AT503296A4 - Protein-allergen-derivat - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des Wildtyp-Protein-Allergens Phl p 1 und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Allergie ist die ererbte oder erworbene spezifische Änderung der Reaktionsfähigkeit gegen fremde (d.h. nicht eigene) Substanzen, die normalerweise harmlos sind ("Allergene"). Die Allergie ist mit entzündlichen Reaktionen in den betroffenen Organsystemen (Haut, Bindehaut, Nase, Rachenraum, Bronchien-Schleimhaut, Magen-Darm-Trakt) , unmittelbaren Krankheitssymptomen, wie allergischer Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis, anaphylaktischer Schock und Asthma, und chronischen Krankheitsmanifestationen, wie Spätreaktionen bei Asthma und atopische Dermatitis, verbunden.
Die Typ I-Allergie stellt eine genetisch bestimmte Überempfindlichkeits-Krankheit dar, die etwa 20% der Bevölkerung der industrialisierten Welt befällt.
Das pathophysiologische Merkmal der Typ I-Allergie ist die Produktion von Immunglobulin E-(IgE)Antikörpern gegen ansonsten harmlose Antigene (Allergene) .
Derzeit ist die einzige ursächliche Form der Allergie-Behandlung eine Allergen-spezifische Immuntherapie, bei welcher dem Patienten zunehmende Allergen-Dosen verabreicht werden, um ein allergenspezifisches Nichtansprechen zu induzieren. Obgleich mehrere Studien die klinische Wirksamkeit der allergenspezifischen Immuntherapie zeigten, versteht man die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig.
Der Hauptnachteil der allergenspezifischen Immuntherapie ist die Abhängigkeit von der Verwendung natürlicher Allergen-Extrakte, die schwierig, wenn nicht unmöglich, zu standardisieren sind, zumindest in grosstechnischem Massstab.
Solche natürlichen Allergen-Extrakte bestehen aus verschiedenen allergenen und nicht-allergenen Verbindungen, und auf Grund dieser Tatsache ist es möglich, dass bestimmte Allergene im verabreichten Extrakt nicht vorhanden sind oder - was noch schlimmer ist - dass Patienten im Laufe der Behandlung neue IgE-Spezifitäten gegen Komponenten ausbilden können. Ein weiterer Nachteil einer Therapie auf Extrakt-Basis ergibt sich daraus, dass die Verabreichung von biologisch aktiven Allergen-Präparaten anaphylaktische Nebenwirkungen induzieren kann.
Die Anwendung molekular-biologischer Techniken auf dem Gebeit der Allergen-Charakterisierung ermöglichte die Isolierung der cDNAs, die für alle relevanten Umwelt-Allergene codieren und
NACHGERElCh . ermöglichte die Herstellung rekombinanter Allergene.
Die Verwendung solcher rekombinanter Allergene ermöglichte es, das Reaktivitätsprofil des einzelnen Patienten entweder durch Verfahren der in vitro-Diagnose (d.h. Detektion allergenspezifischer IgEAntikörper im Serum) oder durch Testen in vivo zu bestimmen. Auf der Basis dieser Technologie erschien die Möglichkeit der Entwicklung neuer ImpfStrategien auf Komponenten-Basis gegen eine Allergie, insbesondere gegen die Typ I-Allergie, die an das Sensibilisierungs-Profil des Patienten zugeschnitten sind, erreichbar. Auf Grund der Ähnlichkeit der rekombinanten Allergene mit ihren natürlichen Gegenstücken weisen jedoch auch rekombinante Allergene eine signifikante allergene Aktivität auf.
Da die rekombinanten Allergene die allergene Aktivität der Wildtyp-Allergene sehr genau nachahmen, sind alle mit dieser allergenen Aktivität bei der Immuntherapie unter Anwendung natürlicher Allergene verbundenen Nachteile auch bei rekombinanten Allergenen vorhanden. Um die Immuntherapie zu verbessern, muss die allergene Aktivität der rekombinanten Allergene verringert werden, so dass die Dosis der verabreichten Allergene mit nur einem geringen Risiko anaphylaktischer Nebenwirkungen erhöht werden kann. Es wurde vorgeschlagen, ausschliesslich die Aktivität von allergenspezifischen T-Zellen durch das Verabreichen von Peptiden, die nur T-Zell-Epitope enthalten, zu beeinflussen. T-ZellEpitope stellen kleine Peptide dar, die sich aus dem proteolytischen Verdau von intakten Allergenen durch Antigen-repräsentirende Zellen ergeben.
Solche T-Zell-Epitope können als synthetische Peptide erzeugt werden. Bisher mit T-Zell-Epitopen durchgeführte Tests lieferten jedoch nur schlechte Ergebnisse und wiesen eine geringe Wirksamkeit auf. Es wurden mehrere Erklärungen für die geringe Wirksamkeit einer Immuntherapie auf Basis von T-Zell-Peptid in Erwägung gezogen: erstens kann es schwierig sein, die optimale Dosis zu verabreichen, um eine TZellen-Toleranz anstelle einer Aktivierung zu erzielen. Zweitens haben kleine T-Zell-Epitop-Peptide eine kurze Halbwertszeit im Körper. Drittens gibt es beträchtliche Beweise dafür, dass die IgE-Produktion in atopischen Individuen eine Gedächtnis-ImmunAntwort darstellt, die keinen de novo-Klassenwechsel ("class switching") erfordert und somit nicht durch von T-Zellen abstammende Cytokine gesteuert werden kann.
