CN1775947A - 能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒及其制备方法，它是由具有能够表达肿瘤特异凋亡肽基因序列的双质粒pJM17和pACCMV－NT4－P53N－Ant共转染293包装细胞，经过单克隆扩增培养后，再次转染293细胞培养纯化得到的重组腺病毒。它通过重组的腺病毒载体，向肿瘤组织内导入促进肿瘤凋亡的物质——肿瘤凋亡肽，达到治疗肿瘤的目的。

Description

能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒及其制备方法。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，其对人类健康的危害是不言而喻的，全世界的科学家和各国政府都投入了巨大的人力、物力进行了长达数十年的研究，尽管也获得了一些颇具价值的研究成果，但可以说，迄今为止，仍然没有取得突破性进展。手术切除、放疗和化疗仍然是肿瘤治疗的“三大法宝”。曾经认为免疫治疗是第四大法宝，但包括免疫调节、肿瘤特异性单克隆抗体、LAK细胞在内的免疫学干预手段也没有取得预期的效果。

近年来，随着人们对肿瘤生物学和肿瘤发生学的认识逐渐深化，肿瘤细胞的一些生物学特性引起了普遍的关注。众所周知，正常细胞在体内的增殖受到许多因素的制约，包括免疫系统的监视，单核-巨噬细胞系统的吞噬，尤其是细胞自身的凋亡(凋亡是细胞自然死亡的过程，也有人形象地称为细胞的自杀)限制了细胞在体内的无限扩增。单肿瘤细胞能够在体内无限增殖，它似乎具有某种拮抗机制，或某种逃避机制，可以无视这些制约机制。尽管我们对这些逃避机制尚不完全清楚，但利用这些制约机制治疗肿瘤确是一种有效的手段。目前肿瘤的基因治疗研究颇多，其基本原理就是导入制约机制。

20世纪70年代，随着基因操作即DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程。这是当时分子生物学发展的必然结果。基因工程是将基因装配于特定的具有表达必备元件的载体中，在体外通过细胞如原核细胞或真核细胞进行扩增并表达其蛋白质产物。

通过对蛋白质产物分离与纯化，最终获得某一种基因所编码的蛋白质纯品。这是生物高技术在20世纪的重大突破，创造了巨大的经济与社会效益。在此基础上，将基因直接导入人体的基因治疗也应运而生。自Fench Anderson于1989年进行了基因标记物在人体内试验的准备后，于1990年9月进行了第一例应用腺苷脱氨酶基因(ADA)，经反转录病毒导入人自身T淋巴细胞，经扩增后输回患儿体内，获得了成功。患儿5年后体内10％造血细胞ADA基因阳性，除了还需应用部分剂量的ADA蛋白外，其他体征正常。这一成功标志着基因治疗的时代已经开始。

基因治疗为什么具有诱人的前景？它和基因工程有何异同？

1.基因工程是将具有应用价值的基因，即“目的基因”，装配在具有表达所需元件的特定载体中，导入相应的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞，在体外进行扩增。经分离、纯化后，获得其表达的蛋白产物。基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”，装配于能在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。它不需对其表达产物进行分离纯化，因为人体细胞可以完成这一过程。

正由于以上原因，在基因工程中耗资最大的一部分器材与材料及其费用，在基因治疗中可以省却，从而使今后工业化的成本明显降低。

2.基因工程的“目的基因”产物迄今为止限于可分泌的蛋白，如生长因子、多肽了激素、细胞因子、可溶性受体等。对于非分泌性蛋白，如受体、细胞内酶、转录因子、细胞周期调控蛋白、原癌基因及抑癌因子等，由于不能有效的进入细胞而不能应用于基因工程。但基因治疗不受以上限制。几乎所有的细胞基因，只有它具有治疗作用，理论上均可应用基因治疗。因此，基因治疗具有更巨大的潜力。

3.随着蛋白质结构与功能的研究，今后对非分泌性蛋白，通过加上某些肽段或进行某些加工，使其同样能进入细胞。

基因治疗的途径包括下列几种：

1.ex vivo

指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞(或异种细胞)，这种细胞可被称为“基因工程化的细胞”，经体外细胞扩增后，输回人体。这种方法易于操作，由于细胞在扩增过程中，对外源的添加物质经大量稀释并易于清除；同时，人体细胞，尤其是自体细胞，加工后应用于人体自身，一般来说，易于解决安全性问题。但是，这种方法，在工业化方面，除载体系统外不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。

2.in vivo

指将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA。这种方式的导入，无疑有利于大规模工艺化生产。这种方式导入的治疗基因以及其载体必须证明其安全型，而且导入体内之后必须能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。本发明专利技术符合上述标准。

从20世纪80年代到世纪末，基因治疗大体经历了三个阶段：

1.准备期(1980～1989)

