MX2013014439A - Proteinas de fusion portadoras de peptido como vacunas para alergia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a un polipéptido que comprende por lo menos tres fragmentos de péptido que consisten de 10 a 50 residuos de aminoácido consecutivos de por lo menos un alergeno de tipo silvestre fusionados al N- y C-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN PORTADORAS DE PÉPTIDO COMO VACUNAS PARA ALERGIA La presente invención se relaciona a polipéptidos novedosos y usos de los mismos.

La alergia tipo I es una enfermedad de hipersensibilidad mediada por IgE que afecta casi 25% de la población. Esta se basa en el reconocimiento de antigenos de alérgeno y de alérgeno de contacto portados por el aire inofensivos, de insecto, de veneno, de alimentos, derivados de fuentes de antigeno inofensivas per se, tales como polen, insectos, mohos y proteínas de animales mediante la inmunoglobulina E específica. La reticulación de los anticuerpos IgE enlazados a la célula efectora conduce a una liberación de mediadores inflamatorios (por ejemplo, h-istamina, leucotrienos ) y de esta manera a los síntomas inmediatos de alergia (por ejemplo, rinoconjuntivitis, asma, dermatitis, anafilaxis) . La activación de las células T por la vía de mecanismos dependientes de IgE así como independientes de IgE contribuye a la inflamación alérgica crónica.

La probablemente única forma causativa de tratamiento de alergia es la inmunoterapia específica de alérgeno, que se basa en la administración repetida de cantidades incrementadas de extractos de alérgeno para la mayoría de las fuentes. Numerosos estudios clínicos han documentado la eficacia clínica de la inmunoterapia con inyección y hay evidencia para varios mecanismos inmunológicos que implican este tratamiento. Debido a la dificultad para preparar extractos de alérgeno de alta calidad para ciertas fuentes de alérgeno y el hecho de que la administración de alérgenos a los pacientes puede causar efectos secundarios severos, la inmunoterapia específica de alérgeno solamente se puede recomendar para ciertos grupos de pacientes y manifestaciones de enfermedad. Es especialmente difícil tratar pacientes con co-sensibilizaciones a varias fuentes de alérgeno diferentes y los pacientes que sufren de manifestaciones de enfermedad severa tal como el asma alérgico. El asma alérgico es una de las manifestaciones más vigorosas de alergia, debido a que afecta severamente la calidad de vida diaria, causa una alta tasa de admisiones hospitalarias y puede manifestarse por sí misma, en formas amenazantes de la vida, serias, que requieren cuidado intensivo del paciente.

Los extractos de alérgeno preparados a partir de fuentes de alérgeno naturales son de naturaleza cruda, y es imposible influenciar la cualidad y las cantidades de alérgenos individuales en tales preparaciones, por medios técnicos. También contienen numerosos componentes no alergénicos indefinidos, y varios estudios recientes indican la pobre calidad de tales extractos y documentan su gran heterogeneidad.

En la última década se ha hecho gran progreso en el campo de la caracterización de alérgeno molecular utilizando la tecnología de DNA recombinante. Un número grande de los alérgenos que inducen enfermedad más importantes se han caracterizado hacia abajo al nivel molecular, y los alérgenos recombinantes que imitan la complejidad de epítopo de los extractos de alérgeno naturales se han producido. Por otra parte, varios grupos de investigación han utilizado el conocimiento que considera las estructuras del alérgeno para desarrollar nuevas vacunas para alergia definidas. La ingeniería genética, la química de péptido sintético y la conjugación de alérgenos con secuencias de DNA inmunoestimulatorias se han utilizado para reducir la actividad alergénica de las nuevas vacunas y de esta manera la proporción de efectos secundarios inducidos por la terapia. Los primeros estudios clínicos prometedores se condujeron con tales derivados de alérgeno. De manera interesante, esto resulta de que aunque la reactividad de IgE de los alérgenos recombinantes genéticamente diseñados y los péptidos que contienen epítopo de célula T sintéticos derivados de alérgeno podrían ser fuertemente reducidos o aun anulados, estos derivados todavía conducen a efectos secundarios sistémicos que aparecen varias horas después de la inyección. Por ejemplo, se reportó que los péptidos de epitopo de célula T del alérgeno de gato mayor, Fel d 1, indujo asma e hiperreactividad bronquial varias horas después de la inyección intracutánea, y hay una fuerte evidencia de que este efecto es mediado por célula T y restringido por MHC.

Estos resultados indican que la remoción de la reactividad de IgE disminuye los efectos secundarios mediados por IgE puesto que se registraron reacciones inmediatas en el curso de estos estudios de inmunoterapia . Sin embargo, los epitopos de célula T específicos de alérgeno que se han preservado en los derivados de alérgeno recombinantes , asi como en las mezclas de péptidos son responsables para los efectos secundarios posteriores (por ejemplo, dermatitis muy problemática o atópica, manifestación de la piel alérgica mediada por célula T crónica) . Los efectos secundarios causados en el caso de los derivados de alérgeno recombinantes fueron relativamente leves y en el caso de las vacunas de péptido de célula T se pueden superar mediante la dosificación adecuada. Ambos de los dos nuevos procedimientos, por lo tanto, se observan muy prometedores para la inmunoterapia de la rinoconjuntivitis alérgica, pero pueden tener limitaciones cuando entra para el tratamiento de formas severas de asma alérgico, donde la inducción de los efectos secundarios posteriores en el pulmón puede ser muy problemática.

Con el fin de administrar y consecuentemente provocar una respuesta inmune eficiente contra péptidos, polipéptidos y proteínas, se utilizan regularmente adyuvantes y/o portadores. El adyuvante de Freund completo (CFA) , por ejemplo, es uno de los adyuvantes más potentes disponibles. Aún existe una necesidad por composiciones de vacuna capaces de inducir fuertes respuestas inmunes contra péptidos y polipéptidos derivados de alérgenos y del curso de otros antígenos, con o sin el uso del adyuvante de Freund completo. Además, mientras que BSA se ha utilizado exitosamente como un portador en modelos de animal este no puede ser apropiado para el uso en composiciones de vacuna humanas debido al riesgo de reacciones adversas tal como el riesgo de transmitir la enfermedad por prión (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante) . Un reto adicional al desarrollo de una vacuna efectiva contra alérgenos es la necesidad por una respuesta inmune capaz de disminuir rápidamente los alérgenos en un individuo o animal. Por lo tanto, altas concentraciones de anticuerpos específicos de alérgeno en la sangre, que son principalmente del subtipo IgG, son necesarias. En las superficies de la mucosa los anticuerpos IgA también son importantes.

La toxina del cólera, una proteína portadora conocida en la técnica, también se utiliza regularmente como un adyuvante. Sin embargo, la toxina de cólera incrementa los niveles de anticuerpo IgE totales y específicos y conduce a reacciones inflamatorias asociadas con IgE.

Debido a los efectos secundarios provocados por la mayoría de proteínas portadoras utilizadas para vacunación, aún existe una necesidad por sistemas portadores que sean capaces de estimular las respuestas inmunes contra alérgenos u otros antígenos, sin utilizar adyuvantes tóxicos, sin utilizar proteínas portadoras pobremente toleradas y, en ciertas situaciones, sin estimulación de respuestas inmunes potencialmente patológicas. Los sistemas portadores novedosos que cumplen estas especificaciones se pueden utilizar hacia la formación de conjugados novedosos y composiciones adecuadas para el tratamiento o prevención de enfermedades similares a enfermedades alérgicas.

En Bohle B. y colaboradores (J. Immunol. 172 (11) (2004 ): 6642-6648 ) se describe una proteína de fusión recombinante que comprende una porción de proteína de capa S y la porción Bet v 1. Esta molécula comprende el alérgeno Bet v 1 nativo que incluye los epítopos de célula T específicos de Bet v 1.

El documento O 2004/004761 se relaciona a partículas similares a virus que se fusionan a un inmunógeno y que se pueden utilizar para la inmunización.

En el documento WO 2004/003143 se describe el uso de proteínas de fusión que comprenden una partícula similar a virus y una molécula alergénica como inmunógeno para vacunación .

En el documento WO 2007/140505 y Edlmayr y colaboradores (J. Immunol. 182 (10) (2009) 6298-6306) se describe el uso de proteínas de fusión que comprenden varias moléculas portadoras fusionadas a péptidos derivados de alérgeno para inducir anticuerpos IgG específicos de alérgeno, pero estos constructos no exhiben un efecto inmunomodulatorio que se pueda considerar ventajoso para pacientes alérgicos tal como la inducción de inmunidad de IL-10 o Thl. La Fig. 4 de Edlmayr y colaboradores, muestra que los péptidos fusionados a KLH inducen las proteínas de fusión IL-5 de citoquina de Th2 y VPl pero no inducen IL-10 o IFN-gamma.

En Niespodziana y colaboradores, (J. Allergy Clin. Immunol. 127 (6) (2011) 1562-1570) se describe el uso de proteínas de fusión cada una que comprende PreS derivado de hepatitis B y dos péptidos derivados del alérgeno de gato mayor Fel d 1 para inducir anticuerpos IgG específicos de alérgeno. Sin embargo, no se ha descrito régimen adecuado para la vacunación de humanos y los péptidos contuvieron epítopos de célula T específicos de alérgeno.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar medicamentos y portadores que superen las desventajas mencionadas en lo anterior y permitan una vacunación de alérgeno con efectos secundarios reducidos.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona a un polipéptido que comprende por lo menos tres fragmentos de péptido que consisten de 10 a 50 residuos de aminoácido consecutivos de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre fusionados al N- y C-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie o que comprende un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del mismo fusionado N- y/o C-terminal terminalmente a por lo menos tres péptidos derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre .

Con el fin de provocar una respuesta inmune aumentada contra una molécula, en particular contra una molécula alergénica o hipoalergénica de acuerdo con la presente invención, por lo menos tres fragmentos de péptido derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre se fusionan (mediante ingeniería genética) a un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae, de preferencia un virus de hepatitis B, más de preferencia de un polipéptido PreS de hepatitis B, o por lo menos un fragmento del mismo. Sorprendentemente esto resultó de que en contraste a las proteínas portadoras convencionalmente y regularmente empleadas similar a KLH (hemocianina de lapa de punta) un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae, de preferencia de un virus de hepatitis B, más de preferencia de un polipéptido PreS de hepatitis B, o fragmentos del mismo conducen a una formación aumentada de anticuerpos dirigidos a esos péptidos que se enlazan a los mismos .

Por otra parte, esto resultó de que los anticuerpos IgG específicos de alérgeno inducidos por la inmunización con más de tres fragmentos de péptido derivados de alérgeno apropiadamente seleccionados fusionados al polipéptido PreS de hepatitis B se enfocan mejor a los epítopos IgE del alérgeno, mientras que la inmunización con el alérgeno de tipo silvestre conduce a IgG que se dirigen a todas las partes del alérgeno - también aquellos que no son reactivos con IgE. En un experimento normalizado para títulos de IgG esto conduce a una mejor capacidad bloqueante del IgG inducido por PreS/péptido comparado con alérgeno de tipo silvestre inducido (Fig. 12).

También muy sorprendentemente, esto resultó de que en los cultivos de proteínas de fusión PBMCs humanas de fragmentos de péptido derivados de alérgeno al polipéptido PreS de hepatitis B fuertemente indujo las citoquinas IL-10 e IFN-gamma, que se han atribuido como indicadores positivos para una inmunoterapia de alergia exitosa. En contraste, la inducción de IL-10 e IFN-gamma fue significativamente menor con el alérgeno de tipo silvestre, los fragmentos de péptido derivados de alérgeno solos o el PreS solo (Fig. 10) .

"Fusionado al N- y C-terminal", como se utiliza en la presente, significa que por lo menos un péptido se fusiona al N-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie y por lo menos un péptido se fusiona al C-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido superficie. En una modalidad mucho más simple de la presente invención un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie puede comprender en el N-terminal un péptido y en el C-terminal dos péptidos o viceversa.

El polipéptido de la presente invención de preferencia comprende por lo menos cuatro, más de preferencia por lo menos cinco, aún más de preferencia por lo menos seis, fragmentos de péptido, de preferencia péptidos que enlazan células B, derivados de un alérgeno, mediante lo cual son más preferidos cuatro péptidos.

De acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la proteina portadora es el polipéptido PreS de hepatitis B con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 21) : GGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPI KDH PAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILG SPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQ SGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVN PAPNIASHISSISARTGDPVTN También es posible usar los fragmentos PreSl de Hepatitis B o PreS2 de Hepatitis B del polipéptido PreS de Hepatitis B. Un fragmento de polipéptido PreS de Hepatitis B de preferencia comprende o consiste de por lo menos 30, de preferencia por lo menos 40, más de preferencia por lo menos 50, residuos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID No. 21.

"Hipoalergénico" como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas con potencial alergénico reducido o no. reducido (es decir, reactividad de IgE determinada con ensayos que enlazan IgE conocidos en la técnica) . Tales moléculas tienen una capacidad disminuida para provocar reacciones alérgicas en un individuo comparado- con la proteina de tipo silvestre de la cual se derivan estas moléculas.

El por lo menos tres, de preferencia por lo menos cuatro, más de preferencia por lo menos cinco, aún más de preferencia por lo menos seis, fragmentos de péptido fusionados al N- y C-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie comprende o consiste de 10 a 50 aminoácidos consecutivos, más de preferencia de 15 a 50 aminoácidos consecutivos, en particular 20-50 aminoácidos consecutivos, de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre y exhiben de preferencia reactividad de IgE reducida comparada con el alérgeno de tipo silvestre del cual se derivan los fragmentos de péptido. Estos fragmentos de péptido de preferencia se diseñan para excluir epitopos de célula T específicos de alérgenos que pueden causar efectos secundarios mediados por célula T. Los epitopos de célula T y moléculas que exhiben respuesta de célula T reducida se puede determinar e identificar por métodos conocidos por la persona de habilidad en la técnica (por ejemplo, Bercovici N. y colaboradores, Clin Diagn Lab Immunol. (2000) 7:859-864).

Los por lo menos tres fragmentos de péptido que comprenden o que consisten de 10 a 50 aminoácidos consecutivos, más de preferencia de 15 a 50 aminoácidos consecutivos, en particular 20-50 aminoácidos consecutivos, de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre se pueden derivar de uno y el mismo alérgeno. Si dos o más fragmentos se derivan del mismo alérgeno estos dos o más fragmentos no se ubican adyacentemente en el alérgeno de tipo silvestre y/o tienen un orden en el polipéptido de la presente invención que no corresponde al orden en el alérgeno de tipo silvestre.

El término "fragmento de péptido" como se utiliza en la presente significa una parte/fragmento de un polipéptido hipoalergénico o proteína de fusión de la invención que se deriva de la estructura primaria de un alérgeno de tipo silvestre y comprende o consiste de 10 a 50 aminoácidos consecutivos, más de preferencia de 15 a 50 aminoácidos consecutivos, en particular 20-50 aminoácidos consecutivos, de este alérgeno de tipo silvestre.

Los términos "derivado de un alérgeno" y "derivado de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre", como se utiliza en la presente, significan que los fragmentos de péptido de acuerdo con la presente invención se obtienen. directamente de un alérgeno mediante fragmentación o truncamiento. La secuencia de aminoácidos de estos fragmentos de péptido es de preferencia por lo menos 80 % idéntica, más de preferencia por lo menos 90 % idéntica, mucho más de preferencia por lo menos 95% idéntica, en particular 100 % idéntica, al estiramiento de secuencia de aminoácidos del alérgeno de tipo silvestre, del cual se derivan los fragmentos de péptido. Sin embargo, los péptidos que no son 100% idénticos a los fragmentos de alérgeno de tipo silvestre deben ser capaces de enlazar con por lo menos 60% , de preferencia por lo menos 70% , más de preferencia por lo menos 8 0% , mucho más de preferencia por lo menos 90% , de intensidad a un anticuerpo o anticuerpos, de preferencia a anticuerpos IgG, que se dirigen a los fragmentos de alérgeno de tipo silvestre. "Por lo menos un alérgeno de tipo silvestre" significa que el polipéptido de la presente invención puede comprender péptidos que enlazan célula B de más de uno, de preferencia dos, más de preferencia tres, alérgenos de tipo silvestre diferentes (es decir, fuente) (por ejemplo, un péptido derivado de Bet v 1, uno de Amb a 1 y uno de Phl p 1 o dos péptidos son derivados de Bet v 1 y uno de Amb a 1) .

El grado de identidad de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos se puede determinar mediante una comparación directa entre ambas secuencias de aminoácidos utilizando ciertos algoritmos. Tales algoritmos, por ejemplo, se incorporan en varios programas de computadora (por ejemplo, "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova y colaboradores, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F, Nucí. Acids Res. (1988) 16:10881-10890) .

Los polipéptidos de la presente invención se pueden obtener por métodos recombinantes o síntesis química. Alternativamente, por supuesto, también es posible obtener las moléculas mediante segmentación enzimática o química del alérgeno de tipo silvestre o un polipéptido/proteína que alberga la molécula de interés.

Ahora se encontró sorprendentemente que las proteínas de fusión portadoras de péptido con propiedades mejoradas se pueden obtener al emplear proteínas de superficie de los virus de la clase Hepadnaviridae, más específicamente el virus de hepatitis B humano. Uno de hasta 20, de preferencia 3 o 4 hasta 20, más de preferencia 3 o 4 hasta 15, aún más de preferencia 3 o 4 hasta 10 (es decir, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), fragmentos de péptido, de preferencia fragmentos de péptido hipoalergénicos, se pueden fusionar al C-terminal y el N-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie. Una modalidad preferida de la invención actual por lo tanto, son las proteínas de fusión compuestas de por lo menos 3 hasta 6 fragmentos de péptido hipoalergénicos con una proteína portadora derivada de los antígenos de superficie del virus de hepatitis B humano. De -acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, tales proteínas de fusión usan la proteína preS como portador. Una modalidad mucho más preferida de esta invención son las proteínas de fusión, donde 4 fragmentos de péptido hipoalergénico se fusionan a la proteína portadora preS o un fragmento de la misma. Los fragmentos de péptido (hipoalergénicos) pueden ser los mismos o diferentes y se pueden derivar de una o varias proteínas alergénicas y el locus de los péptidos dentro de la proteína de fusión es el C-terminal y N-terminal de la proteína portadora. Uno de hasta tres fragmentos de péptido (hipoalergénicos) se puede fusionar a cada uno del C-terminal y el N-terminal de tal manera tal que la suma de los fragmentos de péptido (hipoalergénicos) será, por ejemplo, tres o cuatro a seis. Los términos "fusionado" o "proteína de fusión", se refiere a una modalidad preferida de la invención, que significa que la proteína portadora no alergenica y los fragmentos de péptido (hipoalergénicos) en el C- y N-terminal del portador se expresan y se preparan como una cadena de péptido recombinante singular.

Una modalidad mucho más altamente preferida de la invención actual son proteínas de fusión de la proteína preS del virus de hepatitis B, que lleva fragmentos de péptido (hipoalergénicos) derivados de un alérgeno específico, tal como uno o dos, de preferencia dos, fragmentos de péptido cada uno que son fusionados al C-terminal y el N-terminal del portador. Para ilustración los polipéptidos preferidos de la invención actual pueden tener la estructura molecular general, representada por las siguientes estructuras genéricas : Estructura 1. Principio de construcción general de las modalidades preferidas Péptido A Péptido B Pre S Péptido C Péptido D Estructura 2. Principio de construcción general de las modalidades preferidas Péptido A Péptido B Pre S Péptido C Estructura 3. Principio de construcción general de las modalidades preferidas Se entiende que los péptidos A, B, C y D pueden ser los mismos o diferentes y se pueden derivar del mismo alérgeno para cada proteina de fusión individual o serán derivados de diferentes alérgenos.

Los péptidos (hipoalergénicos ) que son fusionados al N- y C-terminal del polipéptido de superficie de un virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie, de preferencia la proteina preS o un fragmento de la misma, de preferencia se seleccionan del grupo que consiste de alérgenos de polen de abedul mayores, en particular Bet v 1 y Bet v 4, alérgenos de polen de hierba timotea mayores, en particular Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 y Phl p 7, alérgenos de ácaro de polvo casero mayores, en particular Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 y Der p 23, alérgeno de gato mayor Fel d 1, el alérgeno de ambrosia mayor Amb a 1, los alérgenos de cedro japonés mayores Cry j 1 y Cry j 2, los alérgenos de abeja mayores, alérgenos de avispa mayores, profilinas, especialmente Phi p 7, Phi p 12.

Otros alérgenos adecuados para ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden derivar de la siguiente tabla 2 sin ser restringidos a la tabla.

Tabla 2 Fuen-bes de péptidos hipoalergénicos Nombre de la especie Nombre del Biochem.ID o MW cDA (C) o Referencia, Alérgeno Nombre obsoleto proteina (P) Acc. No.

Ambrosia artemisifolía ambrosía corta Amb a 1 Antígeno 8,20 Amb a 2 Antígeno 8,21 Amb a 3 Ra3 11 22 Amb a 5 Ra5 11,23 Amb a 6 Ra6 10 24,25 Amb a 7 Ra7 12 26 Ambrosia trífida ambrosía gigante Amb t 5 Ra5G 4.4 C 9,10,27 Artemisia vulgar artemisa Art v 1 27-29 C 28 Art v 2 35 28A Art v 3 Proteína de 12 53 transferencia de lípido Art v 4 Profilina 29 Helianthus annuus Girasol Hel a 1 34 29A Hel a 2 Profilina 15.7 C Y15210 Mercurialis annua Mer a 1 Profilina 14-15 C Y13271 Caryophyllales Chenopodium álbum Cuartos de cordero/ cenizo Che a 1 17 29B,AY049012 Quenopodio blanco Che a 2 Prof lina 14 AY082337 Che a 3 Polcalcina 10 AY082338 Salsola kali Barrilla de borde Sal k 1 43 29C Rosales Humulus japonicus lúpulo japonés Hum j 4w AY335187 Parietaria judaica Par j 1 Proteína 1 de 15 C Ver lista de transferencia isoalergenos lípido Par j 2 Proteína 2 de Ver lista de transferencia isoalergenos lípido Par j 3 Profilina Ver lista de isoalergenos Parietaria officinalis Par o 1 Proteína 1 de 15 29D transferencia de lipido B. Hierbas Poales Cynodon dactylon Hierba de las Bermudas Cyn d 1 32 30.S83343 Cyn d 7 31,X91256 Cyn d 12 profilina 14 C 31a, Y08390 Cyn d 15 AF517686 Cyn d 22w enolasa datos pendiente Cyn d 23 Cyn d 14 9 C AF517685 Cyn d 24 p. relacionada con 21 P pendiente patogénesis Dactylis glomerata hierba de huerto Dac AgDgl 32 32 Dac 11 33,S45354 Dac 33A, U25343 Dac 31 34 Festuca pratensis cañuela alta Fes p 4w 60 Holcus lanatus hierba de terciopelo Hol 1 1 Z27084 Lolium perenne ballico Lol p 1 grupo I 27 35,36 Lol p 2 grupo II 11 37,37A,X73363 Lol p 3 grupo III 11 38 Lol p 5 Lol p IX, Lol p Ib 31/35 34,39 Lol p 11 hom: inhibidor de 16 39A tripsina Phalaris aquatica alpiste Pha a 1 40, S80654 Phleum pratense timotea Phl p 1 27 C X78813 Phl p 2 X7592S, 41 Phl p 4 41A Phi p 5 Ag25 32 42 Phl p 6 Z27082, 43 Phl p 11 Hora, inhibidor de 20 C AF521563, 43A tripsina Phl p 12 profilina C X77583, 44 Phl p 13 poligalacturonasa 55-60 C A. J238848 Poa pratensis Hierba azulada de Kentucky Poa p 1 grupo I 33 46 Poa p 5 31/34 C 34,47 Sorghum halepense Hierba de Johnson Sor h 1 48 C. Árboles Arecales Phoenix dactylifera palma de dátil Pho d 2 profilina 14.3 C Asturias p.c.