Therapie-Formen, die ausschliesslich auf der Verabreichung von T-Zell-Epitopen beruhen,
H i
N ACHGEREICl i i - 3 -
konnten daher die aktivität von allergenspezifischen T-Zellen modulieren, aber nur einen geringen Einfluss auf die Erzeugung von allergenspezifischen IgE-Antikörpern durch die bereitsgewechselten Gedächtnis-B-Zellen haben.
Es wurde "eiters vorgeschlagen, hypoallergeneAllergen-Derivate oder -Fragmente durch rekombinante DNA-Technologie oder
Zr ; l ;<P>l[deg.]<P>"<e>^<[beta]rZeUkÖ9nenn[beta]>-<nS>[deg.]^<1Ch>^<e D[beta]>ik<r>ö<iV>rp<a>e<t>r<e>i<0>n<d>d"uzi<F>e<>re^n, dieetmraitder IgE-Erkennung des nativen Allergens konkurrieren.
Es zeigte s<i>ch vor mehr als 20 Jahren, dass der proteolytische Verdau von Allergenen kleine Allergen-Fragmente ergab, die teilweise ihre Ig -Bmdungs-Kapazität beibehielten, jedoch keine Soforttyp-Reakt<i>onen<(>"immediate type reactions<>, hervorriefen. Während die Proteolyse von Allergenen schwer Steuer- und standardisierbar<i>st, eröffnete die Molekularbiologie neue Wege zur Herstellung
Ils nütz? T "<HaPt[beta]nen>-<S>[deg.]<l[theta]he>^-^denden aptene wurdl als n<ü>tzl<i>ch f<ü>r e<i>ne aktive Immunisierung mit verringerten Ris<i>ken anaphylaktischer Wirkungen und für die passive Therapie vorgeschlagen, um Effektor-Zeil-gebundenes IgE vor einem Allergen-Kontakt zu sattigen und somit eine Allergen-induzierte Me<di>ator-Freisetzung zu blockieren.
Ein "eiterer Vorschlag war, hypoallergene Allergen-Versionen m<i>ttels Gentechnik zu erzeugen, ausgehend von der Beobachtung,
dass Allergene in der Natur als isoformen, die sich lediglich in e<i>n<i>gen wenigen Aminosäureresten voneinander unterscheiden und/oder in Konformationen mit geringer IgE-Bindungs-Kapazität vor ommen können. Beispielsweise ergab die Oligomerisation des B<i>rkenpollen-Hauptallergens, Bet v 1, mittels Gentechnik ein rekomb<i>nantes Trimer mit stark reduzierter allergener Aktivität.
Alternat<i>v wurde<d>ie Einführung von Punkt-Mutationen vorgeschlagen, um entweder zu Konformations-Änderungen in derÄllergenStruktur zu führen und somit diskontinuierliche IgE-Epitope aufzubrechen oder die IgE-Blndungskapazitat direkt zu beeinflussen<(>Valenta et al., Biol. ehem. 380 (1999), 815-824).^Es zeigte sich auch, dass die Fragmentierung des Allerqens<i>n e<i>nige Teile<(>z.B. i" zwei Teile) zu einem beinahe vollständ<i>gen Verlust der IgE-Bindungskapazität und allergenen Aktivität des Allergens auf Grund eines Verlusts ihrer nativ-artigen Faltungen führt<(>Vrtala et al., J. clin. Invest. 99(1997)16731681<)>für Bet v 1, Twardosz et al. (BBRC 239(1997), 197-204)
NACHGEREICHT für Bet v 4, Hayek et al. (J. Immunol.161 (1998), 7031-7039) für Aln g 4, Zeiler et al. (J.Allergy Clin.
Immunol.100 (1997), 721727) für bovines Hautschuppen-Allergen, Elfman (Int .Arch.Allergy Immunol.117 (1998), 167-173) für Lep d2) , Westritschnig (J. Immunol.172 (2004), 5684-5692) für Phlp 7)). Die Fragmentierung von Proteinen, die hauptsächlich diskontinuierliche/konformationelle IgE-Epitope enthalten, führt zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungskapazität des Allergens. Auf Basis dieser Kenntnis wurde im Stand der Technik untersucht, ob solche hypoallergenen Allergen-Fragmente schützende Immunantworten in vivo induzieren können (Westritschnig et al., (Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003), 495-500).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren für eine verbesserte Allergie-Immunotherapie auf Basis der oben erwähnten Kenntnisse vorzusehen.
Solche Verfahren und Mittel sollten wirkungsvoll sein, mit einem geringen Risiko für einen anaphylaktischen Schock verbunden sein, leicht anwendbar und an die Bedürfnisse eines einzelnen Patienten anpassbar und leicht auf industrielle Massstäbe übertragbar sein.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Wildtyp-Protein-Allergens Phl pl (ein Haupt-Pollen-Allergen des Wiesen-Lieschgrases) mit im Vergleich zum Wildtyp-Allergen verringerter allergener Aktivität, welches die folgenden Schritte umfasst:
Vorsehen des Wildtyp-Protein-Allergens Phl pl, Spleissen des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente, wobei mindestens ein Fragment dieser mindestens drei Fragmente mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst und die mindestens drei Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität haben oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und
Wiederverbinden der mindestens drei Fragmente in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet.