自1980年至1989年，这是基因治疗的“禁锢时代”。20世纪80年代初，从学术界到宗教、伦理、法律各界，对基因治疗能否进入临床，存在很大争议。直到1989年，FDA才同意基因治疗先将载体导入作为“基因标记”的临床试验，1990年才批准正式临床试验。这个阶段中，科学家们在临床前研究进行了大量工作，同时也在舆论上做了很多准备。其中，French Anderson与Rosenberg、MichaelBlease等，对基因治疗的问世起了重要的历史作用。

2.狂热期(1990～1995)

自1989年后，基因治疗进入临床试验，到来了医学生物学领域的一片狂热。在短短的数年，有100多个临床方案，经FDA批准进入临床试验。从专业刊物至一般媒体，给人的印象是基因治疗即将成为临床治疗的一种成熟的治疗方法。这里既有科学家本身的盲目乐观，又有企业界参与以后媒体的炒作。一方面在1980～1989年期间，科学家所作的储备，在这时几乎倾囊而出，其中一些还没有成熟到可以取得临床疗效的方案也过早地进入了临床试验，在报道中也有某些不实与夸张之词。这种狂热性也传到了国内。由于一些关键技术没有解决，在临床应用中必然回碰壁。

3.理性期(1996～至今)

1995年美国NIH，主持了对过去几年基因治疗临床试验地初步评估，证明一百几十个方案中确证有疗效的方案仅几个。从而提出了必须对基因治疗中地关键问题组织研究。从而，基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道。必须指出，从1995年以后，基因治疗在研究方面决不是冷却。美国成立了三个研究基因导入系统与载体的研究机构；从1996年至1999年，全世界的基因治疗方案增加了一倍，治疗病人数也增加了一倍。从投资来看，除国家投资外，企业界的热情有增无减，仅1996年一年，企业界的投资等于1990～1995年的总和。目前每年的总投资仍在10亿美元左右。基因治疗的专业杂志从1种增加到3种，美国癌症研究协会还成立了以基因治疗为主的“分子治疗”协会。在研究成果方面，以电脉冲DNA导入为代表的新技术于1999年发表，标志着基因导入系统的中药突破。凡此种种，都说明目前基因治疗研究正在以稳健的步伐跨入21世纪。

肽治疗学的发展及存在的问题

肽是几个或几十个氨基酸，通过肽键连接形成的有机分子，可以认为肽是蛋白质的功能亚单位，蛋白质的生物活性是由组成蛋白质分子的所有肽分子共同实现的。同一蛋白质分子中不同的肽链具有不同的功能。作为生物治疗药物，蛋白质的应用历史悠久，应用范围也极为广泛，但随着科学研究的进步，人们逐渐发现，组成蛋白质分子的某些肽分子，可以代表该蛋白质的全部治疗效应，例如胸腺5肽只是胸腺素复杂结构中的一小段，但它在体内可表达胸腺素的免疫调节功能。因此，寻找具有生物学活性的肽已经成为生物治疗学研究的热门课题之一。

生物活性肽具有分子量小，结构简单和功能专一的特点，在预防、诊断和治疗疾病中具有重要使用价值并已经用于临床，如目前使用的免疫调节剂胸腺5肽(商品名日达先)、抗爱滋病毒的T-20肽、肿瘤凋亡肽和神经营养肽等，并显示了明确的治疗效果。

但是由于目前主要是合成方法制备各种肽，产量是毫克级的，难达到工业化生产水平；且合成肽的生产成本很高；人体的循环血和细胞内存在大量的肽水解酶，当肽注射到体内常常被迅速降解，体内半衰期缩短，临床要求每日多次的注射生物肽来治疗疾病，则又增加其治疗费用。上述种种原因，限制了肽作为治疗药物在临床的广泛应用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒制剂及其制备方法和应用，它通过重组的腺病毒载体，向肿瘤组织内导入促进肿瘤凋亡的物质——肿瘤凋亡肽，达到治疗肿瘤的目的。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明一种能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，它是由具有能够表达肿瘤特异凋亡肽基因序列的双质粒pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant共转染293包装细胞，经过单克隆扩增培养后，再次转染293细胞培养纯化得到的重组腺病毒。

本发明所述基因序列是具有人P53和果蝇Ant膜渗透肽的cDNA序列。

本发明所述cDNA序列是具有依据P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入内肽酶识别序列和Nae I内切酶识别点，3′端加入果蝇膜渗透肽Ant-cDNA内切酶Hind III识别点的正负链cDNA。

本发明所述cDNA序列的表达载体构建是将已经插入了NT4全长的pBV-NT4质粒，使用内切酶删除NT4编码的成熟蛋白编码区，插入P53 N peptide-Ant cDNA，得到的pBV-NT4-P53N-Ant载体。

