AT503296B1 - Protein-allergen-derivat - Google Patents
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Description
2 AT 503 296 B1
Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des Wildtyp-Protein-Allergens Phi p 1 und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Allergie ist die ererbte oder erworbene spezifische Änderung der Reaktionsfähigkeit gegen fremde (d.h. nicht eigene) Substanzen, die normalerweise harmlos sind (,Allergene“). Die Allergie ist mit entzündlichen Reaktionen in den betroffenen Organsystemen (Haut, Bindehaut, Nase, Rachenraum, Bronchien-Schleimhaut, Magen-Darm-Trakt), unmittelbaren Krankheitssymptomen, wie allergischer Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis, anaphylaktischer Schock und Asthma, und chronischen Krankheitsmanifestationen, wie Spätreaktionen bei Asthma und atopische Dermatitis, verbunden.
Die Typ I-Allergie stellt eine genetisch bestimmte Überempfindlichkeits-Krankheit dar, die etwa 20% der Bevölkerung der industrialisierten Welt befällt. Das pathophysiologische Merkmal der Typ I-Allergie ist die Produktion von Immunglobulin E-(lgE)-Antikörpern gegen ansonsten harmlose Antigene (Allergene).
Derzeit ist die einzige ursächliche Form der Allergie-Behandlung eine Allergen-spezifische Immuntherapie, bei welcher dem Patienten zunehmende Allergen-Dosen verabreicht werden, um ein allergenspezifisches Nichtansprechen zu induzieren. Obgleich mehrere Studien die klinische Wirksamkeit der allergenspezifischen Immuntherapie zeigten, versteht man die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig.
Der Hauptnachteil der allergenspezifischen Immuntherapie ist die Abhängigkeit von der Verwendung natürlicher Allergen-Extrakte, die schwierig, wenn nicht unmöglich, zu standardisieren sind, zumindest in großtechnischem Maßstab. Solche natürlichen Allergen-Extrakte bestehen aus verschiedenen allergenen und nicht-allergenen Verbindungen, und auf Grund dieser Tatsache ist es möglich, dass bestimmte Allergene im verabreichten Extrakt nicht vorhanden sind oder - was noch schlimmer ist - dass Patienten im Laufe der Behandlung neue IgE-Spezifitäten gegen Komponenten ausbilden können. Ein weiterer Nachteil einer Therapie auf Extrakt-Basis ergibt sich daraus, dass die Verabreichung von biologisch aktiven Allergen-Präparaten anaphylaktische Nebenwirkungen induzieren kann.
Die Anwendung molekular-biologischer Techniken auf dem Gebiet der Allergen-Charak-terisierung ermöglichte die Isolierung der cDNAs, die für alle relevanten Umwelt-Allergene codieren und ermöglichte die Herstellung rekombinanter Allergene. Die Verwendung solcher rekombinanter Allergene ermöglichte es, das Reaktivitätsprofil des einzelnen Patienten entweder durch Verfahren der in vitro-Diagnose (d.h. Detektion allergenspezifischer IgE-Antikörper im Serum) oder durch Testen in vivo zu bestimmen. Auf der Basis dieser Technologie erschien die Möglichkeit der Entwicklung neuer Impfstrategien auf Komponenten-Basis gegen eine Allergie, insbesondere gegen die Typ I-Allergie, die an das Sensibilisierungs-Profil des Patienten zugeschnitten sind, erreichbar. Auf Grund der Ähnlichkeit der rekombinanten Allergene mit ihren natürlichen Gegenstücken weisen jedoch auch rekombinante Allergene eine signifikante aller-gene Aktivität auf. Da die rekombinanten Allergene die allergene Aktivität der Wildtyp-Allergene sehr genau nachahmen, sind alle mit dieser allergenen Aktivität bei der Immuntherapie unter Anwendung natürlicher Allergene verbundenen Nachteile auch bei rekombinanten Allergenen vorhanden. Um die Immuntherapie zu verbessern, muss die allergene Aktivität der rekombinanten Allergene verringert werden, so dass die Dosis der verabreichten Allergene mit nur einem geringen Risiko anaphylaktischer Nebenwirkungen erhöht werden kann.
Es wurde vorgeschlagen, ausschließlich die Aktivität von allergenspezifischen T-Zellen durch das Verabreichen von Peptiden, die nur T-Zell-Epitope enthalten, zu beeinflussen. T-Zell-Epitope stellen kleine Peptide dar, die sich aus dem proteolytischen Verdau von intakten Allergenen durch Antigen-repräsentirende Zellen ergeben. Solche T-Zell-Epitope können als synthetische Peptide erzeugt werden. Bisher mit T-Zell-Epitopen durchgeführte Tests lieferten jedoch nur schlechte Ergebnisse und wiesen eine geringe Wirksamkeit auf. Es wurden mehrere Erklä- 3 AT 503 296 B1 rungen für die geringe Wirksamkeit einer Immuntherapie auf Basis von T-Zell-Peptid in Erwägung gezogen: erstens kann es schwierig sein, die optimale Dosis zu verabreichen, um eine T-Zellen-Toleranz anstelle einer Aktivierung zu erzielen. Zweitens haben kleine T-Zell-Epitop-Peptide eine kurze Halbwertszeit im Körper. Drittens gibt es beträchtliche Beweise dafür, dass die IgE-Produktion in atopischen Individuen eine Gedächtnis-Immun-Antwort darstellt, die keinen de novo-Klassenwechsel („dass switching“) erfordert und somit nicht durch von T-Zellen abstammende Cytokine gesteuert werden kann. Therapie-Formen, die ausschließlich auf der Verabreichung von T-Zell-Epitopen beruhen, könnten daher die Aktivität von allergenspezifischen T-Zellen modulieren, aber nur einen geringen Einfluss auf die Erzeugung von allergenspezifischen IgE-Antikörpern durch die bereits gewechselten Gedächtnis-B-Zellen haben.
