CN1149288C - 来自副鸡嗜血杆菌的新多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种来自副鸡嗜血杆菌的新多肽以预防鸟类传染性鼻炎。来自副鸡嗜血杆菌的诱导HI抗体产生和预防鸟类传染性鼻炎的感染和起病的新多肽，编码所述多肽的基因，表达所述基因的重组载体，用所述载体转化的宿主，制备所述多肽的方法、其中所述多肽由所述宿主产生，包含所述多肽作为活性组分的鸟类传染性鼻炎的疫苗，用所述多肽作为免疫原得到的单克隆抗体以及利用所述肽和所述抗体的鸟类传染性鼻炎的诊断剂和治疗剂。

Description

来自副鸡嗜血杆菌的新多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种可以预防鸟类传染性鼻炎的多肽。更具体地说，本发明涉及来自鸟类传染性鼻炎病原体副鸡嗜血杆菌的多肽、编码所述多肽的基因和识别所述多肽的抗体蛋白。本发明还涉及一种制备所述多肽的方法和所述多肽用于疫苗、诊断试剂和治疗剂的用途。
背景领域
鸟类传染性鼻炎是家禽最重要的呼吸系统疾病之一，它是由副鸡嗜血杆菌(下文也称为HPG)感染引起的急性呼吸系统疾病，主要症状是流鼻涕、面部肿胀和泪溢。鸟类传染性鼻炎导致家禽育种速率降低、延迟下蛋、产蛋率下降或不能下蛋，因此它带来巨大经济损失。为预防鸟类传染性鼻炎，迄今已广泛使用一种灭活疫苗，它是通过培养副鸡嗜血杆菌、回收细胞并用福尔马林、硫柳汞等灭活细胞制得。然而，因为已经报道给与该疫苗时，在接种鸡中形成局部坏死损伤(M.Matsumoto和R.Yamamoto，Avian Dis.，15：109-117，1971)，由这种灭活疫苗引起的不良副作用已成为一个问题，因此，迫切需要研制一种高度安全的疫苗。
近几年来，随着家禽育种扩大规模，正在减轻家禽育种和管理中的劳动。作为其中一部分，也迫切需要减轻接种中的劳动，结果，已开发出一种混合疫苗并已广泛用于该领域中，使得通过将几种疫苗混合在一起，可以降低接种频率。
为提供在不增加剂量的情况下表现出与每种普通疫苗相同的免疫原性的混合疫苗，需要增加混合疫苗中含有的每种抗原的量，或发现并使用更合适的佐剂。在诸如HPG的革兰氏阴性细菌的情况下，较大量的抗原会增强对注射的反应，例如接种部位肿胀。因此，为减轻这种不良反应，最好从细菌细胞或培养上清液中仅获得保护性抗原，即有效组分，或通过基因重组技术克隆编码所述抗原的基因，在细菌、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等中表达所述基因，并纯化大量表达的产物，然后将其同其它疫苗一起与适当的佐剂混合。
减轻接种劳动的另一方法是使用病毒或细菌作为载体。即将来自一或多种病原体的保护性抗原的编码基因导入减毒病毒或细菌中以制备多价活疫苗。对于家禽，已将痘病毒、马立克病病毒等作为载体研究。包含一种病毒载体的疫苗已付诸实践，其中将新城疫病毒的HN蛋白和F蛋白的编码基因导入家禽痘病毒中。
因此，最重要的是鉴定HPG的保护性抗原，以开发作为组分疫苗和载体疫苗的鸟类传染性鼻炎的安全有效的疫苗。
在诸如血凝素(HA)和外膜蛋白的HPG保护性抗原中，HA被认为是一种最重要的抗原，因为用HPG免疫鸡增加了血细胞凝集抑制抗体(下文称为“HI抗体”)，观察到HI抗体水平高的鸡的较高保护效果(K.Otsuki和Y.Iritani，Avian Dis.，18：297-304，1974和K.Kume等，Jpn.J.Vet.Sci.，46：843-850，1984)。
根据凝集试验，HPG的血清型分为A、B和C血清型(Page，Am.J.Vet.Res.，23：85-95，1962)或分为1和2血清型(Sawata等，Jpn.J.Vet.Sci.，40：645-652，1978)。据认为，Page的A血清型对应于Sawata等的1血清型，而Page的C血清型对应于Sawata等的2血清型(K.Kume等，Am.J.Vet.Res.，41：757-760，1980和Sawata等，Am.J.Vet.Res.，41：1901-1904，1980)。
Kume等报道，HPG A血清型(血清型1)至少有三种HA，即HA-L(热不稳定，胰蛋白酶敏感)、HA-HL(热不稳定，胰蛋白酶抗性)和HA-HS(热稳定性，胰蛋白酶抗性)，单独的HA-L不仅对通常的新鲜鸡红细胞而且对戊二醛固定的鸡红细胞表现出的HA活性，并且参与免遭HPG A血清型感染的保护作用(K.Kume，Jpn.J.Vet.Sci.，45：783-792，1983和Sawata等，Jpn.J.Vet.Sci.，46：21-29，1984)。
Iritani等报道HPG A血清型有二种HA，即1型HA(热不稳定，蛋白酶敏感)和2型HA(热不稳定，蛋白酶抗性)，1型HA为热不稳定和蛋白敏感型，并由分子量约39kd的作为亚基的多肽组成，参与免遭感染的保护作用(T.Yamaguchi和Y.Iritani，Jpn.J.Vet.Sci.，42：709-711，1980和Y.Iritani等，Am.J.Vet.Res.，41：2114-2118，1980)。据认为，Kume等的HA-L和HA-HL分别对应于Iritani等的1型HA和2型HA。关于HPG C血清型(血清型2)，Sawata等报道发现一热不稳定和胰蛋白酶敏感型抗原，它对戊二醛固定的鸡红细胞表现出HA活性，并且该抗原的抗原性与HPG A血清型的HA不同(Sawata等，Am.J.Vet.Res.，43：1311-1314，1982)。除Iritani等报道的由HPG A血清型产生的1型HA之外，迄今尚未实际上鉴定HPG的保护性抗原。
如上所述，用硫柳汞、福尔马林等灭活副鸡嗜血杆菌细胞得到的常规灭活疫苗已经引起问题，即因为它包含除保护性抗原之外的各种细胞物质，当将其大量用于家禽时，会诱导上述不良副作用。
本发明说明书
本发明人已认真地进行研究以解决这些问题，结果成功地从副鸡嗜血杆菌A血清型的培养上清液中纯化了一种来自副鸡嗜血杆菌A血清型的分子量约130kd的多肽，所述多肽诱导HI抗体的产生，保护抵抗由副鸡嗜血杆菌A血清型引起的鸟类传染性鼻炎。
此外，本发明人已经制备了HPG A血清型的基因组DNA文库，克隆了编码上述130Kd多肽的基因片段，在大肠杆菌中表达了所述基因片段，发现产生的多肽可以预防由副鸡嗜血杆菌A血清型引起的鸟类传染性鼻炎。编码上述130Kd多肽的所述基因片段也用作克隆能与来自HPG C血清型的所述DNA片段杂交的基因片段的探针，以产生表达得自HPG C血清型的多肽的大肠杆菌。
本发明提供一种病原菌为副鸡嗜血杆菌的鸟类传染性鼻炎的安全有效且不良副作用较小的疫苗，并提供制备该疫苗的方法。
即本发明的目的是提供一种来自副鸡嗜血杆菌的新多肽以及共享至少一部分氨基酸序列的肽。
本发明的另一个目的是提供一个编码所述来自副鸡嗜血杆菌的新多肽以及共享至少一部分氨基酸序列的肽的基因和表达所述基因的重组载体。
本发明的再一个目的是提供制备来自副鸡嗜血杆菌的所述新多肽和来自用所述重组载体转化的微生物或细胞的共享至少一部分氨基酸序列的多肽的方法。
本发明又一个目的是提供一通过将所制备的来自副鸡嗜血杆菌的新多肽或共享至少一部分氨基酸序列的多肽作为免疫原制备的单克隆或多克隆抗体。
本发明的再一个目的是提供借助上述肽、DNA片段、转化体或抗体的组合检测副鸡嗜血杆菌或其抗体的方法。
本发明的又一个目的是提供鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含作为活性组分的来自副鸡嗜血杆菌新多肽的抗体。
附图简述
图1显示用单克隆抗体(克隆HpgA59-40，HpgA59-180和HpgA59-284)被动免疫后用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击鸡得到的结果，其中在预先给与具HI活性的单克隆抗体(克隆HpgA59-40和HpgA59-180)的组中该病发病推迟。
图2显示用单克隆抗体(克隆HpgA59-33，HpgA59-48B和HpgA59-180)被动免疫后用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击鸡得到的结果，其中在预先给与具HI活性的单克隆抗体(克隆HpgA59-180)的组中该病发病推迟。
图3显示用单克隆抗体(克隆HpgA59-48A，HpgA59-145和HpgA59-180)被动免疫后用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击鸡得到的结果，其中在预先给与具HI活性的单克隆抗体(克隆HpgA59-145和HpgA59-180)的组中该病发病推迟。
图4显示用单克隆抗体(克隆HpgA59-188，HpgA59-236和HpgA59-180)被动免疫后用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击鸡后得到的结果，其中在预先给与具HI活性的单克隆抗体(克隆HpgA59-180)的组中该病发病推迟。
图5是一照片，显示HPGp130多肽用CBB染色的SDS-PAGE电泳结果，该多肽用以具HI活性的单克隆抗体(克隆HpgA59-180)作为配体的亲和层析纯化。
图6(a)是一照片，显示纯化的HPGp130多肽和用2-巯基乙醇处理的副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株用CBB染色的SDS-PAGE电泳结果；图6(b)是一照片，显示在纯化的HPGp130多肽和用2-巯基乙醇处理的副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株用SDS-PAGE电泳并转移到一薄膜(PVDF)上之后，检测与抗纯化的HPGp130多肽的豚鼠抗血清反应的蛋白的结果。
图7是一示意图，显示从副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组克隆的HPG1.2k DNA、HPG3.5k DNA、HPG4.1k DNA、HPG6.7k DNA和HPG2.7k DNA片段的位置。
图8是一示意图，显示通过将来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组的XhoI-XbaI片段(HPG4.1k DNA)插入质粒pSP72构建质粒pSA4.1，接着通过将来自质粒pSA4.1的XhoI-KpnI片段插入质粒pTrcHisC构建质粒pTA4.1。
图9是一示意图，显示通过将来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组的XhoI-PstI片段(HPG6.7k DNA)插入质粒pSP72构建质粒pSA6.7，接着通过将来自质粒pSA6.7的XbaI片段插入质粒pSP72构建质粒pSA2.7。
图10是一照片，显示在对用限制性内切酶EcoRI消化来自副鸡嗜血杆菌A、B和C血清型的基因组得到的DNA片段进行琼脂糖电泳并转移到一薄膜(Hybond N+)之后，检测可以与作为探针的HPG1.2kDNA杂交的DNA片段的结果。
图11是一示意图，显示从副鸡嗜血杆菌C血清型53-47菌株基因组克隆的HPG-C1 DNA、HPG-C2 DNA、HPG-C3 DNA和HPG-C4 DNA片段的位置。
图12是一照片，显示用在编码HPG A血清型HMTp210多肽N末端和C末端氨基酸序列的核苷酸序列的基础上制备的引物和以副鸡嗜血杆菌A、B或C血清型作为模板的PCR得到的PCR产物的0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。
本发明的最佳实施方式
以下更详细地解释本发明。
通过以具HI活性的单克隆抗体作为配体的亲和层析从HPG A血清型的培养上清液或破碎细胞悬液中，制备诱导HI抗体产生的来自副鸡嗜血杆菌A血清型的本发明的多肽。
通过常规细胞融合方法制备产生与副鸡嗜血杆菌A血清型结合的单克隆抗体的杂交瘤，然后用HI试验筛选产生具HI活性的单克隆抗体的杂交瘤，得到具HI活性的单克隆抗体(下文称为“ HI-MCA”)。
通过用于副鸡嗜血杆菌普通培养的常规方法得到副鸡嗜血杆菌A血清型，作为生产上述抗体之用的免疫原。例如，可以通过在补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基中(1000ml培养基中包括鸡肉浸液300ml、鸡血清10ml、多种蛋白胨5g、葡萄糖1g、酪蛋白氨基酸1g、谷氨酸钠5g、氯化钠5g、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.025g)于37℃过夜振荡培养并接着用离心法回收HPG221菌株细胞。
可以用常规方式进行免疫法，例如，在用硫柳汞、福尔马林等灭活副鸡嗜血杆菌A血清型后，以腹膜注射、皮下注射、皮内注射或静脉注射方式将灭活细胞与常规佐剂一起给与BALB/c小鼠。免疫原包括HPG细胞本身，或者，用硫氰酸钾、超声处理或透明质酸酶处理的细胞，或者用诸如N-月桂酰肌氨酸钠、Nonidet P-40或Triton X-100的表面活化剂处理得到的加工抗原。佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝凝胶等。更具体地说，按下述方法进行免疫法：用硫柳汞灭活在补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基中培养的副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株，然后进行超声处理。通过将得到的破碎细胞悬液与弗氏完全佐剂混合得到一种乳剂，将此乳剂皮下注射于BALB/c小鼠背部，然后用以等量的该悬液和弗氏不完全佐剂制成的一种乳剂于背部每2-4周皮下注射一次。监测血清抗体水平，在确认抗体效价水平提高后，在又过了2-4周后将超声处理后的破碎细胞悬液作为最后一次免疫接种进行静脉内注射。
作为制备单克隆抗体的免疫细胞，最好使用最后一次注射后2-4天取出的脾细胞。小鼠骨髓瘤细胞包括例如NSI-Ag4/1(Eur.J.Immunol.，6：511，1976)、P3X63-Ag8.U1(Curr.Topics Microbiol.Immunol.，81：1，1978)、X63-Ag8.653(J.Immunol.，123：1548，1979)等。可以按照Milstein等，Method Enzymol.，73，3-46，1981的方法进行脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合。即，可以在脾细胞量高出小鼠骨髓瘤细胞1-10倍的情况下进行融合。细胞融合促进剂可以是浓度30-50％(w/v)分子量为1,000-6,000的聚乙二醇。更具体地说，最好在有约108脾细胞和约107P3X63-Ag8.U1骨髓瘤细胞的通常用于培养淋巴细胞的培养基(诸如RPMI 1640培养基)中进行细胞融合，该培养基含有45％聚乙二醇4,000，并预先于37℃加热。
在HAT培养基中培养足够的时间以使非融合细胞不能存活，一般培养几天到几周，可以得到杂交瘤。然后按照常规限制稀释法，将由此得到的杂交瘤用于采用该杂交瘤培养上清液筛选和克隆产生所需抗体的细胞株。
按照通常的ELISA、RIA、Western印迹法等筛选产生识别副鸡嗜血杆菌A血清型的抗体的细胞株。在这些方法中使用的抗原可以是副鸡嗜血杆菌A血清型细胞悬液、用硫氰酸钾、超声处理或透明质酸酶等处理的细胞，或者用表面活化剂对所述细胞的提取液。
按照通常的HI试验，使用上述杂交瘤培养上清液或来自给与所述杂交瘤的小鼠腹水筛选产生有HI活性的抗体的细胞株。HA抗原包括副鸡嗜血杆菌细胞悬液、用硫氰酸钾、超声处理或透明质酸酶等处理的细胞。用于HI试验的红细胞可以是0.5％新鲜鸡红细胞、戊二醛固定的1％鸡红细胞或福尔马林固定的鸡红细胞，最好用戊二醛固定的鸡红细胞。
更具体地说，将用5倍量的25％高岭土溶液处理的腹水离心后得到的上清液加入戊二醛固定的鸡红细胞沉淀中，然后在37℃振荡60分钟进行致敏。在该上清液的二倍连续稀释液中加入等量包含4个血凝素单位的221菌株细胞悬液，将此混合物静置15分钟。向其中加入戊二醛固定的1％鸡红细胞悬液，将此混合物在室温静置60分钟，并观察微量滴定板的底部。一个HI抗体效价定义为可以阻止血细胞凝集的最大稀释度。
可以通过大量培养所述杂交瘤并从培养上清液中回收所述抗体，或通过向适应所述杂交瘤的小鼠给与所述杂交瘤以使所述杂交瘤增殖并从小时腹水中收获所述抗体，从由此得到的杂交瘤回收具有HI活性的单克隆抗体。
可以用蛋白化学的常规使用方法，例如盐析、超滤、等电沉淀、电泳、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等纯化该单克隆抗体。更具体地说，按照生产厂商的方法使用A蛋白-Sepharose CL-4B(Pharmacia制造)和MAPS-II小鼠单克隆抗体纯化试剂盒(Bio Rad制造)，从腹水纯化该单克隆抗体。
例如按照生产厂商的方法将上述纯化的抗体连接到HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia制造)，用通常方法制备以有HI活性的抗体作为配体的亲和层析柱，以纯化诱导HI抗体产生的来自副鸡嗜血杆菌A血清型的多肽。
使用由此制备的亲和层析柱，可以从HPG A血清型细胞培养上清液或破碎细胞悬液中得到诱导HI抗体产生的来自副鸡嗜血杆菌A血清型的多肽。具体地说，从在补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基中于37℃培养2天的HPG221菌株的培养上清液中，得到分子量约为130Kd、具有产生HI抗体的高能力和预防鸟类传染性鼻炎的活性的多肽(下文称为“HPGp130”)。
按照诸如埃德曼降解法(P.Edman，Acta Chem.Scand.，4：283，1950)的通常方法确定由此得到的多肽的氨基酸序列。所述多肽的N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO：2中。
按照Sambrook等描述的方法(分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，New York，1989)，可以克隆编码得自副鸡嗜血杆菌A血清型的多肽的基因或基因片段。即，按照上述方法培养和回收副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株细胞，按照试剂盒所附的方法用Sepagene试剂盒(Sanko Junyaku K.K.制造)提取和纯化基因组DNA。然后用市售的限制性内切酶(最好用EcoRI)酶切该基因组DNA，将所得的DNA片段插入一市售克隆载体(例如λgtll)以制备DNA文库，在其中筛选表达对有HI活性的所需抗体起反应的抗原的这类克隆。有HI活性的抗体包括该杂交瘤的培养上清液或上述得到的小鼠腹水。最好使用通过用具HI活性的单克隆抗体作为配体的亲和层析从副鸡嗜血杆菌A血清型分离的多肽进行免疫接种得到的抗血清。可以用DNA测序仪(例如，Applied Biosystems377)确定由此得到的重组λgtll噬菌体DNA中外源DNA片段的核苷酸序列。得到的外源DNA片段的新颖性可以通过在该整个核苷酸序列和现有数据库(例如GeneBank、EMBL等)之间进行同源检索来确认。
例如正如实施例3所示，从该DNA文库中得到了十个阳性λgtll噬菌体，琼脂糖电泳证实这些噬菌体的每个DNA都包括一约1.2kb的外源DNA片段(下文也称为“HPG1.2k DNA片段”)。所述外源DNA的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1的核苷酸No.1988至No.3157的核苷酸序列。
由于在该HPG1.2k DNA中没有找到起始密码子和终止密码子，认为该DNA片段编码来自副鸡嗜血杆菌A血清型的多肽的一部分。通过用该HPG1.2k DNA作为探针以产生一较长的DNA片段，确定该DNA片段的核苷酸序列并找到起始密码子和终止密码子，可以得到编码所述多肽的全长编码基因。
更具体地说，用一酶切位点不在该1.2kb DNA内的限制性内切酶(例如HindIII)酶切副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的基因组DNA，用琼脂糖电泳分离所得的DNA片段。使用DIG-DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)，使用地高辛配基(DIG)标记的1.2kb DNA片段作为检测所需DNA片段的探针进行Southern杂交。结果得到了与该1.2kb DNA片段杂交的约3.5kb的HindIII消化的DNA片段(下文也称为“HPG3.5k DNA片段”)。该HPG3.5k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1的核苷酸No.1至No.3450的核苷酸序列。在SEQ ID NO：1的自氨基酸残基No.1至No.13(对应于自No.453至No.491的核苷酸序列)的氨基酸序列中，找到了与上述HPGp130多肽N末端氨基酸序列相同的序列。
因为在该HPG3.5k DNA中只找到了起始密码子而没有找到终止密码子，将用DIG标记的该1.2kb DNA片段和该3.5kb DNA片段作为探针，产生约4.1kb的XhoI-XbaI消化的DNA片段(下文也称为“HPG4.1k DNA片段”)。该HPG4.1k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1的核苷酸No.2212至No.6275的核苷酸序列。因为在该HPG4.1k DNA片段中没有找到终止密码子，使用用DIG标记的该1.2kb DNA和该3.5kb DNA得到了约6.7kb的XhoI-PstI消化的DNA片段(下文也称为“HPG6.7k DNA片段”；该片段包括上述HPG4.1k DNA片段)。该HPG6.7k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQID NO：1的核苷酸No.2212至No.8930的核苷酸序列。在该HPG6.7kDNA片段中有一终止密码子。
已发现由总共8930个核苷酸组成的SEQ ID NO：1的核苷酸序列，包括一从核苷酸No.243起始的可以编码2042个氨基酸残基的开放读框。包含该2042个氨基酸残基的多肽以下也称为“A血清型HMTp210”。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索揭示与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该A血清型HMTp210多肽是一新物质。
据认为在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中存在着另一个可能的开放读框，它从核苷酸No.8375起始，可以编码185个氨基酸残基。在该序列中没有发现终止密码子。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索揭示与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该开放读框编码的多肽也是一新物质。
也可以将得自副鸡嗜血杆菌A血清型的DNA片段作为探针，用于从副鸡嗜血杆菌的不同血清型(诸如B血清型或C血清型)得到DNA片段以及由所述DNA片段编码的多肽。
更具体地说，从HPG C血清型53-47菌株提取和纯化基因组DNA，并用合适的限制性内切酶(最好是HindIII)酶切，将得到的DNA片段插入一市售的克隆载体(例如λDASHII)以制备DNA文库，从该DNA文库中用以DIG标记的A血清型HPG3.5k DNA片段作为探针筛选克隆。
正如实施例5所示，从该DNA文库中得到了十个阳性λDASHII噬菌体，琼脂糖电泳证实这些噬菌体的每个DNA都包括一约13.5kb的外源DNA片段(下文也称为“HPG-C1 DNA”)。
由于约13.5kb的HPG-C1 DNA片段太大而不能亚克隆到质粒载体上，用合适的限制性内切酶(最好是XbaI)将它酶切并将得到的DNA片段插入一市售的克隆载体(例如pUC119)。结果，得到了约5.6kb的DNA片段(下文也称为“HPG-C2 DNA”)、约0.9kb的DNA片段(下文也称为“HPG-C3 DNA”)和约6.9kb的DNA片段(下文也称为“HPG-C4 DNA”)。已测定HPG-C2 DNA片段和HPG-C4 DNA片段的一部分核苷酸序列，显示在这些DNA片段中分别有一起始密码子和一终止密码子存在。
已发现由总共7486个核苷酸组成的SEQ ID NO：5的核苷酸序列包括一开放读框，它从核苷酸No.848起始，可以编码2039个氨基酸残基。包含该2039个氨基酸残基的多肽以下也称为“C血清型HMTp210”。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索揭示与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该C血清型HMTp210多肽是一新物质。
编码C血清型HMTp210多肽的核苷酸序列和编码A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列的同源性检索揭示约80％的同源性。另外揭示在5′位点的约3.4kb区和在3′位点的约1.2kb区显示高同源性，而在这些5′和3′区之间的约1.5kb显示低同源性。这种情况也适用于由这些基因编码的相应多肽。
基于编码该A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列，通过PCR也可以得到来自副鸡嗜血杆菌不同血清型(诸如例如B血清型或C血清型)的DNA片段以及由所述DNA片段编码的多肽。
更具体地说，基于编码A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列，制备一具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的合成DNA作为上游PCR引物和一具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的合成DNA作为下游PCR引物。设计这些引物，使得将BamHI识别序列分别加到5′位点，可以扩增A血清型HMTp210多肽的全长翻译区。使用这些引物，以来自总共九个菌株(即副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株、083菌株、W菌株、德国菌株和乔治亚菌株、HPG B血清型Spross菌株和0222菌株以及HPG C血清型Modesto菌株和53-47菌株)的基因组DNA作为模板进行PCR。在0.8％琼脂糖凝胶电泳上对得到的PCR产物进行的分析证实在这些菌株的任一个中的约6.1kb的扩增片段。
可以将由此得到的DNA片段或其一部分导入一合适的表达载体，将得到的表达载体用于转化微生物或动物细胞，培养转化体以产生来自副鸡嗜血杆菌的本发明多肽或与所述多肽共享一部分氨基酸序列的肽。也可以用肽合成仪制备共享一部分氨基酸序列的肽。
也可以将在微生物或动物细胞中的合适分泌信号序列连接在编码本发明多肽的DNA的上游，以使所述多肽可以分泌到培养基中。由此为分泌而修饰的DNA的优越性在于可以容易地纯化分泌到培养基中的所述多肽。信号序列包括用于大肠杆菌的pe1B信号(S.P.Lei等，J.Bacteriology，169：4379-4383，1987)、来自用于酵母的α因子的信号(A.J.Brake，Yeast Genetic Engeering，第269页，Butterworth，1989)、来自免疫球蛋白的SG-1信号(H.Maeda等，Hum.Antibod.Hybridomas，2：124-134，1991)、用于动物细胞的C25信号(PCT国际公告，编号WO94/20632)。
表达载体包括质粒、病毒载体等。考虑到作为宿主的微生物或动物细胞，因为最终得到具备预防鸟类传染性鼻炎的活性的多肽，任何启动子都可以包括在该表达载体中，诸如lac、tac、pho5、adh、SV40早期、SV40晚期、beta肌动蛋白等的启动子。也可以将本发明的多肽作为与另一蛋白或肽(诸如β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、A蛋白、组氨酸六聚物等之类)的融合蛋白表达。标记基因在微生物表达载体的情况下，包括以大肠杆菌为宿主的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因，以酵母为宿主的β-异丙基苹果酸脱氢酶(Leu2)基因，在动物细胞表达载体的情况下，包括氨基糖苷3′磷酸转移酶(neo)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、谷氨酰胺合成酶(GS)基因等之类。筛选添加剂包括G418、新霉素、氨甲喋呤等之类。