本发明所述pBV-NT4-P53N-Ant载体是使用EcoR I和BamH I双酶切获得编码-NT4信号肽、引导肽-P53N-Ant cDNA片段，将其插入到pACCMVpLpA载体的EcoR I和BamH I多克隆位点，得到将插入目的基因的腺病毒载体。

本发明所述插入目的基因的腺病毒载体是转化Topo10感受态细胞，得到重组腺病毒载体质粒pACCMV-NT4-P53N-Ant。

本发明的辅助表达载体构建是使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因组总长达40.3kb的pJM17。

本发明的包装是使用磷酸钙方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant双质粒共转染293包装细胞得到原代重组病毒。

本发明所述原代重组病毒是感染293细胞1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的办固体完全培养基继续培养，一周后出现噬斑，使用弯头滴管取出单个噬斑的琼脂，反复冻融噬斑琼脂，加2ml培养基洗脱病毒，使用洗脱的病毒感染293细胞，制备的单克隆重组病毒。

本发明所述单克隆重组病毒是感染293细胞后2小时吸出含病毒液体，PBS洗细胞两次，加入完全培养基在5％CO2、37℃继续培养72小时，收获细胞。

本发明所述收获细胞是用PBS洗涤两次，-20℃冰箱冷冻，37℃溶解，冻融三次3000rpm 4℃离心20分钟收集上清。加入0.5体积的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分钟，摇床过夜。4℃20000orpm离心10分钟收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液顶端，水平超速离心360000g，4℃2小时，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等渗Nacl溶液中，将溶液通过sephadex柱床层析，收集260nm吸收峰各管，合并后过膜除菌，得到纯化后的重组病毒。

本发明还提供了一种所述能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的制备方法，它包括下列步骤：

1.细胞库

包装细胞为转导了腺病毒包装蛋白的人胚肾细胞，购置的细胞经过复苏后，增殖两代，经过FLC鉴定和形态学观察，证实为人源二倍体细胞后，液氮冻存20支，为原始细胞库；

1.1种子细胞库

由液氮储存容器保存，每两个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前；

1.2主细胞库

种子细胞库经复苏、扩增后经过上述同种方法进行监测，作为主细胞库，由液氮储存容器保存，每个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前；

1.3工作细胞库

从主细胞库最早复苏的细胞，传代次数依据生产任务而定，且要留有继续传代的细胞的量，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，用至60代后，停止使用；

2.病毒库

2.1种子病毒的制备与筛查

2.1.1目的基因的来源及表达盒构建

目的肽序列：根据GenBank数据库资料，查到人P53和果蝇Ant膜渗透肽的cDNA序列和编码蛋白质序列；

治疗基因的肽序列：依据P53的氨基端12-26aa肽序列

目的基因结构及表达盒构建：依据P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入内肽酶识别序列和Nae I内切酶识别点，3′端加入果蝇膜渗透肽Ant-cDNA内切酶Hind III识别点的正负链cDNA，变性和复性，将合成的cDNA插入到pGEM T载体，酶切图谱鉴定和DNA测序证实其正确性；

2.1.2表达载体构建

(1)将已经插入了NT4全长的pBV-NT4质粒，使用内切酶删除NT4编码的成熟蛋白编码区，插入P53 N peptide-Ant cDNA，构建了pBV-NT4-P53N-Ant载体经酶切图谱检测证实；

(2)使用EcoR I和BamH I双酶切pBV-NT4-P53N-Ant载体获得编码-NT4信号肽、引导肽-P53N-Ant cDNA片段，将其插入到pACCMVpLpA载体的EcoR I和BamH I多克隆位点，

(3)将插入目的基因的腺病毒载体转化Topo10感受态细胞，大量增殖转化菌，碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒，紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态，-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定，大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为表达载体的种子菌和种子质粒；

(4)辅助包装质粒

使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因组总长达40.3kb的pJM17质粒，因为它超过了腺病毒包装容量不能未经重组包装腺病毒，质粒转化的Dh5α宿主菌在LB培养基中扩增，常规在含有抗菌素的固体培养基上划线分离单一菌落，小量扩增后分离质粒，Hind III内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的转化菌，大量培养扩增，碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒，紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态，-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定，大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为包装病毒用辅助质粒；

(5)包装重组病毒

①工作细胞库的293细胞从主细胞库分离获取，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基内5％CO₂、温度37℃条件下贴壁培养，当细胞达到80％成片时用于病毒包装；②使用磷酸钙方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant双质粒共转染293包装细胞，常规方法观察噬菌斑和细胞病变，收获转染细胞，PBS洗涤两次，离心收集沉淀，置-20℃反复冻融3次，3000rpm离心20分钟收集上清，加入含10％甘油的病毒保护液2ml为原代重组病毒；

