酸序列在严谨条件下确能杂交的问题。若核酸序列与SEQ ID NO：1、或者SEQ ID NO：3、5、7、9、或11所示核苷酸序列在严谨条件下杂交，则认为它是依照本发明的核酸序列。

严谨条件的定义是由Meinkoth和Wahl(1984。固定在固相支持物上的核酸的杂交(Hybridization of nucleic acids immobilized onsolid supports)。Anal.Biochem.138：267-284)的公式得出的。

Tm＝[81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L]-1℃/1％错配

在该公式中，M指单价阳离子的摩尔浓度；％GC指DNA中鸟苷和胞苷的百分比；L指杂合体的碱基对长度。

严谨条件指核酸序列或其片段与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、或11中任一所示核酸序列有至多10％错配时仍然发生杂交的那些条件。

此实施方案还涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它与SEQ ID NO：3所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：3所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案还涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它与SEQ ID NO：5所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：5所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案还涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它与SEQ ID NO：7所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：7所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案还涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它与SEQ ID NO：9所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：9所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案还涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列和编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它与SEQ ID NO：11所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。

优选的是，编码所述胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其部分与SEQ ID NO：11所示核酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的同源性。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

因为本发明公开了编码新型胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列，现在第一次有可能获得足够量的这些蛋白质。这可以通过例如使用表达系统来表达编码所述蛋白质的基因来进行。因此，在一个更优选的实施方案中，本发明涉及包含依照本发明的核酸序列的DNA片段。这些DNA片段可以是例如其中克隆了依照本发明的核酸序列的质粒。这些DNA片段可用于例如增加DNA的量，如下文所述用作引物。

表达核酸序列的一项必要条件是将核酸序列与合适的启动子功能性相连，使得所述核酸序列处于该启动子的控制下。对于本领域技术人员显而易见的是，启动子的选择可延伸至能够在用作蛋白质表达宿主细胞的细胞中指导基因转录的任何真核、原核、或病毒启动子。

因此，此实施方案的一种甚至更优选的形式涉及包含依照本发明的DNA片段或核酸序列且其处于功能性相连的启动子控制之下的重组DNA分子。这可以通过例如标准分子生物学技术(Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.，《分子克隆：实验室手册》Molecular Cloning：alaboratory manual，1989，ISBN 0-87969-309-6))来获得。功能性相连的启动子指能够控制相连的核酸序列转录的启动子。这种启动子可以是劳森氏菌启动子，例如参与编码31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、或31.4kD蛋白之基因的体内表达的启动子，只要该启动子在用于表达的细胞中有功能即可。它还可以是异源启动子。当宿主细胞是细菌时，可以使用的有用表达控制序列包括Trp启动子和操纵子(Goeddel等，Nucl.Acids Res.8：4057，1980)、lac启动子和操纵子(Chang等，Nature 275：615，1978)、外在膜蛋白启动子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBO J.1：771-775，1982)、λ噬菌体启动子和操纵子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.11：4677-4688，1983)、α-淀粉酶(枯草芽孢杆菌)启动子和操纵子，以及与所选宿主细胞相容的终止序列和其它表达增强和控制序列。当宿主细胞是酵母时，有用的表达控制序列包括例如α-交配因子。对于昆虫细胞而言，可以使用杆状病毒的多角体蛋白或p10启动子(Smith，G.E.等，Mol.Cell.Biol.3：2156-2165，1983)。当宿主细胞是哺乳动物来源的细胞时，例示性的有用表达控制序列包括SV40启动子(Berman，P.W.等，Science 222：524-527，1983)或金属硫蛋白启动子(Brinster，R.L.，Nature 296：39-42，1982)或热休克启动子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4949-4953，1985)。

细菌、酵母、真菌、昆虫和哺乳动物细胞表达系统是极其频繁使用的系统。这些系统在本领域是众所周知的，而且通常可以通过商业途径例如Clontech Laboratories公司(费边路4030号，帕洛阿尔托，加利福尼亚州94303-4607，美国)获得。在这些表达系统之外，基于寄生虫的表达系统是非常有吸引力的表达系统。这些系统描述于例如公开号为2 714 074的法国专利申请和美国NTIS公开号US 08/043109(Hoffman，S.和Rogers，W.，公开日期1993年12月1日)。

本发明此实施方案的一种甚至还要更优选的形式涉及包含编码本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其免疫原性片段的核酸序列、依照本发明的DNA片段、或依照本发明的重组DNA分子的活体重组载体(LRC)。这些载体是例如细菌和病毒。这些LRC是其中已克隆了额外遗传信息的微生物或病毒。在本案中，所述额外遗传信息指编码本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。受到这些LRC感染的动物将产生免疫原性应答，不仅针对于载体的免疫原，还针对于其遗传密码额外地克隆到LRC中的蛋白质(例如31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白)的免疫原性部分。作为细菌LRC的示例，可以使用本领域已知的沙门氏菌减毒株。活体重组载体寄生虫等已被描述于Vermeulen，A.N.，Int.J.Parasitol.28：1121-1130，1998。同样，可以使用LRC病毒作为将核酸序列运输到靶细胞内的途径。活体重组载体病毒也称为载体病毒。常用作载体的病毒有牛痘病毒(Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927，1982)、疱疹病毒(E.P.A.0473210A2)、和逆转录病毒(Valerio，D.等；Baum，S.J.、Dicke，K.A.、Lotzova，E.、和Pluznik，D.H.编，《今日实验血液学》(Experimental Haematology Today)，1988年，Springer Verlag，纽约，第92-99页，1989年)。

可以使用本领域众所周知的体内同源重组技术将重组核酸序列导入所选细菌、寄生虫、或病毒的基因组，从而能够诱导所插入的本发明核酸序列在宿主动物中表达。

最后，本发明此实施方案的另一种形式涉及包含编码本发明蛋白质的核酸序列、包含这种核酸序列的DNA片段、或包含处于功能性相连的启动子控制下的所述核酸序列的重组DNA分子的宿主细胞。这种形式还涉及包含活体重组载体的宿主细胞，所述活体重组载体包含编码依照本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其片段的核酸。宿主细胞可以是细菌起源的细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和乳酸杆菌物种，并联合基于细菌的质粒像pBR322或细菌表达载体像pGEX或是联合噬菌体。宿主细胞还可以是真菌起源的，例如联合酵母特异性载体分子的酵母细胞，或是联合载体或重组杆状病毒的高等真核细胞，像昆虫细胞(Luckow等，Bio-technology 6：47-55，1988)，联合例如基于Ti质粒的载体或植物病毒载体的植物细胞(Barton，K.A.等，Cell 32：1033，1983)，同样联合适当载体或重组病毒的哺乳动物细胞，像Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、或Crandell猫肾细胞。

本发明的另一个实施方案涉及依照本发明的新型蛋白质及其免疫原性片段。

免疫原性片段的概念将在下文中定义。

此实施方案的一种形式涉及具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段等。

在一种优选的形式中，此实施方案涉及与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

蛋白质同源性水平可以使用计算机程序“BLAST 2 SEQUENCES”、并选择子程序“BLASTP”测定，所述程序可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html上找到。该程序的一篇参考文献是：Tatiana A.Tatusova、Thomas L.Madden，FEMSMicrobiol.Letters 174：247-250，1999。所用矩阵是“blosum62”。所用参数是默认参数：开放缺口：11，延伸缺口：1，缺口x_dropoff 50。