Es wurde weiters vorgeschlagen, hypoallergene Allergen-Derivate oder -Fragmente durch rekombinante DNA-Technologie oder Peptid-Synthese zu erzeugen. Solche Derivate oder Fragmente tragen T-Zell-Epitope und können IgG-Antikörper induzieren, die mit der IgE-Erkennung des nativen Allergens konkurrieren. Es zeigte sich vor mehr als 20 Jahren, dass der proteolytische Verdau von Allergenen kleine Allergen-Fragmente ergab, die teilweise ihre IgE-Bindungs-Kapazität beibehielten, jedoch keine Soforttyp-Reaktionen („immediate type reacti-ons“) hervorriefen. Während die Proteolyse von Allergenen schwer Steuer- und standardisierbar ist, eröffnete die Molekularbiologie neue Wege zur Herstellung von IgE-bindenden Haptenen. Solche IgE-bindenden Haptene wurden als nützlich für eine aktive Immunisierung mit verringerten Risiken anaphylaktischer Wirkungen und für die passive Therapie vorgeschlagen, um Effektor-Zell-gebundenes IgE vor einem Allergen-Kontakt zu sättigen und somit eine Allergen-indu-zierte Mediator-Freisetzung zu blockieren.
Ein weiterer Vorschlag war, hypoallergene Allergen-Versionen mittels Gentechnik zu erzeugen, ausgehend von der Beobachtung, dass Allergene in der Natur als Isoformen, die sich lediglich in einigen wenigen Aminosäureresten voneinander unterscheiden, und/oder in Konformationen mit geringer IgE-Bindungs-Kapazität Vorkommen können. Beispielsweise ergab die Oligomeri-sation des Birkenpollen-Hauptallergens, Bet v 1, mittels Gentechnik ein rekombinantes Trimer mit stark reduzierter allergener Aktivität. Alternativ wurde die Einführung von Punkt-Mutationen vorgeschlagen, um entweder zu Konformations-Änderungen in der Allergen-Struktur zu führen und somit diskontinuierliche IgE-Epitope aufzubrechen oder die IgE-Bindungskapazität direkt zu beeinflussen (Valenta et al., Biol. Chem. 380 (1999), 815-824).
Es zeigte sich auch, dass die Fragmentierung des Allergens in einige Teile (z.B. in zwei Teile) zu einem beinahe vollständigen Verlust der IgE-Bindungskapazität und allergenen Aktivität des Allergens auf Grund eines Verluste ihrer nativ-artigen Faltungen führt (Vrtala et al., J. Clin. Invest. 99 (1997), 1673-1681) für Bet v 1, Twardosz et al. (BBRC 239 (1997), 197-204) für Bet v 4, Hayek et al. (J. Immunol.161 (1998), 7031-7039) für Aln g 4, Zeiler et al. (J.AIIergy Clin. Immunol.100 (1997), 721-727) für bovines Hautschuppen-Allergen, Elfman (lnt.Arch.Allergy lmmunol.117 (1998), 167-173) für Lep d2), Westritschnig (J. Immunol. 172 (2004), 5684-5692) für Phlp 7)). Die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuierliche/konformati-onelle IgE-Epitope enthalten, führt zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungskapazität des Allergens. Auf Basis dieser Kenntnis wurde im Stand der Technik untersucht, ob solche hypoallergenen Allergen-Fragmente schützende Immunantworten in vivo induzieren können (Westritschnig et al., (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003), 495-500).
In Ball T et al. (Eur J Immunol. 1999, 29: 2026-2036) wird die Verabreichung von Gräserpollenextrakten, welche auf Aluminiumhydroxid adsorbiert wurden, im Zuge einer Immuntherapie beschrieben. Dabei wurde festgestellt, dass im Zuge einer derartigen Therapie Phi p 1-Epitope, die vor Beginn der Therapie nicht erkannt wurden, nunmehr zu einer Induktion von Phi p 1-spezifischen IgE-Antikörpern führt.
In der US 2002/0052490 A1 werden rekombinante DNA-Moleküle geoffenbart, die für ein Polypeptid kodieren, welches zumindest ein Phi p 1-Epitop umfasst. 4 AT 503 296 B1
In Flicker S. et al. (J Allergy Clin Immunol. 2006, 117: 1336-1343) wurde festgestellt, dass ein C-terminales Phi p 1-Fragment den Großteil der allergenen Aktivität in Phi p 1-Molekül aufweist.
In Unhart B et al. (FASEB J.2002, 16: 1301-1303) wird die Herstellung von Hybridmolekülen verschiedener Allergene von Wiesen-Lieschgras beschrieben.
Die DE 103 51 471 A1 betrifft Hybridpolypeptide, welche eine Vielzahl von immun-dominanten T-Zell-Epitopen von Allergenen aufweisen, wobei zumindest zwei von den Allergenen miteinander nicht kreuz reagieren.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren für eine verbesserte Allergie-Immunotherapie auf Basis der oben erwähnten Kenntnisse vorzusehen. Solche Verfahren und Mittel sollten wirkungsvoll sein, mit einem geringen Risiko für einen anaphylaktischen Schock verbunden sein, leicht anwendbar und an die Bedürfnisse eines einzelnen Patienten anpassbar und leicht auf industrielle Maßstäbe übertragbar sein.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Wild-typ-Protein-Allergens Phi p1 (ein Haupt-Pollen-Allergen des Wiesen-Lieschgrases) mit im Vergleich zum Wildtyp-Allergen verringerter allergener Aktivität, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen des Wildtyp-Protein-Allergens Phi p1 (Swiss Prot. Nr. P 43213), - Fragmentieren des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente, wobei mindestens ein Fragment dieser mindestens drei Fragmente mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst und die mindestens drei Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität haben oder ihnen die allerge-ne Aktivität fehlt, und - Wiederverbinden der mindestens drei Fragmente in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet.
