CN103687617A - 作为过敏症疫苗的肽载体融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少3个肽片段的多肽，其中肽片段由至少1个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成，所述野生型变应原融合至嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽的N和C端或融合至所述表面多肽的至少1个片段。

Description

作为过敏症疫苗的肽载体融合蛋白
技术领域
本发明涉及新型多肽及其用途。
背景技术
I型过敏症是IgE介导的超敏性疾病，其影响几乎25%的人口。它是基于特异性免疫球蛋白E对无害的空中传播的、昆虫、毒液、食物变应原和接触变应原抗原（源自本身无害的抗原来源，例如花粉、昆虫、霉菌和动物蛋白）的识别。效应细胞结合的IgE抗体的交联引起炎症介质（例如组胺、白细胞三烯（leucotrienes））的释放，并因此引起过敏症的即刻症状（例如，鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏反应）。通过IgE依赖性和IgE非依赖性机制进行的T细胞激活有助于慢性过敏性炎症。
过敏症治疗的唯一可能致病（causative）形式为变应原特异性免疫疗法，其基于反复施用渐增量的大多数来源的变应原提取物。很多临床研究证明了注射免疫疗法的临床功效，并有这种治疗下的几种免疫机理的证据。由于制备某些变应原来源的高质量变应原提取物的困难，以及向患者施用变应原会引起严重的副作用的事实，只能够向某些患者群和疾病表现来推荐变应原特异性免疫疗法。治疗对几种不同变应原来源共同敏感的患者以及遭受严重疾病表现例如过敏性哮喘的患者是特别困难的。过敏性哮喘是过敏症最严重的表现之一，因为它严重影响日常生活质量，引起高入院率，其表现为严重的、威胁生命的形式，需要对患者的深切关注。
从天然变应原来源制备的变应原提取物性质上是粗的，不可能通过技术手段影响这种制备物中的个别变应原的质量和量。它们也含有各种不明确的非变应原性成分，几项最近的研究表明了这种提取物的劣质并证明了它们的高异质性。
在过去的十年中，使用重组DNA技术在分子变应原鉴定领域取得了巨大进步。很大数量的引起疾病的最重要的变应原已被鉴定至分子水平，已经生产出模拟天然变应原提取物表位复杂性的重组变应原。而且，几个研究小组已经使用关于变应原结构的知识开发出确定的新的过敏症疫苗。已经使用遗传工程、合成肽化学和变应原与免疫刺激DNA序列的缀合来减少新疫苗的变应原性活性，并因此减少疗法诱导的副作用率。以这种变应原衍生物进行第一个有前景的临床研究。有趣的是，实际上，虽然可以强烈减少或甚至消除遗传工程化重组变应原和变应原衍生的合成的包含T细胞表位的肽的IgE反应性，但是这些衍生物仍然可以诱导全身性副作用（出现于注射后几小时）。例如，有报道指出，在皮内注射后几个小时，主要猫变应原Fel d1的T细胞表位肽，诱导了哮喘和支气管的高反应性，且有力证据表明，这种效应是T细胞介导的和MHC限制的。
这些结果表明，除去IgE反应性减少IgE介导的副作用，因为在这些免疫疗法研究的过程中未记录到即刻反应。但是，被保留在重组变应原衍生物以及肽混合物中的变应原特异性T细胞表位是造成延迟的副作用（例如问题严重的或特应性皮炎、慢性T细胞介导的过敏性皮肤表现）的原因。在重组变应原衍生物的情况下引起的副作用相对轻微，在T细胞肽疫苗的情况下可通过足够的剂量来克服副作用。因此这两种新方法似乎对过敏性鼻结膜炎的免疫疗法都是非常有前景的，但当涉及治疗严重形式的过敏性哮喘时，其中肺中的延迟副作用的诱导可能是问题严重的，这两种新方法可能具有局限性。
为了施用并因此激发针对肽、多肽和蛋白的有效免疫反应，通常使用佐剂和/或载体。例如，完全弗氏佐剂（CFA），是一种可获得的最有力的佐剂。需要能够诱导针对（源自变应原，当然，以及源自其它抗原的）肽和多肽的强烈免疫反应的疫苗组合物，使用或不使用完全弗氏佐剂。而且，虽然在动物模型中已成功使用BSA作为载体，它可能不适宜用于人类疫苗组合物，因为具有有害反应的风险，例如传播朊病毒病（变异型克雅氏病，（variant Creutzfeldt-Jakob disease））的风险。发展有效的针对变应原的疫苗的进一步挑战是需要能够迅速降低个体或动物中变应原的免疫反应。因此，需要血液中高浓度的变应原特异性抗体，其主要是IgG亚型。在粘膜表面IgA抗体同样重要。
霍乱毒素，现有技术中已知的载体蛋白，通常也用作佐剂。但是，霍乱毒素增加总的和特异性的IgE抗体水平，并引起IgE相关的炎症反应。
由于大多数用于疫苗的载体蛋白所激发的副作用，需要能够刺激针对变应原或其它抗原的免疫反应的载体系统，而不使用毒性佐剂，不使用较差耐受的载体蛋白，并且，在一些情况下，不刺激潜在的致病性免疫反应。满足这些特性的新型载体系统可被用于形成适合于治疗或预防如过敏性疾病等疾病的新型缀合物和组合物。
Bohle B.等人（J.Immunol.172（11）（2004）:6642-6648）描述了一种包含S层蛋白（S-layer protein）半体（moiety）和Bet v1半体的重组融合蛋白。这个分子包含含有Bet v1特异性T细胞表位的天然的Bet v1变应原。
WO 2004/004761涉及融合至免疫原的病毒样颗粒，可用于免疫。
在WO 2004/003143中公开包含病毒样颗粒和变应原性分子的融合蛋白，其作为免疫原用于接种。
在WO 2007/140505中和Edlmayr等人(J.Immunol.182(10)(2009)6298-6306)描述包含几个融合至变应原衍生肽的载体分子的融合蛋白，其用于诱导变应原特异性IgG抗体，但这些构建物并不显示可被视作对过敏患者有利的免疫调节效果，例如IL-10或Thl免疫的诱导。Edlmayr等人的图4显示KLH融合的肽诱导Th2细胞因子IL-5，以及VP1融合蛋白不诱导IL-10或IFN-gamma。
在Niespodziana等人(J.Allergy Clin.Immunol.127(6)(2011)1562-1570)描述各包含乙型肝炎-衍生的PreS和源自主要猫变应原Fel d1的两个肽的融合蛋白，其用于诱导变应原特异性IgG抗体。然而，尚无描述适用于人类接种的方案，所述肽包含变应原特异性T细胞表位。
发明内容
本发明的目的是提供药物和载体，其克服前述缺陷并允许具有减少的副作用的变应原接种。
因此，本发明涉及包含至少3个肽片段的多肽，所述肽片段由至少1个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成，所述野生型变应原融合至嗜肝DNA病毒科（family）病毒表面多肽的N和C端或所述表面多肽的至少1个片段，或者所述多肽包含嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽或其至少1个片段，其N和/或C端融合至源自至少1个野生型变应原的至少3个肽。
为了激发针对分子特别是针对根据本发明变应原性的或低变应原性的分子的提高的免疫反应，源自至少1个野生型变应原的至少3个肽片段（通过遗传工程）融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽，优选乙型肝炎病毒，更优选乙型肝炎PreS多肽，或其至少1个片段。结果令人惊讶，与常规和通常使用的载体蛋白例如KLH（钥孔戚血蓝素，keyhole limpet hemocyanin）相反，嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽，优选乙型肝炎病毒，更优选乙型肝炎PreS多肽，或其片段引发对其所结合的那些肽的抗体的增强形成。
而且，结果表明，使用融合至乙型肝炎PreS多肽的3个以上合适选择的变应原衍生肽片段进行免疫所诱导的变应原特异性IgG抗体，更好地聚焦于变应原的IgE表位，然而用野生型变应原进行免疫则产生针对变应原所有部分的IgG，还有针对非IgE反应性的那些的IgG。在标准化IgG滴度的实验中，这引发PreS/肽诱导的IgG，相对于野生型变应原诱导的IgG，更好的阻断能力（图12）。
同样非常出人意料，结果表明，在融合至乙型肝炎PreS多肽的变应原衍生肽片段的人PBMC融合蛋白的培养物中，强烈诱导细胞因子IL-10和IFN-gamma，其被归为成功的过敏症免疫疗法的阳性指示因子（indicator）。与之相反，使用野生型变应原、单独使用变应原衍生的肽片段或单独使用PreS时，IL-10和IFN-gamma的诱导显著较低（图10）。
本文使用的“融合至N和C端”意思是至少1个肽被融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的N端或所述表面多肽的至少1个片段，以及至少1个肽被融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的C端或所述表面多肽的至少1个片段。在本发明的最简实施方案中，嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽或所述表面多肽的至少1个片段可在N端包含1个肽以及在C端包含2个肽或反之亦然。
本发明的多肽优选地包含至少4个，更优选至少5个，甚至更优选至少6个，肽片段，优选源自变应原的B细胞结合肽，其中4个肽是最优选的。
根据本发明的具体优选实施方案，载体蛋白是具有下列氨基酸序列(SEQ IDNo.21)的乙型肝炎PreS多肽：
GGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTN
也可使用乙型肝炎PreS多肽的片段乙型肝炎PreS1或乙型肝炎PreS2。乙型肝炎PreS多肽的片段优选包含或者由至少30个，优选至少40个，更优选至少50个，SEQ ID No.21的连续氨基酸残基组成。
如本文所用的“低变应原性的”指具有减少的或者没有变应原性潜力的分子（即，本领域已知的在IgE结合测试中确定的IgE反应性）。这样的分子，与这些分子所源自的野生型蛋白相比，在个体中具有降低的激发过敏性反应的能力。
至少3个，优选至少4个，更优选至少5个，甚至更优选至少6个肽片段融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的N和C端或者所述表面多肽的至少1个片段，其包含或由至少1个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别是20-50个连续的氨基酸组成，优选地，其与所述肽片段所源自的野生型变应原相比，显示出减少的IgE反应性。优选地，将这些肽片段设计为不包含变应原特异性T细胞表位，其可能引起T细胞介导的副作用。T细胞表位和显示减少的T细胞反应的分子可通过本领域技术人员已知的方法确定和鉴定（例如,Bercovici N.等人Clin Diagn Lab Immunol.（2000）7:859-864）。
至少3个肽片段包含或由至少1种野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别20-50个连续的氨基酸组成，所述肽片段可源自同一变应原。如果两个或更多个片段源自相同变应原，这些两个或更多个片段在野生型变应原上不相邻和/或在本发明的多肽上具有与野生型变应原上的顺序不对应的顺序。
本文使用的术语“肽片段”意思为源自野生型变应原初级结构的本发明的低变应原性多肽或融合蛋白的部分/片段，并包含或由这个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别20-50个连续的氨基酸组成。
如本文所用的术语“源自变应原”和“源自至少1个野生型变应原”意思为根据本发明的肽片段通过片段化或截断从变应原直接获得。优选地，这些肽片段的氨基酸序列，与所述肽片段所源自的野生型变应原的氨基酸序列延伸（stretch），至少80%相同，更优选为至少90%相同，最优选为至少95%相同，特别地为100%相同。但是，与野生型变应原片段并非100%相同的肽需要能够以至少60%，优选为至少70%，更优选为至少80%，最优选为至少90%的力（strength）结合至抗体，优选结合至针对所述野生型变应原片段的IgG抗体。“至少1个野生型变应原”意思为本发明的多肽可包含多于1个，优选2个，更优选3个，不同的野生型变应原（即，来源）的B-细胞结合肽（例如，1个肽源自Bet v1，1个源自Amb a1和1个源自Phl p1或者2个肽源自Bet v1以及1个源自Amb a1）。
第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性程度可通过使用一定的算法直接比较两条氨基酸序列来确定。这样的算法为例如，嵌合在各种计算机程序中（例如″BLAST2SEQUENCES（blastp）″（Tatusova等人.（1999）FEMS Microbiol.Lett.174:247-25;Corpet F,Nucl.Acids Res.（1988）16:10881-10890）。
根据本发明的多肽可通过重组方法或化学合成以获得。或者，当然也可能通过酶法或化学切割野生型变应原或包含感兴趣分子的多肽/蛋白来获得。
