CN1891829A

CN1891829A - α(1,3)半乳糖转移酶重组载体、病毒体及其制备和应用

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Publication number: CN1891829A
Application number: CN 200510080551
Authority: CN
Inventors: 严泉剑
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2005-07-05
Publication date: 2007-01-10

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种α(1，3)半乳糖转移酶重组载体，特征是该重组体的基因表达盒是由启动子－包含α(1，3)半乳糖转移酶基因cDNA－多聚嘌呤核苷酸构成的特征序列，能够高效感染人的各种靶细胞，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起靶细胞表面大量表达半乳糖表位，激发免疫排斥反应，达到清除靶细胞的目的。制备方法主要应用基因克隆，纯化，重组，表达等基因工程和细胞工程技术。这种载体可以用于肿瘤、疣、胬肉等新生物的基因治疗或/和免疫治疗，以及用于肿瘤、疣、胬肉等新生物细胞进行免疫修饰，制成疫苗进行预防。

Description

α(1，3)半乳糖转移酶重组载体、病毒体及其制备和应用

技术领域本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种α(1，3)半乳糖转移酶重组载体，特征是该重组体的基因表达盒是由启动子-包含α(1，3)半乳糖转移酶基因cDNA-多聚嘌呤核苷酸构成的特征序列，能够高效感染人的各种靶细胞，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起靶细胞表面大量表达半乳糖表位，激发免疫排斥反应，达到清除靶细胞的目的。制备方法主要应用基因克隆，纯化，重组，表达等基因工程和细胞工程技术。这种载体可以用于肿瘤、疣、胬肉等新生物的基因治疗或/和免疫治疗，以及用于肿瘤、疣、胬肉等新生物细胞进行免疫修饰，制成疫苗进行预防。

背景技术随着分子生物学技术的进步，特别是基因工程和细胞工程技术的发展，恶性肿瘤的基因治疗成为人们研究的热点。目前，全球共有600多项基因治疗方案获准进入临床实验，有些治疗方案已获得一定疗效，初步显示了基因治疗的前景。作为可用于基因治疗的各种载体，本身不具有任何治疗疾病的意义，无临床应用价值；而作为可用于各种治疗目的基因，由于直接导入靶细胞及其在靶细胞内直接表达的有一定难度，只具有潜在的治疗作用，没有实际的临床价值。只有将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体结合，通过后者介导，将目的基因导入靶细胞并表达，才能达到真正的临床治疗效果。因此，构建治疗基因与基因载体的融合序列是实现基因治疗的关键。将目的基因的表达盒与载体进行融合常用的方法是在真核细胞中进行同源重组，过程复杂，费时费力，而使用在原核细胞(大肠杆菌)中实现同源重组、构建融合表达载体的基因工程技术则可有效解决上述问题。

缺乏特异性，靶向性及高效性的基因转移载体一直是肿瘤基因治疗的一个难题，目前，用于基因治疗的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒载体有腺病毒载体，腺相关病毒载体和逆转录病毒载体等。腺病毒载体是常用的基因载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片断、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，即能感染分裂期细胞，也能感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点。也有不足之处，一是感染缺乏特异性，二是具有免疫原性。因此，对腺病毒载体进行存利去弊的改进是发展基因治疗的必由之路。研究表明，腺病毒载体E1或E3缺失区携带外源性基因可实现目的基因的较长时间的表达，且可降低其免疫源性，逆转录病毒载体能携带外源基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因稳定持久的表达，但逆转录病毒体外繁殖滴度低、转染效率低，只感染分裂期细胞，在染色体里是随机整合；其他可用于基因转移的病毒载体和非病毒载体均存在不同的利弊。

大量证据提示人体内存在预先形成的抗体，即天然抗体(NAb)，是种间移植存在超急排斥现象(HAR)的基础。HAR中的人的天然抗体可以广泛识别猪抗原，但实际上，90％以上人血清内的补体依赖性排异反应天然抗体只识别异种(猪)抗原的一个结构，即α(1，3)半乳糖基(gal)，它是异种(猪)抗原的抗原表位(决定簇)，这些抗原都特异性地携带一个α(1，3)半乳糖基抗原表位，α(1，3)半乳糖基的形成，主要由α(1，3)半乳糖转移酶催化，这种酶在低等动物和新世界猴体内表达，人、猿、及旧世界猴体内都缺乏这种酶。由于人体不表达α(1，3)半乳糖转移酶，也不携带α(1，3)半乳糖的抗原表位(决定簇)，因此频繁地与该抗原接触使得体内的天然抗体有很高的效价。人细胞，特别是肿瘤细胞，引入异种(猪)的α(1，3)半乳糖转移酶基因，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起肿瘤细胞表面大量表达半乳糖表位，半乳糖表位引发了人体内的天然抗体对肿瘤细胞产生补体介导的细胞毒作用，进而肿瘤特异性抗原的暴露引发特异性免疫反应，达到治疗或/和预防肿瘤的目的。这种方法充分利用体内存在的天然抗体，是一种简便，经济的基因治疗或/和免疫治疗方案。

