CN116726198B - 一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用 - Google Patents
一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用，该抗肿瘤药物是将AAV病毒基因组ITR之间序列去除后，插入Nfil3基因敲低元件和HBVc‑PEP3基因表达元件，并将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1编码框的第663位氨基酸突变成缬氨酸后作为该病毒的衣壳蛋白。从而增强肿瘤特异性抗原呈递，进而更好的激活肿瘤抗原特异性细胞免疫和体液免疫，达到更好的实体瘤免疫治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用。
背景技术
肿瘤是影响人类健康的一种重大疾病，随着城市化、工业化的加速，发病率在不断升高，造成沉重的社会和家庭负担。恶性肿瘤治疗难度大、易复发，临床上通常采用手术加化疗或者放射疗法，但是副作用大，耐药性等问题依然困扰着肿瘤患者。特别是脑胶质瘤是最常见的神经系统原发性肿瘤，大多数属于恶性，由于胶质瘤组织大多数呈浸润性生长，与周围正常脑组织边界不清楚，手术很难全切，更容易复发。
免疫疗法是近几年出现的一种新的急剧前景的肿瘤治疗手段，PD1/PDL1信号阻断，CAR-T疗法等在临床上针对部分肿瘤已经取得了很大的成功。但是在实体瘤的治疗中，由于多数肿瘤存在很强的免疫抑制微环境，目前的免疫疗法取得的效果并不理想。
发明内容
基于目前肿瘤免疫治疗中存在的问题，本发明的目的是：提供了一种抗肿瘤药物及其在脑胶质瘤治疗中的应用。该抗肿瘤药物为一种高效的肿瘤免疫治疗药物，能够为临床制备治疗脑胶质瘤药物提供了新的有效方法。
本发明的技术方案是：
一种抗肿瘤药物，将腺相关病毒基因组的两个ITR之间的序列去除，在ITR之间插入Nfil3基因敲低元件和HBV核心蛋白编码基因与肿瘤抗原PEP-3编码基因融合形成的HBVc-PEP3基因表达元件，同时将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1编码框第663个氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸作为该病毒的衣壳蛋白。
进一步，所述的腺相关病毒基因组是2型腺相关病毒基因组。
进一步，所述的2型腺相关病毒基因组是2型自互补腺相关病毒基因组。
进一步，所述的2型自互补腺相关病毒基因组是将2型腺相关病毒基因组3‘端ITR缺失碱基序列形成的，缺失的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述的Nfil3基因敲低元件是靶向Nfil3基因的shRNA或者microRNA表达元件。
进一步，所述的shRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的shRNA序列、polIII终止子组成；所述的microRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的microRNA序列、polIII终止子组成。
进一步，所述的polIII启动子是U6启动子、H1启动子中的一种，所述的polIII终止子是5-10个T碱基组成的转录终止子。
进一步，所述的靶向Nfil3基因的shRNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述的靶向Nfil3基因的microRNA序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述的HBVc-PEP3基因表达元件由polII启动子、HBVc-PEP3基因、polII终止子组成，polII启动子是CMV、PGK、EF1a、SV40、Ubc中的一种，polII终止子是SV40pA、bGHpA、TKpA、rGBpA中的一种，HBVc-PEP3基因序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述的抗肿瘤药物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明将肿瘤抗原直接导入肿瘤微环境中的抗原呈递细胞中，同时给与抗原呈递细胞强免疫刺激，促进其促炎因子的分泌，产生强免疫微环境，从而增强肿瘤特异性抗原呈递，进而更好的激活肿瘤抗原特异性细胞免疫和体液免疫，达到更好的实体瘤免疫治疗效果。
由于腺相关病毒（Adeno-associated virus）是基因治疗中广泛应用的一种病毒，其安全性的到普遍认可。腺相关病毒分为很多亚型，每种亚型的病毒具有独特的感染细胞偏好性。通过研究发现，在各种亚型的腺相关病毒中6型腺相关病毒对抗原呈递细胞具有最好的感染效率，将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第663位氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸后对抗原呈递细胞的感染效率进一步提高。因此在本发明中，采用了第663位氨基酸突变后的6型腺病毒衣壳蛋白用来包装病毒从而实现对抗原呈递细胞的高效导入。腺相关病毒在感染靶细胞后需要经过复制形成双链才能开始表达携带的目标基因，而这一步骤限制了病毒感染细胞后表达目标基因的速度。本发明通过将腺相关病毒3‘端ITR缺失一段碱基后可以形成自互补腺相关病毒，加快病毒感染细胞后表达的速度和效率。