目前出人意料地发现，通过使用来自嗜肝DNA病毒类/纲（class）的病毒更具体地为人乙型肝炎病毒的表面蛋白可获得具有改善性能的肽载体融合蛋白。1至20个，优选3或4至20个，更优选3或4至15个，甚至更优选3或4至10个(即，3、4、5、6、7、8、9、10)肽片段，优选低变应原性的肽片段，可被融合至嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽的C端和N端或所述表面多肽的至少1个片段。因此，本发明优选的实施方案是由至少3至6个低变应原性的肽片段组成的融合蛋白，其中载体蛋白源自人乙型肝炎病毒表面抗原。根据本发明的具体优选实施方案，这样的融合蛋白使用preS蛋白作为载体。本发明的最优选的实施方案是融合蛋白，其中4个低变应原性的肽片段被融合至preS载体蛋白或其片段。所述（低变应原性的）肽片段可以相同或不同以及可以源自1个或几个变应原性蛋白，以及肽在融合蛋白中的位置位于载体蛋白的C端和N端。可将1至3个（低变应原性的）肽片段融合至C端和N端的每一端，这样，（低变应原性的）肽片段的总数将是，例如3或4至6。术语“融合”（fused）或“融合蛋白”，指本发明优选的实施方案，意思为将非变应原性的载体蛋白和位于载体C和N端的（低变应原性的）肽片段，作为1个单一重组多肽链，予以表达和制备。
本发明最高度优选的实施方案是乙型肝炎病毒preS蛋白的融合蛋白，其携带源自特异性变应原的（低变应原性的）肽片段，从而1或2个，优选2个肽片段，每个被融合至载体的C端和N端。说明性地，本发明优选的多肽可具有由下列通用结构所代表的通用分子结构：
结构1优选实施方案的通用结构原则
肽A 肽B PreS 肽C 肽D
结构2优选实施方案的通用结构原则
肽A 肽B PreS 肽C
结构3优选实施方案的一般通用结构原理原则
肽B PreS 肽C 肽D
应当理解，肽A、B、C和D可以相同或不同，以及对每个单独融合蛋白其可以源自相同变应原，或者源自不同变应原。
待融合至嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽的N和C端或所述表面多肽的至少1个片段优选preS蛋白或其片段的（低变应原性的）肽优选选自：主要桦树花粉变应原，特别为Bet v1和Bet v4，主要牧草（timothy）花粉变应原，特别为Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6和Phl p7，主要屋尘螨变应原，特别为Der p1、Der p2、Der p5、Der p7、Der p21和Der p23，主要猫变应原Fel d1，主要豚草变应原Amb a1，主要日本雪松变应原Cry j1和Cry j2、主要蜂变应原，主要黄蜂变应原，前纤维蛋白（profilin），特别是Phl p7、Phl p12。
根据本发明所用的其它合适变应原可源自下表2，而并非限制于所述表中。
表2低变应原性肽的来源
Figure BDA0000432825670000061
Figure BDA0000432825670000081
Figure BDA0000432825670000091
Figure BDA0000432825670000101
Figure BDA0000432825670000111
Figure BDA0000432825670000121
Figure BDA0000432825670000131
Figure BDA0000432825670000141
Figure BDA0000432825670000151
Figure BDA0000432825670000161
Figure BDA0000432825670000171
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根据本发明的具体优选的实施方案，源自至少1个野生型变应原的至少3个肽中的至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，尤其全部，是B细胞结合肽。
根据本发明的用于过敏症接种的“B细胞结合肽”源自或接近变应原的IgE结合位点，但是与野生型变应原相比，B细胞结合肽自身不显示或显示最小的IgE反应性(Focke M等人.Clinical&Experimental Allergy40(2010):385-397)。对其生产和选择的要求是知道变应原的一级序列和关于IgE结合位点。融合至合适的免疫原性载体的B细胞结合肽，通过免疫，能够诱导产生变应原特异性IgG，其可阻断IgE对变应原的结合。例如，可通过测试IgG对完整变应原的反应性以确定融合蛋白诱导的IgG是否识别变应原。合适的方法包括ELISA、斑点印迹或Western印迹分析。优选那些诱导阻断患者IgE结合至变应原的IgG的肽。
本发明显示，特别是当3个或更多个被融合至根据本发明的合适载体时，使用合适的B细胞结合肽允许诱导IgG反应，相较于通过甚至使用完整变应原免疫所诱导的那些，所述IgG反应更好地聚焦于IgE表位。而且，本发明显示适宜的肽的组合以及其在合适载体上的数目能将变应原特异性免疫反应指向有利的抗过敏性（anti-allergic）免疫反应（特征在于优选诱导变应原特异性IgG和非IgE反应和耐受原性(IL-10)以及Thl（干扰素gamma）的细胞因子反应）。
此外，结果出人意料，包含3个或更多个融合至免疫原性载体的B细胞结合肽的根据本发明的多肽-虽然事实是其缺乏变应原特异性T细胞表位—所述多肽仍能够减少变应原特异性T细胞反应。事实证明，使用本发明低变应原性多肽进行治疗性接种所诱导的变应原特异性IgG的存在减少变应原特异性T细胞激活，所述T细胞激活是通过在PBMC中IgE促进的抗原递呈所引起，所述PBMC来自经接种的人过敏性个体（图16）。
根据本发明的优选实施方案，与野生型变应原相比，所述至少3个肽中的至少1个表现出无或减少的IgE结合能力。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述至少3个B细胞结合肽中的至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，表现出无或基本上无T细胞反应性。
变应原特异性T细胞表位的存在可引起不希望的T细胞介导的副作用。因此，尤其优选使用表现出无或基本上无T细胞反应性的肽以获得本发明的多肽。
但是，在根据本发明多肽中也可使用包含至少1个T细胞表位的变应原片段。
如本文所用的“表现出减少的IgE结合能力”意思为，根据本发明的分子显示出显著减少的IgE结合能力或活性（与野生型变应原相比，结合能力至少减少50%，优选至少减少70%，更优选至少减少80%，甚至更优选至少减少90%，最优选至少减少95%）或甚至完全缺乏IgE结合。
如肽和蛋白等分子的IgE结合活性/能力可通过例如酶联免疫吸附测试（ELISA）以确定，所述酶联免疫吸附测试使用例如从曾经暴露于野生型变应原的受试者（即，过敏性受试者）获得的血清。简单来说，将待测肽包被至微量滴定板的孔中。洗涤并封闭孔后，由过敏性受试者的血浆组成的抗体溶液在孔中孵育，该受试者曾暴露于待测肽或其所衍生的蛋白。向孔中加入标记的二抗并孵育。然后定量IgE结合的量并且与纯化的野生型变应原所结合的IgE的量作比较。
或者，肽的结合能力可通过Western印迹分析确定。例如，使用SDS-PAGE将待测肽在聚丙烯酰胺凝胶中分析。然后将所述肽转移至硝化纤维，接下来用来自过敏性受试者的血清孵育。经标记的二抗孵育后，所结合的IgE的量被确定和定量。
另外1个可用于确定肽的IgE结合活性的测试为竞争ELISA测试。简单来说，通过混合来自过敏性受试者的血浆产生IgE抗体库，所述过敏性受试者通过直接ELISA表明其与野生型变应原具有IgE反应性。在ELISA竞争测试中使用这个库以比较结合至野生型变应原与结合至待测肽的IgE结合。确定并定量野生型变应原和待测肽的IgE结合。
“T细胞表位”意思是蛋白、肽或多肽（例如变应原）或其片段，T细胞对其具有抗原特异性结合位点，结合至所述结合位点的后果为激活T细胞。如本文所用的术语“表现减少的T细胞反应性”是指使用本领域已知的标准测试中的等摩尔量，与野生型变应原（低变应原性分子源自该野生型变应原）所诱导的刺激相比，分子表现出显著性减少的T细胞反应性（减少的T细胞反应性意味着，在等摩尔量下，与野生型变应原相比，低变应原性分子的刺激减少至少30%，优选为至少50%，更优选为至少70%，最优选为至少90%）。在本发明的特别优选实施方案中，所述分子可“缺少”T细胞表位，因此在待处理的个体（即，将接受表位递呈价态平台分子的个体）中分子显示出减少的T细胞反应性。例如可能是，变应原衍生的分子相对于一个个体或一组个体缺少T细胞表位，但相对于其它个体则具有T细胞表位。检测T细胞表位存在的方法在本领域是已知的，包括检测T细胞增殖的测试（例如胸苷掺入）。不能诱导统计学上显著高于背景（即，使用标准的统计学方法，通常p小于0.05）的胸苷掺入的免疫原，通常被认为是缺少T细胞表位，虽然将意识到，胸苷掺入的定量的量可依赖于待测的免疫原而变化（参见例如,Zhen L.等人（Infect Immun.（2003）71:3920-3926））。通常，低于约2-3的刺激指数，优选低于约1，表明缺少T细胞反应性和表位。也可根据标准方法通过测量T细胞衍生的淋巴因子的分泌来确定T细胞表位的存在。可通过将受刺激细胞的增殖率（胸苷摄入）除以只在介质中未经刺激的细胞的增殖率以计算刺激系数（SI）。SI=1意味着无刺激，以及SI>1指示对细胞的刺激。如果存在T细胞表位的定位和内容，其可通过经验确定。
除了T细胞的刺激，还可确定细胞因子的分泌。例如，IFN-gamma和IL-10，作为调节性T细胞的增加活性的生物标志物，其已被视为伴随着成功过敏症免疫疗法的细胞因子。
本发明的肽片段优选地由下述构成或组成：Phl p1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phl p2的1至33、8至39、34至65或66至96位氨基酸、Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸，Phl p6的23至54、56至90、73至114或95至127位氨基酸，Fel d1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸，Bet v1的30至59、50至79、75至104、30至74或60至104位氨基酸，Der p1的1至30、52至84或188至222位氨基酸，Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸，Der p21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，Der p23的1至32、15至48或32至70、32至60、52至84、32至70(Cys->Ser)位氨基酸、Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
上述鉴定的变应原衍生分子的具体氨基酸序列是（在下列表中的具有N和/或C端半胱氨酸残基（C）的用于本发明的多肽中的肽，可缺少所述半胱氨酸残基）：
表3
Figure BDA0000432825670000361
Figure BDA0000432825670000371
Figure BDA0000432825670000381
Figure BDA0000432825670000391
*)丝氨酸取代半胱氨酸(以粗体标记)
术语“其片段”和“其序列变体”，指从本文公开的变应原衍生的分子所导出的肽，其表现出与所述变应原衍生的分子相当的或相同的生物化学特性（例如，防止IgE与那些分子所源自的变应原结合的能力）。本发明的片段包含至少5个，优选至少7个，更优选至少10个，连续的和/或最大为95%，优选的最大为90%，更优选的最大为80%的变应原衍生的分子的氨基酸残基。术语“序列变体”，包括对肽进行的修饰，例如片段化（参上）、氨基酸取代（特别是丝氨酸、丙氨酸或其它天然或非天然的氨基酸或氨基酸衍生物可取代半胱氨酸或甲硫氨酸残基）、删除或加入。“序列变体”也指上表中所述变应原衍生的分子，其中至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，甚至更优选至少4个（5、6、7、8、9、10、15、20）个氨基酸残基被加入到C和/或N端。
注意到本文称为“克隆30变应原”的变应原，是源自屋尘螨Dermatophagoidespteronyssinus的变应原，由以下序列组成：
MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT(SEQ ID No.140;也参见WO2007/124524)。同时，命名为Der p23的变应原已被指定（assigned）为克隆30变应原。这意味Der p23和克隆30变应原是同义词。
根据本发明，也包含与以上所公开的氨基酸序列为至少80%相同，优选为90%相同的肽。
根据本发明的优选的实施方案，嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽或其至少1个片段，包含融合至其N端的源自至少1个野生型变应原的至少2个B细胞结合肽片段，以及融合至其C端的源自至少1个野生型变应原的至少2个B细胞结合肽片段。
在本发明具体优选的实施方案中，所述至少3个B细胞结合肽中的至少两个是相同的。
本发明的多肽可在治疗或预防人或动物过敏症中用作疫苗。
