CN1188516C - 一种重组纳豆激酶的编码核苷酸序列及该酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

纳豆激酶是一种安全，高效的具有纤溶活性的酶制剂。目前已被深入研究，试图作为口服溶栓剂予以开发应用。我们利用基因工程的方法，表达出具有纤溶活性的纳豆激酶。重组产物和天然纳豆激酶相比，具有良好的生物学活性。体内和体外实验证明，纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促进内源性t-PA的产生，从而直接和间接的促进了溶栓作用。同时由于纳豆激酶的安全性较高，没有出现大出血等现象，易于口服治疗。

Description

一种重组纳豆激酶的编码核苷酸序列及该酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组纳豆激酶的编码核苷酸序列及其制备方法。

背景技术

纳豆激酶是一种能达到经口纤溶疗效目的，从世界上数百种食物中筛选出来的，安全性最高的高效血栓溶解酶。目前临床上广泛使用的溶栓剂主要是链激酶，尿激酶，尿激酶原，重组人纤溶酶原激活剂(t-PA)等。上述药物在临床使用中有的易产生抗再灌注，再次出现栓塞，出血，过敏等反应。而NK是一种能口服的，安全性较高的血栓溶解药物。一系列的体外实验，小鼠和狗模型及健康人体测试显示，NK有较高的口服和静脉滴注安全性和高效性能的纤溶性。它不仅可以用于多种血栓疾病的治疗，而且可以用于此类疾病的预防。纳豆激酶主要通过直接溶解血纤维蛋白，间接增加t-PA活性，激活尿激酶原使之转化为尿激酶等途径进行血栓性疾病的治疗。天然的NK在野生菌发酵液中产量较低(＜10％)，提取方法较繁琐，得率底，成本高，且野生菌易发生突变，较难控制。本发明的目的是提供一种新的制备NK的方法，其中包括PCR扩增基因，经序列鉴定后克隆至大肠杆菌表达载体中，温度诱导表达，表达产物占菌体总蛋白的5.5％以上。表达产物以包涵体的形式存在于菌体内，经变性、复性，离子交换层析等方法纯化，产物纯度高，产量高，成本低，产品质量稳定。体内和体外实验证明，纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促进内源性t-PA的产生，从而直接和间接的促进了溶栓作用。同时由于纳豆激酶的安全性较高，没有出现大出血等现象，易于口服治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的制备重组纳豆激酶的方法，其中包括PCR扩增基因，经序列鉴定后克隆至大肠杆菌表达载体中，温度诱导表达，表达产物占菌体总蛋白的5.5％以上。表达产物以包涵体的形式存在于菌体内，经变性、复性，离子交换层析等方法纯化，产物纯度高，产量高，成本低，产品质量稳定。体内和体外实验证明，纳豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促进内源性t-PA的产生，从而直接和间接的促进了溶栓作用。同时由于纳豆激酶的安全性较高，没有出现大出血等现象，易于口服治疗。

具体说，本发明涉及一种制备重组纳豆激酶的方法，包括纳豆激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达，工程菌的发酵，表达产物重组纳豆激酶的纯化以及其生物活性的测定，其特征在于：

(1)以枯草杆菌Baci11us subtilis notto Asl.1086菌体总DNA为模板，参考Bacillus subtilis中编码纳豆激酶EC.3.4.21.62的NAT基因序列设计引物，通过PCR方法直接扩增纳豆激酶基因，纳豆激酶基因克隆进pGEM-T载体后，经序列分析证实，然后与含有cIta857基因，PrPL启动子以及rrnB基因转录终止信号的原核表达载体pBV220质粒组装成高效表达载体pBV-NK；

