ES2463828T3

ES2463828T3 - Polipéptidos híbridos hipoalergénicos para el tratamiento de alergia

Info

Publication number: ES2463828T3
Application number: ES10752799.6T
Authority: ES
Inventors: Rudolf Valenta; Birgit Linhart; Margarete Focke-Tejkl; Angela Neubauer; Peter Valent; Katharina Blatt
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2014-05-29
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: US9103835B2; JP5824452B2; CA2773424A1; EP2295076A1; EP2475386B1; US20120207788A1; EP2475386A1; WO2011029869A1; AU2010294248A1; JP2013504307A

Abstract

Un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.

Description

Polipéptidos híbridos hipoalergénicos para el tratamiento de alergia

Antecedentes de la invención

Más del 10 % de la población mundial sufre alergia al polen de gramíneas. Aquí, los presentes inventores describen el

5 desarrollo de una vacuna basada en moléculas híbridas hipoalergénicas recombinantes que se construyeron a partir de elementos derivados de los cuatro principales alérgenos del polen de hierba timotea Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 para el tratamiento de alergia al polen de gramíneas. Los genes sintéticos de codones optimizados que codifican bloques de construcción y combinaciones de los cuatro alérgenos se diseñaron según estudios de mapeo de epítopes y datos estructurales y posteriormente se expresaron en Escherichia coli. Diecisiete moléculas híbridas recombinantes se

10 purificaron por cromatografía de afinidad y se evaluaron con respecto a la expresión, pureza y plegamiento, solubilidad y actividad alergénica reducida. Se identificaron cuatro moléculas híbridas hipoalergénicas que consisten en elementos reensamblados de los cuatro alérgenos del polen de gramíneas que tras la inmunización en diferentes modelos animales indujeron anticuerpos IgG que bloquean el reconocimiento de IgE de los alérgenos del polen de gramíneas por pacientes alérgicos. Estas moléculas híbridas hipoalergénicas representan vacunas seguras para la inmunoterapia de la alergia al

15 polen de gramíneas.

Las alergias mediadas por IgE representan un problema de salud en el mundo con prevalencia creciente (1). El distintivo de la enfermedad alérgica es la producción de anticuerpos IgE específicos para alérgenos medioambientales, principalmente del polen, ácaros, caspa animal y mohos (1). Los síntomas alérgicos se producen cuando la IgE unida al receptor sobre mastocitos o basófilos se entrecruza por alérgeno multivalente, conduciendo a la liberación de mediadores 20 inflamatorios (2). Además, la presentación facilitada por IgE mediante Fc!RI y Fc!RII sobre células presentadoras de antígeno potencia fuertemente la activación de linfocitos T específicos para alérgenos que contribuye a inflamación alérgica mediada por linfocitos T (3, 4). La inmunoterapia específica para alérgenos actualmente representa el único tratamiento etiológico de alergias con efecto a largo plazo, aunque su éxito está alterado por el uso de extractos de alérgeno en bruto (5, 6). Estas preparaciones contienen material alergénico y no alergénico en cantidades variables, por lo 25 que la presencia de compuestos biológicamente activos aumenta el riesgo de efectos secundarios anafilácticos. Además, la falta de o escasa inmunogenicidad de alérgenos clínicamente relevantes reduce la eficacia de vacunas basadas en extractos (7). Se ha hecho un progreso sustancial en el campo de la caracterización de alérgenos durante los últimos 20 años mediante la aplicación de técnicas inmunoquímicas y de biológica molecular. Hoy en día, los alérgenos más comunes e importantes se han caracterizado con respecto a su estructura y propiedades inmunológicas. Se han 30 producido alérgenos recombinantes que se parecen mucho a las propiedades de los alérgenos naturales y pueden ahora usarse para el diagnóstico y terapia de alergia (5). Además, se ha mostrado que pueden manipularse los derivados de alérgenos con propiedades inmunológicas beneficiosas (8). Se han generado variantes modificadas de alérgenos con actividad alergénica con el fin de evitar los efectos secundarios mediados por IgE en el transcurso de la inmunoterapia y ya se han usado fragmentos derivados de Bet v 1 recombinantes con capacidad de unión a IgE fuertemente reducida en

35 un ensayo clínico (9). Moléculas híbridas que consisten en combinaciones de diferentes alérgenos han mostrado que aumentan la inmunogenicidad de sus componentes individuales (10-12).

Linhart y col. (Ref. 21) prepararon una molécula híbrida hipoalergénica con elevada inmunogenicidad combinando derivados hipoalergénicos de los dos principales alérgenos del polen de gramíneas Phl p 2 y Phl p 6, concretamente una molécula del mosaico de Phl p 2 y un mutante de deleción de Phl p 6, lo cual no fue sorprendente en vista de datos

40 previos (Ref. 15, 17).

El documento EP 1219301 A1 desvela polipéptidos híbridos que consisten en al menos dos proteínas alergénicas diferentes o fragmentos de las mismas.

El documento WO 2007/124526 A1 describe procedimientos para producir derivados del alérgeno de proteína natural Phl p 1 con actividad alergénica reducida que comprenden fragmentar el alérgeno de proteína natural y volver a unir los

45 fragmentos en un orden diferente.

El documento EP 1440979 A1 desvela un procedimiento para la preparación de proteínas de mosaico hipoalergénicas que comprende fragmentar el alérgeno en fragmentos sin reactividad de IgE y volver a unir los fragmentos en un orden diferente.

Schramm y col. (1999) The Journal of Immunology, 162, páginas 2406-2414, describen la producción de variantes del 50 alérgeno Phl p 5 con capacidad de unión a IgE reducida, pero reactividad de linfocitos T conservada.

Westritschnig y col. (2007) The Journal of Immunology, 179, páginas 7624-7634, investigan una vacuna hipoalergénica obtenida por reestructuración de la cola a la cabeza de Phl p 12 para el tratamiento de sensibilización cruzada a profilina.

Los presentes inventores han encontrado ahora que una combinación de la tecnología híbrida y la tecnología de mosaico no conduce en todos los casos a moléculas hipoalergénicas. Sorprendentemente, se ha observado que dos polipéptidos de fusión que consistieron en los mismos fragmentos, pero en un orden diferente, presentaron reactividades de IgE muy diferentes. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar polipéptidos que tienen propiedades hipoalergénicas y pueden servir de posible vacuna.

5 Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.

En una realización, el polipéptido hipoalergénico consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 39, 40, 41, 42, 53 y 54.

10 Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es el uso del polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de alergia, preferentemente de alergia al polen de gramíneas.

Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención.

15 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el diseño de moléculas híbridas por el ensamblaje de fragmentos de alérgenos derivados de los principales alérgenos del polen de la hierba timotea Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 (véase el Ejemplo 1).