Allergische Reaktionen werden ausgelöst, wenn Allergene vorgeformtes IgE, das an den Hochaffinitäts-Rezeptor FcsRI an Mastzellen gebunden ist, vernetzen. Mastzellen belegen die Körperoberflächen und dienen dazu, das Immunsystem auf eine lokale Infektion aufmerksam zu machen. Sobald sie aktiviert sind, induzieren sie entzündliche Reaktionen durch Sezernieren chemischer Mediatoren, die in vorgeformten Granula gelagert sind, und durch Synthetisieren von Leukotrienen und Cytokinen, nachdem die Aktivierung stattgefunden hat. Daher ist wegen der verursachten Nebenwirkungen die Verabreichung von Wildtyp-Allergenen zur Verhinderung, Behandlung oder Sensibilisierung von Individuen, die eine Allergie haben oder bei welchen das Risiko einer Allergie besteht, nicht vorteilhaft. Ein Weg zur Vermeidung allergischer Reaktionen bei der Immuntherapie ist es, das Wildtyp-Allergen soweit zu modifizieren, dass diese modifizierten „Allergene“ in verringerter Menge oder gar nicht mehr an IgE binden. Folglich können solche Moleküle keine starke allergische Reaktion hervorrufen. Es sei jedoch bemerkt, dass Fragmente bestimmter Allergene möglicherweise nicht immunogen genug sind, um eine schützende Antikörper-Antwort zu induzieren (Westritschnig et al., (2004)).
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von Allergen-Derivaten mit verringerter oder fehlender Fähigkeit, an IgE zu binden, wobei jedoch gleichzeitig jene Merkmale des Allergens konserviert werden, welche notwendig sind, um eine T-Zellen-vermittelte Immun-Antwort zu induzieren. Dies kann mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden, weil jene Strukturelemente, die für die Induktion einer T-Zellen-vermittelten Immunantwort verantwortlich sind, z.B. T-Zell-Epitope des Wildtyp-Allergens, im Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen konserviert bleiben. Eine Umordnung („shuffling“) (Fragmentieren und Wiederverbinden) der Fragmente des Allergens führt jedoch zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität oder sogar zum vollständigen Verlust dieser Bindungs-Kapazität. Natürlich sind, wenn im Laufe der Erzeugung der Allergen-Derivate nur ein paar Aminosäurereste verloren gehen (deletiert sind) oder hinzu- 5 AT 503 296 B1 gefügt (insertiert sind), oder wenn die Teile durch einen Linker anstatt durch eine direkte Vereinigung verbunden werden, die Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung noch immer vorhanden. Diese Verringerung oder Ausschaltung der allergenen Aktivität wird durch das bekannte und allgemeine Prinzip der Teilung des Allergens in definierte Fragmente erreicht.
Das Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise rekombinant erzeugt. Natürlich ist es auch möglich, die einzelnen Allergen-Fragmente chemisch zu synthetisieren und danach miteinander zu verbinden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, gemessen.
Die Verringerung der allergenen Aktivität wird vorzugsweise durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern der Allergen-sensibilisierten Seren des Patienten an einen Dot-Blot des Derivats oder durch einen Basophilen-Freisetzungs-Test gemessen.
Herkömmliche in vitro-Tests zur Beurteilung der allergenen Aktivität inkludieren RAST (Sampson and Albergo, J. Allergy Clin. Immunol. 74:26, 1984), ELISAs (Burks et al., N. Engl. J. Med. 314:560, 1986), Immunoblotten (Burks et al., J. Allergy Clin. Immunol. 81:1135, 1988), Basophilen-Histamin-Freisetzungs-Tests (Nielsen, Dan. Med. Bull. 42:455, 1995 und du Buske, Allergy Proc. 14:243, 1993) und andere (Hoffmann et al., Allergy 54:446,1999).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die mindestens drei Fragmente die Aminosäurereste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183 und/oder die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phi p 1.
Die beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden mindestens drei Fragmente können mindestens eines der oben identifizierten T-Zell-Epitope aufweisen (vgl. z.b. Schenk S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1995) 96:986-996).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens drei Fragmente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A), den Aminosäureresten 65 bis 125 (B), den Aminosäureresten 126-205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phi p1.
Die Fragmente der vorliegenden Erfindung werden ausgewählt, um IgE-bindende/B-Zell-Epito-pe und konservierende T-Zell-Epitope, die die Erzeugung einer angemessenen Immunantwort auf diese Epitope induzieren können, zu zerstören. Die Zerstörung/Reduktion von im Wildtyp-Allergen Phi p1 natürlicherweise vorhandenen B-Zell-Epitopen könnte es ermöglichen, dass diese Derivate bei Verabreichung an ein Individuum vor allem eine T-Zell-vermittelte Antwort anstatt einer allergische Reaktion hervorrufen (vollständiges Fehlen oder verringerte Bindung an IgE, das an Mediator-freisetzende Zellen gebunden ist).
Die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat ist vorzugsweise B-D-A-C.
Natürlich ist es auch möglich, diese Fragmente auf eine alternative Weise zu reihen (D-B-A-C, B-A-D-C usw.), vorausgesetzt, dass das erhaltene Allergen-Derivat im Vergleich zum Wildtyp-Allergen eine verringerte allergene Aktivität aufweist.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Derivate können mit einem pharmazeutisch 6 AT 503 296 B1 akzeptablen Exzipienten leicht vereinigt und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.
Vorzugsweise werden die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans vereinigt und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung mit weiteren Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin vereinigt. Solche Allergene sind vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon. Solche Mischungen können spezifisch für die Bedürfnisse (Allergen-Profil) eines bestimmten Patienten hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches pharmazeutisches Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist dieses weitere Allergen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptailergen der Katze Fel d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2.