③重组病毒克隆的分离和扩增

a.滴定重组病毒滴度：将原代病毒或被检测的重组病毒液，用培养基做指数倍的系列稀释，10^-1至10^-10，接种各种浓度病毒到293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的半固体完全培养基继续培养，一周后计数噬斑数，噬斑数×稀释倍数＝病毒滴度

b.分离单克隆重组病毒：根据病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染剂量感染293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的办固体完全培养基继续培养，一周后出现噬斑，使用弯头滴管取出单个噬斑的琼脂，反复冻融噬斑琼脂，加2ml培养基洗脱病毒，使用洗脱的病毒感染293细胞，制备单克隆重组病毒。

2.2建立原始病毒库

单克隆重组病毒毒液冷冻干成粉，每次分装40支，0.1ml/支，每10代冻存一次，作为原始病毒库，每2个月复苏一次，检测病毒的增殖能力、感染能力、遗传稳定性；

2.3建立主病毒库

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主293细胞后，复制出来的病毒，记录代数，监测增殖能力、感染能力、遗传稳定性等参数；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主293细胞后，收获病毒，置于甘油保护液中-20℃保存，每周传代一次；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

2.4建立工作病毒库

主病毒库病毒经过鉴定合格后，冻存存档，供给工作病毒库，工作病毒库感染293细胞，扩增病毒，提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

3.重组病毒的生产和纯化

3.1重组病毒的生产

80％成片的293细胞，10MOI剂量接种工作病毒，感染后2小时吸出含病毒液体，PBS洗细胞两次，加入完全培养基在5％CO2、37℃继续培养72小时，收获细胞。

3.2重组病毒的纯化

收获的细胞用PBS洗涤两次，-20℃冰箱冷冻，37℃溶解，冻融三次3000rpm 4℃离心20分钟收集上清。加入0.5体积的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分钟，摇床过夜。4℃20000orpm离心10分钟收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液顶端，水平超速离心360000g，4℃2小时，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等渗Nacl溶液中，在将溶液通过sephadex柱床层析，收集260nm吸收峰各管，合并后过膜除菌。

本发明纯化后的重组病毒用于肿瘤的治疗，包括脑胶质瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和各种白血病。

本发明是以注射剂形式用于肿瘤治疗。

本发明所述注射剂为注射液或注射用无菌粉末。

本发明的意义在于：

1.本发明使用了信号肽和引导肽，同表达肽cDNA同框架(ORF)连接时设计了自身编码了信号肽酶识别点。因此当将该表达盒插入表达载体转导哺乳动物和人类细胞时，宿主细胞的内肽酶可以正确切割重组蛋白，在分泌出胞时获得了表达肽即肿瘤特异凋亡肽。使转导的肿瘤细胞凋亡，达到治疗肿瘤的目的。

本发明的作用特点为：

由于表达的嵌合肽对正常二倍体细胞没有凋亡作用，转导的正常细胞，尤其是肿瘤的间质细胞可以持续的表达嵌合肽，而且这种表达产物可以分泌到细胞间隙，通过嵌合肽的膜渗透机理，以非受体依赖和非能量依赖方式进入未转导病毒肿瘤细胞，起到持续连续杀伤肿瘤作用。由于本发明对肿瘤的凋亡作用具有特异性，不损害正常细胞的生存和增殖，因此不损害骨髓造血器官和其它器官的生理机能，无化学抗癌药和其它泛性细胞自杀基因的毒负作用，安全性好。由于本发明对正常细胞的无害性，确保了非肿瘤细胞转导之后可以长期表达肿瘤特异凋亡嵌合肽，弥补了肿瘤基因治疗过程中，无法实现所有的肿瘤细胞全部转导了治疗基因的不足。嵌合肽的分泌表达和嵌合肽的膜渗透功能及其核定位精密设计，确保了治疗基因杀伤肿瘤的有效性。因此本发明实现了肿瘤基因治疗中的安全性和有效性的双突破。它的治疗原理其一是通过重组腺病毒转导肿瘤细胞，使其表达肿瘤细胞特异凋亡肽，使其迅速死亡的直接杀伤肿瘤作用。另外是重组病毒转导非肿瘤细胞，使其持续分泌表达使肿瘤特异凋亡的嵌合肽，该肽具有膜渗透功能可以有效进入肿瘤细胞核，使肿瘤细胞凋亡且不定位到正常二倍体细胞核内，不使正常细胞凋亡，起到间接持续杀伤肿瘤作用。本品治疗作用是直接和间接杀伤肿瘤作用之和又保证了对正常细胞的无害性，实现了肿瘤基因治疗的新突破。

