CN1184317C - 一种瘦蛋白基因的修饰方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“一种瘦蛋白基因的修饰方法及其应用”涉及一种修饰瘦蛋白基因的方法及其应用。进一步，本发明涉及把瘦蛋白基因的cDNA序列中编码第二个氨基酸脯氨酸的CCC改变为CCG，以增强该基因的表达，使其最大表达量可达49%-55%。
Description
本发明所属的技术领域属于生物技术领域。
本发明的技术背景：
肥胖是指由于脂肪的过度积累造成体重超出正常范围，它经常与疾病相联系，如高血压、II型糖尿病和不育症等。肥胖不仅影响人类健康，并且已成为严重影响社会发展的障碍。在1988-1994年间，美国约有20％的妇女和25％男性是肥胖者，欧洲35-65岁间的成人中有50％以上属于肥胖者；据英国有关部门统计，英国的肥胖者由1980年的男性8％和女性6％增至1997的男性20％和女性17％；发展中国家在过去的20年中肥胖者的比例也在迅速增加。在美国和欧洲，每年减肥药物和食品的销售额均上千亿美元。虽然现阶段我国的人口肥胖问题并不严重，但随着物质生活水平的提高，肥胖趋势也日趋严重，例如，我国现在每年的减肥药物和食品的销售额都在百亿元以上。
在1994年以前的40年中，研究者通过对机体生长调节的大量研究，提出了许多关于体重调节的假说。1953年，Kennedy(Kennedy G.C.，Proc.R.Soc.Lond.B.，140，579-592(1953))提出了抑制摄食信号的产生是由于脂肪的储存并作用于大脑的结果；当代谢和散发热量诱导体重下降后，抑制摄食信号水平被严格控制，而产生了摄食量的增加，直到能量空缺被补齐。1994年，Stellar(Stellar E.，The physiology of motivation.Psychol.Rev.，61，5(1954))通过下丘脑的VMH核和LHA核损毁实验提出下丘脑通过VMH核作为饱食中枢，LHA作为摄食中枢来对动物的摄食行为进行双重调控，从而达到调节体重的目的。VMH产生的信号可以通过自主神经系统的交感和副交感神经向下传递到肝脏、胰腺和脂肪等组织调节胰岛素的分泌和脂肪代谢。另外一些研究表明(Travers S.等，Annu.Rev.Neurosci.，10，595-632(1987))，小鼠饱食中枢在后脑脑干的NTS区域，因为饱感产生于摄食过程，个体在摄食中，食物对胃肠的机械和化学感受器刺激而产生的信号在此区域集中并综合，产生饱感。但后脑与前脑的切断术证明，在没有下丘脑调节的情况下，摄食调节是可以进行的，因此认为NTS区域是饱食中枢。这两种观点都各有依据，另外，NTS与VMH和LHA间存在更复杂的联系，这一点需进行进一步研究证明。1973年，Gibbs和Smith(Gibbs J.等，J.Comp.Physiol.Psychol.，84，488-495(1973))提出饱食因子，认为其产生于个体进食中，包括胃肠道分泌的一些肽类物质，将信号传递给大脑抑制进食，导致摄食结束。这些假说主要集中在饮食调节、激素和神经内分泌水平上，直到1994年，美国Rockefeller大学J.M.Friedman博士领导的研究小组利用位置克隆技术克隆了鼠ob基因和人的同源物，确定了ob基因的产物---瘦蛋白(Leptin)是由脂肪组织产生的反映脂肪组成的信号因子，成熟肽分子量为16kD，其不仅可以维持和促进能量消耗，还可以降低摄食量(Zhang，Y.等，Nature，373，425-432(1994))。从而揭开研究肥胖形成机理尤其是分子遗传基础的新篇章。
目前已确定，Leptin是脂肪细胞分泌的，它通过内分泌作用分解脂肪，维持和促进能量消耗(Zhang，Y.等，Nature，373，425-432(1994))。另外，它在个体繁育、造血和糖代谢方面有一定作用。鉴于Leptin对体重调节的重要作用和其在个体繁育、造血和糖代谢方面有一定作用，本发明人对已发表的人ob基因和猪ob基因进行了修饰表达，并对相应的表达条件进行了选择研究。
Leptin为非糖蛋白。其中，人Leptin在大肠杆菌中的表达已进行了许多研究，其表达量最高可达50％左右(Jeong KJ和Lee SY.，Appl EnvironMicrobiol.，1999，65(7)：3027-32)。但是，猪Leptin在大肠杆菌中的表达尚未见报道。
1999年，KL Jeong进行了人Leptin在大肠杆菌中的表达(Jeong KJ和LeeSY.，Appl Environ Microbiol.，1999，65(7)：3027-32)(其表达序列如SEQID NO 1所示)。2000年，本发明人也进行了人Leptin在大肠杆菌中的表达(其表达序列如SEQ ID NO 2所示)。但不同的是，本发明人将编码成熟肽第二个氨基酸脯氨酸的CCC密码子修饰为大肠杆菌使用频率高的CCG密码子，在Ptac启动子下表达的融合表达蛋白最高表达量为50％；非融合表达在PT7启动子下，加上编码起始氨基酸的密码子ATG，其表达量高达55％，说明上述修饰对该蛋白表达有一定影响。
2000年，本发明人又进行了猪Leptin在大肠杆菌中的表达：将编码成熟肽第二个氨基酸脯氨酸的CCC密码子修饰为大肠杆菌使用频率高的CCG密码子，在Ptac启动子下表达的融合表达蛋白最高表达量为49％；非融合表达在PT7启动子下，加上编码起始氨基酸的密码子ATG，其表达量高达49％，说明上述修饰对该蛋白表达有一定影响。
本发明人还进行了Leptin在大肠杆菌中表达条件的研究，分别做了表达载体在不同大肠杆菌菌株、不同IPTG浓度、不同生长阶段和不同诱导时间下的诱导表达实验。
本发明的目的：本发明的目的是要提供瘦蛋白基因的一种修饰方法，该方法能有效地增加瘦蛋白基因的表达，并使之成为一种降低个体体重的有效方法和提高饲料利用率与瘦肉率的有效方法。