Die pharmazeutischen und Vakzin-Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung können neben einem Derivat von Phi p 1 andere Allergene oder Derivate und Fragmente davon, Allergen-Extrakte usw., umfassen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein mit einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliches Allergen-Derivat.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Allergen-Derivat von Wildtyp-Protein-Allergen Phi p 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mindestens drei Fragmente des Wildtyp-Protein-Allergens aufweist, die miteinander in einer Reihenfolge fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet, wobei die mindestens drei Wildtyp-Allergen-Fragmente eine verringerte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und wobei mindestens eines der mindestens drei Fragmente ein oder mehrere T-Zell-Epitope umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die mindestens drei allergenen Fragmente mindestens 6 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, insbesondere mindestens 15 Aminosäurereste.
Die mindestens drei Fragmente umfassen vorzugsweise die Aminosäurreste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183 und die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phi p 1.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens drei Fragmente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A), den Aminosäureresten 65 bis 125 (B), den Aminosäureresten 126 bis 205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phi p 1.
Die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat ist vorzugsweise B-D-A-C. 7 AT 503 296 B1
Die Allergen-Derivate der vorliegenden Erfindung können auch zum Nachweis und zur Diagnose einer Empfindlichkeit gegenüber Phi p 1 verwendet werden. Beispielsweise kann dies in vitro erfolgen durch Vereinigen von Blut oder Blutprodukten, die von einem im Hinblick auf Empfindlichkeit zu beurteilenden Subjekt erhalten wurden, mit einem eine Phi p 1-Aktivität aufweisenden Peptid, unter Bedingungen, die für die Bindung von Komponenten im Blut (z.B. Antikörpern, T-Zellen, B-Zellen) mit den Derivaten geeignet sind, und bestimmen des Ausmaßes, in welchem eine solche Bindung auftritt. Andere Diagnosemethoden für allergische Erkrankungen, bei welchen die Derivate der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen den Radioallergo-sorbens-Test (RAST), den Papier-Radioimmunosorbens-Test (PRIST), den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISSA), Radioimmuno-Assays (RIA), immun-radiometrische Assays (IRMA), Lumineszenz-Immuno-Assays (LIA), Histamin-Freisetzungs-Assays und IgE-lmmuno-blots.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe oben) und weitere Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung aus Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen, oder Mischungen davon.
Diese Zusammensetzung enthält vorzugsweise weiters einen Allergen-Extrakt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Allergen-Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung weiters ein oder mehrere Allergene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fel d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur aktiven Immunisierung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Immunisierung.
Dieses Medikament enthält vorzugsweise weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des rekombinanten Allergen-Derivats. Bevorzugte Verabreichungswege inkludieren alle Standard-Verabreichungs-Schemas, die für die Impfung im Allgemeinen und für die Allergie-Immuntherapie im Besonderen beschrieben und vorgeschlagen wurden (oral, transdermal, intravenös, intranasal, über die Schleimhaut usw.). Die vorliegende Erfindung inkludiert ein Verfahren zur Behandlung und Verhinderung einer Allergie durch Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung. 8 AT 503 296 B1
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, - Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und - Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder eine prokaryonti-sche Zelle, vorzugsweise Escherichia coli.
Vorzugsweise ist der Wirt ein Wirt mit einer hohen Expressions-Kapazität. Wie hierin verwendet ist „ein Wirt mit einer hohen Expressions-Kapazität“ ein Wirt, der ein Protein, an dem ein Interesse besteht, in einer Menge von mindestens 1 mg/l Kultur, vorzugsweise mindestens 5 mg/l, mehr bevorzugt mindestens 10 mg/l, am meisten bevorzugt mindestens 20 mg/l exprimiert. Natürlich hängt die Expressions-Kapazität auch vom ausgewählten Wirt und Expressionsystem (z.B. Vektor) ab. Bevorzugte Wirte gemäß der vorliegenden Erfindung sind E. coli, Pichia pasto-ris, Bacillus subtilis, Pflanzenzellen (z.B. aus Tabak stammend) usw..
Natürlich können die Allergen-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit irgendeinem anderen geeigneten Verfahren, insbesondere chemischer Synthese oder halbchemischer Synthese, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung ist weiters durch die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein.
Fig. 1A zeigt die Konstruktion eines hypoallergenen Phi p1-Derivats gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 1B zeigt die Aminosäure-Sequenz des phl p1-Mosaik-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NO: 1).
Fig. 2A zeigt eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE von P1m, welches auf >90% Reinheit gereinigt worden ist.
Fig. 2B zeigt eine massenspektroskopische Analyse von P1m. Die Laser-Desorptions-Massenspektren wurden auf lineare Weise mit einem TOF compact MALDI ll-lnstrument (Kra-tos, UK) (piCHEM, Österreich) erhalten.
Fig. 2C zeigt eine Cirkulardichroismus(CD)-Analyse von P1m. Weite UV-CD-Spektren wurden auf einem Jasco J-810-Spektropolarimeter (Jasco, Easton, MD) bei Raumtemperatur bei Protein-Endkonzentrationen von 46 μΜ für P1m und 12 μΜ für rekombinantes Phl p 1 in 0,001 cm bzw. 0,05 cm Bahn-Längen-Quarz-Kuvetten aufgenommen. Drei unabhängige Messungen wurden aufgezeichnet und für jeden Spektrai-Punkt gemittelt. Die endgültigen Spektren wurden durch Subtrahieren der unter identischen Bedingungen erhaltenen korrespondierenden Puffer-Spektren Basislinien-korrigiert. Die Ergebnisse wurden als mittlere Rest-Elliptizität [Θ] bei einer gegebenen Wellenlänge ausgedrückt.