Fágales Alnus glutinosa aliso Aln g 1 17 C S50892 Betula verrucosa abedul Bet v i 17 C Ver lista de isoalergenos Bet v 2 Profilina 15 C 65179 Bet v 3 C X79267 Bet v 4 8 C X87153, S54819 Bet v 6 h:isoflavona 33.5 C Ver lista de reductasa isoalergenos Bet v 7 ciclofilina 18 P P81531 Carpinus betulus carpe Car b 1 17 Ver lista de isoalergenos Castanea sativa Castaño Cas s 1 22 P 52 Cas s 5 Quitinasa Cas s 8 proteina de 9.7 P 53 transferencia de lipido Corylus avellana avellano Cor a 1 ver lista de isoalergenos Cor a 2 profilina Cor a 8 proteina de transferencia de lipido Cor a 9 proteina similar Beyer p.c. globulina 11S Cor a 10 prot . de enlace AJ295617 luminal Cor a 11 prot. similar a AF441864 vicilina 7S Quercus alba Roble blanco Que a 1 17 54 Lamíales Oleaceae Fraxinus excelsior fresno Fra e 1 20 P 58A, AF526295 Ligustrum vulgare alheña Lig v 1 20 P 58A Olea europea olivo Ole e 1 16 C 59, 60 Ole e 2 profilina 15-18 C 60A Ole e 3 9.2 60B Ole e 4 32 P P80741 Ole e 5 superóxido 16 P P80740 dismutase Ole e 6 10 C 60C, U86342 Ole e 7 ¿ P 60D, P81430 Ole e 8 proteína que 21 C 60E,AF078679 enlaza Ca2+ Ole e 9 beta-l, 3-glucanasa AF249675 Ole e 10 om. de glicosil 60F, AY082335 hidrolasa Syringa vulgaris Lilac Syr v 1 58A Plantaginaceae Plantago lanceolata Plátano Inglés Pía 1 1 18 P P842242 Piñales Cryptomeria japónica Sugi Cry j 1 41-45 C 55,56 Cry j 2 57,D29772 Cupressus arisonica Ciprés Cup a 1 43 C A1243570 Cupressus sempervirens ciprés común Cup s 1 43 C Ver lista de isoalergenos Cup s 3w 34 C Ref . pendiente Juniperus ashei cedro de montaña Jun a 1 43 P P81294 Jun a 2 57A,AJ404653 Jun a 3 30 P 57B,P81295 Juniperus oxycedrus enebro espinoso Jun o 4 hom: calmodulina 29 c 57C,AF031471 Juniperus sabinoides cedro de montaña Jun s 1 50 p Juniperus virginiana cedro rojo del este Jun v 1 43 P81825,58B Platanaceae Platanus acerifolia Árbol plano de Londres Pía a 1 18 P82817 Pía a 2 43 P82967 Pía a 3 proteína de Iris p.c. transferencia de lípido D. Ácaros Acarus siró Artrópodo ácaro Acá s 13 prot. que enlaza 14* C AJ006774 ácido grado Blomia tropical ácaro Blo t 1 cisteína proteasa 39 C AF277840 Blo t 3 Tripsina 24* C Cheong p Blo t 4 alfa amilasa 56 C Cheong p Blo t 5 U59102 Blo t 6 quimotripsina 25 C Cheong p Blo t 10 tropomiosina 33 C 61 Blo t 11 Paramiosina na c AF525465 Blo t 12 Btlla C U27479 Blo t 13 Bt6, prot. que enlaza C 058106 ácido graso Blo t 19 Hom. pep. Cheong p.c. antimicrobiano Dermatophagoides farinae ácaro de polvo casero Americano Der f 1 cisteina prote 69 Der f 2 70,70A, ver lista de isoalergenos Der f 3 Tripsina 30 C 63 Der f 7 24-31 C SW:,Q26456, 71 Der f 10 Tropomiosina C 72 Der f 11 Paramiosina 98 C 72A Der f 14 mag3, C D17686 apolipoforina Der f 15 98k quitinasa 98 C AF178772 Der f 16 gelsolina/villina 53 C 71A Der f 17 proteina EF que 53 C 71A enlaza Ca Der f 18w 60k quitinasa 60 C Weber p.c. Dermatophagoides microceras ácaro de polvo casero Der m 1 cisteina proteasa 25 P Dermatophagoides pteronyssinus ácaro de polvo casero europeo Der p 1 antígeno Pl, 62, ver cisteína proteasa lista de isoalergenos Der p 2 62A-C, ver lista de isoalergenos Der p 3 Tripsina 28/30 63 Der p 4 Amilasa 60 64 Der p 5 14 65 Der p 6 Quimotripsina 25 66 Der p 7 22/28 67 Der p 8 glutationa 67A transferasa Der p 9 pro. De serina 67B colagenolitica Der p 10 Tropomiosina 36 C Y14906 Der p 14 Prot. similar a Epton p . . apolipoforina Euroglyphus maynei ácaro Eur m 2 ver lista de isoalergenos Eur m 14 Apolipoforina 177 C AF 149827 Glycyphagus domesticus ácaro de almacenamiento Gly d 2 72B, ver lista de isoalergenos Lepidoglyphus destructor ácaro de almacenamiento Lep d 2 Lep d i 15 C 73, 74, 74A, ver lista de isoalergenos Lep d 5 75, AJ250278 Lep d 7 75, AJ271058 Lep d 10 tropomiosina 75A, AJ250096 Lep d 13 75, AJ250279 Tyrophagus putrescentiae ácaro de almacenamiento Tyr p 2 75B, Y12690 E. Animales Bos domesticus Ganado vacuno doméstico Bos d 2 Ag3, lipocalina 20 76, ver lista de isoalergenos (ver también alimentos) Bos d 3 hom. S100 que 11 C L39834 enlaza Ca Bos d 4 alfa-lactalbúmina 14.2 C M13780 Bos d 5 beta- 18.3 C X14712 lactoglobulina Bos d 6 albúmina de suero 67 M73993 Bos d 7 Inmunoglobulina 160 77 Bos d 8 Caseínas 20-30 77 Canis familiaris (Canis domesticus) Can f 1 25 78,79 Perro Can f 2 27 78,79 Can f 3 Albúmina S72946 Can E 4 A59491 Equus caballus caballo doméstico Equ c 1 lipocalina 25 U70823 Equ c 2 lipocalina 18.5 P 79A, 79B Equ c 3 Ag3 - albúmina 67 79C,X74045 Equ c 4 17 79D Equ c 5 AgX 17 Goubran Botros p.C.

Felis domesticus gato (saliva) Fel d 1 cat-1 38 15 Fel d 2 Albúmina 79E, X84842 Fel d 3 cistatina 11 79F, AF238996 Fel d 4 lipocalina 22 C AY497902 Fel d 5 Inmunoglobulina ¾ 400 Adedoyin p.c.

Fel d 6w Inmunoglobulina Adedoyin p.c. Fel d 7w Inmunoglobulina Adedoyin p.c.

Cavia porcellus conejillo indias Cav p 1 homólogo de SW:P83507, 80 lipocalina Cav p 2 SW:P83508 Mus musculus ratón (orina) Mus m 1 MUE 81,81A Rattus norvegius rata (orina) Rat n 1 82,83 F. Hongos (mohos) 1. Ascomycota 1.1 Dot ideales Alternarla alternata Alt a 1 U82633 Alt a 2 83A,U62442 Alt a 3 Prot. de choque U87807,U87808 térmico Alt a 4 prot. X84217 disulfideisomerasa Alt a 6a Prot. P2 ribosomal X78222,U87806 cid Alt a 7 proteina YCP4 22 X78225 Alt a 1Q aldehido 53 X78227, P42041 deshidrogenase Alt a 11 Enolasa 45 U82437 Alt a 12 Prot. Pl ribosomal 11 X84216 de ácido Cladosporium herbarum Cía 1 13 83B, 83C Cía h 2 23 83B, 83C Cía h 3 aldehido 53 X78228 deshidrogenasa Cía h 4 Prot. P2 ribos X78223 de ácido Cía h 5 proteina YCP4 22 X78224 Cía 6 Enolasa 46 X78226 Cía h 12 Prot. Pl ribosomal 11 X85180 de ácido 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus Asp fl 13 serina proteasa 34 84 alcalina Aspergillus fumigatus Asp f 18 M83781, S39330 Asp f 37 U56938 Asp f proteina 19 U20722 peroxisomal Asp f, 4 30 AJ001732 Asp f 5 Metalloproteasa 40 Z30424 Asp f 6 super6xido 26.5 C 053561 dismutasa de Mn Asp f 7 12 AJ223315 Asp f 8 Prot. P2 ribosomal 11 AJ224333 Asp f 9 34 AJ223327 Asp f 10 proteasa aspártica 34 X85092 Asp f 11 peptidil-prolil 24 84A isomerasa Asp f 12 Prot. P90 90 de 85 choque térmico Asp f 13 serina proteasa 34 84B alcalina Asp f 15 AJ002026 Asp f 16 g3643813 Asp f 17 AJ224865 Asp f 18 serina proteasa 84C vacuolar Asp f 22w Enolasa 46 AF284645 Asp f 23 proteína ribosomal 85A,AF464911 L3 Aspergillus niger Asp n 14 beta-xilosidasa 105 AF108944 Asp n 18 serina proteasa 34 84B vacuolar Asp n 25 3-fitasa B 66-100 85B, P34754 Asp n ? 85 Z84377 Aspergillus oryzae Asp o 13 serina proteasa 34 X17561 alcalina Asp o 21 TAKA-amilasa A 53 D00434,M33218 Penicillium brevicompactum Pen b 13 serina proteasa 33 86A alcalina Penicillium chrysogenum (antes P. notatum) ) Pen ch 13 serina proteasa 34 87 alcalina Pen ch 18 serina proteasa 32 87 vacuolar Pen ch 20 N-acetil 68 87A glucosaminidasa Penicillium citrinum Pen c 3 Prot. de membrana 18 86B peroxisomal Pen c 13 serina proteasa 33 86A alcalina Pen c 19 Prot. de choque 70 C U64207 térmico P70 Pen c 22w Enolasa AF254643 Pen c 24 factor de AY3639U alargamiento 1 beta Penicillium oxalicum Pen o 18 serina proteasa 87B vacuolar 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum Fus c 1 Prot. P2 ribosomal 11* C AY077706 Fus c 2 Prot. similar a 13* C AY077707 tioredoxina 1. Onygenales Trichophyton rub Tri r 2 Tri r 4 serina proteasa Trichophyton tonsurans Tri 1 30 P 88A Tci 4 serina proteasa 83 C 88 1.5 Saccharomycetales Candida albicans Cand a 1 89 Cand a 3 proteina AY136739 peroxisomal Candida boidinii Cand b 2 20 C J04984, J04985 2. Basidiomycotina 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis Psi c 1 Psi c 2 ciclofilina 16 89A Coprinus comatus casquillo lanudo Cop c 1 proteina de AJ132235 cremallera de leucina Cop c 2 AJ242791 Cop c 3 AJ242792 Cop c 5 AJ242793 Cop c 7 AJ242794 2.2 Urediniomycetes Rhodotorula mucilaginosa ho m 1 Enolasa 47 C 89B Rho m 2 serina proteasa 31 c AY547285 vacuolar 2.3 Ustilaginomycetes alassezia fúrfur Mala f2 MF1, proteina de AB011804, 90 membrana peroxisomal Mala f3 MF2, proteína de AB011805, 90 membrana peroxisomal Mala f4 Malato AB084828, 90A deshidrogenasa mitocóndrica Malassezia sympodialis Mala s 1 X96486, 91 Mala s 5 AJ011955 Mala s 6 17* AJ011956 Mala s 7 AJ0119S7, 91A Mala s 8 19* AJ011958, 91A Mala s 9 37* AJ011959, 91A Mala s 10 prot. de choque AJ428052 térmico 70 Mala s 11 superóxido 23 AJ548421 dismutasa de Mn 3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales Epicoccum purpurascens (antes E. nigrum) Epi p 1 serina proteasa 30 SW:P83340, 91B G. Insectos Aedes aegyptii Mosquito Aed a 1 Apirasa 68 L12389 Aed a 2 37 M33157 Apis mellifera abeja de miel Api m 1 fosfolipasa A2 16 92 Api m 2 hialuronidasa 44 93 Api m 4 melitina 3 94 Api m 6 7-8 Kettner p.c. Api m 7 CUB serina 39 AY127579 proteasa Bombus pennsylvanicus Abejorro Bom fosfolipasa 16 95 Bom proteasa 95 Blattella germánica Cucaracha Alemana Bla Bd90k Bla proteasa aspártica 96 Bla' calicina 97 Bla glutationa 22 98 transferasa Bla troponina C 27 98 Periplaneta americana Cucaracha Americana Per a 1 Cr-PII Per a 3 Cr-PI 72-78 C 98A Per a 7 tropomiosina 37 Y14854 Chironomus kiiensis jején Chi k 100 Tropomisina 32.5* C AJ012184 Chironomus thummi thummi je én Chi t 1-9 hemoglobina 16 99 Chi t 1.01 componente III 16 P02229 Chi t 1.02 componente IV 16 P02230 Chi t 2.0101 componente I 16 P02221 Chi t 2.0102 componente IA 16 P02221 Chi t 3 componente II-beta 16 P02222 Chi t 4 componente IIIA 16 P02231 Chi t 5 componente VI 16 P02224 Chi t 6.01 componente VIIA P02226 Chi t 6.02 componente IX 16 P02223 Chi t 7 componente VIIB 16 P02225 Chi t 8 componente VIII 16 P02227 Chi t 9 componente X 16 P02228 Ctenocephalides felis felis pulga de gato Cte fl Cte f2 Mlb 27 AF231352 Cte f3 25 Thaumetopoea pityocampa polilla procesionaria de pino Thap 1 15 RIA:A59396, 99A Lepisma saccharina pez plateado Lep s 1 tropomiosina 36 AJ309202 Dolichovespula maculata avispón d cara blanca Dol m 1 fosfolipasa Al 35 100 Dol m 2 hialuronidasa 44 101 Dol m 5 antigeno 5 23 102 , 103 Dolichovespula arenaria avispón amarillo Dol a 5 antigeno 5 23 104 Polistes annularies Avispa Pol a 1 fosfolipasa Al 35 105 Pol a 2 hialuronidasa 44 105 Pol a 5 antigeno 5 23 104 Polistes dominulus avispa de papel Mediterránea Pol d 1 Hoffman p.

Pol d 4 serina proteasa 32-34 C Hoffman p.

Pol d 5 P81656 Polistes exclamans avispa Pol e 1 fosfolipasa 107 Pol e 5 antigeno 5 104 Polistes Fuscatus Avispa Pol f 5 antigeno 5 23 C 106 Polistes gallicus Avispa Pol g 5 antigeno 5 24 C P83377 Polistes metricus Avispa Pol m 5 antigeno 5 23 C 106 Vespa crabo avispón Europeo Vesp c 1 fosfolipasa 107 Vesp c 5 antigeno 5 106 Vespa mandarina avispón asiático gigante Vesp m 1 Hoffman p.c. Vesp m 5 P81657 Vespula flavopilosa avispa con pintas Ves f 5 antigeno 5 23 C 106 amarillas Vespula germánica avispa con pintas Ves g 5 antigeno 5 23 C 106 amarillas Vespula maculifrons avispa con pintas amarillas Ves m 1 fosfolipasa Al 108 Ves m 2 Hialuronidasa 109 Ves m 5 antigeno 5 23 C 104 Vespula pennsylvanica avispa con pintas amarillas Ves p 5 antigeno 5 23 106 Vespula squamosa avispa con pintas amarillas Ves s 5 antigeno 5 23 106 Vespula vidua Avispa Ves vi 5 antigeno 5 23 106 Vespula vulgaris avispa con pintas amarillas Ves v 1 fosfolipasa Al 35 105A Ves v 2 Hialuronidasa 44 105A Ves v 5 antigeno 5 23 104 Myrmecia pilosula Hormiga saltadora Australiana Myr p 1 X70256 Myr p 2 SB1785 .

Solenopsis geminata hormiga roja tropical Sol g 2 Hoffman p.c.

Sol g 4 Hoffman p.c.

Solenopsis invicta hormiga roja Sol i 2 13 110, 111 Sol i 3 24 110 Sol i 4 13 110 Solenopsis saevissima hormiga roja Brasileña Sol s 2 Hoffman p.c.

Triatoma protracta bicho chupasangre de California Tria p 1 Procalina 20 AF 179004, 111A.

H. Alimentos Gadus callarías bacalao Gad c 1 alérgeno M 12 112,113 Salmo salar salmón del Atlántico Sal s 1 parvalbúmina 12 X97824 Bos domesticus ganado vacuno doméstico Bos d 4 alfal-actalbúmina 14 M18780 (leche) Bos d 5 Beta-lactoglobulina 18 X14712 ver también animales Bos d 6 albúmina de suero 67 C M73993 Bos d 7 inmunoglobulina 160 77 Bos d 8 caseínas 20-30 77 Cyprinus carpió (carpa común) Cyp c 1 parvalbúmina 12 129 Gallus domesticus Pollo Gal d 1 ovomucoide 28 114,115 Gal d 2 Ovalbúmina 44 114,115 Gal d 3 Ag22, con albúmina 78 C 114, 115 Gal d 4 lisozima 14 C 114, 115 Gal d 5 albúmina de suero 69 X60688 Metapenaeus ensis Camarón Met e 1 tropomiosina U08008 Penae s aztecus camarón Pen a 1 tropomiosina 36 P 116 Penaeus indicus camarón Pen i 1 tropomiosina 34 c 116A Penaeus monodon camarón tigre negro Pen m 1 tropomiosina 38 Pen m 2 arginina quinasa 40 AF479772, 117 Todarodes pacificus calamar Tod p 1 tropomiosina 38 117A Helix aspersa caracol de jardín café Hel as 1 tropomiosina 36 Y14855, 117B Haliotis midae Abalone Hal m 1 49 117C Rana esculenta rana comestible Ran e 1 parvalbumina alfa 11.9* C A.T315959 Ran e 2 parvalbumina beta 11.7* C A.T414730 Brassica júncea mostaza oriental Bra j 1 2S albúmina 14 118 Brassica napus nabina Bra n 1 2S albúmina 15 118A,P80208 Brassica rapa A o Bra r 2 hom: proheveina 25 P81729 Hordeum vulgare Cebada Hor v 15 BMAI-1 15 119 Hor v 16 alfa-amilasa Hor v 17 beta-amilasa Hor v 21 gamma-3 hordeina 34 119A, SW:P80198 Sécale cereale Centeno Sec c 20 secalina Ver lista de isoall Triticum aestivum trigo Tri a 16 aglutinina Tri a 19 omega-5 gliadina PIR:A59156 Zea mays maíz, cereal Zea m 14 Prot. 9 p 19656 transferencia de lípido Oryza sativa Arroz Ory s 1 C 119B, U31771 Apium graveolens apio Api g 1 hom: Bet v 1 16* C Z48967 Api g 4 profilina AF 129423 Api g 5 55/58 P P81943 Daucus carota Zanahoria Dau c 1 hom: Bet i 16 C 117D, ver lista de isoalergenos profilina AF456482 Corylus avellana Avellana Cor a 1.04 hom: Bet v 1 17 ver lista de isoalergenos Cor a 2 profilina 14 AF327622 Cor a 8 proteína de AF329829 transferencia de lípido Malus domestica Mal d 1 hom: Bet v 1 ver lista de isoalergenos Mal d 2 hom: taumatina AJ243427 Mal d 3 proteina de Pastorello transferencia de p.c. lípido Mal d 4 profilina 14.4* C ver lista de isoalergenos Pyrus communis Pera Pyr c 1 hom: Bet v 1 AF05730 Pyr c 4 profilina 14 AF 129424 Pyr c 5 hom: isoflavona 33.5 C AF071477 reductasa Persea americana Aguacate Pers a 1 endoquitinasa 32 Z78202 prunus armeniaca albaricoque Pru ar 1 hom: Bet v 1 U93165 Pru ar 3 proteina de transferencia de lípido Prunus avium ciruela dulce Pru av hom: Bet v 1 U66076 Pru av hom: taumatina U32440 Pru av proteína de 10 AF221501 transferencia de lipido Pru av 4 profilina 15 AF129425 Prunus domestica ciruela Europea Pru d 3 proteina de 119C transferencia de lipido Prunus pérsica Durazno Pru p 3 proteina de 10 P81402 transferencia de lipido Pru p 4 profilina 14 lista de alérgenos Asparagus officinalis Espárragos Aspa o 1 proteina de 119D transferencia de lipido Crocus sativus Azafrán Cro s 1 21 Varasteh A-R p.c.

Lactuca sativa Lechuga Lac s 1 proteina de Vieths p.c. transferencia de lipido Vitis vinifera Uva proteina de 9 P P80274 transferencia de lipido Musa x paradisiaca plátano Profilina 15 C AF377948 Ananas comosus piña Ana c 1 Profilina 15 C AF377949 Ana c 2 Bromelaina 22.8* C 119E-G, D14059 Citrus limón limón Cit 1 3 proteina de 9 P Torrejón transferencia de p.c. lipido Citrus sinensis naranja dulce Cit s 1 proteina similar a 23 P Torrejón p germina Cit s 2 Profilina 14 P Torrejón p Cit s 3 proteina de 9 P Torrejón p transferencia de lipido Litchi chinensis Lichi Lit c 1 profilina 15 AY049013 Sinapis alba mostaza amarilla Sin a 2S albúmina 14 C 120 Glycine max soja Gly m HPS 7 P 120A Gly ra 8 P A57106 Gly m profilina 14 C ver lista de isoalergenos Gly m (SAM22) PR-10 17 C X60043, 120B prot.