此实施方案的另一种形式涉及具有与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段等。

一种优选的形式涉及与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案的另一种形式涉及具有与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段，等等。

一种优选的形式涉及与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案的另一种形式涉及具有与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段，等等。

一种优选的形式涉及与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案的另一种形式涉及具有与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段，等等。

一种优选的形式涉及与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

此实施方案的另一种形式涉及具有与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段，等等。

一种优选的形式涉及与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列具有至少92％、优选94％、更优选96％的序列同源性的所述胞内劳森氏菌蛋白质及其免疫原性片段。甚至更优选98％或甚至100％的同源性水平。

可以理解，对于本文所涵盖的具体蛋白质而言，单个胞内劳森氏菌菌株之间可以存在天然变异。这些变异可以表现为整个序列中的氨基酸差异，或是所述序列中氨基酸的缺失、替代、插入、倒置、或添加。基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸替代描述于例如Neurath等，《蛋白质》(The Proteins)，Academic出版社，纽约，1979。相关氨基酸之间的氨基酸取代或进化中频繁发生的取代特别地有Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(参阅Dayhof，M.D.，蛋白质序列和结构集(Atlas of proteins sequence and structure)，Nat.Biomed.Res.Found.，华盛顿特区，1978，第5卷，增刊3)。其它氨基酸替代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val、和Ala/Glu。根据这一信息，Lipman和Pearson开发了用于快速且灵敏的比较蛋白质(Science 227：1435-1441，1985)并测定同源蛋白质之间功能相似性的方法。本发明例示性实施方案的这种氨基酸替代以及具有缺失和/或插入的变化属于本发明的范围之内，只要由此得到的蛋白质保持了它们的免疫反应性即可。这解释了为何由不同野外隔离种群分离得到的本发明胞内劳森氏菌蛋白质可能具有约90％的同源性水平、但仍然代表具有相同免疫学特征的相同蛋白质。如果依照本发明的某种蛋白质中存在氨基酸序列的变异，但是提供的蛋白质仍然能够诱发针对胞内劳森氏菌感染或至少针对该感染的临床表现的免疫应答，那么认为那些变异“基本上不影响免疫原性”。

在将蛋白质用于例如接种目的或用于制备抗体时，并不需要使用完整的蛋白质。使用能够就这样或在偶联载体(诸如例如KLH)后诱发针对所述蛋白质的免疫应答的所述蛋白质之片段，即所谓的免疫原性片段，也是可能的。“免疫原性片段”理解为仍然保留其在宿主中诱发免疫应答的能力、即包含B或T细胞表位的全长蛋白质之片段。目前，有多种技术可用于容易的鉴定编码抗原性片段(决定簇)的DNA片段。由Geysen等(专利申请WO 84/03564；专利申请WO 86/06487；美国专利NR.4,833,092；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002，1984；J.Imm.Meth.102：259-274，1987)描述的方法(即所谓的PEPSCAN法)易于执行，是快速检测表位(即蛋白质中的免疫学重要区域)的完善方法。该方法在世界范围得到使用，而且在本领域技术人员中同样是众所周知的。这种(经验)方法尤其适合于检测B细胞表位。同样，在给出编码任何蛋白质的基因序列后，计算机算法能够根据其与目前已知的表位在序列和/或结构上的一致性指出特定蛋白质片段是免疫学上重要的表位。这些区域的确定基于的是依照Hopp和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：38248-3828，1981)的亲水性标准和依照Chou和Fasman(Advances in Enzymology 47：45-148，1987；美国专利4,554,101)的二级结构方面的综合。同样可以使用计算机借助Berzofsky氏两亲性标准(Science 235：1059-1062，1987；美国专利申请NTIS US 07/005,885)由序列预测T细胞表位。其简明综述参见：关于一般原理，Shan和Lu，Tibtech 9：238-242，1991；关于Malaria表位，Good等，Science 235：1059-1062，1987；关于回顾，Lu，Vaccine 10：3-7，1992；关于HIV表位，Berzowsky，The FASEB Journal 5：2412-2418，1991。

因此，本发明另一个实施方案的一种形式涉及能够保护猪免于胞内劳森氏菌感染的疫苗，它包含一种或多种上文所述依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段以及制药学可接受载体。

本发明的另一个实施方案涉及用于疫苗的本发明蛋白质。

本发明的另一个实施方案涉及依照本发明的蛋白质用于制造抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗的用途。

生产依照本发明的疫苗的一种方法是由取自受感染肠壁的粘膜拭样获得细菌，并通过生物化学方法由细菌纯化依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段。然而，这种生产疫苗的方法非常费时。

因此，在疫苗中使用编码依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段的基因的表达产物要方便得多。本发明列出了编码31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的基因的核酸序列。

通过混合一种或多种依照本发明的蛋白质或依照本发明的其免疫原性片段以及下文所述制药学可接受载体，可以容易的生产基于这些基因表达产物的疫苗。

或者，依照本发明的疫苗可以包含上文所述能够表达本发明蛋白质或其依照本发明的免疫原性片段的活体重组载体。例如基于感染肠上皮或例如呼吸道上皮的沙门氏菌载体或病毒载体的这种疫苗具有优于亚单位疫苗的优势，即它们更好的模拟了胞内劳森氏菌感染的天然途径。此外，它们的自主繁殖也是优势，因为免疫只需要少量的重组载体。

上文所述疫苗都促成主动接种，即宿主的免疫系统受到一种或多种依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段的触发而生成针对这些蛋白质的抗体。或者，可以在例如兔中制备这些抗体，或者可以如下所述由生成抗体的细胞系获得这些抗体。然后，可以对宿主动物施用这些抗体。这种接种方法即被动接种是动物已受到感染且没有时间来触发天然免疫应答时的接种选择。它也是给无免疫应答动物接种的优选方法。在这些情况中，所施用的针对胞内劳森氏菌的抗体直接结合细菌。这具有立即降低或终止胞内劳森氏菌生长的优势。因此，本发明此实施方案的一种形式涉及包含针对依照本发明的六种胞内劳森氏菌蛋白中任一种的抗体的疫苗。

疫苗还可以基于如上所述的宿主细胞，其中包含依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段。

接种的一种有效的变通方法是直接接种编码相关抗原的DNA。直接接种编码蛋白质的DNA已经在许多不同蛋白质中获得成功(有关综述参见例如Donnelly等，The Immunologist 2：20-26，1993)。这种接种方法对于对猪进行针对胞内劳森氏菌感染的接种而言非常诱人。因此，本发明此实施方案的另外一些形式涉及包含编码依照本发明的蛋白质或其依照本发明的免疫原性片段的核酸序列的疫苗，以及包含含有所述核酸序列的DNA片段的疫苗。此实施方案的另外一些形式涉及包含依照本发明的重组DNA分子的疫苗。例如可以使用无针头注射器通过皮内施用而容易的施用DNA疫苗。这种施用方法将DNA直接投递至待接种动物的细胞内。1-100微克范围的DNA量就能提供很好的效果。