Fig. 3 zeigt die IgE-Bindung an Membran-gebundene rekombinante Allergene rPhl p 1, P1m und HSA. Seren von 49 gegen Graspollen allergischen Patienten und ein Serum von einem nicht-atopischen Spender (n = 50) wurden mit den Membran-gebundenen rekombinanten Allergenen rPhl p 1, P1m und HSA inkubiert. Gebundenes IgE wurde mit mit 125l-markierten anti-Human-lgE-Antikörpern detektiert. 9 AT 503 296 B1
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der CD203c-Expression, wenn eine Probe von fünf gegen Phi p 1 allergischen Individuen rPhl p 1 und P1m ausgesetzt wird.
Fig. 5 zeigt die Induktion einer lgG1-Antwort bei einer rPhl p1 und P1m ausgesetzten Maus.
Beispiele: Charakterisierung eines hypoallergenen Phi p 1-Mosaik(P1m)-Proteins
Beispiel 1: Konstruktion eines hypoallergenen Phi p 1-Mosaik(P1m)-Proteins Für die Konstruktion eines rekombinanten hypoallergenen Phi p 1-Mosaiks wurden für vier Phi p 1-Fragmente codierende cDNAs amplifiziert. Die Fragmente A (AS 1-64), B (AS 65-125), C (AS 126-205) und D (AS 206-240) sind in Fig. 1A gezeigt. Die beschriebenen cDNA-Fragmente wurden durch „gene SOEing“ in der Reihenfolge B-D-A-C zusammengefügt (Horton et al., 1999). In den ersten PCR-Reaktionen wurden cDNAs für die Fragmente A (Primer AF: 5'ATC CCC AAG GTT CCC 3' und AR: 5'CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3'), B (Primer BF: 5'C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3' und BR: 5'GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3’), C (Primer CF: 5'AGC GCC GGC GAG CTG 3’ und CR: 5’C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3'), und D (Primer DF: 5'ACG GGC CCC TTC ACC 3' und DR: 5'GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3') erhalten. In der folgenden ersten SOEing-Reaktion wurden die Gel-gereinigten PCR-Produkte als Matrizen verwendet, um cDNAs zu erhalten, die für die Fragmente BD (unter Verwendung der Primer BF und DR) und AC (unter Verwendung der Primer AF und CR) codieren. In der nachfolgenden zweiten SOEing-Reaktion wurden die Gel-gereinigten Fragmente BD und AC als Matrizen verwendet, um das PCR-Produkt zu erhalten, das für BDAC codiert, wobei die Primer BF und CR (schematisch in Fig. 1A dargestellt) verwendet wurden.
Das resultierende cDNA-Konstrukt, das für BDAC codiert, wurde in die Ndel/BamHI-Restriktionsstelle von Plasmid pET17b (Novagen, Madison, Wl) insertiert. Am C-Terminus des BDAC-Konstrukts folgen auf zwei Glycine ein Hexahistidin-Tag, was die Reinigung des Mosaik-Proteins mittels Ni2+-Affinitäts-Chromatographie ermöglicht (Fig. 1B). Die korrekte Sequenz der cDNA, die für das phl p 1-Mosaik (P1m) codiert, wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Das resultierende Molekül behält die gesamte primäre Sequenz (Laffer et al., 1994) und T-Zell-Epitope (Schenk et al., 1995) bei.
Beispiel 2: Biochemische Charakterisierung von P1 m
Expression und Reinigung von P1m
Das P1m-Konstrukt wurde in E.coli BL21 (DE3) (Stratagene, Australien) transformiert und in LB-Medium, ergänzt mit 100 mg/l Ampicillin, exprimiert. Transformierte Zellen wurden bei 37°C zu einer OD600=0,9 gezüchtet, und die Expression des rekombinanten P1m wurde durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Inkubation wurde 4 h unter denselben Bedingungen fortgesetzt, und danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet. Rekombinantes P1m wurde aus der unlöslichen Pellet-Fraktion unter Verwendung denaturierender Bedingungen gereinigt. Die Zellen wurden durch 60-minütiges Rühren in 8 M Harnstoff, 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 8,0, lysiert. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 14.000 x g wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Säule geladen. Rekombinates P1m eluierte in 8 M Harnstoff, 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 4,5, und wurde durch schrittweise Dialyse für mindestens 4 h renaturiert, jeder Schritt gegen 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 6, 4, 3, 2, 1 und 0,5 M Harnstoff. Das Protein wurde schließlich gegen 10 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 8,0, dialysiert und unter Verwendung eines Amicon-Centricon YM.-3-Konzentrators konzentriert.
Die Proteinreinheit wurde mittels SDS-PAGE bestätigt. Die Protein-Konzentration der gereinig- 10 AT 503 296 B1 ten Probe wurde durch UV-Absorption bei 280 nm bewertet. Der molare Extinktions-Koeffizient des Proteins wurde aus dem Tyrosin- und Tryptophan-Gehalt berechnet (Gill et al., 1989). P1m zeigt ein Migrations-Muster, das rekombinantem Phi p 1 vergleichbar ist (siehe Fig. 2A), was mit dem gemäß der hergeleiteten Aminosäure-Sequenz des Proteins berechneten Molekulargewicht übereinstimmt.
Die Molekülmasse von P1m wurde mittels Massenspektrometrie als 27 082 Dalton bestimmt, was mit dem vorausgesagten Molekulargewicht des Proteins übereinstimmt (siehe Fig. 2B).
Das gereinigte P1m wurde mittels Circulardichroismus-Analyse analysiert und mit rekombinantem Phi p 1 verglichen, um deren Sekundär-Strukturgehalt zu bestimmen (siehe Fig. 2C). Unerwarteterweise ist P1m ein gefaltetes Molekül mit einem Minimum bei 207 und 215 nm und einem Maximum bei 195 nm, was eine beträchtliche Menge an ß-Sekundär-Struktur nahelegt. P1m, das ein künstliches Allergen-Protein darstellt, weist ein CD-Spektrum auf, das sich von der gefalteten Version von rekombinantem phl p 1-, in mit Baculovirus infizierten Insekten-Zellen exprimiert, unterscheidet (Ball et al.). Im Vergleich dazu zeigte in E.coli exprimiertes rekombi-nantes Phl p 1 das Spektrum eines ungefalteten Proteins, eine Tatsache, die kürzlich beschrieben wurde (Ball et al., 2005).