所述多肽优选地以0.01微克/kg体重至5mg/kg体重的量施用于个体，优选0.1微克/kg体重至10微克/kg体重。
根据本发明具体优选的实施方案，本发明的多肽以每种多肽至少10μg、优选至少20μg的量施用于个体。待施用多肽的最大量可变，但其优选每种多肽100μg以下，更优选50μg以下，甚至更优选40μg或更少。
多肽可与赋形剂相结合以生产单一剂量形式，所述多肽的量将根据治疗的宿主和施用的具体模式而变化。疫苗的剂量根据诸如个体的疾病状态（disease state）、年龄、性别和体重、以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。为提供最佳治疗反应可调整剂量方案。例如，几个分开的剂量可每日施用，或者如治疗情况的紧急性（exigencies of the therapeutic situation）所示可成比例地减少剂量。根据情况，也可改变疫苗的剂量以提供最佳预防性的剂量反应。例如，始终取决于变应原特异性IgG诱导的水平，可间隔几天、1或2周或甚至数月将本发明的多肽和疫苗施用给个体。
在本发明优选的实施方案中，使用所述多肽/疫苗在2和10次之间，优选2和7次之间，甚至更优选至多5次，最优选至多3次。在特别优选的实施方案中，后续接种之间的时间间隔选在2周和5年之间，优选在1月和至多3年间，更优选在2月和1.5年间。本发明的肽/疫苗的重复施用可使得治疗性接种的最终效果最大化。
根据本发明的具体优选实施方案，3个或更多个B细胞结合肽选自：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.137、SEQ ID No.139、SEQ ID No.142和SEQ ID No.10，所述3个或更多个B细胞结合肽以N和C端结合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽，优选肝炎PreS多肽或其片段。
本发明的多肽包含源自至少1个野生型变应原的至少3个B细胞结合肽，所述多肽优选自SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。
本发明的另一方面涉及编码根据本发明的多肽的核酸分子。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。
所述载体优选为表达载体。
容纳本发明的核酸分子的载体可用于克隆目的或用于生产表达载体。所述载体可以是质粒、粘粒（cosmid）、病毒、噬菌体或任何其它遗传工程中通常使用的载体，除了本发明的核酸分子外，还可包括用于控制表达的真核或原核元件，例如用于启动和终止转录和/或翻译的调节序列、增强子、启动子、信号序列等等。
根据本发明的优选实施方案，所述载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。
优选地，本发明的载体可用于在各种宿主中克隆和表达的目的，所述宿主如细菌、酵母、丝状真菌（filamentous fungi）、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或任何其它原核或真核细胞。因此，所述载体除了包含编码根据本发明的低变应原性分子或融合蛋白的核酸之外，还包含宿主特异性调节序列。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸分子或载体的宿主。
根据本发明的核酸分子和载体可被引入合适的宿主。所述分子可被并入所述宿主的基因组。所述载体可在胞质中以染色体外的形式存在或被并入宿主的染色体中。
本发明的又一方面涉及针对本发明的低变应原性分子、低变应原性融合蛋白或融合蛋白的抗体。
本发明的另一方面涉及疫苗制剂，其包含至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，甚至更优选至少4个，根据本发明的多肽。
在本发明的具体优选的实施方案中，所述疫苗包含至少1个，优选至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个多肽，所述多肽所具有选自SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.149、SEQ ID No.150、SEQ ID No.151和SEQID No.152的氨基酸序列。
在患有这样的过敏症或者存在患过敏症风险的个体中，这样的疫苗根据组成（composition）可用于治疗和/或预防草花粉过敏症、桦树花粉过敏症、屋尘螨过敏症或那些过敏症的组合。
本文使用的术语“预防”（preventing），不仅覆盖预防疾病发生的手段，例如减少风险因素，还覆盖建立（established）后阻遏（arrest）其进展和减少其后果的手段。“预防”也意味着预防存在患过敏症风险的个体的致敏作用（sensitization）。
如本文使用的术语“治疗”或语法等同物包括疾病（例如过敏症）症状的改善和/或反转。当用于本发明筛选方法中的化合物引发疾病相关的任何参数的改善，所述化合物可因此被认为是治疗性的（therapeutic）化合物。术语“治疗”指治疗性治疗和预防性的（prophylactic）或预防的（preventative）手段两者。
根据本发明最优选的实施方案之一，所述疫苗包含具有氨基酸序列SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID No.17的多肽。
根据本发明另一优选的实施方案，所述疫苗包含具有氨基酸序列SEQ ID No.18和/或SEQ ID No.19的多肽。
根据本发明具体优选的实施方案，所述疫苗包含本发明的多肽，其包含源自屋尘螨变应原的变应原片段。特别优选的是Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸残基，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸残基，Der p21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸残基，Der p23的1至32、15至48或32至70、32至60、52至84、32至70(Cys->Ser)位氨基酸，Der p1的1至30、1至41、27至57、42至82、52至84、85至115、99至135、145至175、155至187、175至208或188至222位氨基酸残基。最优选地是，所述疫苗包含多肽SEQ ID No.149至152中至少1个（图18A-D所示）。
在具体优选的实施方案中，在1至5年的，优选2至3年的总治疗期中，本发明的多肽/疫苗每治疗年施用4次。所述每年施用4次中有3次应用于6至12周，优选8周的期间内，在施用1和2之间以3至6周，优选4周的间隔，并且在施用2和3之间又以3至6周，优选4周的间隔。在第3次施用后3至7个月应用第四次施用。如果总治疗周期超过1年，在后面的治疗年中应用同样的给药方案。
对季节性过敏症（例如，如草花粉过敏症或桦树花粉过敏症的花粉过敏症）的治疗，优选在具有变应原暴露的各个季节（花粉季）之前按计划施用1、2和3，在所述季节后按计划第4次施用。
根据本发明的疫苗制剂可以按照本领域已知的进行配制，并必要地按所述疫苗制剂的施用方式进行调整。
（本发明的）疫苗制剂施用的优选方式包括通常为接种所描述和建议的所有标准施用方案以及特异性过敏症免疫疗法（口服、经皮、静脉内、鼻内、经粘膜、直肠等）。但是，特别优选皮下或肌内施用根据本发明的分子和蛋白。
根据本发明的疫苗制剂可只包含嗜肝DNA病毒属成员的病毒衣壳蛋白或其片段。
所述制剂优选地进一步包含至少一种佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
为了增加根据本发明的低变应原性分子的免疫原性，可在根据本发明的药物中使用例如佐剂。根据本发明的佐剂为辅助性试剂，当与抗原一起或平行施用时，增加其免疫原性和/或影响免疫反应的质量。因此，佐剂可例如相当地影响体液或细胞免疫反应的程度。通常的佐剂为例如铝化合物、含脂化合物或灭活的分支杆菌。
通常，佐剂可以是不同的形式，只要其适于向人施用。这样佐剂的其它例子为矿物或植物来源的油乳剂、矿物化合物例如磷酸铝或氢氧化铝，或磷酸钙、细菌产物和衍生物，例如P40（源自肉芽肿棒状杆菌（Corynebacterium granulosum）的细胞壁）、单磷酰脂质A（monophosphoryl lipid A,MPL,LPS的衍生物）和胞壁酰肽（muramyl peptide）衍生物及其缀合物（来自分支杆菌成分的衍生物）、明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn（无对应中译文）、皂角苷、鲨烯等（见例如Gupta R.K.等人，（Vaccine11:293-306（1993））和Johnson A.G.（Clin.Microbiol.Rev.7:277-289）。本发明的药物最优选包含作为佐剂的明矾。
本发明的另一优选的实施方案是一种以上融合蛋白的组合，其中融合蛋白包含低变应原性肽和乙型肝炎pre S蛋白。这些组合可源自来自单一变应原的肽，或来自相同变应原来源的或来自几个不同变应原来源的不同变应原的肽。
本发明优选的实施方案涉及4种融合蛋白的混合物，融合蛋白包含低变应原性肽和乙型肝炎病毒preS蛋白，所述低变应原性肽来自Phl p1、Phl p2、Phl p5和Phl p6。
本发明另一优选的实施方案涉及融合蛋白或2种融合蛋白的混合物，其中融合蛋白包含来自Bet v1的低变应原性肽和乙型肝炎病毒PreS蛋白。
本发明的又一优选的实施方案涉及至少2种融合蛋白的混合物，其中融合蛋白包含低变应原性肽以及乙型肝炎病毒PreS蛋白，所述低变应原性肽来自屋尘螨变应原，最优选选自Der p1、Der p2、Der p5、Der p7、Der p21和Der p23。最优选地，所述混合物包含3种融合蛋白，其中融合蛋白含有源自Der p1、Der p2和Der p23的低变应原性肽。特别优选的是，混合物包含SEQ ID No.149至152所示多肽中的至少1个，优选至少2个，更选至少3个(也参见图18A-D)。
一般来说，本发明的低变应原性多肽代表变应原来源的临床相关变应原，通过本发明低变应原性多肽的组合以制备根据本发明的特异性疫苗制剂，用于不同过敏症的治疗或预防。用于确定变应原来源的临床相关变应原的方法是本领域所知的，并在之前已得到描述(Valenta和Niederberger,2007,J Allergy Clin Immunol,119(4):826-830)。在优选的实施方案中，所述特异性疫苗制剂的低变应原性多肽被吸附至可用于人的佐剂（例如，氢氧化铝）上，然后所述混合物持续1-3年每年施用3-4次，在每个剂量中使用存在于疫苗制剂中的多于10μg的每种多肽。
根据本发明的另一个优选实施方案，所述制剂包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，尤其0.5μg至200μg的所述低变应原性分子或抗体。
本发明的另一方面涉及根据本发明的低变应原性蛋白或抗体在制备用于治疗或预防人类或动物中病毒感染和/或过敏症的药物中的用途。
所述药物优选为进一步包含至少一种佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
根据本发明的药物可用于主动（施用本发明的低变应原性蛋白和/或分子）以及被动免疫（针对本发明低变应原性蛋白和/或分子的抗体）。
根据本发明优选实施方案，所述药物包含10ng至1g，优选为100ng至10mg，尤其0.5μg至200μg的所述低变应原性分子、核酸分子、载体、宿主或抗体。
优选地，所述药物以0.01μg/kg体重至5mg/kg体重，优选为0.1μg/kg体重至10μg/kg体重的量施用于个体。
在特别优选的实施方案中，以包含每个所含的低变应原性多肽的5-200μg，更优选10–80μg，最优选20–40μg的绝对量的剂量施用所述药物。
具体剂量方案，即剂量、时间和重复，取决于具体个体和该个体的医疗史。经验考虑，例如半衰期，通常有助于确定剂量。可在疗法过程中确定并调节施用频率。
最优选地，所述药物的剂量方案在2-3年的总治疗期间由同一剂量的每年4次皮下注射组成。所述每年4次皮下注射中有3次应用于6至12周，优选8周的期间内，其在注射1和2之间间隔3至6周，优选4周，并且在注射2和3之间又间隔3至6周，优选4周。在第3次施用后4至6个月应用第4次注射。在后面的治疗年中应用同样的剂量方案。
对季节性过敏症（例如，如草花粉过敏症或桦树花粉过敏症的花粉过敏症）的治疗，优选在具有变应原暴露的各个季节（花粉季）之前按计划施用1、2和3，在所述季节后按计划第4次施用。
优选地，施用根据本发明的药物的个体为患有或存在患过敏症风险的个体或动物。
患有或具有患过敏症、过敏性病状、过敏性病症或过敏性疾病风险的受试者包括已存在过敏性病状或者已知的或怀疑朝着与过敏性病状相连或由过敏性病状引起的症状发展的趋势的受试者。因此，该受试者可具有主动的慢性过敏性病状、病症或疾病，急性过敏性发作，或潜伏的过敏性病状、病症或疾病。某些过敏性病状与季节性或地理性环境因素相关。因此，基于既往个人或家族史，以及季节或物理位置，有风险的受试者包括那些具有患病状风险的受试者，但所述病状或与病状相关的症状其自身可能目前不在受试者中表现出来。