Vigna radiata frijol mungo Vig r 1 proteína PR-10 15 AY792956 Arachis hypogaea Cacahuate Ara h 1 vicilina 63.5 C L34402 Ara h 2 conglutina 17 L77197 Ara h 3 glicinina 60 AF093541 Ara h 4 glicinina 37 AF086821 Ara h 5 profilina 15 AF059616 Ara h 6 hom: conglutina 15 AF092846 Ara h 7 hom: conglutina 15 AF091737 Ara h 8 proteína R-10 17 AY328088 Lens culinaris lenteja Len c 1 vicilina 47 ver lista de isoalergenos Len c 2 prot. biotinilado 66 120C de semilla Pisum savitum Chícharo Pis a 1 vicilina 44 ver lista de isoalergenos Pis s 2 convicilina 63 pendiente Actinidia chinensis Kiwi Act c 1 cisteína proteasa P00785 Act c 2 proteína similar a SW:P81370, taumatina 121 Capsicum annuum pimiento dulce Cap a lw proteína similar a 23 C AJ297410 osmotina Cap a 2 profilina 14 AJ417552 Lycopersicon esculent m tomate Lyc e 1 profilina 14 AJ417553 Lyc e 2 b-fructo- ver lista de furanosidasa isoalergenos Lyc e 3 proteína de U81996 transferencia de lipido Solanum tuberosum Papa Sola t Patatina 43 P15476 Sola t 2 Inhibidor de 21 P16348 catepsina D Sola t 3 Inhibidor de 21 P20347 cisteina proteasa Sola t 4 Inhibidor de 16+4 P P30941 proteasa aspártica Bertholletia excelsa nuez Brasileña Ber e 1 2S albúmina 9 P04403,M17146 Ber e 2 Proteina de 29 AY221641 almacenamiento de semilla 11S globulina Juglans nigra nogal negro Jug n 1 2S albúmina 19* AY102930 Jug n 2 Prot. similar a 56* C AY102931 vicilina Juglans regia nogal Inglés Jug r 1 2S albúmina U66866 Jug r 2 Vicilina 44 AF066055 Jug r 3 Proteina de Pastorello transferencia de lípido Anacardium occidentale Anacardo Ana o 1 proteína similar a 50 C ver lista vicilina isoalergenos Ana o 2 proteína similar a 55 C AF453947 legumina Ana o 3 2S albúmina 14 C AY081853 Ricinus' communis Semilla de ricino Ric c 1 2S albúmina C P01089 Sesamum indicum ajonjolí Sea i 1 2S albúmina 9 C 121A, AF240005 Ses i 2 2S albúmina 7 C AF091841 Se3 i 3 globulina similar 45 c AF240006 a 7S vicilina Ses i 4 Oleosina 17 C AAG23840 Ses i 5 Oleosina 15 C AAD42942 Cucumis meló melón Cue m 1 serina proteasa 66 C D32206 Cue ra 2 Profilina 14 C AY27129 Cue m 3 p. PR-1 16* P P83834 relacionado con patogénesis I. Otros Anisakis simplex Nematodo Ani s 1 24 P 121B,A59069 Ani s 2 paramiosina 97 C AF173004 Ani s 3 tropomiosina 41 C 121CY19221 Ani s 4 9 P P83885 Argas reflexus garrapata de pichón Arg r 1 17 C AJ697694 Ascaris suum Gusano Ase s 1 10 P 122 Carica papaya Papaya Car p 3w Papaina 23.4* C 122A, M15203 Dendronephthya nipponica coral blando Den n 1 53 P 122B Hevea brasiliensis caucho (látex) Hev b 1 factor de 58 P 123, 124 alargamiento Hev b 2 1, 3-glucanasa 34/36 C 125 Hev b 3 24 P 126, 127 Hev b 4 componente de 100- P 128 complejo de 115 microhélice Hev b 5 16 042640 Hev b 6.01 1 Precursor de 20 C M36986,p0287 heveina 7 Hev b 6.02 Heveina M36986p02877 Hev b 6.03 fragmento 14 M36986,p0287 C-terminal 7 Hev b 7.01 hom: patatina de U80598 B-suero Hev b 7.02 hom: patatina de 44 AJ223038 C-suero Hev b 8 Profilina 14 ver lista de isoalergenos Hev b 9 Enolasa 51 AJ132580 Hev b 10 superóxido 26 ver lista de dismutasa Mn isoalergenos Hev b 11 quitinasa clase I ver lista de isoalergenos Hev b 12 proteina de AY057860 transferencia de lipido Hev b 13 P83269 Homo sapiens Autoalergenos humanos Hom s 1 73 Y14314 Hom s 2 10 X80909 Hom s 3 20 X89985 Hom s 4 36 Y17711 Hom s 5 42 P02538 Triplochiton ecleroxilon Obeche Trip si quitinasa clase I 38.5 P Kespohl p.c.

Referencias 1 Marsh, D.G., and L.R. Freidhoff. 1992. ALBE, an allergen datábase. IUIS, Baltimore, MD, Edition 1.0. 2 Marsh, D. G. y colaboradores, 1986. Allergen nomenclature . Bull WHO 64:767-770. 3 King, T.P. y colaboradores, 1964. Biochemistry 3:458-468. 4 Lowenstein, H. 1980. Allergy 35: 188-191. 5 Aukrust, L. 1980. Allergy 35:206-207. 6 Demerec, M. y colaboradores, 1966. Genetics 54:61-75. 7 Bodmer, J. G. y colaboradores, 1991. Immunogenetics 33:301-309. 8 Griffith, I.J. y colaboradores, 1991. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296-304. 9 Roebber, M. y colaboradores, 1985. J. Immunol. 134:3062-3069. 10 Metzler, . J. y colaboradores, 1992. Biochemistry 31:5117-5127. 11 etzler, W. J. y colaboradores, 1992. Biochemistry 31:8697-8705. 12 Goodfriend, L. y colaboradores, 1979. Fed. Proc. 38: 1415. 13 Ekramoddoullah, A. K. M. y colaboradores, 1982. Mol.

Immunol. 19: 1527-1534. 14 Ansari, A. A. y colaboradores, 1987. J. Allergy Clin. Immunol. 80:229-235. 15 Morgenstem, J.P. y colaboradores, 1991. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:9690-9694. 16 Griffith, I.J. y colaboradores, 1992. Gene 113:263-268. 17 Weber, A. y colaboradores, 1986. Biochem. Physiol. 83B:321-324. 18 Weber, A. y colaboradores, 1987. Allergy 42:464-470. 19 Stanworth, D. R. y colaboradores, 1990. Bulletin WHO 68: 109-111. 20 Rafnar, T. y colaboradores, 1991. J. Biol. Chem. 266: 1229-1236. 21 Rogers, B.L. y colaboradores, 1991. J. Immunol. 147:2547-2552. 22 Klapper, D.G. y colaboradores, 1980. Biochemistry 19:5729-5734. 23 Ghosh, B. y colaboradores, 1993. J. Immunol. 150:5391-5399. 24 Roebber, M. y colaboradores, 1983. J. Immunol. 131:706- 711. 25 Lubahn, B. y D.G. Klapper. 1993. J. Allergy Clin. Immunol . 91:338. 26 Roebber, M. , and D.G. Marsh. 1991. J. Allergy Clin. Immunol. 87:324. 27 Goodfriend L . y colaboradores, Mol Immunol 22: 899-906, 1985. 28 Himly M. y colaboradores, FASEB J 17: 106-108, 2003. 28A Nilsen, B. M. y colaboradores, 1991. J. Biol. Chem. 266:2660-2668. 29 opfher N. y colaboradores, Biol Chem 383: 1779-1789, 2002. 29A Jiménez A. y colaboradores, 1994. Int Arch Allergy Immunol 105:297-307. 29B Barderas R. y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 127: 47-54, 2002. 29C Carnes J. y colaboradores, Allergy 56, Supplement 68: 274, 2001. 29D Giuliani A. y colaboradores, Allergy 42: 434-440, 1987. 30 Smith, P.M. y colaboradores, 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 98:331-343. 31 Suphioglu, C. y colaboradores, 1997. FEBS Lett . 402: 167-172. 31a Asturias J.A. y colaboradores, 1997. Clin Exp Allergy 27: 1307-1313. 32 Mecheri, S. y colaboradores, 1985. Allergy Appl. Immunol. 78:283-289. 33 Roberts, A.M. y colaboradores, 1993. Allergy 48:615-623. 33a Guerin-Marchand, C. y colaboradores, 1996. Mol. Immunol. 33:797-806. 34 Klysner, S. y colaboradores, 1992. Clin. Exp. Allergy 22: 491-497. 35 Pérez, M. y colaboradores, 1990. J. Biol. Chem. 265:16210-16215. 36 Griffith, I. J. y colaboradores, 1991. FEBS Letters 279:210-215. 37 Ansari, A. A. y colaboradores, 1989. J. Biol. Chem. 264: 11181-11 185. 37a Sidoli, A. y colaboradores, 1993. J. Biol. Chem. 268:21819-21825. 38 Ansari, A. A. y colaboradores, 1989. Biochemistry 28:8665-8670. 39 Singh, M. B. y colaboradores, 1991. Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 1384-1388. 39a van Ree R. y colaboradores, 1995. J Allergy Clin Immunol 95:970-978. 40 Suphioglu, C. and Singh, M.B. 1995. Clin. Exp. Allergy 25: 853-865. 41 Dolecek, C. y colaboradores, 1993. FEBS Lett. 335:299-304. 41A Fischer S. y colaboradores, 1996. J Allergy Clin Immunol 98: 189-198. 42 Matthiesen, F. y H. Lowenstein. 1991. Clin. Exp. Allergy 21:297-307. 43 Petersen, A.. y colaboradores, 1995. Int. Arch. Allergy Iramunol. 108:55-59. 43A Marknell DeWitt A. y colaboradores, Clin Exp Allergy 32: 1329-1340, 2002. 44 Valenta, R. y colaboradores, 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 106-118. 46 Esch, R. E . , and D. G. Klapper. 1989. Mol. Immunol. 26:557-561. 47 Olsen, E. y colaboradores, 1991. J. Immunol. 147:205-211. 48 Avjioglu, A. y colaboradores, 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:340. 52 Kos T. y colaboradores, 1993. Biochem Biophys Res Commun 196: 1086-92. 53 Diaz-Perales A. y colaboradores, 2000. Clin Exp Allergy 30: 1403-1410. 54 Ipsen, H., and O.C. Hansen. 1991. Mol. Immunol. 28: 1279-1288. 55 Taniai, M. y colaboradores, 1988. FEBS Lett . 239:329-332. 56 Griffith, I.J. y colaboradores, 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91:339. 57 Sakaguchi, M. y colaboradores, Allergy 45: 309-312, 1990. 57A Yokoyama M. y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 275: 195-202, 2000. 57B Midoro-Horiuti T. y colaboradores, J Immunol 164: 2188-2192, 2000. 57C Tinghino R. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 101: 772-777, 1998. 58 Gross GN y colaboradores, Scand J Immunol 8: 437-441, 1978. 58A Obispo TM y colaboradores, Clin Exp Allergy 23: 311-316, 1993. 58B Midoro-Horiuti T. y colaboradores, Clin Exp Allergy 31: 771-778, 2001. 59 Lombardero M. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 24: 765-770, 1994. 60 Villalba, M. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 216: 863-869, 1993. 60A Asturias JA y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 100: 365-372, 1997. 60B Batanero E. y colaboradores, Eur J Biochem 241: 772-778, 1996. 60C Batanero E. y colaboradores, FEBS Lett. 410: 293-296, 1997. 60D Tejera ML y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 104: 797-802, 1999. 60E Ledesma A. y colaboradores, FEBS Lett 466: 192-196, 2000. 60F Barral P. y colaboradores, J Immunol 172: 3644-3651, 2004. 61 Yi FC y colaboradores, Clin Exp Allergy 32: 1203-1210, 2002. 61A Ramos JD y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 126: 286-293, 2001. 62 Chua, K. Y. y colaboradores, J. Exp. ed. 167: 175-182, 1988. 62A Chua, K. Y. y colaboradores, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 118-123, 1990. 62B Smith AM y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 124: 61-63, 2001. 62C Smith AM y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 107: 977-984, 2001. 63 Smith WA, Thomas WR. Int Arch Allergy Immunol 109: 133-140, 1996. 64 Lake, F.R. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 87: 1035-1042, 1991. 65 Tovey, E. R. y colaboradores, J. Exp. Med. 170: 1457-1462, 1989. 66 Yasueda, FL, T. Shida, T. Ando, S. Sugiyama, and H. Yamakawa. 1991. Allergenic and proteolytic properties of fourth allergens from Dermatophagoides mites. In: "Dust Mite Allergens and Asthma. Report of the 2nd international workshop" A. Todt, Ed., UCB Institute of Allergy, Brussels, Belgium, páginas 63-64. 67 Shen, H.-D. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 23: 934-940, 1993. 67A O'Neil GM y colaboradores, Biochim Biophys Acta, 1219: 521-528, 1994. 67B King C. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 98: 739-747, 1996. 68 Lind P. y colaboradores, J. Immunol. 140: 4256-4262, 1988. 69 Dilworth, R. J. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 21: 25-32, 1991. 70 Nishiyama, C. y colaboradores, Int. Aren. Allergy Immunol. 101: 159-166, 1993. 70A Trudinger, M. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 21: 33-38, 1991. 71 Shen HD y colaboradores, Clin Exp Allergy 25: 1000-1006, 1995. 71A Tategaki A. y colaboradores, ACI International suppl . 1: 74-76, 2000. 72 Aki T. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 96: 74-83, 1995. 72A Tsai L. y colaboradores, Clin Exp Allergy 29: 1606-1613, 1999. 72B Gafvelin G. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 107: 511-518, 2001. 73 van Hage-Hamsten . y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 91:353, 1993. 74 Várela J. y colaboradores, Eur J Biochem 225: 93-98, 1994. 74A Schmidt M. y colaboradores, FEBS Lett 370: 11-14, 1995. 75 Eriksson TLJ y colaboradores, Eur. J. Biochem. 268: 287-294, 2001. 75A Saarne T. y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 130: 258-265, 2003. 75B Eriksson TL y colaboradores, Eur. J. Biochem. 251 (1-2), 443-447, 1998. 76 Rautiainen J, Rytkonen M, Pelkonen J, Pentikainen J, Perola O, Virtanen T, Zeiler T, Mantyjarvi R. BDA20, a major bovine dander allergen characterised at the sequence level is Bos d 2. Submitted. 77 Gjesing B, Lowenstein H. Ann Allergy 53:602, 1984. 78 de Groot, H. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 87: 1056-1065, 1991. 79 Konieczny, A. Personal communication; Immunologic Pharmaceutical Corp. 79A Bulone, V. Eur J Biochem 253: 202-211, 1998. 79B Swiss-Prot acc. P81216, P81217. 79C Dandeu J. P. y colaboradores, (1993) . J. Chromatogr. 621:23-31. 79D Goubran Botros H. y colaboradores, 1998. J. Chromatogr. B 710:57-65. 79E Hilger C. y colaboradores, Allergy 52: 179-187; and Hilger C. y colaboradores, Gene 169:295-296, 1996. 79P Ichikawa K. y colaboradores, Clin Exp Allergy, In Press 2001. 80 Fahlbusch B. y colaboradores, Allergy 57: 417-422, 2002. 81 McDonald, B. y colaboradores, 1988. J. Allergy Clin. Immunol. 83:251. 81A Clarke, A. J. y colaboradores, 1984. EMBO J 3: 1045-1052. 82 Longbottom, J. L. 1983. Characterisation of allergens from the uriñes of experimental animáis. McMillan Press, London, páginas 525-529. 83 Laperche, Y. y colaboradores, 1983. Cell 32:453-460. 83A Bush RK y colaboradores, 1999. J Allergy Clin Immunol 104: 665-671. 83B Aukrust L, Borch S . 1979. Int Arch Allergy Appl Immunol 60:68-79. 83C Sward-Nordmo M. y colaboradores', 1988. Int Arch Allergy Appl Immunol 85:288-294. 84 Shen, y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 103:S157, 1999. 84A Crameri R. Epidemiology and molecular basis of the involvement of Aspergillus fumigatus in allergic diseases.

Contrib. icrobiol. Vol . 2, Karger, Basel (in press). 84B Shen, y colaboradores, (manuscript submitted) , 1999 84C Shen HD y colaboradores, Vacuolar serine proteinase: A major allergen of Aspergillus fumigatus. 10th International Congress of Immunology, Abstract, 1998. 85 Kumar A. y colaboradores, 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 91: 1024-1030. 85A Saxena S. y colaboradores, 2003. Clin Exp Immunol 134:86-91. 85B Baur X. y colaboradores, Allergy 57: 943-945, 2002. 86A Shen HD y colaboradores, 1996. Clin Exp Allergy 26:444-451. 86B Shen, y colaboradores, Abstract; The XVIII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, Brussels, Belgium, 3-7 July 1999. 87 Shen HD y colaboradores, Clin Exp Allergy 29: 642-651, 1999. 87A Shen HD y colaboradores, Clin Exp Allergy 25: 350-356, 1995. 87B Shen HD y colaboradores, J Lab Clin Med 137: 115-124, 2001. 88 Woodfolk JA y colaboradores, 1998. J Biol Chem 273:29489-96. 88A Deuell, B. y colaboradores, 1991. J. Immunol. 147:96-101. 89 Shen, H.D. y colaboradores, 1991. Clin. Exp. Allergy 21: 675-681. 89A Horner WE y colaboradores, 1995. Int Arch Allergy Immunol 107:298-300. 89B Chang CY y colaboradores, J Biomed Sci 9: 645-655, 2002. 90 Yasueda H. y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 248: 240-244, 1998. NB: strain TI 2782 (Teikyo University Institute for Medical ycology) equal to strain CBS 1878 (Central Bureau von Schimmelkulturen) . 90A Onishi Y. y colaboradores, Eur J Biochem 261: 148-154, 1999. NB: strain TIMM2782 (Teikyo University Institute for Medical Mycology) equal to strain CBS 1878 (Central Bureau von S chimme lkulturen) . 91 Schmidt M. y colaboradores, Eur J Biochem 246: 181-185, 1997. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection) . 91A Rasool 0. y colaboradores, Eur J Biochem 267: 4355-4361, 2000. NB: strain ATCC no. 42132 (American Type Culture Collection) . 91B NB: strain 4625 (Indian Agricultural Research Institute, PUSA; New Delhi, India) . 92 Kuchler, K. y colaboradores, 1989. Eur. J. Biochem. 184:249-254. 93 Gmachl, M. , and G. Kreil. 1993. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 : 3569-3573. 93A Hoffman DR. 1977. J Allergy Clin. Inmuno1. 59:364-366. 94 Habermann, E. 1972. Science 177:314-322. 95 Hoffman DR, Jacobson RS. 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 97:812-821. 95A Hoffman DR, El-Choufani AE, Smith MM, de Groot H. 2001.

Occupational allergy to bumblebee venom: Allergens of Bombus terrestris. J Allergy Clin Immunol In press. 95B Helm R. y colaboradores, 1996. J Allerg Clin Immunol 98: 172-180. 95C Pomes A. y colaboradores, 1998. J Biol Chem 273:30801-30807. 96 Arruda LK y colaboradores, J Biol Chem 270: 19563-19568, 1995. 97 Arruda LK y colaboradores, J Biol Chem 270:31196-31201, 1995. 98 Arruda LK y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 107:295-297, 1995. 98A u CH y colaboradores, 1998. J Allergy Clin Immunol 101: 832-840. 98B Melen E. y colaboradores, 1999. J Allergy Clin Immunol 103: 859-6 . 98C Wu CH y colaboradores, J Biol Chem 271: 17937-17943, 1996. 98D Wu CH y colaboradores, Molecular Immunol 34: 1-8, 1997. 98E Santos ABR y colaboradores, 1999. J Allergy Clin Immunol 104:329-337. 98F Asturias JA y colaboradores, 1999. J Immunol 162:4342-4348. 99 Mazur, G. y colaboradores, 1990. Monog. Allergy 28:121-137. 99A Moneo I. y colaboradores, Allergy 58: 34-37, 2003. 100 Soldatova, L. y colaboradores, 1993. FEBS Letters 320: 145-149. 101 Lu, G. y colaboradores, 1994. J. Allergy Clin. Immunol. 93:224. 102 Fang, K. S. F. y colaboradores, 1988. Proc. Nati. Acad. Sci. , USA 85: 895-899. 103 King, T. P. y colaboradores, 1990. Prot . Seq. Data Anal. 3:263-266. 104 Lu, G. y colaboradores, 1993. J. Immunol. 150: 2823-2830. 105 King, T. P. and Lu, G. 1997. Unpublished data. 105A King TP y colaboradores, 1996. J. Allergy Clin. Immunol. 98:588-600. 106 Hoffman, D.R. 1993. J. Allergy Clin. Immunol. 92:707-716. 107 Hoffman DR. 1992. Unpublished data. 108 Hoffman DR. J. Allergy Clin. Immunol. 91:187, 1993. 109 Jacobson RS y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 89:292, 1992. 110 Hoffman DR. J. Allergy Clin. Immunol 91: 71-78, 1993. 111 Schmidt M. y colaboradores, FEBS Letters 319: 138-140, 1993. 111A Paddock CD y colaboradores, J Immunol 167: 2694-2699, 2001. 112 Elsayed S, Bennich H. Scand J Immunol 3: 683-686, 1974. 113 Elsayed S. y colaboradores, Immunochemistry 9: 647-661, 1972. 114 Hoffman, D.. R. 1983. J. Allergy Clin. Immunol. 71: 481-486. 115 Langeland, T. 1983. Allergy 38:493-500. 116 Daul CB, Slattery M, Morgan JE, Lehrer SB. 1993. Common Crustácea allergens: identification of B cell epitopes with the shrimp specific monoclonal antibodies. In: "Molecular Biology and Immunology of Allergens" (D. Kraft and A. Sehon, eds.). CRC Press, Boca Ratón, páginas 291-293. 116A Shanti KN y colaboradores, J. Immunol. 151: 5354-5363, 1993. 117 Yu CJ y colaboradores, J Immunol 170: 445-453, 2003. 117A Miyazawa M y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol . 98: 948-953, 1996. 117B Asturias JA y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 128: 90-96, 2002. 117C Lopata AL y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 100: 642-648, 1997. 117D Hoffmann-Sommergruber K. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 29: 840-847, 1999. 118 Monsalve RI y colaboradores, Bioc em. J. 293: 625-632 1993. 118A. Monsalve RI y colaboradores, 1997. Clin Exp Allergy 27:833-841. 119 Mena, M. y colaboradores, Plant Molec. Biol. 20: 451-458, 1992. 119A Palosuo K. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 108: 634-638, 2001. 119B Xu H. y colaboradores, Gene 164: 255-259, 1995. 119C Pastorello EA y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 94: 699-707, 1994. 119D Diaz-Perales A. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 110: 790-796, 2002. 119E Galleguillos F, Rodríguez JC. Clin Allergy 8: 21-24, 1978. 119F Baur X. Clin Allergy 9: 451-457, 1979. 119G Gailhofer G. y colaboradores, Clin Allergy 18: 445-450, 1988. 120 Menendez-Arias, L. y colaboradores, 1988. Eur. J. Biochem. 177: 159-166. 120A González R. y colaboradores, Lancet 346:48-49, 1995. 120B Kleine-Tebbe J. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 110: 797-804, 2002. 120C Sanchez-Monge R. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 106: 955-961, 2000. 121 Gavrovic-Jankulovic M. y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 110: 805-810, 2002. 121A Pastorello EA y colaboradores, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 756: 85-93, 2001. 121B Moneo I. y colaboradores, J. Allergy Clin. Immunol. 106: 177-182, 2000. 121C Asturias JA y colaboradores, 2000. Allergy 55:898-890. 122 Christie, J. F. y colaboradores, 1990. Immunology 69:596-602. 122A Baur X. y colaboradores, Clin Allergy 12: 9-17, 1982. 122B Onisuka R. y colaboradores, Int Arch Allergy Immunol 125: 135-143, 2001. 123 Czuppon AB y colaboradores, J Allergy Clin Immunol 92:690-697, 1993. 124 Attanayaka DPSTG y colaboradores, 1991. Plant Mol Biol 16: 1079-1081. 125 Chye ML, Cheung KY . 1995. Plant Mol Biol 26:397-402. 126 Alenius H. y colaboradores, 1993. Int Arch Allergy Immunol 102:61-66. 127 Yeang HY, Cheong KF, Sunderasan E, Hamzah S, Chew NP, Hamid S, Hamilton RG, Cardosa MJ. 1996. The 14.6 kD (REF, Hev b 1) and 24 kD (Hev b 3) rubber particle proteins are recognized by IgE from Spina Bifida patients with Látex allergy. J Allerg Clin Immunol in press. 128 Sunderasan E. y colaboradores, 1995. J nat Rubb Res 10: 82-99. 129 Swoboda I. y colaboradores, 2002. J Immunol. 168:4576-84. 130 Vrtala y colaboradores,,, 2007. J Immunol. 179: 1731-1739. 131 Valenta and Niederberger, 2007. J Allergy Clin Immunol. 119(4) :826-830 De acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, por lo menos uno, de preferencia por lo menos dos, más de preferencia por lo menos tres, en particular todos, de los por lo menos tres péptidos derivados del por lo menos un alérgeno de tipo silvestre es un péptido que enlaza célula B.

"Péptidos que enlazan célula B" que son utilizados para la vacunación de alergia de acuerdo con la invención se derivan de o están cercanos a los sitios que enlazan IgE de los alérgenos, pero no muestran o mínimamente muestran per se reactividad de IgE comparada con el alérgeno de tipo silvestre (Focke y colaboradores, Clinical & Experimental Allergy 40 (2010) : 385-397 ) . Los requerimientos para su producción y selección son el conocimiento de la secuencia primaria del alérgeno y considerando los sitios que enlazan IgE. En la inmunización, los péptidos que enlazan célula B fusionados a un portador inmunogénico adecuado, son capaces de inducir la producción de IgG específico de alérgeno que puede bloquear el enlace IgE al alérgeno. Si el IgG inducido con la proteína de fusión puede reconocer el alérgeno se puede determinar, por ejemplo, al probar el IgG para reactividad con el alérgeno completo. Los métodos adecuados incluyen ELISA, manchado de punto o ensayos de manchado de Western. Se prefieren esos péptidos que inducen IgG que bloquea el enlace de IgE de los pacientes al alérgeno.