Beispiel 3: Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von P1m
Die IgE-Reaktivität von P1m wurde bestimmt und mit rPhl p 1 mittels Dot-Blot-Versuchen unter Bedingungen eines Antigen-Überschusses verglichen (Niederberger et al., 1998). Drei pg der gereinigten rekombinanten Proteine wurden auf Nitrozellulose-Streifen punktweise aufgetragen („dotted“) und mit Seren von 49 gegen Phl p 1 allergischen Patienten inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit mit 125l-markierten anti-Human-lgE-Antikörpern detektiert und durch y-Zählung (Wallac, Finnland) quantifiziert (Ball et al., 1999).
Die unter nicht-denaturierenden Bedingungen bestimmte IgE-Reaktivität von P1m war im Vergleich zur IgE-Bindungs-Kapazität von rPhl p 1 stark reduziert (Fig. 3). Die Quantifizierung von p1m-gebundenen IgE-Antikörpern zeigte eine mittlere Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von 86.5% von P1m im Vergleich zu rPhl p 1 (Tabelle 1).
Fig. 3 zeigt die IgE-Bindung an die Membran-gebundenen rekombinanten Allergene rPhl p 1, P1m und HSA. Seren von 49 gegen Graspollen allergischen Patienten und ein Serum von einem nicht-atopischen Spender (n = 50) wurden mit Membran-gebundenen rekombinanten Allergenen rPhl p 1, P1m und HSA inkubiert. Gebundenes IgE wurde mit mit 125l-markierten anti-Human-lgE-Antikörpern detektiert.
Tabelle 1. Serum-lgE-Reaktivität von rPhl p 1 und P1m. Punktweise aufgetragene Proteine wurden Seren von 29 gegen Graspollen allergischen Patienten ausgesetzt. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit mit 125l-markierten anti-Human-lgE-Antikörpern detektiert und durch y-Zählung quantifiziert.
IgE-Bindung (cpm) % Reduktion der
Patient_rPI_P1m IgE-Bindung (cpm) 1 855 31 96,4 2 604 209 65,4 4 252 45 82,1 5 724 47 93,5 6 1508 171 88,7 1 1 AT 503 296 B1
IgE-Bindung (cpm) % Reduktion der Patient rP1_P1m IgE-Bindung (cpm) 7 1133 303 73,3 8 247 37 85 9 1448 356 75,4 10 1676 213 87,3 11 17971 847 95,3 12 342 90 73,7 13 1539 77 95 14 413 58 86 15 105 28 73,3 16 252 19 92,5 17 300 27 91 18 987 70 92,9 19 623 34 94,5 20 687 47 93,2 21 50 8 84 22 694 42 93,9 23 1825 173 90,5 24 9681 386 96 25 1696 299 82,4 26 3230 295 90,9 27 183 25 86,3 28 763 89 88,3 29 179 40 77,7 30 0 0 - 86,5 %
Mittelwert
Beispiel 4: p1m zeigt verringerte allergene Aktivität Basophilen-Aktivierung, gemessen mittels CD203c-Expression
Peripheres Blut wurde von 5 allergischen Spendern nach Einverständniserklärung erhalten. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Blut-Aliquots (100 pl) wurden mit seriellen Verdünnungen von P1m und rphl p 1 (10'3 bis 10 pg/ml), anti-lgE-Antikörper (1 pg/ml) (Immuno-tech, Marseille, Frankreich) oder Puffer (mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, „phosphate-buffered saline“ = PBS) 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in PBS, enthaltend 20 mM EDTA, gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 10 μΙ PE-konjugiertem CD203c mAb 97A6 (Immunotech, Marseille, Frankreich) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden die Proben einer Erythrozyten-Lyse mit 2 ml FACS™ Lysing solution (Becton Dickinson, San Jose, CA) unterzogen. Die Zellen wurden gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels Zweifarben-Durchfluss-Cytometrie auf einem FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung von Paint-a-Gate Software analysiert. Aller-gen-induzierte Hinauf-Regulierung von CD203c wurde aus den mittleren Fluoreszenz-Intensitäten (MFIs), die mit stimulierten (MFIstim) und unstimulierten (MFIcomroi) Zellen erhalten worden waren, berechnet und als Stimulations-Index (MFIstim : MFIcomroi) ausgedrückt.
Die allergene Aktivität von P1m wurde durch Messung der CD203c-Expression auf Blut-Basophilen von fünf gegen Phi p 1 allergischen Patienten analysiert. Wie in Fig. 4 dargestellt ist 12 AT 503 296 B1 die CD203c-Expression nach Inkubation mit rPhl p 1 bei einer Protein-Konzentration von 1 pg/ml signifikant (p<0,05) hinauf reguliert, wogegen mit P1m keine Expression von CD203c induziert wird. Nur wenn die Konzentration von P1m auf 10 pg/ml erhöht wird, ist die Expression von CD203c hinauf reguliert. Somit zeigt Phi p 1 eine zehnfache allergene Aktivität im Vergleich zu P1m.
Beispiel 5: IgG-Antikörper, induziert durch Immunisierung mit P1m inhibieren bei Patienten die IgE-Bindung an rPhl p 1
Immunisierung von Kaninchen
Kaninchen wurden zuerst mit 200 pg P1m und rPhl p 1 unter Verwendung von CFA, und 100 pg der Immunogene für die folgenden Booster-Injektionen unter Verwendung von IFA (erste Booster-Injektion nach 4 Wochen, eine zweite Booster-Injektion mit unvollständigem Adjuvans wurde nach 7 Wochen gegeben) immunisiert (Charles River Breeding Laboratories, Kisslegg, Deutschland). Den Kaninchen wurde 8 Wochen nach der ersten Immunisierung das Blut entnommen („bled“).