在另一个实施方案中，依照本发明的疫苗额外包含一种或多种衍生自其它猪致病性生物体和病毒的抗原或编码这些抗原的遗传信息。这些生物体和病毒优选选自下组：假狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、可传染的胃肠炎病毒、轮状病毒、埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、和大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。

依照本发明的所有疫苗都包含制药学可接受载体。制药学可接受载体可以是例如无菌水或无菌生理盐溶液。在一种更复杂的形式中，载体可以是例如缓冲液。

用于制备疫苗的方法包括将依照本发明的蛋白质或其免疫原性片段与制药学可接受载体混合。

依照本发明的疫苗在优选的形式中还包含佐剂。佐剂通常包含以非特异方式增强宿主免疫应答的物质。本领域知道许多不同的佐剂。佐剂的实例有弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、Quill A^、矿物油例如Bayol^或Markol^、植物油、Cambopol^(一种均聚物)、或Diluvac^Forte。疫苗中还可以包含所谓的“载体”。载体指多肽与之附着而非共价结合的化合物。常用的载体化合物有例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、硅石、高岭土、和斑脱土。这种载体的一种具体形式是所谓的ISCOM(EP 109.942；EP180.564；EP 242.380)中，其中抗原部分包埋在载体中。另外，疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂，例如Span或Tween。通常，将疫苗与稳定剂混合，例如用于保护倾向于降解的多肽免于降解、延长疫苗的保存期、或提高冻干效率。有用的稳定剂有SPGA(Bovarnik等，J.Bacteriology 59：509，1950)；碳水化合物，例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷、或葡萄糖；蛋白质，诸如清蛋白或酪蛋白或其降解产物；和缓冲剂，诸如碱金属磷酸盐，等等。另外，可以将疫苗悬浮于生理学可接受的稀释剂中。

无需多言，本发明还包含辅助、添加载体化合物或稀释剂、乳化或稳定多肽的其它方法。

依照本发明的疫苗可以在1-100微克的数量范围内非常合适的施用，尽管原则上可以使用更少的剂量。超过100微克的剂量尽管在免疫学上很合适，但出于商业原因而不太诱人。

可以以低得多的剂量施用基于活体减毒重组载体(诸如上文所述LRC病毒和细菌)的疫苗，因为它们在感染过程中自我繁殖。因此，非常合适的用量范围将是10³-10⁹CFU(细菌)或PFU(病毒)。

可以执行许多施用方法。口服是非常诱人的施用方法，因为该感染是消化道感染。口服施用的一种优选方法是将疫苗包装到本领域知道且频繁使用的只在经过高度酸性的胃环境后崩解的胶囊中。同样，可以将疫苗与本领域知道的可暂时提高胃pH的化合物混合。全身施用也是合适的，例如通过疫苗的肌肉内施用。如果这种路径是允许的，那么本领域知道的用于全身施用的标准流程是非常合适的。

从针对疾病的保护作用这个角度看，快速且正确诊断胞内劳森氏菌感染是重要的。因此，本发明的另一个目的是提供适于检测胞内劳森氏菌感染的诊断工具。

用于检测胞内劳森氏菌的诊断性测试基于例如由待测动物分离的细菌DNA与特异探针或PCR引物的反应，所述探针或引物基于的是编码31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的基因的编码序列。若动物中存在胞内劳森氏菌DNA，则它将例如与特异PCR引物特异性结合并随后将在PCR反应中扩增。然后可以在DNA凝胶电泳中容易的检测PCR反应产物。DNA可以非常容易地由取自待测动物的消化道的拭样中存在的微生物中分离。标准PCR教科书中给出了给胞内劳森氏菌DNA的选择性PCR反应确定引物长度的方法。常常使用具有至少12个核苷酸的核苷酸序列的引物，但是超过15个、更优选18个核苷酸的引物在某种程度上选择性更高一些。尤其是长度为至少20个、优选至少30个核苷酸的引物通常非常适用。PCR技术详尽描述于Dieffenbach和Dreksler，《PCR引物，实验室手册》(PCR primers，alaboratorymanual)，ISBN 0-87969-447-5，1995。因此，编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其长度至少为12个、优选15个、更优选18个、以此顺序甚至更优选20、22、25、30、35、或40个核苷酸的部分(其中所述核酸序列或其部分与SEQ ID NO：1或3所示核酸序列具有至少90％的同源性)，也是本发明的一部分。这些核酸序列可以在PCR反应中作为引物使用，以增加它们所编码的DNA的量。这可使得快速扩增特异核苷酸序列以作为诊断工具使用，例如用于例如如上所述在组织中检测劳森氏菌。

另一种基于DNA的测试依据的是由拭样获得的细菌材料的生长，随后是经典的DNA纯化，然后再是与放射性或显色标记的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白特异性DNA片段的经典杂交。PCR反应和杂交反应二者在本领域都是众所周知的，而且特别地描述于Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等，《分子克隆：实验室手册》Molecular cloning：a laboratory manual，ISBN 0-87969-309-6)。

由此，本发明的一个实施方案涉及用于检测胞内劳森氏菌DNA的诊断性测试。这种测试包括依照本发明的核酸序列或其对编码31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的DNA特异的片段。对所述DNA特异的片段被理解为由于与胞内劳森氏菌DNA有更高同源性、因而在可比条件下与胞内劳森氏菌DNA的结合比与其它细菌DNA的结合更好的片段，例如如上所述至少12个核苷酸的引物。

用于检测血清中的胞内劳森氏菌抗体的诊断性测试可以是例如简单的标准夹心ELISA测试，其中将依照本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段包被在ELISA板的孔壁上。用于检测这些抗体的一种方法是例如将31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段与来自待测试哺乳动物的血清一起保温，随后例如与针对相关哺乳动物抗体的已标记抗体一起保温。然后显色反应可以揭示针对胞内劳森氏菌的抗体的存在与否。诊断性测试系统的另一个实例是例如将包含依照本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段的Western印迹与待测试哺乳动物的血清一起保温，随后分析印迹。

因此，本发明的另一个实施方案涉及用于检测针对胞内劳森氏菌的抗体的诊断性测试。这种测试包括依照本发明的蛋白质或其片段。

同样，本发明涉及用于检测血清中针对胞内劳森氏菌的抗体的方法，其中所述方法包括将血清与依照本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段一起保温。

基于检测胞内劳森氏菌抗原的特异31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的抗原性物质、因而适于检测胞内劳森氏菌感染的诊断性测试还可以是例如标准ELISA测试。在这种测试的一个实例中，用针对31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的抗体包被ELISA平板的孔壁。与待测材料一起保温后，向孔中加入已标记的抗胞内劳森氏菌抗体。然后显色反应揭示存在来自胞内劳森氏菌的抗原性物质。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于检测胞内劳森氏菌抗原性物质的诊断性测试。这种测试包括针对依照本发明的蛋白质或其片段的抗体。

如上所述表达的依照本发明的多肽或其免疫原性片段可以用于生成抗体，可以是多克隆的、单特异性的、或单克隆的抗体(或其衍生物)。如果想要多克隆抗体，那么用于生成和处理多克隆血清的技术在本领域是众所周知的(例如Mayer和Walter编，《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology)，Academic出版社，伦敦，1987)。可以通过本领域众所周知的技术(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497，1975)，通过免疫近交小鼠来制备针对本发明多肽(或其变体或片段)有反应性的本发明单克隆抗体。