La Figura 2 muestra un gel de PAA teñido con Coomassie que contiene las proteínas híbridas purificadas A-Q (véase el Ejemplo 1). Los pesos moleculares se indican en el margen izquierdo (m, marcador de peso molecular).

20 La Figura 3 muestra los espectros de CD en el UV lejano de las proteínas B, C, P y Q disueltas en agua recogidos en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón), véase el Ejemplo 2.

La Figura 4 representa la reactividad de IgE sobre híbridos unidos a nitrocelulosa y proteínas de control para tres pacientes alérgicos al polen de gramíneas representativos (véase el Ejemplo 3).

La Figura 5 representa reactividad alergénica reducida de híbridos en comparación con los alérgenos naturales 25 como se detecta por expresión de CD203c (véase el Ejemplo 4).

La Figura 6 representa reactividad de IgG después de la inmunización de ratones con una mezcla de Phl p 1 y Phl p 5, o una mezcla de Phl p 2 y Phl p 6, o una mezcla de B y C, o P o Q. El desarrollo de niveles de anticuerpos IgG1 específicos para Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 se comparó por medidas de ELISA (véase el Ejemplo 6).

La Figura 7 muestra los resultados del Ejemplo 7. La figura representa la reactividad de IgG después de la

30 inmunización de conejos con B, C, P o Q, concretamente respuestas de anticuerpos IgG a los alérgenos naturales Phl p 1 (Figura 7A), Phl p 5 (Figura 7B), Phl p 2 y Phl p 6 (Figura 7C).

La Figura 8 representa la reactividad de IgG después de la inmunización de conejos con B, C, P o HPG (un híbrido derivado de alérgenos del polen de gramíneas descrito en la Ref. 11), concretamente respuestas de anticuerpos IgG al alérgeno natural Phl p 1 (véase el Ejemplo 8).

35 Descripción detallada de la invención

El procedimiento de la presente divulgación es un procedimiento para identificar polipéptidos hipoalergénicos. Alternativamente, el procedimiento de la presente divulgación es un procedimiento de cribado para identificar polipéptidos hipoalergénicos. El término “hipoalergénico”, como se usa en el presente documento, significa la reducción de la reactividad y capacidad de IgE para inducir desgranulación de mastocitos o basófilos mediada por IgE.

40 En su primera etapa, el procedimiento de la presente divulgación comprende proporcionar un grupo de polipéptidos, en el que cada polipéptido dentro de dicho grupo comprende independientemente N fragmentos derivados de al menos dos alérgenos diferentes.

Los polipéptidos

El grupo de polipéptidos consiste en al menos dos polipéptidos diferentes. Preferentemente, el grupo de polipéptidos

45 consiste en 2 a 100, preferentemente de 3 a 75, más preferentemente de 4 a 50, lo más preferentemente de 5 a 30 polipéptidos diferentes.

Cada polipéptido comprende, o consiste independientemente en, N fragmentos derivados de al menos dos alérgenos diferentes. N es un número entero superior a 3, preferentemente N es 4 a 25, más preferentemente 4 a 20, todavía más preferentemente 4 a 15, lo más preferentemente 4 a 10 (por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10). Los polipéptidos dentro del grupo pueden comprender o consistir en el mismo número de fragmentos o un número diferente. Es decir, N puede ser igual o diferente para los polipéptidos respectivos dentro del grupo. Preferentemente, todos los fragmentos dentro de un polipéptido dado son diferentes entre sí.

Cada fragmento consiste en al menos 8, preferentemente de 8 a 100, más preferentemente de 10 a 90, todavía más preferentemente de 12 a 80, más preferentemente de 15 a 70, más preferentemente de 20 a 60 aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos del alérgeno.

El polipéptido preparado según la presente invención no consiste necesariamente solo en secuencias de aminoácidos derivadas de los alérgenos. Es posible que secuencias no nativas (por ejemplo, secuencias espaciadoras) se inserten entre los fragmentos (fragmentos que son secuencias de aminoácidos consecutivas de diferentes alérgenos). También es posible que los polipéptidos comprendan una secuencia de marca que facilita la purificación del polipéptido tras la expresión en una célula huésped. Un ejemplo de una secuencia de marca tal es una marca de hexahistidina que permite la purificación por cromatografía en quelato de Ni2+. Otras marcas son conocidas para aquellos expertos en la materia. Además, el polipéptido puede contener un residuo de metionina extraño en la posición de aminoácido 1 que resulta de la expresión en células huésped. La metionina estará frecuentemente presente si la porción del extremo N del polipéptido es un fragmento de alérgeno interno o del extremo C.

En una realización de la presente divulgación, el polipéptido puede consistir en una cualquiera de las siguientes estructuras (I) a (VII):

(I): Met-F1-F2-... -FN-marca,

(II): Met-F1-F2-... -FN,

(III) F1-F2-... -FN-marca,

(IV): Met-marca-F1-F2-... -FN,

(V): marca-F1-F2-... -FN,

(VI): marca-F1-F2-... -FN-marca,

(VII) F1-F2-... -FN

en las que Met es un residuo de metionina del extremo N, F1, F2 y FN son el primer, segundo y enésimo fragmento, respectivamente, y marca es una secuencia de marca (por ejemplo, una marca de hexahistidina (His)6). En las realizaciones (I) a (VII) anteriores no hay aminoácidos extraños entre los fragmentos. Es decir, F1-F2-... -FN es una secuencia consecutiva de fragmentos de alérgenos. En otras realizaciones, puede haber uno o más (por ejemplo 1, 2 ó 3) aminoácidos extraños entre los fragmentos. Sin embargo, lo cual no se prefiere.

El polipéptido según la presente invención puede prepararse por diversos procedimientos. En una realización el polipéptido se prepara expresando un polinucleótido en una célula huésped. La célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota. Si se usan células procariotas la célula huésped es preferentemente E. coli. Ejemplos de células eucariotas incluyen levadura, células de insecto o líneas celulares tales como células CHO. Después de introducir un polinucleótido adecuado que codifica el polipéptido de la invención en una célula huésped la célula huésped se cultiva en condiciones tales que el polipéptido se exprese en la célula. El polipéptido puede ser secretado por la célula o se acumula dentro de la célula. Pueden usarse técnicas de purificación conocidas para recuperar el polipéptido de la célula o del medio de cultivo.

En otra realización el polipéptido se prepara por síntesis química, por ejemplo, por síntesis en fase sólida según técnicas que son por sí conocidas.

Alérgenos

El término “alérgeno” como se usa en el presente documento indica una sustancia que puede provocar una reacción de hipersensibilidad tipo I en individuos atópicos. La mayoría de los seres humanos organizan respuestas de inmunoglobulina E (IgE) significativas solo como defensa contra las infecciones parasíticas. Sin embargo, algunos individuos organizan una respuesta de IgE contra antígenos medioambientales comunes. Esta predisposición hereditaria se llama atopía. En individuos atópicos, los antígenos no parasíticos estimulan la producción de IgE inapropiada, conduciendo a hipersensibilidad tipo I.