根据本发明的药物向个体的施用，其包含至少1个如本文描述的低变应原性分子，可预防所述个体的致敏或可诱导针对变应原的合适的免疫反应。如果本发明的药物用于预防致敏，则其应该在个体与所述变应原首次接触前施用。因此，优选为向新生儿和儿童施用根据本发明的药物。结果表明，向怀孕个体施用根据本发明的药物将在未出生孩子中诱导针对变应原的抗体形成。对这样的疗法使用根据本发明的低变应原性分子是特别有益的，这是因为，由于缺少变应原特异性T细胞表位，在变应原免疫疗法过程中发生的副作用可被显著减少或甚至完全避免。
本发明的另一方面涉及来自嗜肝DNA病毒科病毒的病毒衣壳蛋白在药物或疫苗中作为载体的用途。
这样的载体的优点之一为，不仅所融合或缀合其上的抗原可暴露于免疫系统，而且还诱导了针对嗜肝DNA病毒的衣壳蛋白的免疫反应。因此，这样的接种引起预防和/或治疗嗜肝DNA病毒引起的疾病。所述病毒优选为人乙型肝炎病毒种。
本发明的另一方面涉及源自Phl p5（Genbank Nr.X7435）的低变应原性分子，其具有C和/或N端截短并基本上缺乏IgE结合能力。
草花粉是对干草热和过敏性哮喘负责的空气传播变应原的最强效室外季节性来源之一。
超过40%的过敏性个体表现出对草花粉变应原的IgE反应性，其被分成超过11个组。超过80%的草花粉过敏性患者与第5组变应原反应。
第5组变应原为非糖基化的、高度同源蛋白，具有介于25-33kD的分子量。几个第5组变应原已被克隆和/或进行了免疫学表征。
通过引入点突变、序列中（in row）几个氨基酸的突变或删除来降低变应原性活性的试验表明没有效果（Schramm G,等人J Immunol1999;162:2406-1435）。已经描述Phl p5的IgE结合区域（Flicker S,等人J Immunol2000;165:3849-3859），已经解析其三维结构（Maglio O,等人.2002.Protein Eng.15:635-642）。
特别地，结果表明根据本发明的Phl p5肽，其为C和/或N端截短的并缺少IgE结合能力，可用于个体的主动接种。
根据本发明的优选实施方案，经截短的分子基本上缺少T细胞表位以及，因此缺少Phl p5特异性T细胞反应性。
如上所述，如果低变应原性分子基本上缺少变应原特异性T细胞表位，变应原免疫疗法的延迟副作用可得到显著降低或甚至得以避免。
缺少T细胞表位的经截短的Phl p5分子由Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58或252至283位氨基酸或其片段或其序列变体组成。
特别地，这些经截短的分子基本上表现出低或无变应原特异性T细胞反应性以及，无论如何，能够激发针对野生型变应原的合适的免疫反应。
根据本发明的另一优选的实施方案，低变应原性经截短的Phl p5由Phl p5的132至162、217至246或176至212位氨基酸或其序列变体组成。
这些低变应原性分子包含1个或更多个T细胞表位但缺少IgE结合能力。
本发明的另一优选的实施方案为缺乏T细胞表位的经截短的Phl p1分子，其由融合至病毒载体蛋白优选Hep B pre S蛋白的Phl p1的1至30、43至70、87至117、151至171或214至241位氨基酸或其序列变体组成。
本发明的另一优选的实施方案为缺乏T细胞表位的经截短的Phl p2分子，其由融合至病毒载体蛋白优选Hep B pre S蛋白的Phl p2的1至33、8至39、34至65或66至96位氨基酸或其序列变体组成。
本发明的又一优选的实施方案为缺乏T细胞表位的经截短的Phl p6分子，其由融合至病毒载体蛋白优选Hep B pre S蛋白的Phl p6的23至54、56至90、73至114或95至127位氨基酸或其序列变体组成。
本发明的再一优选的实施方案指缺乏T细胞表位的经截短的Bet v1分子，其由Bet v1的30至59、50至79、75至104、30至74或60至104位氨基酸组成。
本发明的又一优选的实施方案为缺乏T细胞表位的经截短的猫尾草（Phleumpratense）分子的组合或混合物，猫尾草分子融合至病毒载体蛋白，优选如上所述的Hep B pre S蛋白。
本发明的优选的实施方案为缺乏T细胞表位的经截短的猫尾草分子的组合或混合物，其由来自如上所述经截短的Phl p1、Phl p2、Phl p5、和Phl p6这样的融合蛋白的各1个（one each）组成。
本发明的另一个方面涉及源自Fel d1（Genbank Nr.X62477和X62478）的低变应原性分子，其具有C和/或N端截短并缺少IgE结合能力。
对动物的过敏症影响多达40%的过敏性患者。在驯养环境中，对最受欢迎的宠物如猫和狗的过敏症特别占主导并与常年症状相关。动物变应原存在于皮屑、上皮、唾液、血清或尿液中。可通过直接的皮肤接触或通过吸入携带变应原的颗粒而暴露于变应原。已表明主要猫和狗变应原普遍存在，甚至可在未拥有宠物的家庭和公共场所例如学校被检测到。这是由于工业化国家养宠物的数目高并在增长（大约50%），以及得以带走并传播的变应原的高度稳定性。
Fel d1被鉴定为主要猫变应原，其为多于90%的猫过敏性患者所识别。Fel d1代表生物功能未知的38kDa的酸性糖蛋白。它由两个相同的非共价连接的异二聚物组成，所述异二聚物又由两个反平行的由3个二硫键连接的多肽链组成。链1和链2在不同的基因上编码，每个由3个外显子组成。已经作为链2至链1融合蛋白而表达在大肠杆菌（E.coli）中产生重组Fel d1（rFel d1）。这个重组Fel d1能够完全模拟野生型变应原的免疫特性。
源自主要猫变应原Fel d1以及缺少IgE结合能力的肽适合于例如免疫疗法和预防性的过敏症接种。Fel d1衍生的合成肽，如Phl p5和本文公开的变应原衍生的肽能够诱导IgG反应，即产生所谓的“阻断抗体”或“保护性抗体”。这些抗体防止IgE与变应原Fel d1的结合。因此可实现显著性降低过敏性症状。
根据本发明的优选实施方案，经截短的分子表现出减少的T细胞反应性。
为了避免或显著较少延迟的副作用，Fel d1衍生的低变应原性分子显示出如本发明所限定的减少的T细胞反应性。
优选地，经截短的Fel d1由Fel d1的链1的1至34或35至70位氨基酸，Fel d1的链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸或其序列变体组成。
本发明的另1个方面涉及低变应原性分子，其由下列氨基酸组成或包含下列氨基酸：Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸，Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸，Der p21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，Der p23的1至32、15至48或32至70、32至60、52至84、32至70(Cys->Ser)位氨基酸，Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸，Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸，Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸，Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸，Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸，Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸，Amb a1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350或356至396位氨基酸，Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸，Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
生产融合蛋白的方法在本领域中是公知的，可见于标准分子生物学参考例如Sambrook等人（Molecular Cloning,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）和Ausubel等人（Short Protocols inMolecular Biology,第3版;Wiley and Sons,1995）。通常，通过首先构建融合基因，再将其插入到合适的表达载体中，然后用所述表达载体转染合适的宿主细胞以生产融合蛋白。通常，通过一系列限制性酶消化和连接反应，其导致产生所需的并入至质粒中的序列，以产生重组融合构建物。如果不能得到合适的限制性位点，则可使用本领域技术人员已知的和以上所列参考中所描述的合成寡聚核苷酸接头或连接子。编码变应原和天然蛋白的多聚核苷酸序列可在被插入到合适的载体之前被组装，或者编码变应原的序列可被插入到编码载体中已经存在的天然序列的序列附近。将序列插入到载体中应该符合读码框（in frame）以使该序列可被转录成蛋白。所需要的精确的限制性酶、连接子和/或接头以及精确的反应条件将根据所用序列和克隆载体而变化，这对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。但是，DNA构建物的组装在本领域是常规的，可由本领域技术人员容易地完成。
这是特异且出乎意料的优点，源自经截短的低变应原性的变应原分子和人乙型肝炎pre S蛋白的融合蛋白可在标准表达系统中重复表达，以及在本领域技术人员所公知的标准表达系统中，最特别为通过使用大肠杆菌作为表达系统，容易地通过过程以高产量重复生产制造所述融合蛋白。这样的生产方法通常包括，通过在生物反应器中培养细胞（例如，在发酵罐、摇瓶中），随后进行细胞收集（例如，通过过滤、离心等）和破裂细胞（例如，通过高压匀浆、超声、冻/融循环、酶法或化学细胞裂解等），分子纯化（例如，通过色谱、过滤、沉淀、超滤法/透析过滤法（ultra/diafiltration）等）以及最终产物制剂表达根据本发明的分子。为获得高产量的根据本发明的分子，优选地通过使用补料分批发酵，采用高细胞密度培养方法。
本发明的另一方面涉及编码根据本发明的低变应原性分子和融合蛋白的核酸分子。
本发明的核酸分子可用于例如重组地生产所述分子。
根据本发明的另一方面，所述核酸分子可包含于载体中。
这种载体优选为表达载体。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明，但是，其并不限制本发明。
附图说明
图1A表示载体HBV_Phlpl_4xP5的示意图。
图1B表示载体HBV_Phlp2_4xP3的示意图。
图1C表示载体HBV_Phlp5_V2的示意图。
图1D表示载体HBV_Phlp6_4xPl的示意图。
图2A表示融合蛋白HBV_PhlPl_4xP5的一级序列(BM321,序列ID Nr.14)。
图2B表示融合蛋白HBV_Phlp2_4xP3的一级序列(BM322,序列ID Nr.15)。
图2C表示融合蛋白HBV_Phlp5_V2的一级序列(BM325,序列ID Nr.16)。
图2D表示融合蛋白HBV_Phlp6_4xPl的一级序列(B326,序列ID Nr.17)。
图2E表示融合蛋白HBV_Betvl_4PA的一级序列(BM31a,序列ID Nr.18)。
图2F表示融合蛋白HBV_Betvl_2PA2PB的一级序列(BM31,序列ID Nr.19)。
图2G表示融合蛋白HBV_Phlp5_Vl的一级序列(序列ID No.20)。
图3A表示考马斯蓝染色的含有纯化的融合蛋白HBV_Phlpl_4xP5的12%SDSPage凝胶(BM321,泳道1和10:5ug分子标志物,泳道2、3、11和12：5ug BM321,泳道4和13：2ug BM321,泳道5和14：1ug BM321,泳道6和15：0.5ug BM321,泳道7和16：0.25ug BM321,泳道8和17：0.1ug BM321,泳道9和18：0.05ugBM321)。泳道1至9在还原条件下，泳道10-18在非还原条件下。
图3B表示考马斯蓝染色的含有纯化的融合蛋白HBV_Phlp2_4xP3的12%SDSPage凝胶(BM322,泳道1和10:5ug分子标志物,泳道2、3、11和12：5ug BM322,泳道4和13：2ug BM322,泳道5和14：1ug BM322,泳道6和15：0.5ug BM322,泳道7和16：0.25ug BM322,泳道8和17：0.1ug BM322,泳道9和18：0.05ugBM322)。泳道1至9在还原条件下，泳道10-18在非还原条件下。
图3C表示考马斯蓝染色的含有纯化的融合蛋白HBV_Phlp5_V2的12%SDSPage凝胶(BM325,泳道1和10:5ug分子标志物,泳道2,3,11和12：5ug BM325,泳道4和13：2ug BM325,泳道5和14：1ug BM325,泳道6和15：0.5ug BM325,泳道7和16：0.25ug BM325,泳道8和17：0.1ug BM325,泳道9和18：0.05ugBM325)。泳道1至9在还原条件下，泳道10-18在非还原条件下。