本发明的效果：
本发明将人和猪的ob基因经过PCR方法修饰克隆于Ptac启动子和PT7启动子的下游，进行融合和非融合表达，融合表达分子量为42kD，其中含有26kD的谷胱苷肽转移酶和16kD的重组蛋白Leptin；非融合表达分子量为16kD(参见附图1)。
依据本发明的优选实施方案，人ob基因的表达最高可达55％，猪ob基因的表达最高达49％。
依据本发明的一个优选实施方案，注射重组得到的瘦蛋白到小鼠体内，以检测其生物学活性，发现可使小鼠体重显著下降，表明瘦蛋白可作为减轻体重的制剂使用；并且，瘦蛋白还可在小鼠体内通过限制体脂增加以减少摄食，以提高饲料转化率。
本发明的技术方案：
本发明以瘦蛋白(ob)基因全长cDNA为模板，通过引物设计改变编码成熟Leptin第二个氨基酸的密码子，使其成为大肠杆菌使用频率高的密码子；然后，将其分别克隆于Ptac启动子和PT7启动子下游，进行融合和非融合表达。表达条件为：菌体生长至OD6000.9左右，补加1/5的培养基，在0.1m Mol/L的IPTG诱导下诱导2.5-3小时。通过对人和猪ob基因表达产物纯化，其中人重组Leptin纯度达96％，猪重组Leptin纯度达95％。
其中，依据本发明的优选实施方案，融合表达和非融合表达的引物分别为：
猪ob(POB)融合表达引物：
引物1： 5’ GGGATCCGTGCCGATCTGGAGAGTCCAGGATG 3’
引物2： 5’ GGAATTCTTCAAGGCTTCAGCAGCCAGGG 3’
人ob(HOB)融合表达引物：
引物1： 5’ GGGATCCGTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGA 3’
引物2： 5’ CGAATTCCTTCAAGGCCTCAGCACCCAG 3’
猪ob(POB)非融合表达引物：
引物1： 5’ GCATATGGTGCCGATCTGGAGAGTCCAGG 3’
引物2： 5’ GGAATTCTTCAAGGCTTCAGCAGCCAGGG 3’
人ob(HOB)非融合表达引物：
引物1： 5’ GCATATGGTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGA 3’
引物2： 5’ CGAATTCCTTCAAGGCCTCAGCACCCAG 3’
使用的PCR反应体系及其反应条件为：
PCR反应体系：2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl2，0.01％明胶)，2μl dNTPs(2.5mmol/L)，引物终浓度0.5μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，模板DNA 50-100ng。终体积为25μl。
PCR反应条件：
94℃、3分钟；然后94℃、0.5分钟，60℃、0.5分钟，72℃、0.7分钟28个循环；最后72℃、5分钟。4℃长时间保存。
用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
融合表达分子量为42kD，其中含有26kD的谷胱苷肽转移酶和16kD的重组蛋白Leptin，两个肽链间有一个凝血酶因子X的酶切位点；非融合表达分子量为16kD。利用纯化的非融合表达重组蛋白制备抗兔血清，进行生物学活性检测实验，Western印渍杂交为阳性；利用纯化产物注射小鼠，可使小鼠体重下降，与对照组有显著性差异(p＜0.05)，表明纯化产物具有生物学活性。
本发明所用的实验材料：
1.菌株和克隆载体：
(1)本发明所用菌株：见表1：
表1.本发明所用菌株和其表型及基因型
| 菌株名称 | 表型及基因型 |
| DH5α | supE44 ΔLac169(Φ80 LacZ ΔM15)hsdR17 RecA endA1 gyrA98 thi-1 recA1 |
| JM109 | recA1 supE44 endA1 hsdR17 gryA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F′〔traD36 proAB+laIq LacZΔM15) |
| JM107 | supE44 endA1 hsdR17 gryA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F′(traD36 proAB+laIq LacZAM15) |
| JM83 | rpsLF- araΔ(lac-proAB)(Strr)(φ80dlacΔ(lacZ)M15) |
| C600BL21(DE3) | supE44 hsdR thi-1 leuB6 LacY1 tonA21hsdS gal(λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7基因1) |
(2)本发明所用表达载体：
融合表达载体：pGEMX-2T，购自Amershampharmacia公司(AmershamPharmcia Biotech Inc.，800 Centennial Ave，PO Box 1327，Piscataway，NJ 08855，USA)；
非融合表达载体：pET-5a，购自Promega公司(Promega Corporation，2800Wood Hollow Road Madison，WI 53711-5399，USA)。
2.实验用模板和动物：
实验用PCR模板为本实验室(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，中国北京圆明园西路2号)保存；制备抗血清的新西兰大耳白购自中国农业大学动物科技学院种兔厂(中国农业大学，北京圆明园西路2号)，生物学活性实验用小白鼠购自北京大学医学部实验动物室(北京市海淀区学院路38号)。