Alérgenos en el sentido de la presente divulgación incluyen alérgenos de plantas y animales (base de datos Allergome: www.allergome.org). Los alérgenos son normalmente alérgenos naturales. Los alérgenos pueden ser alérgenos de una o más de las siguientes especies: Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermafophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus 5 putrescentiae, Blattella germanica, Periplaneta americana, Harmonia axyridis, Archaeopotamobius sibiriensis, Artemia franciscana, Charybdis feriatus, Crangon crangon, Homarus americanus, Litopenaeus vannamei, Metapenaeus ensis, Panulirus stimpsoni, Penaeus aztecus, Penaeus indicus, Penaeus monodon, Pontastacus leptodactylus, Aedes aegypti, Chironomus kiiensis, Chironomus thummi thummi, Forcipomyia taiwana, Triatoma protracta, Apis cerana, Apis dorsata, Apis mellifera, Bombus pennsylvanicus, Bombus terrestris, Dolichovespula arenaria, Dolichovespula maculata, Myrmecia 10 pilosula, Polistes annularis, Polistes dominulus, Polistes exclamans, Polistes fuscatus, Polistes gallicus, Polistes metricus, Polybia paulista, Polybia scutellaris, Solenopsis geminata, Solenopsis invicta, Solenopsis richteri, Solenopsis saevissima, Vespa crabro, Vespa mandarinia, Vespula flavopilosa, Vespula germanica, Vespula maculifrons, Vespula pensylvanica, Vespula squamosa, Vespula vidua, Vespula vulgaris, Argas reflexus, Thaumetopoea pityocampa, Ctenocephalides felis felis, Lepisma saccharina, Rana esculenta, Canis familiaris, Felis domesticus, Bos domesticus, Sardinops sagax, Gadus 15 callarias, Gallus domesticus, Oryctolagus cuniculus, Xiphias gladius, Equus caballus, Lepidorhombus whiffiagonis, Cavia porcellus, Mus musculus, Rattus norvegius, Salmo salar, Dendronephthya nipponica, Todarodes pacificus, Helix aspersa, Haliotis midae, Anisakis simplex, Ascaris suum, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium oxalicum, Fusarium culmorum, Trichophyton 20 rubrum, Trichophyton tonsurans, Candida albicans, Candida boidinii, Epicoccum purpurascens, Coprinus comatus, Psilocybe cubensis, Rhodotorula mucilaginosa, Malassezia furfur, Malassezia sympodialis, Chamaecyparis obtusa, Cryptomeria japonica, Cupressus arizonica, Cupressus sempervirens, Juniperus ashei, Juniperus oxycedrus, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Phoenix dactylifera, Asparagus officinalis, Crocus sativus, Ananas comosus, Anthoxanthum odoratum, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Hordeum vulgare, 25 Lolium perenne, Oryza sativa, Paspalum notatum, Phalaris aquatica, Phleum pratense, Poa pratensis, Secale cereale, Sorghum halepense, Triticum aestivum, Zea mays, Musa acuminata, Apium graveolens, Daucus carota, Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia psilostachya, Ambrosia trifida, Artemisia vulgaris, Helianthus annuus, Lactuca sativa, Brassica juncea, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Sinapis alba, Beta vulgaris, Chenopodium album, Salsola kali, Cucumis melo, Actinidia chinensis, Actinidia deliciosa, Bertholletia excelsa, Arachis hypogaea, Glycine max, Lens culinaris, 30 Lupinus angustifolius, Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Vigna radiata, Alnus glutinosa, Betula verrucosa, Carpinus betulus, Castanea sativa, Corylus avellana, Juglans nigra, Juglans regia, Quercus alba, Catharanthus roseus, Fraxinus excelsior, Ligustrum vulgare, Olea europea, Plantago lanceolata, Sesamum indicum, Syringa vulgaris, Persea americana, Hevea brasiliensis, Mercurialis annua, Ricinus communis, Platanus acerifolia, Platanus orientalis, Fragaria ananassa, Humulus japonicus, Malus domestica, Morus nigra, Parietaria judaica, Parietaria officinalis, Prunus armeniaca, Prunus

35 avium, Prunus domestica, Prunus dulcis, Prunus persica, Pyrus communis, Rubus idaeus, Ziziphus mauritiana, Vitis vinifera, Anacardium occidentale, Citrus limon, Citrus reticulata, Citrus sinensis, Litchi chinensis, Pistacia vera, Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum.

Preferentemente, uno o más alérgenos de la presente divulgación son alérgenos de las especies Phleum pratense, Betula verrucosa, Dermatophagoides pteronyssinus. Lo más preferentemente, uno o más alérgenos son alérgenos de las

40 especies Phleum pratense.

En una realización preferida del procedimiento de la presente divulgación, todos los alérgenos de los que se derivan fragmentos son de una única especie de la lista citada anteriormente. Es decir, los diferentes 'alérgenos fuente' se derivan todos de las mismas especies.

Un grupo preferido de alérgenos según esta divulgación son alérgenos del polen de gramíneas, por ejemplo, alérgenos de

45 la especie Phleum pratense. Preferentemente, los alérgenos están seleccionados del grupo que consiste en Phl p 1, Phl p 2, Phl p 3, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12 y Phl p 13. Los alérgenos de la presente invención están seleccionados del grupo que consiste en Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6.

Los fragmentos se derivan de al menos dos alérgenos diferentes, preferentemente de 2 a 10 alérgenos diferentes, más preferentemente de 2 a 5 alérgenos diferentes, por ejemplo, de 2, 3, 4 ó 5 alérgenos diferentes.

50 En una realización especial, el grupo de polipéptidos comprende al menos 2 polipéptidos que consisten en los mismos fragmentos pero en los que los fragmentos se ensamblan en un orden diferente.

Determinación de la reactividad de IgE

En otra etapa, el procedimiento de la presente divulgación comprende determinar la reactividad de IgE de los polipéptidos. En un sentido más amplio, el término “reactividad de IgE” indica la capacidad de una sustancia para unirse a anticuerpos 55 IgE. Más específicamente, como se usa en el presente documento, el término “reactividad de IgE” se refiere a la capacidad del polipéptido para unirse a anticuerpos IgE de individuos que son alérgicos a uno o más de los alérgenos de

los que se derivan los fragmentos dentro del polipéptido.

La reactividad de IgE puede medirse determinando el grado de unión entre (1) IgE de suero de individuos que son alérgicos a uno o más de los alérgenos de los que se derivan los fragmentos y (2) el polipéptido. Esto puede hacerse mediante el procedimiento descrito en la referencia (18) o (19).