发明内容本发明旨在将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体进行有机结合，而提供一种病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因的重组载体，能够在基因工程改造过的特定细胞中繁殖、生产，并可在真核细胞中表达，使肿瘤细胞膜表面产生较多α(1，3)半乳糖基表位。结果令人鼓舞，半乳糖表位引发了人体内的天然抗体对肿瘤细胞产生补体介导的细胞毒作用以及肿瘤特异性抗原的暴露引发的特异性免疫反应，达到了治疗或/和预防肿瘤的目的。本发明的目的还在于提供重组载体的制备方法及其用于制备治疗或/和预防肿瘤药物的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因的重组载体，该重组载体是将由DNA克隆技术构建的病毒载体与α(1，3)半乳糖转移酶基因表达盒相结合，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中表达α(1，3)半乳糖转移酶的融合序列。

具体地说是涉及一种α(1，3)半乳糖转移酶表达载体，特征是能够高效感染人的各种肿瘤细胞，使之表达α(1，3)半乳糖转移酶，引起肿瘤细胞表面大量表达半乳糖表位，激发免疫排斥反应，达到清除肿瘤的目的。制备方法主要应用基因克隆，重组，纯化，表达等基因工程和细胞工程技术。这种载体可以用于肿瘤的基因治疗以及免疫治疗。

该重组载体的载体可以为质粒载体，DNA病毒或PNA病毒载体的任何一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体；最优选载体为腺病毒载体。

本发明提供一株重组5型腺病毒，已于2005年5月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，登记入册编号为：CGMCCNo.1383。

所述α(1，3)半乳糖转移酶基因可以是α(1，3)半乳糖转移酶基因的任一种，最优选的基因为猪α(1，3)半乳糖转移酶基因。

本项发明提供了这种重组载体的制备和应用方法：

一、重组α(1，3)半乳糖转移酶基因重组腺病毒载体和/或重组腺病毒颗粒的制备方法提供了一种用分子生物学中基因克隆，表达，纯化，重组等基因工程和细胞工程技术制备重组载体的方法。该重组载体的载体可以为DNA病毒或PNA病毒的任一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体；最优选载体为腺病毒载体。这种方法在载体中引入α(1，3)半乳糖转移酶基因，组成转染效率高、可操作性强的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因重组腺病毒载体和/或重组腺病毒颗粒。

例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体这样准备：

(a)构建猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒载体在腺病毒载体(pShuttle)序列中，定点引入猪的α(1，3)半乳糖转移酶的cDNA，组成α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒穿梭载体；

(b)将(a)中组成α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒穿梭载体转入原核细胞中筛选，挑取阳性克隆，酶切以及测序确定正确阳性克隆，并进行扩增获取重组载体DNA；

(c)将(b)中扩增的重组载体DNA与同源重组质粒如PBHG共转入包装细胞，产出适量猪的α(1，3)半乳糖转移酶基因的腺病毒体(复制缺陷的病毒颗粒)，该重组腺病毒颗粒组成组合之一是：含有MCMV启动子-Sus scrofa a1，3GT-polyA表达盒。该重组腺病毒为5型腺病毒，其基因组中E1和E3缺失。；

(d)将上述病毒颗粒纯化制备成制剂，如液体剂型、半固体剂型、固体型或气体剂型。

二、重组载体或病毒体的应用方法此项发明提供了应用上述重组病毒体进行肿瘤等新生物治疗或/和预防的方法。本发明的重组载体或病毒体可用于制备成合适的剂型，如液体剂型、半固体剂型、固体型或气体剂型。本发明的重组载体中治疗基因的启动子可以换成人体器官特异性启动子，达到靶向性治疗的目的。本发明的重组载体可用于对肿瘤细胞进行免疫修饰，制成肿瘤疫苗预防肿瘤。