(2)pBV-NK转化大肠杆菌BL21-DE3，用温度诱导重组纳豆激酶基因的表达，表达产物以包涵体的形式存在于大肠杆菌BL21-DE3中；

(3)通过发酵技术大规模培养大肠杆菌BL21-DE3，用温度诱导重组纳豆激酶基因表达，发酵参数为温度28℃-40℃，溶氧量为50％-80％，PH6-8；

(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集破碎后的沉淀，将包涵体变性后，经凝胶过滤纯化包涵体，包涵体复性后，经离子交换法纯化重组纳豆激酶，进行活性测定后，冻干成粉末保存。

此外，本发明还包括一种编码重组纳豆激酶的核苷酸序列，其特征在于其是用权利要求1所述的方法生产的，所述序列如下：

GCG CAA TCT GTT CCT TAT GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG CCG GCT

Ala  Gln  Ser  Val  Pro Tyr  Gly  Ile  Ser  Gln Ile  Lvs  Ala  Pro  Ala

CTT CAC TCT CAA GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC

Leu His  Ser  Gln  Gly  Tyr Thr  Gly  Ser  Asn Val  Lys  Val  Ala Val  Ile  Asp

AGC GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA GCA AGC

Ser  Gly  Ile  Asp  Ser Ser  His  Pro Asp  Leu Asn  Val  Arg  Gly Gly  Ala  Ser

TTC GTT CCT TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC AGT TCT CAC GGT ACG

Phe  Val  Pro Ser  Glu Thr  Asn  Pro  Tyr Gln  Asp Gly  Ser  Ser  His  Gly Thr

CAT GTC GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT AAT AAC TCA ATC GGT GTT CYG GGC

His  Val Ala  Gly  Thr Ile  Ala  Ala  Leu Asn  Asn Asn  Iln  Gly Val  Leu  Gly

GTA GCG CCA AGC GCA TCA TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA

Val  Ala  Pro Ser Ala  Ser  Leu Tyr  Ala  Val  Lys Val  Leu  Asp Ser  Thr  Gly

GTA GCG CCA AGC GCA TCA TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA

Val  Ala  Pro Ser  Ala  Ser Leu Tyr Ala  Val  Lys  Val  Leu Asp Ser  Thr  Gly

AGC GGC CAA TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC

Ser  Gly  Gln Tyr  Ser Trp  Ile  Ile  Asn Gly  Ile  Gln Trp  Ala  Ile Ser  Asn

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT TCT ACA

Asn Met  Asp Val  Ile  Asn  Met Ser  Leu Gly  Gly Pro  Thy  Gly Ser  Thr

GCG CTG AAA ACA GAT GTT GAT AAA GCG GTT TCC AGC GGT ATC GTC GTT GCT

Ala  Leu  Lys Thr  Val  Val  Asp Lys  Ala  Val  Ser Ser  Gly  Ile  Val  Val  Ala

GCC GCA GCC GGA AAC GAA GGT TCA TCC GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC

Ala  Ala  Ala Gly  Asn  Glu Gly  Ser  Ser Gly  Ser Thr  Ser Thr Val  Gly

TAC CTT GCA AAA TAT CCT TCT ACT ATT GCA GTA GGT GCG GAT AAC AGC AGC

Tyr  Pro  Ala Lys Try  Pro  Ser  Thr Ile  Ala  Val  Gly Ala  Val  Asn Ser  Ser

ACC CAA AGA GCT TCA TTC TCC AGC GAT GGT TCT GAG CTT GAT GTA ATG

Asn  Gln Arg  Ala  Ser  Phe  Ser Ser  Val  Gly Ser  Glu  Leu Asp Val  Met

GCT CCT GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC

Ala  Pro  Gly Val  Ser  Ile  Gln Ser Thr  Leu Pro  Gly  Gly  Thr Tyr  Gly

GTC TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA GCA GCA

Ala  Tyr Asn  Gly Thy  Ser Met  Ala Thr  Pro  His Val  Ala Gly  Ala  Ala

CG CTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC GCG CAA GTC CGT GAT

Ala Leu  Ile  Leu Ser His  His  Pro  Thr  Trp Thr  Asn Ala  Gln  Val  Arg  Asp

CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA

Arg  Leu Glu  Ser  Thr  Ala Thr  Tyr  Leu Gly Asn  Ser Phe  Tyr  Tyr Gly  Lys

GGG TTA ATC AAC GAT CAA GCA GCT GCA CAA TAA

Gly  Lue Ile  Asn Val  Gln Ala  Ala  Ala  Gln  *

本发明采用下述技术方案：

(1)从枯草杆菌Bacillus subtilis notto中提取菌体总DNA，以其为模板，通过PCR的方法直接扩增纳豆激酶基因。纳豆激酶基因经核苷酸序列分析后与表达载体(如含PrPL启动子，cLts857基因及核糖体rrnB基因转录终止信号等调控原件的pBV220)组装成表达pBV-NK。

(2)pBV-NK转化大肠杆菌，采用温度诱导纳豆激酶基因的表达。经SDS-PAGE证实表达产物纳豆激酶分子量为28000Da，以细胞内包涵体的形式存在于工程菌中，占菌体总蛋白含量的55％，工程菌命名为BVNK。

(3)通过发酵技术大规模培养工程菌，以LBG培养基为基础培养液，发酵参数为温度24℃-42℃溶氧量为50％-80％，PH6-8。发酵后用高压破碎细胞，离心收集沉淀，包涵体变性，凝胶纯化后复性，再用离子交换法纯化产品。

(4)纯品纳豆激酶溶液中加入人血清白蛋白，谷氨酸钠及磷酸盐等稳定剂后，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥后成粉末状成品。注射用水溶解后，以治疗血栓性疾病为主要用途。

(5)治疗情况：

1)纳豆激酶的急性，毒性实验。观察了纳豆激酶尾静脉给药对小鼠的急性毒性反应，结果表明小鼠一次性注射的纳豆激酶的LD50为8.554mg/kg。

2)纳豆激酶的药效学的研究。观察了纳豆激酶对大鼠颈动脉血栓的形成，ADP诱导哦的小鼠急性肺栓塞及对家兔纤维蛋白溶解活性测定的影响。实验结果表明，纳豆激酶静脉注射给药能明显延长大鼠体内颈动脉栓的形成时间，对ADP的诱导小鼠的急性肺栓塞死亡率无明显影响，纳豆激酶静脉注射滴对家兔的纤维蛋白溶解活性有明显增强作用。

附图说明

说明书附图1：纳豆激酶基因扩增及pGEM-TNK的构建图

说明书附图2：表达载体pBV-NK的构建图

说明书附图3：工程菌BVNK表达纳豆激酶基因的SDS-PAGE结果

Lane1蛋白质分子量标准(94000，66200，43000，31000，20100)

Lane2BL21(DE3)空菌温度诱导后的菌体总蛋白

Lane3BVNK温度诱导4小时后的培养液上清

Lane4BVNK温度诱导后的培养液上清

说明书附图4：BVNK菌体超声波破碎后的SDS-PAGE照片

Lane1蛋白质分子量标准

Lane2BVNK表达菌体总蛋白

Lane3超声波破碎后的上清

Lane4超声波破碎后的沉淀

具体实施方式

实施例一  纳豆激酶基因表达载体的构建及表达：

1.从枯草杆菌Bacillus subtilis notto中提取菌体总DNA：将Bacillus subtilis notto接种于LB培养基中，37℃，250rpm/min摇动培养16小时。500rpm/min离心10分钟，收集菌块重悬于TE缓冲液中，加入SDS和蛋白酶K，37℃保温1小时。加入NaCl，CTAB混匀，65℃保温10分钟。加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，离心分蹭，上层液再用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，离心后上层液加入0.6倍体积的异戊醇，离心沉淀，用75％的乙醇洗2次，抽干后溶于TE缓冲液中，紫外分光检测证明A260/A280＞2.0。