Allergische Reaktionen werden ausgelöst, wenn Allergene vorgeformtes IgE, das an den Hochaffinitäts-Rezeptor Fc[epsilon]RI an Mastzellen gebunden ist, vernetzen. Mastzellen belegen die Körperoberflächen und dienen dazu, das Immunsystem auf eine lokale Infektion aufmerksam zu machen.
Sobald sie aktiviert sind, induzieren sie entzündliche Reaktionen durch Sezernieren chemischer Mediatoren, die in vorgeformten Granula gelagert sind, und
[NACHGEREIOHT durch Synthetisieren von Leukotrienen und Cytokinen, nachdem die Aktivierung stattgefunden hat. Daher ist wegen der verursachten Nebenwirkungen die Verabreichung von Wildtyp-Allergenen zur Verhinderung, Behandlung oder Sensibilisierung von Individuen, die eine Allergie haben oder bei welchen das Risiko einer Allergie besteht, nicht vorteilhaft. Ein Weg zur Vermeidung allergischer Reaktionen bei der Immuntherapie ist es, das Wildtyp-Allergen soweit zu modifizieren, dass diese modifizierten "Allergene" in verringerter Menge oder gar nicht mehr an IgE binden. Folglich können solche Moleküle keine starke allergische Reaktion hervorrufen.
Es sei jedoch bemerkt, dass Fragmente bestimmter Allergene möglicherweise nicht immunogen genug sind, um eine schützende Antikörper-Antwort zu induzieren (Westritschnig et al., (2004)).
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung von Allergen-Derivaten mit verringerter oder fehlender Fähigkeit, an IgE zu binden, wobei jedoch gleichzeitig jene Merkmale des Allergens konserviert werden, welche notwendig sind, um eine T-Zellen-vermittelte Immun-Antwort zu induzieren. Dies kann mit dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung erreicht werden, weil jene Strukturelemente, die für die Induktion einer T-Zellen-vermittelten Immunantwort verantwortlich sind, z.B. T-Zell-Epitope des Wildtyp-Allergens, im Allergen-Derivat gemäss der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen konserviert bleiben.
Eine Umordnung ("shuffling") (Spleissen und Wiederverbinden) der Fragmente des Allergens führt jedoch zu einer wesentlichen Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität oder sogar zum vollständigen Verlust dieser Bindungs-Kapazität. Natürlich sind, wenn im Laufe der Erzeugung der Allergen-Derivate nur ein paar Aminosäurereste verloren gehen (deletiert sind) oder hinzugefügt (insertiert sind) , oder wenn die Teile durch einen Linker anstatt durch eine direkte Vereinigung verbunden werden, die Vorteile gemäss der vorliegenden Erfindung noch immer vorhanden. Diese Verringerung oder Ausschaltung der allergenen Aktivität wird durch das bekannte und allgemeine Prinzip der Teilung des Allergens in definierte Fragmente erreicht.
Das Allergen-Derivat gemäss der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise rekombinant erzeugt.
Natürlich ist es auch möglich, die einzelnen Allergen-Fragmente chemisch zu synthetisieren und danach miteinander zu verbinden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er-
.
NACHGi[beta] findung wird die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, gemessen.
Die Verringerung der allergenen Aktivität wird vorzugsweise durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern der Allergensensibilisierten Seren des Patienten an einen Dot-Blot des Derivats oder durch einen Basophilen-Freisetzungs-Test gemessen.
Herkömmliche in vitro-Tests zur Beurteilung der allergenen Aktivität inkludieren RAST (Sampson and Albergo, J. Allergy Clin. Immunol. 74:26, 1984), ELISAs (Burks et al., N.
Engl. J. Med. 314:560, 1986), Immunoblotten (Burks et al., J. Allergy Clin. Immunol. 81:1135, 1988), Basophilen-Histamin-FreisetzungsTests (Nielsen, Dan. Med. Bull. 42:455, 1995 und du Buske, Allergy Proc. 14:243, 1993) und andere (Hoffmann et al., Allergy 54:446, 1999) .
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die mindestens drei Fragmente die Aminosäurereste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168,
die Aminosäurereste 169 bis 183 und/oder die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phl p 1.
Die beim Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendenden mindestens drei Fragmente können mindestens eines der oben identifizierten T-Zell-Epitope aufweisen (vgl. z.b. Schenk S., et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1995) 96:986-996).
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens drei Fragmente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A) , den Aminosäureresten 65 bis 125 (B) , den Aminosäureresten 126205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phl pl.
Die Fragmente der vorliegenden Erfindung werden ausgewählt, um IgE-bindende/B-Zell-Epitope und konservierende T-Zell-Epitope, die die Erzeugung einer angemessenen Immunantwort auf diese Epitope induzieren können, zu zerstören.
Die Zerstörung/Reduktion von im Wildtyp-Allergen Phl pl natürlicherweise vorhandenen B-Zell-Epitopen könnte es ermöglichen, dass ^<ogo>^rJY"<1>""<v>""<a"t>
NAGHGERIIGI - f Verabreichung an ein Individuum vor allem eine T-Zell-vermittelte Antwort anstatt einer allergische Reaktion hervorrufen (vollständiges Fehlen oder verringerte Bindung an IgE, das an Mediator-freisetzende Zellen gebunden ist) .