例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体治疗尖锐湿疣这样实施：

(a)猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体制备成质量符合临床试验标准的半固体制剂；然后

(b)尖锐湿疣表面涂敷(a)中半固体制剂，引起尖锐湿疣细胞表面大量表达α(1，3)半乳糖基表位，激发免疫排斥反应，达到清除和/或预防尖锐湿疣的目的。

例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体瘤内注射这样实施：

(a)猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体制备成质量符合临床试验标准的注射液；然后

(b)体表肿瘤瘤体内直接注射(a)中注射液，体内肿瘤用介入方法西向肿瘤瘤体内注射(a)中注射液，引起肿瘤细胞表面大量表达α(1，3)半乳糖基表位，激发免疫排斥反应，达到清除和/或预防肿瘤的目的。

猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体前列腺靶向性改造这样实施：

(a)克隆纯化人的前列腺特异性抗原基因的启动子，调控试验证实有效；然后

(b)正确定向克隆入猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒重组载体，替代原有启动子。

猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体修饰肿瘤细胞疫苗这样制备和应用：

(a)培养扩增肿瘤细胞，用猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体转染修饰；

(b)筛选转染肿瘤细胞阳性克隆或不筛选；

(c)物理或化学方法进有效周期抑制；

(d)制成肿瘤细胞疫苗制剂应用。

具体实施方式

实施例1

例如，猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒在针剂这样制备：

(a)制备猪组织或有核细胞的cDNA文库，根据AF221509.Sus scrofaclone.mRNA序列设计引物，上游引入EcoR I位点，下游引入Sal I酶切位点，扩增猪α(1，3)半乳糖转移酶基因(alpha1，3 galactosyltransferase；a1，3GT)；

(b)将(a)中组成α(1，3)半乳糖转移酶基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒PUC18-a1，3GT。然后用EcoRI+Sal I酶切，回收a1，3GT基因片段，EcoRI+SalI酶切载体质粒pDC316，回收载体骨架片段，构建成功重组质粒PDC316-a1，3GT，测序两个反应测通，拼接以后的序列如下：

TGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGCTCGAAGTCGACTCAGATGTTATTTCTAACCAAATTATACTCTTTTTTCTGCCAAGCTATCTTGACAATCCTAATATCCACAGACATGCCTATATGATAATCCCAGCAGTATTCTGGGGATAAGATTTTAGTGGGTTTGTTGAGAAGGAAATACTTGTTTAGATGGCTTTCATCATGCCACTCGGCTTCTATGTCATTTTCCTTGTCCTGGAGGATTCCCTTGAAGCACTCCTGAGTGATGTTTAGAACCTGAGTGGGTGTTCCCCCAAAAATGGCTGCGTGGTAATAAAAATCCCCCTGGCCAAACGGAATGTAGGCTGCGGACTCCTTCCGCCTCTCGTAGGTGAACTCGTCAGGATGTGCCTTGTACCACCAGGCCTGTAGCTGAGCCACCGACTGGCCCAGGGTCTCCACCCCAAAGTTGTTTTGGAAGACCTGATCCACGTCCATGCAGAAGAGGAAGTCCACCTCGTGCTGGATGTGGGCCAGGATGTGCTCCCCGATGGTCTTCATGCGCATCATGCTGATGTCTTGCCACCTCTTCTCGGACTTGATCTCAAACACTTTAAAGGAACGCAGAGGACCCAGCTCTATCAAAGGCATCCTGGAGATATCATCCACCATGATGTAAAAGATGACTTTGTGGCCAACCATGAAGTATGTATTTGCAGATATTAAGAACTCCTCCAAGTAATGCTCAATGTATCTTCCGACAGCAAAAACCGTCAAGCCCACGGTAATTTTCTGTTTGGCATAATAATTATCTAAGACGGCTCTGTTGTAAGTGCCTTCCCATACCACTGGAGCCTTCCATCTGGTTATGGTCACGACCTCTGGGCGTTTCTCAGGATTAAACCAGTCCACTAGCGGAAGCTCTCCTCTGTTGTCTTCTTTTCTTTGTTCCTTTTCGTTGCCTATAGCGTCTTCTTCTTCGTGGTAACTGTGAGTCCCATTGTTAAACCAGCTCGGAAACCACCAGCCCCTCTGAGCACTGCTGCCAACTTCTGGGTTTTTTGACTGGTATATCCAGAACAAAGAACCTTCTGGGCTGTTGATGTATTCCCAAAACACAACCATTACAGTTGAGACAAGCAGCATTGACAGAACCACTCTTCCTTTGACATTCATGAATTCGATCTGCGTTCTACGGT