La presente invención muestra que el uso de péptidos que enlazan célula B adecuados en particular cuando tres o más son fusionados a un portador adecuado de acuerdo con la presente invención permite la inducción de respuesta de IgG que son mejor enfocadas a los epitopos IgE que aquellos inducidos por inmunización aun con un alérgeno completo. Además, la invención muestra que la combinación de los péptidos apropiados y su número con un portador adecuado pueden dirigir la respuesta inmune especifica de alérgeno hacia una respuesta inmune anti-alérgica favorable (caracterizada por la inducción de respuestas preferencialmente de IgG especifico de alérgeno y no de IgE y respuestas de citoquinas tolerogénicas (IL-10) y Thl (Interferona gamma).

Por otra parte, esto sorprendentemente resultó de que - a pesar del hecho de que carecen epitopos de célula T específicos de alérgeno - los polipéptidos de acuerdo con la invención que contienen 3 o más péptidos que enlazan célula B fusionados a un portador inmunogénico son capaces de reducir las reacciones de célula T especificas de alérgeno. Esto se muestra por el hecho de que la presencia de IgG especifico de alérgeno inducido por la vacunación terapéutica con los polipéptidos hipoalergénicos de la presente invención reduce la activación de célula T especifica de alérgeno causada por la presentación de antigeno facilitada por IgE en PBMCs de individuos alérgicos humanos vacunados. (Fig. 16).

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, por lo menos uno de los por lo menos tres péptidos exhibe nada o reducida capacidad de enlace de IgE comparada con el alérgeno de tipo silvestre.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, por lo menos uno, de preferencia por lo menos dos, más de preferencia por lo menos tres, de los por los menos tres péptidos que enlazan célula B exhiben nada o sustancialmente nada de reactividad de célula T.

La presencia de epitopos de célula T específicos de alérgeno, pueden dar origen a efectos secundarios mediados por célula T indeseados. Por lo tanto, particularmente se prefiere usar péptidos que exhiben nada o sustancialmente nada de reactividad de célula T con el fin de obtener los polipéptidos de la presente invención.

Sin embargo, también los fragmentos de alérgeno que comprenden por lo menos un epítopo de célula T se pueden utilizar en el polipéptido de acuerdo con la presente invención.

"Que exhibe capacidad que enlaza IgE reducida", como se utiliza en la presente, significa que las moléculas de acuerdo con la presente invención muestran capacidad o actividad de enlace de IgE significativamente reducida (por lo menos 50% menos, de preferencia por lo menos 70% menos, más de preferencia por lo menos 80% menos, aún más de preferencia por lo menos 90% menos, mucho más de preferencia por lo menos 95% menos, capacidad de enlace comparada con el alérgeno de tipo silvestre) o aún carecen de IgE en todo.

La actividad/capacidad de enlace de IgE de las moléculas similares a péptidos y proteínas se puede determinar, por ejemplo, mediante un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) utilizando, por ejemplo, sueros obtenidos de un sujeto, (es decir, un sujeto alérgico) que se ha expuesto previamente al alérgeno de tipo silvestre. Brevemente, un péptido que es probado se recubre sobre cavidades de una placa de microtítulo. Después del lavado y el bloqueo de las cavidades, una solución de anticuerpo que consiste del plasma de un sujeto alérgico, quien se ha expuesto al péptido que es probando o la proteína de la cual se derivó, se incuba en las cavidades. Un anticuerpo secundario etiquetado se adiciona a las cavidades y se incuba. La cantidad de enlace de IgE luego cuantifica y se compara con la cantidad de IgE enlazado por un alérgeno de tipo silvestre purificado.

Alternativamente, la actividad de enlace de un péptido se puede determinar mediante el análisis de manchado de Western. Por ejemplo, un péptido que es probado se corre sobre un gel de poliacrilamida utilizando SDS-PAGE. El péptido luego se transfiere a nitrocelulosa y subsecuentemente se incuba con suero de un sujeto alérgico. Después de la incubación con el anticuerpo secundario etiquetado, se determina y se cuantifica la cantidad de IgE enlazado .

Otro ensayo que se puede utilizar para determinar la actividad de enlace a IgE de un péptido es un ensayo de ELISA de competición. Brevemente, una acumulación de IgE-anticuerpo se genera al combinar plasma de sujetos alérgicos quienes se han mostrado por ELISA directa que son reactivos con IgE con el alérgeno de tipo silvestre. Esta acumulación se utiliza en ensayos de competición de ELISA para comparar el enlace de IgE al alérgeno de tipo silvestre con el péptido probado. El enlace de IgE para el alérgeno de tipo silvestre y el péptido que es probado se determina y cuantifica .

Un "epitopo de célula T" significa una proteina, péptido o polipéptido (por ejemplo, alérgeno) o fragmento del mismo, para el cual una célula T tiene un sitio de enlace especifico de antigeno, el resultado del enlace al sitio de enlace activa la célula T. El término "que exhibe reactividad de célula T reducida", como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas que exhiben una reactividad de célula T que es significativamente reducida comparada con la estimulación inducida por el alérgeno de tipo silvestre del cual la molécula hipoalergénica se deriva utilizando cantidades equimolares en los ensayos estándares conocidos en la técnica (reactividad de célula T reducida significa por lo menos 30%, de preferencia por lo menos 50%, más de preferencia por lo menos 70%, mucho más de preferencia por lo menos 90%, menos estimulación de moléculas hipoalergénicas comparado con el alérgeno de tipo silvestre en cantidades de equimolares) . En una modalidad particularmente preferida de esta invención, las moléculas pueden "carecer" de epitopos de célula T y de esta manera la molécula muestra reactiva de célula T reducida en el individuo (s) que es tratado (es decir, quien está recibiendo una molécula de plataforma de valencia que presente epitopo) . Es probable que, por ejemplo, una molécula derivada de alérgeno pueda carecer de un epitopo (s) de célula T con respecto a un individuo, o un grupo de individuos, mientras que posee un epitopo (s) de célula T con respecto a otro individuo (s) . Métodos para detectar la presencia de un epitopo de célula T son conocidos en la técnica e incluyen ensayos que detectan la proliferación de célula T (tal como la incorporación de timidina) . Los inmunógenos que no logran inducir incorporación estadísticamente significativa de timidina arriba del antecedente (es decir, generalmente, p menor que 0.05 utilizando métodos estadísticamente estándares) generalmente se consideran que carecen de epitopos de célula T, aunque será apreciado que la cantidad cuantitativa de incorporación de timidina puede variar, dependiendo del inmunógeno que es probado (ver, por ejemplo, Zhen L. y colaboradores, (Infect Immun. (2003) 71:3920-3926)) . Generalmente, un índice de estimulación abajo de aproximadamente 2-3, más de preferencia menor que aproximadamente 1, indica la carencia de reactividad de célula T y epítopos . La presencia de epítopos de célula T también se puede determinar al medir la secreción de linfocinas derivadas de célula T de acuerdo con métodos estándares. El índice de estimulación (SI) se puede calcular al dividir la tasa de proliferación (captación de timidina) de las células estimuladas a través de la tasa de proliferación de células no estimuladas en medio solo. SI = 1 significa no estimulación, y SI>1 indica estimulación de las células. La ubicación y el contenido de epítopos de célula T, si están presentes, se puede determinar empíricamente.

La secreción de citoquinas se puede determinar además de la estimulación de célula T. Por ejemplo, IFN-gamma e IL-10 como biomarcadores para actividad incrementada de célula T regulatorias se han reconocido como citoquinas que acompañan a una inmunoterapia de alergia exitosa .

Los fragmentos de péptido de la presente invención de preferencia están compuestos o consisten de los aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 o 212 a 241 de Phl p 1, aminoácidos 1 a 33, 8 a 39, 34 a 65 o 66 a 96 of Phl p 2, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 o 176 a 212' de Phl p 5, aminoácidos 23 a 54, 56 a 90, 73 a 114 o 95 a 127 de Phl p 6, aminoácidos 1 a 34 o 35 a 70 de cadena 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 o 64 a 92 de cadena 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79, 75 a 104, 30 a 74 o 60 a 104 de Bet v 1, aminoácidos 1 a 30, 52 a 84 o 188 a 222 of Der p 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 o 98 a 129 of Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 o 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111-145, 140-170, 175-205, 210-250 o 250-284 de Der p 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 o 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 o 32 a 70, 32 a 60, 52 a 84, 32 a 70 (Cys->Ser) de Der p 23, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 o 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 o 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 o 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 o 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 o 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 o 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 o 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 o 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 o 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 o fragmentos o variaciones de secuencia de los mismos.

Las secuencias de aminoácidos especificas de las moléculas derivadas de alérgeno identificadas en lo anterior son (los péptidos en la siguiente tabla que tienen un residuo de cisteina (C) N- y/o C-terminal que es utilizado en el polipéptido de la presente invención pueden carecer del residuo de cisteina) : Péptido Posición Secuencia SEQ ID ¡No.

Pep Alia 1.1 19-58 APLES QDTASCPVTTEGDYVWKISEFYGRKPEGTYYN 23 SL Pep Alt a 1.2 59-95 GFMKATNGGTLDFTCSAQADKLEDHKWYSCGENSFM 24 Pep Alt a 1.3 91-120 ENSFMDFSFDSDRSGLLLKQKVSDDrTYVA 25 Pep Alt a 1.4 121-157 TATLPNYCRAGGNGPKDFVCQGVADAYITLVTLPKSS 26 Pep Alta 2.1 1-40 MHSS NFFKD IFRSLSKEDPDYSRNIEGQVIRLHWDW 27 AQ Pep Alt a 2.2 41-80 LLMLSA RMKVAF LDIEKDQRVWDRCTADDLKGR 28 GFKR Pe Alta2.3 81-120 CLQFTLYRP DLLSLLNEAFFS F ENRE?I tDLEYAA 29 Pe Alta2.4 121-160 5ISMARI.EDLWK.EYQKIFPSIQV1TSAFRSIEPELTVYT 30 Pe Alta2.5 161-190 CLKKIEASFELIEENGDPKITSEIQLL AS 31 Pe Altaó.l 1-34 ?TKIHARSVYDSRGNPTVEVDIVTE GLHRAI 32 Pe Alta6.2 35-74 VTETGLHRA1VPSGASTGSHE ACELRDGDKS WGG GV 33 TK Pc AKa6.3 74-115 APALIKEKXDVKDQSAVDAFLNKLDGTTNKTns(LGANAI 34 LGVS PepAlta6.4 125-165 EKGVPLYAHISDLAGT KKPYVLPVPF 35 Q VLNGGSHAGGRLA Pop Alt a 6.5 174-213 CEAPTFSEAMRQGAEVYQKLKALAKKTYGQSAGNVGD 36 EGG Pe Alta .6 241-280 IKIAMDVASSEFYKADEKKYDLDFK PDSDKSKWLTYE 37 QL PepAlta6.7 294-333 VSÍEDPFAEDDWEAWSYFFKTYDGQIVGDDLTVTNPEFI 38 PepAlta6.8 361-400 AKDAFGAGWGVMVSHRSGETEDVTIADIWGLRSGQIK 39 TG Pe Alla6.9 401-438 APARSERLAKLNQILRtEEELGDNAVYAGNNFRTAVNL 40 PepAm al.l 31-70 EILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAENRKALA 41 DC PepAmbal.2 80-120 GGKDGDrmnTSELDDDVA PKEGTLRFGAAQ RPLWI 42 IFE Pe Ainbal.3 125-155 IRLDKEMWNSDK DGRGAKVEItNAGFTL 43 PepAmbal.4 160-200 NVII]MNMHDVK\^ 44 IS Pep Araba 1.5 225-263 GTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLATVA 45 F Pe Ambal.6 264-300 NTFTDNVDQRMPRCRHGFFQWNNNYDKWGSYAIGGS 46 PepAmbal.7 305-350 ILS(^NRFCAPDERSKXNVLGRHGEAAAESMKWN RT 47 NK.DVLENGA PepAmbal.8 356-396 GVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSCQPGA 48 PC PepArtvt.1 27-70 S LCE TSKTYSGKCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHK 49 REAG ES PepArtv 1.2 70-100 SCFCYFDCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGS 50 PepArtv 1.3 92-132 APPPAAGGSPSPPADGGSPPPPADGGSPPVTJGGSPPPPST 51 H Canf 1 Pepl 19-56 QDTPALG DTVAVSGKWYLKAMTADQEVPE PDSVTP 52 CanflPe 2 51-90 DSVTPMILKAQ GGNLEAi ^ 53 SE CanflPe 3 78-118 CQNITWLHKTSEPGKYTAYEGQRWFIQPSPVRDHYIL 54 YC Canfl e 4 106-145 QPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQSQEA 55 LE CanflPep5 135-174 RDPEQSQEALEDFREFSRAKGLNQEILELAQSETCSPGG 56 Q Canf2Pepl 19-58 QEGNHEEPOGGLEELSGRWHSVALASNKSDLIKPWGHF 57 RV Canf2Pe 2 52-91 P GHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKVSLTAF 58 Can f 2 Pep 3 82-119 CEKVSLTAFKTATS TOLEYWGHNDLYLAEVDPKSYL 59 Canf2Pep4 106-144 NDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLMVRDLS 60 R Canf2Pep5 139-180 VRDLSRQQDFLPAFESVCEDIGLHKDQIWLSDDDRCQ 61 GSRD Feld2Pepl 25-58 EAHQSEIAHRFNDLGEEHFRGLVLVAFSQYLQQC 62 Feld2Pep2 99-133 CTVASLRD YGEMADCCEKKEPERNECFLQHKDDN 63 Feld2Pep3 154-183 NEQRFLGKYLYEJARRHPYFYAPELLYYAE 64 Feld2Pep4 277-307 CADDRADLA YICENQDStSTKL ECCGKPV 65 Feld2Pe 5 334-363 VED EVC NYQEAKDVFLGTFLYEYSRRHP 66 Feld2Pep6 373-402 LAKEYE ATLEKCCATDDPPACY AHVFDEFK 67 Feld2Pep 544-573 EKQ1KKQSALVELLKHKPKATEEQLKTVMG 68 Feld2Pe 8 579-608 VDKCCAAEDKEACFAEEGPKLVAAAQAALA 69 Feld2Pcp9 58-99 CPFEDHVKLVNEVTEFAKGCVADQSAANCEKSLHELLG 70 DKLC Feld2Pe lO 125-165 CFLQHKDDNPGFGQLVTPEADA CTAFHE EQRFLGK 71 YLYE Feld2Pe l.l 1.83-224 EEYKGVFTECCEAADKAACLTPKVDALRE VLASSAKE 72 RL C Feld2Pepl2 224-261 CASLQKFGERAFKAWSVARLSQKFPKAEFAEISKLVTD 73 Feld2Pe l3 252-289 FAEISKLVTDI.AKIHKECCHGDLLECADDRADLAKYIC 74 Feld2 e l4 303-340 CGKPVLEKSHCISEVERDELPADLPPLAVDFVEDKEVC 75 Feld2Pepl5 416-457 CELFEKLGEYGFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRSL 76 GKV Feld2Pepl6 460-500 CTHPEAERLSCAEDYLSWL RLCVLHE TPVSERVTK. 77 C Feld epl7 501-542 CTESLVNRRPCFSALQVDETYVPKEFSAETFTFHADLCT 78 LPE Pep Olee 1.1 1-40 EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIPGASLR 79 Pep Ole e 1.2 36-66 GASLRLQC DKENGDVTFTEVGYTRAEGLYS 80 Pe Olecl.3 63-99 GLYSMLVERDH NEFCErrLISSGRKDCMEIPTEGWA 81 Pep Olee 1.4 86-120 GRKDCNEII EGWA PSLKFKLNTVNGTTRTVNPL 82 Pep Olee 1.5 107-145 LN NGTTRTVNPLGFFKKEALP CAQVYNKLGMYPP 83 NM Pep Par j 2.1 31-60 GEEACGKWQDIMPCLHFVKGEE EPSKEC 84 Pep Par j 2.2 45-80 CLHFVKGEE EPSKECCSGTKJLSEEVKTTEQ REA 85 Pep Par j 2.3 60-96 CCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISGI N 86 Pep Par j 2.4 97-133 ELVAEVPKKCDIK'GTLPPITADFDCSKIQS?FRGYY 87 Der 1 Pep 1 1-30 TN ACSINGNA P AEIDLRQM RTVTPIRMQGG 88 Der lPep2 52-84 NQSLDLAEQELVDCASQHGCHGD?P GIEYIQ 89 Der lPep3 85-115 HNGWQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN 90 Der lPe 4 99-135 REQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVN IREALAQTH 91 Derp 1 Pep 5 145-175 DLDAFRHYDG R?IQRDNG YQPNYHAVNI V 92 Der lPepó 155-187 GRTOQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWI 93 DerplPe 7 175-208 VGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAAN1 94 Der lPep8 188-222 VRNSWDTNWGDNGYGYFAANrDLMMIEEYPYWlL 95 Derp 1 Pep 1.2 1-41 TN ACS1NGN APAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCW AFS 143 GVA Derp 1 Pep 2.2 42-82 ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRG 144 IEYIQ Der p 1 Pep 9 27-57 MQGC :GSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLD 145 Dcr p 2 Pep 1 1-33 DQVDVÍOX:AMHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGK 96 Derp2Pe 2 21-51 CHGSEPCIIHRG PFQLEAVFEANQNSKTAK 97 Derp2Pep3 42-73 EANQNSKTAKIEIKAS1EGLEVDVPGIDPNAC 98 Der 2 Pep4 62-103 EVDVPGIDP ACHYM CPLV GQQYDIKYTWTVPK1AP 99 SEN Der p 2 Pep 5 98-129 APKSENVWTVKVMGDNGVLACAIATHAKIRD 100 Der p 5 Pep l 1-35 EDKKHDYQNEFDFLLMERJHEQIK GELALFYLQ 101 Der p 5 Pep 2 25-60 KKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTI 102 Der p 5 Pep 3 65-95 DGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQY LEMAB-KSG 103 Der 5 Pep4 78-114 DLDIFEQYNLEMAJOCSGDn-ERDLKKEEARVKKIEV 104 Dcrp7 Pep 1 1-30 DPIHYD 1TEE1NKAVDEAVAAIEKSETFD 105 Derp7Pep2 20-50 VAAIEKSETFDPMKVPDHSDKFERHIGIIDL 106 Derp7Pe 3 50-80 LKGELDMR IQVRGL QM RVGDATVKSEDG 107 Der p 7 Pcp 4 90-125 VHDDVVSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFWEL 108 Der p 7 Pep 5 125-155 LSLEVSEEGNMTLTSFEVRQFAlSrVV HIGGL 109 Derp7Pe 6 165-198 LSDVLTAIFQDTYRAEMTKVLAPAF KLELERNNQ 110 Der p 10 Pep 1 1-35 EAI JK QAMKLEKDNA1DRAEIAEQKARDANLR 111 Der lO cp2 36-70 AEKSEEEVRALQ QQQIENELDQVQEQLSAANTK 112 Der p 10 Pep 3 71-110 LEEKEKALQTAEGDVAALNRRIQUEEDLERSEERL IA 113 T DerplOPep4 111-145 A LEEASQSADESER RK LEHRSITDEERMEGLE 114 Dcr p 10 Pep 5 140-170 RMEGLENQL EARMMAEDADRKYDEVARKLA 115 Derp 10 Pep6 175-205 DLERAEERAETGESKTVELEEELRWGNNLK 116 Derp 10 Pe 7 210-250 SEEKLAO^REEAHEQQIRIMTTKLKEAEARAEFAERSVQ 117 KLQ Derp 10Pe 8 250-284 QKEVDRLEDELVHEKEKYKSISDELDQTFAELTGY 118 Derp21 Pepl .1-35 MFIVGDKKEDEWRMAFDRLMMEELEmiDQVEKGL 119 Derp21 Pep2 35-72 LHLSEQYKELE TKSKELKEQILRELTÍGENFMKGAL 120 Der 21 Pep3 70-100 GALKFFEMEAKRTDLNMFERYNYEFALESI 121 Derp21 Pe 4 90-122 YNYEFALES1 LLI LDELAKKVKAVNPDEYY 122 Der p 23 Pep 1 1-32 MANDNDDDPTTTVHPTTrEQPDD FECPSRFG 123 Derp23 Pe 2 15-48 PTTTEQPDD FECPSRFGYFADPKDPHKFYICSN 124 Der p 23 Pep 3 32-70 GYFADP DPHKFYICSN EAVHKDCPGNTRWNEDEE 125 Der 23 Pep4 32-60 GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPG T 146 Derp23 Pe 5 42-70 KFYICSNWEAVH DCPGNTRWNEDEETCT 147 Der 23 Pep 32-70* GYFADP DPH FYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETS 148 (Cys T ->Ser) Betv 1 Pepl 30-59 LFP .VAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF 126 Betv lPc 2 50-79 GPGTDKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN 127 Betv lPe 3 75-104 VDHTNFKYNYSV1EGGPIGDTLEKISNEI 128 Betv l PepA 30-74 LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTTKKISFPEGFPFKYV 143 DRVDE Bet v 1 Pep B 60-104 PEGFPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEK 144 ISNEIKI Fel d 1 cadena 1 1-34 EICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPWC 129 Pep 1 Fel d 1 cadena 1 35-70 LE ARILKNCVDAKMTEEDKENALSLLDKIYTSPLC 130 Pep 2 Fel d 1 cadena 2 1-34 V MAITCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNAC 131 Pepl Fel d 1 cadena 2 35-63 TEPERTAMK JQCtCYVENGLlSRVLDiLVC 132 Pep 2 Fel d 1 cadena 2 64-92 CMT rSSS DCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR 133 Pep 3 Phl p 5 Pep 1 98-128 CGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSS AALTSK 134 Phlp5Pep2 26-58 ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKC 135 Phl p 5 Pep 3 132-162 A YKL A YKTAEG ATPEA YD AYV ATLS EALRIC 136 Phl p 5 Pep 4 217-246 CEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVK 137 Phl p 5 Pep 5 252-283 TVATAPEY YTVFETALKKAITA SEAQKAAKC 138 Phl p 5 Pep 6 176-212 CAEEVKV1PAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPAND 139 ir Phl p 5 Pep la 93-128 CFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK 141 Phl p 5 Pep 2b 26-53 ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAC 142 Phl p 5 Pep 7 59-91 ATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPAD YR 22 Phl p 1 Pep 1 151-171 H VEKGSNPNYLALL V YVNG DGD W A VC 1 Phl p 1 Pep 2 87-117 EPVWHITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGAMAC 2 Phl p 1 Pep 3 1-30 IPKVPPGPNITATYGD WLDA STWYGKJPTGC 3 Phl p 1 Pep 4 43-70 GYKDVD PPFSGMTCJCGNTPIFKSGR JC 4 Phl 1 Pep 5 212-241 CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEG KADTSYESK 5 Phl p 2 Pep 1 1-33 VPKVTFTVEKGSNEKHLAVLVKYEGDTMAEVELC 6 Phlp 2 Pep 2 28-39 CVEKGSNE HLAVLVKYEGDTMAEVELREHGSD 7 Phlp 2 Pep 3 34-65 REHGSDEWVAMTT GEGGVWTFDSEEPLQCJPFNC 8 Phl p 2 Pep 4 66-96 CFRFLTE GMKNVFDDVVPEKY?GATYAPEE 9 Phl p 6 Pep 1 23-54 GKATTEEQKLmDVNASFRAAMATTANVPPAD 10 Phl p 6 Pep 2 56-90 YKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYN Plil p 6 Pep 3 95-127 AADHAAPEDKY EAFVLHFSEALRIIAGTPEVHA Phl p 6 Pep 4 73-114 DAVSKAPQLVTJKLDEVYNAAY AADHAAPED Y *) Cisteínas intercambiadas con serinas (marcadas negritas) ¦ Los términos "fragmentos de los mismos" y "variaciones de secuencia de mismos" se refieren a péptidos que se deducen de las moléculas derivas de alérgeno descritas en la presente y muestran propiedades bioquímicas (por ejemplo, la capacidad para prevenir el enlace de IgE al alérgeno del cual se derivan esas moléculas) que son comparables o idénticas a las moléculas derivas de alérgeno. Los fragmentos de la presente invención comprenden por lo menos 5, de preferencia por lo menos 7, más de preferencia por lo menos 10, sucesivo y/o un máximo de 95%, de preferencia un máximo de 90%, más de preferencia un máximo de 80% de residuos de aminoácido de la molécula derivada de alérgeno. El término "variación de secuencia" incluye modificaciones de los péptidos tal como la fragmentación (ver lo anterior) , sustituciones de aminoácidos (en particular residuos de cisteína o metionina se pueden intercambiar con serina, alanina u otros aminoácidos naturales o no naturales o derivados de aminoácidos) , supresiones o adiciones. "Variación de secuencia" se refiere también a las moléculas derivas de alérgeno de la tabla anterior, en donde el por lo menos 1, de preferencia por lo menos 2, más de preferencia por lo menos 3, aún más de preferencia por lo menos 4 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20) residuos de aminoácido se adicionan al C- y/o N-terminal .