宿主细胞的转化可以通过已知方法进行，包括例如氯化钙法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、细胞转染试剂法、原生质体聚乙烯融合法、电穿孔法等之类，可以根据所用的宿主适当选择。
可以按照下述方法制备来自副鸡嗜血杆菌的本发明的新多肽或共享所述多肽的至少一部分氨基酸序列的肽。例如，将来自HGPA血清型的HPG3.5k DNA片段加入一表达载体pTrcHisC(Invitrogen制造)，将所述表达载体导入大肠杆菌菌株JM109进行转化。在所得到的转化细胞中，以抗体与所述多肽的反应性指数用斑点印迹，筛选产生目标新多肽的那些转化体。用该破碎细胞悬液离心后得到的上清液免疫的鸡具有对HPG A血清型221菌株免疫攻击的较高保护作用。
借助上述在蛋白质化学领域使用的方法，可以从产生所述多肽的转化体的大规模培养的细胞提取液或培养上清液纯化该新多肽。
由此得到的来自副鸡嗜血杆菌的新多肽具有预防鸟类传染性鼻炎的活性。可以将上述来自副鸡嗜血杆菌的所述多肽、抗所述多肽的单克隆和多克隆抗体以及表达载体单独或与一合适的载体、稀释或稳定剂以常规方式如注射或口服药物的形式结合用做鸟类传染性鼻炎的疫苗或治疗剂。
按照上述描述的方法，可以将上述来自副鸡嗜血杆菌的新多肽或共享所述多肽至少一部分氨基酸序列的多肽用做制备多克隆和多克隆抗体的免疫原。也可以将所述多肽以及能与所述多肽结合的抗体用于抗原或抗体检测系统，例如Western印迹分析、ELISA等之类，并可以作为构建诊断试剂的材料。另外，可以将有上述抗体可以结合的载体的亲和层析用于纯化上述多肽。
按照本发明，提供了来自副鸡嗜血杆菌的新多肽和编码所述多肽的基因片段以预防鸟类传染性鼻炎，并提供具HI活性的可以用做治疗剂的抗体。
本发明人发现的来自副鸡嗜血杆菌的多肽的分子量约为130Kd，它具有诱导HI抗体产生的活性，它是预防鸟类传染性鼻炎的新的、重要的多肽。本发明人解决了与获得(obtention)所述多肽有关的技术问题，诸如分离编码所述多肽的基因、构建表达载体、制备表达细胞和纯化所述多肽，这允许提供比先有技术疫苗更有效的疫苗。另外，它们可以作为提供快速、简单的鸟类传染性鼻炎诊断试剂的材料使用。
通过以下实施例可以更详细地描述本发明，但不应解释为限制本发明。
实施例1：单克隆抗体的制备和特征
(1)单克隆抗体的制备
将副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株接种到补加了鸡血清的100ml鸡肉浸液培养基中，于37℃振荡培养过夜，然后离心(8,000rpm，20分钟)回收细胞。用PBS离心清洗得到的细胞，然后以约5×1010细胞/ml的浓度悬浮于含0.01％硫柳汞的PBS中。用Branson Sonifer350于20kHz、4℃超声处理该悬液10分钟(交替重复超声处理0.5秒和冷却0.5秒)。将由此得到的超声处理破碎细胞悬液与同等量的弗氏完全佐剂混合，彻底混合该混合物直至形成油包水(w/o)。将各0.1ml的这种乳剂皮下注射于BALB/c小鼠背部的二个位点。四周后，将用弗氏不完全佐剂类似制备的乳剂各0.1ml皮下注射于该小鼠背部的二个位点。又过了18天后，静脉注射0.1ml的该超声处理破碎细胞悬液。
最后一次注射后三天，取出脾细胞。通过铺底(padding)，将所述脾细胞(1×108细胞)与小鼠骨髓瘤细胞P3X63-Ag8.U1(1×107细胞)混合，然后在混合物中加入预先于37℃温热的含有45％聚乙二醇的RPMI1640培养基以进行细胞融合。将融合反应后的细胞悬浮于HAT培养基中(含有5％胎牛血清、补加了1×10-4M次黄嘌呤、4×10-7M氨蝶呤和1.6×10-5M胸苷的RPMI1640培养基)，然后在96孔细胞培养微量滴定板(Coning制造)上平板接种后，在37℃和5％CO2的条件下培养。
对于有杂交瘤增殖的孔，按照下述方法用ELISA测定培养基上清液中识别副鸡嗜血杆菌的单克隆抗体的存在。将用上述方法制备的副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的超声处理破碎细胞悬液用PBS稀释300倍，将这种悬液各100μl平板接种ELISA微量滴定板(Dynatech制造的Immulon II)的孔内。将该微量滴定板于4℃静置过夜，然后每孔加入200μl含有5％脱脂乳的PBS覆盖于室温2小时。用含有0.05％Tween 20(PBS-T)的PBS清洗该微量滴定板，然后加入用含有5％脱脂乳的PBS-T稀释10倍的杂交瘤培养上清液100μl于室温反应2小时。用PBS-T清洗后，加入用含有5％脱脂乳的PBS-T稀释10,000倍的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Bio-Rad制造)各100μl，在室温反应2小时。然后，用PBS-T清洗后，将含有每11ml6mg二盐酸邻苯二胺(OPD；Katayama Kagaku K.K制造)的0.05M柠檬酸盐-0.1M磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)各100μl和4.75μl过氧化氢(含有31％过氧化氢；Mitsubishi Gasu Kagaku K.K.制造)加入在室温反应30分钟。各加入50μl的3M硫酸终止反应，用ELISA自动读板仪测定每孔的吸收值(490nm)。
将培养上清液中有抗副鸡嗜血杆菌A血清型的抗体分泌的孔中的杂交瘤用限制稀释法克隆以使它们成为单克隆。因此，得到了九个产生抗副鸡嗜血杆菌A血清型的单克隆抗体的克隆。
(2)单克隆抗体的HI活性
大量培养这些杂交瘤，并腹膜内注射到用免疫抑制剂姥鲛烷(2，6，10，14-四甲基-十五烷；Aldrich制造)预先处理的BALB/c小鼠，杂交瘤就在小鼠体内增殖。10至20天后，杀死小鼠并取出产生腹水，测定该腹水的HI活性。
使用以硫柳汞灭活的副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株细胞悬液作为HI测试的HA抗原并按照HA效价制备。首先，使用V形微量滴定板(Sanko Junyaku K.K.)，将戊二醛固定的1％鸡红细胞悬液(0.05ml)加入HA抗原的二倍连续稀释液(0.05ml)中，室温静置60分钟后，观察板的底部。将凝集红细胞的最大稀释度定义为HA效价，并以此稀释度的HA抗原浓度作为一个单位，制备HA抗原贮液，使其含有4个单位。
然后，在0.2ml的小鼠腹水中加入5倍量的25％高岭土溶液，将该混合物在37℃振荡60分钟进行致敏，然后离心得到上清液。将此高岭土处理后的离心上清液加入戊二醛固定的10％鸡红细胞(2ml)的离心沉淀物，将该混合物在37℃振荡60分钟进行致敏。致敏后，离心得到上清液并将该上清液作为测定HI抗体的5倍稀释的小鼠腹水使用。使用V形微量滴定板，向0.025ml的该上清液2倍连续稀释液加入等量的用硫柳汞灭活的含4个血细胞凝集单位的221菌株细胞悬液，在混合后，将该混合物静置15分钟。在充分致敏后，加入0.05ml的戊二醛固定的1％鸡红细胞悬液。将该混合物在室温静置60分钟后，观察微量滴定板的底部。将抑制血细胞凝集的最大稀释度定义为一个HI抗体效价。在9个克隆中，来自3个克隆(HpgA59-40、HpgA59-145和HpgA59-180)的单克隆抗体表现出高HI活性(表1)。本申请人已于1996年9月5日将克隆HpgA59-180作为FERM BP-6084保藏于工业科学技术局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)。
                  表1
单克隆抗体                  HI抗体效价
HpgA59-33                   ＜50
HpgA59-40                   25,600
HpgA59-48A                  ＜50
HpgA59-48B                  ＜50
HpgA59-145                  1,600
HpgA59-180                  12,800
HpgA59-188                  ＜50
HpgA59-236                  ＜50
HpgA59-284                  ＜50
(3)单克隆抗体的保护活性
用含有这些抗体的小鼠腹水(0.3ml)对4-6周龄、每组8-10只鸡的SPF白来亨鸡进行腹膜内注射，第二天，对这些鸡的鼻腔滴入约108副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株细胞进行攻击。也使用未注射小鼠腹水的对照组并以同样方式免疫攻击。观察10天每组的鼻炎症状(即流鼻涕、面部肿胀和泪溢)的存在。与对照组相比，所有预先接受具HI活性的单克隆抗体(下文称为“HI-MCA”)的组都很可能推迟起病。与此相反，所有接受其它克隆的单克隆抗体的组未表现出显著区别(图1-4)
实施例2：由HI-MCA识别的抗原的纯化和特性
(1)纯化HI-MCA
使用A蛋白-Sepharose CL-4B(Pharmacia制造)和MAPS-II小鼠单克隆抗体纯化试剂盒(Bio-Rad制造)并按照所附方法从小鼠腹水纯化HI-MCA(HpgA59-1 80)。首先，向4ml的小鼠腹水中加入该抗体纯化试剂盒包含的等量的结合缓冲液。用0.45微米的Sterivex滤器(Millipore制造)过滤该混合液后，将该混合物上A蛋白-SepharoseCL-4B柱(凝胶床体积5ml)，用该结合缓冲液充分流洗直至280nm吸收值小于0.05。然后，用该试剂盒包含的洗脱缓冲液洗脱结合上柱的抗体。将洗脱的抗体对含有0.5M氯化钠的0.2M碳酸氢钠(pH8.3)透析，得到40mg纯化的HI-MCA(HpgA59-180)。同样地，也纯化得到12mg HI-MCA(HpgA59-40)。
(2)将HI-MCA结合到载体上
然后，将纯化的HI-MCA(HpgA59-180)作为配体，按照其所附的方法连接到HiTrap NHS活化的柱子上(Pharmacia制造)。首先，将HiTrap NHS活化柱(凝胶床体积1ml)用1mM盐酸流洗，然后用含0.5M氯化钠和10mg上述纯化的HI-MCA(HpgA59-180)的0.2M碳酸氢钠溶液(10ml)于室温循环30分钟，以使HI-MCA结合上柱。将得到的结合HI-MCA的HiTrap柱交替用含0.5M氯化钠的0.5M乙醇胺(pH8.3)、和含0.5M氯化钠的0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.0)分别流洗三次，并用PBS平衡以纯化由HI-MCA识别的抗原。
(3)纯化由HI-MCA识别的抗原
通过以HI-MCA为配体的亲和层析，从副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的培养物纯化一抗原。按照下述方法用ELISA法检测一抗原。
将上述纯化的HI-MCA(HpgA59-40)用0.05M碳酸钠缓冲液(pH9.0)稀释至1.6μg/ml的浓度，并置于ELISA微量滴定板的孔中。将该板于4℃静置过夜，并于室温用含5％脱脂乳的PBS覆盖2小时。用PBS-T清洗后，将以含有5％脱脂乳的PBS-T稀释10倍的该柱洗脱物于室温反应2小时。用PBS-T清洗后，将以含有5％脱脂乳的PBS-T稀释10,000倍的过氧化物酶标记的HI-MCA(HpgA59-180)于室温反应2小时。然后，用PBS-T清洗后，加入含有OPD和过氧化氢的底物溶液于室温反应30分钟。按照Yoshitake等(J.Biochem.，92：1413-1424，1982)的描述将辣根过氧化物酶(Toyobo K.K.制造)结合到上述纯化的HI-MCA(HpgA59-180)制备过氧化物酶标记的HI-MCA(HpgA59-180)。
将副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株接种于100ml补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基并于37℃振荡培养2天。向经8000rpm离心20分钟除去细胞得到的培养上清液中立即加入一丝氨酸蛋白酶抑制剂1mM的苯基甲基磺酰氟，将该混合物用0.45微米Sterivex滤器过滤。将60ml上述滤过液上柱到预先用PBS平衡的HI-MCA结合的HiTrap柱，并用PBS流洗。当280nm的吸收值小于0.05时，用3M硫氰酸钠洗脱结合到HI-MCA上的抗原。在未结合部分里未发现由HI-MCA识别的抗原，大部分抗原从用3M硫氰酸钠洗脱的部分里回收。将该洗脱物对含有50 mM氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析。
(4)由HI-MCA识别的抗原的N末端氨基酸序列分析
用2-巯基乙醇处理后，按照Laemmli，Nature，227：680-685，1970的方法，该亲和层析洗脱物用5-20％的聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用溶于50％甲醇-10％乙酸的0.25％考马斯亮蓝R250(CBB)染色，以显示分子量约130Kd的一条带(图5)。该多肽称为HPGp130并用下述方法测定N末端氨基酸序列。
首先，用2-巯基乙醇处理纯化的HPGp130多肽，然后用5％聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE。电泳后，用转移缓冲液(10mM N-环己基-3-氨基-丙磺酸，10％甲醇，pH11)清洗，并置于预先相继用100％甲醇和一转移缓冲液浸泡的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore制造)上，然后用TRANS-BLOT CELL(Bio Rad制造)于20V转移过夜。将转移后的PVDF膜用水清洗，并用溶解在45％甲醇-10％乙酸中的0.1％酰胺黑染色30秒，接着用蒸馏水脱色。
切下分子量130Kd的染色带，并用蛋白测序仪分析(AppliedBiosystems 477A)。分析了N末端的13个氨基酸残基，结果发现该氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的Lys-Trp-Leu-Glu-Val-Tyr-Ser-Ser-Ser-Val-Lys-Leu-Ser。
(5)通过HPGp130诱导HI抗体生产
研究了HPGp130多肽是否可以诱导HI抗体产生。将HPGp130多肽溶液(约40μg/ml)和等量的弗氏完全佐剂混合制备的乳剂(1ml；每只动物约20μgHPGp130多肽)皮下注射到豚鼠背部二个位点进行免疫。约三周后，将用弗氏不完全佐剂同样制备的1ml乳剂皮下注射到背部的二个位点。又过了二周后，将用弗氏不完全佐剂制备的乳剂加强注射到背部的二个位点，此时起四周后，将该试验动物放血。按照上述方法测定所得的抗血清HI抗体效价，显示出高HI抗体效价(5,120倍)。因此，发现该HPGp130多肽诱导的HI抗体生产深入参与抵抗鸟类传染性鼻炎的保护作用。
(6)由抗HPGp130多肽豚鼠血清识别的肽
用Western印迹法分析由抗HPGp130多肽豚鼠血清识别的多肽。首先，用2-巯基乙醇处理纯化的HPGp130多肽和在补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基中培养的HPG A血清型221菌株细胞并进行SDS-PAGE。电泳完成后，将该胶浸入转移缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，20％乙醇，pH8.3)5分钟，并置于预先相继在100％甲醇和该转移缓冲液中浸泡的PVDF膜上，然后用TRANS-BLOT SD CELL(BioRad制造)于7V转移1小时。将该膜用含5％脱脂乳的PBS于4℃覆盖过夜，用PBS-T清洗，然后与用含5％脱脂乳的PBS-T稀释1,000倍的抗HPGp130多肽豚鼠血清于室温反应2小时。用PBS-T清洗后，将以含有5％脱脂乳的PBS-T稀释2,000倍的过氧化物酶标记的抗豚鼠IgG(Zymed制造)于室温反应2小时。用PBS-T清洗后，将该膜浸入含有5mg四盐酸3，3′-二氨基联苯胺(DAB；Dojin Kagaku K.K.制造)和3μl过氧化氢的10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中反应。结果，抗HPGp130多肽豚鼠血清识别该HPGp130多肽和一可能是该多肽前体的分子量约160Kd的条带(图6)。
(7)HPGp130多肽的免疫原性
按照下述方法，混合HPGp130多肽溶液(约40μg/ml)和等量的弗氏完全佐剂制备乳剂(含有约10μg HPGp130多肽)，通过在腿部皮下注射0.5ml该乳剂免疫10只5周龄的SPF白来亨鸡。三周后，在这些鸡的腿部皮下注射0.5ml用弗氏不完全佐剂类似制备的乳剂。二周后，用以类似方法用弗氏不完全佐剂制备的乳剂在这些鸡的腿部皮下加强注射。第一次免疫七周后，用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击这些鸡。作为对照，以三周的间隔用补加了氢氧化铝凝胶(按铝计：0.5mg/ml)的0.25％福尔马林灭活的HPG A血清型221菌株(灭活前细胞数量：4×108细胞/ml)0.5ml二次免疫一组，另一组未免疫，对这二个对照组都同样进行免疫攻击。结果示于表2。用HPGp130多肽或用福尔马林灭活细胞免疫的二组在所有鸡中都表现出抵抗该病起病的保护作用。而在未免疫组中，所有鸡都表现出病症。
                                表2
免疫组               检测的鸡    受保护的鸡   保护率(％)
纯化的HPGp130           10           10           100
福尔马林灭活221菌株     10           10           100
未免疫对照              8            0            0
实施例3：克隆编码来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株多肽(A血清
型HMTp210)的基因
(1)从基因组文库中筛选
将副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株细胞接种于5ml补加了鸡血清的鸡肉浸液培养基中，于37℃振荡培养过夜，离心收集细胞。通过PBS离心清洗得到的细胞后，用Sepagene试剂盒(Sanko Junyaku K.K.制造)并按照其所附的方法从细胞里提取和纯化DNA。将该DNA溶于50μl的TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)中，将得到的溶液作为基因组DNA溶液使用。然后，使用cDNA快速克隆试剂盒(cDNA Rpaid Cloning Module)-λgt11(Amersham制造)，按照其所附的方法，将用限制性内切酶EcoRI消化的0.2μg该基因组DNA连接到用限制性内切酶EcoRI消化的0.5μgλgtll臂上。使用λ-DNA体外包装试剂盒(In Vitro packaging module)(Amersham制造)，按照其所附的方法，将该连接产物插入λ噬菌体。将得到的重组噬菌体溶液作为基因组文库使用。
将上述基因组文库溶液加入在10mM硫酸镁水溶液中有约108细胞的大肠杆菌菌株Y1090(Amersham制造)悬液中，于37℃吸收15分钟。在其中加入于45℃温热的上层LB软琼脂培养基(1000ml含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、氨苄青霉素50mg、麦芽糖4g和琼脂8g，pH7)。将该混合物铺到LB琼脂培养基(1000ml含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、氨苄青霉素50mg和琼脂15g，pH7)上，于42℃培养3小时。将浸过10mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)水溶液的硝酸纤维素膜风干，覆盖到上述平板上并于37℃培养过夜。然后将该硝酸纤维素膜从该平板上揭起，将该膜用PBS-T清洗并用含5％脱脂乳的PBS于室温覆盖2小时。然后，重复实施例2描述的步骤，以使抗HPGp130多肽豚鼠血清、过氧化物酶标记的抗豚鼠IgG和一底物相继反应。这一系列步骤产生表达与副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的抗HPGp130豚鼠血清特异性反应的抗原的噬菌斑。按照上述方法用免疫法筛选了约5,000个噬菌斑，得到了43个阳性噬菌斑。在SM缓冲液(含有0.1M氯化钠、10mM硫酸镁和0.01％明胶的50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5)中回收这些阳性噬菌斑，并在加入几滴氯仿后储存于4℃。象初次筛选那样，对回收的噬菌斑中的10个噬菌斑进一步进行第二次和第三次筛选。
将在免疫学筛选中发现为阳性的重组λgtll噬菌体加入在10mM硫酸镁水溶液中有约108细胞的大肠杆菌菌株Y1090悬液中，于37℃吸收15分钟。在其中加入10ml LB液体培养基(含有0.4％麦芽糖、5mM氯化钙和50μg/ml氨苄青霉素)并将该细胞于37℃进一步培养过夜。在加入几滴氯仿溶菌后，将该溶菌溶液去除完整的大肠杆菌细胞和碎片。在5ml所得的培养上清液中加入等量的含有20％聚乙二醇6,000的2.5M氯化钠水溶液，将该混合物置于冰上1小时。以10,000rpm离心后，将沉淀的λgtll噬菌体进行酚处理和异丙醇沉淀以回收噬菌体DNA。将150μg得到的噬菌体DNA用EcoRI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以分离得自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的DNA片段。使用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia制造)，按照其所附的方法，从该胶上洗脱和回收DNA片段。所有从10个阳性噬菌体得到的该DNA片段的长度都约为1.2kb。将得自一克隆(2号克隆)噬菌体的DNA片段(以下称为“HPG1.2k DNA”)用于以下试验中。
(2)HPG1.2k DNA片段的核苷酸序列
用EcoRI消化质粒pUC119(Takara Shuzo K.K制造)，并用碱性磷酸酶处理以将5′末端脱磷酸。将酶切的pUC119 DNA用酚和氯仿处理，然后通过乙醇沉淀回收。用DNA连接试剂盒2版(Takara Shuzo K.K.制造)连接酶切的pUC119和该HPG1.2k DNA片段。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109(Takara Shuzo K.K.制造)感受态细胞，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长琼脂培养基(BIO101制造)上于37℃培养过夜。将该琼脂培养基上生长的菌落接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的0.5ml环状生长培养基上于37℃培养5小时。用碱法从这些细胞中提取质粒，将该质粒用EcoRI消化后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以检测包含与得自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的1.2k DNA长度相等的DNA片段的重组质粒，因此确认了转化的大肠杆菌。
将得到的大肠杆菌转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上培养，然后通过PEG沉淀法从这些细胞中回收该重组质粒(以下称为“pUA1.2”)。采用引物步查法，用DNA测序仪(AppliedBiosytems377)分析该HPG1.2k DNA片段的核苷酸序列。结果，确定了一1170个核苷酸的序列。发现该HPG1.2k DNA的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1自No.1988至No.3157编码下述A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列的序列，并编码在此区域内没有起始密码子和终止密码子的389个氨基酸残基。也显示了一对应的氨基酸序列，该序列与HPGp130多肽的N末端氨基酸序列没有相同序列。因此，认为该HPG1.2k DNA编码HPGp130多肽的一部分。
(3)克隆HPG3.5k DNA
使用DIG-DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim制造)，按照其所附的方法，用地高辛配基(DIG)标记约0.3μg的上述HPG1.2kDNA。用几种限制性内切酶酶切副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的基因组DNA后，将适量的酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后转移到Hybond N+膜(Amersham制造)上。使用该DIG标记的HPG1.2k DNA作为探针，用DIG核酸检测试剂盒(BoehringerMannheim制造)按照其所附方法进行Southern杂交，以检测所需的DNA。结果，用HindIII消化得到的约3.5kb片段与该DIG标记的HPG1.2k DNA片段杂交。因此，用SephaglasTM BandPrep试剂盒按照其所附的方法，在0.8％琼脂糖凝胶电泳分离、洗脱和回收该片段。
另一方面，用HindIII消化质粒pUC119，然后碱性磷酸酶处理以将5′末端脱磷酸。切割的pUC119 DNA用酚和氯仿处理，然后通过乙醇沉淀回收。用DNA连接试剂盒版本2连接切割的pUC119和上述来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组的HindIII消化产物(约3.5kb)。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109感受态细胞，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长琼脂培养基上于37℃培养过夜。向有转化的大肠杆菌生长的琼脂培养基覆盖Hybond N+膜以提起菌落。使用DIG标记的HPG1.2k DNA作为探针，用常规方法进行菌落杂交并用DIG核酸检测试剂盒筛选阳性菌落。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上培养这些阳性菌落。用PEG沉淀法从该细胞中回收质粒。所得的重组质粒(以下称为“pUA3.5”)用HindIII消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳以分离得自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的3.5kb DNA片段。使用SephaglasTM BandPrep试剂盒，按照其所附的方法，洗脱和回收该DNA片段(以下称为“HPG3.5k DNA”)。本申请人已于1996年9月5日将用该重组质粒转化的大肠杆菌UA3.5JM作为FERM BP-6083保藏于工业科学技术局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)。
(4)HPG3.5k DNA的表达
表达载体pTrcHisC(InVitrogen制造)用HindIII消化，然后用碱性磷酸酶处理以将5′末端脱磷酸。酶切的pTrcHisC DNA用酚和氯仿处理，然后通过乙醇沉淀回收。用DNA连接试剂盒2版连接酶切的pTrcHisC和上述HPG3.5k DNA。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109的感受态细胞，然后在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长琼脂培养基上于37℃培养过夜。将该琼脂培养基上生长的菌落接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的0.5ml环状生长培养基上于37℃培养5小时。用碱法从这些细胞中提取质粒，该质粒用HindIII消化后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，以检测包含与来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的3.5k DNA长度相等的DNA片段的重组质粒，因此确认了转化的大肠杆菌。