Nfil3是与昼夜节律相关的一个生物钟分子，通过研究发现Nfil3以人体很多免疫细胞的功能密切相关，Nfil3敲除的巨噬细胞IL-12表达水平显著升高，Nfil3敲除可以显著增强树突细胞IL-12、TNF-α等促炎因子的表达水平。IL-12对增强肿瘤免疫微环境具有重要的作用，同时IL-12因子还是促进CD4 T细胞向促炎型Th1细胞分化的关键因子。这些结果表明通过降低抗原呈递细胞（如巨噬细胞、树突细胞）中的Nfil3基因表达水平增强肿瘤微环境中的炎症水平。在很多肿瘤中（比如脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌）EGFR受体存在突变，即EGFRVIII突变，这是一种肿瘤特异性的突变，可以作为肿瘤特异性的免疫原。研究表明人工合成的EGFRVIII突变区域的一段小肽，即PEP-3小肽，可以诱导小鼠可以产生肿瘤特异性免疫反应。但是PEP-3小肽自身的免疫原性很低，通过和乙型肝炎病毒HBV核心蛋白（HBVc）融合后用于免疫小鼠可以产生更好的免疫效果。
因此在本发明中，同时在腺相关病毒中携带Nfil3敲低元件和HBVc-PEP3基因表达元件，通过第663位氨基酸突变的6型腺相关病毒衣壳蛋白（AAV6 CapS663V）包裹该病毒基因组，通过瘤内直接注射从而将这些元件高效的导入到肿瘤微环境中的抗原呈递细胞中。从而实现抗原呈递细胞对肿瘤特异性抗原的高效呈递，并产生强免疫微环境，刺激免疫系统产生更强的肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫，达到更强、副作用更小的肿瘤清楚效果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒基因组的结构；
图2是注射scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒对肿瘤生长的影响；
图3是不同组肿瘤微环境中免疫细胞浸润数量的变化；
图4是不同组肿瘤微环境中CD8+ T细胞和CD4+ T细胞数量的变化；
图5是不同组肿瘤微环境中Th1细胞在CD4+ T细胞中的比例；
图6是不同组的肿瘤微环境中骨髓来源细胞分泌促炎因子的水平；
图7是不同组的肿瘤微环境中CD8+ T细胞对肿瘤抗原的特异性免疫反应；
图8是AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒基因组的结构；
图9是注射AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒后对荷瘤小鼠存活率的影响。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
本发明提供了一种抗肿瘤药物，将腺相关病毒基因组的两个ITR之间的序列去除，在ITR之间插入Nfil3基因敲低元件和HBV核心蛋白编码基因与肿瘤抗原PEP-3编码基因融合形成的HBVc-PEP3基因表达元件，同时将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1编码框第663个氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸作为该病毒的衣壳蛋白。
进一步，所述的腺相关病毒基因组是2型腺相关病毒基因组。
进一步，所述的2型腺相关病毒基因组是2型自互补腺相关病毒基因组。
进一步，所述的2型自互补腺相关病毒基因组是将2型腺相关病毒基因组3‘端ITR缺失碱基序列形成的，碱基序列为SEQ ID NO.1，具体如下：
GTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT。
进一步，所述的Nfil3基因敲低元件是靶向Nfil3基因的shRNA或者microRNA表达元件。
进一步，所述的shRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的shRNA序列、polIII终止子；所述的microRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的microRNA序列、polIII终止子组成。
进一步，所述的polIII启动子是U6启动子、H1启动子中的一种，所述的polIII终止子是5-10个T碱基组成的转录终止子。
进一步，所述的靶向Nfil3基因的shRNA序列为SEQ ID NO.2，具体如下：
GCAGGTGACGAACATTCAAGATCAAGAGTCTTGAATGTTCGTCACCTGC；
所述的靶向Nfil3基因的microRNA序列为SEQ ID NO.3，具体如下：
GTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGGCAGGTGACGAACATTCAAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTTGAATGTTCGTCACCTGCTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCAC。
进一步，所述的HBVc-PEP3基因表达元件由polII启动子、HBVc-PEP3基因、polII终止子组成。
进一步，所述的polII启动子是CMV、PGK、EF1a、SV40、Ubc中的一种，所述的polII终止子是SV40pA、bGHpA、TKpA、rGBpA中的一种。
为了获得本发明所述的抗肿瘤药物，申请人从载体家公司购买了2型腺相关病毒质粒pAAV、2型自互补腺相关病毒质粒pscAAV；从GENEMEDI公司购买了腺相关病毒包装辅助质粒pHelper；从Cell Biolabs公司购买了AAV6包装质粒pAAV6 Rep-Cap，通过定点突变将Cap基因VP1编码框第663位氨基酸突变成为缬氨酸。从金斯瑞生物科技公司合成了HBVc-PEP3基因、shNfil3（靶向Nfil3的shRNA）以及microNfil3（靶向Nfil3的microRNA），通过分子克隆手段将各个基因片段以及启动子、终止子依次克隆到腺相关病毒或自互补腺相关病毒质粒中。将携带目的基因的病毒质粒与包装辅助质粒pHelper和pAAV6 Rep-CapS663V共转染HEK293细胞包装病毒，并通过密度梯度离心纯化获得病毒。并通过小鼠模型测试了其在恶性脑胶质瘤治疗中的应用潜力。