上述序列AF221509.Sus scrofa clone.mRNA序列完全一致。

(c)扩增后大提质粒，与大质粒PBHG共转染293细胞，产生重组腺病毒Ad5-a1，3GT，进行三轮单克隆挑选，保证病毒的均一性和稳定性。扩大生产规模，扩大总产量通常在10¹²～10¹³vp(小试，80个125cm²瓶)和10¹⁴～10¹⁵vp(中试，5L发酵罐)左右。两步层析工艺，即阴离子柱层析和凝胶过滤层析，进行腺病毒的纯化，进行如下检测：1)提取Ad5-a1，3GT基因组，经酶切及PCR鉴定含有目的基因a1，3GT片断大小正确，2)病毒颗粒滴度检测，通过OD260的检测或点杂交的方法，推算(VP/ml，v.g./ml)，3)病毒感染滴度，主要有TCID50方法(IU/ml)和空斑计数法(PFU/ml)，4)纯度检测：PHLC和OD260/280比值：经过纯化的腺病毒，该比值应该在1.2～1.4。过高或过低，说明残余的杂蛋白和RNA较多，5)表达检测，适量Ad5-a1，3GT感染人细胞(如人黑色素瘤细胞RPMI8322)，使人类细胞表达人类不具有的αGal1-3βGal1-4βGlcNAc1-R，简称α-Gal，用植物凝集素Griffonia Simplicifolia IB4(GSIB4)isolectin与这种半乳糖高度亲和特性，进行GSIB4-FITC染色验证；

(d)将上述病毒颗粒制备成各种制剂，如注射液，缓冲液采用10mM TrisHCl pH8.0，2mM MgCl2，4％ sucrose，进一步制备成产品，如注射针剂。

实施例2

一个较好的具体实例是，肿瘤瘤体内注射治疗肿瘤，方法如下：

(a)猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体制备成质量合格注射制剂；然后

(b)体表肿瘤瘤体内直接注射，体内肿瘤用介入方法完成肿瘤瘤体内注射，剂量为10-100000vp/cell，优选1000vp/cell，引起肿瘤细胞表面大量表达α(1，3)半乳糖基表位，激发免疫排斥反应；

(c)根据情况可重复注射，直至达到病情稳定或清除肿瘤的目的。

实施例3

猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体前列腺癌靶向性改造，方法如下：

(a)从列腺癌中克隆纯化人的前列腺癌特异性抗原基因的启动子，序列如下

cactagagga gcaccttagg aattgacctg tggatctcaa cttcgttagg gttaaaagat60

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(b)正确定向克隆入猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒重组载体，包含上述序列372 to 460，替代原有启动子。

实施例4

猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体修饰肿瘤细胞疫苗制备和应用，方法如下：

(a)培养扩增肿瘤细胞，用猪的重组α(1，3)半乳糖转移酶基因腺病毒体(1000vp/cell)转染；

(b)筛选转染肿瘤细胞阳性克隆或不筛选，物理或化学方法进有效周期抑制，优选gamma射线照射方法；

(c)用缓冲液(10mM Tris HCl pH8.0，2mM MgCl2，4％ sucrose)制成肿瘤细胞疫苗制剂，即用或-80度冻存；

(d)上述肿瘤疫苗制剂应用部位和方法不固定，如果是实体瘤，优先选择肿瘤附近，注射方式可选择皮下，颅内，皮内，静脉内，动脉内等注射方式，优选肌内注射方式。

序列表

<110>泉剑，严

<120>α(1，3)半乳糖转移酶重组载体、病毒体及其制备和应用

<130>

<140>200510080551.4

<141>20050705

<160>2

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>1116

<212>DNA

<213>猪属，驯化猪种(Sus scrofa，domestic pig)

<220>

<221>CDS

<400>1

atgaatgtca aaggaagagt ggttctgtca atgctgcttg tctcaactgt aatggttgtg 60

ttttgggaat acatcaacag cccagaaggt tctttgttct ggatatacca gtcaaaaaac 120

ccagaagttg gcagcagtgc tcagaggggc tggtggtttc cgagctggtt taacaatggg 180

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ttagataatt attatgccaa acagaaaatt accgtgggct tgacggtttt tgctgtcgga 420