图3D表示考马斯蓝染色的含有纯化的融合蛋白HBV_Phlp6_4xP1的12%SDSPage凝胶(BM326,泳道1和10:5ug分子标志物,泳道2,3,11和12：5ug BM326,泳道4和13：2ug BM326,泳道5和14：1ug BM326,泳道6和15：0.5ug BM326,泳道7和16：0.25ug BM326,泳道8和17：0.1ug BM326,泳道9和18：0.05ugBM326)。泳道1至9在还原条件下，泳道10-18在非还原条件下。
图4证明了源自草花粉变应原的融合肽缺少IgE反应性。通过IgE斑点印迹分析测试了与完整的变应原相比的融合蛋白的IgE结合。来自指定数目的草花粉过敏症患者的血清与斑点蛋白孵育，使用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。对于四个肽-载体融合蛋白的任何一个没有检测到IgE结合，a）表示来自使用HBV_Phlpl_4XP5(BM321)的斑点印迹分析的结果；b）表示来自使用HBV_Phlp2_4xP3(BM322)的斑点印迹分析的结果；c）表示来自使用HBV_Phlp5_V2(BM325)的斑点印迹分析的结果；d）表示来自使用HBV_Phlp6_4xPl(BM326)的斑点印迹分析的结果。
图5表示草花粉变应原衍生的融合蛋白HBV_Phlpl_4xP5(BM321)的低变应原活性，如通过在过敏症患者的嗜碱细胞上CD203c的表达所确定的。来自草花粉过敏症患者的PBMC与系列稀释的Phl p1（浅灰色条）或BM321（深灰色条）孵育。CD203c的诱导测量为平均荧光强度，计算的刺激指数在y轴表示。
图6表示草花粉变应原衍生的融合蛋白HBV_Phlp6_4xPl(BM326)的低变应原活性，如通过在过敏症患者的嗜碱细胞上CD203c的表达所确定的。来自草花粉过敏症患者的PBMC与系列稀释的Phl p6（浅灰色条）或BM326（深灰色条）孵育。CD203c的诱导测量为平均荧光强度，计算的刺激指数在y轴表示。
图7表示小鼠中牧草花粉变应原特异性IgG1反应。在研究的第0周和第3周用20ug融合蛋白（单一融合蛋白和4种融合蛋白的组合）和10μg每种野生型变应原（Phl p1和5）或5μg每种野生型变应原（Phl p2和6）免疫4只小鼠的组，随后在研究的第17周加强免疫。在动物的背部区域皮下施用抗原。在研究的第0、3、6、9、12、17、20和22周从小鼠尾静脉收集血液。在用免疫研究周中，在免疫前一天收集血液。通过EILSA研究小鼠免疫血清中变应原特异性IgG1的存在。在第一次免疫之前所有动物中的前免疫血清是阴性的。比较单个融合蛋白与融合蛋白混合物的应用。
a）HBV_Phlpl_4xP5(BM321作为单一组分)、在与BM322、BM325和BM326的混合物中的BM321和rPhl p1免疫的小鼠对rPhl p1抗原的免疫反应。
b）HBV_Phlp2_4xP3(BM321作为单一组分)、在与BM321、BM325和BM326的混合物中的BM322和rPhl p2免疫的小鼠对rPhl p2抗原的免疫反应。
c）HBV_Phlp5_V2(BM325作为单一组分)、在与BM321、BM322和BM326的混合物中的BM325和rPhl p5免疫的小鼠对rPhl p5抗原的免疫反应。
d）HBV_Phlp6_4xPl(BM326作为单一组分)、在与BM321、BM322和BM325的混合物中的BM326和rPhl p6免疫的小鼠对rPhl p6抗原的免疫反应。
图8表示重组融合蛋白的分子和免疫特征。A、表示具有Bet v1衍生肽的四种PreS融合蛋白（泳道1：2xPA-PreS,泳道2:2xPB-PreS,泳道3:4xPA-PreS,泳道4:2xPA2xPB-PreS）和载体PreS（泳道5）的考马斯染色的SDS-PAGE。B、用兔抗PreS血清（泳道1），兔免疫前血清（泳道3）兔抗体的缓冲液对照（泳道3）和抗Bet v1衍生肽P2’的单克隆抗体（mAb2）（泳道4）和抗P4’的单克隆抗体(mAbl2)（泳道5）和单克隆小鼠抗体的缓冲液对照（泳道6）探针杂交硝酸纤维素斑点的重组融合蛋白和PreS。
图9A表示rBet v1以及PreS和Bet v1衍生肽的重组融合蛋白的IgE反应性。对来自桦树花粉过敏症患者的血清、来自非过敏症对照的血清和仅缓冲液，测试其对斑点印迹的rBet v1、四种重组融合蛋白（2PA-PreS,2PB-PreS,4PA-PreS,2PA2PB-PreS）和单独的PreS的反应性。用125I标记的抗人IgE抗体检测结合的人IgE。用gamma计数器测量对应于结合的IgE的每分钟计数（cpm），并表示于Y轴。框图表示50个桦树花粉过敏症患者的结果。
图9B表示如通过CD203c上调测量的由rBet vl和四种PreS融合蛋白的嗜碱细胞激活。桦树花粉过敏症患者的血液样品暴露于渐增浓度（0.001-1μg/ml）的抗原、缓冲液对照的抗IgE（Co）。表示了一个代表性患者的结果。通过FACS分析确定了CD203c的表达，并将其表示为刺激指数（SI（y-轴））。显示了三次测量的平均值，并表明了标准偏差。
图10表示桦树花粉过敏症患者PBMC的淋巴细胞增殖反应和细胞因子的产生。用等摩尔量的rBet v1、Bet v1衍生肽PA和PB、单独的PreS、和PreS融合蛋白(即2PA-PreS,2PB-PreS,4PA-PreS,2PAPB-PreS)刺激桦树花粉过敏症患者的PBMC。表示了刺激指数（SI）（y-轴）。
（A）6个桦树花粉过敏症患者的最高浓度（5μg/孔Bet v1和等摩尔量的肽、PreS和PreS融合蛋白）的SI表示为框图，其中数值的50%在框内，在条之间没有离群值。框内的线表示中位值。
（B）表示了一个代表性患者的四个浓度(l=5μg/孔,2=2.5μg/孔,3=1.25μg/ml,4=0.63μg/孔的rBet vl和等摩尔的肽、PreS和PreS融合蛋白)的SI。
（C）测量了用2.5μg/mL rBet v1和等摩尔量的肽PA和PB、PreS和四种PreS融合蛋白刺激的6个桦树花粉过敏症患者PBMC上清中的细胞因子生产。用抗原刺激后观察到的浓度（pg/mL）（y-轴）表示在框图中，其中数值的50%在框内，在条之间没有离群值。框内的线表示中位值。
图11表示兔中用PreS融合蛋白皮下免疫后，对于rBet v1和Bet v1同源变应原特异性的IgG抗体的诱导。（A）用氢氧化铝吸收的（铝）（上方）或完全弗氏佐剂（CFA）吸收的（下方）的融合蛋白(2PA-PreS,2PB-PreS,4PA-PreS,2PAPB-PreS)和rBet v1免疫兔。测量对于rBet v1特异性的兔IgG，表示了不同稀释度的兔抗血清（x-轴）的一式两份测量的平均光密度（OD）值（y-轴）。
（B1）在桤木(Aln g1)、榛树(Cor a1)和苹果(Mal d1)中Bet v1和Bet v1-同源变应原的多序列比对。相同氨基酸用点表示，缺口表示为破折号。Bet v1同源变应原对Bet v1的同一性百分比在右侧表示。Bet v1衍生肽A（PA，虚线）和肽B（PB，实线）被框起来。
（B2）通过ELISA测量抗兔血清（rab α-2PA-PreS,rab α-2PB-PreS,rabα-4PA-PreS,rab α-2PAPB-PreS）对抗rBet v1、rAln g1、rCor a1和rMal d1(x-轴)的IgG抗体。表示了一式两份测量的平均值。显示了对应于兔血清中变应原特异性IgG（后）的光密度（OD）与相应的免疫前血清（前）的比较（y-轴）。
（C）通过ELISA测量用rBet v1和重组融合蛋白(2PA-PreS,2PB-PreS,4PA-PreS,2PAPB-PreS)免疫的兔对抗六种Bet v1衍生肽(P1′-P6′)的IgG抗体（x-轴）。表示了一式两份测量（y-轴）的光密度（OD）值的平均值。
图12表示与抗完整rBet v1的兔血清相比，抗过敏症患者IgE的抗2xPA2xPB-PreS兔血清的抑制。通过抑制ELISA的平均值确定用抗2xPA2xPB-PreS和抗rBet v1兔血清获得的结合至rBet v1的IgE的抑制百分比（y-轴），并用框图表示，其中值的50%在框内，并且在条之间没有离群值。框内的线表示中位值。表示了21个桦树花粉过敏症患者的结果。
图13表示用包含2或者4个拷贝Phl p6衍生肽的PreS融合蛋白免疫后产生的兔IgG滴定。用使用氢氧化铝作佐剂的不同融合蛋白免疫兔（新西兰白兔）用于免疫原性测试。在ELISA分析中监测特异抗体的诱导。结果表明含有4个肽的融合蛋白比含有2个肽的融合蛋白更具有免疫原性。
图14表示用含有4种具有SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID NO.17的低变应原融合蛋白的混合物的疫苗制剂（BM32）皮下免疫后，人草花粉过敏症后针对草花粉变应原Phl p1(A)、Phl p2(B)、Phl p5(C)和Phl p6(D)的强IgG反应的诱导。通过ELISA进行IgG确定。比较处理前（前）的IgG水平和处理后（后）的IgG水平。
图15表示在用由4种具有SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID NO.17的低变应原融合蛋白的混合物组成的疫苗制剂免疫后，在来自草花粉过敏症个体的T细胞上进行的T细胞增殖分析的结果。如果与草花粉比较，T细胞反应性强烈地降低或缺失。图的y-轴反应了刺激指数。
图16表示通过疫苗制剂（BM32）疗法诱导的IgG降低了人PBMC中对草花粉变应原的淋巴细胞增殖反应，所述疫苗制剂包含4种具有SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16和SEQ ID NO.17的低变应原融合蛋白的混合物。（a）实验的设置。（b）来自在不存在（+血清前）和存在（+血清后）治疗诱导的IgG时进行的T细胞增殖分析的结果。图的y-轴反应了刺激指数。P1-P5指来自不同研究参与者的结果。
图17表示使用包含4种具有SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID NO.17的低变应原融合蛋白混合物的疫苗制剂BM32在69个草花粉过敏症个体中进行的临床研究的设置。
图18A表示融合蛋白HBV Der p2-2xP2-2xP4的一级序列(序列ID Nr.149)。
图18B表示融合蛋白HBV Der p2-3xP2-3xP4的一级序列(序列ID Nr.150)。
图18C表示融合蛋白HBV Der p23-2xP4-2xP5的一级序列(序列ID Nr.151)。
图18D表示融合蛋白HBV Der p23-4xP6的一级序列(序列ID Nr.152)。
图19A表示用包含4种具有SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID NO.17的低变应原融合蛋白混合物的疫苗制剂BM32皮下注射3次治疗所诱导的鼻症状的改变。黑条：治疗前，灰条：治疗后。
图19B表示用疫苗制剂BM32治疗前和后，滴定皮肤点刺试验之间的平均水疱面积的改变。使用8个系列稀释的草花粉提取物（未稀释至1：128）进行滴定皮肤点刺试验。
图20表示通过IgE斑点印迹分析测试的与完整变应原比较，Der p2衍生肽的IgE结合。来自26个屋尘螨过敏症患者的血清与斑点的KLH-缀合肽孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如实施例26所示，5种肽的任何一个均没有检测到IgE结合。
具体实施方式
实施例
实施例1：HBV Phlpl_4xP5(BM321)表达质粒的构建
从合成的寡核苷酸和/或PCR产物装配合成的BM321基因，并克隆至适当的标准载体(pMK-RQkanR)。从转化的大肠杆菌K12株(DH10B-T1R)纯化质粒，并由UV光谱确定浓度。使用适当的限制性位点（在5’端的NcoI位点和在3’端的EcoRI），将最终合成的和密码子优化的BM321DNA序列进一步克隆至表达载体pET28b(+)。从转化的大肠杆菌K12DH10B(dam+dcm+)纯化质粒DNA，并由UV光谱确定浓度。通过插入物的测序证实最终的构建物。以下表明了最终表达载体″pBM-321″的质粒数据和质粒图谱的总结。
克隆至最终表达载体pET-28b(+)的BM321序列的总结。
序列 别名序列 基因大小 质粒大小 质粒名 限制性位点
BM321 HBV_Ph1p1_4xP5 882bp 6153bp pBM-321 NcoI/EcoRI
实施例2：表达质粒向用于HBV_Phlpl_4xP5(BM321)的表达宿主的转化
通过热激方法用表达质粒转化化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将转化的细胞铺板于由0.5%氯化钠、1%大豆蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.5%琼脂和50μg/mL卡那霉素组成的LB琼脂板进行选择。通过37℃下过夜培养使LB板上的细胞生长。分离转化的BL21(DE3)大肠杆菌细胞的单个克隆，在LB介质中培养，并筛选BM321的生长和表达。选择表现最佳的克隆用于进一步的主细胞库建立。
实施例3：HBV Phlpl_4xP5(BM321)的主细胞库的制备
选定克隆的等分用于150mL培养基的接种（组成：0.5%氯化钠，1%大豆蛋白胨，0.5%酵母提取物，50μg/mL卡那霉素）。在37℃下在200rpm连续搅拌下孵育主细胞库（MCB）培养物，直至培养物到达光密度OD600=1-2。加入甘油，以得到15%v/v的最终甘油浓度，将MCB分装到1mL小瓶中并存储在-75±10℃的超低温冰箱中。