本发明解决了生物活性肽的临床应用难题，减少了肽的化学合成程序和一日多次给药等缺陷，减低了肽类物质作为预防、治疗疾病的生产成本和使用成本。

附图说明

图1为本发明所述cDNA变性和复性后的编码结构。

其中：

1为内肽酶切点；2为Nae I切点；3为Hind III切点；

4为P53氨基肽cDNA编码；       5为渗透肽cDNA编码

具体实施方式

下面以实施例进一步解释本发明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。

实施例1能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的制备

1.细胞库

包装细胞为转导了腺病毒包装蛋白的人胚肾细胞(购自于美国ATCC)，购置的细胞经过复苏后，增殖两代，经过FLC鉴定和形态学观察，证实为人源二倍体细胞后，液氮冻存20支，为原始细胞库(原始种子细胞库)，标记冻存时间，代数等参数。

1.1种子细胞库

由专用的液氮储存容器保存，专人专门负责。每两个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，标记冻存时间，代数等参数。每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定。以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前。

1.2主细胞库

种子细胞库经复苏、扩增后经过上述同种方法进行监测，作为主细胞库。由专用的液氮储存容器保存，专人专门负责。每个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，标记冻存时间，代数等参数。每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定。以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前。

1.3工作细胞库

从主细胞库最早复苏的细胞。传代次数依据生产任务而定，且要留有继续传代的细胞的量。每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定。一般用至60代后，集停止使用。

2.病毒库

2.1种子病毒的制备与筛查

2.1.1目的基因的来源及表达盒构建

目的肽序列：根据GenBank数据库资料，查到人P53和果蝇Ant膜渗透肽的cDNA序列和编码蛋白质序列。

治疗基因的肽序列：依据P53的氨基端12-26aa肽序列

目的基因结构及表达盒构建：依据P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入内肽酶识别序列和Nae I内切酶识别点，3′端加入果蝇膜渗透肽Ant-cDNA内切酶Hind III识别点的正负链cDNA，变性和复性后将合成的cDNA插入到pGEM T载体，酶切图谱鉴定和DNA测序证实其正确性。

2.1.2表达载体构建

(1)将已经插入了NT4全长的pBV-NT4质粒(本室自己克隆构建，测序证实)，使用内切酶删除NT4编码的成熟蛋白编码区，插入P53 N peptide-Ant cDNA，构建了pBV-NT4-P53N-Ant载体经酶切图谱检测证实。

(2)使用EcoR I和BamH I双酶切pBV-NT4-P53N-Ant载体获得编码-NT4信号肽、引导肽-P53N-Ant cDNA片段，将其插入到pACCMVpLpA载体的EcoR I和BamH I多克隆位点，pACCMVpLpA载体由加拿大Microbix生物公司提供。

(3)将插入目的基因的腺病毒载体转化Topo10感受态细胞(美国Invtrogen公司购买)。大量增殖转化菌，碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒。紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态。-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定。大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为表达载体的种子菌和种子质粒。

(4)辅助包装质粒

使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因组总长达40.3kb的pJM17质粒(因为它超过了腺病毒包装容量不能未经重组包装腺病毒)，购于Microbix公司。质粒转化的Dh5α宿主菌在LB培养基中扩增，常规在含有抗菌素的固体培养基上划线分离单一菌落，小量扩增后分离质粒，Hind III内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的转化菌，大量培养扩增。碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒。紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态。-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定。大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为包装病毒用辅助质粒。

(5)包装重组病毒

①工作细胞库的293细胞从主细胞库分离获取，记录代数和分离时间。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基内5％CO2、温度37℃条件下贴壁培养，当细胞达到80％成片时用于病毒包装。

②使用磷酸钙方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant双质粒共转染293包装细胞，常规方法观察噬菌斑和细胞病变。收获转染细胞，PBS洗涤两次，离心收集沉淀，置-20℃反复冻融3次，3000rpm离心20分钟收集上清。加入含10％甘油的病毒保护液2ml为原代重组病毒。

③重组病毒克隆的分离和扩增

a.滴定重组病毒滴度：将原代病毒或被检测的重组病毒液，用培养基做指数倍的系列稀释，10-1至10-10，接种各种浓度病毒到293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的半固体完全培养基继续培养，一周后计数噬斑数。

噬斑数×稀释倍数＝病毒滴度

b.分离单克隆重组病毒：根据病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染剂量感染293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的办固体完全培养基继续培养，一周后出现噬斑，使用弯头滴管取出单个噬斑的琼脂，反复冻融噬斑琼脂，加2ml培养基洗脱病毒，使用洗脱的病毒感染293细胞，制备单克隆重组病毒。

2.2建立原始病毒库

单克隆重组病毒毒液冷冻干成粉，每次分装40支，0.1ml/支。每10代冻存一次。作为原始病毒库。每2个月复苏一次，检测病毒的增殖能力、感染能力、遗传稳定性。

2.3建立主病毒库

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主(293)细胞后，复制出来的病毒，记录代数，监测增殖能力、感染能力、遗传稳定性等参数；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例。