5 Alternativamente, la reactividad de IgE y actividad alergénica pueden determinarse analizando la expresión de CD203c sobre basófilos humanos que se aislaron de individuos alérgicos a uno o más de dichos alérgenos. Véase el Ejemplo 4 y la referencia (20).

Determinación de la reactividad de linfocitos T

En otra etapa, el procedimiento de la presente divulgación comprende determinar la reactividad de linfocitos T de los

10 polipéptidos. El término “reactividad de linfocitos T” como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de una sustancia para unirse específicamente a receptores de linfocitos T. Más específicamente, “reactividad de linfocitos T” significa la capacidad del polipéptido para inducir proliferación de linfocitos T.

La reactividad de linfocitos T de los polipéptidos puede medirse (1) proporcionando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) aisladas de individuos alérgicos a uno o más de los alérgenos de los que se derivan los fragmentos, y

15 (2) determinando el grado de proliferación de linfocitos T contenidos en dichas CMSP. Véase el Ejemplo 5 y la referencia (16).

Inducción de una respuesta de IgG protectora

En otra etapa, el procedimiento de la presente divulgación comprende determinar la capacidad de los polipéptidos para inducir una respuesta de IgG contra uno o más de los alérgenos de los que se derivan los fragmentos. Esto puede

20 hacerse (1) inmunizando un mamífero no humano (por ejemplo, un ratón, rata o conejo) con el polipéptido y (2) determinando la cantidad de anticuerpos IgG producidos en dicho mamífero no humano que son específicos para dicho uno o más alérgenos de los que se derivan los fragmentos. Los anticuerpos IgG medidos son preferentemente anticuerpos IgG1. Preferentemente, la etapa (2) se realiza usando un ensayo de ELISA. Véase el Ejemplo 6.

El procedimiento comprende además determinar a qué grado los polipéptidos pueden inducir una respuesta de IgG

25 protectora. Esto puede hacerse (1) proporcionando una composición que contiene anticuerpos IgG inmunizando un mamífero no humano (por ejemplo, un ratón, rata o conejo) con el polipéptido; (2) proporcionando una composición que contiene anticuerpos IgE de individuos que son alérgicos a uno o más de dichos alérgenos de los que se derivan los fragmentos del polipéptido, y (3) midiendo si y/o a qué grado dicha composición que contiene anticuerpos IgG puede bloquear la unión de dichos anticuerpos IgE a uno o más de dichos alérgenos.

30 Esta prueba se realiza preferentemente usando un ensayo de ELISA. Por ejemplo, los alérgenos naturales de los que se derivan los fragmentos pueden inmovilizarse sobre una placa de ELISA. La placa de ELISA así pretratada puede entonces ponerse en contacto con dicha composición que contiene los anticuerpos IgG para permitir la unión de anticuerpos IgG a dichos alérgenos inmovilizados. Después de lavar la composición que contiene dichos anticuerpos IgE se pone en contacto con la placa de ELISA. Después de lavar se determina la cantidad de anticuerpos IgE. Véase el Ejemplo 7.

35 Selección del polipéptido

El procedimiento de la presente divulgación comprende la etapa final de seleccionar aquellos polipéptidos que presentan propiedades favorables y así son útiles para el posible uso como vacuna. Para seleccionar un polipéptido debe tener las siguientes propiedades:

(i): menor reactividad de IgE que uno o más de los alérgenos de los que se derivan los fragmentos del 40 polipéptido;

(ii) reactividad de linfocitos T

(iii) capacidad para inducir una respuesta de IgG dirigida contra los alérgenos de los que se derivan los fragmentos del polipéptido; y

(iv): capacidad para inducir una respuesta de IgG protectora que bloquee la unión de IgE de pacientes alérgicos a 45 dichos alérgenos de los que se derivan los fragmentos del polipéptido.

Con respecto al punto (i) anterior, el polipéptido se selecciona si su reactividad de IgE es inferior a la de al menos un alérgeno del que se deriva. Preferentemente, el polipéptido se selecciona solo si su reactividad de IgE es inferior a la de cada alérgeno del que se deriva. Por ejemplo, si el polipéptido consiste en fragmentos derivados de Phl p 2 y Phl p 5, el polipéptido debe tener una menor reactividad de IgE que Phl p 2, y debe tener una menor reactividad de IgE que Phl p 5 para seleccionarse.

Para ser seleccionado, la reactividad de IgE y la actividad alergénica se reducen preferentemente al menos el 25 %, más preferentemente al menos el 50 %, lo más preferentemente al menos el 90 %, determinado por mediciones de IgE cuantitativas como se describe en la Ref. 16, y como se describe en el Ejemplo 4.

5 Con respecto al requisito (ii), el polipéptido se selecciona solo si puede provocar la activación de linfocitos T específica para alérgenos (Ejemplo 5).

Con respecto a la condición (iii), el polipéptido se selecciona solo si puede inducir un respuesta de IgG específica para alérgenos tras la inmunización (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6).

Con respecto a la condición (iv), el polipéptido se selecciona solo si los anticuerpos IgG inducidos por inmunización 10 pueden inhibir la unión de IgE de pacientes alérgicos al alérgeno natural (véase, por ejemplo, el Ejemplo 7).

Polipéptidos hipoalergénicos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento

En otro aspecto la presente divulgación se refiere a un polipéptido hipoalergénico identificado y producido según esta divulgación.

El polipéptido hipoalergénico puede comprender o consistir en al menos cuatro fragmentos derivados de al menos dos

15 alérgenos diferentes, en el que la secuencia de aminoácidos de cualquiera de dos fragmentos adyacentes dentro del polipéptido no está presente como una secuencia de aminoácidos consecutiva en dicho alérgenos, caracterizado porque al menos un fragmento se deriva de Phl p 1 o Phl p 5. El número de fragmentos puede ser N, en el que N tiene el significado que se ha definido anteriormente.

En otra realización, el polipéptido hipoalergénico de la presente divulgación puede comprender o consistir en al menos

20 cuatro fragmentos derivados de al menos dos alérgenos diferentes, en el que la secuencia de aminoácidos de cualquier par de dos fragmentos adyacentes dentro del polipéptido de fusión no está presente como una secuencia de aminoácidos consecutiva en dicho alérgenos, caracterizado porque cada uno de dichos fragmentos consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 55 a 76. Estas secuencias de aminoácidos están comprendidas en los fragmentos usados en los ejemplos de la presente solicitud. El número de fragmentos puede ser N,

25 en el que N tiene el significado que se ha definido anteriormente. Preferentemente, el polipéptido hipoalergénico puede consistir en una cualquiera de las siguientes estructuras (VIII) a (XIV):

(VIII) Met-F1-F2-... -FN-marca,

(IX): Met-F1-F2-... -FN,

(X): F1-F2-... -FN-marca,

30 (XI) Met-marca-F1-F2-... -FN,

(XII) marca-F1-F2-... -FN,

(XIII) marca-F1-F2-... -FN-marca,

(XIV) F1-F2-... -FN

en las que Met es un residuo de metionina del extremo N, F1, F2 y FN son el primer, segundo y enésimo fragmento,

35 respectivamente, y marca es una secuencia de marca (por ejemplo (His)6), consistiendo cada fragmento en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 55 a 76. La secuencia de marca tiene normalmente 5 a 10 aminoácidos de longitud.