实施例4：HBV PhlP1_4xP5（BM321）的高细胞密度的补料分批发酵
合成的培养基（100mL，pH=6.8，盐和微量元素，10g/L葡萄糖作为碳源）上接种1mL主细胞库（大肠杆菌BL21（DE3）/pBM321），并培养在摇瓶中（37℃，200rpm），直到光密度目标值达到OD=1。22L不锈钢发酵罐用于执行补料分批发酵。为了自动和可再现的补料控制，程序化配方以允许预先定义的特定生长速率、补料速率、分批阶段（phase）的持续时间和指数补料阶段的持续时间。为了提高发酵罐的氧气传输率，控制背压并将其设置为1bar。发酵罐连同如上所述的合成培养基进行原位灭菌，通过接种预培养物开始发酵。葡萄糖耗尽后，开始指数补料阶段，以维持特定生长速率μ=0.25h-1。在OD=45时，通过一次性添加IPTG（0.8mM的最终浓度）诱导重组BM321的表达。在OD600=73时收获培养物。从补料分批发酵获得的BM321产物的滴度为1.2g每L培养肉汤。之后，将细菌培养肉汤冷却至≤20℃，并在4℃下以7000rpm（5,500g）进行15分钟的离心。湿的细胞生物质进行等分并贮存于-75℃。
实施例5：细胞破碎和澄清
为了细胞破碎，融化来自于实施例6的748克生物质，分成125克的等份，并在室温下机械搅拌30分钟，再悬浮于匀浆化缓冲液（20mM Tris，1mM EDTA，0.1%Triton X-100，pH11.0）。为了细胞破碎，使用通过-75℃冷冻以及随后的融化的冷冻/融化程序，随后通过机械匀浆化。将匀浆的pH调节至pH=10.0。对粗细胞匀浆进行在7,000rpm（5,500g）、在4℃下持续30分钟的离心步骤。在机械搅拌下将上清用PEI（聚乙烯亚胺）进行沉淀。通过随后的离心步骤分离不溶物。将澄清的上清进行以下的色谱步骤。
实施例6：HBV Phlpl_4xP5(BM321)的色谱纯化
将总体1840mL的来自如实施例7所述的澄清步骤的PEI沉淀上清，加样至5x30cm Q-琼脂糖FF柱，用缓冲液A(TrisHCl,EDTA)平衡。通过用缓冲液A冲洗去除未结合的物质，然后用缓冲液C（1磷酸钠，EDTA，pH7.0）冲洗。通过用BM32缓冲液C中的0-100%BM32缓冲液E(磷酸钠,EDTA,NaCl pH7.0)的线性梯度洗脱完成产物馏分的洗脱。根据SDS-PAGE分析，通过馏分纯度的密度计评估以及通过产物带强度，进行含产物馏分的选择以便合并。
通过加入2.5M氯化钠，将来自捕获步骤的合并馏分调整至电导115mS/cm，并将该给料（feedstock）加样至用缓冲液D(磷酸钠,EDTA,NaCl pH7.0)平衡的丙基琼脂糖HP柱上。通过用缓冲液D冲洗去除未结合的物质。通过用缓冲液D中的40-100%缓冲液C(磷酸钠,EDTA,pH7.0)的梯度洗脱完成产物馏分的洗脱。根据SDS-PAGE分析，通过馏分纯度的密度计评估以及通过产物带强度，进行含产物馏分的选择以便合并。
通过加入2.5M氯化钠将来自中间步骤的合并馏分调整至电导80mS/cm，将该给料加样至用混合物缓冲液F(磷酸钠，EDTA,NaCl pH7.0)平衡的ToyopearlButyl650-S柱上。通过用缓冲液C中的80-0%BM32缓冲液F(磷酸钠,EDTA,pH7.0)的梯度冲洗去除未结合的物质。通过缓冲液C中的从0-1缓冲液G(磷酸钠,EDTA,异丙醇，pH7.0)的梯度洗脱完成馏分的洗脱。根据SDS-PAGE分析，通过馏分纯度的密度计评估以及通过产物带强度进行含产物馏分的选择以便合并。
实施例7：HBV_Phlp2_4xP3(BM322)、HBV_Phlp5_V2(BM325)和 HBV_Phlp6_4xP1(BM326)的生产：
为了表达和生产根据本发明的重组分子，即，HBV_Phlp2_4xP3(BM322)、HBV_Phlp5_V2(BM325)和HBV_Phlp6_4xPl(BM326)，应用了与实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和实施例6所描述的方法和程序相同的、相似的及可比的方法和程序。
实施例8：由HBV_PhlP1_4xP5(BM321)、HBV_PhlP2_4xP3(BM322)、 HBV_PhlP5_V2(BM325)和HBV_PhlP6_4xP1(BM326)混合物组成的可注射制剂的 制备
将每一种重组纯化蛋白溶解于含有0.9%氯化钠和2mM磷酸钠的等渗缓冲液中，并向每种蛋白溶液中加入适量氢氧化铝。制备含有等同部分的四种获得的混悬液的混合物，在无菌条件下分装到密封小瓶中。通过该程序获得的可注射制剂含有0.4mg/mL每种HBV_PhlPl_4xP5、HBV_PhlP2_4xP3、HBV_PhlP5_V2和HBV_PhlP6_4xPl。
实施例9：his-标签的HBV_Bety1_4xPA的制备
通过ATG:生物合成,Merzhausen,Germany合成编码由在N和C端与Bet v1衍生肽PA融合两次的PreS（即，4PA-PreS)组成的融合蛋白的基因，并将其插入载体pET-17b(Novagen,Germany)的Ndel/XhoI位点。通过两条DNA链的自动测序(Microsynth,Balgach,Switzerland)的方法确认DNA序列。
在大肠杆菌株BL21(DE3;Stratagene,La Jolla,CA)中表达融合蛋白。在含有50μg/mL卡那霉素的Luria Bertani介质中生长细胞，至OD为0.6。通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mmol/L在37℃下过夜诱导蛋白表达。以3500rpm离心10分钟收获细胞。主要在包涵体馏分中检测到蛋白产物。将其溶解于6M GuHCl、l00mM NaH2PO4、l0mM TRIS,pH8.0，过夜。以14000g离心匀浆18分钟。上清与2mL预先平衡的Ni-NTA树脂孵育4小时(Qiagen,Hilden,Germany)，而后将混悬液加样至柱，用2倍柱体积的冲洗缓冲液(8mol/L尿素,100mmol/L NaH2PO4,和10mmol/LTris-HCl[pH=6.1])冲洗，并用相同的缓冲液(pH=3.5)洗脱。将纯化的蛋白对水透析。
在还原条件下通过考马斯染色的SDS-PAGE(12.5%)分析重组蛋白的纯度。
使用特异于Bet v1衍生肽P2′(mAb2)和P4′(mAbl2)的单克隆抗体和PreS特异性兔抗体以及相应的兔免疫前IgG，通过斑点印迹的方法确认融合蛋白的鉴定。将1μg PreS融合蛋白、PreS和HSA（对照）固定于硝酸纤维素上，与单克隆以及1：1000稀释的兔血清在4℃下孵育。使用碘125标记的兔抗小鼠IgG(mAb2,mAbl2)或1：500稀释的125I山羊抗兔IgG（兔抗PreS，兔免疫前）(Perkin-Elmer,Waltham,Massachusetts)持续2小时检测结合的抗体，用放射性自显影使其可视化。而且，用稀释于0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH9.6中的2μg PreS融合蛋白和PreS包被ELISA板(Maxisorp,Nunc,Denmark)，用含有0.05%vol/vol Tween20(PBST)的PBS冲洗3次，并用1%BSA-PBST封闭2小时。随后将板与mAb2、mAbl2、抗PreS兔血清和以1:5000(稀释缓冲液:PBST中0.5%wt/vol BSA)稀释的兔抗Bet v1抗体在4℃过夜孵育。冲洗5次后，用HRP标记的绵羊抗小鼠抗体(对于mAb2,mAbl2)或HRP标记的驴抗兔抗体（兔血清）(两者均来自GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来检测结合的IgG抗体，以及进行显色反应。
实施例10his标签的HBV_Bety1_2xPA2xPB(BM31)的制备
通过GenScript Piscataway,NJ,USA,2PAPB-Pres)合成编码由在N和C端与Betv1衍生肽融合两次的PreS（2xPA2xPB-PreS)组成的融合蛋白的基因，并将其插入载体pET-17b(Novagen,Germany)的Ndel/XhoI位点。通过两条DNA链的自动测序(Microsynth,Switzerland)的方法确认DNA序列。
在大肠杆菌株BL21(DE3;Stratagene,CA)中表达重组PreS融合蛋白。在含有50μg/mL卡那霉素的Luria Bertani介质中生长细胞，至OD为0.6。通过加入异丙基-β--D-硫代半乳糖苷至终浓度1mmol/L在37℃下过夜诱导蛋白表达。以3500rpm离心10分钟收获细胞。主要在包涵体馏分中检测到蛋白。将得到的蛋白溶解于6M GuHCl、l00mM NaH2PO4、l0mM TRIS,pH8.0，过夜。以14000g离心匀浆18分钟。其上清与2mL预先平衡的Ni-NTA树脂孵育4小时(Qiagen,Hilden,Germany)，而后将混悬液加样至柱，用2倍柱体积的冲洗缓冲液(8mol/L尿素,100mmol/L NaH2PO4,和10mmol/LTris-HCl[pH=6.1])冲洗，并用相同的缓冲液(pH=3.5)洗脱。将蛋白质对l0mM NaH2PO4透析。
在还原条件下通过考马斯染色的SDS-PAGE(12.5%)分析重组蛋白质的纯度。使用特异于Bet v1衍生肽P2′(mAb2)和P4′(mAbl2)的单克隆抗体和PreS特异性兔抗体以及相应的兔免疫前IgG，通过斑点印迹的方法确认融合蛋白的鉴定。将1μgPreS融合蛋白、PreS和HSA（对照）固定于硝酸纤维素上，与单克隆以及1：1000稀释的兔血清在4℃下孵育。使用碘125标记的兔抗小鼠IgG(mAb2,mAbl2)或1：500稀释的125I山羊抗兔IgG（兔抗PreS，兔免疫前）(Perkin-Elmer,Waltham,Massachusetts)持续2小时检测结合的抗体，用放射性自显影使其可视化。而且，用稀释于0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH9.6中的2μg PreS融合蛋白和PreS包被ELISA板(Maxisorp,Nunc,Rosklide，Denmark)，用含有0.05%vol/vol Tween20(PBST)的PBS冲洗3次，并用1%BSA-PBST封闭2小时。随后将板与mAb2、mAbl2、抗PreS兔血清和以1:5000(稀释缓冲液:PBST中0.5%wt/vol BSA)稀释的兔抗Bet v1抗体在4℃过夜孵育。冲洗5次后，用HRP标记的绵羊抗小鼠抗体(对于mAb2,mAbl2)或HRP标记的驴抗兔抗体（兔血清）(两者均来自GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来检测结合的IgG抗体，以及进行显色反应。
实施例11：融合蛋白HBV Phlp1_4xP5(BM321)的IgE反应性的检测
通过IgE斑点印迹分析测试与完整变应原相比的IgE结合。来自草花粉过敏症患者的血清与斑点的蛋白孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如图4A所示对于HBV_Phlpl_4xP5(BM321)没有检测到IgE结合。
实施例12：融合蛋白HBV_Phlp2_4xP3(BM322)的IgE反应性的检测
通过IgE斑点印迹分析测试与完整变应原相比的IgE结合。来自草花粉过敏症患者的血清与斑点的蛋白孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如图4B所示对于HBV_Phlp2_4xP3(BM321)没有检测到IgE结合。
实施例13：融合蛋白HBV_Phlp5_V2(BM325)的IgE反应性的检测
通过IgE斑点印迹分析测试与完整变应原相比的IgE结合。来自草花粉过敏症患者的血清与斑点的蛋白孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如图4C所示对于HBV_Phlp5_V2(BM325)没有检测到IgE结合。
实施例14：融合蛋白HBV_Phlp6_4xP1(BM326)的IgE反应性的检测
通过IgE斑点印迹分析测试与完整变应原相比IgE的结合。来自草花粉过敏症患者的血清与斑点的蛋白孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如图4D所示对于HBV_Phlpl_4xPl(BM326)没有检测到IgE结合。
实施例15：融合蛋白HBV_etV1_4xPA和HBV_Betv1_2xPA2xPB(BM31)的IgE 反应性的检测
通过IgE斑点印迹分析测试与完整变应原相比的IgE结合。来自草花粉过敏症患者的血清与斑点的蛋白孵育，用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如图5所示对于两种融合蛋白均没有检测到IgE结合。
实施例16：兔抗r89P5抗体阻断患者IgE结合至rPhl p1