Se observa que el alérgeno referido en la presente como "alérgeno de clon 30" es un alérgeno derivado del ácaro de polvo casero Dermatophagoides pteronyssinus y consiste de la siguiente secuencia: MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCP GNTRWNEDEETCT (SEQ ID No. 140; ver también el WO 2007/124524) .

Mientras tanto, el nombre del alérgeno Der p 23 se ha asignado al alérgeno de clon 30. Esto significa que el alérgeno Der p 23 y de clon 30 son sinónimos.

De acuerdo con la presente invención también se abarcan péptidos que son por lo menos 80% idénticos, de preferencia 90% idénticos, a las secuencias de aminoácidos descritas en lo anterior.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el polipéptido de superficie del virus de la familia Hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del mismo comprende por lo menos dos fragmentos de péptido que enlazan célula B derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre fusionado a su N-terminal y por lo menos dos fragmentos de péptido que enlazan célula B derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre fusionado a su C-terminal.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, por lo menos dos de los por lo menos tres péptidos que enlazan célula B son idénticos.

El polipéptido de la presente invención se puede utilizar como vacuna en el tratamiento o prevención de una alergia en un humano o animal.

El polipéptido de preferencia se administra a un individuo en la cantidad de 0.01 microgramo por kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, de preferencia 0.1 microgramo por kg de peso corporal a 10 microgramos por kg de peso corporal .

De acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, los polipéptidos de la presente invención se administran a un individuo en una cantidad de por lo menos 10 pg, de preferencia por lo menos 20 µ?, por polipéptido. La cantidad máxima de polipéptidos que son administrados se puede variar, pero es de preferencia a bajo de 100 pg, más de preferencia a bajo de 50 µ?, aún más de preferencia 40 pg o menos, por polipéptido.

La cantidad de polipéptidos que se pueden combinar con excipientes para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del hospedero tratado y el modo particular de administración. La dosis de la vacuna puede variar de acuerdo con factores tal como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la habilidad del anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente como es indicado por las exigencias de la situación terapéutica. La dosis de la vacuna también se puede variar para proporcionar una respuesta de dosis preventiva óptima dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, los polipéptidos y vacuna de la presente invención se pueden administrar a un individuo en intervalos varios días, una o dos semanas o aun meses, dependiendo siempre del nivel de inducción de IgG especifica de alérgeno.

En una modalidad preferida de la presente invención el polipéptido/vacuna se aplica entre 2 y 10, de preferencia entre 2 y 7, aún más de preferencia hasta 5 y mucho más de preferencia hasta 3 veces. En una modalidad particularmente preferida el intervalo de tiempo entre las vacunaciones subsecuentes se elige para estar entre 2 semanas y 5 años, de preferencia entre 1 mes y hasta 3 años, más de preferencia entre 2 meses y 1.5 años. La administración repetida del péptido/vacuna de . la presente invención puede maximizar el efecto final de una vacunación terapéutica.

De acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención tres o más péptidos que enlazan célula B seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 137, SEQ ID No. 139, SEQ ID No. 142 y SEQ ID No. 10 se enlazan N- y C-terminalmente a un pdlipéptido de superficie del virus de la familia Hepadnaviridae, de preferencia el polipéptido PreS de hepatitis o fragmentos del mismo.

Los polipéptidos de la presente invención que comprenden por lo menos los tres péptidos que enlazan célula B derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre se seleccionan de preferencia del grupo que consiste de SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18 y SEQ ID No. 19.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

El vector es de preferencia un vector de expresión. El vector que alberga la molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede utilizar para propósitos de clonación o para la producción de vectores de expresión. El vector puede ser un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago o cualquier otro vector comúnmente utilizado en ingeniería genética, y puede incluir, además de la molécula de ácido nucleico de la invención, elementos eucarióticos o procarióticos para el control de la expresión, tales como secuencias regulatorias para la iniciación y terminación de la transcripción y/o traducción, aumentadores, promotores, secuencias de señal y los similares.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el vector es un vector bacteriano, fungal, de insecto, viral o mamífero.

El vector de la presente invención de preferencia se puede emplear para propósitos de clonación y de expresión en varios hospederos similares a bacterias, levaduras, hongos filamentosos, células mamíferas, células de insecto, células de plantas o cualquiera de otras células procarióticas o eucarióticas . Por lo tanto, el vector comprende además de un ácido nucleico que codifica una molécula hipoalergénica o proteína de fusión de acuerdo con la presente invención secuencias reguladoras específicas del hospedero.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un hospedero que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención.

La molécula de ácido nucleico ' y el vector de acuerdo con la presente invención se pueden introducir en un hospedero adecuado. La molécula se puede incorporar en el genoma del hospedero. El vector puede existir extracromosómicamente en el citoplasma o incorporado en el cromosoma del hospedero.

Todavía, otro aspecto de la presente invención se relaciona a un anticuerpo dirigido contra una molécula hipoalergénica, proteína de fusión hipoalergénica o una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una formulación de vacuna que comprende por lo menos uno, de preferencia por lo menos dos, más de preferencia por lo menos tres, aún más de preferencia por lo menos 4, polipéptidos de acuerdo con la presente invención .

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la vacuna comprende por lo menos uno, de preferencia por lo menos dos, de preferencia por lo menos tres, de preferencia por lo menos cuatro, de preferencia por lo menos 5, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID. 149, SEQ ID No. 150, SEQ ID No. 151 y SEQ ID No. 152.

Dependiendo de la composición tal vacuna se puede utilizar en el tratamiento y/o prevención de alergias por polen de hierba, alergias por polen de abedul, alergias por ácaros de polvo casero o una combinación de esas alergias en individuos que sufren de tales alergias o que están en riesgo de sufrir las mismas.

El término "prevención", como se utiliza en la presente, cubre medidas no solamente para prevenir la ocurrencia de la enfermedad, tal como la reducción de factor de riesgo, sino también para detener su progreso y reducir sus consecuencias una vez establecidas. "Prevención" significa también prevenir la sensibilización de un individuo que esté en riesgo de obtener una alergia.

Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" o equivalentes gramaticales abarca el mejoramiento y/o reversión de los síntomas de la enfermedad (por ejemplo, alergia) . Un compuesto que causa un mejoramiento en cualquier parámetro asociado con la enfermedad cuando se utilizan los métodos de clasificación de la presente invención de esta manera se puede identificar como un compuesto terapéutico. El término "tratamiento" se refiere a medidas tanto de tratamiento terapéutico como profilácticas o preventivas.

De acuerdo con una de la modalidad mucho más preferida de la presente invención, la vacuna comprende polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16 y SEQ ID No. 17.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, la vacuna comprende polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 18 y/o SEQ ID No. 19.

De acuerdo con una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la vacuna comprende polipéptidos de la presente invención que comprenden fragmentos de alérgeno derivados de alérgeno de ácaro de polvo casero. Particularmente se prefieren los residuos de aminoácido 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 o 98 a 129 de Der p 2, residuos de aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 o 165 a 198 de Der p 7, residuos de aminoácido 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 o 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 o 32 a 70, 32 a 60, 52 a 84, 32 a 70 (Cys->Ser) de Der p 23, residuos de aminoácidos 1 a 30, 1 a 41, 27 a 57, 42 a 82, 52 a 84, 85 a 115, 99 a 135, 145 a 175, 155 a 187, 175 a 208 o 188 a 222 de Der p 1. Mucho más de preferencia, la vacuna comprende por lo menos uno de los polipéptidos de SEQ ID No. 149 a 152 (mostradas en la Fig. 18A-D) .

En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido/vacuna de la presente invención se administra 4 veces por año de tratamiento durante un periodo de tratamiento total de 1 a 5 años, de preferencia durante 2 a 3 años. De las 4 administraciones al año, 3 se aplican durante un periodo de 6 a 12, de preferencia 8, semanas que tienen intervalos de 3 a 6 semanas, de preferencia 4 semanas, entre la administración 1 y 2 y otras 3 a 6 semanas, de preferencia 4 semanas, entre la administración 2 y 3. La cuarta administración se aplica 3 a 7 meses después de la tercera administración. Si el periodo de tratamiento total excede 1 año, el mismo régimen de dosificación se aplica en los siguientes años de tratamiento.

Para el tratamiento de alergias estacionales (por ejemplo, alergias de polen, tal como la alergia de polen de hierba o la alergia de polen de abedul) , la administración 1, 2 y 3 se preferencia se programan antes de la estación respectiva, con la exposición del alérgeno (estación de polen) , y la cuarta administración se programa después de la estación.

La formulación de vacuna de acuerdo con la presente invención se puede formular como es conocido en la técnica y necesariamente adaptar a la manera de administración de la formulación de vacuna.

Las maneras preferidas de administración de la formulación de vacuna (de la presente invención) incluyen todos los regímenes de administración estándares descritos y sugeridos para la vacunación en general y la inmunoterapia de alergia, específicamente (oralmente, transdérmicamente, intravenosamente, intranasalmente , por la vía de la mucosa, rectalmente, etc.)- Sin embargo, es particularmente preferido administrar las moléculas y proteínas de acuerdo con la presente invención subcutáneamente o intramuscularmente .

La formulación de vacuna de acuerdo con la presente invención solamente puede comprender una proteína de cápsida viral o fragmentos de la misma de un miembro del género de Hepadnaviridae .

La formulación de preferencia además comprende por lo menos un adyuvante, excipiente farmacéutico aceptable y/o conservador.

Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de las moléculas hipoalergénicas de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar adyuvantes, por ejemplo, en un medicamento de acuerdo con la presente invención. Un adyuvante de acuerdo con la presente invención es un agente auxiliar que, cuando se administra conjuntamente o en paralelo con un antigeno, incrementa su inmunogenicidad y/o influencia la cualidad de la respuesta inmune. Por consiguiente, el adyuvante, por ejemplo, puede considerablemente influenciar el grado de la respuesta inmune humoral o celular. Los adyuvantes usuales son, por ejemplo, compuestos de aluminio, compuestos que contienen lipido o micobacterias inactivadas .

Generalmente, los adyuvantes pueden ser de formas diferentes, siempre y cuando sean adecuados para la administración a seres humanos. Ejemplos adicionales de tales adyuvantes son emulsiones de aceite de origen mineral o vegetal, compuestos minerales, tales como fosfato o hidróxido de aluminio, o fosfato de calcio, productos y derivados bacterianos, tal como P40 (derivado de la pared celular de Corynebacterium granulosum) , lipido A de monofosforilo (MPL, derivado de LPS) y derivados de muramil péptidos y conjugados de los mismos (derivados de componentes de micobacterias) , alumbre, adyuvante de Freund incompleto, liposina, saponina, escualeno, etc (ver, por ejemplo, Gupta R.K. y colaboradores, (Vacuna 11:293-306 (1993)) y Johnson A.G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289). El medicamento de la presente invención comprende mucho más de preferencia alumbre como adyuvante.

Otra modalidad preferida de la presente invención es una combinación de más de una proteina de fusión qué contiene péptidos hipoalergénicos y la proteina PreS de hepatitis B. Estas combinaciones se pueden derivar de péptidos de un solo alérgeno o de diferentes alérgenos de la misma fuente de alérgeno o de varias fuentes de alérgeno diferentes .

Una modalidad preferida de la presente invención se relaciona a una mezcla de cuatro proteínas de fusión que contienen péptidos hipoalergénicos de Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, y Phl p 6 y la proteína PreS del virus de hepatitis B.

Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona a una proteína de fusión o una mezcla de 2 proteínas de fusión que contienen péptidos hipoalergénicos de Bet v 1 y la proteína PreS del virus de hepatitis B.

Todavía otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona a una mezcla de por lo menos 2 proteínas de fusión que contienen péptidos hipoalergénicos de alérgenos de ácaro de polvo casero, más de preferencia seleccionados de Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 21 y Der p 23 y la proteina PreS del virus de hepatitis B. Mucho más de preferencia, la mezcla contiene 3 proteínas de fusión que contienen péptidos hipoalergénicos derivados de Der p 1, Der p 2 y Der p 23. Particularmente se prefiere que la mezcla comprenda por lo menos uno, de preferencia por lo menos dos, más de preferencia por lo menos tres, de los polipéptidos mostrados en la SEQ ID No. 149 a 152 (ver también la fig. 18A-D) .

Generalmente, las formulaciones de vacuna específicas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar para el tratamiento o prevención de diferentes alergias mediante la combinación de polipéptidos hipoalergénicos de la invención que representan los alérgenos clínicamente relevantes de una fuente de alérgeno. Métodos para determinar los alérgenos clínicamente relevantes de una fuente de alérgeno son conocidos en la técnica y se han descrito anteriormente (Valenta y Niederberger, 2007, J Allergy Clin Immunol, 119 (4 ): 826-830 ) . En una modalidad preferida, los polipéptidos hipoalergénicos de la formulación de vacuna específica se adsorben a un adyuvante que se puede utilizar en humanos (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y la mezcla se administra 3-4 veces por año durante 1-3 años aplicando más de 10µg de cada polipéptido presente en la formulación de vacuna por dosis.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, las formulaciones comprenden 10 ng a 1 g, de preferencia 100 ng a 10 mg, especialmente de 0.5 µ a 200 ]iq de la molécula o anticuerpo hipoalergénico.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de una proteina o un anticuerpo hipoalergénico de acuerdo con la presente invención para fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección viral y/o una alergia en un humano o animal-.

El medicamento de preferencia además comprende por lo menos un adyuvante, excipiente farmacéutico aceptable y/o conservador .

El medicamento de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para la inmunización activa (administración de la proteina y/o moléculas hipoalergénicas de la invención) , asi como para la inmunización pasiva (anticuerpos dirigidos a la proteina y/o moléculas hipoalergénicas de la invención) .

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el medicamento comprende 10 ng a 1 g, de preferencia 100 ng a 10 mg, especialmente de 0.5 g a 200 µ? de la molécula hipoalergénica, molécula de ácido nucleico, vector, hospedero o anticuerpo.

El medicamento de preferencia se administra a un individuo en una cantidad de 0.01 pg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, de preferencia 01 ug/kg de peso corporal a 10 g/kg de peso corporal.

En una modalidad particularmente preferida, el medicamento se administra en una dosis que contiene una cantidad absoluta de 5 a 200 pg, más de preferencia 10-80pg, mucho más de preferencia 20-40 g de cada polipéptido hipoalergénico incluido.

El régimen de dosificación particular, es decir, dosis, sincronización y repetición, dependerá del individuo particular y de la historia médica de ese individuo. Las consideraciones empíricas, tal como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. La frecuencia de administración se puede determinar y ajustar durante el transcurso de la terapia.

Mucho más de preferencia, el régimen de dosificación para el medicamento consistirá de 4 inyecciones subcutáneas al año de una y la misma dosis durante un periodo de tratamiento total de 2 a 3 años. De las 4 inyecciones subcutáneas al año 3 se aplican dentro de un período de 6 a 12, de preferencia 8, semanas que tiene intervalos de 3 a 6 semanas, de preferencia 4 semanas, entre la inyección 1 y 2 y otras 3 a 6 semanas, de preferencia 4 semanas, entre la inyección 2 y 3. La cuarta inyección se aplica 4 a 6 meses después de la tercera administración. El mismo régimen de dosificación se aplica en los siguientes años de tratamiento.

Para el tratamiento de alergias estacionales (por ejemplo, alergias al polen, tal como la alergia de polen de hierba o alergia de polen de abedul) la administración 1, 2 y 3 de preferencia se programan antes de la estación respectiva, con la exposición de alérgeno (estación de polen) , y la cuarta administración se programa después de la estación.

El individuo a quien se administra el medicamento de acuerdo con la presente invención es de preferencia un individuo o animal que está teniendo o está en riesgo de tener una alergia.

Los sujetos que tienen o están en riesgo de tener una alergia, condición alérgica, trastorno alérgico o enfermedad alérgica incluyen sujetos con una condición alérgica existente o una predisposición conocida o sospechosa hacia desarrollar un síntoma asociado con o causado por una condición alérgica. De esta manera, el sujeto puede tener una condición, trastorno o enfermedad alérgica crónica activa, un episodio alérgico agudo, o una condición, trastorno o enfermedad alérgica latente. Ciertas condiciones alérgicas están asociadas con factores ambientales estacionales o geográficos. De esta manera, sujetos en riesgo incluyen aquellos en riesgo de sufrir una condición en base a una historia personal o familiar previa, y de estación o ubicación física, pero que la condición o un síntoma asociado con la condición no se puede manifestar actualmente por si mismo en el sujeto.

La administración del medicamento de acuerdo con la presente invención, que comprende por lo menos una molécula hipoalergénica como es descrito en la presente, a un individuo puede prevenir la sensibilización del individuo o puede inducir una respuesta inmune apropiada a los alérgenos. Si el medicamento de la presente invención se utiliza para prevenir la sensibilización, éste se debe administrar a un individuo antes del primer contacto con el alérgeno. Por lo tanto, se prefiere administrar el medicamento de acuerdo con la presente invención a neonatos y niños. Esto resultó de que también la administración del medicamento de acuerdo con la invención a embarazadas inducirá la formación de anticuerpos dirigidos contra los alérgenos en el niño no nacido. Es especialmente benéfico utilizar moléculas hipoalergénicas de acuerdo con la presente invención para tales terapias, debido a que los efectos secundarios de los epitopos de células T específicos de alérgeno que ocurren en el curso de la inmunoterapia de alérgeno se pueden reducir significativamente o aun ser evitadas completamente.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de una proteína de cápsida viral a partir de un virus de la familia Hepadnayiridae como un portador en medicamentos o vacunas.

Una de las ventajas de tal . portador es que no solamente el antígeno fusionado o conjugado en el mismo se puede exponer al sistema inmune, sino también una respuesta inmune contra la proteina de cápsida de un hepadnavirus se induce. Consecuentemente, tal vacunación puede conducir a la prevención y/o tratamiento de enfermedades causadas por hepadnavirus. El virus es de preferencia de la especie del virus de hepatitis B humano.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una molécula hipoalergénica derivada de Phl p 5 (GenBank Nr. X7435) que tiene un truncamiento C- y/o N-terminal y que carece sustancialmente de la capacidad de enlace de IgE.

El polen de hierba es una de las fuentes estacionales al aire libre más potentes de alérgenos portados por el aire responsables para la fiebre del heno y asma alérgico .

Más de 40% de los individuos alérgicos exhiben reactividad de IgE con alérgenos de polen de hierba, que se dividen en más de 11 grupos. Más de 80% de los pacientes alérgicos al polen de hierba reaccionan con alérgenos del grupo 5.

Los alérgenos del grupo 5 son proteínas altamente homologas, no glicosiladas con un intervalo de masa molecular de 25-33kD. Varios alérgenos del grupo 5 se han clonado y/o caracterizado inmunológicamente .

El experimento para reducir la actividad alergénica al introducir mutaciones puntuales, mutaciones de varios aminoácidos en hilera o supresiones no mostró efecto (Schramm G, y colaboradores, J. Immunol 1999; 162:2406-1435). Las regiones de enlace de IgE de Phl p 5 (Flicker S, y colaboradores, J. Immunol 2000; 165:3849-3859) ya se han descrito y se ha resuelto la estructura tridimensional (Maglio O, y colaboradores, 2002. Protein Eng. 15:635-642).

Esto resultó que en particular, los péptidos Phl p 5 de acuerdo con la presente invención, que son C - y/o N-terminalmente truncados y carecen de capacidad de enlace de IgE, se pueden emplear para la vacunación activa de individuos .

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la molécula truncada sustancialmente carece de los epitopos de célula T y de esta manera carece de la reactividad de célula T especifica de Phl p 5.

Cómo ya se resumió en lo anterior, los efectos secundarios posteriores de la inmunoterapia de alérgeno se pueden reducir significativamente o aun ser evitados si las moléculas hipoalergénicas sustancialmente carecen de epitopos de célula T específicos de alérgeno.

Las moléculas Phl p 5 truncadas que carecen de los epitopos de células T están compuestas de los aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58 o 252 a 283 de Phl p 5 o fragmentos o variaciones de secuencia de los mismos.

En particular, estas moléculas truncadas sustancialmente muestran baja o nada de reactividad de células T especificas de alérgeno y no obstante, son capaces de provocar una respuesta inmune apropiada dirigida contra el alérgeno de tipo silvestre.

De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, el Phl p 5 truncado hipoalergénico está compuesto de los aminoácidos 132-162, 217-246 o 176-212 de Phl p 5 o variaciones de secuencia de los mismos.

Estas moléculas hipoalergénicas comprenden uno o más epitopos de células T, pero carecen de la capacidad de enlace de IgE.

Otra modalidad preferida de la presente invención con las moléculas Phl p 1 truncadas gue carecen de los epitopos de células T, gue están compuestas de los aminoácidos 1 a 30, 43 a 70, 87 a 117, 151 a 171 o 214 a 241 de Phl p í o variaciones de secuencia de los mismos fusionados a una proteina portadora viral, de preferencia la proteina pre S de Hep B.

Otra modalidad preferida de la presente invención son las moléculas Phl p 2 truncadas gue carecen de epitopos de células T, gue están compuestas de los aminoácidos 1 a 33 de 8 a 39, 34 a 65 o 66 a 96 de Phl p 2 o variaciones de secuencia de los mismos fusionados a una proteina portadora viral, de preferencia la proteina pre S de Hep B.

Otra modalidad preferida de la presente invención son las moléculas Phl p 6 truncadas que carecen de los epítopos de células T, que están compuestas de los aminoácidos 23 a 54, de 56 a 90 y 73 a 114 o 95 a 127 de Phl p 6 o variantes de secuencias de los mismos fusionados a una proteina portadora viral, de preferencia la proteina pre S de Hep B.

Otra modalidad preferida de la presente invención se relaciona a moléculas Bet v 1 truncadas que carecen de epitopos de células T, que están compuestas de los aminoácidos 30 a 59, 50 a 79, 75 a 104, 30 a 74 o 60 a 104 de Bet v 1.

Otra modalidad preferida de la presente invención son combinaciones o mezclas de moléculas de Phleum pratense truncadas que carecen de epitopos de células T, fusionadas a una proteina portadora viral, de preferencia la proteina pre S de Hep B, como es descrito en lo anterior.

Una modalidad preferida de la presente invención son combinaciones o mezclas de moléculas de Phleum pratense truncadas que carecen de los epitopos de células T, que están compuestas de una de cada proteina de fusión de Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, y Phl p 6 truncadas, como es descrito en lo anterior .

Otro aspecto, de la presente invención se relaciona a una molécula hipoalergénica derivada de Fel d 1 (GenBank Nr. X62477 y X62478) que tiene un truncamiento C- y/o N-terminal y que carece de la capacidad de enlace de IgE.