将得到的大肠杆菌转化体平板接种于1ml含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长琼脂培养基上，于37℃培养3小时。在其中加入IPTG(最终浓度为1mM)并于37℃将转化体再培养3小时。从培养物中离心收集细胞并悬浮于50μl PBS中。将该细胞悬液(10μl)与等量的2％SDS混合，将混合物煮沸5分钟，然后将2μl点到硝酸纤维素膜上。将该硝酸纤维素膜风干，然后用含5％脱脂乳的PBS于4℃覆盖过夜。然后，重复实施例2描述的步骤，以使抗HPGp130多肽豚鼠血清、过氧化物酶标记的抗豚鼠IgG和一底物相继反应。这一系列步骤给出了被重组质粒转化的大肠杆菌，其中HPG3.5k DNA的连接方向正确并表达与抗HPGp130豚鼠血清特异性反应的抗原。
(5)HPG3.5k-HIS多肽的免疫原性
将得到的大肠杆菌转化体接种于200ml含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上于37℃培养3小时。在其中加入IPTG(最终浓度1mM)并于37℃将转化体再培养3小时。从培养物中离心收集细胞并悬浮于10mlPBS中。在悬浮液中以100μg/ml加入溶菌酶，并于4℃反应1小时。用Branson Sonifer350于4℃对悬浮液超声处理10分钟进行溶菌。  离心去除完整的细胞，将得到的上清液用做粗HPG3.5k-HIS多肽。
彻底混合粗HPG3.5k-HIS多肽溶液和等量的弗氏完全佐剂制备乳剂，通过在腿部皮下注射0.5ml该乳剂，免疫10只8周龄的SPF白来亨鸡。三周后，在这些鸡的腿部皮下注射0.5ml用弗氏不完全佐剂类似制备的乳剂。二周后，用以类似方法用弗氏不完全佐剂制备的乳剂在这些鸡的腿部皮下加强注射。第一次免疫七周后，用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株攻击这些鸡。作为对照，按照实施例2(7)描述的，一组用福尔马林灭活的HPG A血清型221菌株免疫，另一组未免疫，对这二个对照组都类似地进行攻击。结果示于表3。用粗HPG3.5k-HIS多肽免疫组的10只鸡中有七只表现出抵抗该病起病的保护作用。用福尔马林灭活细胞免疫的组在所有鸡中都表现出抵抗该病起病的保护作用，而在未免疫组中，所有鸡都表现出病症。
                            表3
免疫组              检测的鸡   被保护的鸡  保护率(％)
粗HPG3.5k-HIS           10           7           70
福尔马林灭活221菌株     10           10          100
未免疫对照              8            0           0
(6)HPG3.5k DNA片段的核苷酸序列
按照上述方法用DNA测序仪分析HPG3.5k DNA片段的核苷酸序列。结果，确定了一个3450个核苷酸的序列。HPG3.5k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1的自核苷酸No.1至No.3450的核苷酸序列。发现了一个编码的氨基酸序列与HPGp130多肽的N末端氨基酸序列相同的区域。在与HPGp130多肽的同一框架中得到了来自HPG3.5k DNA的开放读框，并发现翻译起始于核苷酸No.243以编码1069个氨基酸残基。在该区域内没有终止密码子，因此推测HPG3.5kDNA编码HPGp130多肽的一部分。也显示了一对应的氨基酸序列。
(7)HPG4.1k DNA的克隆
按照上述方法，用DIG标记上述HPG3.5k DNA。用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的基因组DNA后，使用该DIG标记的HPG3.5k DNA或HPG1.2k DNA作为探针，按照实施例3(3)描述的方法进行Southern杂交。结果，用该DIG标记的HPG3.5k DNA作为探针，检测到了约5.5kb、约4.1kb和约1kb的DNA。用该DIG标记的HPG1.2k DNA作为探针时，检测到了约4.1kb和约1kb的DNA。因为如图7所示在该HPG3.5k DNA片段内有二个XhoI位点，因此认为约5.5kb的DNA是对应于从第一个XhoI酶切位点至5′位点的片段，约4.1kb的DNA是对应于从第二个XhoI酶切位点至3′位点的片段，约1kb的DNA片段是这二个XhoI位点之间的片段。因此，在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分离和回收该约4.1kb的片段。
如图8所示，质粒pSP72(Promega制造)用XhoI和XbaI消化，然后在将5′端脱磷酸后，与上述得自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组的XhoI-XbaI消化物(约4.1kb)连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。使用该DIG标记的HPG3.5k DNA作为探针对得到的大肠杆菌转化体进行菌落杂交，以筛选阳性菌落。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上培养该阳性菌落。用PEG沉淀法从这些细胞中回收质粒。所得的其中加入得自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的XhoI-XbaI消化片段(以下称为“HPG4.1k DNA”)的质粒(以下称为“pSA4.1”)用XhoI和XpnI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，以分离和回收约4.1kb、在上述HPG4.1k DNA上增加了来自质粒pSP72的XbaI-KpnI片段的DNA片段。
(8)HPG4.1k DNA的表达
按照实施例3(4)的描述，将表达载体pTrcHisC用XhoI和XpnI消化，在将5′末端脱磷酸后，与上述约4.1kb的XhoI-XpnI消化物连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109的细胞。从得到的大肠杆菌转化体中得到了被重组质粒转化的大肠杆菌，其中HPG4.1k DNA的连接方向正确，并表达与抗HPGp130豚鼠血清特异性反应的抗原。
(9)HPG4.1k-HIS多肽的免疫原性
将得到的大肠杆菌转化体接种于200ml含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上，于37℃培养3小时。在其中加入IPTG(最终浓度为1mM)并于37℃将转化体再培养3小时。从该培养物中离心收集细胞并悬浮于10mlPBS中。在该悬浮液中以100μg/ml加入溶菌酶，并于4℃反应1小时。于4℃对悬浮液超声处理10分钟进行溶菌。离心去除完整的细胞，将得到的上清液用做粗HPG4.1k-HIS多肽。
彻底混合粗HPG4.1k-HIS多肽溶液和等量的弗氏完全佐剂制备乳剂，通过在腿部皮下注射0.5ml该乳剂免疫10只5周龄的SPF白来亨鸡。约三周后，在这些鸡的腿部皮下注射0.5ml用弗氏不完全佐剂类似制备的乳剂。二周后，用以类似方法用弗氏不完全佐剂制备的乳剂在这些鸡的腿部皮下加强注射。第一次免疫七周后，用副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株免疫攻击这些鸡。作为对照，按照实施例2(7)描述的，一组用福尔马林灭活的HPG A血清型221菌株免疫，另一组未免疫，对这二个对照组都类似地进行攻击。结果示于表4。用粗HPG4.1k-HIS多肽免疫组的所有10只鸡都表现出抵抗该病起病的保护作用。用福尔马林灭活细胞免疫的组在所有鸡中都表现出抵抗该病起病的保护作用，而在未免疫组中，所有鸡都表现出病症。
                        表4
免疫组             检测的鸡   被保护的鸡   保护率(％)
粗HPG4.1k-HIS          10          10          100
福尔马林灭活221菌株    10          10          100
未免疫对照             8           0           0
(10)HPG4.1k DNA片段的核苷酸序列
按照上述方法用DNA测序仪分析HPG4.1k DNA片段内一个区域的核苷酸序列，该区域与HPG3.5k DNA片段不重叠，即该区域的范围从HindIII酶切位点至XbaI酶切位点。结果，确定了一个2831个核苷酸的序列。所分析的HPG4.1k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQID NO：1中自核苷酸No.3445至No.6275的核苷酸序列。在所述DNA片段的该区域内未发现终止密码子。也显示了一对应的氨基酸序列。
(11)HPG6.7k DNA的克隆
用XhoI和PstI酶切副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的基因组DNA后，使用该DIG标记的HPG3.5k DNA或HPG1.2k DNA作为探针，按照实施例3(3)描述的方法进行Southern杂交。结果，用该DIG标记的HPG3.5k DNA作为探针，检测到了约9.4kb、约6.7kb和约1kb的DNA。用该DIG标记的HPG1.2k DNA作为探针时，检测到了约6.7kb和约1kb等DNA。因为如上所述在该HPG3.5k DNA片段内有二个XhoI位点，因此认为约9.4kb的DNA是对应于从第一个XhoI酶切位点至5′位点的片段、约6.7kb的DNA是对应于从第二个XhoI酶切位点至3′位点的片段，约1kb的DNA片段是这二个XhoI位点之间的片段。因此，在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分离和回收了该约6.7kb的片段。
如图9所示，质粒pSP72用XhoI和PstI消化，并在将5′端脱磷酸后，与上述来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株基因组的XhoI-PstI消化物(约6.7kb)连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。使用该DIG标记的HPG3.5k DNA作为探针对得到的大肠杆菌转化体进行菌落杂交以筛选阳性菌落。
在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上培养该阳性菌落。用PEG沉淀法从这些细胞中回收质粒。所得的重组质粒以下称为“pSA6.7”。。本申请人已于1997年8月27日将用该重组质粒转化的大肠杆菌SA6.8JM作为FERM BP-6081保藏于工业科学技术局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)。
(12)HPG2.7k DNA的克隆
因为该加入得到的重组质粒(pSA6.7)的约6.7kb的DNA片段(以下称为“HPG6.7k DNA”)包含上述HPG4.1k DNA，将HPG6.7kDNA和HPG4.1k DNA之差的约2.7kb的片段(以下称为“HPG2.7k DNA”)亚克隆。将pSA6.7用XbaI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，以分离和回收约2.7kb、在上述HPG2.7k DNA上增加了来自质粒pSP72的PstI-XbaI片段的DNA片段。
然后质粒pSP72用XbaI消化，并在将5′端脱磷酸后，与上述约2.7kb的XbaI消化物连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。在含有50μg/ml氨苄青霉素的环状生长培养基上培养得到的大肠杆菌转化体。用PEG沉淀法从这些细胞中回收质粒。所得的重组质粒以下称为“pSA2.7”。
(13)HPG2.7k DNA的核苷酸序列
按照上述方法用DNA测序仪分析HPG2.7k DNA片段的核苷酸序列。结果，确定了一个2661个核苷酸的序列。HPG2.7k DNA片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1中自核苷酸No.6270至No.8930的核苷酸序列。在该区域内发现一个终止密码子。也显示了一对应的氨基酸序列。
已发现由总共8930个核苷酸组成的SEQ ID NO：1的核苷酸序列包括一从核苷酸No.243起始的可以编码2042个氨基酸残基的开放读框。包含该2042个氨基酸残基的多肽以下也称为“A血清型HMTp210”。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索发现与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该A血清型HMTp210多肽是一新物质。
也提示在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中可能存在着另一个从核苷酸No.8375起始的可以编码185个氨基酸残基的开放读框。在该序列中没有发现终止密码子。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索发现与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该开放读框编码的多肽也是一新物质。
实施例4：寻找可以与来自除副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株之外的
其它菌株的HPG1.2k DNA杂交的DNA片段
按照实施例3(1)的描述，从总共9个菌株制备基因组DNA，即HPG A血清型221菌株、083菌株、W菌株、德国菌株和乔治亚菌株、HPG B血清型Spross菌株和0222菌株以及HPG C血清型Modesto菌株和53-47菌株。用限制性内切酶EcoRI酶切所制备的基因组DNA后，使用该DIG标记的HPG1.2k DNA作为探针，按照实施例3(3)描述的方法进行Southern杂交。结果，在每个菌株中都检测到了可以与HPG1.2k DNA杂交的片段，尽管每个片段的长度随菌株而变化(图10)。
实施例5：克隆编码来自副鸡嗜血杆菌C血清型的多肽(C血清型
HMTp210)的基因
(1)从基因文库中筛选
按照实施例3(1)描述的同样方法制备副鸡嗜血杆菌C血清型53-47菌株的基因组文库。即使用cDNA Rapid Cloning Module-λgtll，将用限制性内切酶HindIII消化的HPG C血清型53-47菌株的基因组DNA连接到用限制性内切酶HindIII消化的λDASHII(STRATAGENE制造)臂上。使用λ-DNA体外包装试剂盒，将该连接产物插入λ噬菌体。将得到的重组噬菌体溶液作为基因组文库使用。
将上述基因组文库溶液加入在10mM硫酸镁水溶液中有约108细胞的大肠杆菌菌株XL1-Blue MRA(P2)(STRATAGENE制造)悬液中于37℃吸收15分钟。在其中加入于45℃温热的上层LB软琼脂培养基(1000 ml含有胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、氨苄青霉素50mg、麦芽糖4g和琼脂8g，pH7)。将该混合物铺到LB琼脂培养基上，于37℃培养过夜。在有转化的大肠杆菌生长的琼脂培养基上覆盖Hybond N+膜以提起这些噬菌体斑。使用DIG标记的A血清型HPG3.5k DNA作为探针，以常规方法进行噬菌斑杂交并筛选阳性克隆。按照上述方法用免疫法筛选了约1,000个噬菌斑，得到了37个阳性噬菌斑。象初次筛选那样，对获得的噬菌斑中的10个噬菌斑进一步进行第二次和第三次筛选。
将在噬菌斑杂交中发现为阳性的重组λDASHII噬菌体加入在10mM硫酸镁水溶液中有约108细胞的大肠杆菌菌株XL1-Blue MRA(STRATAGENE制造)悬液中，于37℃吸收15分钟。按照实施例3(1)的描述，回收该噬菌体DNA。得到的噬菌体DNA用HindIII消化，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以分离回收来自副鸡嗜血杆菌C血清型53-47菌株的DNA片段。从10个阳性噬菌体得到的所有DNA片段的长度都约为13.5kb。将得自一克隆(1号克隆)噬菌体的DNA片段(以下称为“HPG-C1 DNA”)用于以下试验中。
(2)HPG-C1 DNA的片段化和亚克隆
由于该约13.5kb的HPG-C1 DNA太大而不能亚克隆到质粒载体上，因此用几种限制性内切酶将它酶切，并将得到的适量DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果，当用XbaI消化时，检测到了约6.9kb、约5.6kb和约0.9kb的DNA片段。
质粒pUC119用HindIII和XbaI消化并在将5′端脱磷酸后，与上述HPG-C1 DNA的XbaI消化物连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。另外，培养用包含约5.6kb或约0.9kb DNA片段的重组质粒转化的大肠杆菌，并用PEG沉淀法从这些细胞中回收质粒。所得的重组质粒(以下称为“pU-C2”和“pU-C3”，分别含有约5.6kb和约0.9kb的DNA片段)用HindIII-XbaI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，以分离和回收约5.6kb和约0.9kb的DNA片段(以下称为“HPG-C2 DNA”和“HPG-C3 DNA”)。本申请人已于1997年8月27日将用该重组质粒pU-C2转化的大肠杆菌U-C2JM作为FERMBP-6082保藏于工业科学技术局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)。
质粒pUC119用XbaI消化，并在将5′端脱磷酸后，与上述HPG-C1 DNA的XbaI消化物连接。用这些连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。另外，培养用包含约6.9kb DNA片段的重组质粒转化的大肠杆菌，并用PEG沉淀法从该细胞中回收质粒。所得的重组质粒(以下称为“pU-C4”)用XbaI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳以分离和回收约6.9kb的DNA片段(以下称为“HPG-C4 DNA”)。本申请人已于1997年8月27日将用该重组质粒pU-C4转化的大肠杆菌U-C4JM作为FERM BP-6080保藏于工业科学技术局国立生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)。
将每种所得的HPG-C2、HPG-C3和HPG-C4 DNA片段点在Hybond N+膜上。然后，使用上述DIG标记的HPG3.5k DNA或HPG4.1k或同样以DIG标记的HPG2.7k DNA作为探针，进行斑点杂交。当用DIG标记的HPG3.5k DNA或DIG标记的HPG4.1k DNA作为探针时，检测到了HPG-C4 DNA。另一方面，当用HPG2.7k DNA作为探针时，检测到了HPG-C2 DNA。由此推测，如图11所示，HPG-C3、HPG-C4和HPG-C2以此序列从5′端起定位，并且HPG-C4主要包括编码该多肽的区域。
(3)HPG-C4 DNA片段的核苷酸序列
按照上述方法用DNA测序仪分析HPG-C4 DNA片段的核苷酸序列。结果，确定了一个6871个核苷酸的序列。HPG-C4 DNA片段的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：5中自核苷酸No.1至No.6871的核苷酸序列。根据与A血清型HMTp210的编码基因的高度同源性，在与A血清型HMTp210的编码基因相同的框架内从HPG-C4 DNA得到了一个开放读框，并发现它从核苷酸No.848开始翻译，以编码2008个氨基酸残基。然而，在所述DNA片段区域内未发现终止密码子。也显示了一对应的氨基酸序列。
(4)一部分HPG-C2 DNA片段的核苷酸序列
因为在HPG-C4 DNA片段区域内未发现终止密码子，分析了位于HPG-C4 DNA片段3′位点的HPG-C2 DNA片段5′位点的核苷酸序列。如图11所示，在HPG-C2 DNA片段内有三个AccI酶切位点。也发现从克隆位点(即XbaI酶切位点)至第一个AccI酶切位点的片段的长度是约0.6Kb，正如琼脂糖凝胶电泳所证实的那样。因此，按照上述方法用DNA测序仪分析该约0.6Kb片段的核苷酸序列。结果，确定了一个621个核苷酸的序列。HPG-C2 DNA片段的一部分的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：5中自核苷酸No.6866至No.7486的核苷酸序列。在HPG-C2 DNA的这一部分区域内发现了一个终止密码子。也显示了一对应的氨基酸序列。
已发现由总共7486个核苷酸组成的SEQ ID NO：5的核苷酸序列包括一从核苷酸No.848起始的可以编码2039个氨基酸残基的开放读框。包含该2039个氨基酸残基的多肽以下称为“C血清型HMTp210”。用现有数据库(GeneBank和EMBL)进行的同源检索发现与任何已知核苷酸序列和氨基酸序列没有同源性，表明该C血清型HMTp210多肽是一新物质。
编码C血清型HMTp210多肽的核苷酸序列和编码A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列同源性检索显示约80％的同源性。另外发现5′位点的约3.4kb区和3′位点的约1.2kb区显示极高的同源性，而在这些5′和3′区之间的约1.5kb显示低同源性。这种情况也适用于由这些基因编码的对应的多肽。
实施例6：来自HPG A血清型、B和C细胞基因组DNA的HMTp210
基因的PCR扩增
按照实施例3(1)的描述，从总共9个菌株制备基因组DNA，即HPG A血清型221菌株、083菌株、W菌株、德国菌株和乔治亚菌株、HPG B血清型Spross菌株和0222菌株以及HPG C血清型Modesto菌株和53-47菌株。基于编码A血清型HMTp210多肽的核苷酸序列，制备一具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的合成DNA作为上游PCR引物和一具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的合成DNA作为下游PCR引物。设计这些引物以将BamHI识别序列分别加到5′位点，可以扩增全长的A血清型HMTp210多肽翻译区。使用这些引物，以上述制备的基因组DNA作为模板进行PCR。使用LA PCR试剂盒2版(Takara Shuzo K.K.制造)在下述条件下进行PCR：于94℃反应1分钟后，进行98℃40秒和60℃10分钟的反应循环30次，接着在72℃反应10分钟。在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分析得到的PCR产物确认了在所有这些菌株中约6.1Kb的扩增片段(图12)。
实施例7：全长A和C血清型HMTp210多肽的表达
(1)A血清型HMTp210多肽的表达
在实施例6中以来自副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株的基因组DNA为模板得到的PCR产物用BamHI消化。在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分离后，用SephaglasTM BandPrep试剂盒洗脱和回收约6.1Kb的扩增部分。
质粒pUC119用BamHI消化，并在将5′端脱磷酸后，与上述约6.1Kb的扩增片段连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。另外，培养用包含约6.1kb DNA片段的重组质粒转化的大肠杆菌细胞，用PEG沉淀法从该细胞中回收质粒。将所得的重组质粒(以下称为“pU-AP1”)用BamHI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳以分离和回收约6.1kb的DNA片段(以下称为“HPG-AP1 DNA”)。
按照实施例3(4)的描述，将表达载体pTrcHisA(InVitrogen制造)用BamHI消化，在将5′末端脱磷酸后，与上述HPG-AP1 DNA连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109的细胞。从得到的大肠杆菌转化体中得到了用重组质粒转化的大肠杆菌，其中HPG-AP1 DNA的连接方向正确，并表达与抗HPGp130豚鼠血清特异性反应的抗原。
(2)表达C血清型HMTp210多肽
在实施例6中以来自副鸡嗜血杆菌C血清型53-47菌株的基因组DNA为模板得到的PCR产物用BamHI消化。在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分离后，回收约6.1Kb的扩增片段。
质粒pUC119用BamHI消化，并在将5′端脱磷酸后，与上述约6.1Kb的扩增片段连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109细胞。另外，培养用包含约6.1kb DNA片段的重组质粒转化的大肠杆菌细胞，并用PEG沉淀法从该细胞中回收质粒。所得的重组质粒(以下称为“pU-CP1”)用BamHI消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上电泳以分离和回收约6.1kb的DNA片段(以下称为“HPG-CP1 DNA”)。
按照实施例3(4)的描述，将表达载体pTrcHisA(InVitrogen制造)用BamHI消化，在将5′末端脱磷酸后，与上述HPG-CP1 DNA连接。用该连接产物转化大肠杆菌菌株JM109的细胞。从得到的大肠杆菌转化体中得到了用重组质粒转化的大肠杆菌，其中HPG-CP1 DNA的连接方向正确，并表达与抗HPGp130豚鼠血清特异性反应的抗原。
                       序列表
SEQ ID NO.：1
序列长度：8930
序列类型：核酸
链型：双链
拓扑学：线性
分子类型：基因组DNA
来源：副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株
序列描述：
AAGCTTTTTC GGGCGATTGA AGACGGAATG TTACTTTGGC AAGCGGTTTG AAACCTTTGA     60
ACAGCTTGAA AAAGTGATTC ACGAGTACAT TCATTACTAC AACAATGAGC GTATTCAAGT     20
GAAGCTCAAA GGACTAAGCC CTGTGGAATA CAGAACTCAG TCCTTGAATG AAATTAGAAT     80
ATAGTCTAAC TTTTTGGGGC AGATCAACAC TCATTTTTAA TATTAATATA GGAAAATGAT    240
TT ATG AAT AAA GTT TTT AAA ATT AAA TAT TCT GTT GTA AAA CAA GAA       287
   Met Asn Lys Val Phe Lys Ile Lys Tyr Ser Val Val Lys Gln Glu
   -70                 -65                 -60
ATG ATT GTG GTT TCA GAG CTA GCA AAT AAT AAA GAT AAA ACA GCT AGC      335
Met Ile Val Val Ser Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Lys Thr Ala Ser
-55                 -50                 -45                 -40
CAA AAA AAC ACA CAT AAT ACT GCA TTT TTT CAA CCG CTA TTT ACA AAG      383
Gln Lys Asn Thr His Asn Thr Ala Phe Phe Gln Pro Leu Phe Thr Lys
                -35                 -30                 -25