El polipéptido hipoalergénico de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37. Estas secuencias de aminoácidos están comprendidas en las

40 construcciones B, C, D, E, P y Q, respectivamente (véanse los ejemplos). El polipéptido hipoalergénico puede consistir en una cualquiera de las siguientes estructuras (XV) a (XXI):

(XV) Met-SEC-marca,

(XVI) Met-SEC,

(XVII) SEC-marca,

45 (XVIII) Met-marca-SEC, (XIX) marca-SEC,

(XX) marca-SEC-marca,

(XXI) SEC

en la que Met es un residuo de metionina del extremo N, SEC es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo 5 que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37, y marca es una secuencia de marca (por ejemplo (His)6). La secuencia de marca tiene normalmente 5 a 10 aminoácidos de longitud.

El polipéptido puede consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 39, 40, 41, 42, 53 y 54. Las construcciones B, C, D, E, P y Q consisten en estas secuencias de aminoácidos, respectivamente (véanse los ejemplos). Estas realizaciones se corresponden con la estructura (VIII) o (XV) anterior.

10 Todas las realizaciones descritas anteriormente a propósito del procedimiento de la presente divulgación son aplicables al polipéptido hipoalergénico de la invención y viceversa.

Otros aspectos de la invención

La invención se refiere adicionalmente a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención. Debido a la degeneración del código genético, muchas moléculas de polinucleótidos diferentes pueden codificar un único polipéptido.

15 El polinucleótido de la invención es preferentemente una construcción de expresión para obtener el polipéptido después de la expresión en células huésped. La construcción de expresión puede comprender además componentes que generalmente son conocidos en la técnica tales como secuencias promotoras, genes que codifican factores de resistencia contra antibióticos, un origen de replicación y similares.

La presente divulgación se refiere adicionalmente a una célula transfectada o transformada con un polinucleótido de la

20 presente invención. Células adecuadas incluyen células eucariotas y células procariotas. Las células eucariotas pueden transfectarse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como transfección mediada por fosfato de calcio, electroporación, lipofección, etc.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que contiene el polipéptido según la presente invención. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente

25 aceptables tales como un tampón o disolución de sal. Preferentemente, la composición farmacéutica de la invención es una composición de vacuna. En una realización particular, la composición farmacéutica contiene además un adyuvante tal como hidróxido de aluminio.

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para la preparación del polipéptido de la invención. El procedimiento comprende proporcionar un polinucleótido que codifica el polipéptido, introducir dicho polinucleótido en una 30 célula huésped, cultivar la célula huésped así obtenida en condiciones tales que el polipéptido híbrido se exprese, recuperar el producto de expresión de la célula. El polinucleótido puede prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Puede preferirse usar tecnología de PCR para preparar el polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención. Las secuencias de ADNc de los alérgenos del polen de gramíneas Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12 y 13 se muestran en SEC ID Nº: 11 a 20, respectivamente. Basándose en estas secuencias y en la divulgación en la presente

35 solicitud, el experto puede diseñar fácilmente ácidos nucleicos adecuados que codifican polipéptidos de la presente divulgación.

La invención se refiere además al uso del polipéptido descrito en el presente documento para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno alérgico. Un medicamento tal puede estar compuesto por el polinucleótido que codifica una vacuna que puede usarse directamente para la vacunación basada en ADN contra 40 alergia tipo 1. El polipéptido recombinante o sintético puede usarse para preparar formulaciones para el tratamiento oral, sublingual o parenteral de trastornos alérgicos de tipo 1 ya que se usan ahora rutinariamente para inmunoterapia. Ejemplos de formulaciones para inmunoterapia sublingual o polipéptido híbrido unido a adyuvante para inmunoterapia de inyección. Posibles aplicaciones también incluyen formas basadas en células de inmunoterapia que pueden basarse en, por ejemplo, células dendríticas u otras células presentadoras de antígeno. Aquellas células se transforman y se expresan

45 en antígeno in vivo. Preferentemente se usan células ortólogas transformadas con vectores adecuados. Un modo de aplicación puede ser la inyección subcutánea de polipéptido unido a adyuvante. Otra posibilidad es administración oral o nasal del polipéptido con el fin de inducir tolerancia inmunológica o anergia contra los componentes del polipéptido. Todas las posibles formulaciones pueden prepararse según medidas que son conocidas para aquellos expertos en la materia (esquema de administración de adyuvantes de dosificación).

50 La presente divulgación se refiere además al uso del polipéptido descrito en el presente documento o de un polipéptido o una célula descrita en el presente documento para la preparación de un medicamento para vacunación profiláctica o inducción de tolerancia. Administración profiláctica de polipéptidos híbridos significa la administración del polipéptido a individuos, preferentemente niños que todavía no sufren alergia tipo 1 con el fin de inducir un estado de tolerancia inmunológica, anergia o no sensibilidad, o una inmunidad protectora contra los componentes de la vacuna híbrida. Esto puede lograrse por los diversos protocolos explicados brevemente para el tratamiento de un trastorno alérgico establecido. El tratamiento profiláctico puede realizarse con los polipéptidos o polinucleótidos descritos en el presente documento anteriormente.

5 En otra realización, la presente divulgación se refiere al uso de un polipéptido descrito en el presente documento para la detección de anticuerpos contra una proteína alergénica en una muestra. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgM, IgE, IgG o IgA. La concentración del anticuerpo puede determinarse a partir de una muestra que ha sido obtenida de un líquido corporal. La muestra puede derivarse de animales o seres humanos. Tales pruebas pueden basarse en un polipéptido inmovilizado en fase sólida o el polipéptido en la fase líquida. Ejemplos de tales pruebas incluyen pruebas de ELISA, 10 pruebas de transferencia Western o cualquier otra prueba en la que el polipéptido se inmovilice para unirse a anticuerpos específicos fuera de la muestra. Alternativamente, el polipéptido se añade directamente al líquido que contiene anticuerpos con el fin de adsorber anticuerpos específicos como, por ejemplo, en ensayos inmunológicos competitivos.