Die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat ist vorzugsweise B-D-A-C.
Natürlich ist es auch möglich, diese Fragmente auf eine alternative Weise zu reihen (D-B-A-C, B-A-D-C usw.), vorausgesetzt,
dass das erhaltene Allergen-Derivat im Vergleich zum Wildtyp-Allergen eine verringerte allergene Aktivität aufweist.
Die gemäss der vorliegenden Erfindung erhaltenen Derivate können mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten leicht vereinigt und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.
Vorzugsweise werden die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans vereinigt und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden die Derivate gemäss der vorliegenden Erfindung mit weiteren Allergenen zu einem Kombinations-Vakzin vereinigt. Solche Allergene sind vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
Solche Mischungen können spezifisch für die Bedürfnisse (Allergen-Profil) eines bestimmten Patienten hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein solches pharmazeutisches Präparat weiters einen Allergen-Extrakt.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist dieses weitere Allergen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von WiesenLieschgras-Pollen, insbesondere Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 und Phl p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fei d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phl p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe,
insbesondere Lep D 2.
Die pharmazeutischen und Vakzin-Präparate gemäss der vorliegenden Erfindung können neben einem Derivat von Phl p 1 andere Allergene oder Derivate und Fragmente davon, Allergen-Extrakte
NACHGEREIOHT
<EMI ID=7.1>
usw., umfassen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein mit einem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung erhältliches Allergen-Derivat.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Allergen-Derivat von Wildtyp-Protein-Allergen Phl p 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mindestens drei Fragmente des Wildtyp-Protein-Allergens aufweist, die miteinander in einer Reihenfolge fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet,
wobei die mindestens drei Wildtyp-Allergen-Fragmente eine verringerte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und wobei mindestens eines der mindestens drei Fragmente ein oder mehrere T-Zell-Epitope umfasst.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die mindestens drei allergenen Fragmente mindestens 6 Aminosäurereste, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, insbesondere mindestens 15 Aminosäurereste.
Die mindestens drei Fragmente umfassen vorzugsweise die Aminosäurreste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168,
die Aminosäurereste 169 bis 183 und die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phl p 1.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens drei Fragmente ausgewählt aus der Gruppe besehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A) , den Aminosäureresten 65 bis 125 (B) , den Aminosäureresten 126 bis 205 (C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phl
P i-
Die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat ist vorzugsweise B-D-A-C.
Die Allergen-Derivate der vorliegenden Erfindung können auch zum Nachweis und zur Diagnose einer Empfindlichkeit gegenüber Phl p 1 verwendet werden.
Beispielsweise kann dies in vitro erfolgen durch Vereinigen von Blut oder Blutprodukten, die von einem im Hinblick auf Empfindlichkeit zu beurteilenden Subjekt erhalten wurden, mit einem eine Phl p 1-Aktivität aufweisenden Peptid, unter Bedingungen, die für die Bindung von Komponenten laAGH<Q>Bgjgll im Blut (z.B. Antikörpern, T-Zellen, B-Zellen) mit den Derivaten geeignet sind, und bestimmen des Ausmasses, in welchem eine solche Bindung auftritt.
Andere Diagnosemethoden für allergische Erkrankungen, bei welchen die Derivate der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen den Radioallergosorbens-Test (RAST), den Papier-Radioimmunosorbens-Test (PRIST) , den EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISSA) , Radioimmuno-Assays (RIA) , immun-radiometrische Assays (IRMA), Lumineszenz-Immuno-Assays (LIA) , Histamin-Freisetzungs-Assays und IgE-Immunoblots.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat gemäss der vorliegenden Erfindung (siehe oben) und weitere Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung aus Wildtyp-Allergenen, rekombinanten Wildtyp-Allergenen, Derivaten von Wildtyp-Protein-Allergenen,
oder Mischungen davon.
Diese Zusammensetzung enthält vorzugsweise weiters einen Allergen-Extrakt .
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Allergen-Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung weiters ein oder mehrere Allergene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen, insbesondere Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 und Phl p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fei d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phl p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe,
insbesondere Lep D 2.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur aktiven Immunisierung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammen-
NACHGÄBE:
. * Setzung gemäss der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Immunisierung.
Dieses Medikament enthält vorzugsweise weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Medikament 10 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 0,5 [mu]g bis 200 [mu]g des rekombinanten Allergen-Derivats. Bevorzugte Verabreichungswege inkludieren alle Standard-Verabreichungs-Schemas, die für die Impfung im Allgemeinen und für die Allergie-Immuntherapie im Besonderen beschrieben und vorgeschlagen wurden (oral, transdermal, intravenös, intranasal, über die Schleimhaut usw.).
Die vorliegende Erfindung inkludiert ein Verfahren zur Behandlung und Verhinderung einer Allergie durch Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Präparate gemäss der vorliegenden Erfindung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats gemäss der vorliegenden Erfindung, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäss der vorliegenden Erfindung codiert,
Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise Escherichia coli.