用于大规模生产本发明抗体的方法在本领域也是众所周知的。这种方法依赖于在用于噬菌体展示的丝状噬菌体中克隆编码本发明蛋白质的遗传信息(的片段)。这种技术特别地描述于http：//aximtl.imt.uni-marburg.de/～rek/aepphage.html中“filamentous phage display”(丝状噬菌体展示)下的“AntibodyEngineering Page”(抗体工程网页)，以及下述综述性论文中：Cortese，R.等，Trends Biotechn.12：262-267，1994；Clackson，T.和Wells，J.A.，Trends Biotechn.12：173-183，1994；Marks，J.D.等，J.Biol.Chem.267：16007-16010，1992；Winter，G.等，Annu.Rev.Immunol.12：433-455，1994；和Little，M.等，Biotechn.Adv.12：539-555，1994。随后将噬菌体用于筛选表达骆驼化(camelid)重链抗体的骆驼化表达文库(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.，J.Mol.Recogn.12：131-140，1999；和Ghahroudi，M.A.等，FEBS Letters414：512-526，1997)。可以扩增文库中表达期望抗体的细胞，随后用于大规模表达抗体。

本发明的另一个实施方案涉及用于检测胞内劳森氏菌抗原性物质的方法，其中所述方法包括将血清、组织、或体液与针对本发明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段的抗体一起保温。

最后，本发明的一个实施方案涉及编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或其长度为至少20个、以此顺序优选25、30、35、或40个核苷酸的部分，其中所述核酸序列或其部分与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、或11所示核酸序列具有至少90％的同源性。这些核酸序列可以在PCR反应中作为引物使用，以增加它们所编码的DNA的量。这可使得快速扩增特异核苷酸序列以作为诊断工具使用，用于例如如上所述检测组织中的劳森氏菌。

实施例

实施例1：由受感染的猪的回肠分离胞内劳森氏菌

由死于PE的猪采集通过组织病理学和抗酸Ziehl-Neelsen染色确认受胞内劳森氏菌感染的回肠，并保存于-80℃。解冻后，由取自受感染肠壁的粘膜拭样分离胞内劳森氏菌。如Lawson等，Vet.Microbiol.10：303-323，1985所述，将回肠拭样在通用匀浆器中在PBS中反复匀浆，以释放细胞内细菌。将低速离心除去细胞碎片后得到的上清液通过5.0、3.0、1.2、和0.8μm滤器(Millipore)过滤。随后将滤出液以8000g离心30分钟，得到胞内劳森氏菌的少量沉淀。使用Percoll梯度进一步纯化这些细菌。通过PCR评估已纯化的细菌的身份(Jones等，J.Clin.Microbiol.31：2611-2615，1993)，通过相差显微术评估分离的细菌的纯度(＞95％)，以显示存在的任何污染性细菌或肠碎片。

细菌菌株和质粒

携带载体pLysSrare和质粒pET22b的大肠杆菌宿主菌株BL21star(DE3)购自Novagen(麦迪逊，威斯康星州，美国)。pET-HIS1(1)如Schaller等，Microbiology 145：2105-2116，1999所述构建。大肠杆菌菌株TOP10F′购自Invitrogen(格罗宁根，荷兰)。含30％甘油的所有细菌菌株原种保存于-70℃。

如上所述由受感染的回肠材料分离胞内劳森氏菌细胞。

培养基、缓冲液和抗体

依照标准流程制备LB培养基。依照标准流程制备LB平板，即在微波炉中熔化LB培养基+1.5％琼脂，待溶液冷却至45℃后倒入平板，根据需要添加氨苄青霉素(ACS-Dophar，Raamsdonksveer，荷兰)。异丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)购自Biosynth Ag(Staad，瑞士)。

PCR扩增

使用Geneamp 9700PCR系统(Applied Biosystems，加利福尼亚州，美国)进行PCR扩增。使用Expand高保真PCR系统(RocheDiagnostics GmbH，曼海姆，德国)进行PCR。PCR混合液中含有：52U/mlExpand高保真酶混合液、含2.5mM MgCl₂的Expand HF缓冲液、16mM dNTP(Promega，威斯康星州，美国)、20pmol引物、和15ng胞内劳森氏菌染色体DNA作为模板。用于扩增DNA的所有引物列于表1。

DNA分离

为了获得高度纯化的劳森氏菌染色体DNA，使用Biorad染色体DNA分离试剂盒(Biorad，Veenendaal，荷兰)依照制造商的说明书制备DNA。

DNA测序

在ABI 310自动化测序仪(Perkin Elmer，加利福尼亚州，美国)上对DNA进行测序。测序混合液含有：100ng PCR产物、2μl终止物预制反应混合液(Perkin Elmer，加利福尼亚州，美国)、2.4pmol引物、6μl缓冲液(200mM Tris-HCl pH8.5；5mM MgCl₂)和水至20μl。将此混合液在Geneamp 9700上进行循环。程序是：96℃10秒钟、50℃5秒钟、60℃2分钟，25个循环。使用Dye-Ex柱(Qiagen，加利福尼亚州，美国)依照制造商的说明书纯化测序循环产物，并在ABI 310自动化测序仪上运行。使用1.0.4版ABI 310 Collection Software采集软件(Perkin Elmer，加利福尼亚州，美国)采集测序结果，并使用3.1版Sequence Analysis序列分析软件(Perkin Elmer，加利福尼亚州，美国)进行分析。使用1.0.1版Sequence Navigator(序列导航软件)(Perkin Elmer，加利福尼亚州，美国)进行比对。使用4.1.4版Sequencer(序列分析软件)(GeneCodes，安阿伯，加利福尼亚州，美国)进行序列分析。

连接和转化

在含1单位连接酶(Gibco BRL Life Technologies，美国)的1x连接缓冲液中于16℃进行连接过夜。通过热休克用1μl连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。通过Maniatis/Sambrook的方法，使用缓冲液TFB1(30mM KOAc、100mM RbCl、10mM CaCl₂、50mM MnCl₂、15％甘油)和TFB2(10mM RbCl、75mM CaCl₂、10mM MES、15％甘油)使BL21star(DE3)大肠杆菌感受态细胞和TOP10F′大肠杆菌感受态细胞处于感受态。在补充10mM MgSO₄和20mM葡萄糖的SOC培养基中于37℃恢复1小时后，将细胞涂布在含合适抗生素的LB平板上。

10xHIS融合蛋白的表达

将携带pLysSrare和表达载体的大肠杆菌菌株BL21star(DE3)在5ml含氨苄青霉素的LB中于37℃以200rpm培养过夜。将过夜培养物在50ml含氨苄青霉素的LB中1∶100稀释。将培养液在相同条件下培养，直至在NovaspecII分光光度计(Pharmacia，Woerden，荷兰)上测量OD₆₀₀达到0.5。此时(t＝0)用终浓度1mM的IPTG诱导培养物，并继续培养3个小时(t＝3)。取100μl样品用于分析。在相同条件下培养和诱导携带pLysSrare的大肠杆菌菌株BL21star(DE3)，并采集样品作为阴性对照。如下所述，通过SDS-PAGE及后续考马斯亮蓝染色分析样品。将剩余培养物以5000rpm离心，并将沉淀保存于-20℃直至下一步使用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹

使用来自NuPAGE电泳系统(Novex，圣迭戈，美国)的4-12％Bis-Tris凝胶进行SDS-PAGE。分离前，将样品与含β-巯基乙醇的加样缓冲液(样品∶缓冲液＝2∶1)一起煮沸5分钟。将凝胶用考马斯亮蓝染色，或通过标准半干Western印迹流程转印到Immobulon-P膜(Millipore，贝德福德，美国)上。鸡抗劳森氏菌多克隆血清是针对n-GNE(水∶油＝45∶55)中的全细胞制剂制备的。血清E2-839是由显示典型的胞内劳森氏菌感染临床症候和死后损伤的猪获得的。将血清用等体积的携带载体pLysSrare的BL21star(DE3)粗制细胞提取物于4℃预吸收4小时。

基因	正向引物	反向引物	PCR产物长度
基因	正向引物	反向引物	PCR产物长度	1135791	CATGCCATGGATAGTAATAATGATTCAATGATTACATGCCATGGCTAAAAATTACTCTTTACTTCCATGCCATGGCTTCGATCAATACACTTTTCGGCATGCCATGGCTAGGGTTACCCACCAATCAATCATTGGCGCCATATTTCATTAAATAATTCATCCATGCCATGGCTTCTTTGGTCATTAACAACAA	CGCGGATCCTTATTTTGGAGATGTTGACACGCGGATCCGAAAGGCCAGAGGGTATCCACGCGGATCCCTGTTTTAAAGAAAGTAAAGCGCGGATCCAATGTATTTTGTTAAATTTACGCGGATCCCGCCAGAATACGCTGTGTTGCGCGGATCCGCCACTAATGAGTTGGCTTG	750bp692bp2117bp1577bp779bp884bp

表1：用于扩增和克隆胞内劳森氏菌基因的引物

基因	T7表达载体	克隆位点	计算分子量	质粒
基因	T7表达载体	克隆位点	计算分子量	质粒	SEQ ID NO：11SEQ ID NO：3SEQ ID NO：5SEQ ID NO：7SEQ ID NO：9SEQ ID NO：1	pET22bpETHIS1pETHIS1pETHIS1pETHIS1pETHIS1	NcoI BamHINcoI BamHINcoI BamHINcoI BamHINcoI BamHINcoI BamHI	30.7kDa26.4kDa78.3kDa58.4kDa28.8kDa32.6kDa	pET31.4pET24.8pET76.7pET56.8pET28.8pET31.0

表2：包含克隆的胞内劳森氏菌基因的质粒一览表

结果

在基于T7的表达载体中克隆劳森氏菌基因

使用表1所列引物，通过PCR扩增劳森氏菌基因。用限制酶NcoI和BamHI消化得到的PCR产物。随后将消化后的PCR产物连接到事先用表2所列相同的两种酶切割的pET22b或pET-HIS1中。用连接混合液转化大肠杆菌TOP10F，并于37℃保温过夜。通过菌落PCR对假定的转化子检查正确的质粒。由此得到6个不同的表达质粒。通过核苷酸序列分析检查这些质粒，而且序列与基于克隆策略的预期一致。

在大肠杆菌中由T7启动子表达劳森氏菌基因

对表2所列的所有质粒测试重组蛋白生成。用质粒转化BL21star(DE3)pLysSrare，并进行诱导。通过SDS-PAGE凝胶电泳和CBB染色分析诱导培养物(图1)。所有六种基因在大肠杆菌BL21star(DE3)pLysSrare中都进行充分表达。表达水平达到150μg/ml。

通过Western印迹分析表达产物

使用经劳森氏菌全细胞接种的鸡的血清和来自显示典型的胞内劳森氏菌临床症候和死后损伤的猪的血清，通过Western印迹分析表达产物(图2)。用鸡和猪血清确实鉴定出了重组劳森氏菌蛋白。

附图说明

图1：胞内劳森氏菌基因在大肠杆菌BL21STAR/pLys SRARE中过度表达的NuPAGE分析

第1道，分子量标志；第2道，pET76.7T＝0；第3道，pET76.7T＝3；第4道，pET56.8T＝0；第5道，pET56.8T＝3；第6道，pET24.8T＝0；第7道，pET24.8T＝3；第8道，pET28.8T＝0；第9道，pET28.8T＝3；第10道，pET31.0T＝0；第11道，pET31.0T＝3；第12道，pET31.4T＝0；第13道，pET31.4T＝3；第14道，T＝3，无表达载体。

箭头指示表达产物的位置。

图2：胞内劳森氏菌基因在大肠杆菌BL21STAR/pLysSRARE中的表达产物的Western印迹分析

第1道，pET31.4；第2道，pET28.8；第3道，pET31.0；第4道，pET24.8；第5道，pET76.7；第6道，pET56.8；第7道，无表达载体。

箭头指示表达产物的位置。

序列表

<110>AKZO Nobel N.V.

<120>胞内劳森氏菌亚单位疫苗

<130>2003.xxx

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1004

<212>DNA

<213>胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)

<220>

<221>CDS

<222>(55)..(939)