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主(293)细胞后，收获病毒，置于甘油保护液中-20℃保存。每周传代一次，记录代数，监测增殖能力、感染能力、遗传稳定性等参数；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例。

2.4建立工作病毒库

主病毒库病毒经过鉴定合格后，冻存存档，供给工作病毒库。工作病毒库感染293细胞，扩增病毒，记录代数，监测增殖能力、感染能力、遗传稳定性等参数；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例。用于药物生产。

3.重组病毒的生产和纯化

3.1重组病毒的生产

80％成片的293细胞，10MOI剂量接种工作病毒，感染后2小时吸出含病毒液体，PBS洗细胞两次，加入完全培养基在5％CO2、37℃继续培养72小时，收获细胞。

3.2重组病毒的纯化

收获的细胞用PBS洗涤两次，-20℃冰箱冷冻，37℃溶解，冻融三次3000rpm 4℃离心20分钟收集上清。加入0.5体积的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分钟，摇床过夜。4℃20000orpm离心10分钟收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液顶端，水平超速离心360000g，4℃2小时，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等渗Nacl溶液中，在将溶液通过sephadex柱床层析，收集260nm吸收峰各管，合并后过膜除菌。

实施例2重组病毒注射剂的制备成型

重组病毒注射液的制备成型

将纯化后的重组病毒稀释到含有2％甘露醇的0.85％Nacl溶液中，使其终浓度为2×10⁸pfu，灌装得到重组病毒注射液。

实施例3重组病毒注射剂的制备成型

重组病毒无菌粉末的制备成型

将纯化后的重组病毒稀释到含有2％甘露醇的0.85％Nacl溶液中，使其终浓度为2×10⁸pfu，灌装经冷冻干燥得到重组病毒无菌粉末。

临床应用剂型及规格

1.注射液(10^-10～10¹⁰ml/规格)

2.注射用无菌粉末(10^-10～10¹⁰mg/规格)

临床给药途径

1.皮下注射

2.皮内注射

3.肌肉注射

4.静脉注射

5.静脉滴注

6.肿瘤体内注射

7.血管插管等

临床应用范围：

1.脑胶质瘤

2.肝癌

3.肺癌

4.乳腺癌

5.前列腺癌

6.各种白血病等。

使用能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒制剂转导二倍体细胞，人胚肾293细胞，原代分离的血管内皮细胞和NIH 3T3小鼠成纤维细胞，不影响细胞的生长和传代，不出现细胞凋亡和形态学异常。

实施例4

使用能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒制剂转染肿瘤细胞，包括小鼠肝癌细胞H22、人肝癌细胞HpaG2、宫颈癌细胞Hela，24小时后出现了明显的细胞病变，48小时后脱壁死亡。

实施例5

使用能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒制剂转染的正常二倍体细胞培养物，移植到肿瘤细胞中见到了同重组病毒相同的杀伤作用，而且不影响正常细胞生长和增殖。使用细胞形态学观察、流式细胞的IP染色和细胞LDH释放实验证实了本品的特异杀伤肿瘤作用。

实施例6

使用小鼠H22肝癌细胞系和Waker256乳腺癌肉瘤细胞系，建立ICR小鼠皮下种植瘤动物模型。当肿瘤结节的最大直径达到10mm时，多点瘤体注射使用能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒制剂一次，2天后病理检查发现肿瘤注射区出现中心性坏死和出血，注射GFP和对照病毒动物的瘤区无此现象，仅注射表达GFP的病毒的瘤组织显示GFP荧光。注射治疗病毒后7天，7/22小鼠肿瘤结节消退，小鼠生活如常已经达治疗后8周。另11只肿瘤生长缓慢或不在生长，4只死亡。16只对照小鼠，种植瘤直径已经达到20mm以上，两只出现颈部淋巴结转移和另两只出现腹腔转移和癌性腹水，在注射对照药物六周内14死亡。

                                      序列表

抗肿瘤肽氨基酸DNA序列

File：NT4P53N.TXT

Range：1-339 Mode：Normal

Codon Table：Universal

Molecular Weight：12634.2

             9          18          27          36          45          54

5’ATG CTC CCT CTC CCC TCA TGC TCC CTC CCC ATC CTC CTC CTT TTC CTC CTC CCC

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro

            63          72          81          90          99         108

   AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC TCA ACA TTG CCC CCT TTT CTG GCC

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala

           117         126         135         144         153         162

   CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CCC CGA GTA GTC CTG TCT AGG GGT GCC CCT GCT

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala

           171         180         189         198         207         216

   GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT GGG GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGT

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly

           225         234         243         252         261         270

   GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT CCC CCT CTG AGT CAG GAA ACA TTT TCA GAC