TGT ACA TAT CTT GCT CTT CTC ATT AAT ATC GCA CTA GGA GCA TCA TTA      431
Cys Thr Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Asn Ile Ala Leu Gly Ala Ser Leu
            -20                 -15                 -10
TTC CCT CAA TTA GCT AAT GCG AAG TGG TTA GAG GTT TAT AGT AGC TCC      479
Phe Pro Gln Leu Ala Asn Ala Lys Trp Leu Glu Val Tyr Ser Ser Ser
        -5                  1               5
GTA AAA CTA TCT ACT GTT AGT GCA CAA AGT AAT AGT GTT AAT CTT AAT     527
Val Lys Leu Ser Thr Val Ser Ala Gln Ser Asn Ser Val Asn Leu Asn
10                  15                  20                  25
CCA TCG GGA GCT GAG AGT GTT GGC ACA AAT AGC CCA CAA GGG GTT GCT     575
Pro Ser Gly Ala Glu Ser Val Gly Thr Asn Ser Pro Gln Gly Val Ala
                30                  35                  40
ATT GGC TAT GGT GCA ACC AAC GAT AGA TCT GCA ACA GGA GCT ATT GCT     623
Ile Gly Tyr Gly Ala Thr Asn Asp Arg Ser Ala Thr Gly Ala Ile Ala
            45                  50                  55
CTT GGG GTT GGG GTA AAA AAT GAA ACT TTA GCG AAA GAC TCT ATT GCC     671
Leu Gly Val Gly Val Lys Asn Glu Thr Leu Ala Lys Asp Ser Ile Ala
        60                  65                  70
ATT GGT TAT GGG GCA AAA AAT GAA AGC ACA GCA CCA AGT TCT GTG ACT     719
Ile Gly Tyr Gly Ala Lys Asn Glu Ser Thr Ala Pro Ser Ser Val Thr
    75                  80                  85
ATT GGA AAA CAG GCG ATT AAC CGT TTT GAA AAA TCT ATT GTG ATG GGT     767
Ile Gly Lys Gln Ala Ile Asn Arg Phe Glu Lys Ser Ile Val Met Gly
90                  95                  100                 105
CTT AAT GCT TAT ACA CAA TTA GAT CCC CGT GGA ACT AGT AAA GAA ACC     815
Leu Asn Ala Tyr Thr Gln Leu Asp Pro Arg Gly Thr Ser Lys Glu Thr
                110                 115                 120
CGT CAA GGT TCT GTA GTG ATT GGG GAA AAT GCG AAA AGT GCT GGG AAT     863
Arg Gln Gly Ser Val Val Ile Gly Glu Asn Ala Lys Ser Ala Gly Asn
            125                 130                 135
CAA TCT GTT TCT TTA GGG CAA AAT TCG TGG TCA AAA ACC AAT TCT ATT     911
Gln Ser Val Ser Leu Gly Gln Asn Ser Trp Ser Lys Thr Asn Ser Ile
        140                 145                 150
TCT ATT GGG GCA GGA ACC TTT GCG GAA GGA AAA TCA AGC ATT GCT ATA     959
Ser Ile Gly Ala Gly Thr Phe Ala Glu Gly Lys Ser Ser Ile Ala Ile
    155                 160                 165
GGG ACT GAT AAA ATA TCA GGG ACT AAG TAT AAT GAC AAA TTG CCT GCT    1007
Gly Thr Asp Lys Ile Ser Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Ala
170                 175                 180                 185
ACT GCT TGG AAT GGA ACA GGC ACT GTT CCG AAA AAC TCC ATT TGG GAT    1055
Thr Ala Trp Asn Gly Thr Gly Thr Val Pro Lys Asn Ser Ile Trp Asp
                190                  195                200
ATA TTT TCT GAG TTA TAT ATG GGG AAA CAG ACT AAC GGC AGA GAT TAT    1103
Ile Phe Ser Glu Leu Tyr Met Gly Lys Gln Thr Asn Gly Arg Asp Tyr
             205                210                 215
GAT ACA ACT ACT CGA GAC CCT AAT AAA CCG GAG GCA TTT TAT AAA TTT    1151
Asp Thr Thr Thr Arg Asp Pro Asn Lys Pro Glu Ala Phe Tyr Lys Phe
        220                 225                 230
AGC GAT TTT AAA GGA AAA TAT GTC AAT ACC CCA ACT GCT TCA CCT ACT    1199
Ser Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Val Asn Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr
    235                 240                 245
TAT GCA GGG AAA TTA GGG GCA ATT GCT CTA GGT TCC CGC ACC ATT GCC    1247
Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Ser Arg Thr Ile Ala
250                 255                 260                 265
GCG GGG GAA ATG TCC ACC GCA GTG GGT TCG TTA GCC TTT GCA TTG GCA    1295
Ala Gly Glu Met Ser Thr Ala Val Gly Ser Leu Ala Phe Ala Leu Ala
                270                  275                280
GAT AGA TCC ACC GCA ATG GGG TTA CGT TCT TTT GTT GCT AAA GAC GCC    1343
Asp Arg Ser Thr Ala Met Gly Leu Arg Ser Phe Val Ala Lys Asp Ala
            285                 290                 295
GTA GGT GGA ACG GCG ATC GGG GAA GAA TCT CGA ACC TTT GCT AAA GAT    1391
Val Gly Gly Thr Ala Ile Gly Glu Glu Ser Arg Thr Phe Ala Lys Asp
        300                 305                  310
TCC GTT GCC ATT GGT AAT AAA ACT GAA GCC TCA AAT GCT GGC TCA ATG    1439
Ser Val Ala Ile Gly Asn Lys Thr Glu Ala Ser Asn Ala Gly Ser Met
    315                 320                 325
GCT TAT GGT TAT AAG GCG AAA GCA GTA GGT GCG GGA GCA ATC GCA ATT    1487
Ala Tyr Gly Tyr Lys Ala Lys Ala Val Gly Ala Gly Ala Ile Ala Ile
330                 335                 340                 345
GGG ACA GAA GTC GCA GCA GGG GCT AAA TTT AAT AGC CAT CAA ACA GGA    1535
Gly Thr Glu Val Ala Ala Gly Ala Lys Phe Asn Ser His Gln Thr Gly
                350                 355                 360
AAT TTA CTA CAG GAT AAT AAT GCT TAT GCT ACC TTA AAA AAT GCC GAT    1583
Asn Leu Leu Gln Asp Asn Asn Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Ala Asp
            365                 370                 375
AAA TCA GAT GAT ACT AAA ACC GGA AAT GCG ATT ACT GTA TTT ACC CAG    1631
Lys Ser Asp Asp Thr Lys Thr Gly Asn Ala Ile Thr Val Phe Thr Gln
        380                 385                 390
TCT TTT GAT AAT ATG CTT ACT AAT GGA TTA CCG CTG GTA AGT GAA AAC    1679
Ser Phe Asp Asn Met Leu Thr Asn Gly Leu Pro Leu Val Ser Glu Asn
    395                 400                 405
GAA ACC TAT TTA ACG ACC TCA GCG GGA GCA ATT AAA AAA ACT GCA ACA    1727
Glu Thr Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Gly Ala Ile Lys Lys Thr Ala Thr
410                  415                420                 425
ACA GAC AGC AGT GCG GGG GGA GGT AAA AAT GCC ATT GCA ATT GGT AGT    1775
Thr Asp Ser Ser Ala Gly Gly Gly Lys Asn Ala Ile Ala Ile Gly Ser
                430                 435                 440
AAA ACC TTT GCC TCT AAA GCA AAT TCT GTG GCA TTA GGG AGC TAT GCC    1823
Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ala Asn Ser Val Ala Leu Gly Ser Tyr Ala
            445                 450                 455
TTA GCC GAT GCC CAA AAT GCC TTT GCA CTA GGT TCT TAT TCT TTT GTG    1871
Leu Ala Asp Ala Gln Asn Ala Phe Ala Leu Gly Ser Tyr Ser Phe Val
        460                 465                 470
GAA TCT TCA GCA ACA AAT ACA ATC ACA ATT GGT GTG GGA AGT TAT GCC    1919
Glu Ser Ser Ala Thr Asn Thr Ile Thr Ile Gly Val Gly Ser Tyr Ala
     475                480                 485
AAA GGG AAA AAC AGT TTC TTA GGG GGG ACT TGG GCA TCA ACC CTT TCA    1967
Lys Gly Lys Asn Ser Phe Leu Gly Gly Thr Trp Ala Ser Thr Leu Ser
490                 495                  500                505
GAT CGG ACA GTT GTG CTA GGG AAT TCC ACT TCA ATT AGC TCA GGT TCT    2015
Asp Arg Thr Val Val Leu Gly Asn Ser Thr Ser Ile Ser Ser Gly Ser
                510                 515                 520
CAG AAT GCA TTA GCA ATC GGG GTG AAT GTC TTT ATT GGT AAT GAT AGT    2063
Gln Asn Ala Leu Ala Ile Gly Val Asn Val Phe Ile Gly Asn Asp Ser
            525                 530                 535
GCT TCT TCA TTG GCA TTA GGT ATG GGT TCT ACT ATT GCG AAA AGT GCC    2111
Ala Ser Ser Leu Ala Leu Gly Met Gly Ser Thr Ile Ala Lys Ser Ala
        540                 545                 550
AAA TCC CCT GAC AGC TTA GCC ATT GGT AAA GAG GCA CGA ATT GAC GCT    2159
Lys Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ile Gly Lys Glu Ala Arg Ile Asp Ala
    555                 560                 565
AAA GAT ACA GAT AAT GGT ACT TTG TAT CAG CCT CAA GTT TAT GAT GAA    2207
Lys Asp Thr Asp Asn Gly Thr Leu Tyr Gln Pro Gln Val Tyr Asp Glu
570                 575                 580                 585
ACT ACT CGA GCC TTT AGA AAC TTT AAT GAA AGT AGC GAT TAT ATG CGT    2255
Thr Thr Arg Ala Phe Arg Asn Phe Asn Glu Ser Ser Asp Tyr Met Arg
                590                 595                 600
CAA GCA ATG GCA TTA GGT TTT AAT GCT AAA GTT TCG CGT GGG GTG GGC    2303
Gln Ala Met Ala Leu Gly Phe Asn Ala Lys Val Ser Arg Gly Val Gly
            605                 610                 615
AAA ATG GAA ACG GGG ATT AAC TCG ATG GCG ATT GGT GCT TAT GCT CAA    2351
Lys Met Glu Thr Gly Ile Asn Ser Met Ala Ile Gly Ala Tyr Ala Gln
        620                 625                 630
GCA ACT TTG CAA AAT TCC ACC GCA CTT GGG GTA GGC TCT AAA ACA GAT    2399
Ala Thr Leu Gln Asn Ser Thr Ala Leu Gly Val Gly Ser Lys Thr Asp
    635                 640                 645
TAC ACT TGG GAA CAG TTA GAA ACC GAT CCT TGG GTA TCT GAA GGG GCA    2447
Tyr Thr Trp Glu Gln Leu Glu Thr Asp Pro Trp Val Ser Glu Gly Ala
650                 655                 660                 665
ATC AGT ATC CCA ACT TCA GGT AAA ACT GGG GTT ATC TCT GTG GGT TCA    2495
Ile Ser Ile Pro Thr Ser Gly Lys Thr Gly Val Ile Ser Val Gly Ser
                670                 675                 680
AAA GGT TCA GAA CGT CGT ATT GTG AAT CTT GCT TCG GGT TCT TCT GAT    2543
Lys Gly Ser Glu Arg Arg Ile Val Asn Leu Ala Ser Gly Ser Ser Asp
            685                 690                 695
ACT GAT GCC GTG AAT GTT GCT CAG TTA AAA ACC GTT GAA GAA CGT TTC    2591
Thr Asp Ala Val Asn Val Ala Gln Leu Lys Thr Val Glu Glu Arg Phe
        700                 705                 710
CTA TCT GAA ATT AAT TTA TTA CAA AAT GGC GGT GGG GTG AAA TAT CTC    2639
Leu Ser Glu Ile Asn Leu Leu Gln Asn Gly Gly Gly Val Lys Tyr Leu
    715                 720                 725
TCT GTT GAA AAA ACG AAT ATC AAT GGA CAA TCG GGG AGA GTG GCT AGC    2687
Ser Val Glu Lys Thr Asn Ile Asn Gly Gln Ser Gly Arg Val Ala Ser
730                 735                 740                 745
CAA ATT CGT AAA GGG GAA AAT TAT GAG CGA TAT GTG AAA TTA AAA ACA    2735
Gln Ile Arg Lys Gly Glu Asn Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Lys Thr
                750                 755                 760
CAA TTG CTC TAT TTA GAT GCA CGA GGA AAA TTA AAT GGA GAG AAG TTT    2783
Gln Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Gly Lys Leu Asn Gly Glu Lys Phe
            765                 770                 775
GAT CAA AAT TCA TTA AAC AAA ATT CGT GCG GTA GTG CAA GAA CTT GAA    2831
Asp Gln Asn Ser Leu Asn Lys Ile Arg Ala Val Val Gln Glu Leu Glu
        780                 785                 790
GCG GAA TAT AGT GGC GAG TTA AAA ACA ACC GCG TCA GCT CTC AAT CAG    2879
Ala Glu Tyr Ser Gly Glu Leu Lys Thr Thr Ala Ser Ala Leu Asn Gln
    795                 800                 805
GTT GCA ACA CAA TTA GAG CAA GAA GTA ACC ACA AAT AAC TTC GAC AAA    2927
Val Ala Thr Gln Leu Glu Gln Glu Val Thr Thr Asn Asn Phe Asp Lys
810                 815                 820                 825
TTT AAT CAA TAT AAA ACG CAG ATT GAG AAT GCA AGC AAT GCG GAT TCA    2975
Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Gln Ile Glu Asn Ala Ser Asn Ala Asp Ser
                830                 835                 840
GCA AGA AAT GTA GGC GGC TTA ACC CCT CAA GCA ATT GCA CAG TTA AAA    3023
Ala Arg Asn Val Gly Gly Leu Thr Pro Gln Ala Ile Ala Gln Leu Lys
            845                 850                 855
GCC AAT AAT AAC TAT CTT AAT GAT GGT GCA AAA GGG CAA GAC AGT ATT    3071
Ala Asn Asn Asn Tyr Leu Asn Asp Gly Ala Lys Gly Gln Asp Ser Ile
        860                 865                 870
GCA TTT GGC TGG CAG GCA AAA ACC TCA GGA GCT AAT AAT GGA TTA GCA    3119
Ala Phe Gly Trp Gln Ala Lys Thr Ser Gly Ala Asn Asn Gly Leu Ala
    875                 880                 885
GGG AAA CAA GCC ATT GCG ATT GGT TTC CAA GCG AAT TCT TCC GCT GAA    3167
Gly Lys Gln Ala Ile Ala Ile Gly Phe Gln Ala Asn Ser Ser Ala Glu
890                 895                 900                 905
AAT GCC ATT TCA ATC GGC ACG AAT TCG GAT ACC TCA ATG ACA GGG GCA    3215
Asn Ala Ile Ser Ile Gly Thr Asn Ser Asp Thr Ser Met Thr Gly Ala
                910                 915                 920
GTG GCG ATT GGT AAA GGT GCA ACG GTT ACT GCG GGT GGA AAA CCT TCC    3263
Val Ala Ile Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Ala Gly Gly Lys Pro Ser
            925                 930                 935
ATT GCA TTG GGG CAA GAT TCG ACG GTT GCC AAT TCC GCA ATT AGC CGT    3311
Ile Ala Leu Gly Gln Asp Ser Thr Val Ala Asn Ser Ala Ile Ser Arg
        940                 945                 950
ACA AGT TCA CCG ATG ATA AAT GGT TTA ATA TTC AAT AAT TTT GCA GGT    3359
Thr Ser Ser Pro Met Ile Asn Gly Leu Ile Phe Asn Asn Phe Ala Gly
    955                 960                 965
TCC CCT GAA ACA CTC GGT GTG TTA AGT ATC GGA ACG GCT GGG AGA GAG    3407
Ser Pro Glu Thr Leu Gly Val Leu Ser Ile Gly Thr Ala Gly Arg Glu
970                 975                 980                 985
CGT AAA ATT GTT AAT GTT GCA GCA GGC GAT GTT TCG CAA GCT TCT ACT    3455
Arg Lys Ile Val Asn Val Ala Ala Gly Asp Val Ser Gln Ala Ser Thr
                990                 995                 1000
GAA GCC ATT AAC GGC TCA CAG CTT TAT GCA ACG AAC TTT ATG TTG AGC    3503