Inhibierung der Bindung von IgE allergischer Patienten an rPhl p 1 durch P1 m-induziertes IgG
Die Fähigkeit von P1m- und rPhl p 1-induziertem Kaninchen-IgG, die Bindung von IgE allergischer Patienten an rPhl p1 zu inhibieren, wurde mit einem ELISA-Kompetitions-Test getestet (Focke et al., 2001). ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Dänemark) wurden mit 1 pg/ml rPhl p 1 beschichtet und mit 1/100 Verdünnungen der rPhl p 1- und P1m-Antiseren und - für Kontroll-zwecke - der entsprechenden Präimmun-Seren vorinkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1/10 verdünnten Seren von 43 mit Phi p 1-sensibilisierten, gegen Graspollen allergischen Patienten inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit HRP-gekuppelten Ziegen-anti-Human-lgE-Antikörpern (KPL, Gaithersburg, MD), 1/2500 verdünnt, detektiert. Der Prozentsatz der Inhibierung der IgE-Bindung, die durch Vorinkubation mit den anti-Phl p 1- und anti-P1m-antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: Prozentsatz der Inhibierung der IgE-Bindung = 100 - OD|/ODP x 100. OD| und ODP stellen die Extinktionen nach Vorinkubation mit den Kaninchen-Immunseren bzw. den entsprechenden Vorimmun-Seren dar.
Die Fähigkeit von P1m, die IgE-Bindung von Patienten an rPhl p 1 zu inhibieren, ist als Prozent Reduktion in Tabelle 2 gezeigt. Die stärkste Inhibierung der Patienten-lgE-Bindung an rPhl p 1 im Bereich von 0 bis 89% (52% mittlere Reduktion) wurde mit anti-P1m Antikörpern erreicht, wogegen die Inhibierung mit anti-Phl p 1-Antikörpern im Bereich von 4 bis 75% (43% Mittelwert) lag.
Tabelle 2. Gegen rPhl p 1 und P1m gezogene Kaninchen-Antiseren inhibieren die Bindung des IgE von gegen Graspollen allergischen Patienten an rPhl p 1. ELISA-Platten-gebundenes rPhl p 1 und P1m wurde mit Kaninchen-anti-rPhl p1- und anti-P1m-Antiseren vorinkubiert. Die von 43 gegen Graspollen allergischen Patienten erhaltenen Prozent der Reduktion der IgE-Bindung sind gezeigt.
% Reduktion der IgE-Bindung an rPhl p 1 durch P1 m-induziertes Kaninchen-IgG
Patient rctP1 OD Werte: raP1m 1 37 50 2 44 61 3 32 49 AT 503 296 B1
% Reduktion der IgE-Bindung an rPhl p 1 durch P1 m-induziertes Kaninchen-IgG
Patient rctP1 OD Werte: raP1m 4 50 70 5 4 34 6 44 52 7 55 75 8 27 38 9 51 55 10 28 0 11 32 13 12 36 24 13 40 36 14 20 14 15 23 51 16 39 60 17 41 56 18 25 41 19 42 55 20 43 58 22 62 56 23 55 68 24 46 50 26 35 32 27 31 24 28 70 77 29 28 38 30 58 65 31 43 57 32 52 56 33 56 66 34 59 66 36 69 80 37 49 70 38 72 81 39 37 61 40 68 78 41 23 37 42 75 89 43 49 68 44 72 81 45 72 85 47 9 23 Mittelwert 43 52 1 4 AT 503 296 B1
Beispiel 6: Immunogenität von P1m
Um zu untersuchen, ob das Phi p 1-Mosaik-Protein eine Allergen-spezifische IgG-Antwort in vivo induziert, wurden 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Breeding Laboratories) subkutan immunisiert. Gruppen von 5 Mäusen wurden mit 5 pg P1m, rPhl p 1 und - zu Kontrollzwecken - mit PBS alleine, adsorbiert an AI(OH)3 (Alu-Gel-S, Serva, Deutschland) immunisiert (Vrtala et al., 1998). Die Mäuse wurden drei Mal immunisiert (Tag 1, 28 und 56) und aus den Schwanzvenen wurden in 4-Wochen-lntervallen Blut entnommen, und die Seren wurden bei -20°C bis zur Analyse gelagert.
Die lgG1-Antworten auf rPhl p 1 wurden mittels ELISA gemessen (Vrtala et al., 1998). Die ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Dänemark) wurden mit 5 pg von P1m beschichtet und mit 1:1000 verdünnten Maus-Seren inkubiert. Gebundene lgG1-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten monoklonalen Ratten-anti-Maus-lgG1 (Pharmingen, CA) und einem 1:200 verdünnten, HRP markierten Schaf-anti-Ratten-Antiserum (Amsersham, UK) detektiert.
Wie in Fig. 5 gezeigt ist, ist die P1m-induzierte lgG1-Antwort auf rPhl p 1 beinahe so groß wie jene, die durch Immunisierung mit rPhl p 1 induziert ist.
Fig. 5. Immunogenität von P1m. Mittlere lgGrAntwort von 5 Mäusen, immuisiert mit PBS, rPhl p1 oder P1m oder (x-Achse) als OD-Werte (y-Achse) gezeigt, 4, 8 oder 12 Wochen nach Immunisierung.
Literaturstellen:
Ball, T„ et al. (2005) FEBS J. 272:217-227.
Ball, T„ et al. (1999) FASEB J. 13:1277.
Focke, M„ et al. (2001) FASEB J. 15:2042
Gill, S. C., and P. H. Hippel. (1989) Anal. Biochem. 182:319.
Hauswirth, AW., et al. (2002) J Allergy Clin Immunol 110:102.