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp

           279         288         297         306         315         324

   CTA TGG AAA CTA CTT GAG CGC CAG ATA AAG ATT TGG TTC CAG AAT CGG CGC ATG

   --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

   Leu Trp Lys Leu Leu Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met

           333

   AAG TGG AAG AAG TGA 3’

   --- --- --- --- ---

   Lys Trp Lys Lys ***

Claims (15)

1、一种能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：它是由具有能够表达肿瘤特异凋亡肽基因序列的双质粒pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant共转染293包装细胞，经过单克隆扩增培养后，再次转染293细胞培养纯化得到的重组腺病毒。

2、根据权利要求1所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述基因序列是具有人P53和果蝇Ant膜渗透肽的cDNA序列。

3、根据权利要求2所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述cDNA序列是具有依据P53的氨基端12-26aa肽序列，在5`端加入内肽酶识别序列和Nae I内切酶识别点，3`端加入果蝇膜渗透肽Ant-cDNA内切酶Hind III识别点的正负链cDNA。

4、根据权利要求3所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述cDNA序列的表达载体构建是将已经插入了NT4全长的pBV-NT4质粒，使用内切酶删除NT4编码的成熟蛋白编码区，插入P53 N peptide-Ant cDNA，得到的pBV-NT4-P53N-Ant载体。

5、根据权利要求4所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述pBV-NT4-P53N-Ant载体是使用EcoR I和BamH I双酶切获得编码-NT4信号肽、引导肽-P53N-Ant cDNA片段，将其插入到pACCMVpLpA载体的EcoR I和BamH I多克隆位点，得到将插入目的基因的腺病毒载体。

6、根据权利要求5所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述插入目的基因的腺病毒载体是转化Topo10感受态细胞，得到重组腺病毒载体质粒pACCMV-NT4-P53N-Ant。

7、根据权利要求1所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：它的辅助表达载体构建是使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因组总长达40.3kb的pJM17。

8、根据权利要求1所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：它的包装是使用磷酸钙方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant双质粒共转染293包装细胞得到原代重组病毒。

9、根据权利要求8所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述原代重组病毒是感染293细胞1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的办固体完全培养基继续培养，一周后出现噬斑，使用弯头滴管取出单个噬斑的琼脂，反复冻融噬斑琼脂，加2ml培养基洗脱病毒，使用洗脱的病毒感染293细胞，制备的单克隆重组病毒。

10、根据权利要求9所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述单克隆重组病毒是感染293细胞后2小时吸出含病毒液体，PBS洗细胞两次，加入完全培养基在5％CO2、37℃继续培养72小时，收获细胞。

11、根据权利要求10所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒，其特征在于：所述收获细胞是用PBS洗涤两次，-20℃冰箱冷冻，37℃溶解，冻融三次3000rpm 4℃离心20分钟收集上清。加入0.5体积的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分钟，摇床过夜。4℃20000orpm离心10分钟收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液顶端，水平超速离心360000g，4℃2小时，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等渗Nacl溶液中，将溶液通过sephadex柱床层析，收集260nm吸收峰各管，合并后过膜除菌，得到纯化后的重组病毒。

12、一种如权利要求1-11所述能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的制备方法，其特征在于它包括下列步骤：

1.细胞库

包装细胞为转导了腺病毒包装蛋白的人胚肾细胞，购置的细胞经过复苏后，增殖两代，经过FLC鉴定和形态学观察，证实为人源二倍体细胞后，液氮冻存20支，为原始细胞库；

1.1种子细胞库

由液氮储存容器保存，每两个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前；

1.2主细胞库

种子细胞库经复苏、扩增后经过上述同种方法进行监测，作为主细胞库，由液氮储存容器保存，每个月复苏一支，再行增殖2代，冻存10支，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，以此类推，主细胞库传代至50代，终止使用，再次重新购置，鉴定方法及监测方法同前；

1.3工作细胞库

从主细胞库最早复苏的细胞，传代次数依据生产任务而定，且要留有继续传代的细胞的量，每隔10代，要经过FLC、形态学观察和增值能力鉴定，用至60代后，停止使用；

2.病毒库

2.1种子病毒的制备与筛查

2.1.1目的基因的来源及表达盒构建

目的肽序列：根据GenBank数据库资料，查到人P53和果蝇Ant膜渗透肽的cDNA序列和编码蛋白质序列；

治疗基因的肽序列：依据P53的氨基端12-26aa肽序列

目的基因结构及表达盒构建：依据P53的氨基端12-26aa肽序列，在5`端加入内肽酶识别序列和Nae I内切酶识别点，3`端加入果蝇膜渗透肽Ant-cDNA内切酶Hind III识别点的正负链cDNA，变性和复性，将合成的cDNA插入到pGEM T载体，酶切图谱鉴定和DNA测序证实其正确性；

