JP2009535041A - Phlp1アレルゲン誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
野生型タンパク質アレルゲンPhl p 1を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも3つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも3つの断片のうちの少なくとも1つの断片は少なくとも1つのT細胞エピトープを含み、該少なくとも3つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも3つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含む方法に関する。
本発明に係るアレルゲン誘導体をコードするDNA分子を準備するステップと、
上記DNA分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含む方法に関する。
(実施例1:低アレルゲン性Phl p 1モザイク(Plm)タンパク質の構築)
組み換え低アレルゲン性Phl p 1モザイクを構築するために、4つのPhl p 1断片をコードするcDNAを増幅した。断片A(アミノ酸1−64)、B(アミノ酸65−125)、C(アミノ酸126−205)およびD(アミノ酸206−240)は図1Aに示されている。説明したcDNA断片は、「ジーン・ソーイング法(gene soeing)」(Horton et al., 1999)によってB−D−A−Cの順序でアセンブルされている。第1のPCR反応において、断片A(プライマーAF:5'ATC CCC AAG GTT CCC 3'およびAR:5'CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3')、B(プライマーBF:5'C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3'およびBR:5'GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3')、C(プライマーCF:5'AGC GCC GGC GAG CTG 3'およびCR:5'C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3')およびD(プライマーDF:5'ACG GGC CCC TTC ACC 3'およびDR:5'GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3')のためのcDNAを取得した。その後の第1のソーイング(SOEing)反応では、断片BD(プライマーBFおよびDRを使用)および断片AC(プライマーAFおよびCRを使用)をコードするcDNAを取得するために、ゲル精製したPCR産物をテンプレートとして用いた。その後の第2のソーイング反応では、プライマーBFおよびCRを用いてBDACをコードするPCR産物を取得するために、ゲル精製した断片BDおよびACをテンプレートとして用いた(図1Aに概略的に示している)。
Plmの発現および精製
形質転換によりPlmコンストラクトをE.coli BL21(DE3)(ストラタジーン社、オーストラリア)内に導入し、100mg/lのアンピシリンを加えたLB培地中で発現させた。形質転換された細胞を37℃でOD600=0.9になるまで増殖させ、1mMのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによって組み換えPlmの発現を誘導した。同じ条件下で4時間インキュベーションを継続し、その後、遠心分離によって細胞を回収した。変性条件を用いて、組み換えPlmを不溶性ペレット画分から精製した。8Mの尿素、100mMのNaH2PO4、10mMのTris、pH8.0中で60分間攪拌することによって、細胞を溶解した。14,000×gで30分間遠心分離した後、上清をNi−NTAカラムにロードした。組み換えPlmを、8Mの尿素、100mMのNaH2PO4、10mMのTris、pH4.5中に溶出させ、段階的透析によって再生した。100mMのNaH2PO4、10mMのTris、pH8.0で、6M、4M、3M、2M、1Mおよび0.5Mの尿素を含む段階的透析の各ステップにおいて、少なくとも4時間透析した。10mMのTris、100mMのNaCl、pH8.0でタンパク質の最終的な透析を実施し、Amicon centricon YM.−3濃縮器を用いてタンパク質を濃縮した。
抗原過剰の条件下におけるドットブロット実験によって、PlmのIgE反応性を測定し、rPhl p 1と比較した(Niederberger et al., 1998)。3μgの精製組み換えタンパク質をニトロセルロースストリップ上に点状にのせ(ドットし)、49人のPhl p 1アレルギー性患者の血清とともにインキュベートした。結合したIgE抗体を、125I標識した抗ヒトIgE抗体を用いて検出し、γ−計測(Wallac社、フィンランド)によって定量した(Ball et al., 1999)。
CD203c発現によって測定された好塩基球の活性化
インフォームド・コンセントが得られた後、5人のアレルギードナーから末梢血を採取した。血液をヘパリン添加チューブに回収した。等分した血液(100μl)を、PlmおよびrPhl p 1の連続希釈(10−3から10μg/ml)、抗IgE抗体(1μg/ml)(イムノテック社、マルセイユ、フランス)またはバッファー(リン酸緩衝生理食塩水=PBS)とともに、15分間37℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を20mM EDTAを含むPBS中で洗浄した。次いで、CD203c mAb 97A6(イムノテック社、マルセイユ、フランス)を含む10μlのPEとともに、細胞を15分間室温(RT)でインキュベートした。その後、サンプルを、2mlのFACSTMライシング・ソリューション(ベクトン・ディッキンソン社、サンノゼ、カリフォルニア州)による赤血球溶解に供した。細胞を洗浄し、PBS中に再懸濁し、Paint−a−Gateソフトウェアを用いてFACScan(ベクトン・ディッキンソン社)で二色フローサイトメトリーにより解析した。CD203cのアレルゲン誘導亢進制御を、刺激細胞(MFIstim)および非刺激細胞(MFIcontrol)を用いて得られた平均蛍光強度(MFIs)から算出し、刺激指数(MFIstim:MFIcontrol)として表した。
ウサギへの免疫付与