Glu Ala Ile Asn Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Thr Asn Phe Met Leu Ser
            1005                1010                1015
AAA GTG GCT CAA TCT GTT AAG AGC AAC TTT GGT GGC AAT GTA AAT CTT    3551
Lys Val Ala Gln Ser Val Lys Ser Asn Phe Gly Gly Asn Val Asn Leu
        1020                1025                1030
GGC ACT GAT GGC ACA ATT ACA TTT ACA AAT ATT GGC GGC ACA GGG CAA    3599
Gly Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln
    1035                1040                1045
GCT ACA ATC CAC GAT GCG ATT AAT AAT GTT CTC ACT AAA GGG ATC TAC    3647
Ala Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Gly Ile Tyr
1050                1055                1060                1065
CTT AAA GCG GAT CAG AAT GAT CCA ACA GGA AAT CAA GGT CAG AAA GTG    3695
Leu Lys Ala Asp Gln Asn Asp Pro Thr Gly Asn Gln Gly Gln Lys Val
                1070                1075                1080
GAA CTT GGT AAT GCA ATA ACG CTT TCG GCA ACA AAT CAA TGG GCG AAT    3743
Glu Leu Gly Asn Ala Ile Thr Leu Ser Ala Thr Asn Gln Trp Ala Asn
            1085                1090                1095
AAC GGC GTA AAT TAT AAA ACG AAC AAT TTA ACC ACT TAT AAT TCA CAA    3791
Asn Gly Val Asn Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Thr Thr Tyr Asn Ser Gln
        1100                1105                1110
AAT GGC ACG ATT TTA TTT GGA ATG CGT GAA GAT CCA AGT GTA AAA CAA    3839
Asn Gly Thr Ile Leu Phe Gly Met Arg Glu Asp Pro Ser Val Lys Gln
    1115                1120                1125
ATT ACA GCG GGA ACC TAT AAT ACA ACG GGT GAT GCG AAC AAT AAA AAT    3887
Ile Thr Ala Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Gly Asp Ala Asn Asn Lys Asn
1130                1135                1140                1145
CAA CTA AAT AAT ACA CTT CAA CAA ACC ACG CTT GAA GCA ACT GGG ATC    3935
Gln Leu Asn Asn Thr Leu Gln Gln Thr Thr Leu Glu Ala Thr Gly Ile
                1150                1155                1160
ACC AGT AGC GTA GGT TCA ACT AAC TAC GCT GGC TTT AGC TTA GGG GCA    3983
Thr Ser Ser Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gly Phe Ser Leu Gly Ala
            1165                1170                1175
GAC AGC GTC ACC TTC TCG AAA GGT GGA GCT GGC ACG GTG AAA CTT TCT    4031
Asp Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser
        1180                1185                1190
GGC GTA AGC GAT GCC ACA GCC GAC ACC GAC GCT GCC ACT CTA AAA CAA    4079
Gly Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala Thr Leu Lys Gln
    1195                1200                1205
GTG AAA GAA TAC CGC ACA ACA TTA GTG GGT GAT AAT GAC ATC ACC GCA    4127
Val Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ala
1210                1215                1220                1225
GCA GAT CGT AGT GGC GGC ACA AGC AAT GGC ATT ACC TAC AAC TTA AGC    4175
Ala Asp Arg Ser Gly Gly Thr Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Leu Ser
                1230                1235                1240
CTT AAT AAA GGT ACG GTT TCG GCA ACA GAA GAA AAA GTG GTG TCA GGG    4223
Leu Asn Lys Gly Thr Val Ser Ala Thr Glu Glu Lys Val Val Ser Gly
            1245                1250                1255
AAA ACT GTC TAT GAA GCC ATT AGA AAT GCC ATC ACA GGC AAC ATC TTC    4271
Lys Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr Gly Asn Ile Phe
        1260                1265                1270
ACA ATT GGC TTA GAC GAT ACC ACC TTG AAC AAA ATC AAC AAT CCC GCG    4319
Thr Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala
    1275                1280                1285
GAT CAA GAT CTT TCA AAC CTC AGT GAA AGT GGC AAA AAT GCC ATT ACG    4367
Asp Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Thr
1290                1295                1300                1305
GGC TTA GTG GAT GTG GTG AAA AAA ACA AAT TCA CCG ATC ACA GTT GAG    4415
Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Thr Asn Ser Pro Ile Thr Val Glu
                1310                1315                1320
CCT TCT ACC GAT AGC AAC AAG AAA AAA ACC TTC ACT GTA GGC GTG GAT    4463
Pro Ser Thr Asp Ser Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Val Asp
            1325                1330                1335
TTC ACC GAT ACC ATT ACG GAA GGT GAC GCA ACG GAT GAT AAA AAA CTG    4511
Phe Thr Asp Thr Ile Thr Glu Gly Asp Ala Thr Asp Asp Lys Lys Leu
        1340                1345                1350
ACG ACT TCA AAA TCC GTT GAA AGC TAT GTC ACA AAC AAA CTC GCG AAC    4559
Thr Thr Ser Lys Ser Val Glu Ser Tyr Val Thr Asn Lys Leu Ala Asn
    1355                1360                1365
TTC TCT ACA GAT ATT TTG TTA TCG GAT GGG CGT TCT GGT AAC GCA ACA    4607
Phe Ser Thr Asp Ile Leu Leu Ser Asp Gly Arg Ser Gly Asn Ala Thr
1370                1375                1380                1385
ACG GCA AAT GAT GGG GTG GGT AAA CGT CGT TTG TCT GAT GGC TTT ACG    4655
Thr Ala Asn Asp Gly Val Gly Lys Arg Arg Leu Ser Asp Gly Phe Thr
                1390                1395                1400
ATC AAA TCT GAA AAC TTT ACG CTA GGT TCA AAA CAA TAT AAT GGC TCT    4703
Ile Lys Ser Glu Asn Phe Thr Leu Gly Ser Lys Gln Tyr Asn Gly Ser
            1405                1410                1415
GAT AGC TTA GGG GTA ATG TAT GAC GAT CAA AAT GGG GTC TTT AAA TTA    4751
Asp Ser Leu Gly Val Met Tyr Asp Asp Gln Asn Gly Val Phe Lys Leu
        1420                1425                1430
AGC CTA AAT ATG ACC GCA CTT ACC ACT TCA TTG GCT AAT ACT TTC GCG    4799
Ser Leu Asn Met Thr Ala Leu Thr Thr Ser Leu Ala Asn Thr Phe Ala
    1435                1440                1445
AAG TTG GAT GCC TCT AAC CTT ACT GAT GAT AGC AAT AAA GAG AAA TGG    4847
Lys Leu Asp Ala Ser Asn Leu Thr Asp Asp Ser Asn Lys Glu Lys Trp
1450                1455                1460                1465
CGT ACT GCG TTG AAT GTG TAT TCA AAA ACA GAA GTA GAT GCA GAA ATT    4895
Arg Thr Ala Leu Asn Val Tyr Ser Lys Thr Glu Val Asp Ala Glu Ile
                1470                1475                1480
CAA AAA TCC AAG GTA ACA CTC ACA CCA GAT TCG GGT TTG ATC TTT GCG    4943
Gln Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Ser Gly Leu Ile Phe Ala
            1485                1490                1495
ACC AAA CAA GCT GGG AGT GGT AAT AAC GCA GGT ATT GAT GCT GGG AAT    4991
Thr Lys Gln Ala Gly Ser Gly Asn Asn Ala Gly Ile Asp Ala Gly Asn
        1500                1505                1510
AAG AAA ATT AGT AAT GTC GCC GAT GGG GAT ATT TCT CCA ACC AGT GGT    5039
Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly
    1515                1520                1525
GAT GTA GTG ACA GGT CGT CAG CTC TAC GCC TTA ATG CAG AAA GGT ATT    5087
Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala Leu Met Gln Lys Gly Ile
1530                1535                1540               1545
CGC GTG TAT GGT GAT GAA GTT AGT CCA ACG AAG ACT CAA ACA ACA GCA    5135
Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr Lys Thr Gln Thr Thr Ala
                1550                1555                1560
CCT ACA AAT GCA AAC CCA ACT GCG ACG ACA GCA CCT ACA GCA TCT AGC    5183
Pro Thr Asn Ala Asn Pro Thr Ala Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser
            1565                1570                1575
ACT CAA GGT TGG GCG ACA ACG GCG AAT ACG GCG GGT GGT GTA GCA CCA    5231
Thr Gln Gly Trp Ala Thr Thr Ala Asn Thr Ala Gly Gly Val Ala Pro
        1580                1585                1590
GCA GGT AAT GTA GCA ACG GGG GAT ATT GCG CCG ACA CAG CCA ACA TTG    5279
Ala Gly Asn Val Ala Thr Gly Asp Ile Ala Pro Thr Gln Pro Thr Leu
    1595                1600                1605
CCA GAG ATG AAT ACG GCA TTG GTT GAT GAT CAC TTG GCT GTG CCG TTA    5327
Pro Glu Met Asn Thr Ala Leu Val Asp Asp His Leu Ala Val Pro Leu
1610                1615                1620                1625
GGT GGA AGC CTC AAG ATT CAC GGA GAT CAT AAT GTG AAA ACA ACG ATT    5375
Gly Gly Ser Leu Lys Ile His Gly Asp His Asn Val Lys Thr Thr Ile
                1630                1635                1640
TCT GCG GAT AAT CAA GTG GGG ATT TCA TTA CAG CCA AAT ATT TCT ATT    5423
Ser Ala Asp Asn Gln Val Gly Ile Ser Leu Gln Pro Asn Ile Ser Ile
            1645                1650                1655
GAG AAT AAC TTG GTA ATT GGT TCA AAT GAT CCT GAG AAG GCA AAA TTA    5471
Glu Asn Asn Leu Val Ile Gly Ser Asn Asp Pro Glu Lys Ala Lys Leu
        1660                1665                1670
GCC GCA CAA GAA GGT AAT GCT TTG GTT ATC ACT AAC AAA GAT GAC GGG    5519
Ala Ala Gln Glu Gly Asn Ala Leu Val Ile Thr Asn Lys Asp Asp Gly
    1675                1680                1685
AAT GCG GCG ATG GTC TTT AAT AAC GAG AAA AAT ATG CTT GTT CTC AGT    5567
Asn Ala Ala Met Val Phe Asn Asn Glu Lys Asn Met Leu Val Leu Ser
1690                1695                1700                1705
GAT AAA GAG GCG AAA CCA AGA GTG CTT CTT GAT GGA CAAAAT GGG GCA     5615
Asp Lys Glu Ala Lys Pro Arg Val Leu Leu Asp Gly Gln Asn Gly Ala
                1710                1715                1720
TTA ACT TTA GTC GGC AAT GAT GAT TCT CAA GTC ACC CTT TCC TCT AAG    5663
Leu ThrLeu Val Gly Asn Asp Asp Ser Gln Val Thr Leu Ser Ser Lys
            1725                1730                1735
AAA GGT AAA GAT ATT GAT GGA AAT GAT TTG AGC CGT CTC TCT GTG ACG    5711
Lys Gly Lys Asp Ile Asp Gly Asn Asp Leu Ser Arg Leu Ser Val Thr
        1740                1745                1750
ACT GAA AGA ACA AAT GCT GAT GGG CAA CTT GAA AAA GTG GAA ACC TCA    5759
Thr Glu Arg Thr Asn Ala Asp Gly Gln Leu Glu Lys Val Glu Thr Ser
    1755                1760                1765
TTT GCT ACA ATG GAT GAT GGC TTG AAG TTC AAA GCC GAC GGG GAT AAA    5807
Phe Ala Thr Met Asp Asp Gly Leu Lys Phe Lys Ala Asp Gly Asp Lys
1770                1775                1780                1785
GTG ATT AAT AAG AAA CTT AAT GAA ACC GTT GAA ATT GTT GGT GAT GAG    5855
Val Ile Asn Lys Lys Leu Asn Glu Thr Val Glu Ile Val Gly Asp Glu
                1790                1795                1800
AAT GTG ACA ACA TCT ATT ACT GAT GAT AAT AAG GTG AAA GTT TCA CTG    5903
Asn Val Thr Thr Ser Ile Thr Asp Asp Asn Lys Val Lys Val Ser Leu
            1805                1810                1815
AAT AAG AAA ATC GCG ATT GAT GAG GTT AAG ATT CCA AAT ACA GAT CCT    5951
Asn Lys Lys Ile Ala Ile Asp Glu Val Lys Ile Pro Asn Thr Asp Pro
        1820                1825                1830
GAT GCT CAA AAG GGA GAT AGC ATT GTA ATC AAC AAT GGT GGA ATC CAC    5999
Asp Ala Gln Lys Gly Asp Ser Ile Val Ile Asn Asn Gly Gly Ile His
    1835                1840                1845
GCA GGT AAT AAA GTG ATT ACT GGC GTT AAA GCG AGT GAT GAC CCA ACC    6047
Ala Gly Asn Lys Val Ile Thr Gly Val Lys Ala Ser Asp Asp Pro Thr
1850                1855                1860                1865
AGT GCA GTG AAT CGA GGT CAA TTA AAT ACT GTG ATT GAT AAT GTT CAA    6095
Ser Ala Val Asn Arg Gly Gln Leu Asn Thr Val Ile Asp Asn Val Gln
                1870                1875                1880
AAT AAT TTC AAT CAA GTT AAT CAA CGT ATT GGC GAT TTA ACA CGG GAG     6143
Asn Asn Phe Asn Gln Val Asn Gln Arg Ile Gly Asp Leu Thr Arg Glu
            1885                1890                1895
TCG CGT GCA GGT ATT GCA GGT GCA ATG GCG ACG GCA AGC CTA CAA AAT     6191
Ser Arg Ala Gly Ile Ala Gly Ala Met Ala Thr Ala Ser Leu Gln Asn
        1900                1905                1910
GTT GCT TTA CCA GGG AAA ACA ACG ATT TCC GTA GGT ACA GCA ACG TTC     6239
Val Ala Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ile Ser Val Gly Thr Ala Thr Phe
    1915                1920                1925
AAA GGG GAG AAT GCT GTT GCA ATA GGG ATG TCT AGA CTC TCT GAT AAT     6287
Lys Gly Glu Asn Ala Val Ala Ile Gly Met Ser Arg Leu Ser Asp Asn
1930                1935                1940                1945
GGA AAA GTA GGT ATC CGT TTA TCT GGT ATG AGT ACG AGT AAC GGA GAT     6335
Gly Lys Val Gly Ile Arg Leu Ser Gly Met Ser Thr Ser Asn Gly Asp
                1950                1955                 1960
AAA GGG GCA GCA ATG AGT GTT GGA TTT AGC TTT TAGCCTTAAT CCATAAATAA   6388
Lys Gly Ala Ala Met Ser Val Gly Phe Ser Phe
            1965                1970
GCAAAAAGCG AATCACCTTT GATTCGCTTT TTTTATCAGA TTATGTGCCG TAAAACTCCG   6448
TCCTTCAGGG CGGAGATATA AGGCACAAAC GGCGTAAGCC GTTTCAAACC TAACTAATCA   6508
GGTGTTTGTT GTTGCTCAAT GTATTGGCGA ATAATGGAAA TTGGAGCGCC ACCACAACTC   6568
CCTGCAAAAT AAGACGGAGA CCAAAGCTGA TTACCCCAAA GTTTTTTGCG GATGTTCGAG   6628
TAGTTTTTCT TCCTAATCAT TCGGCTTGAT ACACCTTTTA AACTGTTTAC AAGTGTAGAT   6688
ACAGCCACTT TCGGTGGATA TTCCACAAGT AAATGAACAT GATCGTCTTC ACCGTCAAAT   6748
TCAACTAATT TTGCTTTAAA ATCATTGCAG ACGCTTTCAA AAATCAATTT GAGTTCGTCT   6808
AAAATAGCTT TCGTAAAAAC ATCACGGCGA TATTTTGTTA CAAAGACTAA GTGAACATGC   6868
ATATTAAAAA CACAATGTCT ACCGTGCCTA ATTTCTGTTT CTTTTTGCAT AGACCAAGTG    6928