2.1.2表达载体构建

(1)将已经插入了NT4全长的pBV-NT4质粒，使用内切酶删除NT4编码的成熟蛋白编码区，插入P53 N peptide-Ant cDNA，构建了pBV-NT4-P53N-Ant载体经酶切图谱检测证实；

(2)使用EcoR I和BamH I双酶切pBV-NT4-P53N-Ant载体获得编码-NT4信号肽、引导肽-P53N-Ant cDNA片段，将其插入到pACCMVpLpA载体的EcoR I和BamH I多克隆位点，

(3)将插入目的基因的腺病毒载体转化Topo10感受态细胞，大量增殖转化菌，碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒，紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态，-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定，大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为表达载体的种子菌和种子质粒；

(4)辅助包装质粒

使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因组总长达40.3kb的pJM17质粒，因为它超过了腺病毒包装容量不能未经重组包装腺病毒，质粒转化的Dh5α宿主菌在LB培养基中扩增，常规在含有抗菌素的固体培养基上划线分离单一菌落，小量扩增后分离质粒，Hind III内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的转化菌，大量培养扩增，碱裂解方法提取质粒，sephadex G50柱层析纯化质粒，紫外分光度计280/260测定DNA纯度，酶切图谱鉴定重组状态，-20℃条件下LB/甘油溶液中保存转化菌，每两周传代一次，小提质粒，酶切鉴定，大提的重组质粒，无菌条件下冷冻干燥，-20℃冰箱保存，每6个月制备一次，酶切图谱鉴定，为包装病毒用辅助质粒；

(5)包装重组病毒

①工作细胞库的293细胞从主细胞库分离获取，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基内5％CO₂、温度37℃条件下贴壁培养，当细胞达到80％成片时用于病毒包装；

②使用磷酸钙方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant双质粒共转染293包装细胞，常规方法观察噬菌斑和细胞病变，收获转染细胞，PBS洗涤两次，离心收集沉淀，置-20℃反复冻融3次，3000rpm离心20分钟收集上清，加入含10％甘油的病毒保护液2ml为原代重组病毒；

③重组病毒克隆的分离和扩增

a.滴定重组病毒滴度：将原代病毒或被检测的重组病毒液，用培养基做指数倍的系列稀释，10^-1至10^-10，接种各种浓度病毒到293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的半固体完全培养基继续培养，一周后计数噬斑数，噬斑数×稀释倍数＝病毒滴度

b.分离单克隆重组病毒：根据病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染剂量感染293细胞，感染1小时后，吸出病毒液体，PBS洗细胞两次，换含有1.3％细胞琼脂的办固体完全培养基继续培养，一周后出现噬斑，使用弯头滴管取出单个噬斑的琼脂，反复冻融噬斑琼脂，加2ml培养基洗脱病毒，使用洗脱的病毒感染293细胞，制备单克隆重组病毒。

2.2建立原始病毒库

单克隆重组病毒毒液冷冻干成粉，每次分装40支，0.1ml/支，每10代冻存一次，作为原始病毒库，每2个月复苏一次，检测病毒的增殖能力、感染能力、遗传稳定性；

2.3建立主病毒库

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主293细胞后，复制出来的病毒，记录代数，监测增殖能力、感染能力、遗传稳定性等参数；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

从原始病毒库复苏病毒，感染宿主293细胞后，收获病毒，置于甘油保护液中-20℃保存，每周传代一次；提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

2.4建立工作病毒库

主病毒库病毒经过鉴定合格后，冻存存档，供给工作病毒库，工作病毒库感染293细胞，扩增病毒，提取病毒DNA，PCR特异扩增目的基因，检测野生毒株比例；

3.重组病毒的生产和纯化

3.1重组病毒的生产

80％成片的293细胞，10MOI剂量接种工作病毒，感染后2小时吸出含病毒液体，PBS洗细胞两次，加入完全培养基在5％CO2、37℃继续培养72小时，收获细胞。

3.2重组病毒的纯化

收获的细胞用PBS洗涤两次，-20℃冰箱冷冻，37℃溶解，冻融三次3000rpm 4℃离心20分钟收集上清。加入0.5体积的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分钟，摇床过夜。4℃20000orpm离心10分钟收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液顶端，水平超速离心360000g，4℃2小时，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等渗Nacl溶液中，在将溶液通过sephadex柱床层析，收集260nm吸收峰各管，合并后过膜除菌。

13、根据权利要求11所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的应用，其特征在于：纯化后的重组病毒用于肿瘤的治疗，包括脑胶质瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和各种白血病。

14、根据权利要求13所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的应用，其特征在于：它是以注射剂形式用于肿瘤治疗。

15、根据权利要求14所述的能够表达肿瘤特异凋亡肽的重组腺病毒的应用，其特征在于：所述注射剂为注射液或注射用无菌粉末。

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