以下是给出本发明的具体实施例。
实施例1
以下是以携带shNfil3表达元件和HBVc-PEP3基因表达元件，AAV6 CapS663V衣壳包被的2型自互补腺相关病毒scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3为例的实施例。
1、scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒结构如下
该病毒由病毒基因组和包裹在基因组外部的AAV6 CapS663V衣壳蛋白组成，其中病毒基因组从5’到3’端依次包含以下元件：AAV2 5’ITR、U6-shNfil3-pT表达元件、EFS-HBVc-PEP3-bGHpA表达元件、AAV2 3’ITR-△trs。AAV2 3’ITR-△trs是由AAV2 3’ITR缺失碱基序列形成的，缺失的碱基序列如SEQIDNO.1。附图1显示了scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒基因组的结构。
shNfil3-pT序列为SEQ ID NO.5，具体如下：
CACCGCAGGTGACGAACATTCAAGATCAAGAGTCTTGAATGTTCGTCACCTGCTTTTTT，该序列中包含了SEQ ID NO.2。
shNfil3-pT序列也可以替换为以下序列中的一种:
CACCGCAGGTGACGAACATTCAAGATCAAGAGTCTTGAATGTTCGTCACCTGCTTTTT；
CACCGCAGGTGACGAACATTCAAGATCAAGAGTCTTGAATGTTCGTCACCTGCTTTTTTTTTT。
HBVc-PEP序列为SEQ ID NO.4，具体如下：
ATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTCTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGACCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACGGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTAATGAATCTAGCCACCTGGGTGGGAAGTAATCTGGAGGAAAAGAAAGGTAATTATGTGGTGACAGATCACTTAGTAGTCAGCTATGTCAACGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCATATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAGTGTTAA
其中U6启动子也可以替换为H1启动子，EFS启动子(EF1a short)也可以替换为PGK、EF1a、SV40、Ubc、CMV启动子中的一种，bGHpA终止子也可以是SV40pA、TKpA、rGBpA中的一种。
U6-shNfil3-pT表达元件和EFS-HBVc-PEP3-SV40pA表达元件在病毒基因组中的位置也可以交换。
AAV6S663V定点突变的引物：
S663V mutation for：
AATCCTCCGGCAGAGTTTgtGGCTACAAAGTTTGCTTC；
S663V mutation reverse：
GAAGCAAACTTTGTAGCCacAAACTCTGCCGGAGGATT。
2. scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒的制备过程
通过分子生物学手段将pscAAV两个ITR之间测序列全部去除，然后将U6-shNfil3-pT表达元件、EFS-HBVc-PEP3-bGHpA表达元件依次克隆进去，获得pscAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3；以pAAV6 Rep-Cap为模板，通过PCR介导的定点突变将AAV6 cap基因VP1编码框第663个氨基酸突变为缬氨酸，获得包装质粒pAAV6 Rep-CapS663V；将9μg pscAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3、11μg pAAV6 Rep-CapS663V和23μg pHelper共转染到1个铺有1×107HEK293细胞的150mm细胞培养皿中，包装获得scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒，转染72小时后收集病毒，通过碘克沙醇密度梯度离心纯化病毒。通过qPCR对纯化后的病毒进行滴度测定。
3、scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒在恶性脑胶质瘤治疗中的应用
将上述病毒包装、纯化后，通过qPCR测定病毒滴度为1×109vg/ul。取将8周龄C57雄鼠30只，通过脑立体定位系统在每只小鼠右半脑纹状体区域接种1×105个带有荧光素酶基因的GL261小鼠脑胶质瘤细胞，通过小动物活体成像系统监测肿瘤生长情况。