<400>1

tggtatatcc attgcatgat ttatggtaac caaccatttc aggaggtttg ccat atg 57

Met

1

tct ttg gtc att aac aac aac atg atg gct gca aat gca gcc cgt aac 105

Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg Asn

5 10 15

ctc aat gaa agt tat tca cga ctt agc caa tca aca aga cgt cta tct 153

Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu Ser

20 25 30

tct gga ctt cgt gtt ggg aca gca gct gat gat tca gca ggg ctt gct 201

Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu Ala

35 40 45

att aga gaa ctt atg cga gcc gat att aaa aca ttt caa caa ggt gca 249

Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly Ala

50 55 60 65

aga aat gca aat gat gct att tca tta gta caa gtt gca gat ggg gca 297

Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly Ala

70 75 80

cta ggt gtt ata gat gaa aag ctt atc cga atg aaa gag ctt gct gaa 345

Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala Glu

85 90 95

caa gct gct aca ggt act tat aat tca aca caa cgc ttg att att gaa 393

Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile Glu

100 105 110

tct gaa tat caa gca atg gct tca gaa att aca cgt att tct gtt gca 441

Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val Ala

115 120 125

aca gaa ttt aat ggt ata aaa tta tta gat ggt tct cta tct gga cct 489

Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly Pro

130 135 140 145

cat aaa gga act aat cta caa caa aca gga gct cta aga gta cat ttt 537

His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His Phe

150 155 160

ggt cca ggg aat agt tca gca gaa gac tat tat gaa att agc ata cat 585

Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile His

165 170 175

tcc gct aca gct tct gca cta ggc ctt gga aat gga act act ggt cct 633

Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly Pro

180 185 190

ggt gct aca atc tct act caa gct gca gca caa gca gcg tta gac gcc 681

Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Ala

195 200 205

atc aat gat gct atc gtt tct aaa gat aat att cgt gct agc ctt ggt 729

Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu Gly

210 215 220 225

acg cta caa aat agg tta gaa gca aca att aca aac tta aat acc caa 777

Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr Gln

230 235 240

gct gaa aac ctc cag gct gca gaa tca cga att tct gat ata gac gtt 825

Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp Val

245 250 255

tca aca gaa atg act gaa ttt gta aga aat caa att tta aca caa tct 873

Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln Ser

260 265 270

gga gta gca atg ctt tca cag gca aac tca ctg cca aag atg gca agc 921

Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala Ser

275 280 285

caa ctc att agt ggc taa tccatcacta cataatatgg ttaaggcaga 969

Gln Leu Ile Ser Gly

290

ccaaagacac atggcttgga ggaaagaagt tgttg 1004

<210>2

<211>294

<212>PRT

<213>胞内劳森氏菌

<400>2

Met Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala

85 90 95

Glu Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile

100 105 110

Glu Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val

115 120 125

Ala Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly

130 135 140

Pro His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile

165 170 175

His Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly

180 185 190

Pro Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp

195 200 205

Ala Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu

210 215 220

Gly Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr

225 230 235 240

Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp

245 250 255

Val Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln

260 265 270

Ser Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala

275 280 285

Ser Gln Leu Ile Ser Gly

290

<210>3

<211>764

<212>DNA

<213>胞内劳森氏菌

<220>

<221>CDS

<222>(25)..(717)

<400>3

acgctaacgt attggaaacc catt atg aaa aaa tta ctc ttt act tca ggc 51

Met Lys Lys Leu Leu Phe Thr Ser Gly

1 5

tgt att ctt att tta aca ggt tgt tct gct cca aac aaa act cct gtt 99

Cys Ile Leu Ile Leu Thr Gly Cys Ser Ala Pro Asn Lys Thr Pro Val

10 15 20 25

gtt gct cct cct ata aca cct cct cca gca tat gta gaa cct gaa gac 147

Val Ala Pro Pro Ile Thr Pro Pro Pro Ala Tyr Val Glu Pro Glu Asp

30 35 40

tcc tat agt aat cct ggc tct ctt tac tca tct gct gaa tct gat ggt 195

Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Ser Asp Gly

45 50 55

ctt ttt gct gat act cgt gct cga cgt gta ggt gat att gtt atg gta 243

Leu Phe Ala Asp Thr Arg Ala Arg Arg Val Gly Asp Ile Val Met Val

60 65 70

aaa att gta gaa aat aat act gct aaa aat aaa gca gat aca aca gct 291

Lys Ile Val Glu Asn Asn Thr Ala Lys Asn Lys Ala Asp Thr Thr Ala

75 80 85

gat aaa aaa act gca aat aca tac gga att gat gcg ttt ttt ggt aga 339

Asp Lys Lys Thr Ala Asn Thr Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Gly Arg

90 95 100 105

caa tat att ggt gga gga tca aca aaa att cct gta ggt agt gtt gct 387

Gln Tyr Ile Gly Gly Gly Ser Thr Lys Ile Pro Val Gly Ser Val Ala

110 115 120

ttt gat aca acc tct gaa agt gga acc act agt aca gga gaa aca aaa 435

Phe Asp Thr Thr Ser Glu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Gly Glu Thr Lys

125 130 135

cgt gaa gga gct ata aat gga aca att gct gct cgt gta tta cga gtt 483

Arg Glu Gly Ala Ile Asn Gly Thr Ile Ala Ala Arg Val Leu Arg Val

140 145 150

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Met Pro Gly Gly Leu Leu Glu Ile Glu Gly Val Arg Glu Thr Arg Val

155 160 165

aat aat gaa aca cag tat att gtt atc aca gga ctt ata cga cca atg 579

Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Ile Val Ile Thr Gly Leu Ile Arg Pro Met

170 175 180 185

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Asp Ile Glu Pro Asp Asn Ser Ile Met Ser Asn Arg Ile Ser Asp Ala

190 195 200

aaa att gct tat tat ggt caa ggt gtt ctt tcc gag aaa caa aaa cct 675

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205 210 215

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Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met Asp Thr Leu Trp Pro Phe

220 225 230

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<210>4

<211>230

<212>PRT

<213>胞内劳森氏菌

<400>4

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1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Gly Val Leu Ser Glu Lys Gln Lys Pro Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met

210 215 220

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225 230

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<213>胞内劳森氏菌

<220>

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1

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5 10 15

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20 25 30 35

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55 60 65

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70 75 80

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85 90 95

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100 105 110 115

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135 140 145

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150 155 160

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165 170 175

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180 185 190 195

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215 220 225

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230 235 240

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245 250 255

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260 265 270 275

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280 285 290

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295 300 305

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310 315 320

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325 330 335

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340 345 350 355

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375 380 385

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390 395 400

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405 410 415

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420 425 430 435

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470 475 480

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485 490 495

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520 525 530

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535 540 545

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550 555 560

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565 570 575

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580 585 590 595

ggt gat aat agt ata gct aaa gaa ctt gct gac ctt gct aca aaa gaa 1879

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600 605 610

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615 620 625

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645 650 655

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660 665 670 675

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<213>胞内劳森氏菌

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165 170 175

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180 185 190

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Ile Asp Lys Leu Asp Ala Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Glu Val Asn

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500 505 510

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

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Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ser Ile Thr Gly Val Asn Leu Asp Glu Glu

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Leu Ile Thr Thr Ala Asp Gln Met Leu Gln Thr Leu Leu Ser Leu Lys

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Gln

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140 145

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150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300 305

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310 315 320

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Asn Ser Glu Val Ile Val Ser Pro Gly Pro Pro Ser Thr Ser Thr Ala

325 330 335

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Arg Leu Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Met Asp Ile Gly Ser Ala Asp Thr

340 345 350

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390 395 400

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420 425 430

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470 475 480

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500 505 510

tct atg att atg cag tta aat tta aca aaa tac att taa tctattacta 1641

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515 520 525

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Arg Phe Glu Lys Asp Glu Thr Ile Pro Pro Ala Ala Asp Leu Asn Tyr

180 185 190

Gln Trp Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Gln Thr Ala Thr Ile Pro

195 200 205

Ala Gly Gly Arg Glu Ile Thr Ile Gly Gly Ala Val Val Thr Val Pro

210 215 220

Ala Pro Ala Thr Thr Asn Val Thr Ala Phe Asp Pro Asp Lys Pro Leu

225 230 235 240

Gly Asp Thr Asn Gly Ser Leu Leu Tyr Val Arg Pro Thr Ala Ile Tyr

245 250 255

Gln Gly Ser Asp Asn Asn Ser Lys Pro Ile Val Asp Arg Tyr Gly Thr

260 265 270

Val Pro Met Pro Pro Leu Asn Thr Asn Thr Val Gly Thr Phe Ser Asp

275 280 285

Asn Val Val Val Lys Phe Pro Asn Gly Val Asp Leu Ser Thr Pro Gly

290 295 300

Ser Phe Asp Phe Ser Tyr Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Thr Ala

305 310 315 320

Gly Asn Ser Glu Val Ile Val Ser Pro Gly Pro Pro Ser Thr Ser Thr

325 330 335

Ala Arg Leu Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Met Asp Ile Gly Ser Ala Asp