まず、CFAを用いて、200μgのPlmおよびrPhl p 1によりウサギを免疫した。また、その後のIFA(チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー、キスレッグ、ドイツ)を用いた追加免疫注射のために、100μgの免疫原により免疫付与した(第1の追加免疫注射を4週間後に付与し、不完全アジュバントを含む第2の追加免疫注射を7週間後に付与した)。最初の免疫から8週間後、ウサギは出血させられた(bled)。
rPhl p 1へのアレルギー患者のIgE結合を阻害する、PlmおよびrPhl p 1により誘導したウサギIgGの阻害能力を、ELISA競合アッセイ(Focke et al., 2001)により試験した。ELISAプレート(ヌンク・マキシソープ社、デンマーク)を、1μg/mlのrPhl p 1でコートし、rPhl p 1およびPlm抗血清の1/100希釈液を用いて、また、コントロール目的のために対応する免疫前血清を用いて、プレインキュベートした。洗浄後、43人のPhl p 1感作花粉アレルギー患者からの血清1/10希釈とともに、プレートをインキュベートした。HRPに連結したヤギ抗ヒトIgE Abs(1/2500に希釈)(KPL、ゲイサーズバーグ、メリーランド州)を用いて、結合したIgE Absを検出した。抗Phl p 1および抗Plm抗血清を用いたプレインキュベーションにより実現したIgE結合の阻害の割合を、以下のように算出した。IgE結合の阻害の割合=100−ODI/ODP×100
。ODIおよびODPは、それぞれ、ウサギの免疫血清および対応する免疫前血清を用いてプレインキュベーションした後の吸光度を表している。
in vivoにおいて、Phl p 1モザイクタンパク質がアレルゲン特異的IgG応答を誘導するかを調べるために、6週齢の雌のBALB/cマウス(チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー)を皮下免疫した。5匹のマウスからなる複数のグループについて、5μgのPlm、rPhl p 1、およびコントロール目的のためにAl(OH)3に吸着したPBSのみ(Alu−Gel−S、セルバ、ドイツ)を用いて免疫した(Vrtala et al., 1998)。マウスを3回免疫し(1日目、28日目、56日目)、4週間おきに尾の静脈から採血し、分析まで血清を−20℃で保存した。
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Claims (31)
- 野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンPhl p 1の誘導体を製造する方法であって、
野生型タンパク質アレルゲンPhl p 1を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも3つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも3つの断片のうちの少なくとも1つの断片は少なくとも1つのT細胞エピトープを含み、該少なくとも3つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも3つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含むことを特徴とする方法。 - アレルゲン活性の低減を、野生型アレルゲンと比べて少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、特には少なくとも50%のIgE結合能力の低減によって判定することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- アレルゲン活性の低減を、好ましくは、上記誘導体のドットブロットに対する、アレルゲンに過敏な患者の血清におけるIgE抗体の結合の欠如によって、または好塩基球放出分析によって判定することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも3つの断片に断片化する前に、上記アレルゲンのT細胞エピトープを決定することを特徴とする請求項1から3の何れか1項に記載の方法。
- 上記少なくとも3つの断片は、Phl p 1の25から39番目までのアミノ酸残基、34から45番目までのアミノ酸残基、73から84番目までのアミノ酸残基、91から102番目までのアミノ酸残基、100から111番目までのアミノ酸残基、109から133番目までのアミノ酸残基、121から135番目までのアミノ酸残基、127から138番目までのアミノ酸残基、157から168番目までのアミノ酸残基、169から183番目までのアミノ酸残基、または226から240番目までのアミノ酸残基を含んで構成されることを特徴とする請求項1から4の何れか1項に記載の方法。
- 上記少なくとも3つの断片は、Phl p 1の1から64番目までのアミノ酸残基(A)、65から125番目までのアミノ酸残基(B)、126から205番目までのアミノ酸残基(C)および206から240番目までのアミノ酸残基(D)から成る群より選択されることを特徴とする請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、B−D−A−Cであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記誘導体を、製薬基準を満たした賦形剤と組み合わせて医薬製剤に仕上げることを特徴とする請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 上記誘導体を、好適なワクチンアジュバントと組み合わせて製薬基準を満たしたワクチン製剤に仕上げることを特徴とする請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 上記誘導体を少なくとも1つのさらなるアレルゲンと組み合わせて複合ワクチンにすることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 上記さらなるアレルゲンは、野生型アレルゲン、特に野生型アレルゲンの混合物、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 上記製剤は、アレルゲン抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項9から11の何れか1項に記載の方法。