TAAAATGTTG AAAACTTACA TTCTAAACCT TGTCAATGCA ACTACGCAAA GCCTTTAAGT    6988
TCGAGATAAT GCCGAATGGC GAACAAACCC GTAAAATCAA GCAATTTTGC GGTTGTTCTC    7048
GTTTTGTGTT CAATCGGGCA TTGGCTTGGC AAAATGAACA ATACGGGCAA GATAACAGCT    7108
TTAAGTTCAG TTACACTAAA ATCGCCAACT TGCTTCCACA ATGGAAAAAA GAATTAGTTT    7168
GGCTAAAAGA ATGCCATTCT CAAGTGCTTC AACAGTCGCT AAAAGATCTT GAGAGTGCGT    7228
TCAAAAATTT CTTTCAGAAA CGTGCCGACT TTCCAAAATT CAAGAAAAAA GGCGTGAAAG    7288
AGAGCTTTCG TTTTCCGCAA GGTTGCAAAT TAGAACAGGA AAATGACCGC TTATTTTTGC    7348
CAAAAATCGG CTGGATTCGC TATCGCAACA GCCGAGATAT CGTTGGTGAA ATCAAAAATG    7408
TTACCGTCAG CCAAAAGTGC GGTCACTATT TTGTCAGTAT TCAAACTGAA TTTGAGTACG    7468
AAATCCCGAC ACATAAAGGC GGTGAAATCG GTATTGATAT GGGCGTTGCA CGTTTTGCAA    7528
CATTGTCAAA TGGTGAATAT TTTGAACCGG TTAACGCCTT TAAAACTTAC AAAGGAAAAT    7588
TGGCTAAACT GCAAAAGAGG CTTAAAAATA AAGTAAAATT TAGCCAAAAT TGGCAGAAAT    7648
TAAAGGCGAA AATCGCCAAA CTGCATCATA AAATTGCTAA TTGTCGCAAA GACTTCTTGC    7708
ATCAGACTTC AAGCAAAATC AGCAAAAACC ACGCCATGAT CTATATTGAA GATTTGCAGG    7768
TGTCAAATAT GTCAAAATCA GCCAAAGGTA CGGCGGAAAC ACCAGGCAAA AATGTTGCTG    7828
CAAAATCAGG GTTGAACCAA GCGATATTAG ATCAATCTTG GTTTGAGTTT CGCCGTCAGT    7888
TGGACTACAA AACGCAATGG CAAGGTGGAT TTTTAGTGGC AGTGCCAGCG CAAAATACCA    7948
GTCGAACTTG CCCTTGTTGT GGTCATGTAG CAAAAGAAAA TCGCCAAACA CAGGCTAATT    8008
TTGAGTGTGT AGAATGTGGC TACACAGAAA ATGCCGATGT GGTTGGAGCG TTAAATGTAT    8068
TGGGGCGTGG GCGAGCTATC GTCCACGCGT AATAAAATGT CAGGGCAGGA CATGCCCGTA    8128
GAGCTTGTGA AGTGAACTTC ATTGAGAGGT CAGCAACAAG AACCCACCGA GAGTAGCCCA    8188
TTGCTTGCCA ATTGGCACTA GTAGGAATCC CCATCCTTTA GGGCGGGGAG GATGTCAAAT    8248
ACATCATTAA TATTTAATGA AAAATATTAT AACTAATTGA TTTTTATATT ATTATTTGTC    8308
TATTTGGGCG GTGGGACATA ATTTTGACAG ACAGAATGAT ATCGTTTATA TTTCCGAATA    8368
TCTGAT ATG TTA TTT AGT AAA ATA TCA GAT AAG AAA AAT TTA TTT TTC       8416
       Met Leu Phe Ser Lys Ile Ser Asp Lys Lys Asn Leu Phe Phe
        1                5                  10
TTT ATA TAT AGC TCA ATT AAA AGG AAA TTT ATT ATG AAA AAG ACA CTT    8464
Phe Ile Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Lys Phe Ile Met Lys Lys Thr Leu
    15              20                  25                  30
ATC GCT TTA GCT GTA ATA ACA ATG TTT TCA AGT GCA GCA AAT GCT GCG    8512
Ile Ala Leu Ala Val Ile Thr Met Phe Ser Ser Ala Ala Asn Ala Ala
                35                  40                  45
GTC ATT TAT GAA AAA GAA GGT ACG AAA ATT GAT ATT GAT GGT CGT ATG    8560
Val Ile Tyr Glu Lys Glu Gly Thr Lys Ile Asp Ile Asp Gly Arg Met
            50                  55                  60
CAT TTT GAA TTA CGT AAT GAT TCA GGC AAA CGT TCT GAT TTA CAA GAT    8608
His Phe Glu Leu Arg Asn Asp Ser Gly Lys Arg Ser Asp Leu Gln Asp
        65                  70                  75
GCA GGC TCT CGT GTC CGC GTA AGA GCT TTT CAA GAA ATT GGC AAT GGC    8656
Ala Gly Ser Arg Val Arg Val Arg Ala Phe Gln Glu Ile Gly Asn Gly
    80                  85                  90
TTT TCT ACC TAT GGG GCT GTT GAG TTT CGT TTT TCT ACT AAG AAA GAT    8704
Phe Ser Thr Tyr Gly Ala Val Glu Phe Arg Phe Ser Thr Lys Lys Asp
95                  100                 105                 110
GGC TCA GAA CAA AGT ATT GGA TCT GAC TTA AGA GCT CAC CGC TTT TTT    8752
Gly Ser Glu Gln Ser Ile Gly Ser Asp Leu Arg Ala His Arg Phe Phe
                115                 120                 125
GCA GGA ATT AAA CAA AAA GAC ATA GGG GAA TTA ACT TTC GGT AAA CAA    8800
Ala Gly Ile Lys Gln Lys Asp Ile Gly Glu Leu Thr Phe Gly Lys Gln
            130                 135                 140
CTC CAT TTA GGT GAT CTT GTC CCG AAA GCA AAT TAT TCT TAT GAT TTA    8848
Leu His Leu Gly Asp Leu Val Pro Lys Ala Asn Tyr Ser Tyr Asp Leu
        145                 150                 155
GGG GCG AAC TCT TTT TTT GGT GCA CAT AGT AAA GTA GCA CAT TTT ATT    8896
Gly Ala Asn Ser Phe Phe Gly Ala His Ser Lys Val Ala His Phe Ile
   160                  165                 170
TCT GTA CCA TTT AAT GGT GTG AGG GTG TCT GCA G                      8930
Ser Val Pro Phe Asn Gly Val Arg Val Ser Ala
175                 180                 185
SEQ ID NO.：2
序列长度：13
序列类型：氨基酸
链型：单链
拓扑学：线性
分子类型：肽
来源：副鸡嗜血杆菌A血清型221菌株
序列描述：
Lys Trp Leu Glu Val Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Ser
1               5                   10
SEQ ID NO.：3
序列长度：43
序列类型：核酸
链型：单链
拓扑学：线性
分子类型：其它核酸(合成DNA)
序列描述：
CGCGGATCCA TGAATAAAGT TTTTAAAATT AAATATTCTG TTG         43
SEQ ID NO.：4
序列长度：39
序列类型：核酸
链型：单链
拓扑学：线性
分子类型：其它核酸(合成DNA)
序列描述：
CGCGGATCCT TAAGGCTAAA AGCTAAATCC AACACTCAT        39
SEQ ID NO.：5
序列长度：7486
序列类型：核酸
链型：双链
拓扑学：线性
分子类型：基因组DNA
来源：副鸡嗜血杆菌血清型C53-47菌株
序列描述：
TCTAGAATAT AAATCTTCAG TATCAACATA CAAGGGGCGT ATCGCATACG CCCCTGTGCT     60
GAATTTTTAC TTACAGAACA CCGTACTTTT GTTCTGTCAT TTTTGGATAT TTGGGCTGAT    120
GGCTTTTTTC TTTGGTAGTT ATAACGGGTT TCGCTCGTTG AGCGACTTAC TTTCTTTTAC    180
ATTCCCAAAA GAAAGTAAGC AAAGAAAAGG GAACCCGACT AAATTGCTGT TCCTCATTCC    240
AATAAAATTT TCTTCATGAA AAGTAAGCCT GATGTTCGCT TCGCTCTCGC TCGGCGTTAC    300
TTTTCTTAAA ATTTTATTTC CATTCGGGCA ATTTACACGG GAAAGGGCGA TTTTTAAAAG    360
TGCGGTGGTT TTGAAGGAT  ATTTTTGTAT TTGGAAAAAT CAAGAAAATG GCTTTAGAAA    420
ACACCTCACT TATTTTAACT GTAGGTATTG CATTTTTAAT AATACAAATT TTTCTTGAAA    480
TGATGAAATA ACCAATCAAA TTAGTCAGTT ATAAGTGGAG AAACTTAAAG AAAATGATTA    540
AATTAGGCTC ACTCATTAGA CCAGTAAGGG AATTAAAATA GTATTTTTAA TTGCATTTAG    600
TTATTAAGTG TTAGAAATTA CCTATTGCAT CAATAAATGA GGTGTTTTTA TTTGTAATCT   660
CTAATTAATT AGAGTAGTAT TAAGTGGAGT TTTATCTTTA CTAAATTAAT GGTATCACCT   720
CTCAGAGAGG GAGAAGCAAA TTCCCCCCCC CTAGAAATAC CTAATAAGAG TTACATTAAG   780
GGCATATTAT AAAAGTAATT TATCAATAAT GATTAACGCT CATTATTATT AACAAAGGCA   840
AATGATT ATG AAT AAA GTT TTT AAA ATT AAA TAT TCT GTT GTA AAA CAA     889
        Met Asn Lys Val Phe Lys Ile Lys Tyr Ser Val Val Lys Gln
        -70                 -65                 -60
GAA ATG ATT GTG GTT TCA GAG CTA GCA AAT AAT AAA GAT AAA ACA GCT     937
Glu Met Ile Val Val Ser Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Lys Thr Ala
    -55                 -50                 -45
AGC CAA AAA AAC ACA CAT AAT ACT GCC TTT TTT CAA CCG CTA TTT ACA     985
Ser Gln Lys Asn Thr His Asn Thr Ala Phe Phe Gln Pro Leu Phe Thr
-40                -35                  -30                 -25
AAG TGT ACA TAT CTT GCT CTT CTC ATT AAT ATC GCA CTA GGA ACA TCA    1033
Lys Cys Thr Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Asn Ile Ala Leu Gly Thr Ser
                -20                 -15                 -10
TTA TTC CCT CAA TTA GCT AAT GCG AAA TTT TTA GAG GTT TAT AAT AGC    1081
Leu Phe Pro Gln Leu Ala Asn Ala Lys Phe Leu Glu Val Tyr Asn Ser
            -5                  1                   5
TCC GTA AAA CTA CAG CAT GTT AAT AGT GGC GTA CCA AGT GAT AGT GTT    1129
Ser Val Lys Leu Gln His Val Asn Ser Gly Val Pro Ser Asp Ser Val
    10                  15                  20
AAT CTT AAT CCA TCG GGA GGT GAG AAT GTT GGC ATG AAT AGC AAT CAA    1177
Asn Leu Asn Pro Ser Gly Gly Glu Asn Val Gly Met Asn Ser Asn Gln
25                  30                  35                  40
GGG GTC GCT ATT GGC CGT GGT GCA GTA AAT AAT TAT TCG GCG ACG GGA    1225
Gly Val Ala Ile Gly Arg Gly Ala Val Asn Asn Tyr Ser Ala Thr Gly
                45                  50                  55
TCA ATT GCT ATT GGT CAG GGG GCA AAA AAT GAT AAT TGG GCG ACG AGA    1273
Ser Ile Ala Ile Gly Gln Gly Ala Lys Asn Asp Asn Trp Ala Thr Arg
            60                  65                  70
TCA ATT GCT ATT GGT CAG GGG GCA AAA AAT GAA AGT ATA GCA TCA GAT    1321
Ser Ile Ala Ile Gly Gln Gly Ala Lys Asn Glu Ser Ile Ala Ser Asp
        75                  80                  85
TCT GTG GCT ATT TCC AAC GCG ATT AAC CGT TTT AAA AAA TCT ATT GTG    1369
Ser Val Ala Ile Ser Asn Ala Ile Asn Arg Phe Lys Lys Ser Ile Val
    90                  95                  100
ATA GGT CTT AAT ACT TAT ACA CAA TTA GAT CCC CGT AGA GCT CCA GAA    1417
Ile Gly Leu Asn Thr Tyr Thr Gln Leu Asp Pro Arg Arg Ala Pro Glu
105                 110                 115                 120
TCC CGT CAA GGT TCT GTG GTG ATT GGG GAA AAT GCG AAA AGT GCT GGG    1465
Ser Arg Gln Gly Ser Val Val Ile Gly Glu Asn Ala Lys Ser Ala Gly
                125                 130                 135
AAT CAA TCT GTT TCT TTA GGG CAA AAT GCG TGG TCA AAA ACC AAT TCT    1513
Asn Gln Ser Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Trp Ser Lys Thr Asn Ser
            140                 145                 150
ATT TCT ATT GGG GCA GGA ACC TTT GCG GAA GGG AAA TCA ACC ATT GCT    1561
Ile Ser Ile Gly Ala Gly Thr Phe Ala Glu Gly Lys Ser Thr Ile Ala
        155                 160                 165
ATA GGG ACT GAT AAA ATA CTA GGG ACT AAT TAT AAT GAC AAA TTG CCT    1609
Ile Gly Thr Asp Lys Ile Leu Gly Thr Asn Tyr Asn Asp Lys Leu Pro
    170                 175                 180
GCT CCT AGT TGG GAT GGA AGA ACA GGT AAG GCA CCT ACT AAT TCC ATT    1657
Ala Pro Ser Trp Asp Gly Arg Thr Gly Lys Ala Pro Thr Asn Ser Ile
185                 190                 195                 200
TGG GAT ATA TTT TCT GAG TTA TAT ATG GGG AAA AAG ACT AAC GGC ACA    1705
Trp Asp Ile Phe Ser Glu Leu Tyr Met Gly Lys Lys Thr Asn Gly Thr
                205                 210                 215
GAT TAT GAT GCA AAA AAA AAT GAC CGC GAT CCA AAT AAG CCA GAG GCT    1753
Asp Tyr Asp Ala Lys Lys Asn Asp Arg Asp Pro Asn Lys Pro Glu Ala
            220                 225                 230
TTT TAT ACC TAT TCT GAT TTT AAA AGC AGA TAT GTT AAT AAC CCA AGT    1801
Phe Tyr Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Ser Arg Tyr Val Asn Asn Pro Ser
        235                 240                 245
ACC TCT CCC ACT TAT GCC GCT AAA TTA GGG GCA ATT GCC CTA GGT TCC    1849
Thr Ser Pro Thr Tyr Ala Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Ser
    250                 255                 260
CGC ACC ATT GCT GCG GGG GAA ATG TCC ACT GCG GTC GGT TCC TTA GCC    1897
Arg Thr Ile Ala Ala Gly Glu Met Ser Thr Ala Val Gly Ser Leu Ala
 265                270                 275                 280
TTT GCA TTG GCA GAT AAA TCC ACC GCA ATG GGG TTA CGT TCT TTT GTT    1945
Phe Ala Leu Ala Asp Lys Ser Thr Ala Met Gly Leu Arg Ser Phe Val
                285                 290                 295
GCT AAA GAT GCC GTA GGT GGA ACG GCA ATC GGG GAA GAA TCG CGA ACC    1993
Ala Lys Asp Ala Val Gly Gly Thr Ala Ile Gly Glu Glu Ser Arg Thr
            300                 305                 310
TTT GCT AAA GAT TCC GTT GCC ATT GGT AAT AAA ACT GAA GCC TCA AAT    2041
Phe Ala Lys Asp Ser Val Ala Ile Gly Asn Lys Thr Glu Ala Ser Asn
        315                 320                 325
GCT GGC TCA ATG GCT TAT GGT TAT AAG GCG AAA GCG GTA GGT GCG GGG    2089
Ala Gly Ser Met Ala Tyr Gly Tyr Lys Ala Lys Ala Val Gly Ala Gly
    330                 335                 340
GCA ATC GCA ATT GGT GCA GAA GTC GCA GCA GGG GCT GAA TTT GAT AGC    2137
Ala Ile Ala Ile Gly Ala Glu Val Ala Ala Gly Ala Glu Phe Asp Ser
345                 350                 355                 360
AGT CAA GCA GGA AAT TTA TTA CTA AAT AGA GGT GCT TAT GCT ACT TTA    2185
Ser Gln Ala Gly Asn Leu Leu Leu Asn Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Leu
                365                 370                 375
AAA AGT GCC GAT AAA TCA GAT GAT ATT AAA GCT GGA GAT GCG ATT AAC    2233
Lys Ser Ala Asp Lys Ser Asp Asp Ile Lys Ala Gly Asp Ala Ile Asn
            380                 385                 390
GTA TTT ACC CAG TTT TTT GAT AAT ATG CTT ACT CAA GGC TCA CAC CTG    2281
Val Phe Thr Gln Phe Phe Asp Asn Met Leu Thr Gln Gly Ser His Leu
        395                 400                 405
ACA TAT GAA AAT ACC ACC TAT TTA ACC ACT TCA GCA GGT GAT ATC AAG    2329
Thr Tyr Glu Asn Thr Thr Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Gly Asp Ile Lys
    410                 415                 420
AAA ACA TTA GCT GCA GTT GGA GAT GGC GGG AAA AAT GCC ATT GCC ATT    2377
Lys Thr Leu Ala Ala Val Gly Asp Gly Gly Lys Asn Ala Ile Ala Ile
425                 430                 435                 440
GGT AAT AAA ACC TTT GCA TCT AAA GCA AAT TCT GTG GCA TTA GGG AGC    2425
Gly Asn Lys Thr Phe Ala Ser Lys Ala Asn Ser Val Ala Leu Gly Ser
                445                 450                 455
TAT GCC TTA GCG AGT GCC CAA AAT GCC TTT GCA CTA GGT TCT TAT TCT    2473
Tyr Ala Leu Ala Ser Ala Gln Asn Ala Phe Ala Leu Gly Ser Tyr Ser
            460                 465                 470
TTA GTG TCC CCT TTA GCA GCC AAT ACA ATC GTA ATT GGT GTG GGA GGT    2521
Leu Val Ser Pro Leu Ala Ala Asn Thr Ile Val Ile Gly Val Gly Gly
        475                 480                 485
TAT GCC ACA GGA TCA AAC AGT TTC GTA GGG GGT TCT TGG GTA TCA ACC    2569
Tyr Ala Thr Gly Ser Asn Ser Phe Val Gly Gly Ser Trp Val Ser Thr
    490                 495                 500