340 345 350

Thr Thr Ser Pro Asn Asn Thr Ile Pro Pro Asp Gly Gln Leu Ile Leu

355 360 365

Arg Pro Gln Arg Thr Asp Leu Ser Phe Glu Ile Met Glu Gly Gln Asn

370 375 380

Ile Thr Val Thr Asn Val Gly Lys Asp Ile Phe Gly Gly Ile Tyr Ser

385 390 395 400

Thr Asn Gly Ser Ser Asn Leu Glu Pro Met Phe Gly Gln Asn Asp Gly

405 410 415

Arg Asn Leu Phe Glu Thr Val Gly Asn Leu Ile Ala Tyr Thr Glu Thr

420 425 430

Asn Asn Gln Glu Gly Ile Ala Asn Ala Leu Lys Asp Leu Glu Leu Ala

435 440 445

Gln Lys Asn Ile Leu Thr Gln Ala Ala Arg Ile Gly Gly Lys Glu Asn

450 455 460

Arg Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ala Leu Asp Thr Asn Lys Tyr Asp Gln

465 470 475 480

Thr Gln Arg Leu Ser Gly Val Glu Asp Ala Asp Leu Thr Glu Leu Val

485 490 495

Ser Arg Leu Ala Gln Gln Gln Met Ala Tyr Ser Thr Ile Leu Lys Ser

500 505 510

Ser Ser Met Ile Met Gln Leu Asn Leu Thr Lys Tyr Ile

515 520 525

<210>9

<211>902

<212>DNA

<213>胞内劳森氏菌

<220>

<221>CDS

<222>(63)..(842)

<400>9

ctttagtaaa tacagtgact atactataat atataaatta ataaattttg gagaagacta 60

tc atg att tca tta aat aat tca tca att caa ata cca caa caa aat 107

Met Ile Ser Leu Asn Asn Ser Ser Ile Gln Ile Pro Gln Gln Asn

1 5 10 15

ata gaa gaa agt acc tca caa gaa gta act tcc tcc tct ggt gga caa 155

Ile Glu Glu Ser Thr Ser Gln Glu Val Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gln

20 25 30

cct gct aaa gtt gat ggt gta tca atc caa gcc cct aag gct cct gtt 203

Pro Ala Lys Val Asp Gly Val Ser Ile Gln Ala Pro Lys Ala Pro Val

35 40 45

act tct gca gct agt aac tta gaa gga gta cag caa aga gaa gct caa 251

Thr Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Gly Val Gln Gln Arg Glu Ala Gln

50 55 60

gaa aat gtt aca aaa atg ggc tta cct gag cta tca gct cct aaa ggt 299

Glu Asn Val Thr Lys Met Gly Leu Pro Glu Leu Ser Ala Pro Lys Gly

65 70 75

ggt ggt tat gtt cag tca aca gca gct atg ttt gca gaa gtt aca gtt 347

Gly Gly Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Met Phe Ala Glu Val Thr Val

80 85 90 95

gat gct atg aat cag caa cgt aaa gct gcg caa gac gta caa aat agt 395

Asp Ala Met Asn Gln Gln Arg Lys Ala Ala Gln Asp Val Gln Asn Ser

100 105 110

gct ctt gaa gga atg gtt aat aag atg ctg gaa gca gct aaa gat ata 443

Ala Leu Glu Gly Met Val Asn Lys Met Leu Glu Ala Ala Lys Asp Ile

115 120 125

aaa gaa caa tct aaa tta atg atg ggg tta ggt ata gca agt tct gtt 491

Lys Glu Gln Ser Lys Leu Met Met Gly Leu Gly Ile Ala Ser Ser Val

130 135 140

atg acc act gca atg gga ttt ggg ggt act ata ggt ggt gta aaa agt 539

Met Thr Thr Ala Met Gly Phe Gly Gly Thr Ile Gly Gly Val Lys Ser

145 150 155

atg aca gct aac cct gga gta gga aca aca cct caa gca caa gtt act 587

Met Thr Ala Asn Pro Gly Val Gly Thr Thr Pro Gln Ala Gln Val Thr

160 165 170 175

tca aac aag ctt act tta ggt aag gag att gct gaa ggt ata aga ggt 635

Ser Asn Lys Leu Thr Leu Gly Lys Glu Ile Ala Glu Gly Ile Arg Gly

180 185 190

ggt atg gat act ggt aaa gag agt caa gtg aaa tct ata gat gct gat 683

Gly Met Asp Thr Gly Lys Glu Ser Gln Val Lys Ser Ile Asp Ala Asp

195 200 205

ata aga aca act caa gca gaa gaa aag aaa cta gaa gca caa atg gaa 731

Ile Arg Thr Thr Gln Ala Glu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Gln Met Glu

210 215 220

cta gta aag caa ttt gct gaa aat tca aag aac ctt gct cag caa gct 779

Leu Val Lys Gln Phe Ala Glu Asn Ser Lys Asn Leu Ala Gln Gln Ala

225 230 235

ctg cag att atg tca gaa gtt act agg gat gct aat gca aca aca cag 827

Leu Gln Ile Met Ser Glu Val Thr Arg Asp Ala Asn Ala Thr Thr Gln

240 245 250 255

cgt att ctg gcg taa taatttatag aacaactaat atgaagttat tgagaaataa 882

Arg Ile Leu Ala

atatagattg taatatatag 902

<210>10

<211>259

<212>PRT

<213>胞内劳森氏菌

<400>10

Met Ile Ser Leu Asn Asn Ser Ser Ile Gln Ile Pro Gln Gln Asn Ile

1 5 10 15

Glu Glu Ser Thr Ser Gln Glu Val Thr Ser Ser Ser Gly Gly Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Val Asp Gly Val Ser Ile Gln Ala Pro Lys Ala Pro Val Thr

35 40 45

Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Gly Val Gln Gln Arg Glu Ala Gln Glu

50 55 60

Asn Val Thr Lys Met Gly Leu Pro Glu Leu Ser Ala Pro Lys Gly Gly

65 70 75 80

Gly Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Met Phe Ala Glu Val Thr Val Asp

85 90 95

Ala Met Asn Gln Gln Arg Lys Ala Ala Gln Asp Val Gln Asn Ser Ala

100 105 110

Leu Glu Gly Met Val Asn Lys Met Leu Glu Ala Ala Lys Asp Ile Lys

115 120 125

Glu Gln Ser Lys Leu Met Met Gly Leu Gly Ile Ala Ser Ser Val Met

130 135 140

Thr Thr Ala Met Gly Phe Gly Gly Thr Ile Gly Gly Val Lys Ser Met

145 150 155 160

Thr Ala Asn Pro Gly Val Gly Thr Thr Pro Gln Ala Gln Val Thr Ser

165 170 175

Asn Lys Leu Thr Leu Gly Lys Glu Ile Ala Glu Gly Ile Arg Gly Gly

180 185 190

Met Asp Thr Gly Lys Glu Ser Gln Val Lys Ser Ile Asp Ala Asp Ile

195 200 205

Arg Thr Thr Gln Ala Glu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Gln Met Glu Leu

210 215 220

Val Lys Gln Phe Ala Glu Asn Ser Lys Asn Leu Ala Gln Gln Ala Leu

225 230 235 240

Gln Ile Met Ser Glu Val Thr Arg Asp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Arg