3.酶与试剂：
限制性内切酶、修饰酶、羊抗兔二抗、完全佐剂和不完全佐剂分别购自华美生物工程公司(中国河南洛阳国家高新技术产业开发区三山路007号)、Biolab(New England Biolabs Ltd.，73 Knowl Piece Wilbury Way Hitchin，HertfordshireSG4 OTY England，UK)公司和Promega公司(Promega Corporation，2800 WoodHollow Road Madison，WI 53711-5399，USA公司地址)；PCR引物由上海生物工程公司(中国上海市漕宝路500号1号楼235室)合成。
4.DNA分析软件：
同源性分析软件：GENETYX-MAX8.5；
PCR引物设计软件：OLIGO4.0；
数据分析软件：SAS(6.12版本)。
本发明所用的实验方法：
1.试剂的配制：
质粒DNA提取溶液I：50mM葡萄糖，2.5mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌(8磅15分钟)，贮存于4℃；
质粒DNA提取溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，现配现用；
质粒DNA提取溶液III：5M乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml；
1M IPTG溶液：IPTG 2g溶解于10ml双蒸水中，过滤除菌，分装贮存于-20℃：
1M DTT溶液：DTT 3.09g溶解于20ml 0.01Mol/L乙酸钠中，过滤除菌，分装，贮存于-20℃；
转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris、0.37g SDS加入200ml甲醇，再加入ddH2O定容至1000ml；
丽舂红S染色：2g丽舂红、30g三氯乙酸、30g磺基水杨酸，定容于100ml；
封闭液：5g脱脂奶粉、0.02g叠氮化钠、0.02mlTween-20，定容于100ml；
RNaseA溶液：10mg/ml溶于10mM Tris·Cl(pH7.5)，15mM NaCl中100℃煮沸10分钟，室温冷却后，贮存于-20℃。
2.感受态细胞的制备(CaCl2法)：
挑取DH5α或JM109大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线培养；挑取培养好的新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃培养至OD600达到0.4～0.5；将菌转移至一预冷的灭菌100ml离心管中，冰浴10～15分钟；4000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀；加入20ml冰预冷的0.1M CaCl2悬浮细菌沉淀；冰浴10～15分钟；4000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀；加入4ml 0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀(这时细胞可直接用于转化实验)；加甘油至终浓度为15％～20％；混匀，分装成200μl一小份，冻存于-70℃。
3.质粒DNA的小规模提取---碱裂解法：
接种单菌落于3ml含70ug/ml Amp的LB液体培养基中，220rpm，37℃振荡培养过夜(8-10小时)，10,000rpm，4℃离心5分钟(无4℃条件常温亦可)，收集菌体；适量STE重悬细菌沉淀，3ml培养物沉淀在一个1.5ml离心管中，4℃离心5分钟，收集菌体；倾去STE液体，加入200ul溶液I，振荡充分悬浮细胞于溶液I中；加入新配制的溶液II 200ul，将管迅速颠倒混匀10次，室温静置5分钟；加入溶液III 200ul，将管倒置振荡1分钟，冰浴5分钟；1,2000rpm离心8分钟，小心取上清于离心管中；用与上清等体积的Tris饱和酚、酚/氯仿、氯仿顺次抽提一次，保留水相；加入1/10体积的pH5.2的3M NaAc，再加2体积的无水乙醇，-70℃冰箱内沉淀15分钟；离心弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀；离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇；加入50ul TE同时加1ulRNase放入37℃中2小时；电泳检查含量。
4.质粒DNA的大量制备：
接种大肠杆菌单菌落于100ml LB液体培养基中，37℃培养过夜；4000rpm，4℃离心10分钟，收集菌体，弃上清；将细菌沉淀用20ml冰预冷的STE溶液重悬，按上述方法重新离心，去上清，倒置，吸干残留液，加入冰预冷的质粒提取溶液I 2ml，将细菌沉淀重悬；加入200μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mM Tris·Cl，pH8.0)，混匀；加入4ml新配制的质粒提取溶液II，盖紧离心管盖，缓慢颠倒数次，充分混匀内容物，于室温放置5～10分钟；加2ml用冰预冷的质粒提取溶液III，将离心管颠倒数次，冰浴15分钟，可见白色絮状沉淀产生；12,000rpm，4℃离心20分钟；将上清转移至另一离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟；10000rpm，室温离心15分钟，回收质粒沉淀；去除上清，用70％乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1ml TE中；加入5μl RNaseA(5mg/ml)，37℃消化1小时；转移至小离心管，用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿、氯仿，各抽提一次；加入1/5体积的10MNH4AC，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置30分钟；12,000rpm，室温离心10分钟弃上清，用70％乙醇洗沉淀两次，真空抽干，溶于适量TE中，储存于-20℃。