2.用PCR方法扩增纳豆激酶基因：

设计PCR引物，并用固相磷酸三酯法进行DNA合成，纯化后用于扩增纳豆激酶基因，PCR引物的5’，3’末端分别含有限制性内切酶识别位点。

PCR引物I：

5’CG GAA TTC ATG GCG CAA TCT GTT CTT TAT GGC 3’

PCR引物II；

5’CG GGC TCC TTA TTG TGC AGC TGC TTG TAC G3’

PCR反应总体积50μl，含：

模板DNA              0.5μg

引物1                50.0pmol

引物2                50.0pmol

10*PCR BUFFER        50μl

TAQ酶                2.5U

PCR反应条件：

94℃       3min

94℃       30s    55℃    30s    72℃    2min；

5个循环后，72℃延伸10min。

反应结束后取2μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测在800-900bp处有一条十分明亮的条带其分子量符合纳豆激酶成熟基因的大小。

3.纳豆激酶基因内克隆的构建和鉴定：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化后，加入pGEM-T载体中，加T4DNA连接酶，10℃连接12小时，用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α。用氨变苄青霉素-LB平板进行重组插入失活筛选，挑取白斑克隆，按Sambrook的碱裂解法制备质粒，酶切鉴定，PCR鉴定，呈现特征条带者为阳性克隆pGEM-TNK。质粒pGEM-TNK经核苷酸序列分析证明含有正确的基因序列核阅读框架。

4.纳豆激酶基因在大肠杆菌中表达：

1)表达质粒的构建：

pGEM-TNK质粒经双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离，回收800bp纳豆激酶基因，并与原核表达载体如pBV220(含PrPL启动子，cIts857基因，rrnB转录终止子等调控元件)重组。反应产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，用氨苄青霉素-LB平板进行培养，经酶切鉴定挑取重组克隆，质粒命名为pGEM-NK，工程菌为BVNK。

2)基因表达：

挑取BVNK单克隆，在LBG培养基中振荡培养过夜，次日按1∶50转接，在摇瓶中30℃p培养至OD600 0.4-0.6，3分钟内迅速升温至42℃，继续培养6小时，4℃离心收集菌体，用PBS洗两次，保存于-20℃或立刻做表达产物活性鉴定和纯化。

LBG培养基成分：

酵母提取物5克；胰蛋白胨10克；氯化钠10克；葡萄糖2克。

3)表达条件优化：

BVNK单菌落接种于LBG(含氨苄青霉素)中30℃摇菌，次日按1∶50转接，摇菌至OD600＝0.6时，42℃诱导2-7小时，分别进行SDS-PAGE电泳。

5.表达产物鉴定

(1)SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定表达产物的分子量和表达水平：

样品溶解液：0.0626M Tris-HCL(PH6.7)；

2％SDS；10％甘油；5％巯基乙醇；0.001％溴酚蓝

样品处理上样：诱导培养后取1ml菌液5000rpm/min离心后沉淀重悬于50μlPBS中，加入等体积2倍样品溶解液中，置沸水浴5分钟，使沉淀溶解。层析分离的样品用2倍样品溶解液混合后，置沸水浴中5分钟。点样各为5ul/孔。分子量标准，对照细菌，诱导前细菌样品用同样的方法处理。

凝胶染色：用考马氏蓝R-250染色。

(2).表达水平测量：

凝胶经染色后用岛津CS-910双波长扫描仪做黑度扫描，计算机数据处理，打印纳豆激酶峰所占比例。结果42℃诱导后细菌SDS-PAGE凝胶上在分子量28000Da处有较深条带，诱导前细菌在28000Da处有一微弱条带，空载质粒表达菌无此特异性条带。菌体上清都无此条带，表明纳豆激酶为胞内表达蛋白。其中诱导6小时达到表达量的最高峰，纳豆激酶表达水平占菌体总蛋白量的55％左右。