为了确定肽诱导的兔Ig抑制过敏症患者IgE抗体与rPhl p1结合的能力，用1μg/ml rPhl p1包被ELISA板，冲洗并封闭。用1：100稀释的兔抗肽(HBV_Phlpl_4xP5,KLHP5)、兔抗rPhl p1，以及用于对照目的的相应的免疫前血清，预孵育板。冲洗后，用来自Phl p1过敏症患者的人血清（1：3稀释）孵育板，用小鼠抗人IgE(Pharmingen1:1000)以及随后用偶联POX的绵羊抗小鼠IgG(Amersham Bioscience)1：2000检测结合的IgE。通过用抗肽抗血清预孵育实现的IgE结合的抑制百分比如下计算：100-ODi/ODp x100。
ODi和ODp分别代表用兔免疫和免疫前血清预孵育后的消减。表1表示抗Phlp1肽抗体抑制13位过敏症患者IgE结合至完整rPhl p1的能力。抗融合蛋白血清，以与抗rPhl pl和KLHP5血清相同程度，阻断了IgE结合。表2表示了所有13位患者的抑制（以%）。
表1：用兔抗rPhl p1、抗HBV_Phlp l_4xP5和抗KLHP5抗血清孵育后13位患者的IgE结合至rPhl p1的抑制%。
Figure BDA0000432825670000571
实施例17：兔抗HBV_Phlp2_4xP3抗体阻断患者IgE结合至rPhl p2
为了确定肽诱导的兔Ig抑制过敏症患者IgE抗体与rPhl p2结合的能力，用1μg/ml rPhl p2包被ELISA板，冲洗并封闭。用1：100稀释的兔抗肽(HBV_Phlp2_4xP3,KLHP3)、兔抗rPhl p2，以及用于对照目的的相应的免疫前血清，预孵育板。冲洗后，用来自Phl p2过敏症患者的人血清（1：3稀释）孵育板，用小鼠抗人IgE(Pharmingen1:1000)以及随后用偶联POX的绵羊抗小鼠IgG(Amersham Bioscience)1：2000检测结合的IgE。通过用抗肽抗血清预孵育实现的IgE结合的抑制百分比如下计算：100-ODi/ODp x100。
ODi和ODp分别代表用兔免疫和免疫前血清预孵育后的消减。表2表示抗Phlp2肽抗体抑制19位过敏症患者IgE结合至完整rPhl p2的能力。抗融合蛋白血清，以与抗rPhl p2和KLHP3血清相同程度，阻断了IgE结合。表2表示了所有19位患者的抑制（以%）。
表2：用兔抗rPhl p1、抗HBV_Phl p2_4xP3和抗KLHP3抗血清孵育后19位患者的IgE结合至rPhl p2的抑制%。
Figure BDA0000432825670000581
实施例18：兔抗HBV_Phlp5_V2抗体阻断患者IgE结合至rPhl p5
为了确定肽诱导的兔Ig抑制过敏症患者IgE抗体与rPhl p5结合的能力，用1μg/ml rPhl p5包被ELISA板，冲洗并封闭。用1：100稀释的兔抗肽(HBV_Phlp2_V2)、兔抗rPhl p5，以及用于对照目的的相应的免疫前血清，预孵育板。冲洗后，用来自Phl p5过敏症患者的人血清（1：3稀释）孵育板，用小鼠抗人IgE(Pharmingen1:1000)以及随后用偶联POX的绵羊抗小鼠IgG(AmershamBioscience)1：2000检测结合的IgE。通过用抗肽抗血清预孵育实现的IgE结合的抑制百分比如下计算：100-ODi/ODp x100。
ODi和ODp分别代表用兔免疫和免疫前血清预孵育后的消减。表3表示抗Phlp5肽抗体抑制16位过敏症患者IgE结合至完整rPhl p5的能力。抗融合蛋白血清，以与抗rPhl p5血清相同程度，并比KLH肽混合物更好地，阻断了IgE结合。表3表示了所有16位患者的抑制（以%）。
表3：用兔抗rPhlp1、抗HBV_Phlp5_V2和抗KLH肽混合物抗血清孵育后13位患者的IgE结合至rPhl p5的抑制%。
％抑制
患者 rPhlp5 HBV_Phlp5_V2 KLHP混合
1 99.00 96.69 91.74
2 94.57 94.15 68.42
3 98.98 95.88 85.74
4 97.39 88.38 80.23
5 98.95 93.74 62.33
6 98.52 93.36 78.82
9 97.22 91.35 79.94
8 96.02 89.70 80.14
9 97.09 88.48 61.11
％抑制
患者 rPhlp5 HVB_Phlp5_V2 KLHP混合
10 99.30 84.03 92.92
11 99.50 94.09 86.46
12 95.45 88.97 81.31
13 96.22 93.34 60.87
14 90.86 94.80 83.02
15 98.45 94.15 83.60
16 94.68 92.46 91.77
平均值 97.01 92.10 79.28
实施例19：兔抗HBV_Phlp6_4xP1抗体阻断患者IgE结合至rPhl p6
为了确定肽诱导的兔Ig抑制过敏症患者IgE抗体与rPhl p6结合的能力，用1μg/ml rPhl p6包被ELISA板，冲洗并封闭。用稀释的兔抗肽(HBV_Phlp6_4xPl,KLHP1)、兔抗rPhl p6，以及用于对照目的的相应的免疫前血清，预孵育板。冲洗后，用来自Phl p6过敏症患者的人血清（1：3稀释）孵育板，用小鼠抗人IgE(Pharmingen1:1000)以及随后用偶联POX的绵羊抗小鼠IgG(AmershamBioscience)1：2000检测结合的IgE。通过用抗肽抗血清预孵育实现的IgE结合的抑制百分比如下计算：100-ODi/ODp x100。ODi和ODp分别代表用兔免疫和免疫前血清预孵育后的消减。表4表示抗Phl p6肽抗体抑制21位过敏症患者IgE结合至完整rPhl p6的能力。抗融合蛋白血清，以与抗rPhl p6和KLHP1血清相同程度地，阻断了IgE结合。表4表示了所有21位患者的抑制（以%）。
表4：用兔抗rPhl p6、抗HBV_Phlp6_4xPl和抗KLHP1抗血清孵育后21位患者的IgE结合至rPhl p6的抑制%。
Figure BDA0000432825670000601
实施例20：通过斑点印迹和ELISA确定PreS融合蛋白的IgE反应性
由基于RAST、非变性的斑点印迹分析测试纯化的rBet v1、重组融合蛋白4xPA-PreS,2xPA2xPB-PreS的IgE反应性。2μg纯化的蛋白和用于对照目的的HSA斑点点样至硝酸纤维素膜条带(Schleicher&Schuell,Dassel,Germany)。
在缓冲液A(Vrtala,J Clin Invest,1997)中封闭硝酸纤维素条带，并用与1:10稀释的来自桦树花粉过敏症患者(n=50)的血清、来自非过敏症人(n=3)的血清、缓冲液对照和阳性对照(1:1000稀释的兔抗rBet v1抗血清)孵育。用125I标记的抗人IgE抗体(BSM Diagnostica,Vienna,Austria)检测结合的IgE抗体，用125I标记的山羊抗兔抗血清(Perkin-Elmer)检测结合的兔抗体，并用放射性自显影(Valenta等人1992)使其可视化。另外，用rBet v1和纯化的PreS融合蛋白(5μg/mL)包被ELISA板。如上所述冲洗和封闭后，用1:5稀释的桦树花粉过敏症患者(n=21)的血清和三个非过敏症对照血清孵育板。通过1:1000稀释的纯化的小鼠抗人IgE(BDPharmingen)过夜检测结合的IgE，并用1:2000稀释的HRP标记的绵羊抗小鼠IgG(GE Healthcare)可视化。冲洗后，如上所述确定显色反应。
实施例21：变应原诱导的过敏症患者嗜碱细胞的CD203c的上调
肝素化血液样品获得自取得知情同意后的桦树过敏症患者，并将其与范围从0.001至1mg/mL递增浓度的rBet v1、4PA-PreS、2PAPB-PreS，作为阳性对照的单克隆抗体抗IgE抗体(Immunotech,Marseille,France)，或者PBS（阴性对照）孵育15分钟(37℃)。如上所述测定CD203c的表达。
实施例22：来自桦树花粉过敏症患者的PBMC中淋巴细胞增殖反应和细胞因 子诱导
通过Ficoll(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)密度梯度离心分离来自桦树花粉过敏症患者(n=6)的PBMC。随后将PBMC再悬浮于AIM V介质(LifeTechnologies,Grand Island,NY)至终浓度2x105个细胞/孔，并用递减抗原剂量(等摩尔量的5μg/孔rBet v1、PA、PB、PreS、2PA-PreS、2PB-PreS、4PA-PreS、2PAPB-PreS)、用仅仅介质（阴性对照）或用IL-2(4IE/孔)（阳性对照）刺激。6天后，由[3H]胸苷掺入测定增殖反应，并表示为刺激指数（SI）。
而且，根据生产商的说明书使用Bio-plex Pro Human Cytokine17-Plex Panel(Bio-Rad Laboratories)在刺激6天后测定了17种不同细胞因子(即，IL-Ιβ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IFN-γ、TNF-a、G-CSF、GM-CSF、ΜΙΡ-Ιβ、MCP-1)的细胞因子产生。简言之，将未稀释的上清与偶联至不同珠作为捕获抗体的抗细胞因子/趋化因子小鼠单克隆抗体(Bio-Rad)混合。使用8个点的标准曲线实现低端敏感性。冲洗后，加入抗细胞因子生物素化的检测抗体。通过加入链霉亲和素标记的藻红蛋白（PE）和分析缓冲液使反应可视化。在Luminex100仪器(Biosource,Nivelles,Belgium)上分析样品，使用Bio-Plex Manager6.0软件获取数据。所有样品在一个运行中分析。结果在图10中表示。
实施例23：通过ELISA分析用rBet v1和PreS融合蛋白免疫的兔血清对rBet  v1、Bet v1同源变应原和Bet v1衍生肽的识别
用1μg/ml rBet v1或桤木(rAln g1)、榛树(rCor a1)、苹果(rMal dl)中的同源变应原以及另外地用浓度为1μg/ml的几种Bet v1衍生肽在4℃下过夜包被ELISA板(Maxisorp,Nunc)。如上所述冲洗和封闭后，以范围从1:500至1:1280000的系列1:2稀释，以及以1:1000的浓度孵育兔血清，该兔用缀合至铝或CFA的rBetv1和PreS融合蛋白免疫。用HRP标记的驴抗兔抗体(GE Healthcare)检测结合的兔IgG，如上所述确定显色反应。
实施例24：过敏症患者IgE结合rBet v1的抑制
使用抑制ELISA研究桦树花粉过敏症患者IgE结合rBet v1的抑制。用浓度1μg/ml rBet v1在4℃下过夜包被ELISA板。冲洗和封闭后，用抗PreS融合蛋白2PAPB-PreS的兔血清和抗Bet v1兔血清以1:80和1:160稀释在4℃下过夜预孵育板，并与兔免疫前血清比较。另外的冲洗步骤后，加入1:5稀释的桦树花粉过敏症患者的血清在4℃下过夜，用1:1000稀释的碱性磷酸酶缀合的小鼠单克隆抗人IgE抗体(BD Pharmingen)检测结合的人IgE。如下计算用2PAPB-PreS兔抗血清和Bet v1兔抗血清预孵育后IgE结合rBet v1的抑制百分比：抑制百分比=100-(ODix100/ODp)。ODp和ODi分别代表用特异性兔IgG（ODi）或免疫前血清(ODp)预孵育后的消减（图12）。
实施例25：包含4种低变应原融合蛋白混合物的疫苗制剂用于治疗草花粉过 敏症人个体中的草花粉过敏症
如实施例8所述制备具有氢氧化铝的低变应原融合蛋白SEQ ID No.14,SEQID No.15,SEQ ID No.16和SEQ ID No.17的可注射制剂。在临床研究过程中，疫苗3次皮下施用至69位草花粉过敏症人受试者（图17）。
用疫苗制剂的接种导致强的IgG免疫反应
在用疫苗制剂3次皮下注射的治疗前和后，在从研究参与者收集的血清中通过ELISA确定3种不同剂量水平的疫苗和安慰剂皮下注射后变应原特异性IgG的诱导（图14）。
为了这一目的，用5μg/ml抗原Phl p1,Phl p2,Phl p5,和Phl p6或作为对照的人血清白蛋白（HSA）在4℃下过夜包被ELISA板(Nunc Maxisorp,Roskilde,Denmark)。用含有0.5%Tween20(PT)的PBS冲洗以及用PT中2%w/v BSA封闭后，而后用1:10至1:100稀释的来自患者的血清、来自非特应性个体的血清或单独的缓冲液一式三份在4℃下过夜孵育板。用PT,0.5%w/v BSA中稀释的HRP偶联的抗人IgE抗体检测结合的IgE抗体。通过加入染色溶液ABTS(2,2′-连氮基-双(3-乙苯噻唑啉-6-磺酸)二铵盐;Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)(100μl/孔)进行显色。使用ELISA读取器在405nm处测量光密度。IgG评估结果在图14表示。
如通过体外T细胞增殖分析确定的（图15），疫苗不激发任何对疫苗制剂中 存在的低变应原融合蛋白相关的T细胞反应性，因而证实了没有低变应原融合蛋白的T细胞反应性。