Las alergias a los animales afectan hasta 40% de los pacientes alérgicos. En el ambiente doméstico, las alergias a las mascotas más populares, gatos y perros, son particularmente prevalentes y conectadas con síntomas perennes. Los alérgenos de animales están presentes en la caspa, epitelio, saliva, suero u orina. La exposición a los alérgenos puede ocurrir ya sea mediante el contacto de la piel directo o mediante la inhalación de' partículas que portan los alérgenos. Los alérgenos de gato y perro mayores, se mostraron que se presentan dispersados y podrían aun ser detectados en casas que no tienen mascotas y en lugares públicos, por ejemplo, escuelas. Esto se puede atribuir al número alto e incrementado en casas que conservan las mascotas en países industrializados (aproximadamente 50%) y la alta estabilidad de los alérgenos, que son portados y distribuidos.

Fel d 1 se identificó como el alérgeno de gato mayor, que se reconoce por más de 90% de pacientes alérgicos a gatos. Fel d 1 representa una glicoproteína acídica de 38 kDa de función biológica desconocida. Este consiste de dos heterodímeros no covalentemente enlazados idénticos, que nuevamente, están compuestos de dos cadenas de polipéptido antiparalelamente enlazadas por tres enlaces de disulfuro. La cadena 1 y la cadena 2 se codifican en genes diferentes, cada uno que consiste de 3 exones. Fel d 1 recombinante (rFel d 1), expresado como una proteina de fusión de cadena 2 - a cadena 1, se ha generado en E. coli. Este Fel d 1 recombinante es capaz de imitar completamente las propiedades inmunológicas del alérgeno de tipo silvestre.

Los péptidos derivados del alérgeno de gato mayor Fel d 1, y que carecen de capacidad de enlace de IgE son adecuados, por ejemplo, para inmunoterapia y vacunación para alergia profiláctica. Los péptidos sintéticos derivados de Fel d i - similar al Phl p 5 y péptidos derivados de alérgeno descritos en la presente - son capaces de inducir una respuesta de IgG, es decir, la producción de los llamados "anticuerpos bloqueantes" o "anticuerpos protectores". Estos anticuerpos previenen el enlace de IgE al alérgeno Fel d 1. De esta manera se puede lograr una reducción significativa en los síntomas alérgicos.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la molécula truncada exhibe reactividad de células T reducida.

Con el fin de evitar o significativamente reducir los efectos secundarios posteriores la molécula hipoalergénica derivada de Fel d 1 exhibe reactividad de células T reducida como se define en la presente invención.

El Fel d 1 truncado de preferencia está compuesto de los aminoácidos 1 a 34 o 35 a 70 de la cadena 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 o 64 a 92 de la cadena 2 de Fel d i o variaciones de secuencia de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a moléculas hipoalergénicas que están compuestas de o que comprenden los aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 o 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, .50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 o 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 o 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 o 32 a 70, 32 a 60, 52 a 84, 32 a 70 (Cys->Ser) de Der p 23, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 o 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 o 97 a 133 of Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 o 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 o 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 o 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 o 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 o 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 o 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 o 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 o fragmentos o variaciones de secuencia de los mismos.

Los métodos para la producción de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en referencias de biología molecular estándares tal como Sambrook y colaboradores, (Molecular Cloning, 2- edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y Ausubel y colaboradores, (Short Protocols in Molecular Biology, 3-edición; iley and Sons, 1995) . En general, una proteína de fusión se produce al primero construir un gen de fusión que se inserta en un vector de expresión adecuado, que, a su vez, se utiliza para transfectar una célula T del hospedero adecuada. En general, los constructos de fusión recombinantes se producen mediante una serie de digestiones de enzimas de restricción y reacciones de ligación que dan por resultado las secuencias deseadas que son incorporadas en un plásmido. Si no están disponibles los sitios de restricción adecuados, se pueden utilizar adaptadores o enlazadores de oligonucleótido sintético como es conocido por aquellos de habilidad en la técnica y descrito en las referencias citadas en lo anterior. Las secuencias de polinucleótido que codifican alérgenos y proteínas nativas se pueden ensamblar antes de la inserción en un vector adecuado o la secuencia que codifica el alérgeno se puede insertar adyacente a una secuencia que codifica una secuencia nativa ya presente en un vector. La inserción de la secuencia dentro del vector debe estar en la estructura de modo que la secuencia se puede transcribir en una proteina. Será evidente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que las enzimas de restricción precisas, enlazadores y/o adaptadores requeridos, asi como las condiciones de reacción precisas variarán con las secuencias y vectores de clonación utilizados. El ensamblar de constructos de DNA, sin embargo, es de rutina en la técnica y se puede realizar fácilmente por una persona experta en la técnica.

Es una ventaja especifica e inesperada, que las proteínas de fusión derivadas de moléculas de alérgeno hipoalergénicas truncadas y la proteína preS de hepatitis B humano se pueden expresar reproductiblemente en sistemas de expresión estándares y fácilmente se puedan fabricar para ser producidas en alto rendimiento con los procesos y reproductiblemente en sistemas de expresión estándares conocidos para una persona de habilidad en la técnica, mucho más particularmente al utilizar un Escherichia coli como el sistema de expresión. Tal proceso de fabricación típicamente comprende la expresión de las moléculas de acuerdo con la invención mediante la cultivación de células en un biorreactor (por ejemplo, en un termentador, matraz agitado) , seguido por la recolección de células (por ejemplo mediante filtración, centrifugación, etc) y el rompimiento celular (por ejemplo mediante homogenización de alta presión, sonicación, ciclos de congelación/descongelación, lisis celular enzimática o química, etc) , la purificación de las moléculas (por ejemplo, mediante cromatografía, filtración, precipitación, ultra/diafiltración, etc) y formulación del producto final. Con el fin de obtener un alto rendimiento de las moléculas de acuerdo con la invención, de preferencia se emplean procesos de cultivación de- alta densidad celular, mediante la aplicación de la fermentación alimentada en lotes.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula hipoalergénica y una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede emplear, por ejemplo, para producir las moléculas recombinantemente .

La molécula de ácido nucleico - de acuerdo con otro aspecto de la presente invención - pueda estar comprendida en un vector.

Este vector es de preferencia un vector de expresión.

La presente invención además se ilustra por las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin estar restringida a los mismos.

La Fig. 1 A muestra una vista general esquemática del vector HBV_Phlpl_4xP5.

La Fig. 1 B muestra una vista general esquemática del vector HBV_Phlp2_4xP3.

La Fig. 1 C muestra una vista general esquemática del vector HBV_Phlp5_V2.

La Fig. 1 D muestra una vista general esquemática del vector HBV_Phlp6_4xPl .

La Fig. 2 A muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_PhlPl_4xP5 (BM321, secuencia ID Nr .14) .

La Fig. 2 B muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Phlp2_4xP3 (BM322, secuencia ID Nr. 15) .

La Fig. 2 C muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Phlp5_V2 (BM325, secuencia ID Nr.16).

La Fig. 2 D muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Phlp6_4xPl (B326, secuencia ID Nr. 11) .

La Fig. 2 E muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Betvl_4PA (BM31a, secuencia ID Nr. 18) .

La Fig. 2 F muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Betvl_2PA2PB (BM31, secuencia ID No. 19) .

La Fig. 2 G muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV_Phlp5_Vl (secuencia ID No. 20).

La Fig. 3 A muestra un gel SDS Page al 12% manchado con Azul de Coomassie que contiene la proteina de fusión purificada HBV_Phlpl_4xP5 (BM 321, franja 1 y 10: 5 ug de marcador molecular, franja 2, 3, 11 y 12 5 ug de BM321, franja 4 y 13 2 ug de BM321, franja 5 y 14 1 ug de BM321, franja 6 y 15 0.5 ug de BM321, franja 7 y 16 0.25 ug de BM321, franja 8 y 17 0.1 ug de BM321, franja 9 y 18 0.05 ug de BM321) . Las franjas 1 a 9 están bajo reducción y las franjas 10-18 bajo condiciones de no reducción.

La Fig. 3 B muestra un gel SDS Page al 12% manchado con Azul de Coomassie que contiene la proteina de fusión purificada HBV_Phlp2_4xP3 (BM 322, franja 1 y 10: 5 ug de marcador molecular, franja 2, 3, 11 y 12 5 ug de BM322, franja 4 y 13 2 ug de BM322, franja 5 y 14 lug de BM322, franja 6 y 15 0.5 ug de BM322, franja 7 y 16 0.25 ug de BM322, franja 8 y 17 0.1 ug de BM322, franja 9 y 18 0-.05 ug de BM322) . Los franjas 1 a 9 están bajo reducción y las franjas 10-18 bajo condiciones de no reducción.

La Fig. 3 C muestra un gel SDS Page al 12% manchado con Azul de Coomassie que contiene la proteina de fusión purificada HBV_Phlp5_V2 (BM 325, franja 1 y 10: 5 ug de marcador molecular, franja 2, 3, 11 y 12 5 ug de BM325, franja 4 y 13 2 ug de BM325, franja 5 y 14 lug de BM325, franja 6 y 15 0.5 ug de BM325, franja 7 y 16 0.25 ug de BM325, franja 8 y 17 0.1 ug de BM325, franja 9 y 18 0.05 ug de BM325) . Las franjas 1 a 9 están bajo reducción y las franjas 10-18 bajo condiciones de no reducción.

La Fig. 3 D muestra un gel SDS Page al 12% manchado con Azul de Coomassie que contiene la proteina de fusión purificada HBV_Phlp6_4xPl (BM 326, franja 1 y 10: 5 ug de marcador molecular, franja 2, 3, 11 y 12 5 ug de BM326, franja 4 y 13 2 ug de BM326, franja 5 y 14 lug de BM326, franja 6 y 15 0.5 ug de B 326, franja 7 y 16 0.25 ug de BM326, franja 8 y 17 0.1 ug de BM326, franja 9 y 18 0.05 ug de BM326) . Las franjas 1 a 9 están bajo reducción y las franjas 10-18 bajo condiciones de no reducción.

La Fig. 4 demuestra la carencia de reactividad de IgE de los péptidos de fusión derivados de alérgenos de polen de hierba. El enlace de IgE de las proteínas de fusión en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros del número indicado de pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con IgE anti-humano marcado con 1251. No se detectó enlace de IgE para cualquiera de las cuatro proteínas de fusión de péptido - portador, a) muestra los resultados del ensayo de manchado de puntos utilizando HBV_Phlpl_4XP5 (BM321); b) muestra los resultados del ensayo manchado de puntos utilizando HBV_Phlp2_4xP3 (BM322), c) muestra los resultados de manchado utilizando HBV_Phlp5_V2 (BM325) ; d) muestra los resultados del ensayo de manchado de puntos utilizando HBV_Phlp6_4xPl (BM326) .

La Fig. 5 muestra la baja actividad alergénica de la proteina de fusión derivada del alérgeno de polen de hierba HBV_Phlpl_4xP5 (BM321) como es determinado mediante la expresión CD203c en basófilos de pacientes alérgicos. Las PBMCs de pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con diluciones en serie de Phl p 1 (barras grises claras) o BM321 (barras grises oscuras) . La inducción de CD203c se midió como intensidades de florescencia medias, y los Indices de estimulación calculados se muestran en el eje y.

La Fig. 6 muestra la baja actividad alergénica de la proteina de fusión derivada de alérgeno de polen de hierba HBV_Phlp6_4xPl (BM326) como es determinado mediante la expresión CD203c en basófilos de pacientes alérgicos. Las PBMCs de pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con diluciones en serie de Phl p 6 (barras grises claras) o BM326 (barras grises oscuras). La inducción de CD203c se midió como intensidades florescencia medias, y los índices de estimulación calculados se muestran en el eje y.

La Fig. 7 muestra las respuestas de IgGl específicas de alérgeno de polen de hierba Timotea en ratones. Grupos de 4 ratones se inmunizaron con 20 ug de proteínas de fusión (proteínas de fusión únicas y combinación de 4 proteínas de fusión) y 10 g cada uno (Phi pl y 5) o 5 µq cada uno (Phi p2 y 6) del alérgeno de tipo silvestre en la semana 0 y 3 del estudio seguido por una inmunización de refuerzo en la semana 17 del estudio. Los antígenos se administraron subcutáneamente en la región de espalda de los animales. La sangre se recolectó en la semana 0, 3, 6, 9, 12, 17, 20 y 22 del estudio a partir de la vena de la cola de los ratones. En las semanas del estudio con inmunizaciones la sangre se recolectó un día antes de la inmunización. Los sueros inmunes de los ratones se investigaron para la presencia de IgGl específico de alérgeno mediante ELISA. Los sueros pre-inmunes antes de la primera inmunización fueron negativos en todos los individuos. Las proteínas de fusión individuales se compararon con la aplicación de una mezcla de proteínas de fusión. a) Respuesta inmune contra el antígeno rPhl p 1 para HBV_Phlpl_4xP5 (BM321 como el único componente) , BM321 en una mezcla con BM322, BM325 y B 326, y ratones inmunizados con rPhl p 1. b) Respuesta inmune contra el antígeno rPhl p 2 para HBV_Phlp2_ xP3 (BM321 como el único componente) , BM322 en una mezcla con BM321, B 325 y BM326, y ratones inmunizados con rPhl p 2. c) Respuesta inmune contra el antígeno rPhl p 5 para HBV_Phlp5_V2 (BM325 como el único componente) , BM325 en una mezcla con BM321, BM322 y BM326, y ratones inmunizados con rPhl p 5. d) Respuesta inmune contra el antigeno rPhl p 6 antígeno para HBV_Phlp6_4xPl (BM326 como el único componente) , BM326 en una mezcla con BM321, B 322 y BM325, y ratones inmunizados con rPhl p 6.

La Figura 8 muestra la caracterización molecular e inmunológica de las proteínas de fusión recombinantes. A. SDS-PAGE manchado con Coomassie que muestra cuatro proteínas de fusión PreS con los péptidos derivados de Bet vi (franja 1: 2xPA-PreS, franja 2: 2xPB-PreS, franja 3:4xPA-PreS, franja 4: 2xPA2xPB-PreS) y la PreS portadora (franja 5). B. Las proteínas de fusión recombinantes punteadas con nitrocelulosa y la PreS se sondearon con un suero anti-PreS de conejo (franja 1), de suero preinmune de conejo (franja 3) control amortiguador para anticuerpos de conejo (franja 3) y anticuerpos monoclonales dirigidos contra el péptido P2' derivado de Bet v 1 (mAb2) (franja 4) y P4' (mAbl2) (franja 5) y el control amortiguador para anticuerpos de ratón monoclonales (franja 6) .

La Figura 9 muestra la reactividad IgE de rBet v 1 y las proteínas de fusión recombinantes de PreS, con péptidos derivados de Bet v 1. Los sueros de pacientes alérgicos al polen de abedul, de controles no alérgicos y la solución amortiguadora únicamente se probaron para su reactividad a rBet v 1 manchado con puntos, las cuatro proteínas de fusión recombinantes (2PA-Pres, 2PB-Pres, 4PA-Pres, 2PA2PB-pres) y PreS solo. El IgE humano enlazado se detectó con los anticuerpos Anti-IgE humano marcados con 1251. Los conteos por minuto (cpm) correspondientes al IgE enlazado se miden con un contador ? y se indican en el eje y. Las gráficas de cuadro muestran los resultados de 50 pacientes alérgicos al polen de abedul.

La Figura 9B muestra la activación de basófilo mediante rBet v 1 y las cuatro proteínas de fusión PreS, como es medido por la regulación hacia arriba de CD 203c. Las muestras de sangre de pacientes alérgicos al polen de abedul se expusieron a concentraciones incrementadas (0.001-1 µ/ml) de antígenos, anti-IgE de control amortiguador (Co) . Los resultados de un paciente representativo son mostrados. La expresión CD 203c se determinó mediante el análisis de FACS y se exhibe como índice de estimulación (SI (eje y) ) . Se muestran las medias de mediciones triplicadas y se indican las desviaciones estándares.

La Figura 10 muestra las respuestas linfoproliferativas y la producción de citiquina de PBMCs de pacientes alérgicos al polen de abedul. Las PBMCs de pacientes alérgicos al polen de abedul se han estimulado con cantidades equimolares de rBet v 1, los péptidos PA y PB derivados de Bet v 1, PreS sola, y las proteínas de fusión de PreS (es decir 2PA-Pres, 2PB-Pres, 4PA-Pres, 2PAPB-PreS). Se exhiben los índices de estimulación (SI) (ejes y) .

(A) SI para la concentración más alta (5µg/ca idad de Bet v 1 y cantidades equimolares de los péptidos, PreS y proteínas de fusión PreS) de 6 pacientes alérgicos al polen de abedul se muestran como manchas de cuadro, donde el 50% de los valores están dentro de los cuadros y los no valores extremos están entre las barras. Las líneas dentro de los cuadros indican los valores medios.

(B) SI para cuatro concentraciones (1 = 5yg/cavidad, 2 = 2.5 g/cavídad, 3 = 1.25µ?/?1, 4 = 0.63 pg/cavidad de rBet vi y cantidades equimolares de los péptidos PreS, y proteínas de fusión de PreS) se muestran para un paciente representativo.

(C) Producción, de citoquina en sobrenadantes de PBMCs de 6 pacientes alérgicos al polen de abedul, estimulados con 2.5 g/ml de rBet v 1 y cantidades equimolares de los péptidos PA y PB, PreS y cuatro proteínas de fusión PreS, se han medido. Las concentraciones observadas (pg/mL) (ejes y) después de la estimulación con antígenos se muestran en puntos en cuadros, donde 50% de los valores están dentro de los cuadros y los no valores extremos están entre las barras. Las líneas dentro de los cuadros indican los valores medios.

La Figura 11 muestra la inducción de anticuerpos IgG específicos para los alérgenos homólogos rBet v 1 y de Bet v 1 después de la inmunización subcutánea mediante las proteínas de fusión de PreS en conejos.

(A) Los conejos se han inmunizado con proteínas de fusión (2PA-PreS, 2PB-PreS, 4PA-PreS, 2PAPB-PreS) adsorbidas en hidróxido de aluminio (alumbre) (parte superior) o absorbidas en adyuvante de Freund completo (CFA) (fondo) y rBet V 1. IgG de conejo específico para rBet v 1 se ha medido y los valores de densidad óptica media (OD) para mediciones duplicadas se exhiben (ejes y) para diferentes diluciones de anti-suero de conejo (ejes x) .

(Bl) La alineación de secuenciación múltiple de Bet v 1 y alérgenos homólogos de Bet v 1 en aliso (Aln g 1) , avellano (Cor a 1) y manzano (Mal d 1) . Los mismos aminoácidos se indican como puntos, los espacios se indican como guiones. El porcentaje de identidad de los alérgenos homólogos de Bet v 1 a Bet v 1 se muestra en el lado derecho. El péptido A derivado de Bet v 1 (PA, línea de guiones) y el péptido B (PB, línea llena) están encuadrados.

(B2) Anticuerpos IgG de sueros de anti-conejo (rab a-2PA-PreS, rab a-2PB-PreS, Rab -4PA-PreS, rab a-2PAPB-PreS) dirigidos contra rBet v 1, rAln g 1, rCor a 1 y rMal d 1 (eje x) se ha medido mediante ELISA. Se muestran medias de mediciones duplicadas. La densidad óptica (OD) correspondiente a IgG específico de alérgeno de suero de conejo (post) se exhibe en comparación con los sueros preinmunes correspondientes (pre) (ejes y) .

(C) Los anticuerpos IgG de conejo inmunizados con rBet v 1 y proteínas de fusión recombinantes (2PA-PreS, 2PB-PreS, 4PA-PreS, 2PAPB-PreS) dirigidos contra seis péptidos derivados de Bet v 1 (??' - P61) (eje x) se han medido mediante ELISA. Se exhiben las medias de los valores de densidad óptica (OD) para mediciones duplicadas (eje y) .

La Figura 12 muestra la inhibición del suero de conejo anti-2xPA2xPB-PreS contra IgE de pacientes alérgicos comparado con el suero de conejo contra rBet v 1 completo. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE a rBet v 1 (ejes y) obtenido con sueros de conejo anti-2xPA2xPB-PreS y anti-rBet v 1 se determinaron por medio de ELISA de inhibición y se exhiben como manchas de cuadro, donde el 50% de los valores están dentro de los cuadros y los no valores extremos están entre las barras. Las líneas entre los cuadros indican los valores medios. Se muestran los resultados de 21 pacientes alérgicos al polen de abedul.

La Figura 13 muestra una titulación de IgG de conejo criado después de la inmunización con proteínas de fusión de PreS que contienen ya sea 2 o 4 copias de un péptido derivado de Phl p 6. Para la inmunogenicidad conejos de prueba (conejos blancos de Nueva Zelanda) se inmunizaron con las diferentes proteínas de fusión utilizando hidróxido de aluminio como adyuvante. La inducción de anticuerpos específicos se inspeccionó en ensayos de ELISA. Los resultados muestran que las proteínas de fusión que contienen 4 péptidos son más inmunogénicas que las proteínas de fusión que contienen 2 péptidos.

La Figura 14 muestra la inducción de una respuesta de IgG robusta dirigida a los alérgenos de polen de hierba Phl p 1 (A), P2 Phi (B) , Phl p 5 (C) , y Phl p 6 (D) siguiendo los alérgicos de polen de hierba humanos después de la inmunización subcutánea con una formulación de vacuna (BM32) que comprende una mezcla de las 4 proteínas de fusión hipoalergénicas con SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y SEQ ID No. 17. La determinación de IgG se llevó a cabo mediante ELISA. Los niveles de IgG antes del tratamiento (pre) se comparan con los niveles de IgG de post-tratamiento (post) .

La Figura 15 muestra los resultados de los ensayos de proliferación de células T realizados en células T de individuos alérgicos al polen de hierba después de la inmunización con una formulación de vacuna que consiste de una mezcla de las 4 proteínas de fusión hipoalergénicas con SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y SEQ ID No. 17. La reactividad de células T se reduce fuertemente o está ausente si se compara con el polen de hierba. El eje y de la-gráfica refleja el índice de estimulación.

La Figura 16 muestra que IgG inducido por la terapia con una formulación de vacuna (BM32) que comprende una mezcla de las 4 proteínas de fusión hipoalergénicas con SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y la SEQ ID No. 17 reduce las respuestas linfoproliferativas a los alérgenos de polen de hierba en PBMCs humanas. (a) arreglo experimental. (b) resultados de los ensayos de proliferaciones de células T realizados en la ausencia (+ suero antes) y la presencia (+ suero después) del IgG inducido para el tratamiento. El eje y de la gráfica refleja el índice de estimulación. P1-P5 indican los resultados de diferentes participantes en el estudio.

La Figura 17 muestra el arreglo de un estudio clínico llevado a cabo en 69 individuos alérgicos al polen de hierba utilizando la formulación de vacuna de B 32 que comprende una mezcla de las 4 proteínas de fusión hipoalergénicas con SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y SEQ ID No. 17.

La Fig. 18 A muestra la secuencia primaria de la proteína de fusión HBV Per p2-2xP2-2xP4 (secuencia ID Nr . 149) La Fig. 18 B muestra la secuencia primaria de la proteína de fusión HBV Per p2-3xP2-3xP4 (secuencia ID Nr . 150) Fig. 18 C muestra la secuencia primaria de la proteína de fusión HBV Per p23-2xP4-2xP5 (secuencia ID Nr. 151) Fig.18 D muestra la secuencia primaria de la proteina de fusión HBV Per p23-4xP6 (secuencia ID Nr. 152) La Figura 19A muestra el cambio en los síntomas nasales inducidos por el tratamiento con 3 inyecciones subcutáneas de la formulación de vacuna B 32 que comprenden una mezcla de las 4 proteínas de fusión hipoalergénicas con SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y SEQ ID No. 17. Barras negras: antes del tratamiento, barras grises: después del tratamiento.

La Figura 19B muestra el cambio en el área de roncha media entre la prueba de pinchazo en la piel titulada antes y después del tratamiento con la formulación de vacuna BM32. La prueba de pinchazo en la piel titulada se llevó a cabo utilizando 8 diluciones en serie del extracto de polen de hierba (no diluido a 1:128).