5.重组质粒大小的快速鉴定---Cracking法：
挑取转化后平板培养的白色菌落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12～16小时；用牙签挑取少量菌体，涂于含有20μl灭菌水的离心管内；振荡，充分悬浮菌体后，加入等体积20μl的2×Cracking缓冲液，剧烈振荡2分钟；12,000rpm离心5分钟，取上清10～20μl上样电泳，以蓝斑的裂解物作对照，检测质粒是否有插入及其大致大小。
6.转化：
从-70℃取出保存的感受态细胞，冰浴助融；200μl感受态细胞加入5μl连接产物，冰浴30分钟；42℃水浴热激90秒，冰浴2分钟；加800μl LB，37℃水浴复活50分钟；铺200μl于含X-gal、IPTG、Amp的LB平板；37℃培养9-16小时。
7.筛选重组子：
接划线菌于2ml LB中，过夜培养；碱变性提取重组质粒；内切酶消化0.5μg DNA；电泳检查。
8.制备模板：
碱变性制备模板；调浓度至0.1-0.2μg/μl。
9.Dye Terminator对阳性克隆作部分测序
(1)碱裂解法准备模板，稀释至0.1-0.2μg/μl；
(2)克隆测序反应体系：见表2：
表2.克隆测序反应体系组成
| 组分 | 体积 |
| 模板(μl) | 2 |
| Premix(μl) | 8 |
| Primer | 1 |
| ddH2O | 9 |
| 总体积(μl) | 20 |
(3)PE9600 PCR反应：
95℃，10秒；50℃，5秒；60℃，1分钟；25个循环；4℃
(4)沉淀PCR产物：
将反应物加入到含100μl 95％乙醇，1.5ml离心管中；冰上放置15分钟；12,000rpm，离心15分钟；250μl 70％的乙醇洗一遍；抽干，-20℃保存，准备测序上样。
10.利用玻璃奶洗脱法回收PCR产物：
(1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml Eppendorff管中捣碎，动作轻柔；
(2)加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5分钟(或50℃保温3分钟)，其间轻摇Eppendorff管几次，使胶完全溶化；
(3)加入10μl玻璃奶，颠倒混匀，冰浴下放置10分钟。并且间隔2-3分钟混匀一次；
(4)12,000rpm离心30秒，吸弃上清；
(5)加250μl漂洗液，用加样器吸漂洗液轻柔地将玻璃奶冲散均匀，离心弃上清；
(6)重复上述步骤(5)一次。吸取完漂洗液后，再离心10秒钟，用Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃温箱干燥20分钟；
(7)加适量无菌蒸馏水或TE(10-30μl)，混匀。60℃水浴5分钟；
(8)12,000rpm离心1分钟，回收上清备用，重复上述步骤(7)-(8)1-2次。
11.融合表达载体的构建(参见附图2)；
12.非融合表达载体的构建(参见附图3)；
13.外源片段在大肠杆菌中的表达：
挑取单菌落接种于5ml液体LB培养基中37℃震荡过夜培养(14小时-16小时)；次日，按2％接种于100ml液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD6000.9左右；补充38℃液体LB培养基20ml，加入IPTG至终浓度0.1Mm/L，继续在37℃震荡培养2-3小时；测OD600值，取1ml离心，弃上清，剩余培养物同样离心备用。
14.SDS-PAGE电泳检测：SDS-PAGE电泳胶的灌制见表3：
表3.配制SDS-PAGE胶的组成
| 溶液成分 | 12％分离胶(ml) | 5％浓缩胶(ml) |
| 30％丙烯酰胺溶液2MTris(PH8.8)2MTris(PH6.8)10％SDS10％过硫酸铵dH2OTEMED | 4.0001.875-0.1000.1004.0000.004 | 0.330-0.1250.0200.0201.5250.002 |
| 合 计 | 10 | 2 |
每毫升菌液按所测OD600值乘以141加入Loading缓冲液，混匀，于100℃加热5-10分钟，迅速冰浴，12,000rpm离心10分钟，取5ul上样。
15.包涵体的提取：
将表达的菌体用少量STE溶液悬浮，加入容菌酶，室温放置15分钟，置于-70℃超低温冰箱中冷冻2小时，取出于室温溶解；重复冷冻和溶解3次以上；加入STE溶液洗涤，离心12000rpm 10分钟，收集沉淀，反复洗涤3次以上；收集沉淀的包涵体，备用。
16.表达产物的初步纯化：
在1g包涵体中加入15ml 8M/L pH8.8尿素使包涵体裂解，蛋白变性，过夜；离心，12000rpm 10分钟；吸取上清，准确测量体积；在4℃环境下加入3倍体积的10mM/L PH8.3的乙醇胺溶液复性，放置1小时；将复性液于4℃环境下在10mM/L pH8.3的Tris缓冲液中透析36小时，透析液酶6小时换一次；取出透析产品，冷冻于-70℃备用。
17.抗体的制备：