接种细胞10天后，将荷瘤小鼠分为三组，每组10只，在瘤内注射AAV病毒。实验组注射scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒1×1010vg，对照组1注射scAAV2-shScram-HBVc-PEP3病毒1×1010vg，对照组2注射PBS 10ul，每隔一天注射一次，连续注射三次。注射病毒后通过小动物活体成像系统监测肿瘤生长情况，附图2显示了注射scAAV2-shNfil3-HBVc-PEP3病毒对肿瘤生长的影响。在最后一次注射病毒后第14天处死所有小鼠，取右侧大脑，消化成单细胞悬液后，通过Percoll密度梯度离心分离免疫细胞。每只小鼠取一半的免疫细胞通过流式分析免疫细胞的浸润及分化情况。附图3显示了不同组肿瘤微环境中免疫细胞浸润数量的变化，附图4显示了不同组肿瘤微环境中CD8+T细胞和CD4+T细胞数量的变化，附图5显示了不同组肿瘤微环境中Th1细胞在CD4+T细胞中的比例。将剩余的免疫细胞用CD3磁珠剔除淋巴细胞，将剩下的骨髓来源细胞以5×104密度接种于96孔板中培养24小时，收集上清，通过Elisa检测上清中促炎因子的水平，图6显示了不同组的肿瘤微环境中骨髓来源细胞分泌促炎因子的水平。用CD8磁珠从CD3阳性细胞中分离CD8+T细胞，分别在平底96孔板中接种1×104个过表达EGFRVIII基因的GL261细胞以及野生型GL261细胞，将CD8+T细胞以4×104/孔密度接种于铺有肿瘤细胞的96孔板中，40小时后收集上清，通过Elisa检测上清中IFN-γ的水平，如附图7显示了不同组的肿瘤微环境中CD8+T细胞对肿瘤抗原的特异性免疫反应。
实施例2
以下是以携带microNfil3表达元件和HBVc-PEP3基因表达元件，AAV6S663V衣壳包被的2型自互补腺相关病毒AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3为例的实施例。
1、AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒结构如下
该病毒基因组从5’到3’端依次包含以下元件：AAV 5’ITR、U6-microNfil3-pT表达元件、EFS-HBVc-PEP3-bGHpA表达元件、AAV 3’ITR。附图8显示了AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒基因组的结构。
microNfil3-pT序列为SEQ ID NO.6，具体如下：
CACCGTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGGCAGGTGACGAACATTCAAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTTGAATGTTCGTCACCTGCTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTT，该序列中包含了SEQ ID NO.3。
其它结构与实施例1相同。
2、AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒的制备
通过分子生物学手段将pAAV两个ITR之间测序列全部去除，然后将U6-microNfil3-pT表达元件、EFS-HBVc-PEP3-bGHpA表达元件依次克隆进去，获得pAAV2-microNfil3-HBVc-PEP3；其它步骤与实施例1相同，可以获得AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒。
3、AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒在恶性脑胶质瘤治疗中的应用
实验流程与实施例1相同。注射病毒后通过小动物活体成像系统监测肿瘤生长情况。附图9显示了注射AAV2-microNfil3-HBVc-PEP3病毒后对荷瘤小鼠存活率的影响。
本发明通过上述实验证明，本发明所述的病毒是较理想的预防/治疗抗肿瘤药物，可作为针对抗脑胶质瘤药物的制备。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。
Claims (3)
1.一种抗肿瘤药物，其特征在于，将腺相关病毒基因组的两个ITR之间的序列去除，在ITR之间插入Nfil3基因敲低元件和HBV核心蛋白编码基因与肿瘤抗原PEP-3编码基因融合形成的HBVc-PEP3基因表达元件，同时将6型腺相关病毒衣壳蛋白VP1编码框第663个氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸作为该病毒的衣壳蛋白；
所述的腺相关病毒基因组是2型腺相关病毒基因组；
所述的2型腺相关病毒基因组是2型自互补腺相关病毒基因组；
所述的2型自互补腺相关病毒基因组是将2型腺相关病毒基因组3‘端ITR缺失碱基序列形成的，缺失的碱基序列为SEQ ID NO.1所示；
所述的Nfil3基因敲低元件是靶向Nfil3基因的shRNA或者microRNA表达元件；
所述的shRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的shRNA序列、polIII终止子组成；所述的microRNA表达元件是由polIII启动子、靶向Nfil3基因的microRNA序列、polIII终止子组成；
所述的靶向Nfil3基因的shRNA序列为SEQ ID NO.2所示；所述的靶向Nfil3基因的microRNA序列为SEQ ID NO.3所示；shNfil3-pT序列为SEQ ID NO.5；
所述的HBVc-PEP3基因表达元件由polII启动子、HBVc-PEP3基因、polII终止子组成，polII启动子是CMV、PGK、EF1a、SV40、Ubc中的一种，polII终止子是SV40pA、bGHpA、TKpA、rGBpA中的一种，HBVc-PEP3基因序列为SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的polIII启动子是U6启动子、H1启动子中的一种，所述的polIII终止子是5-10个T碱基组成的转录终止子。
3.权利要求1或2所述的抗肿瘤药物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
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