La Figura 20 muestra el enlace de IgE de los péptidos derivados de Der p 2 en comparación al alérgeno completa probado mediante un ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de 26 pacientes alérgicos al ácaro de polvo casero se incubaron con los péptidos conjugados con KLH punteados y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano marcado con 1251. No se detectó enlace de IgE para cualquiera de los 5 péptidos como en el ejemplo 26.

EJEMPLOS : Ejemplo 1: Construcción del plásmido de expresión para HBV Phlpl 4xP5 (BM321) El gen BM321 sintético se ensambló de los oligonucleótidos sintéticos y/o productos de PCR y se clonó en un vector estándar apropiado (pMK-RQkanR) . El plásmido se purificó de una cepa K12 de E. coli transformada (DH10B-T1R) y la concentración se determinó mediante espectroscopia de UV. La secuencia de DNA de B 321 sintética y optimizada en codón final además se clonó en el vector de expresión pET28b (+) utilizando los sitios de restricción apropiados (sitio Ncol en el extremo 5' y EcoRI en el extremo 3' ) . El ADN de plásmido se purificó de K12 de DH10B de E. coli transformado (dam+ dcm+) y la concentración se determinó mediante la espectroscopia de UV. El constructo final se verificó mediante la secuenciación del inserto. Un resumen de los datos de plásmido y un mapa del plásmido del vector de expresión final "PBM-321" se muestra enseguida.

Resumen de la secuencia B 321 clonada en el vector de expresión final pET-28b(+).

Ejemplo 2: Transformación del plásmido de expresión en hospedero de expresión para HBV Phlpl 4xP5 (BM321) Las células BL21(DE3) de E. coli químicamente competentes se transformaron con el plásmido de expresión mediante el método de choque térmico. Las células transformadas se colocaron sobre placas de LB-agar que consisten de cloruro de sodio al 0.5%, peptona de soja al 1%, extracto de levadura al 0.5%, agar al 1.5% y 50 pg/mL de kanamicina para la selección. Las células sobre las placas LB se cultivaron mediante la cultivación durante la noche a 37°C. Colonias individuales de células BL21(DE3) de E. coli transformadas se aislaron, se cultivaron en medio LB y se clasificaron para el crecimiento y expresión de BM321. El clon de mejor desempeño se seleccionó para el establecimiento adicional de un Banco de Células Maestro.

Ejemplo 3: Preparación de un Banco de Células Maestro para HBV Phlpl 4xP5 (BM321) Una alícuota del clon seleccionado se utilizó para la inoculación de 150 mi del medio de cultivo (composición: cloruro de sodio al 0.5%, peptona de soja al 1%, extracto de levadura al 0.5%, 50 yg/ml de kanamicina). El cultivo de Banco de Células Maestro (MCB) se incubó a 37°C bajo agitación constante a 200 rpm hasta que el cultivo alcanzó una densidad óptica de OD600 = 1-2. Se adicionó glicerol con el fin de obtener una concentración de glicerol final de 15% v/v y el MCB se colocó en alícuotas en frasquitos de 1 mi y se almacenó en un congelador Ultra intenso a -75 + 10°C.

Ejemplo 4: Fermentación alimentada en lotes con alta densidad celular de HBV_Ph1Pl_4xP5 (BM321) El medio de cultivo sintético (100 mi, pH = 6.8, sales y elementos menores, 10 g/L de glucosa como fuente de carbono) se inoculó con 1 mi del Banco de Células Maestro (£. coli BL21 ( DE3 ) /pBM321 ) y se cultivó en un matraz de agitación (37°C, 200 rpm) hasta que se alcanzó un valor objetivo densidad óptica de OD = 1. Un fermentador de acero inoxidable de 22 L se utilizó para realizar la fermentación alimentada por lotes. Para el control de alimentación automático y reproductible, una receta se programó permitiendo predefinir la tasa de crecimiento especifica, la tasa de alimentación, la duración de la fase de lote y la duración de la fase de alimentación exponencial. Con el fin de incrementar la tasa de transferencia de oxigeno del fermentador, la retropresion se controló y se ajustó a 1 bar. El fermentador se esterilizó in situ con el medio de cultivo sintético como es mencionado en lo anterior y la fermentación se inició mediante la inoculación con el precultivo. Después del agotamiento de la glucosa, la fase de alimentación exponencial se inició con el fin de mantener una tasa de crecimiento especifica de µ = 0.25 h"1. En una OD = 45, la expresión de BM321 recombinante se indujo mediante la adición de bolo de IPTG (concentración final 0.8 mM) . El cultivo se recolectó en DO600 = 73. El titulo del producto BM321 obtenido de la fermentación alimentada con lote fue 1.2 g por L de caldo de cultivo. Después, el caldo de cultivo bacteriano se enfrió a bajo de <20°C y se centrifugó a 7000 rpm (5500 g) a 4°C durante 15 min. La biomasa celular húmeda se tomó en alícuotas y se almacenó a -75°C.

Ejemplo 5: Rompimiento celular, y clarificación Para el rompimiento celular, 748 gramos de biomasa del Ejemplo 6 se descongelaron y se subdividieron en alícuotas de 125 gramos y se resuspendieron en una solución amortiguadora de homogenización (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0.1%, pH 11.0) bajo agitación mecánica a temperatura ambiente durante 30 min. Para el rompimiento celular, se aplicó un procedimiento de congelación/ descongelación al congelar a -75°C y la descongelación subsecuente, seguido por la homogenización mecánica. El pH del homogenado se ajustó a pH = 10.0. El homogenado celular crudo se sometió a una etapa de centrifugación a 7000 rpm (5500 g) a 4°C durante 30 min. Los sobrenadantes se sometieron a precipitación con PEI (polietilnimina) bajo agitación mecánica. Las materias insolubles se separaron mediante una etapa de centrifugación subsecuente. Los sobrenadantes clarificados se sometieron a la siguiente etapa de cromatografía.

Ejemplo 6_: Purificación croma tográfica de HBV_Phlpl_4xP5 (BM321) Un total de 1840 mi del sobrenadante de precipitación de PEI de la etapa de clarificación como es descrito en el Ejemplo 7 se cargaron en una columna Q-Sepharose FF de 5 x 30 cm y se equilibraron con solución amortiguadora A (TrisHCl, EDTA) . El material no enlazado se removió mediante un lavado con la solución amortiguadora A, seguido por un lavado con la solución amortiguadora C (1 fosfato de sodio, EDTA, pH 7.0) . La elución de la fracción del producto se realizó mediante una elución de gradiente lineal con BM32 solución amortiguadora E de 0-100% (fosfato de sodio, EDTA, NaCl pH 7.0) en solución amortiguadora C de BM32. La selección de las fracciones que contienen producto para la acumulación se realizó de acuerdo con el análisis SDS-PAGE, mediante la evaluación densitométrica de la pureza de la fracción y mediante la intensidad de banda del producto.

Las fracciones acumuladas de la etapa de captura se ajustaron a una conductividad de 115 mS/cm mediante la adición de cloruro de sodio 2.5 , y este material se cargó en una columna Fenil Sepharose HP equilibrada con solución amortiguadora D (fosfato de sodio, EDTA, NaCl pH 7.0). El material no enlazado se removió mediante el lavado con la solución amortiguadora D. La elución de la fracción de producto se realizó mediante una elución de gradiente de solución amortiguadora C de 40-100% (fosfato de sodio, EDTA, pH 7.0) en solución amortiguadora D. La selección de las fracciones que contienen el producto para la acumulación se realizó de acuerdo con el análisis de SDS-PAGE, mediante la evaluación densitométrica de la pureza de la fracción y mediante la intensidad de banda del producto.

Las fracciones acumuladas de la etapa intermedia se ajustaron a una conductividad de 80 mS/cm mediante la adición de cloruro de sodio 2.5 M, y este materia se cargó en una columna de Toyópearl Butil 650-S equilibrada con un solución amortiguadora F de mezcla (fosfato de sodio, EDTA, NaCl pH 7.0). El material no enlazado se removió mediante un lavado de gradiente con solución amortiguadora C de BM32 de80-0% en solución amortiguadora C (fosfato de sodio, EDTA, pH 7.0). La elución de la fracción se realizó mediante una elución de gradiente de solución amortiguadora G 0-1 (fosfato de sodio, EDTA, isopropanol, pH 7.0) en solución amortiguadora C. La selección de las fracciones que contienen producto para la acumulación se realizó de acuerdo al análisis de SDS-PAGE, mediante la evaluación densitométrica de la pureza de la fracción y mediante la intensidad de banda del producto.

Ejemplo 7: Fabricación de HBV Phlp2 4xP3 (BM322) , HBV_Phlp5_V2 (BM325) , y HBV_Phlp6_4xPl (BM326) : Para la expresión y fabricación de las moléculas recombinantes de acuerdo con la invención, específicamente, HBV_Phlp2_4xP3 (BM322), HBV_Phlp5_V2 (BM325) , y HBV_Phlp6_4xPl (BM326) , se aplicaron los mismos, similares o comparables métodos y procedimientos como es descrito en el Ejemplo 1, Ejemplo 2, Ejemplo 3, Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6.

Ejemplo 8: Preparación de una formulación inyectable que consiste en una mezcla de HBV PhlPl 4xP5 (BM321) ; HBV_PhlP2_4xP3 (BM322) , HBV_PhlP5_V2 (BM325) , y HBV_PhlP6_4xPl (BM326) Cada una de las proteínas purificadas recombinantes se disolvieron en una solución amortiguadora isotónica que contiene cloruro de sodio al 0.9% y fosfato de sodio 2 m y a cada solución de proteína se adicionó una cantidad apropiada de hidróxido de aluminio. Una mezcla que contiene partes iguales de las cuatro suspensiones resultantes se preparó y se formó en alícuotas bajo condiciones estériles en frasquitos sellados. La formulación inyectable obtenida mediante este procedimiento contuvo 0.4 mg/ml de cada HBV_PhlPl_4xP5; HBV_PhlP2_4xP3 , HBV_PhlP5_V2 y HBV_PhlP6_4xPl.

Ejemplo 9: Preparación de HBV Betvl 4xPA etiquetado con his El gen que codifica para las proteínas de fusión que consisten de PreS fusionada con el péptido PA derivado de Bet v 1 dos veces en el N- y C -terminal (es decir 4PA-PreS) se sintetizó mediante ATG:biosynthetics, Merzhausen, Alemania y se insertó en los sitios Ndel/Xhol del vector pET-17b (Novagen, Alemania) . Las secuencias de DNA se confirmaron por medio de la secuenciación automatizada de ambas hebras del DNA (Microsynth, Balgach, Suiza) .

La proteina de fusión se expresó en la cepa de BL21 de E. coli (DE3; Stratagene, La Jolla, CA) . Las células se cultivaron en el medio de Luria Bertani que consiste de 50pg/mL de kanamicina a una OD de 0.6. La expresión de proteínas se indujo al adicionar isopropil-p-D-tiogalactopiranósido a una concentración final de 1 mmol/L durante la noche a 37 °C. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos. El producto de proteína se detectó principalmente en la fracción de cuerpo de inclusión. Este se solubilizó en GuHCl 6M, NaH2P04 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0 durante la noche. El homogenado se centrifugó a 14,000 g durante 18 minutos. Los sobrenadantes se incubaron con 2 mi de una resina Ni-NTA previamente equilibrada durante 4 horas (Qiagen, Hilden, Alemania) y las suspensiones se cargaron subsecuentemente en una columna, se lavaron con 2 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado (8 mol/L de urea, 100 mmol/L de NaH2P04, y 10 mmol/LTris-HCl [ pH = 6.1]), y se eluyeron con la misma solución amortiguadora (pH = 3.5). La proteína purificada se dializó contra agua.

La pureza de las proteínas recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE manchada con Coomassie (12.5%) bajo condiciones de reducción.

La identidad de la proteina de fusión se confirmó por medio del manchado de puntos utilizando anticuerpos monoclonales, específicos para los péptidos P2' (mAb2) y P4' (mAbl2) derivados de Bet v 1 y anticuerpos de conejo específicos de PreS, así como IgGs preinmunes de conejo correspondientes. Un µ? de proteínas de fusión de PreS, PreS y HSA (control) se ha inmovilizado sobre nitrocelulosa y se incubaron con el suero monoclonal así como de conejo diluido 1:1000 que tiene a 4°C. Los anticuerpos enlazados se detectaron con IgG anti-ratón de conejo marcado con yodo125 (mAb2, mAbl2) o IgG anti-conejo de cabra con 125I (anti-PreS de conejo, preinmune de conejo) (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts ) diluido 1:500 durante 2 horas y visualizado mediante autorradiografía . Además placas de ELISA ( axisorp, Nunc, Dinamarca) se recubrieron con 2iq de proteína de susió de PreS y PreS, diluido en 0.1 mol/L de solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6 lavado con PBS que contiene Tween al 0.05% vol/vol 20 (PBST) 3 veces y bloqueado durante 2 horas con BSA al 1%-PBST. Subsecuentemente las placas se incubaron con mAb2, mAbl2, suero de conejo anti-PreS y anticuerpos anti-Bet v 1 de conejo en una dilución de 1:5000 (solución amortiguadora de dilución: BSA al 0.5% p/vol en PBST) durante la noche a 4°C. Después de lavar 5 veces, los anticuerpos IgG enlazados se han detectado con un anticuerpo anti-ratón de oveja etiquetado con HRP (para mAb2, mAbl2) o anticuerpo anti-conejo de asno etiquetado con HRP (suero de conejo) (ambos de GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y se reveló la reacción de color.

Ejemplo 10 Preparación de HBV Betvl 2xPA2xPB (BM31) etiquetado con his Los genes que codifican para la proteina de fusión que consiste de PreS fusionada dos veces con péptidos Bet v 1 en el N- y C-terminal 2xPA2xPB-PreS) se sintetizaron mediante GenScript Piscataway, NJ, E.U.A, 2PAPB-Pres) y se insertaron en los sitios Ndel/Xhol del vector pET-17b (Novagen, Alemania) . Las secuencias del DNA se confirmaron por medio de la secuenciación automatizada de ambas hebras de DNA (Microsynth, Suiza) .

Las proteínas de fusión de PreS recombinantes se expresaron en la cepa BL21 de E. coli (DE3; Stratagene, CA) . Las células se cultivaron en medio de Luria Bertani que contiene 50 g/mL de kanamicina a una OD de 0.6. La expresión de proteínas se indujo al adicionar isopropil-p-D-tiogalactopiranósido a una concentración final de 1 mmol/L durante la noche a 37°C. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos. Las proteínas se detectaron principalmente en la fracción de cuerpo de inclusión. La proteína resultante se solubilizó en GuHCl 6M, NaH2P04 100 mM, Tris 10 mM, pH 8.0 durante la noche. El homogenado se centrifugó a 14,000 g durante 18 minutos. Los sobrenadantes se incubaron con 2 mi de una resina de Ni-NTA previamente equilibrada durante 4 horas (Qiagen, Hilden, Alemania) y las suspensiones se cargaron subsecuentemente en una columna, se lavaron con 2 volúmenes de columna de solución amortiguadora de lavado (8 mol/L de urea, 100 mmol/L de NaH2P04, y 10 mmol/LTris-HCl [ pH = 6.1 ]), y se eluyeron con la misma solución amortiguadora (pH = 3.5). La proteina se dializó contra NaH2P04 10 mM.

La pureza de las proteínas recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE manchada con Coomassie (12.5%) bajo condiciones de reducción. La identidad de las proteínas de fusión se confirmó por el medio de manchado de puntos utilizando anticuerpos monoclonales, específicos para los péptidos P2' (mAb2) y P4' (mAbl2) derivados de Bet v 1 y anticuerpo de conejo específicos de PreS, así como IgG preinmunes de conejo correspondientes. Un g de proteína de fusión de PreS, PreS y HSA (control) se han inmovilizado sobre nitrocelulosa y se incubaron con suero monoclonal así como de conejo diluido 1:1000 que está a 4°C. Los anticuerpos enlazados se detectaron con IgG anti-ratón de conejo etiquetados con yodo125 (mAb2, mAbl2) o IgG de anti-conejo de cabra con 125I (anti-PreS de conejo, preinmune de conejo) ( Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts ) diluido 1:500 durante 2 horas y visualizado mediante autorradiografia . Además las placas de ELISA (Maxisorp, Nunc, Rosklide, Dinamarca) se recubrieron con 2µg de proteína de fusión de PreS, y PreS, se diluyeron en 0.1 mol/L de solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6, se lavaron con PBS que contiene Tween 20 al 0.05% vol/vol (PBST) 3 veces y se bloquearon durante 2 horas con BSA al 1%-PBST. Subsecuentemente las placas se incubaron con mAb2, mAbl2, suero de conejo anti-PreS y anticuerpos anti-Bet v 1 de conejo en una dilución de 1:5000 (solución amortiguadora de dilución: BSA al 0.5% p/vol en PBST) durante la noche a 4°C. Después de lavar 5 veces, los anticuerpos IgG enlazados se han detectado con un anticuerpo anti-ratón de oveja etiquetado con HRP (para mAb2, mAbl2) o anticuerpo anti-conejo de asno etiquetado con HRP (sueros de conejo) (ambos de GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y se reveló la reacción de color.

Ejemplo 11: Detección de la reactividad de IgE de la proteína de fusión HBV Phlpl 4xP5 (BM321) El enlace de IgE en comparación con el alérgeno completo se estimó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de los pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con el Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó enlace de IgE para HBV_Phlpl_4xP5 (BM321) como se muestra en la Fig. 4A.

Ejemplo 12: Detección de la reactividad de IgE de la proteína de fusión HBV Phlp2 4xP3 (BM322) El enlace de IgE en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de los pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó el enlace de IgE para HBV_Phlp2_4xP3 (BM321) como se muestra en la Fig. 4B.

Ejemplo 13: Detección de la reactividad de IgE de la proteina de fusión HBV Phlp5 V2 (BM325) El enlace de IgE en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de los pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con las proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con el Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó enlace de IgE para HBV_Phlp5_V2 (BM325) como se muestra en la Fig. 4C.

Ejemplo 14: Detección de la reactividad de IgE de la proteína de fusión HBV Phlp6 4??1 (BM326) El enlace de IgE en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de los pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con las proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó enlace de IgE para HBV_Phlpl_4xPl (BM326) como se muestra en la Fig. 4D.

Ejemplo 15: Detección de la reactividad de IgE de la proteína de fusión HBV etVl 4xPA y HBV_BetVl_2xPA2xPB (BM31) El enlace de IgE en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de los pacientes alérgicos al polen de hierba se incubaron con las proteínas punteadas y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó enlace de IgE para ambas proteínas de fusión como se muestra en la Fig. 5.

Ejemplo 16: Los anticuerpos anti-r89P5 de conejo bloquean el enlace de IgE del paciente a rPhl p 1 Para determinar la habilidad de IgE de conejo inducido por péptido para inhibir el enlace de los anticuerpos IgE del paciente alérgico a rPhl p 1, placas de ELISA se recubrieron con 1 µg/ml de rPhl p 1, se lavaron y se bloquearon. Las placas se preincubaron con el anti-péptido de conejo (HBV_Phlpl_4xP5, KLHP5) diluido 1:100, un anti-rPhl p 1 de conejo y, para propósitos de control, con los sueros preinmunes correspondientes. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros humanos de pacientes alérgicos a Phl p 1 (1:03 diluido) y el IgE enlazado se detectó con el IgE-anti-humano de ratón (Pharmingen 1:1000) y luego con IgG anti-ratón de oveja POX acoplado (Amersham Bioscience) 1:2000. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE logrado mediante la preincubación con los antisueros anti-péptido se calculó como sigue: 100-ODi/ODp x 100.

ODi y ODp representan las extinciones después de la preincubación con el suero inmune y preinmune de conejo, respectivamente. La Tabla 1 muestra la capacidad de los anticuerpos de péptido anti-Phl p 1 para inhibir el enlace del IgE de 13 pacientes alérgicos al rPhl p 1 completo. Los sueros de proteina anti-fusión bloquearon el enlace de IgE al mismo grado como los sueros contra rPhl p y KLHP5. La Tabla 2 muestra la inhibición (en %) de todos los 13 pacientes.

Tabla 1: % de inhibición del enlace de IgE de los 13 pacientes a rPhl p 1 después de la incubación con antisueros anti-rPhlp 1, anti-HBV_Phlpl_4 xP5 y anti-KLHP5 de conejo Ejemplo 17: Los anticuerpos anti-HBV Phlp2 4xP3 de conejo bloquean el enlace de IgE del paciente a rPhl p 2 Para determinar la habilidad del Ig de conejo inducido por péptido para inhibir el enlace de los anticuerpos IgE, del paciente alérgico a rPhl p 2, placas de ELISA se recubrieron con lpg/ml de rPhl p 2, se lavaron y se bloquearon. Las placas se preincubaron con anti-péptido de conejo (HBV_Phlp2_4xP3, KLHP3) diluido 1:100, un anti-rPhl p 2 de conejo y, para propósitos de control, con los sueros preinmunes correspondientes. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros humanos de pacientes alérgicos a Phl p2 (1:03 diluido) y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano de ratón (Pharmingen 1:1000) y luego con IgG antiratón de oveja POX-acoplado (Amersham Bioscience) 1:2000. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE logrado por la preincubación con los antisueros anti-péptido se calculó como sigue: 100-ODi/ODp x 100.

ODi y ODp representan las extinciones después de la preincubación con el suero inmune y preinmune de conejo, respectivamente. La Tabla 2 muestra la capacidad de los anticuerpos de péptido anti-Phl p 2 para inhibir el enlace de IgE de 19 pacientes alérgicos al rPhl p 2 completo. Los sueros de anti-proteina de fusión bloquean el enlace de IgE al mismo grado como los sueros contra rPhl p 2 y KLHP3. La Tabla 2 muestra la inhibición (en %) de todos los 19 pacientes .

Tabla 2: % de inhibición del enlace de IgE de 19 pacientes al rPhl p 2 después de la incubación con los antisueros anti- rPhl p 1, anti-HBV_Phlp2_4xP3 y anti-KLHP3 de conejo Ejemplo 18: Los anticuerpos anti-HBV_Phlp5_V2 de conejo bloquean el enlace de IgE del paciente al rPhl p 5 Para determinar la habilidad del Ig de conejo inducido por péptido para inhibir el enlace de los anticuerpos IgE de pacientes alérgicos a rPhl p 5, placas de ELISA se recubrieron con ?µ?/p?? de rPhl p 5, se .lavaron y se bloquearon. Las placas se preincubaron con anti-péptido de conejo (HBV_Phlp2_V2) diluida 1:100, un anti-rPhl p 5 de conejo y, para propósitos de control, con los sueros preinmunes correspondientes. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros humanos de pacientes alérgicas a Phl p 5 (1:03 diluido) y el IgE enlazado se detectó con el Anti-IgE humano de ratón (Pharmingen 1:1000) y luego con IgG antiratón de oveja POX-acoplado (Amersham Bioscience) 1:2000. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE logrado por la preincubación con los antisueros de anti-péptido se calculó como sigue: 100-ODi/ODp x 100.

ODi y ODp representan las extinciones después de la preincubación con el suero inmune y preinmune de conejo, respectivamente. La Tabla 3 muestra la capacidad de los anticuerpos de péptido anti-Phl p 5 para inhibir el enlace de IgE de 16 pacientes alérgicos al rPhl p 5 completo. Los sueros de anti-proteína de fusión bloquean el enlace de IgE al mismo grado como los sueros contra rPhl p 5 y mejor que la mezcla de péptidos KLH. La Tabla 3 muestra la inhibición (en %) de todos los 16 pacientes.