用完全佐剂乳化包涵体；在兔子背部多点注射乳化剂，每点100ul，共20点；15天后，多点注射用不完全佐剂乳化的纯化蛋白乳化剂，剂量和点数同上；用不完全佐剂乳化的纯化蛋白乳化剂每10天多点注射一次，共注射3次；最后一次用纯化蛋白直接在兔耳缘静脉注射进行免疫；免疫后第10天，通过心脏采血，置于50ml离心管中，37℃保温；当血液凝聚后，取出血清，加入0.1％的叠氮化钠，冷冻于-70℃备用。
18.纯化蛋白生物活性检测
将2月龄成年雌性小鼠随机分为四组，每组注射相同的量1ml，对照组1不注射，对照组2注射10Mm/L PH8.3Tris缓冲液，实验组注射纯化产品，每天早晚各注射一次，注射量hOB10mg/次，pOB5mg/次，注射时间相隔10小时，共注射7天，每天晚上注射前称量体重。
19.Western印渍检测：
SDS-PAGE电泳；转膜(2小时)；取出膜加入封闭液封闭(2小时)；弃去封闭液，按0.1ml/cm2加入封闭液和制备的抗血清(1∶200)，4℃轻摇2小时；PBS洗三次，每次10分钟；将膜放入含有辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶50)的溶液(5％脱脂奶粉、150mMNaCl、50mMTris PH7.5)室温1小时；洗涤液洗涤(150mMNaCl，50mMTris PH7.5)四次，每次10分钟；将膜放入显色液(使用前将溶于20ml冰甲醇的60mg4-氯-1-萘酚和100ml含60ul 30％H2O2的10mMTris PH7.5、150mMNaCl混合)中，显影后，用蒸馏水洗两遍停止显色。
本发明的实施例：
1.人ob基因的融合表达：
(1)pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表达：
据E.coli BL21生长曲线，在补给营养的条件下，pGEMX-HOB在E.coliBL21不同生长期间(OD600：0.25-1.73)表达量扫描结果如表4所示，OD600在0.25-1.73之间时表达量变化无明显差异，表明在营养充分的条件下，pGEMX-HOB在E.coli BL21中均能高效表达。
表4 pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 不同OD600值表达量(％) | 0.24923.3 | 0.53230.7 | 0.98331.9 | 1.20329.5 | 1.48727.7 | 1.73228.8 |
(2)pGEMX-HOB在不同菌株中的表达：
不同菌株中pGEMX-HOB诱导表达结果见表5，其中E.coli BL21、JM107、c600较高，E.coli DH5α较低，表明pGEMX-HOB在大肠杆菌中的诱导表达对菌株有一定选择性。
表5 pGEMX-HOB在不同菌株中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 不同菌株 | C600 | JM83 | DH5α | JM107 | JM109 | BL21 |
| 表达量(％) | 41.9 | 39.5 | 33.8 | 40.7 | 35.9 | 42.6 |
(3)不同浓度IPTG诱导pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表达：
不同浓度IPTG诱导pGEMX-HOB在E.coli BL21中表达量见表6，结果表明IPTG浓度从0.1-10mM对pGEMX-HOB诱导表达无明显差异，IPTG浓度在此间对表达量影响不大。
表6 不同浓度IPTG诱导pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5 6
不同浓度IPTG(mM) 0.05 0.1 1.0 2.0 5.0 10.0
表达量(％) -33.3 45.4 43.7 44.9 47.0 49.8
(4)pGEMX-HOB在E.coli BL21中不同诱导时间的表达：
pGEMX-HOB在E.coli BL21中不同诱导时间表达量见表7，结果表明在菌体生长至OD600为0.9左右时，加入0.1mM IPTG和补充培养基，诱导0.5小时-1.5小时表达量较低，诱导2小时后表达量较高，随着诱导时间的延长，表达量也较高。
表7 不同诱导时间pGEMX-HOB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 诱导时间(小时)表达量(％) | 0.516.1 | 121.0 | 1.524.2 | 2.029.2 | 2.533.5 | 336.4 |
(5)重组蛋白提取：
pGEMX-HOB在IPTG诱导下表达融合蛋白表达量为28.3％，经裂解细胞STE洗涤三次后其占菌体蛋白的37.1％，经变性和复性后其纯度达91.8％。扫描蛋白图谱见附图4。
2.人ob基因非融合表达
(1)pET-HOB在E.coli BL21中的表达：
据E.coli BL21生长曲线，在补给营养的条件下，pET-HOB在E.coli BL21不同生长期间(OD600：0.3-1.8)表达量扫描结果列于表8。结果显示，在OD600处于0.30-1.8之间其表达量变化无明显差异，这说明在营养充分的条件下pET-HOB在E.coli BL21中均能高效表达。
表8 pET-HOB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 不同OD600值表达量(％) | 0.31342.7 | 0.66733.2 | 1.00036.8 | 1.40538.3 | 1.82245.5 | 1.84639.1 |
(2)不同浓度IPTG诱导pET-HOB在E.coli BL21中的表达：