Vorzugsweise ist der Wirt ein Wirt mit einer hohen Expressions-Kapazität. Wie hierin verwendet ist "ein Wirt mit einer höhnen Expressions-Kapazität" ein Wirt, der ein Protein, an dem ein Interesse besteht, in einer Menge von mindestens 1 mg/1 Kultur, vorzugsweise mindestens 5 mg/1, mehr bevorzugt mindestens 10 mg/1, am meisten bevorzugt mindestens 20 mg/1 exprimiert.
Natürlich hängt die Expressions-Kapazität auch vom ausgewählten Wirt und Expressionsystem (z.B. Vektor) ab. Bevorzugte Wirte gemäss der vorliegenden Erfindung sind E. coli, Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Pflanzenzellen (z.B. aus Tabak stammend) usw..
Natürlich können die Allergen-Derivate gemäss der vorliegen-
NACHQI üQh den Erfindung auch mit irgendeinem anderen geeigneten Verfahren, insbesondere chemischer Synthese oder halbchemischer Synthese, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung ist weiters durch die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein.
Fig. 1A zeigt die Konstruktion eines hypoallergenen Phl plDerivats gemäss der vorliegenden Erfindung.
Fig.
IB zeigt die Aminosäure-Sequenz des phl ph.-Mosaik-Proteins gemäss der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NO: 2) .
Fig. 2A zeigt eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE von Plm, welches auf >90% Reinheit gereinigt worden ist.
Fig. 2B zeigt eine massenspektroskopische Analyse von Plm. Die Laser-Desorptions-Massenspektren wurden auf lineare Weise mit einem TOF compact MALDI II-Instrument (Kratos, UK) (piCHEM, Österreich) erhalten.
Fig. 2C zeigt eine Cirkulardichroismus (CD) -Analyse von Plm. Weite UV-CD-Spektren wurden auf einem Jasco J-810-Spektropolarimeter (Jasco, Easton, MD) bei Raumtemperatur bei Protein-Endkonzentrationen von 46 [mu]M für Plm und 12 [mu]M für rekombinantes Phl p 1 in 0,001 cm bzw. 0,05 cm Bahn-Längen-Quarz-Kuvetten aufgenommen. Drei unabhängige Messungen wurden aufgezeichnet und für jeden Spektral-Punkt gemittelt.
Die endgültigen Spektren wurden durch Subtrahieren der unter identischen Bedingungen erhaltenen korrespondierenden Puffer-Spektren Basislinien-korrigiert . Die Ergebnisse wurden als mittlere Rest-Elliptizität [[theta]] bei einer gegebenen Wellenlänge ausgedrückt.
Fig. 3 zeigt die IgE-Bindung an Membran-gebundene rekombinante Allergene rPhl p 1, Plm und HSA. Seren von 49 gegen Graspollen allergischen Patienten und ein Serum von einem nichtatopischen Spender (n = 50) wurden mit den Membran-gebundenen rekombinanten Allergenen rPhl p 1, Plm und HSA inkubiert.
Gebundenes IgE wurde mit mit<125>I-markierten anti-Human-IgE-Antikörpern detektiert.
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der CD203c-Expression, wenn eine Probe von fünf gegen Phl p 1 allergischen Individuen rPhl p 1 und Plm ausgesetzt wird.
Fig. 5 zeigt die Induktion einer IgGl-Antwort bei einer rPhl pl und Plm ausgesetzten Maus.
BEISPIELE: Charakterisierung eines hypoallergenen Phl p 1-
NACHGEREICHT
[Omega]
- 12 -
Mosaik (Plm) -Proteins
Beispiel 1 : Konstruktion eines hypoallergenen Phl p 1-Mosaik(Pl ) -Proteins
Für die Konstruktion eines rekombinanten hypoallergenen Phl pl-Mosaiks wurden für vier Phl p 1-Fragmente codierende cDNAs m lifiziert. Die Fragmente A (AS 1-64), B (AS 65-125<)>, C<(>AS 126-205)und D (AS 206-240) sind in Fig. 1A gezeigt. Die beschriebenen cDNA-Fragmente wurden durch "gene SOEing" in der Reihenfolge B-D-A-C zusammengefügt (Horton et al., 1999<)>.
In den ersten PCR-Reaktionen wurden cDNAs für die Fragmente A<(>Primer AF: 5'ATC CCCAAG GTT CCC 3' und AR: 5'CAG CTC GCC GGC GCT CTTGAAGAT GGG 3'), B (Primer BF: 5'C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3' und BR: 5'GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3<' )>, C(Primer CF: 5'AGCGCC GGC GAG CTG 3' und CR: 5<'>C GGG ATC CTA ATG ATG ATGATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3<' )>, und D(Primer DF: 5'ACGGGC CCC TTC ACC 3' und DR: 5<'>GGG AA<C C>TT GG<G>GATCTTGGA CTC GTA3') erhalten. In der folgenden erstenSOEing-Reaktion wurden die Gel-gereinigten PCR-Produkte als Matrizen verwendet, um cDNAs zu erhalten, die für die Fragmente BD(unter Verwendung der Primer BF und DR) und AC (unter Verwendung der Primer AF undCR) codieren.
In der nachfolgenden zweiten SOEing-Reaktion wurden die Gel-gereinigten Fragmente BD und AC als Matrizen verwendet, um das PCR-Produkt zu erhalten, das für BDAC codiert, wobei die Primer BF und CR (schematisch in Fig. 1A dargestellt) verwendet wurden.