Tabla 3: % de inhibición del enlace de IgE de 13 pacientes a rPhl p 5 después de la incubación con los antisueros de mezcla de péptidos anti-rPhl p 1, anti-HBV_Phlp5_V2 y anti- KLH de conejo Ejemplo 19: Los anticuerpos anti-HBV Phlp6 4XP1 de conejo bloquean el enlace de IgE del paciente a rPhl p 6 Para determinar la habilidad del Ig de conejo inducido por péptido para inhibir el enlace de los anticuerpos IgE de los pacientes alérgicos a rPhl p 6, placas de ELISA se recubrieron con ?µ?/p?? de Phl p 6, se lavaron y se bloquearon. Las placas se preincubaron con anti-péptido de conejo (HBV_Phlp6_4xPl, KLHP1) diluido, un anti-rPhl p 6 de conejo y, para propósitos de control, con los sueros preinmunes correspondientes. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros humanos de pacientes alérgicos a Phl p 6 (1:03 diluido) y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano de ratón (Pharmingen 1:1000) y luego con IgG antiratón de oveja POX-acoplado (Amersham Bioscience) 1:2000. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE logrado por la preincubación con los antisueros de anti-péptido se calculó como sigue: 100-ODi/ODp x 100. ODi y ODp representan las extinciones después de la preincubación con el suero inmune y preinmune de conejo, respectivamente. La Tabla 4 muestra la capacidad de los anticuerpos de péptido anti-Phl p 6 para inhibir el enlace de IgE de 21 pacientes alérgicos al rPhl p 6 completo. Los sueros de anti-proteina de fusión bloquearon el enlace de IgE al mismo grado como los sueros contra rPhl p 6 y KLHP1. La Tabla 4 muestra la inhibición (en %) de todos los 21 pacientes.

Tabla : % de inhibición del enlace de IgE de lo 21 pacientes a rPhl p 6 después de la incubación con anti sueros anti-rPhl p 6, anti-HBV_Phlp6_4xPl y anti-KLHPl d conejo Ejemplo 20: Reactividad de IgE de las proteínas de fusión de PreS determinada mediante el manchado puntos y ELISA Proteínas de fusión recombinantes, rBet v 1 purificadas, 4xPA-PreS, 2xPA2xPB-PreS se probaron para su reactividad de IgE, mediante ensayos de manchados de puntos no desnaturalizantes, a base de RAST. Dos pg de las proteínas purificadas y, para propósitos de control, HSA se mancharon en puntos sobre tiras de membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) .

Las tiras de nitrocelulosa se bloquearon en solución amortiguadora A (Vrtala, J Clin Invest, 1997) y se incubaron con sueros de pacientes alérgicos al polen de abedul (n = 50) , los sueros de personas no alérgicas (n = 3) diluido 1:10, control de solución reguladora y control positivo (antisuero anti-rBet va 1 de conejo diluido 1:1000). Los anticuerpos IgE enlazados se detectaron con anticuerpos Anti-IgE humano etiquetados con 125I (BS Diagnostica, Viena, Austria), anticuerpos de conejo enlazados con antisuero anti-conejo de cabra etiquetado con 125I (Perkin-Elmer) y se visualizaron mediante autorradiografía (Valenta y colaboradores, 1992). Adicionalmente, las placas de ELISA se recubrieron con rBet v 1 y las proteínas de fusión de PreS purificadas (5 g/mL) . Después el lavado y el bloqueo como es descrito en lo anterior, las placas se incubaron con sueros de pacientes alérgicos al polen de abedul (n = 21) y tres sueros de control no alérgicos diluidos 1:05. IgE enlazado se detectó mediante Anti-IgE humano de ratón purificado (BD Pharmingen) diluido 1:1000 durante la noche y se visualizó con el IgG anti-ratón de oveja etiquetado con HRP (GE Healthcare) diluido 1:2000. Después del lavado, se determinó la reacción de color como es descrito en lo anterior.

Ejemplo 21: Regulación hacia arriba inducida por alérgeno de CD203c de basófilos de pacientes alérgicos Muestras de sangre heparinizada se obtuvieron de pacientes alérgicos al abedul después de que se dio el consentimiento informado y se incubaron con concentraciones incrementadas de rBet v 1, 4PA-PreS, 2PAPB-PreS que varían de 0.001 a 1 mg/mL, un anticuerpo anti-IgE monoclonal (Immunotech, Marsella, Francia) como control positivo, o PBS (control negativo) durante 15 min (37°C). La expresión de CD 203c se determinó como es descrito en lo anterior.

Ejemplo 22: Respuestas linfoproliferativas e inducción de citoquina en PBMC de pacientes alérgicos al polen de abedul Las PBMCs de pacientes alérgicos al polen de abedul (n = 6) se han aislado mediante la centrifugación de gradiente de densidad Ficoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) . Subsecuentemente las PBMCs se resuspendieron en el medio AIM V (Life Technologies, Grand Island, NY) a una concentración final de 2 x 105 células/cavidad y se estimularon con dosis de antigeno disminuidas (cantidades equimolares de 5 pg/cavidad rBet v 1, PA, PB, PreS, 2PA-Pres, 2PB-Pres, 4PA-Pres, 2PAPB-PreS) , con el medio solo (control negativo) o con IL-2 (4 IE/cavidad) (control positivo). Después de 6 días, se midieron las respuestas proliferativas mediante la incorporación de [3H] timidina y se expresan como índices de estimulación (SI) .

Además la producción de citoquinas de 17 diferentes citoquinas (es decir, IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IFN-?, TNF- , G-CSF, GM-CSF, ???-?ß, MCP-1) después de 6 días de estimulación con el panel 17-Plex de citoquina humano Bio-Plex Pro (Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sobrenadantes no diluidos se mezclaron con anticuerpos monoclonales de ratón anti-citoquina/quimioquina acoplados a diferentes cuentas como anticuerpos de captura (Bio-Rad) . Una curva estándar de 8 puntos se utilizó para lograr la sensibilidad de baja extremo. Después del lavado, se adicionó el anticuerpo de detección biotinilado anti-citoquina . La reacción se visualizó al adicionar ficoeritrina etiquetada con estreptavidina (PE) y solución amortiguadora de ensayo. Las muestras se analizaron en un instrumento Luminex 100 (Biosource, Nivelles, Bélgica) y los datos se adquirieron utilizando el software Bio-Plex Manager 6.0. Todas las muestras se analizaron en una corrida. Los resultados se muestran en la Fig. 10.

Ejemplo 23: Análisis de los sueros de conejo inmunizados con rBet v 1 y las proteínas de fusión de. PreS para su reconocimiento de rBet v 1, alérgenos homólogos de Bet v 1 y péptidos derivados de Bet v 1 mediante ELISA Placas de ELISA ( axisorp, Nunc) se recubrieron ya sea con l /ml de rBet v i o los alérgenos homólogos en aliso (rAln g 1), avellano (rCor a 1), manzano (rMal di) y adicionalmente con varios péptidos derivados de Bet v 1 en una concentración de lyug/ml durante la noche a 4°C. Después del lavado y el bloqueo como es descrito en lo anterior los sueros de los inmunizados con rBet v 1 y las proteínas de fusión de PreS conjugadas con alumbre o CFA, se incubaron en diluciones en serie 1:02 que varían de 1:500 a 01:01 280 000 y a una concentración de 1:1000. El IgG de conejo enlazado se detectó con anticuerpos de anti-conejo de asno etiquetado con HRP (GE Healthcare) y la reacción de color se determinó como es descrito en lo anterior.

Ejemplo 24: Inhibición del enlace de IgE de pacientes alérgicos a rBet v 1 Una ELISA de inhibición se utilizó para estudiar la inhibición del enlace del IgE de los pacientes alérgicos al de polen de abedul a rBet v 1. Las placas de. ELISA se recubrieron con rBet v 1 en una concentración de l g/ml a 4°C durante la noche. Después del lavado y el bloqueo las placas se pre-incubaron con sueros de conejo dirigido contra la proteina de fusión de PreS, 2PAPB-PreS y el suero de conejo anti-Bet v 1 en una dilución de 1:80 y 1:160 en comparación con los sueros preinmunes de conejo durante la noche a 4°C. Después de una etapa de lavado adicional los sueros de los pacientes alérgicos al polen de abedul diluidos 1:05 se adicionaron durante la noche a 4°C y el IgE humano enlazado se detectó con un anticuerpo Anti-IgE humano monoclonal de ratón conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 (BD Pharmingen) . El porcentaje de inhibición del enlace de IgE a rBet v 1 después de la pre-incubación con antisuero de conejo 2PAPB-PreS y los antisueros de conejo Bet v 1 se calculó como sigue: porcentaje de inhibición = 100 - (DO1 x 100/ODP) . ODp y OD1 representan las extinciones después de la pre-incubación con sueros de conejo (OD1) especifico o preinmune (ODp) , respectivamente. (Fig. 12) Ejemplo 25: Uso de una formulación de vacuna que comprende una mezcla de 4 proteínas de fusión hipoalergénicas para el tratamiento de la alergia al polen de hierba en individuos humanos alérgicos al polen de hierba Una formulación inyectable de proteínas de fusión hipoalergénicas SEC ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, y' SEQ ID No. 17 con hidróxido de aluminio se preparó como es descrito en el ejemplo 8. En el curso de un estudio clínico, la vacuna se administró 3 veces subcutáneamente a 69 sujetos humanos alérgicos al polen de hierba (Fig. 17) La vacunación con la formulación de vacuna condujo a una respuesta inmune de IgG robusta. La inducción de IgG especifico de alérgeno después de la inyección s.c. de los 3 diferentes niveles de dosis de la vacuna y placebo se determinó mediante ELISA en los sueros recolectados de los participantes del estudio antes y después del tratamiento con 3 inyecciones s.c. de la formulación de vacuna (Fig. 14) .

Para este propósito, placas de ELISA (Nunc Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) se recubrieron con 5 ug/ml de los antigenos Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, y Phl p 6 o albúmina de suero humano (HSA) como control durante la noche a 4°C. Después del lavado con PBS que contiene Tween 20 al 0.5% (PT) y el bloqueo con BSA al 2% p/v en PT, las placas se incubaron subsecuentemente con sueros diluidos 1:10 a 1:100 de los pacientes, suero de un individuo no atópico o solución amortiguadora sola por triplicado durante la noche a 4°C. Los anticuerpos de IgE enlazados se detectaron con anticuerpos Anti-IgE humano acoplados a HRP diluidos en Pt, 0.5% p/v de BSA. El desarrollo de color se realizó mediante la adición de la solución de manchado ABTS sal de diamonio de (ácido 2,2'- Azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) , Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, E.U.A.) ( ???µ?/cavidad) . La densidad óptica se midió utilizando un lector de ELISA a 405 nm. Los resultados de las estimaciones de IgG se muestran en la Figura 14.

La vacuna no provocó cualquier reactividad de células T relevante hacia las proteínas de fusión hipoalergénicas en la formulación de vacuna como es determinado mediante el ensayo de proliferación de células T in vitro (Fig. 15), demostrando de esta manera la carencia de reactividad de células T de las proteínas de fusión hipoalergénicas .

Los ensayos de proliferación de células T se realizaron usando el siguiente procedimiento: células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de muestras de sangre heparinizadas de los pacientes alérgicos al polen de hierba mediante la centrifugación de gradiente de identidad Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido) . PBMC (2xl05) luego se cultivaron por triplicado en placas de 96 cavidades (Nunclone Nalge Nunc International, Roskilde, Dinamarca) en 200µ1 del medio Ultra Cultura libre de suero (BioWhittaker, Rockland, ME) suplementado con L-glutamina 2 mM (Sigma, St . Louis, MO) , b-mercaptoetanol 50 mM (SIGMA) y 0.1 mg de gentamicina por mi (Sigma) a 37°C y 5% de C02 en una atmósfera humidificada . Las células se estimularon en una mezcla que contiene. 0.25yg de cada componente de polipéptido de la vacuna y para comparación una concentración equimolar de extracto de hierba o para propósitos de control con 4 U de interleucina-2 por cavidad (Boehringer Mannheim, Alemania) o el medio solo. Después de 6 d de cultivo 0.5 µ?? por cavidad de [3H] timidina (Amersham Pharmacia Biotech) se adicionó y 16 h después de midió la . radiactividad incorporada mediante el conteo de centelleo de líquido utilizando un contador de centelleo de Microbeta (Wallac ADL, Freiburg, Alemania) . El cpm medio se calculó de los triplicados y los índices de estimulación (SI) se calcularon como el cociente del cpm obtenido por antígeno o la estimulación de interleucina-2 y el control no estimulado. Los resultados de los ensayos de proliferación se muestran en la Fig. 15.

El tratamiento con la vacuna indujo los anticuerpos de IgG con la capacidad para modular la respuesta de células T específicas de alérgeno como es demostrado por una respuesta proliferativa reducida en la estimulación con los alérgenos de polen de hierba en la presencia del IgG inducido por el tratamiento. (Fig. 16) . Para este propósito," se realizaron ensayos de proliferación de células T con PBMCs aisladas de los participantes del estudio después del tratamiento como es descrito en lo anterior con la excepción de que la estimulación se hizo con una mezcla de los 4 alérgenos de polen de hierba Phl p 1, Phl p 2, Phl p5, y Phl p 6 (0.25 g por alérgeno) junto con el suero recolectado del mismo participante antes y después del tratamiento. El arreglo experimental y los resultados se muestran en la Figura 16.

La reducción de los síntomas de alergia nasales inducidos por la provocación en una cámara de polen y la reducción de la reactividad de la piel como es determinado por la prueba de pinchadura de la piel titulada se observó en pacientes que tienen 3 inyecciones recibidas que contienen ya sea 2C^g o C^g de cada uno de los 4 polipéptidos, mientras que no hubo reducción en esos parámetros después del tratamiento con dosis de 10yg de cada polipéptido. (ver la Fig. 19) .

Ejemplo 26: Selección de péptidos derivados del alérgeno de ácaro de polvo casero Der p 2 y ' diseño de las proteínas de fusión de PreS utilizando esos péptidos Los 5 péptidos derivados de Der p 2 de no enlace de IgE - Der p2 Pepl (SEQ ID No. 96), Der p2 Pep2 (SEQ ID No. 97), Der p2 Pep3 (SEQ ID No. 98), Der p2 Pep4 (SEQ ID No. 99), y Der p2 Pep5 (SEQ ID No. 100) - se clasificaron con respecto a • sus propiedades de enlace de IgE (ensayo de manchado de puntos) · su potencial para inducir reacciones de células T específicas de Der p 2 y (ensayo de proliferación de células T) • su capacidad para inducir anticuerpos específicos del Der p 2 con la capacidad para bloquear IgE del paciente humano al Der p 2 (ELISA de inhibición utilizando el IgG de anti-péptido de conejo) Para ese propósito, cada uno de los péptidos se acopló químicamente a KLH. KLH y el acoplamiento químico de los péptidos se utilizó en ese experimento de clasificación, debido a que es un modelo fácil de utilizar y bien establecido y correcto que permite la comparación inicial de los diferentes péptidos.

El enlace de IgE de los péptidos derivados de Der p 2 en comparación al alérgeno completo se probó mediante el ensayo de manchado de puntos de IgE. Los sueros de 26 pacientes alérgicos al ácaro de polvo casero se incubaron con los péptidos conjugados con KLH punteados y el IgE enlazado se detectó con Anti-IgE humano etiquetado con 1251. No se detectó enlace de IgE para cualquiera de los 5 péptidos como es mostrado enseguida.

Para identificar los péptidos que inducen una baja respuesta linfoproliferativa en PBMC de pacientes alérgicos al ácaro de polvo casero, las PBMCs aisladas de 10 pacientes se estimularon con los 5 péptidos derivados de Der p 2 solos, los péptidos conjugados con KLH, y Der p 2 de tipo silvestre para comparación.

Las PBMCs de todos los 10 pacientes se estimularon mediante el Der p 2 de tipo silvestre, y no hubo o solamente muy baja proliferación a la estimulación con Der p2 pepl, Der p2 Pep2 y Der p2 pep4. La estimulación con Der p2 Pep3 y Der p2 Pep5 sin embargo, dio por resultado la proliferación significativa de las PBMCs en 4 de entre 10 y 3 de entre 10 casos, respectivamente, indicando que los péptidos 3 y 5 contienen epitopos de células T importantes.

Para identificar la habilidad de los péptidos para inducir el bloqueo de IgG, los conejos se inmunizaron con los 5 conjugados de KLH-péptido individuales. Subsecuentemente, la habilidad de IgG de conejo inducido por péptido para inhibir el enlace de los anticuerpos IgE de los pacientes alérgicos a rDer p 2 se investigó mediante ELISA. Placas de ELISA se recubrieron con 1 g/ml de rDer p 2, se lavaron y se bloquearon. Las placas se preincubaron con anti-péptido de conejo (KLH-P1, KLH-P2, KLH-P3, KLH-P4, y KLH-P5 ) diluido 1:100, un anti-rDer p 2 de conejo y, para propósitos de control, con los sueros preinmunes correspondientes. Después del lavado, las placas se incubaron con sueros humanos de pacientes sensibilizados a Der p 2, alérgicos al ácaro de polvo casero, (diluido 1:03) y el IgE enlazado se detectó con el Anti-IgE humano de ratón (Pharmingen 1:1000) y luego con IgG anti-ratón de oveja POX-acoplado (Amersham Bioscience) 1:2000. El porcentaje de inhibición del enlace de IgE logrado por la preincubación con los antisueros anti-péptido se calculó como sigue: 100 - ODi/ODP x 100.

Tabla 5: Capacidad de inhibición de los anticuerpos anti-Der p 2-péptido para inhibir el enlace de IgE de 20 pacientes alérgicos a rDer p 2 completo. Los sueros anti-KLH-péptido inducidos por los péptidos 2,3, y 4 bloquearon el enlace de IgE al mismo grado como los sueros contra Der p 2 de tipo silvestre. La Tabla 5 muestra la inhibición (en %) de todos los 20 pacientes Tabla 6: Matriz de decisión para la selección de péptidos. Los péptidos 2 y 4 cumplen todos los requerimientos de los fragmentos de péptido de la presente invención . el péptido el péptido induce eI péptido induce es de no nada o solamente 1UC inhibe el enlace baja reactividad de enlace de IgE ¿Péptido de lgE célula T humano a Der p2 adecuado? Ejemplo 27: Selección de péptidos hipoalergénicos derivados de Der p 1 La habilidad de los péptidos derivados de Der p 1 para inducir anticuerpos IgG bloqueantes de IgE se determinó utilizando los antisueros anti-péptido KLH de conejo y los sueros de 6 pacientes alérgicos al ácaro de polvo casero en una ELISA de inhibición como es descrito en el ejemplo 26 con la excepción de que las placas de ELISA se recubrieron con Der p 1 de tipo silvestre en lugar de Der p 2.

Tabla 7 : Capacidad de inhibición de los anticuerpos anti-Der p 1-péptido para inhibir el enlace de IgE de 6 pacientes alérgicos al Der p 1 completo. Los sueros anti-KLH-péptido inducidos por los péptidos 1, 2, y 8 se encontraron que bloquean el enlace de IgE a un grado similar como los sueros contra Der p 1 de tipo silvestre La Tabla 7 muestra la inhibición (en %) de 6 pacientes.

Paciente I Paciente II Paciente III Paciente IV Paciente V Paciente VI medio péptido 1 50 68,4 65,5 87,7 77,4 85, 1 72,4

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido, caracterizado porque comprende por lo menos tres fragmentos de péptido que consisten de 10 a 50 residuos de aminoácido consecutivos de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre fusionados al N- y C-terminal de un polipéptido de superficie de un virus de la familia hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie .

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de la familia hepadnaviridae es el virus de Hepatitis B.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido de superficie del virus de la familia de hepadnaviridae es PreS.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el por lo menos un fragmento del polipéptido de superficie es PreSl de Hepatitis B o PreS2 de Hepatitis B.

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque por lo menos uno de los por lo menos tres fragmentos de péptido derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre es un péptido que enlaza célula B.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los por lo menos tres fragmentos de péptido exhiben nada o reducida capacidad de enlace de IgE comparada con el alérgeno de tipo silvestre.

7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque por lo menos uno de los por lo menos tres fragmentos de péptido exhibe nada o sustancialmente nada de reactividad de célula T.

8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el alérgeno de tipo silvestre se selecciona del grupo que consiste de alérgenos de polen de abedul mayores, en particular Bet v 1, alérgenos de polen de hierba timotea mayores, de preferencia Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 y Phl p 7, alérgenos de ácaro de polvo casero mayores, de preferencia Der p 1, Der p 2 y Der p 23, alérgeno de gato mayor Fel d 1 y Fel d 2, alérgenos de abeja mayores, alérgenos de avispa mayores, profilinas, especialmente Phl p 12, alérgenos de olivo, de preferencia Ole e 1, alérgenos de Parietaria judaica, de preferencia Par j 2, alérgenos de ambrosia, de preferencia Amb a 1, alérgenos de polen de artemisa, de preferencia Art v 1, y alegerno de polen de cedro japonés, de preferencia Cry j 1 y Cry j 2.

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el fragmento de péptido se selecciona del grupo que consiste de los aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 o 212 a 241 de Phl p 1, aminoácidos 1 a 33, 8 a 39, 34 a 65 o 66 a 96 de Phl p 2, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 o 176 a 212 de Phl p 5, aminoácidos 23 a 54, 56 a 90, 73 a 114 o 95 a 127 de Phl p 6, aminoácidos 1 a 34 o 35 a 70 de cadena 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 o 64 a 92 de cadena 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79, 75 a 104, 30 a 74 o 60 a 104 de Bet v 1, aminoácidos 1 a 30, 52 a 84 o 188 a 222 de Der p 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 o 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 o 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111-145, 140-170, 175-205, 210-250 o 250-284 de Der p 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 o 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 o 32 a 70, 32 a 60, 52 a 84, 32 a 70 (Cys->Ser) de Der p 23, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 o 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 o 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 o 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 o 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 o 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 o 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 o 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300, 305 a 350 o 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 o 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 o fragmentos o variaciones de secuencia de los mismos .

10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el polipéptido de superficie del virus de la familia hepadnaviridae o por lo menos un fragmento del mismo comprende por lo menos dos fragmentos de péptido derivados de por lo menos una alérgeno de tipo silvestre fusionados a su N-terminal y por lo menos dos fragmentos de péptido derivados de por lo menos un alérgeno de tipo silvestre fusionados a su C-terminal .

11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque por lo menos dos de los por lo menos tres péptidos son idénticos.

12. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID. 149, SEQ ID No. 150, SEQ ID No. 151 y SEQ ID No. 152.

13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque es para el uso como una vacuna en el tratamiento o prevención de una alergia en un humano o animal.

14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido se administra a un individuo en la cantidad de 0.001 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, de preferencia 0.003 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.

15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque induce la producción de IL-10 e IFN-gama.

16. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque induce una respuesta de IgG que se enfoca sobre los epitopos de IgE de un alérgeno de tipo silvestre.

17. Molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Vector, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 .

19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vector es un vector de expresión.

20. El vector de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el vector es un vector bacteriano, fungal, de insecto, viral o mamífero.

21. Un hospedero, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 17 o un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

22. Formulación de vacuna, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 17 o un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

23. Formulación de vacuna para el uso en el tratamiento o prevención de alergia por polen de hierba que contiene una mezcla de polipéptidos hipoalergénicos derivados de alérgenos de polen de hierba, caracterizada porque por lo menos uno de los polipéptidos se selecciona de SEQ I D No. 14, SEQ I D No. 15, SEQ I D No. 16 y SEQ I D No. 17.

24. Formulación de vacuna para el uso en el tratamiento o prevención de alergia por polen de abedul, caracterizada porque contiene por lo menos un polipéptido hipoalergénico seleccionado de SEQ I D No. 18 o SEQ I D No. 19.

25. Formulación de vacuna para el uso en el tratamiento o prevención de alergia por ácaro de polvo casero que contiene por lo menos un polipéptido derivado de alérgenos de ácaro de polvo casero, caracterizada porque por lo menos uno de los polipéptidos se selecciona de SEQ ID No. 149, SEQ ID No. 150, SEQ ID No. 151 y SEQ ID No. 152.

26. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizada porque la formulación comprende 10 ng a 1 g, de preferencia 100 ng a 10 mg, especialmente 0.5 µq a 200 µq del polipéptido, molécula de ácido nucleico o vector.

27. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizada porque la formulación además comprende por lo menos un adyuvante, un excipiente farmacéutico aceptable y/o conservador.