不同浓度IPTG诱导pET-HOB在E.coli BL21中表达量见表9，结果表明IPTG浓度从0.05-5mM对pET-HOB诱导表达无明显差异，IPTG浓度在此间对表达量影响不大。
表9 不同浓度IPTG诱导pET-HOB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| 不同浓度IPTG(mM)表达量(％) | 0.0118.3 | 0.0540.4 | 0.1039.1 | 0.2039.3 | 0.5046.2 | 1.0037.6 | 5.0043.1 |
(3)pET-HOB在E.coli BL21中不同诱导时间的表达：
pET-HOB在E.coli BL21中不同诱导时间表达量见表10.结果表明在菌体生长至OD600为0.9左右时，加入.0.1mM IPTG和补充培养基，诱导0.5小时-1.5小时表达量较低，诱导2小时后表达量较高，随着诱导时间的延长，表达量也较高。
表10 不同诱导时间pET-HOB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 诱导时间(小时)表达量(％) | 0.521.3 | 130.1 | 1.537.0 | 2.043.5 | 2.550.5 | 355.1 |
(4)重组蛋白纯化：
pET-HOB在IPTG诱导下表达融合蛋白表达量为46.6％，经裂解细胞STE洗涤，变性和复性后其纯度达96.4％。扫描蛋白图谱见附图5。
3.猪ob基因融合表达：
(1)pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达：
据E.coli BL21生长曲线，在补给营养的条件下，pGEMX-POB在E.coliBL21不同生长期间(OD600：0.2-1.9)的表达量扫描结果如表11所示，OD600在0.2-1.9之间其表达量变化无明显差异，说明在营养充分的条件下pGEMX-POB在E.coli BL21中均能高效表达。
表11 pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| 不同OD600值表达量(％) | 0.24934.5 | 0.43237.7 | 0.58338.4 | 0.80340.0 | 0.98741.1 | 1.23241.5 | 1.62338.7 | 1.89237.9 |
(2)pGEMX-POB在不同菌株中的表达
不同菌株中pGEMX-POB诱导表达结果见表12，其中pGEMX-POB在E.coliBL21、JM83中表达较高，在E.coli DH5α较低，表明pGEMX-POB的诱导表达对菌株有一定选择性。
表12 pGEMX-POB在不同菌株中的表达
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 不同菌株 | DH5α | C600 | BL21 | JM83 | JM107 | JM109 |
| 表达量(％) | 26.2 | 37.4 | 41.0 | 40.5 | 37.8 | 29.6 |
(3)不同浓度IPTG诱导pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达：
不同浓度IPTG诱导pGEMX-OB在E.coli BL21中表达量见表13，结果表明IPTG浓度从0.01-10mM对pGEMX-POB诱导表达无明显差异，浓度过高或过低表达量部有下降，本实验在诱导IPTG浓度0.01时未检测到蛋白表达带。
表13 不同浓度IPTG诱导pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
不同浓度IPTG(mM) 0.01 0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.8 1.0 5.0 10.0
表达量(％) -- 33.9 46.3 47.5 46.4 49.1 47.1 48.1 39.8 38.6
(4)pGEMX-POB在E.coli BL21中不同诱导时间的表达
pGEMX-POB在E.coli BL21中不同诱导时间表达量见表14，结果表明在菌体生长至OD600为0.9左右时，加入0.1mM IPTG和补充培养基，诱导0.5小时-1.5小时表达量较低，诱导2小时后表达量较高，随着诱导时间的延长，表达量也较高。
表14 不同诱导时间pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5 6
诱导时间(小时) 0.5 1 1.5 2.0 2.5 3
表达量(％) 12.5 17.0 20.4 22.7 27.4 29.1
(5)蛋白质纯化：
pGEMX-POB在IPTG诱导下表达融合蛋白表达量为27.0％，经裂解细胞STE洗涤其纯度达42.5％，经变性和复性后其纯度达92.7％。扫描蛋白图谱见附图6。
4.猪ob基因的非融合表达：
(1)pET-POB在E.coli BL21中的表达：
据E.coli BL21生长曲线，在补给营养的条件下，pET-POB在E.coli BL21不同生长期间(OD600：0.30-1.33)的表达量扫描结果如表15所示，OD600在0.30-1.33之间其表达量变化无明显差异，说明在营养充分的条件下pET-POB在E.coli BL21中均能高效表达。
表15 pET-POB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5
不同OD600值 0.295 0.497 0.871 1.167 1.334
表达量(％) 33.3 35.9 29.5 29.2 32.1