CTT TCA GCT CGG ACA GTT GTG CTA GGG TAT TCC GCT TCA ATT AGC TCA    2617
Leu Ser Ala Arg Thr Val Val Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Ile Ser Ser
505                 510                 515                 520
GAT TCT CAT GAT TCA TTA GCA ATG GGG GTG AAT GCC TTT ATT GGT AAT    2665
Asp Ser His Asp Ser Leu Ala Met Gly Val Asn Ala Phe Ile Gly Asn
                525                 530                 535
GGT AGT AAT TCT TCA TTG GCA TTA GGT ACG GGA TCT ACT ATT GCG AAA    2713
Gly Ser Asn Ser Ser Leu Ala Leu Gly Thr Gly Ser Thr Ile Ala Lys
            540                 545                 550
AAT GCC AAA TCT CCT GAC AGC TTA GCC ATT GGT AAA GAC TCA CGA ATT    2761
Asn Ala Lys Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ile Gly Lys Asp Ser Arg Ile
        555                 560                 565
GAC GCT AAA GAT ACA GAT AAT GGT GTT TTG TAT ACC CCT CAA GTT TAT    2809
Asp Ala Lys Asp Thr Asp Asn Gly Val Leu Tyr Thr Pro Gln Val Tyr
    570                 575                 580
GAT GAA ACT ACT CGA GCC TTT AGA ACC TTT GAT GAA AAC AAA GAT TAT    2857
Asp Glu Thr Thr Arg Ala Phe Arg Thr Phe Asp Glu Asn Lys Asp Tyr
585                 590                 595                 600
ATG CGT CAA GCA ATG GCA TTA GGT TTT AAT GCG AAG GTT TCG CGT GGG    2905
Met Arg Gln Ala Met Ala Leu Gly Phe Asn Ala Lys Val Ser Arg Gly
                605                 610                 615
AAG GGC AAA ATG GAA ACG GGG ATT AAC TCG ATG GCG ATT GGT GCT CGT    2953
Lys Gly Lys Met Glu Thr Gly Ile Asn Ser Met Ala Ile Gly Ala Arg
            620                 625                 630
TCT CAA GCA ACT TTG CAA AAT TCC ACC GCA CTT GGG GTA AAC GCT AAA    3001
Ser Gln Ala Thr Leu Gln Asn Ser Thr Ala Leu Gly Val Asn Ala Lys
        635                 640                 645
ACA GAT TAC ACT TGG GAA CAG TTA GAA GCC GAT CCT TGG GTA TCT AAA    3049
Thr Asp Tyr Thr Trp Glu Gln Leu Glu Ala Asp Pro Trp Val Ser Lys
    650                 655                 660
GGG GCA ATC AGT ATC CCA ACT TCA GGC AAA ATT GGG GTT ATC TCT GTG    3097
Gly Ala Ile Ser Ile Pro Thr Ser Gly Lys Ile Gly Val Ile Ser Val
665                 670                 675                 680
GGC TCA AAA GGC TCA GAA CGT CGT ATT GTG AAT GTT GCT TCG GGT TCT    3145
Gly Ser Lys Gly Ser Glu Arg Arg Ile Val Asn Val Ala Ser Gly Ser
               685                  690                 695
CTT GAT ACC GAT GCC GTG AAT GTT GCC CAA TTA AAA ACT ATT GAA GAA    3193
Leu Asp Thr Asp Ala Val Asn Val Ala Gln Leu Lys Thr Ile Glu Glu
            700                 705                 710
CGT TTC CAA TCT GAA ATT GAT TTA TTA CAA AAT GGC GGT GGG GTG CAA    3241
Arg Phe Gln Ser Glu Ile Asp Leu Leu Gln Asn Gly Gly Gly Val Gln
        715                 720                 725
TAT CTC TCT GTT GAA AAA ACG AAT ATC AAT GGA GAA GCG GGG AGA GTG    3289
Tyr Leu Ser Val Glu Lys Thr Asn Ile Asn Gly Glu Ala Gly Arg Val
    730                 735                 740
GCT AGC CAA ATT CGT AAA GGG GAA AGT TAT AAG CGA TAT GTG AAA TTA    3337
Ala Ser Gln Ile Arg Lys Gly Glu Ser Tyr Lys Arg Tyr Val Lys Leu
745                 750                 755                 760
AAA ACA CAA TTG CTC TAT TTA GAT GCA CGA AAA AAA TTA AAT GGA GAG    3385
Lys Thr Gln Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Arg Lys Lys Leu Asn Gly Glu
                765                 770                 775
AAG TTT GAT CAA ACT TCA TTA GAC AAA ATT AGT AAG GCA GTG CAA GAA    3433
Lys Phe Asp Gln Thr Ser Leu Asp Lys Ile Ser Lys Ala Val Gln Glu
            780                 785                 790
CTT GAA GCG GAA TAT AGT GGC GAG TTA AAA ACA ACT GCG TCA GAA CTT    3481
Leu Glu Ala Glu Tyr Ser Gly Glu Leu Lys Thr Thr Ala Ser Glu Leu
        795                 800                 805
AAT AGA GTT GCA ATG CAA TTG AAT GCT GAG ACA ACT GTA AAT GAC TTC    3529
Asn Arg Val Ala Met Gln Leu Asn Ala Glu Thr Thr Val Asn Asp Phe
    810                 815                 820
GGG AAA TTT AAT CAA TAT AAA ACG CAG ATT GAG AAT GCA ACC AAT GCG    3577
Gly Lys Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Gln Ile Glu Asn Ala Thr Asn Ala
825                 830                 835                 840
GAT TCA GAA AAA AAT GTA GGC GGC TTA TCC CCT CAA GTA ATT GCA CAG    3625
Asp Ser Glu Lys Asn Val Gly Gly Leu Ser Pro Gln Val Ile Ala Gln
                845                 850                 855
TTA AAA GCC AAT AAT AAC TAT CTT AAT GAT GGT GCA AAA GGG CAA GAC    3673
Leu Lys Ala Asn Asn Asn Tyr Leu Asn Asp Gly Ala Lys Gly Gln Asp
            860                 865                 870
AGT ATA GCA TTT GGC TGG CAG GCA AAA ACC TCA GAA GCT AAT AAT GGA    3721
Ser Ile Ala Phe Gly Trp Gln Ala Lys Thr Ser Glu Ala Asn Asn Gly
        875                 880                 885
TTA GCA GGG AAA CAA GCC ATT GCG ATT GGT TTC CAA GCG AAT TCT TCC    3769
Leu Ala Gly Lys Gln Ala Ile Ala Ile Gly Phe Gln Ala Asn Ser Ser
     890                895                 900
GCT GAA AAT GCC ATT TCT ATC GGT ACG AAT TCG GAT ACC TCA ATG ACA    3817
Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ile Gly Thr Asn Ser Asp Thr Ser Met Thr
905                 910                 915                 920
GGG GCA GTG GCG ATT GGT AAA GGT GCA ACG GTT ACT GCG GGT GGA AAA    3865
Gly Ala Val Ala Ile Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Ala Gly Gly Lys
                925                 930                 935
CCT TCC ATT GCA TTG GGG CAA GAT TCG ACG GTT GCC AAT TCC GCA ATT    3913
Pro Ser Ile Ala Leu Gly Gln Asp Ser Thr Val Ala Asn Ser Ala Ile
            940                 945                 950
AGC CGT ACA AGT TCA GTG ATG ATA AAT GGT TTA ACA TTC AAT AAT TTT    3961
Ser Arg Thr Ser Ser Val Met Ile Asn Gly Leu Thr Phe Asn Asn Phe
        955                 960                 965
GCA GGT TCC CCT GAA ACA CTC GGT GTG TTA AGT ATC GGA ACG GCT GGG    4009
Ala Gly Ser Pro Glu Thr Leu Gly Val Leu Ser Ile Gly Thr Ala Gly
    970                 975                 980
AAA GAG CGT AAA ATT GTT AAT GTT GCA GCA GGC GAT ATT TCG CAA ACT    4057
Lys Glu Arg Lys Ile Val Asn Val Ala Ala Gly Asp Ile Ser Gln Thr
985                 990                 995                 1000
TCT ACT GAA GCC ATT AAC GGC TCA CAG CTT TAT GCA ACG AAC TTT ATG    4105
Ser Thr Glu Ala Ile Asn Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Thr Asn Phe Me
                1005                1010                1015
TTG AAC AAA CTG GCT CAA TCC GTT AAA ACG AAT TTT GGC GGT AAT GCA    4153
Leu Asn Lys Leu Ala Gln Ser Val Lys Thr Asn Phe Gly Gly Asn Ala
            1020                1025                1030
AAC CTT GCC ACT GAT GGC ACA ATT ACA TTT ACA AAT ATT GGC GGC ACA    4201
Asn Leu Ala Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr
        1035                1040                1045
GGG CAA GAT ACA ATC CAC GAT GCG ATT AAT AAT GTT CTC ACC AAA TTG    4249
Gly Gln Asp Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu
    1050                1055                1060
ATC TCG CTT TCG GCA ACA GAA GAA GAA GAA GTG GTG TCA GGG GAA GCT    4297
Ile Ser Leu Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala
1065               1070                 1075                1080
GTC TAT GAT GCA CTT AAA GGT GCA AAA CCA ACG GTT TCA GCA GAA GCC    4345
Val Tyr Asp Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala
                1085                1090                1095
AAC AAA GGC ATT ACT GGC TTG GTG GAT GTG GTG AAA AAA GCA AAT TCA    4393
Asn Lys Gly Ile Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser
            1100                1105                1110
CCG ATC ACA GTT GAG CCT TCT ACC GAT AAC AAC AAG AAA AAA ACC TTC    4441
Pro Ile Thr Val Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe
        1115                1120                1125
ACT GTC GGC TTA ATG AAA GAC ATT GAA GGG GTA AAC AGC ATT ACC TTT    4489
Thr Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe
    1130                1135                1140
GAT AAG TCA GGG CAA GAT CTA AAT CAA GTT ACG GGC AGA ATG AGC AGT    4537
Asp Lys Ser Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser
1145                1150                1155                1160
GCG GGT TTA ACC TTC AAA AAA GGC GAC ACA ACA AAT GGT TCA ACC ACC    4585
Ala Gly Leu Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr
                1165                1170                1175
ACT TTT GCA GAA GAT GGC TTA ACC ATT GAT AGC ACA ACA AAT TCT GCT    4633
Thr Phe Ala Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala
            1180                1185                1190
CAA ACA AAC TTA GTG AAA GTA AGT CGT GAT GGC TTC TCG GTG AAA AAT    4681
Gln Thr Asn Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn
        1195                1200                1205
GGC AGC GAT GAA AGC AAA TTA GCC TCG ACA AAA TTA TCT ATC GGT GCG    4729
Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala
    1210                1215                1220
GAA AAT GCA GAA CAC GTT GAA GTA ACT AAA TCG GGC ATA GCC TTA AAA    4777
Glu Asn Ala Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys
1225                1230                1235                1240
GCG GAT AAC ACC TCC GAT AAA TCT AGC ATC ACC TTA GCC CAA GAT GCG    4825
Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala
                1245                1250                1255
ATT ACT CTT GCG GGG AAC GCA ACC GGA ACG GCG ATT AAA TTG ACT GGT    4873
Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly
            1260                1265                1270
GTT GCA GAT GGC AAC ATT ACG GTA AAT TCA AAA GAT GCG GTA AAT GGG    4921
Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly
    1275                1280                1285
GGG CAG TTG CGT ACC TTA TTA GGG GTT GAT AGC GGG GCT AAA ATT GGC    4969
Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly
    1290                1295                1300
GGT ACT GAG AAA ACA ACG ATC AGT GAA GCC ATT TCT GAT GTG AAG CAA    5017
Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln
1305                1310                1315                1320
GCT CTT ACC GAT GCG ACA TTG GCA TAT AAA GCG GAC AAT AAA AAC GGT    5065
Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly
                1325                1330                1335
AAA ACA GTT AAA TTG ACT GAC GGA TTG AAT TTT ACT AGC ACG ACC AAT    5113
Lys Thr Val Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn
            1340                1345                1350
ATT GAT GCT TCA GTG GAA GAT AAC GGT GTG GTG AAA TTC ACC TTA AAA    5161
Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys
        1355                1360                1365
GAT AAA TTA ACA GGC TTA AAA ACT ATC GCA ACT GAA TCT TTG AAT GCT    5209
Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala
    1370                1375                1380
TCT CAA AAT ATC ATC GCT GGC GGT ACG GTA ACA GTG GGC GGC GAG ACA    5257
Ser Gln Asn Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr
1385                1390                1395                1400
GAG GGC ATT GTG CTA ACA AAA TCT GGC TCA GGA AAT GAC CGC ACT TTA    5305
Glu Gly Ile Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu
                1405                1410                1415
TCT TTA TCT GGT GCA GGC AAT GCA GCA ACA GAT GGC ATT AAA GTC TCT    5353
Ser Leu Ser Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser
            1420                1425                1430
GGC GTG AAA GCA GGG ACG GCA GAC ACC GAT GCG GTG AAT AAA GGT CAG    5401
Gly Val Lys Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln
        1435                1440                1445
TTA GAT AAA CTT TTT AAA GCG ATC AAT GAC GCA TTA GGC ACA ACA GAT    5449
Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp
    1450                1455                1460
TTA GCG GTA ACC AAA AAT CCA AAT CAA ACC TCT ATC TTT AAT CCG ATA    5497
Leu Ala Val Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile
1465                1470                1475                1480
AAC GGC ACG GCT CCA ACC ACC TTT AAA GAC GCG GTG GAT AAA TTA ACC    5545
Asn Gly Thr Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr
                1485                1490                1495
ACC GCT GTG AAT ACA GGT TGG GGA TCA AAG GTA GGT ATT TTG GCA ACA    5593
Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr
            1500                1505                1510
GGT ATT GAT GGT ATT GAT GCT GGG AAT AAG AAA ATT AGT AAT GTC GCC    5641
Gly Ile Asp Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala
        1515                1520                1525
GAT GGG GAT ATT TCT CCA ACC AGT GGT GAT GTA GTG ACA GGT CGT CAG    5689
Asp Gly Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln
    1530                1535                1540