El polipéptido de la invención también puede usarse para pruebas celulares tales como una prueba de proliferación de linfocitos T, etc.

15 Resumen de las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos mostradas en el listado de secuencias:

SEC ID Nº: secuencia / construcción

1 secuencia de aminoácidos de Phl p 1

2 secuencia de aminoácidos de Phl p 2

3 secuencia de aminoácidos de Phl p 3

4 secuencia de aminoácidos de Phl p 4

5 secuencia de aminoácidos de Phl p 5

6 secuencia de aminoácidos de Phl p 6

7 secuencia de aminoácidos de Phl p 7

8 secuencia de aminoácidos de Phl p 11

9 secuencia de aminoácidos de Phl p 12

10 secuencia de aminoácidos de Phl p 13

11 ADNc de Phl p 1

12 ADNc de Phl p 2

13 ADNc de Phl p 3

14 ADNc de Phl p 4

15 ADNc de Phl p 5

16 ADNc de Phl p 6

17 ADNc de Phl p 7

18 ADNc de Phl p 11

19 ADNc de Phl p 12

20 ADNc de Phl p 13

(continuación) (continuación)

SEC ID Nº:: secuencia / construcción

21: construcción A sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

22: construcción B sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

23: construcción C sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

24: construcción D sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

25: construcción E sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

26: construcción F sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

27: construcción G sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

28: construcción H sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

29: construcción I sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

30: construcción J sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

31: construcción K sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

32: construcción L sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

33: construcción M sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

34: construcción N sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

35: construcción O sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

36: construcción P sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

37: construcción Q sin Met del extremo N y (His)6 del extremo C

38: construcción A con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

39: construcción B con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

40: construcción C con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

41: construcción D con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

42: construcción E con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

43: construcción F con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

44: construcción G con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

45: construcción H con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

46: construcción I con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

47: construcción J con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

48: construcción K con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

49: construcción L con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

50: construcción M con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

51: construcción N con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

52: construcción O con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

53: construcción P con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

SEC ID Nº:: secuencia / construcción

54: construcción Q con Met del extremo N y (His)6 del extremo C

55: P1a

56: P1b

57: P1c

58: P1d

59: P1a1

60: P1a2

61: P1c1

62: P1c2

63: P2A

64: P2B

65: P2a

66: P2b

67: P2c

68: P2a1

69: P2b2

70: P5a

71: P5b

72: P5c

73: P5d

74: P5c1

75: P5c2

76: P6b

Las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº: 1-10 muestran los péptidos maduros que carecen del péptido señal, cuando corresponda.

5 Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplos

En este estudio los presentes inventores demuestran que estos enfoques pueden combinarse y extenderse para una fuente de alérgenos compleja como polen de gramíneas. Los presentes inventores construyeron una vacuna basada en los cuatro alérgenos principales de la hierba timotea (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6) para el tratamiento de alergia al

10 polen de gramíneas (13, 14). Con referencia a datos estructurales y estudios de mapeo de epítopes, los alérgenos se fraccionaron en fragmentos con actividad alergénica reducida. Los presentes inventores describen la producción de diferentes combinaciones de estos fragmentos como proteínas híbridas, sus propiedades bioquímicas e inmunológicas y cómo se seleccionaron cuatro proteínas híbridas como moléculas candidatas para la vacunación contra alergia al polen de gramíneas.

Ejemplo 1: Design, expresión y purificación de las moléculas híbridas

Para la construcción de moléculas hipoalergénicas híbridas se diseñaron diecisiete moléculas híbridas diferentes por el

ensamblaje de fragmentos de alérgenos derivados de los principales alérgenos del polen de la hierba timotea Phl p 1, Phl

p 2, Phl p 5, y Phl p 6 como se muestra en la Figura 1. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas resultantes

5 (diseñadas A-Q) se enumeran en la Tabla 1. P1M y P2M se refieren a derivados de alérgenos previamente diseñados

(Referencias 15, 16). Todas las secuencias fueron de codones optimizados para la expresión en Escherichia coli, se

añadió un codón de iniciación (ATG) en el extremo 5' y se añadió una marca de 6xhistidina en el extremo 3' de cada

secuencia, seguido de un codón de terminación. Los genes resultantes que codifican las moléculas híbridas A-Q se

clonaron en el vector de expresión pET17b (Novagen) y se expresaron en cultivo líquido en células BL21 de Eschericha 10 coli (DE3) (Stratagene). Todas las proteínas se purificaron por cromatografía de afinidad usando un protocolo

convencional (Qiagen). La pureza de las moléculas híbridas expresadas se analizó por SDS-PAGE. (Figura 2)

Ejemplo 2: Estimación de la estructura secundaria de las moléculas híbridas

Para evaluar la estructura secundaria de moléculas híbridas, espectros del CD de UV lejano de las proteínas B, C, P y Q disueltas en agua se recogieron en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón) como se 5 ha descrito (16). Todas las proteínas híbridas, que se analizaron con respecto a su estructura secundaria, presentaron una estructura enrollada al azar, que se ha observado previamente para varios otros derivados de alérgeno (18, 19).

Ejemplo 3: Reactividad de IgE de las moléculas híbridas

Para analizar la reactividad de IgE de moléculas híbridas, la unión directa de IgE del suero de pacientes alérgicos al polen de gramíneas a las moléculas híbridas derivadas de Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 A-Q, o rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y 10 rPhl p 6, o HSA como control negativo, se investigó por experimentos de transferencia puntual no desnaturalizante como se ha descrito (18, 19). Los anticuerpos IgE de pacientes se unieron a los alérgenos 'naturales' recombinantes Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6, pero no a la proteína de control HSA. Inesperadamente, los presentes inventores observaron reactividades de IgE diferentes de IgE de pacientes alérgicos a las moléculas híbridas A-Q, que no pudo explicarse por la estructura primaria (por ejemplo, híbridos A y C e híbridos E y F contienen exactamente los mismos fragmentos derivados

15 de alérgeno).

Ejemplo 4: Actividad alergénica reducida de las moléculas híbridas B, C, P y Q

Se seleccionaron cuatro moléculas híbridas, B, C, P y Q para posteriores análisis. Para determinar la reactividad de IgE de los híbridos B, C, P y Q sobre la activación de células efectoras dependientes de IgE se analizó la expresión de CD203c sobre basófilos humanos aislados de pacientes alérgicos al polen de gramíneas. CD203c se ha descrito

20 previamente como un marcador de activación sobre basófilos humanos, que está regulado por incremento tras la entrecruzamiento inducido por alérgenos de IgE unida a receptor (20). Como se muestra en la Figura 5, las células toleraron una concentración al menos 10 veces superior de las moléculas híbridas en comparación con la cantidad equimolar de los alérgenos naturales (pacientes 1-12). Estos datos sugieren una actividad alergénica fuertemente reducida de las cuatro moléculas híbridas B, C, P y Q.