Das resultierende cDNA-Konstrukt, das für BDAC codiert, wurde in die Ndel/BamHI-Restriktionsstelle von Plas id pET17b<(>Novagen, Madison, WI) insertiert. Am C-Terminus des BDA<C>Konstrukts folgen auf zwei Glycine ein Hexahistidin-Tag, was die Reinigung des Mosaik-Proteins mittels Ni<2+>-Affinitäts-Chromatographie ermöglicht (Fig. IB) .
Die korrekte Sequenz der cDNA, die für das phl p 1-Mosaik (Plm) codiert, wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Das resultierende Molekül behält die gesamte primäre Sequenz(Laffer et al., 1994) und T-Zell-Epitope (Schenk et al., 1995<)>bei.
Beispiel 2 : Biochemische Charakterisierung von Plm
Expression und Reinigung von Plm
Das Plm-Konstrukt wurde in E.coli BL21 (DE3) (Stratagene, Australien)transformiert und in LB-Medium, ergänzt mit 100 mg/1
NACHGEREICHT Ampicillin, exprimiert. Transformierte Zellen wurden bei 37 [deg.]C zu einer OD600=0,9 gezüchtet, und die Expression des rekombinanten Plm wurde durch Zugabe von ImM Isopropyl-ss-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Inkubation wurde 4 h unter denselben Bedingungen fortgesetzt, und danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet.
Rekombinantes Plm wurde aus der unlöslichen Pellet-Fraktion unter Verwendung denaturierender Bedingungen gereinigt. Die Zellen wurden durch 60-minütiges Rühren in 8 M Harnstoff, 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 8,0, lysiert. Nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 14.000 x g wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Säule geladen. Rekombinates Plm eluierte in 8 M Harnstoff, 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 4,5, und wurde durch schrittweise Dialyse für mindestens 4 h renaturiert, jeder Schritt gegen 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 6, 4, 3, 2, 1 und 0,5 M Harnstoff. Das Protein wurde schliesslich gegen 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0, dialysiert und unter Verwendung eines Amicon-Centricon YM. -3-Konzentrators konzentriert.
Die Proteinreinheit wurde mittels SDS-PAGE bestätigt. Die Protein-Konzentration der gereinigten Probe wurde durch UV-Absorption bei 280 nm bewertet.
Der molare Extinktions-Koeffizient des Proteins wurde aus dem Tyrosin- und Tryptophan-Gehalt berechnet (Gill et al., 1989).
Plm zeigt ein Migrations-Muster, das rekombinantem Phl p 1 vergleichbar ist (siehe Fig. 2A) , was mit dem gemäss der hergeleiteten Aminosäure-Sequenz des Proteins berechneten Molekulargewicht übereinstimmt.
Die Molekülmasse von Plm wurde mittels Massenspektrometrie als 27 082 Dalton bestimmt, was mit dem vorausgesagten Molekulargewicht des Proteins übereinstimmt (siehe. Fig. 2B) .
Das gereinigte Plm wurde mittels Circulardichroismus-Analyse analysiert und mit rekombinantem Phl p 1 verglichen, um deren Sekundär-Strukturgehalt zu bestimmen (siehe Fig. 2C) . Unerwarteterweise ist Plm ein gefaltetes Molekül mit einem Minimum bei 207 und 215 nm und einem Maximum bei 195 nm, was eine beträchtliche Menge an ss-Sekundär-Struktur nahelegt.
Plm, das ein künstliches Allergen-Protein darstellt, weist ein CD-Spektrum auf, das sich von der gefalteten Version von rekombinantem phl p 1-, in mit Baculovirus infizierten Insekten-Zellen exprimiert, unterscheidet (Ball et al.). Im Vergleich dazu zeigte in E.coli exprimiertes rekombinantes Phl p 1 das Spektrum eines ungefalte-
NACHGEREICHT . *
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[Phi] CQ -H ü [phi] 4-> [phi] d [Phi]<>H [Phi] o rH [phi] cu o P 4-> H Di [Phi] 3 O [Phi] [phi]
<EMI ID=14.1>
P * [epsilon] co P O Di <1 a N d > a S P - rö X) H P Cu a a S
IgE-Bindung (cpm) % Reduktion der
Patient [Gamma]PI Plm IgE-Bindung (cpm)
1 855 31 96,4
2 604 209 65,4
4 252 45 82,1
5 724 47 93,5
6 1508 171 88,7
7 1133 303 73,3
8 247 37 85
9 1448 356 75,4
10 1676 213 87,3
11 17971 847 95,3
12 342 90 73,7
13 1539 77 95
14 413 58 86
15 105 28 73,3
16 252 19 92,5
17 300 27 91
18 987 70 92,9
19 623 34 94,5
20 687 47 93,
2
21 50 8 84
22 694 42 93,9
23 1825 173 90,5
24 9681 386 96
25 1696 299 82,4
26 3230 295 90,9
27 183 25 86,3
28 763 89 88,3
29 179 40 77,7
30 0 0
<EMI ID=15.1>
Mittelwert 86,5 %
Beispiel 4 : plm zeigt verringerte allergene Aktivität Basophilen-Aktivierung, gemessen mittels CD203c-Expression Peripheres Blut wurde von 5 allergischen Spendern nach Einverständniserklärung erhalten. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Blut-Aliquots (100 [mu]l) wurden mit seriellen Verdünnungen von Plm und rphl p 1 (10<¯3>bis 10 [mu]g/ml) , anti-IgEAntikörper (1 [mu]g/ml) (Immunotech, Marseille, Frankreich) oder Puffer (mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, "phosphate-buffered saline" = PBS) 15 Minuten lang bei 37 [deg.]C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in PBS, enthaltend 20 mM EDTA, gewaschen.