- 上記さらなるアレルゲンは、主要なカバノキの花粉アレルゲン、特にBet v 1およびBet v 4、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン、特にPhl p 2、Phl p 5、Phl p 6およびPhl p 7、主要なイエダニアレルゲン、特にDer p 1およびDer p 2、主要なネコアレルゲンFel d 1、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン、特にPhl p 12、および貯蔵庫ダニ(storage mite)アレルゲン、特にLep d 2、から成る群より選択されることを特徴とする請求項10から12の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1から7の何れか1項に記載の方法によって得られるアレルゲン誘導体。
- 野生型タンパク質アレルゲンPhl p 1のアレルゲン誘導体であって、
上記野生型タンパク質アレルゲンの少なくとも3つの断片をふくみ、該3つの断片は上記野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序で互いに連結しており、
上記少なくとも3つの野生型アレルゲン断片はアレルゲン活性が低減しているか、またはアレルゲン活性を欠いており、上記少なくとも3つの断片のうちの少なくとも1つは1つ以上のT細胞エピトープを含んで構成されていることを特徴とするアレルゲン誘導体。 - 上記少なくとも3つのアレルゲン断片は、少なくとも6アミノ酸残基、好ましくは少なくとも10アミノ酸残基、特に少なくとも15アミノ酸残基を含んで構成されていることを特徴とする請求項15に記載のアレルゲン誘導体。
- 上記少なくとも3つの断片は、Phl p 1の25から39番目までのアミノ酸残基、34から45番目までのアミノ酸残基、1から64番目までのアミノ酸残基、73から84番目までのアミノ酸残基、91から102番目までのアミノ酸残基、100から111番目までのアミノ酸残基、109から133番目までのアミノ酸残基、121から135番目までのアミノ酸残基、65から125番目までのアミノ酸残基、126から205番目までのアミノ酸残基、127から138番目までのアミノ酸残基、157から168番目までのアミノ酸残基、169から183番目までのアミノ酸残基、206から240番目までのアミノ酸残基、または226から240番目までのアミノ酸残基を含んで構成されていることを特徴とする請求項15または16に記載のアレルゲン誘導体。
- 上記少なくとも3つの断片は、Phl p 1の1から64番目までのアミノ酸残基(A)、65から125番目までのアミノ酸残基(B)、126から205番目までのアミノ酸残基(C)および206から240番目までのアミノ酸残基(D)から成る群より選択されることを特徴とする請求項15から17の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体。
- 上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、B−D−A−Cであることを特徴とする請求項18に記載のアレルゲン誘導体。
- 請求項14から19の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体と、さらなるアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲン、特には野生型アレルゲン、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物の混合物とを含んで構成されることを特徴とするアレルゲン組成物。
- アレルゲン抽出物をさらに含むことを特徴とする請求項20に記載のアレルゲン組成物。
- 製薬基準を満たした賦形剤を含むことを特徴とする請求項20または21に記載のアレルゲン組成物。
- 主要なカバノキの花粉アレルゲン、特にBet v 1およびBet v 4、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン、特にPhl p 1、Phl p 2、Phl p 5、Phl p 6およびPhl p 7、主要なイエダニアレルゲン、特にDer p 1およびDer p 2、主要なネコアレルゲンFel d 1、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン、特にPhl p 12および貯蔵庫ダニアレルゲン、特にLep d 2、から成る群より選択される1つ以上のアレルゲンをさらに含んで構成されることを特徴とする請求項20から22の何れか1項に記載のアレルゲン組成物。
- アレルゲン特異的免疫療法薬剤の調剤のための、請求項14から23の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
- 能動免疫付与用薬剤の調剤のための、請求項14から23の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
- 予防免疫接種用薬剤の調剤のための、請求項14から23の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用。
- 上記薬剤は、アジュバント、希釈剤、防腐剤またはこれらの混合物をさらに含むことを特徴とする請求項24から26の何れか1項に記載の使用。
- 10ngから1g、好ましくは100ngから10mg、特には0.5μgから200μgの上記組み換えアレルゲン誘導体を含むことを特徴とする請求項24から27の何れか1項に記載の使用。
- 請求項15から18の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
請求項15から18の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体をコードするDNA分子を準備するステップと、
上記DNA分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 上記宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母細胞もしくは植物細胞、または原核細胞、好ましくはエシェリキア・コリであることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 請求項15から18の何れか1項に記載のアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
上記アレルゲン誘導体は化学合成によって製造されることを特徴とする方法。
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