(3)表达产物存在形式鉴定：

将诱导后的细菌5000rpm/min的离心10min，收集菌体。细菌超声破碎后(JY92-II型，功率设为400W)，10000rpm/min的离心10min，分别收集上清和沉淀，取10ul分别电泳。电泳结束后染色，显示超声上清有微弱的表达条带，而超声沉淀则含有大部分的目的蛋白。说明表达产物以包涵体的形式存在于细菌体内。

(4)表达产物的纤溶活性鉴定：

测活平板含纤维蛋白，人纤溶酶原，凝血酶原。上述样品经SDS-PAGE后，取出凝胶，经2.5％Triton X-100和蒸馏水反复洗涤后，覆盖于含纤维蛋P白，纤溶酶原和琼脂糖凝胶上，37℃保温数小时，在超声沉淀28000Da处出现纤维蛋白溶解圈，表明表达蛋白具有溶酶活性。

实施例二：基因工程纳豆激酶的大规模制备：

1.工程菌BVNK的发酵：

(1)摇瓶发酵：

工程菌BVNK单克隆接种于LBG-氨苄青霉素(100ug/ml)培养液中，30℃培养过夜。次日按1∶50稀释，充分振荡至OD600 0.4-0.6后，42℃升温培养6小时。菌液用以测重的离心管4℃，5000rpm/min离心10分钟。弃上清，沉淀菌块用PBS(PH7.4)洗涤一次，离心后称重。

(2)发酵罐(5L)发酵：

BVNK单克隆接种于100mlLBG-氨苄青霉素(100ug/ml)培养液中，30℃培养过夜，次日按1∶50转接于发酵罐中，设置温度30℃，PH6-8，溶氧50％-80％，搅拌速度600转/分(搅拌速度随溶氧量变化而变化)，OD600达到0.8-1.0后，在维持此参数不变的情况下，升温诱导5-6小时。菌体收集方法同摇瓶培养，-20℃保存备用。

2.重组纳豆激酶的纯化：

(1)细菌的破碎：

湿菌用1000ml(PH7.4)的PBS洗三次，悬浮于PBS中，高压匀浆破碎，10000rpm/min，4℃离心10分钟，收集沉淀。沉淀用含0.05Mtris-CL(PH7.5)，0.15M NaCL，1％TritonX-100的溶液反复洗涤，离心，收集沉淀。

(2)包涵体蛋白的变性，纯化及复性：

将包涵体溶解于变性缓冲液中，室温放置10小时。用Sepharol S200析柱分离包涵体，洗脱液为变性缓冲液。收集变性条件下的包涵体，然后加入9倍体积复性缓冲液，30℃，12小时。再用蒸馏水透析过夜。

变性缓冲液：0.1M Tris-HCL PH7.5，8M Urea，0.15M DTT

复性缓冲液：2M Urea，3M reduced glutathione，1Mm EDTA，

         0.2mM oxidised glutayhione，0.1M Tris-CL PH7.5；

复性后将蛋白经超滤浓缩后进行离子交换层析纯化。

(3)离子交换层析(BioCAD perfusion chromatography workstation)：

上述经浓缩后的样品，加入用NH₄AC(PH0.7)平衡过的CM-Sephorose，进行氯化钠盐梯度洗脱，盐浓度由0.04M-1.0M，收集紫外吸收峰，进行活性测定，合并有纤维溶活性的各管溶液，对蒸馏水透析过夜。

(4)电泳鉴定纯度：

样品经SDS-PAGE电泳，银染一条带，纯度为95％-98％。

(5)冻干粉制备：

将上述制备好的样品，经ddH2O透析后，用0.22微米的微孔过滤除菌，加入无菌的人血清白蛋白等稳定剂后冻干。

(6)纯化产物纤维活性的鉴定：将上述冻干粉用无菌水配置成0.1mg/ml的溶液，点样10μl于测活平板上，以尿激酶标准品为对照。计算纤溶圈的面积，得到纳豆激酶的比活性为12万IU/mg。