Die Zellen wurden dann mit 10 [mu]l PE-konjugiertem ACHGERE!QHT " *, - 16 -
CD203c mAb 97A6 (Immunotech, Marseille, Frankreich) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden die Proben einer Erythrozyten-Lyse mit 2 ml FACS(TM) Lysing solution (Becton Dickinson, San Jose, CA) unterzogen. Die Zellen wurden gewaschen, in PBS resuspendiert und mittels Zweifarben-DurchflussCytometrie auf einem FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung von Paint-a-Gate Software analysiert.
Allergen-induzierte Hinauf-Regulierung von CD203c wurde aus den mittleren FluoreszenzIntensitäten (MFIs), die mit stimulierten (MFIstim) und unstimulierten (MFIcontro[iota]) Zellen erhalten worden waren, berechnet und als Stimulations-Index (MFIst[chi]m: MFIcontroi ) ausgedrückt.
Die allergene Aktivität von Plm wurde durch Messung der CD203c-Expression auf Blut-Basophilen von fünf gegen Phl p 1 allergischen Patienten analysiert. Wie in Fig. 4 dargestellt ist die CD203c-Expression nach Inkubation mit rPhl p 1 bei einer Protein-Konzentration von 1 [mu]g/ml signifikant (p<0,05) hinauf reguliert, wogegen mit Plm keine Expression von CD203c induziert wird.
Nur wenn die Konzentration von Plm auf 10 [mu]g/ml erhöht wird, ist die Expression von CD203c hinauf reguliert, somit zeigt Phl p 1 eine zehnfache allergene Aktivität im Vergleich zu Plm.
Beispiel 5 : IgG-Antikörper, induziert durch Immunisierung mit Plm inhibieren bei Patienten die IgE-Bindung an rPhl p 1
Immunisierung von Kaninchen
Kaninchen wurden zuerst mit 200 [mu]g Plm und rPhl p 1 unter Verwendung von CFA, und 100 [mu]g der Immunogene für die folgenden Booster-Injektionen unter Verwendung von IFA (erste Booster-Injektion nach 4 Wochen, eine zweite Booster-Injektion mit unvollständigem Adjuvans wurde nach 7 Wochen gegeben) immunisiert (Charles River Breeding Laboratories, Kisslegg, Deutschland) .
Den Kaninchen wurde 8 Wochen nach der ersten Immunisierung das Blut entnommen ("bled") .
Inhibierung der Bindung von IgE allergischer Patienten an rPhl p 1 durch Plm-induziertes IgG
Die Fähigkeit von Plm- und rPhl p 1-induziertem KaninchenIgG, die Bindung von IgE allergischer Patienten an rPhl pl zu inhibieren, wurde mit einem ELISA-Kompetitions-Test getestet (Focke et al., 2001). ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Dänemark) wurden mit 1 [mu]g/ml rPhl p 1 beschichtet und mit 1/100 Verdünnungen der rPhl p 1- und Plm-Antiseren und - für Kontrollzwecke -
NACHGEREICHT _17 ....
der entsprechenden Präimmun-Seren vorinkubiert . Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1/10 verdünnten Seren von 43 mit Phl p 1sensibilisierten, gegen Graspollen allergischen Patienten inkubiert.
Gebundene IgE-Antikörper wurden mit HRP-gekuppelten Ziegen-anti-Human-IgE-Antikörpern (KPL, Gaithersburg, MD) , 1/2500 verdünnt, detektiert. Der Prozentsatz der Inhibierung der IgEBindung, die durch Vorinkubation mit den anti-Phl p 1- und antiPlm-antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: Prozentsatz der Inhibierung der IgE-Bindung = 100 - OD[iota]/ODp x 100. OD[Iota]und ODPstellen die Extinktionen nach Vorinkubation mit den Kaninchen-Immunseren bzw. den entsprechenden Vorimmun-Seren dar.
Die Fähigkeit von Plm, die IgE-Bindung von Patienten an rPhl p 1 zu inhibieren, ist als Prozent Reduktion in Tabelle 2 gezeigt.
Die stärkste Inhibierung der Patienten-IgE-Bindung an rPhl p 1 im Bereich von 0 bis 89% (52% mittlere Reduktion) wurde mit anti-Plm Antikörpern erreicht, wogegen die Inhibierung mit anti-Phl p 1-Antikörpern im Bereich von 4 bis 75% (43% Mittelwert) lag.
Tabelle 2. Gegen rPhl p 1 und Plm gezogene Kaninchen-Antiseren inhibieren die Bindung des IgE von gegen Graspollen allergischen Patienten an rPhl p 1. ELISA-Platten-gebundenes rPhl p 1 und Plm wurde mit Kaninchen-anti-rPhl pl- und anti-Plm-Antiseren vorinkubiert.
Die von 43 gegen Graspollen allergischen Patienten erhaltenen Prozent der Reduktion der IgE-Bindung sind gezeigt.