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accctgggcc agtcggtggc tcagctacag gcctggtggt acaaggcaca tcctgacgag 780

ttcacctacg agaggcggaa ggagtccgca gcctacattc cgtttggcca gggggatttt 840

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tgctgggatt atcatatagg catgtctgtg gatattagga ttgtcaagat agcttggcag 1080

aaaaaagagt ataatttggt tagaaataac atctga 1116

<210>2

<211>580

<212>CDS

<213>人属，人种(Homo sapiens，human)

<400>2

cactagagga gcaccttagg aattgacctg tggatctcaa cttcgttagg gttaaaagat 60

tatttgttgg gcaagggtag gaccaataac ctcattcaca atgcattcat tgattcgttg 120

attcacagag caaatacttc tgaacaactc ctgtgtttct ggcactgttc taggcaccag 180

tgatatagga gccaacaaga cagacatgtc actgctctca tggagctgca tttcagtgca 240

tggaggcaga aaacaaacaa acaaataaat aaataaataa ataaataaga taatttttaa 300

tagcaacgtg tcaacatagt gtgacgggaa ggagcatgat gagacagaag gaaggtttaa 360

actgggaaat ctgagaaatg gtatggttgt atgtgggttg gcattcttgc atgatgggag 420

tggccacctg ctttcatatt ctgaagtcag agtgttccag acagaagaaa tagcaagtgc 480

cgagaagctg gcatcagaaa aacagagggg agatttgtgt ggctgcagcc gagggagacc 540

aggaagatct gcatggtggg aaggacctga tgatacagag 580

Claims

1.一种重组载体，是载体基因和α(1，3)半乳糖转移酶表达编码区的重组体，通过基因工程和细胞工程方法制备，能够在靶细胞或宿主细胞中表达α(1，3)半乳糖转移酶，用于非特异性肿瘤、疣、胬肉等新生物治疗或器官特异性启动子等指导的靶向性治疗以及用于对肿瘤、疣、胬肉等新生物细胞进行免疫修饰，制成疫苗进行预防。

2.权利要求1所述的载体，其特征是：该重组体的载体可以为质粒载体，DNA病毒或RNA病毒载体的任何一种，其优选载体为腺病毒载体或含有腺病毒载体序列的复合载体；最优选载体为腺病毒载体。

3.权利要求1所述的载体，其特征是：该重组体的基因表达盒是由启动子-包含α(1，3)半乳糖转移酶基因cDNA-多聚嘌呤核苷酸构成的特征序列。

4.权利要求3所述的载体，其特征是：所述基因表达盒的上游为任一真核细胞启动子、原核细胞启动子或病毒启动子，下游为任何真核基因的多聚嘌呤核苷酸。

5.权利要求2所述的载体，其特征是：腺病毒复制的必须基因缺失，引入α(1，3)半乳糖转移酶基因表达框，所述α(1，3)半乳糖转移酶基因可以是α(1，3)半乳糖转移酶基因的任何一种，最优选的基因为猪α(1，3)半乳糖转移酶基因。

6.权利要求2所述的载体，其特征是：腺病毒载体的E1A和E1B区缺失，引入α(1，3)半乳糖转移酶基因表达框。

7.权利要求1所述的载体，其特征是：应用时采用任何合适的可接受的药理学剂型或/和给药方式。

8.挽救野生型α(1，3)半乳糖转移酶功能缺失的细胞的方法是：一定量的权利要求1所述的重组载体通过接触并进入野生型α(1，3)半乳糖转移酶基因缺失的细胞，在细胞中有效表达野生型α(1，3)半乳糖转移酶蛋白来挽救细胞。

9.权利要求8所述的方法，其特征是：α(1，3)半乳糖转移酶功能缺失的细胞是α(1，3)半乳糖转移酶基因缺失的细胞，α(1，3)半乳糖转移酶功能缺失的细胞是人或哺乳动物细胞。

10.一种生产重组腺病毒的方法，包括：(a)将含有表达α(1，3)半乳糖转移酶元件的腺病毒质粒载体用脂质体介导的转染方法导入合适的宿主细胞；并且(b)分析培养的宿主细胞出现的细胞病变效应，监测同源重组的病毒产量。

11.权利要求10所述的方法，其特征是：这种腺病毒质粒具有复制缺限，而宿主细胞能够弥补这种缺陷；这种腺病毒质粒缺失功能性E1A和E1B基因，而宿主细胞是功能性能E1基因表达细胞；这种宿主细胞是293细胞，这种宿主细胞的培养基是MEM培养基。

12.权利要求1所述的载体，用于新生物治疗或制备疫苗预防新生物。