使用以下的测序进行T细胞增殖分析：通过Ficoll(Amersham PharmaciaBiotech,Little Chalfont,UK)密度梯度离心从肝素化的草花粉过敏症患者的血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后在37℃下、在5%CO2的湿润气氛中，将PBMC(2x105)一式三份培养于补充2mM L谷氨酰胺酶(SIGMA,St.Louis,MO)、50μΜb巯基乙醇(SIGMA)和0.1mg庆大霉素每ml(SIGMA)的200μl不含血清超培养基(BioWhittaker,Rockland,ME)的96孔板(Nunclone;Nalge Nunc International,Roskilde,Denmark)中。用含有0.25μg每种疫苗的多肽组分的混合物，为了比较用等摩尔浓度的草花粉提取物或用于对照目的每孔4U白细胞介素-2(BoehringerMannheim,Germany)，或仅使用介质，刺激细胞。培养后6天，每孔加入0.5μCi[3H]胸苷(Amersham Pharmacia Biotech)，此后16小时使用microbeta闪烁计数器(WallacADL,Freiburg,Germany)由液体闪烁计数测量掺入的放射性。从一式三份中计算平均cpm，刺激指数（SI）计算为抗原或白细胞介素-2刺激和无刺激对照获得的cpm的商。增殖分析的结果在图15中表示。
如在治疗诱导的IgG存在时用草花粉变应原刺激时降低的增殖反应所证实的（图16），用疫苗的治疗诱导了能够调节变应原特异性T细胞反应的IgG抗体。为了这一目的，使用分离自如上所述的治疗后的研究参与者的PBMC进行了T细胞增殖分析，不同的是刺激是用4种草花粉变应原Phl p1、Phl p2、Phl p5和Phlp6(每种变应原0.25μg)的混合物与收集自治疗前和后相同的参与者的血清共同进行的。试验的设置和结果如图16所示。
在接受3次含有20μg或40μg4种多肽中的每一种的注射的患者中观察到花粉室内激发诱导的鼻过敏症症状的减轻，以及通过滴定皮肤点刺试验确定的皮肤反应性的降低，然而，用剂量10μg的各多肽治疗后这些参数并没有降低（参见图19）。
实施例26：源自屋尘螨变应原Der p2的肽的选择和使用这些肽的PreS融合 蛋白的设计
关于以下方面筛选5个非IgE结合的Der p2衍生肽-Der p2Pepl(SEQ IDNo.96)、Der p2Pep2(SEQ ID No.97)、Der p2Pep3(SEQ ID No.98)、Der p2Pep4(SEQ ID No.99)和Der p2Pep5(SEQ ID No.100)：
·其IgE结合特性（斑点印迹分析）
·其诱导Der p2特异性T细胞反应的潜力，和（T细胞增殖分析）
·其诱导具有阻断人患者IgE至Der p2的能力的Der p2特异抗体的能力（使用兔抗肽IgG的抑制ELISA）。
为了该目的，将每种肽化学偶联至KLH。在该筛选实验中使用肽的KLH和化学偶联，是因为其容易使用、明确确立以及允许不同肽的初始比较的直观模型系统。
通过IgE斑点印迹分析测试了与完整变应原比较的Der p2衍生肽的IgE结合。来自26位屋尘螨过敏症患者的血清与斑点的KLH缀合肽孵育，并使用125I标记的抗人IgE检测结合的IgE。如下所示5个肽中没有任何一个检测到IgE结合。
为了鉴定在来自屋尘螨过敏症患者的PBMC中诱导低淋巴细胞增殖反应的肽，用5种单独的Der p2衍生肽、KLH缀合肽和用于比较的野生型Der p2，刺激分离自10位患者的PBMC。
用野生型Der p2刺激来自所有10位患者的PBMC，在Der p2 Pepl、Der p2 Pep2和Der p2 Pep4刺激时没有或仅有非常低的增殖。但是，用Der p2 Pep3和Der p2Pep5刺激分别导致了10位中的4位以及10位中的3位显著的PBMC增殖，表明肽3和5含有重要的T细胞表位。
为了鉴定肽诱导阻断IgG的能力，用5个个别的KLH肽缀合物免疫兔。而后，通过ELISA研究肽诱导的兔IgG抑制过敏症患者IgE抗体结合rDer p2的能力。用1μg/ml rDer p2包被ELISA板，冲洗并封闭。用1:100稀释的兔抗肽(KLH-P1,KLH-P2,KLH-P3,KLH-P4和KLH-P5)、兔抗rDer p2、以及用于对照目的相应免疫前血清，预孵育板。冲洗后，用来自屋尘螨过敏的、Der p2敏感的患者的人血清(1:3稀释)孵育板，用小鼠抗人IgE(Pharmingen1:1000)以及随后的POX偶联的绵羊抗小鼠IgG(Amersham Bioscience)1:2000检测结合的IgE。通过与抗肽抗血清预孵育实现的IgE结合的抑制百分比如下计算：100-ODi/ODP x100。
表5：抗Der p2肽抗体抑制20位过敏症患者IgE结合至完整rDer p2的抑制能力。由肽2、3和4诱导的抗KLH肽血清，以与抗野生型Der p2血清相同的程度，阻断了IgE结合。表5表示所有20位患者的抑制（以%）。
Figure BDA0000432825670000641
表6：肽选择的决定矩阵。肽2和4符合本发明肽片段的所有要求。
Figure BDA0000432825670000651
实施例27：Der p1衍生低变应原性肽的选择
使用兔抗肽KLH抗血清和来自6位屋尘螨过敏症患者的血清，在实施例26所述的抑制ELISA中确定Der p1衍生肽诱导阻断IgE的IgG抗体的能力，不同之处在于用野生型Der p1而不是Der p2包被ELISA板。
表7：抗Der p1肽抗体抑制6位过敏症患者IgE结合至完整Der p1的抑制能力。发现由肽1、2和8诱导的抗KLH肽血清，以与抗野生型Der p1血清相似的程度，阻断IgE结合。表7显示了6位患者的抑制（以%）。
Figure BDA0000432825670000652
Figure IDA0000432825720000011
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Claims (27)

1.包含至少三个肽片段的多肽，所述肽片段由融合至嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽的N和C端或所述表面多肽的至少一个片段的至少一个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于嗜肝DNA病毒科的病毒是乙型肝炎病毒。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽是PreS。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于表面多肽的至少一个片段是乙型肝炎PreS1或乙型肝炎PreS2。
5.根据权利要求1至4任一项所述的多肽，其特征在于源自至少一个野生型变应原的至少三个肽片段中的至少一个是B细胞结合肽。
6.根据权利要求1至5任一项所述的多肽，其特征在于与野生型变应原相比，至少三个肽片段表现出无或降低的IgE结合能力。
7.根据权利要求1至6任一项所述的多肽，其特征在于所述至少三个肽片段中的至少一个表现出无或基本上无T细胞反应性。
8.根据权利要求1至7任一项所述的多肽，其特征在于野生型变应原选自：主要桦树花粉变应原，特别是Bet v1、主要牧草花粉变应原，优选Ph1p1、Ph1p2、Ph1p5、Ph1p6和Ph1p7、主要屋尘螨变应原，优选Der p1、Der p2和Der p23、主要猫变应原Fel d1和Fel d2、主要蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白，特别是Ph1p12、橄榄变应原，优选Ole e1、欧蓍草变应原，优选Par j2、豚草变应原，优选Amb a1、艾蒿花粉变应原，优选Art v1、和日本雪松花粉变应原，优选Cryjl或Cryj2。
9.根据权利要求1至8任一项所述的多肽，其特征在于所述肽片段选自Phl p1的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phl p2的1至33、8至39、34至65或66至96位氨基酸，Phl p5的93至128、98至128、26至53、26至58、132至162、217至246、252至283或176至212位氨基酸、Phl p6的23至54、56至90、73至114或95至127位氨基酸、Fel d1链1的1至34或35至70位氨基酸、Fel d1链2的1至34、35至63或64至92位氨基酸、Bet v1的30至59、50至79、75至104、30至74或60至104位氨基酸、Der p1的1至30、52至84或188至222位氨基酸、Der p2的1至33、21至51、42至73、62至103或98至129位氨基酸、Der p7的1至30、20至50、50至80、90至125、125至155或165至198位氨基酸、Der p10的1-35、36-70、71-110、111-145、140-170、175-205、210-250或250-284位氨基酸、Der p21的1至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，Der p23的1至32、15至48或32至70、32至60、52至84、32至70(Cys->Ser)位氨基酸、Alt a1的19至58、59至95、91至120或121至157位氨基酸，Par j2的31至60、45至80、60至96或97至133位氨基酸、Ole e1的1至40、36至66、63至99、86至120或107至145位氨基酸、Fel d2的25至58、99至133、154至183、277至307、334至363、373至402、544至573、579至608、58至99、125至165、183至224、224至261、252至289、303至340、416至457、460至500或501至542位氨基酸、Can f2的19至58、52至91、82至119、106至144或139至180位氨基酸、Can f1的19至56、51至90、78至118、106至145或135-174位氨基酸、Art v1的27至70、70至100或92至132位氨基酸、Amb a1的31至70、80至120、125至155、160至200、225至263、264至300、305至350或356至396位氨基酸、Alt a6的1至34、35至74、74至115、125至165、174至213、241至280、294至333、361至400或401至438位氨基酸、Alt a2的1至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
10.根据权利要求1至9任一项所述的多肽，其特征在于所述嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽或其至少一个片段，包含融合至其N端的源自至少一个野生型变应原的至少两个肽片段、和融合至其C端的源自至少一个野生型变应原的至少两个肽片段。
11.根据权利要求1至10任一项所述的多肽，其特征在于所述至少三个肽的至少两个是相同的。
12.根据权利要求1至11任一项所述的多肽，其特征在于所述多肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.149、SEQ ID No.150、SEQ ID No.151和SEQ ID No.152。
13.根据权利要求1至12任一项所述的多肽，在治疗或预防人或动物过敏症中用作疫苗。
14.根据权利要求13所述的多肽，其特征在于所述多肽以0.001mg/kg体重至5mg/kg体重，优选0.003mg/kg体重至2mg/kg体重的量施用于个体。
15.根据权利要求13或14所述的多肽，其特征在于其诱导IL-10和IFN-gamma的产生。
16.根据权利要求13至15任一项所述的多肽，其特征在于其诱导聚焦于野生型变应原IgE表位的IgG反应。
17.编码根据权利要求1至12任一项所述的多肽的核酸分子。
18.包含根据权利要求17所述的核酸分子的载体。
19.根据权利要求18所述的载体，其特征在于所述载体是表达载体。
20.根据权利要求18或19所述的载体，其特征在于所述载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。
21.包含根据权利要求17所述的核酸分子或包含根据权利要求18至20任一项所述的载体的宿主。
22.疫苗制剂，其包含至少一种根据权利要求1至12任一项所述的多肽、根据权利要求17所述的核酸分子或根据权利要求18至20任一项所述的载体。
23.用于治疗或预防草花粉过敏症的疫苗制剂其包含源自草花粉变应原的低变应原性多肽的混合物，其特征在于至少一个所述多肽选自SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16和SEQ ID No.17。
24.用于治疗或预防桦树花粉过敏症的疫苗制剂，其包含至少一个选自SEQ IDNo.18或SEQ ID No.19的低变应原性多肽。
25.用于治疗或预防屋尘螨过敏症的疫苗制剂，其包含至少一个源自屋尘螨变应原的多肽，其特征在于至少一个多肽选自SEQ ID No.149、SEQ ID No.150、SEQ ID No.151和SEQ ID No.152。
26.根据权利要求22至25任一项所述的制剂，其特征在于所述制剂包含10ng至1g，优选100ng至10mg，特别地0.5μg至200μg的所述多肽、核酸分子或载体。
27.根据权利要求22至26任一项所述的制剂，其特征在于所述制剂进一步包括至少一种佐剂、药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。
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