25 Ejemplo 5: Proliferaciones de linfocitos T

Para evaluar la reactividad de linfocitos T de moléculas híbridas se realizaron experimentos de proliferación in vitro con CMSP aisladas de cuatro pacientes alérgicos al polen de gramíneas como se ha descrito (16). Aunque la actividad alergénica de las moléculas híbridas se redujo, se preservó la mayoría de los epítopes de los linfocitos T de los alérgenos Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 naturales (Tabla II).

Tabla. II. CMSP de pacientes alérgicos al polen de gramíneas responden a las moléculas híbridas

20 μg/ml: 10 μg/ml 5 μg/ml 2,5 μg/ml 1,25 μg/ml

rPhlp1+rPhlp 5: 2,5 (±1,5) 2,6 (±1,8) 2.,0 (±1,1) 1,3 (±0,1) 1,6 (±0,7)

B+C: 1,7 (±1,1) 2,1 (±1,5) 2,2 (±1,4) 2,0 (±0,9) 1,4 (±0,3)

P: 2,0 (±1,5) 2,2 (±1,4) 2,0 (±0,6) 2,7 (±1,2) 2,5 (±1,2)

rPhlp2+rPhlp6: 1,6 (±0,9) 1,3 (±0,69) 1,5 (±0,6) 1,3 (±0,7) 1,5 (±0,4)

O: 1,4 (±1,0) 1,6 (±0,8) 2,0 (±0,5) 2,9 (±1,0) 2,8 (±0,7)

Ejemplo 6: La inmunización con las moléculas híbridas B, C, P y Q indujo una respuesta de IgG dirigida contra los alérgenos naturales

35 Para investigar si anticuerpos IgG inducidos por inmunización con B, C, P o Q fueron capaces de reconocer o no los alérgenos naturales rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y rPhl p 6 se usaron dos modelos animales diferentes (ratones BALB/c, conejos). Los presentes inventores inmunizaron ratones BALB/c con una mezcla de Phl p1 y Phl p 5, o una mezcla de Phl p 2 y Phl p 6, o una mezcla de B y C, o P, o Q, y compararon el desarrollo de niveles de anticuerpos específicos para Phl p1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 por medidas de ELISA (Figura 6). Los híbridos B+C, además de P y Q, pudieron inducir una respuesta de anticuerpos IgG1 específica para Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6, que fue superior a la respuesta de anticuerpos inducida por los propios alérgenos naturales.

El desarrollo de respuestas de anticuerpos IgG específicas para alérgenos también se investigó por inmunización de conejos con B, C, P o Q. Se probaron diluciones sucesivas de anticuerpos de conejo para anticuerpos IgG específicos 5 para Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 por ELISA. Las construcciones B, C, P y Q pudieron inducir una respuesta de anticuerpos IgG a los alérgenos naturales Phl p 1 (Figura 7A), Phl p 5 (Figura 7B), Phl p 2 y Phl p 6 (Figura 7C).

Ejemplo 7: La inmunización con los alérgenos híbridos B, C, P y Q indujo una respuesta de IgG protectora que bloquea la unión de IgE de pacientes alérgicos a los alérgenos naturales y extracto de polen de gramíneas

Para examinar la capacidad de anticuerpos IgG inducidos con las moléculas híbridas B, C, P y Q para inhibir la unión de

10 IgE de pacientes alérgicos al polen de gramíneas a rPhl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y rPhl p 6, o a un extracto de polen de gramíneas natural. Por tanto, en experimentos de inhibición de ELISA, los presentes inventores preincubaron un extracto de polen de gramíneas natural unido a placas de ELISA con una mezcla de antisuero anti-P y Q de conejo, o una mezcla de antisuero anti-B, C y Q, o un antisuero de conejo obtenido por inmunización con un híbrido de polen de gramíneas previamente descrito (HPG) (11) que consiste en Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 o los sueros preinmunes

15 correspondientes. Estos anticuerpos IgG de conejo podrían inhibir la unión de IgE de 14 pacientes alérgicos al polen de gramíneas a los siguientes extractos de polen de gramíneas: P+Q: 73 %; B+C+Q: 78 %; HPG: 75 % (Tabla III). Se realizaron experimentos similares con rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y Phl p 6 unidos a placas de ELISA, conduciendo a una inhibición promedio del 81-94 % para Phl p 1 (Tabla IV), 86-90 % para Phl p 5 (Tabla V), 45 % para Phl p 2 (Tabla VI) y 34 % para Phl p 6 (Tabla VII).

Tabla III. % de inhibición de IgE de pacientes que se une a GPE después de la preincubación con antisueros de conejo Tabla IV. % de inhibición de IgE de pacientes que se une a rPhl p 1 después de la preincubación con antisueros de conejo

paciente: P+Q B+C+Q HPG

1: 90 93 92

2: 28 23 14

3: 84 89 87

4: 75 81 78

5: 61 71 70

6: 78 84 86

7: 81 86 86

8: 80 80 80

9: 76 83 73

10: 66 71 75

11: 76 87 86

12: 70 80 72

13: 72 81 75

14: 84 89 82

media: 73 78 75

DE: 15,0 17,1 18,9

20

paciente B+C B C PHPG

1 84 86 91 90 66 2 97 82 97 94 46 3 92 77 93 90 44 4 73 69 79 76 47 5 90 86 91 89 57 6 94 80 96 92 43 7 93 81 98 96 44 8 98 93 100 99 67 9 96 82 98 92 44 10 98 789994 44

media 92 81 94 91 50

DE 7,8 6,4 6,2 6,1 9,5

Tabla V. % de inhibición de IgE de pacientes que se une a rPhl p 5 después de la preincubación con antisueros de conejo

paciente B+C B C PHPG

1 92 93 94 94 94 2 93 91 90 95 97 3 92 86 90 92 93 4 86 82 86 89 89 5 87 83 90 91 92 6 93 88 91 94 96 7 95 91 95 96 98 8 95 92 94 97 98 9 68 63 66 52 52 10 95 909297 99

media 90 86 89 90 91

DE 8,2 8,9 8,4 13,5 14,0

Tabla VI. % de inhibición de IgE de pacientes que se une a rPhl p 2 después de la preincubación con antisueros de conejo

paciente Q HPG

1 52 86 2 50 87 3 41 71 4 60 76 5 46 83 6 43 74 7 47 60 8 31 45 9 30 54

media 45 71

DE 8,7 14,8

Tabla VII. % de inhibición de IgE de pacientes que se une a rPhl p 6 después de preincubación con antisueros de conejo

paciente Q HPG

1 38 55 2 38 53 3 36 52 4 29 47 5 32 46 6 40 51 7 32 38 8 41 59 9 23 32

media 34 48

DE 5,9 8,5

Ejemplo 8: La inmunización con las moléculas híbridas B, C y P indujo una respuesta de IgG dirigida contra el alérgeno Phl p 1 natural

5 Diluciones sucesivas de antisueros de conejo se probaron para anticuerpos IgG específicos para Phl p 1 por ELISA. Las construcciones B, C y P fueron capaces de inducir una respuesta de anticuerpos IgG al alérgeno natural Phl p 1. La respuesta de IgG se comparó con niveles de anticuerpos IgG inducidos por inmunización con una molécula híbrida que consiste en los alérgenos naturales Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6 (híbrido del polen de gramíneas, HPG), que se ha descrito previamente como una molécula altamente inmunogénica (11). Inesperadamente, C y P indujeron niveles incluso

10 mayores de anticuerpos IgG específicos para Phl p 1 en conejos. Los resultados se muestran en la Figura 8.