(2)不同浓度IPTG诱导pET-POB在E.coli BL21中的表达：
不同浓度IPTG诱导pGEMX-OB在E.coli BL21中表达量见表16，结果表明IPTG浓度从0.05-5.0mM对pET-POB诱导表达无明显差异。
表16 不同浓度IPTG诱导pET-POB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5
不同浓度IPTG(mM) 0.05 0.10 0.50 1.00 5.00
表达量(％) 31.1 31.2 37.7 36.0 38.1
(3)pET-POB在E.coli BL21中不同诱导时间的表达：
pET-POB在E.coli BL21中不同诱导时间表达量见表17，结果表明在菌体生长至OD600为0.9左右时，加入0.1mM IPTG和补充培养基，诱导0.5小时-1.5小时表达量较低，诱导2小时后表达量较高，随着诱导时间的延长，表达量也较高。
表17 不同诱导时间pET-POB在E.coli BL21中的表达
1 2 3 4 5 6
诱导时间(小时) 0.5 1 1.5 2.0 2.5 3
表达量(％) 16.9 21.1 28.9 45.5 48.6 47.0
(4)蛋白质纯化：
pET-POB在IPTG诱导下表达融合蛋白表达量为41.0％，经裂解细胞STE洗涤变性和复性后其纯度达95.6％。扫描蛋白图谱见附图7。
5.表达蛋白的Western-blotting检测：
(1)融合蛋白Western-blotting检测：
把在大肠杆菌中融合表达的人和猪Leptin电泳转膜，同时加入人和猪Leptin抗体，进行杂交。其Western-blotting检测结果见附图8。
(2)人非融合蛋白表达产物及血清Western-blotting检测：
人血清及表达的人非融合蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜，加入兔抗人Leptin抗血清和标有辣根过氧化物酶的二抗，再经显色。其Western-blotting检测结果见附图9。
(3)猪非融合蛋白表达产物及血清Western-blotting检测：
猪血清及表达的猪非融合蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜，加入兔抗猪Leptin抗血清和标有辣根过氧化物酶的二抗，再经显色。其Western-blotting检测结果见附图10。
6.Leptin的生物学活性检测：
将提取的人和猪的Leptin按上述实验方法注射小鼠，以检测Leptin的生物学活性。结果如表18所示。
表18 Leptin生物学活性的检测结果
| 对照组0 对照组1 人Leptin 猪Leptin |
| 注射前(g) 37.51 37.60 37.75 37.21第一天 38.12 37.84 36.62 36.57第二天 37.99 38.01 36.34 36.38第三天 38.22 38.14 35.70 36.06第四天 38.20 37.18 34.92 35.99第五天 38.54 36.73 34.65 35.13第六天 38.39 36.95 33.87 35.01第七天 38.25 36.94 33.46 34.83第八天 38.28 36.70 33.22 34.77 |
| 停止注射第十天 38.34 36.15 33.63 34.26第十二天 38.4 35.96 33.07 34.40 |
根据以上结果作图，结果见附图11。
方差分析结果见表19。
表19 方差分析结果
| 注射前 第八天 注射后最小二乘均值 |
| CK0 37.51 38.28 38.29aCK1 37.60 36.70 36.63bPOB 37.21 34.77 35.02cHOB 37.75 33.22 33.03d |
注：最小二乘均值比较时相同字母的差异不显著(P＞0.05)
附录：本发明所涉及的序列
SEQ ID NO 1：
GTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCA
GGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTT
GGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTG
GCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCA
ACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACCTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCA
CTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGC
TTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGA
CATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA
SEQ ID NO 2：
GTGCCGATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCA
GGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTT
GGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTG
GCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCA
ACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACCTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCA
CTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGC
TTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGA
CATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA
SEQ ID NO 3：
GTGCCGATCTGGAGAGTCCAGGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACGATTGTCACCA
GGATCAGTGACATTTCACACATGCAGTCTGTCTCCTCCAAACAGAGGGTCACCGGTTT
GGACTTCATCCCTGGGCTCCATCCTGTCCTGAGTTTGTCCAAGATGGACCAGACCCTG
GCGATCTACCAACAGATCCTCACCAGTCTGCCTTCCAGAAATGTGATCCAAATATCGAA
TGACCTGGAGAACCTCCGGGACCTTCTCCACCTGCTGGCCTCCTCCAAGAGCTGCCCC
TTGCCCCAGGCCAGGGCCCTGGAGACCTTGGAGAGCCTGGGCGGCGTCCTGGAAGCC
TCCCTCTACTCCACGGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGGCTCTGCAGGAC
ATGCTGCGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGCTGCTGA
ATGCTGCGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGCTGCTGA
附图及其说明：
1、图1至图4为经修饰的人和猪ob cDNA融合和非融合表达电泳图；
其中图1为经修饰的人ob cDNA融合表达电泳图；
其中图2为经修饰的人ob cDNA非融合表达电泳图；
其中图3为经修饰的猪ob cDNA融合表达电泳图；
其中图4为经修饰的猪ob cDNA非融合表达电泳图；
可以看出，融合表达有一条42KD的表达电泳带，非融合表达有一条16KD的表达电泳带，表达电泳带均是对照中所没有的。
2、图5为融合表达载体的构建；
3、图6为非融合表达载体的构建；
4、图7为重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图谱；
其中1为pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达，2和3为包涵体，4为洗涤包涵体上清，5为纯化的包涵体，MW为蛋白分子量标准。
5、图8为提取重组蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；
其中：1：E.coli BL21总蛋白；2：pET-HOB在E.coli BL21中总蛋白；
3：pET-HOB在E.coli BL21中的表达；4-6：纯化的HOB；
MW：蛋白分子量标准。
6、图9为纯化的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱：
其中：1：pGEMX-POB在E.coli BL21中的表达；2和3：包涵体；
4：裂解细胞上清；5：纯化的蛋白质；M：蛋白分子量标准。
7、图10为纯化的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱：
其中：ck1：E.coli BL21总蛋白ck2：pET-POB在E.coli BL21中总蛋白；
1：pET-HOB在E.coli BL21中的表达；2，3：纯化的POB；MW：蛋白分子量标准。
8、图11为融合蛋白的Western-blotting检测图：
其中：1：人ob基因融合表达蛋白；2：猪ob基因融合表达蛋白；MW分子量标准。
9、图12为人ob基因表达产物及人血清Western-blotting检测：
其中：1：人血清；2：HOB在E.coli中的表达产物；MW：分子量标准。
10、图13为猪ob基因表达产物及人血清Western-blotting检测：
其中：1：猪血清；2：POB在E.coli中的表达；MW：分子量标准。
11、图14为Leptin生物学活性检测分析图：
说明：系列1：非注射；系列2：注射10mM Tris；系列3：注射POB；系列4：注射HOB。
Claims (6)
1.一种修饰瘦蛋白(leptin)基因cDNA序列的方法，其特征是该方法把该基因cDNA序列中编码第二个氨基酸脯氨酸的密码子CCC改变为CCG。
2.权利要求1的修饰瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所说的瘦蛋白基因是人瘦蛋白基因。
3.权利要求1的修饰瘦蛋白基因cDNA序列的方法，其中所说的瘦蛋白基因是猪瘦蛋白基因。
4.一种增强瘦蛋白基因表达的方法，其特征是该方法应用权利要求1的修饰瘦蛋白基因cDNA序列的方法。
5.权利要求4的增强瘦蛋白基因表达的方法，其中所说的基因表达是基因的融合表达或非融合表达。
6.权利要求4的增强瘦蛋白基因表达的方法，其中所说的基因表达是基因在大肠杆菌(E.coli)中的表达。
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