CTC TAC GCC TTA ATG CAG AAA GGT ATT CGC GTG TAT GGT GAT GAA GTT    5737
Leu Tyr Ala Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val
1545                1550                1555                1560
AGT CCA ACG AAG ACT CAA ACA ACA GCA CCT ACA GCA TCT AGC ACT CAA    5785
Ser Pro Thr Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln
                1565                1570                1575
GGT GGG GCG ACA ACG GCG AAT ACG GCG GGT GGT GTA GCA CCA GCA GGT    5833
Gly Gly Ala Thr Thr Ala Asn Thr Ala Gly Gly Val Ala Pro Ala Gly
            1580                1585                1590
AAT GTA GCA ACG GGG GAT ATT GCG CCG ACA CAG CCA GCA TTG CCA GAG    5881
Asn Val Ala Thr Gly Asp Ile Ala Pro Thr Gln Pro Ala Leu Pro Glu
        1595                1600                1605
ATG AAA ACG GCA TTG GTT GGT GAT CAC TTG GCT GTG CCG TTA GGT GGA    5929
Met Lys Thr Ala Leu Val Gly Asp His Leu Ala Val Pro Leu Gly Gly
    1610                1615                1620
AGC CTC AAG ATT CAC GGA GAT CAT AAT GTG AAA ACA ACG ATT TCT GCG    5977
Ser Leu Lys Ile His Gly Asp His Asn Val Lys Thr Thr Ile Ser Ala
1625                1630                1635                1640
GGT AAT CAA GTG GGG ATT TCA TTA CAG CCA AAT ATT TCT ATT GAG AAT    6025
Gly Asn Gln Val Gly Ile Ser Leu Gln Pro Asn Ile Ser Ile Glu Asn
                1645                1650                1655
AAC TTG GTA ATT GGT TCA AAT AAG CCT GAG AAG GCA AAA TTA GCC GCA    6073
Asn Leu Val Ile Gly Ser Asn Lys Pro Glu Lys Ala Lys Leu Ala Ala
            1660                1665                1670
CAA GAA GGT AAT GCT TTG GTT ATC ACT AAC AAA GAT GAC GGG AAT GCG    6121
Gln Glu Gly Asn Ala Leu Val Ile Thr Asn Lys Asp Asp Gly Asn Ala
        1675                1680                1685
GCG ATG GTC TTT AAT AAC GAG AAA AAT ATG CTT GTT CTC AGT GAT AAA    6169
Ala Met Val Phe Asn Asn Glu Lys Asn Met Leu Val Leu Ser Asp Lys
    1690                1695                1700
AAG GCA AAA CCA AGA GCG GTT CTT GAT GGA CAA AAT GGG GCA TTA ACT    6217
Lys Ala Lys Pro Arg Ala Val Leu Asp Gly Gln Asn Gly Ala Leu Thr
1705                1710                1715                1720
TTA GTC GGC AAT GAT GAT TCT CAA GTC ACC CTT TCC TCT AAG AAA GGT    6265
Leu Val Gly Asn Asp Asp Ser Gln Val Thr Leu Ser Ser Lys Lys Gly
                1725                1730                1735
AAA GAT ATT GAT GGA AAT GAT TTG AGC CGT CTC TCT GTG ACG ACT GAA    6313
Lys Asp Ile Asp Gly Asn Asp Leu Ser Arg Leu Ser Val Thr Thr Glu
            1740                1745                1750
AGA ACA AAT GCT GAT GGG CAA CTT GAA AAA GTG GAA ACC TCA TTT GCT    6361
Arg Thr Asn Ala Asp Gly Gln Leu Glu Lys Val Glu Thr Ser Phe Ala
        1755                1760                1765
ACA ATG GAT GAT GGC TTG AAG TTC AAA GCC GAC GGG GAT AAA GTG ATT    6409
Thr Met Asp Asp Gly Leu Lys Phe Lys Ala Asp Gly Asp Lys Val Ile
    1770                1775                1780
AAT AAG AAA CTT AAT GAA ACC GTT GAA ATT GTT GGT GAT GAG AAT GTG    6457
Asn Lys Lys Leu Asn Glu Thr Val Glu Ile Val Gly Asp Glu Asn Val
1785                1790                1795                1800
ACA ACA TCT ATT ACT GAT GAT AAT AAG GTG AAA GTT TCA CTG AAT AAG    6505
Thr Thr Ser Ile Thr Asp Asp Asn Lys Val Lys Val Ser Leu Asn Lys
                1805                1810                1815
AAA ATC GCG ATT GAT GAG GTT AAG ATT CCA AAT ACA GAT CCT GAT GCT    6553
Lys Ile Ala Ile Asp Glu Val Lys Ile Pro Asn Thr Asp Pro Asp Ala
            1820                1825                1830
CAA AAG GGA GAT AGC ATT GTA ATC AAC AAT GGT GGA ATC CAC GCA GGT    6601
Gln Lys Gly Asp Ser Ile Val Ile Asn Asn Gly Gly Ile His Ala Gly
        1835                1840                1845
AAT AAA GTG ATT ACT GGC GTT AAA GCG AGT GAT GAC CCA ACC AGT GCG    6649
Asn Lys Val Ile Thr Gly Val Lys Ala Ser Asp Asp Pro Thr Ser Ala
    1850                1855                1860
GTG AAT CGA GGT CAA TTA AAT ACT GTG ATT GAT AAT GTT CAA AAT AAT    6697
Val Asn Arg Gly Gln Leu Asn Thr Val Ile Asp Asn Val Gln Asn Asn
1865                1870                1875                1880
TTC AAT CAA GTT AAT CAA CGT ATT GGC GAT TTA ACA CGG GAG TCG CGT    6745
Phe Asn Gln Val Asn Gln Arg Ile Gly Asp Leu Thr Arg Glu Ser Arg
                1885                1890                1895
GCA GGT ATT GCA GGT GCA ATG GCG ACG GCA AGC CTA CAA AAT GTT GCT    6793
Ala Gly Ile Ala Gly Ala Met Ala Thr Ala Ser Leu Gln Asn Val Ala
            1900                1905                1910
TTA CCA GGG AAA ACA ACG ATT TCC GTA GGT ACA GCA ACG TTC AAA GGG    6841
Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ile Ser Val Gly Thr Ala Thr Phe Lys Gly
        1915                1920                1925
GAG AAT GCT GTT GCA ATA GGG ATG TCT AGA CTC TCT GAT AAT GGA AAA    6889
Glu Asn Ala Val Ala Ile Gly Met Ser Arg Leu Ser Asp Asn Gly Lys
    1930                1935                1940
GTA GGT ATC CGT TTA TCT GGT ATG AGT ACA AGT AAC GGA GAT AAA GGG    6937
Val Gly Ile Arg Leu Ser Gly Met Ser Thr Ser Asn Gly Asp Lys Gly
1945                1950                1955                1960
GCA GCA ATG AGT GTT GGA TTT ACC TTT TAGCCTTAAT CCATAAATAA GCAAAAA  6991
Ala Ala Met Ser Val Gly Phe Thr Phe
                1965
GCGAATCACC TTTGATTCGC TTTTTTTATC AGATTATGTG CCGTAAAACT CCGTCCTTCA  7051
GGGCGGAGAT ATAAGGCACA AACGGCGTAA GCCGTTTCAA ACCTAACTAA TCAGGTGTTT  7111
GTTGTTGCTC AATGTATTGG CGAATAATGG AAATTGGAGT GCCACCACAA CTCCCTGCAA  7171
AATAAGACGG AGACCAAAGC TGATTACCCC AAAGTTTTTT GCGGATGTTC GAGTAGTTTT  7231
TCTTCCTAAT CATTCGGCTT GATACACCTT TTAAACTGTT TACAAGTGTA GATACAGCCA  7291
CTTTCGGTGG ATATTCCACA AGTAAATGAA CATGATCGTC TTCACCGTCA AATTCAACTA  7351
ATTTTGCTTT AAAATCATTG CAGACGCTTT CAAAAATCAA TTTGAGTTCG TCTAAAATAG  7411
CTTTCGTAAA AACATCACAG CGATATTTTG TTACAAAGAC TAAGTGAACA TGCATATTAA  7471
AAACACAATG TCTAC                                                   7486

Claims (102)

1.一种来自副鸡嗜血杆菌的多肽，其由SEQ ID NO：1或5所示的氨基酸序列组成，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
2.一种来自副鸡嗜血杆菌的多肽，其由一段氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由SEQ ID NO：1或5所示的核苷酸序列编码，其中在所述核苷酸序列的EcoRI切割位点有一或几个核苷酸缺失、增加或置换，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
3.由副鸡嗜血杆菌基因组的大约3.5kb的HindIII DNA片段编码的多肽，所述DNA片段由SEQ ID NO：1的核苷酸残基1-3450的核苷酸序列组成，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
4.权利要求3的多肽，其中所述核苷酸序列在EcoRI切割位点有一或几个核苷酸缺失、增加或置换，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
5.由副鸡嗜血杆菌基因组的大约4.1kb的XhoI-XbaI DNA片段编码的多肽，所述DNA片段由SEQ ID NO：1的核苷酸残基2212-6275的核苷酸序列组成，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
6.权利要求5的多肽，其中所述核苷酸序列在EcoRI切割位点有一或几个核苷酸缺失、增加或置换，所述多肽具有诱导HI抗体产生的活性。
7.权利要求1的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
8.权利要求2的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
9.权利要求3的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
10.权利要求4的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
11.权利要求5的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
12.权利要求6的多肽，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
13.权利要求1的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
14.权利要求2的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
15.权利要求3的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
16.权利要求4的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
17.权利要求5的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
18.权利要求6的多肽，它是用遗传重组技术得到的重组多肽。
19.一段DNA，其由编码权利要求1的多肽的核苷酸序列组成。
20.一段DNA，其由编码权利要求2的多肽的核苷酸序列组成。
21.一段DNA，其由编码权利要求3的多肽的核苷酸序列组成。
22.一段DNA，其由编码权利要求4的多肽的核苷酸序列组成。
23.一段DNA，其由编码权利要求5的多肽的核苷酸序列组成。
24.一段DNA，其由编码权利要求6的多肽的核苷酸序列组成。
25.权利要求19的DNA，其由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
26.权利要求19的DNA，其由SEQ ID NO：5的核苷酸序列组成。
27.一段来自副鸡嗜血杆菌的DNA，它与具有一段核苷酸序列的DNA在严紧条件下杂交，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1或5所示核苷酸序列互补。
28.包含权利要求19的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
29.包含权利要求20的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
30.包含权利要求21的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
31.包含权利要求22的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
32.包含权利要求23的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
33.包含权利要求24的DNA的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子选自质粒、病毒载体和粘粒。
34.用权利要求19的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
35.用权利要求20的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
36.用权利要求21的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
37.用权利要求22的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
38.用权利要求23的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
39.用权利要求24的DNA转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
40.用权利要求28的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
41.用权利要求29的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
42.用权利要求30的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
43.用权利要求31的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
44.用权利要求32的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
45.用权利要求33的重组DNA分子转化的转化体细胞，所述转化体细胞为选自细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的宿主。
46.一种抗体，其识别权利要求1的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
47.一种抗体，其识别权利要求2的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
48.一种抗体，其识别权利要求3的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
49.一种抗体，其识别权利要求4的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
50.一种抗体，其识别权利要求5的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
51.一种抗体，其识别权利要求6的多肽，该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
52.制备权利要求1的多肽的方法，其使用具有HI活性的单克隆抗体。
53.权利要求52的方法，其中副鸡嗜血杆菌是副鸡嗜血杆菌A血清型或C血清型。
54.权利要求52的方法，其中所述多肽是用遗传重组技术得到的重组多肽。
55.制备权利要求1的多肽的方法，其包括培养权利要求34的转化体细胞，以使所述转化体细胞可以产生权利要求1的多肽，并纯化所述多肽。
56.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求1的多肽作为活性组分。
57.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求2的多肽作为活性组分。
58.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求3的多肽作为活性组分。
59.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求4的多肽作为活性组分。
60.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求5的多肽作为活性组分。
61.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求6的多肽作为活性组分。
62.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求19的DNA作为活性组分。
63.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求20的DNA作为活性组分。
64.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求21的DNA作为活性组分。
65.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求22的DNA作为活性组分。
66.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求23的DNA作为活性组分。
67.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求24的DNA作为活性组分。
68.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求25的DNA作为活性组分。
69.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求26的DNA作为活性组分。
70.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求27的DNA作为活性组分。
71.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求28的重组DNA分子作为活性组分。
72.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求29的重组DNA分子作为活性组分。
73.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求30的重组DNA分子作为活性组分。
74.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求31的重组DNA分子作为活性组分。
75.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求32的重组DNA分子作为活性组分。
76.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求33的重组DNA分子作为活性组分。
77.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求34的转化体细胞作为活性组分。
78.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求35的转化体细胞作为活性组分。
79.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求36的转化体细胞作为活性组分。
80.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求37的转化体细胞作为活性组分。
81.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求38的转化体细胞作为活性组分。
82.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求39的转化体细胞作为活性组分。
83.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求40的转化体细胞作为活性组分。
84.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求41的转化体细胞作为活性组分。
85.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求42的转化体细胞作为活性组分。
86.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求43的转化体细胞作为活性组分。
87.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求44的转化体细胞作为活性组分。
88.防治鸟类传染性鼻炎的疫苗，它包含权利要求45的转化体细胞作为活性组分。
89.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求46的抗体作为活性组分。
90.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求47的抗体作为活性组分。
91.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求48的抗体作为活性组分。
92.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求49的抗体作为活性组分。
93.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求50的抗体作为活性组分。
94.鸟类传染性鼻炎的治疗剂，它包含权利要求51的抗体作为活性组分。
95.检测副鸡嗜血杆菌的方法，其通过使用权利要求1的多肽进行检测。
96.检测副鸡嗜血杆菌的方法，其通过使用权利要求19的DNA进行检测。
97.检测副鸡嗜血杆菌的方法，其通过使用权利要求28的重组DNA分子进行检测。
98.检测副鸡嗜血杆菌的方法，其通过使用权利要求34的转化体细胞进行检测。
99.检测副鸡嗜血杆菌的方法，其通过使用权利要求46的抗体进行检测。
100.检测抗副鸡嗜血杆菌的抗体的方法，其通过使用权利要求1的多肽进行检测。
101.检测抗副鸡嗜血杆菌的抗体的方法，其通过使用权利要求34的转化体细胞进行检测。
102.检测抗副鸡嗜血杆菌的抗体的方法，其通过使用权利要求46的抗体进行检测。
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