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G, Quirce S, Douladiris N, Papadopoulos NG, Valenta R, Spitzauer S. A recombinant hypoallergenic parvalbumin mutant for immunotherapy of IgE-mediated fish allergy. J Immunol. 2007.178:6290-6.

20.: Hauswirth AW, Natter S, Ghannadan M, Majlesi Y, Schernthaner GH, Sperr WR, Bühring HJ, Valenta R,

Valent P.J. Recombinant allergens promote expression of CD203c on basophils in sensitized individuals. Allergy 5 Clin Immunol. 2002. 110:102-9.

21. Linhart, B., Mothes-Luksch, N., Vrtala, S., Kneidinger, M., Valent, P. y Valenta, R. 2008. A hypoallergenic hybrid molecule with increased immunogenicity consisting of derivatives of the major grass pollen allergens, Phl p 2 and Phl p 6. Biol. Chem. 389:925-33.

LISTADO DE SECUENCIAS

10 <110> Biomay AG

<120> Polipéptidos híbridos hipoalergénicos para el tratamiento de alergia

<130> moléculas hipoalergénicas híbridas 15

<160> 76

<170> PatentIn versión 3.5

20 <210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> Phleum pratense

25 <400> 1

<210> 2

<211> 96

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 2 <210> 3

<211> 97

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 3

<210> 4

<211> 508 <212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 4

<210> 5

<211> 287

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 5

<210> 6

<211> 110

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 6 <210> 8

10

<210> 7

<211> 78

<212> PRT

<213> Phleum pratense

15

<400> 7

<211> 143

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 8

<210> 9 <211> 131

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 9

<210> 10 10 <211> 360

<212> PRT

<213> Phleum pratense

<400> 10 15

<210> 11

<211> 1066

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 11

<210> 12 <211> 525

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 12

<210> 13 10 <211> 294

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400>: 13 15

<210> 14

<211> 1567

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 14

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400>: 15 10

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400>: 16 10

<210> 17

<211> 575

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 17

<210> 18

<211> 786

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 18 <210> 19

<211> 396

<212> ADN

<213> Phleum pratense

<400> 19

<210> 20

<211> 1492

<212> ADN 15 <213> Phleum pratense

<400> 20

<210> 21

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción A sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 21

<210> 22

<211> 281

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 37

<223> construcción B sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 22

<210> 23

<211> 246 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción C sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 23

<210> 24

<211> 281

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción D sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 24

<210> 25

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción E sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 25

<210> 26

<211> 294

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción F sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 26 10

<210> 27

<211> 233 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción G sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 27

<210> 28

<211> 233

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción H sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 28

<210> 29

<211> 176

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción I sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 29

<210> 30

<220>

<223> construcción J sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 30

<210> 31 10 <211> 176

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>: 15 <223> construcción K sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 31

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>: 10 <223> construcción L sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 32 <210> 33

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción M sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 33

<210> 34

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción N sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 34

<210> 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción O sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 35

<210> 36

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción P sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 36

<210> 37

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción Q sin Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 37

5 <210> 38

<211> 253

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> construcción A con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 38

<210> 39

<211> 288

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción B con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 39

<210> 40

<211> 253

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción C con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 40

<210> 41

<211> 288 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción D con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 41

<210> 42

<211> 301

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción E con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 42 10

<210> 43

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción F con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 43

<210> 44

<211> 240

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción G con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 44 10

<210> 45

<211> 240 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción H con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 45

<210> 46

<211> 183

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción I con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 46

<210> 47

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción J con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 15

<400> 47

<210> 48

<211> 183

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> construcción K con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 48 15

<210> 49

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción L con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 49

<210> 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción M con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 50

<210> 51

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción N con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 51

<210> 52

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>: construcción O con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C 10

<400> 52

<210> 53

<211> 534

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 89

<223> construcción P con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 53

<210> 54

<211> 183

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción Q con Met del extremo N y hexahistidina del extremo C

<400> 54 10

<210> 55

<211> 64

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P1a

<400> 55

<210> 56

<211> 61

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P1b

20 <400> 56 <210> 58

<210> 57

<211> 80

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> fragmento P1c

<400> 57

10

<211> 35 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P1d 20

<400> 58 <210> 60

<210> 59

<211> 32

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> fragmento P1a1

<400> 59

10

<211> 32 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P1a2 20

<400> 60

25 <210> 61

<211> 39

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> fragmento P1c1

<400> 61

5 <210> 62

<211> 41

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> fragmento P1c2

<400> 62

<210> 63

<211> 49

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P2A

25 <400> 63

<210> 64

<211> 47 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P2B 10

<400> 64

15 <210> 65

<211> 33

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> fragmento P2a

<400> 65

<210> 66

<211> 32 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P2b 10

<400> 66

15 <210> 67

<211> 31

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> fragmento P2c

<400> 67

<210> 68

<211> 38

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P2a1

<400> 68

<210> 69

<211> 27

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P2b2

20 <400> 69

<210> 70 25 <211> 72

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P5a

<400> 70

<210> 71

<211> 78

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P5b

15 <400> 71 <210> 73

<210> 72

<211> 68

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> fragmento P5c

<400> 72

10

<211> 69 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P5d 20

<400> 73

<210> 74

<211> 34 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento P5c1 10

<400> 74

15 <210> 75

<211> 34

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> fragmento P5c2

<400> 75

<210> 76 5 <211> 80

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> fragmento P6b

<400> 76

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido hipoalergénico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 22, 23, 24, 25, 36 y 37.
2. El polipéptido hipoalergénico de la reivindicación 1, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del 5 grupo que consiste en SEC ID Nº: 39, 40, 41, 42, 53 y 54.
3.

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
4.

El uso del polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de alergia.

10 5. El uso de la reivindicación 4, en el que dicha alergia es alergia al polen de gramíneas.
6. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.