Horton, R. M. (1999) Mol. Biotechnol. 2:93.
Laffer, S., et al. (1994) J. Allergy Clin. Immunol. 94:689.
Niederberger, V., et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101:258.
Schenk, S., et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. 96:986.
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Sequence listing
<110> "Biomay"AG
Allergopharma GmbH <120> Protein-Allergen-Derivat <130> R 47507 <140> ATA 755/2006 <141 > 2006-05-03 <160> 9 <170> Patentin Version 3.3
<210> 1 <211> 248 <212> PRT 1 5 AT 503 296 B1 <213> Artificial <220> <223> Phi p 1 Mosaic Protein <400 1 Ser Gly Arg Gly Cys Gly Ser Cys Phe Glu Ile Lys Cys Thr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Ala Cys Ser Gly Glu Pro Val Val Val His Ile Thr Asp Asp Asn 20 25 30 Glu Glu Pro Ile Ala Pro Tyr His Phe Asp Leu Ser Gly His Ala Phe 35 40 45 Gly Ala Met Ala Lys Lys Gly Asp Glu Gin Lys Leu Arg Thr Gly Pro 50 55 60 Phe Thr Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Lys 85 90 95 Ile Pro Lys Val Pro Pro Gly Pro Asn Ile Thr Ala Thr Tyr Gly Asp 100 105 110 Lys Trp Leu Asp Ala Lys Ser Thr Trp Tyr Gly Lys Pro Thr Gly Ala 115 120 125 Gly Pro Lys Asp Asn Gly Gly Ala Cys Gly Tyr Lys Asp Val Asp Lys 130 135 140 Pro Pro Phe Ser Gly Met Thr Gly Cys Gly Asn Thr Pro Ile Phe Lys 145 150 155 160 Ser Ala Gly Glu Leu Glu Leu Gin Phe Arg Arg Val Lys Cys Lys Tyr 165 170 175 Pro Glu Gly Thr Lys Val Thr Phe His Val Glu Lys Gly Ser Asn Pro 180 185 190 Asn Tyr Leu Ala Leu Leu Val Lys Tyr Val Asn Gly Asp Gly Asp Val 195 200 205 Val Ala Val Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys Asp Lys Trp Ile Glu Leu 210 215 220 Lys Glu Ser Trp Gly Ala Ile Trp Arg Ile Asp Thr Pro Asp Lys Leu 225 230 235 240 Gly Gly His His His His His His 245 1 6 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 atccccaagg ttccc <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 cagctcgccg gcgctcttga agatggg <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 ctcctcccat atgtccggac gcggc <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ggtgaagggg cccgtgcgca gcttctg <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 agcgccggcg agctg
Claims (31)
1 7 AT 503 296 B1 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 cgggatccta atgatgatga tgatgatggg cggcgagctt gtcgggagtg tc 52 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 acgggcccct tcacc 15 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 gggaaccttg gggatcttgg actcgta 27 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Wildtyp-Protein-Allergens Phi p 1 mit im Vergleich zum Wildtyp-Allergen verringerter allergener Aktivität, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen des Wildtyp-Protein-Allergens Phi p1, - Fragmentieren des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente, wobei mindestens ein Fragment dieser mindestens drei Fragmente mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst und die mindestens drei Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität haben oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und - Wiederverbinden der mindestens drei Fragmente in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allerge-nen Aktivität durch eine Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern der Allergensensibilisierten Seren des Patienten an einen Dot-Blot des Derivats oder durch einen 1 8 AT 503 296 B1 Basophilen-Freisetzungs-Test gemessen wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Fragmentieren des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente T-Zell-Epitope des Allergens bestimmt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente die Aminosäurereste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183 oder die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phi p 1 umfassen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A), den Aminosäureresten 65 bis 125 (B), den Aminosäureresten 126-205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phi p 1.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat B-D-A-C ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem pharmazeutisch akzeptablen Expzipienten vereinigt und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans vereinigt und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit mindestens einem weiteren Allergen zu einem Kombinations-Vakzin vereinigt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Allergen ein Wildtyp-Allergen ist, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergene, Derivate von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fel d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2.
14. Allergen-Derivat, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
15. Allergen-Derivat des Wildtyp-Protein-Allergens Phi p 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mindestens drei Fragmente des Wildtyp-Protein-Allergens enthält, die miteinander in einer Reihenfolge fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet, wobei die mindestens drei Wildtyp-Allergen-Fragmente eine verringerte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und wobei mindestens eines der mindestens drei Fragmente ein oder mehrere T-Zell-Epitope 19 AT 503 296 B1 umfasst.
16. Allergen-Derivat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Allergen-Fragmente mindestens 6 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, insbesondere mindestens 15 Aminosäurereste umfassen.
17. Allergen-Derivat nach einem Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente die Aminosäurreste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 1 bis 64, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 65 bis 125, die Aminosäurereste 126 bis 205, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183, die Aminosäurereste 206 bis 240 oder die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phi p 1 umfassen.
18. Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A), den Aminosäureresten 65 bis 125 (B), den Aminosäureresten 126-205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phi p 1.
19. Allergen-Derivat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat B-D-A-C ist.
20. Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 14 bis 19, und weiters Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung aus Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergene, Derivate von Wildtyp-Protein-Allergenen, oder Mischungen davon.
21. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
22. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten enthält.
23. Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters eines oder mehrere Allergene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen, insbesondere Phi p 1, Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 und Phi p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fel d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phi p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2, umfasst.
24. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
25. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments zur aktiven Immunisierung.
26. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Immunisierung.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das 20 AT503 296B1 Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass es 10 ng bis 1 g, vorzugweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 pg bis 200 pg des rekombinanten Allergen-Derivats umfasst.
29. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 codiert, - Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und - Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise Escherichia coli ist.
31. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-Derivat durch chemische Synthese hergestellt wird. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen
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