实施例三应用本发明制备重组纳豆激酶进行动物实验：

1.重组纳豆激酶对小鼠急性毒性实验。

取健康小鼠40只，雌雄各半，按体重随机分为4组。每组10只，剂间距K＝0.48，分别给小鼠尾静脉注射不同的计量的药物，给药体积0.5ml/20kg体重，观察给药后小鼠反应情况及死亡情况。按BLISS统计方法计算LD50＝8.54mg/kg

2.重组纳豆激酶的药效学研究

(1)重组纳豆激酶静脉注射对大鼠颈动脉栓形成的影响。雄性大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为纳重组豆激酶大计量组6.0mg/kg，中计量组3.0mg/kg，小计量组1.5mg/kg，尿激酶组(UK)10.0IU/kg及生理盐水对照组。用3.5％戊巴比妥钠1ml/kg腹腔麻醉大鼠给药，均为一次性静脉注射给药，给药体积1ml/200g，给药30分钟后分离左颈动脉，采用电流损伤颈动脉内膜法在动脉上放置电极进行电刺激(2mA，7min)，记录自电磁极开始至颈动脉完全堵塞的时间，结果见表1

 表1.重组纳豆激酶对大鼠颈动脉血栓形成的影响(n＝10 X±SD)

        组别    剂量(mg/kg)    颈动脉完全阻塞时间(分)

生理盐水对照                   15.17±2.51

重组纳豆激酶     6.0           26.11±5.53

重组纳豆激酶     3.0           20.54±6.25

重组纳豆激酶     1.5           17.91±3.60

尿激酶           10万IU/kg     27.57±5.39

(2)重组纳豆激酶静脉注射对ADP诱导的小鼠急性肺栓塞的影响。

雄性小鼠60只，随机分为6组，每组10只分别为重组纳豆激酶大剂量组6.0mg/kg，中计量组3.0mg/kg，小计量组1.5mg/kg，尿激酶组(UK)10.0万IU/kg。阿司匹林灌胃给药，给药体积0.8ml/23g，其余各组均灌胃等容积水灌胃2小时后重组纳豆激酶及UK组再静脉注射等溶剂生理盐水，注射30分钟后各鼠尾静脉注射ADP(700mg/ml)0.1ml/10kg体重，10秒注射完毕。观察各组动物的死亡数，结果见表2.(统计学检测采用两组百分率的四格表直接几率计算法)

表2.重组纳豆激酶对ADP所至小鼠急性肺栓塞的影响

组别        剂量(mg/kg) 动物只数 死亡数(只)  死亡率(％)

                         (只)