245 250 255

Ile Leu Ala

<210>11

<211>951

<212>DNA

<213>胞内劳森氏菌

<220>

<221>CDS

<222>(50)..(877)

<400>11

tgcattaact ttctaaattt ttatttagaa aaacacagag gtaaagata atg ctc ttt 58

Met Leu Phe

1

tct ttt cgt ttt att acc tat ccc ctc ata aca att ttt ata tta tat 106

Ser Phe Arg Phe Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Ile Phe Ile Leu Tyr

5 10 15

act tgt cat aat gcg ctt gct agt aat aat gat tca atg att acc tct 154

Thr Cys His Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asp Ser Met Ile Thr Ser

20 25 30 35

gaa aat ttt gaa agc caa tta cga ctt ctt ctt cat aac cat cct gag 202

Glu Asn Phe Glu Ser Gln Leu Arg Leu Leu Leu His Asn His Pro Glu

40 45 50

ctt gtc ctt gat gta cta aga gag cat agc gaa ctt gtc ctt gaa att 250

Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val Leu Glu Ile

55 60 65

gcc caa caa ggt tct aaa cag cgt caa cat aaa tcc ctt ata gca cag 298

Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu Ile Ala Gln

70 75 80

tgg aaa aaa gac ata act act cca aaa aat atg cat ctg gaa aat aga 346

Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu Glu Asn Arg

85 90 95

cca atc cga ggg aat cca aaa gca ccc gta act att gta gca ttt tca 394

Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val Ala Phe Ser

100 105 110 115

gac ttt aca tgt ttg tac tgt tca caa gct tct aaa act gta caa caa 442

Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr Val Gln Gln

120 125 130

atg ctt att gat tat aaa gat aat gta aaa tat att ttt aaa cac ttc 490

Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe Lys His Phe

135 140 145

ccg ctt aaa gga cat act att tca caa caa gcg gca ata tat ttc att 538

Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile Tyr Phe Ile

150 155 160

gct gca tct ttc caa agt aat gaa aaa gca tgg gca ctt tat gat ctt 586

Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu Tyr Asp Leu

165 170 175

ctt ttt caa aaa aga gat gag cta tta caa aac ggt gaa cag act ctt 634

Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu Gln Thr Leu

180 185 190 195

aaa caa gca gta aaa gaa gtg gga cta gat ata aaa aag tta atg agt 682

Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys Leu Met Ser

200 205 210

gac ctc aac aaa gca gaa gta aac aat att ctt gga caa gac ata aaa 730

Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln Asp Ile Lys

215 220 225

gat gct gca caa ctt gat att agt ggt act cca tac ttt att gtt aat 778

Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe Ile Val Asn

230 235 240

aac ctt atc ctt cgt ggt gca tta cct cct gaa tta ttc aca gaa gca 826

Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe Thr Glu Ala

245 250 255

att aat atg gcc tta aaa aat aca aaa gaa gtg tca aca tct cca aaa 874

Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr Ser Pro Lys

260 265 270 275

taa attctaaaag gtgtcataac tacaacacat tactatataa tgaaacctat 927

gctagtatat ttattacaat actt 951

<210>12

<211>275

<212>PRT

<213>胞内劳森氏菌

<400>12

Met Leu Phe Ser Phe Arg Phe Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Ile Phe

1 5 10 15

Ile Leu Tyr Thr Cys His Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asp Ser Met

20 25 30

Ile Thr Ser Glu Asn Phe Glu Ser Gln Leu Arg Leu Leu Leu His Asn

35 40 45

His Pro Glu Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val

50 55 60

Leu Glu Ile Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Ala Gln Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu

85 90 95

Glu Asn Arg Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val

100 105 110

Ala Phe Ser Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr

115 120 125

Val Gln Gln Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe

130 135 140

Lys His Phe Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile

145 150 155 160

Tyr Phe Ile Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu

165 170 175

Tyr Asp Leu Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu

180 185 190

Gln Thr Leu Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys

195 200 205

Leu Met Ser Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln

210 215 220

Asp Ile Lys Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe

225 230 235 240

Ile Val Asn Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe

245 250 255

Thr Glu Ala Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr

260 265 270

Ser Pro Lys

275

Claims

1.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SEQID NO：1所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

2.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SEQID NO：3所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

3.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SEQID NO：5所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

4.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SEQID NO：7所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

5.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SBQID NO：9所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

6.编码胞内劳森氏菌蛋白质的核酸序列或编码所述蛋白质之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分与SEQID NO：11所示核酸序列具有至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％的同源性。

7.包含依照权利要求1-6的核酸序列的DNA片段。

8.包含处于功能性相连的启动子控制之下的依照权利要求1-6的核酸序列或依照权利要求7的DNA片段的重组DNA分子。

9.包含依照权利要求1-6的核酸序列、依照权利要求7的DNA片段、或依照权利要求8的重组DNA分子的活体重组载体。

10.包含依照权利要求1-6的核酸序列、依照权利要求7的DNA片段、依照权利要求8的重组DNA分子、或依照权利要求9的活体重组载体的宿主细胞。

11.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

12.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

13.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

14.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

15.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

16.胞内劳森氏菌蛋白质或其免疫原性片段，所述蛋白质包含与SEQ ID NO：12所示氨基酸序列至少90％、优选92％、更优选94％、甚至更优选96％同源的氨基酸序列。

17.用于疫苗中的依照权利要求11-16的胞内劳森氏菌蛋白质。

18.依照权利要求11-16的胞内劳森氏菌蛋白质用于制备抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗的用途。

19.用于抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗，其特征是包含依照权利要求1-6的核酸序列、依照权利要求7的DNA片段、依照权利要求8的重组DNA分子、依照权利要求9的活体重组载体、依照权利要求10的宿主细胞、或依照权利要求11-16的蛋白质，以及制药学可接受载体。

20.依照权利要求19的疫苗，其特征是包含佐剂。

21.依照权利要求19或20的疫苗，其特征是包含由猪致病性病毒或微生物衍生的额外抗原或编码所述抗原的遗传信息。

22.依照权利要求21的疫苗，其特征是所述猪致病性病毒或微生物选自：假狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、可传染的胃肠炎病毒、轮状病毒、埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、和大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。

23.用于抗击胞内劳森氏菌感染的疫苗，其特征是包含针对依照权利要求11-16所述蛋白质的抗体。

24.用于制备依照权利要求19-23的疫苗的方法，所述方法包括将依照权利要求1-6的核酸序列、依照权利要求7的DNA片段、依照权利要求8的重组DNA分子、依照权利要求9的活体重组载体、依照权利要求10的宿主细胞、依照权利要求11-16的蛋白质、或针对依照权利要求11-16所述蛋白质的抗体与制药学可接受载体混合。

25.用于检测胞内劳森氏菌特异性DNA的诊断性测试，其特征是所述测试包含依照权利要求1-6的核酸序列或其长度为至少12个、优选15个、更优选18个核苷酸的片段。

26.用于检测针对胞内劳森氏菌的抗体的诊断性测试，其特征是所述测试包含权利要求11-16中所定义的蛋白质或其片段。

27.用于检测胞内劳森氏菌的抗原性物质的诊断性测试，其特征是所述测试包含针对权利要求11-16中定义的蛋白质或其片段的抗体。