生理盐水对照              10      10         100

重组纳豆激酶6.0           10      9          90

            3.0

重组纳豆激酶             10          9            90

重组纳豆激酶  1.5        10          10           100

重组纳豆激酶  10万IU/kg  10          9            90

尿激酶        300.0      10          2            20

结果表明，阿司匹林可明显降低由ADP诱导的小鼠急性肺栓塞死亡率，重组纳豆激酶及UK对ADP诱导的小鼠急性肺栓塞的死亡率无明显影响。

(3).重组纳豆激酶对家兔纤维蛋白溶解活性测定的影响

家兔30只，按体重随机分为5组，每组6只，分别为重组纳豆激酶大剂量组2.50mg/kg，中剂量组1.25mg/kg，小剂量组0.50mg/kg，尿激酶组(UK)，10.0万IU/kg及生理盐水对照组。用3.5％戊巴比妥钠1ml/kg耳缘静脉麻醉家兔，分离两侧颈静脉以备取血，耳缘静脉给药，上述各剂量组给药总体积为120ml，实验开始10分钟缓慢推注药物30ml，余下量在5小时内滴注完。检测指标：分别在给药前，给药2小时，3小时，5小时从颈静脉取血，测定凝血时间(毛细管法)，优球蛋白溶解时间(加钙法)，纤维蛋白降解产物(酶连免疫吸附双抗体夹心法)及纤维蛋白原含量(凝固法)。结果为，纳豆激酶及UK静脉滴注对正常的家兔凝血时间无明显影响；纳豆激酶静脉滴注能明显缩短优球蛋白溶解时间，降低纤维蛋白原含量，增加FDP含量，其作用具有明显的量效依赖性，说明纳豆激酶对正常家兔的纤维蛋白溶解活性具有明显的增强作用。在本实验组中纳豆激酶大中剂量组可明显延长大鼠体内血栓形成时间，小剂量组也有延长趋势，大剂量作用与尿激酶作用相当，对优球蛋白溶解时间，FDP含量的影响，大剂量组优于尿激酶组。

Claims (2)

1.一种制备重组纳豆激酶的方法，包括纳豆激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达，工程菌的发酵，表达产物重组纳豆激酶的纯化以及其生物活性的测定，其特征在于：

(1)以枯草杆菌Bacillus subtilis notto Asl.1086菌体总DNA为模板，参考枯草杆菌中编码纳豆激酶EC.3.4.21.62的NAT基因序列设计引物，通过PCR方法直接扩增纳豆激酶基因，纳豆激酶基因克隆进pGEM-T载体后，经序列分析证实，然后与含有cIta857基因，PrPL启动子以及rrnB基因转录终止信号的原核表达载体pBV220质粒组装成高效表达载体pBV-NK；

(2)pBV-NK转化大肠杆菌BL21-DE3，用温度诱导重组纳豆激酶基因的表达，表达产物以包涵体的形式存在于大肠杆菌BL21-DE3中；

(3)通过发酵技术大规模培养大肠杆菌BL21-DE3，用温度诱导重组纳豆激酶基因表达，发酵参数为温度28℃-40℃，溶氧量为50％-80％，PH6-8；

(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集破碎后的沉淀，将包涵体变性后，经凝胶过滤纯化包涵体，包涵体复性后，经离子交换法纯化重组纳豆激酶，进行活性测定后，冻干成粉末保存。

2.一种编码重组纳豆激酶的核苷酸序列，其特征在于其是用权利要求1所述的方法生产的，所述序列如下：

 GCG CAA TCT GTT CCT TAT GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG CCG GCT

 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala

CTT CAC TCT CAA GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC

Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

AGC GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA GCA AGC

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser

TTC GTT CCT TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC AGT TCT CAC GGT ACG

Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr

CAT GTC GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT AAT AAC TCA ATC GGT GTT CYG GGC

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Asn Iln Gly Val Leu Gly

GTA GCG CCA AGC GCA TCA TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA

Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly

GTA GCG CCA AGC GCA TCA TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA

Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly

AGC GGC CAA TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC

Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Gln Trp Ala Ile Ser Asn

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT TCT ACA

Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thy Gly Ser Thr

GCG CTG AAA ACA GAT GTT GAT AAA GCG GTT TCC AGC GGT ATC GTC GTT GCT

Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala

GCC GCA GCC GGA AAC GAA GGT TCA TCC GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC

Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly

TAC CTT GCA AAA TAT CCT TCT ACT ATT GCA GTA GGT GCG GAT AAC AGC AGC

Tyr Pro Ala Lys Try Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser Ser

ACC CAA AGA GCT TCA TTC TCC AGC GAT GGT TCT GAG CTT GAT GTA ATG

Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val Met

GCT CCT GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC

Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly

GTC TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA GCA GCA

Ala Tyr Asn Gly Thy Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala

CG  CTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC GCG CAA GTC CGT GAT

Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp

CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA

Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys

GGG TTA ATC AAC GAT CAA GCA GCT GCA CAA TAA

Gly Lue Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln *

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