<EMI ID=17.1>
- 18 -
..
..
% Reduktion der IgE-Bindung an rPhl p 1 durch Plm-induziertes Kaninchen-IgG
OD Werte:
Patient r[alpha]Pl r[alpha]Plm
1 37 50
2 44 61
3 32 49
4 50 70
5 4 34
6 44 52
7 55 75
8 27 38
9 51 55
10 28 0
11 32 13
12 36 24
13 40 36
14 20 14
15 23 51
16 39 60
17 41 56
18 25 41
19 42 55
20 43 58
22 62 56
23 55 68
24 46 50
26 35 32
27 31 24
28 70 77
29 28 38
30 58 65
31 43 57
32 52 56
33 56 66
34 59 66
36 69 80
37 49 70
38 72 81
39 37 61
40 68 78
41 23 37
42 75 89
43 49 68
44 72 81
45 72 85
47 9 23
<EMI ID=18.1>
Mittelwert 43 52
Beispiel 6:
Immunogenität von Plm
Um zu untersuchen, ob das Phl p 1-Mosaik-Protein eine Aller-
Es
NACHGEREICHT gen-spezifische IgG-Antwort in vivo induziert, wurden 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Breeding Laboratories) subkutan immunisiert. Gruppen von 5 Mäusen wurden mit 5 [mu]g Plm, rPhl p 1 und - zu Kontrollzwecken - mit PBS alleine, adsorbiert an AI (OH)3(Alu-Gel-S, Serva, Deutschland) immunisiert (Vrtala et al., 1998). Die Mäuse wurden drei Mal immunisiert (Tag 1, 28 und 56) und aus den Schwanzvenen wurden in 4-Wochen-Intervallen Blut entnommen, und die Seren wurden bei -20 [deg.]C bis zur Analyse gelagert.
Die IgGl-Antworten auf rPhl p 1 wurden mittels ELISA gemessen (Vrtala et al., 1998). Die ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Dänemark) wurden mit 5 [mu]g von Plm beschichtet und mit 1:1000 verdünnten Maus-Seren inkubiert.
Gebundene IgGl-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten monoklonalen Ratten-anti-MausIgGl (Pharmingen, CA) und einem 1:200 verdünnten, HRP markierten Schaf-anti-Ratten-Antiserum (A sersham, UK) detektiert.
Wie in Fig. 5 gezeigt ist, ist die Plm-induzierte IgGl-Antwort auf rPhl p 1 beinahe so gross wie jene, die durch Immunisierung mit rPhl p 1 induziert ist.
Fig. 5. Immunogenität von Plm. Mittlere Igd-Antwort von 5 Mäusen, i muisiert mit PBS, rPhl pl oder Plm oder (x-Achse) als OD-Werte (y-Achse) gezeigt, 4, 8 oder 12 Wochen nach Immunisierung.
NACHGEREICHT Literaturstellen :
Ball, T., et al. (2005) FEBS J. 272:217-227.
Ball, T., et al. (1999) FASEB J. 13:1277.
Focke, M., et al. (2001) FASEB J. 15:2042
Gill, S. C, and P. H. Hippel. (1989) Anal. Biochem. 182: 319
Hauswirth, AW., et al. (2002) J Allergy Clin Immunol 110:102.
Horton, R. M. (1999) Mol.
Biotechnol. 2:93.
Laffer, S., et al. (1994) J. Allergy Clin. Immunol. 94:689.
Niederberger, V., et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol.
101:258.
Schenk, S., et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. 96:986.
Vrtala, S., et al. (1998) J. Immunol. 160: 6137.
NACHGEREICHT
Claims (31)
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Wildtyp-Protein-Allergens Phl p 1 mit im Vergleich zum Wildtyp-Allergen verringerter allergener Aktivität, welches die folgenden Schritte umfasst:
Vorsehen des Wildtyp-Protein-Allergens Phl pl, Fragmentieren des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente, wobei mindestens ein Fragment dieser mindestens drei Fragmente mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst und die mindestens drei Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität haben oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und
Wiederverbinden der mindestens drei Fragmente in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet.
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Wildtyp-Protein-Allergens Phl p 1 mit im Vergleich zum Wildtyp-Allergen verringerter allergener Aktivität, welches die folgenden Schritte umfasst:
Vorsehen des Wildtyp-Protein-Allergens Phl pl, Spleissen des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente, wobei mindestens ein Fragment dieser mindestens drei Fragmente mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst und die mindestens drei Fragmente eine reduzierte allergene Aktivität haben oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und
Wiederverbinden der mindestens drei Fragmente in einer Reihenfolge, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch eine Verringerung der IgE-Bindungs-Kapazität von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, mehr bevorzugt mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, im Vergleich zum Wildtyp-Allergen, gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern der Allergen-sensibilisierten Seren des Patienten an einen Dot-Blot des Derivats oder durch einen Basophilen-Freisetzungs-Test gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der allergenen Aktivität durch das Fehlen der Bindung von IgE-Antikörpern der Allergen-sensibilisierten Seren des Patienten an einen Dot-Blot des Derivats oder durch einen Basophilen-Freisetzungs-Test gemessen wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Fragmentieren des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente T-Zell-Epitope des Allergens bestimmt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Spleissen des Wildtyp-Protein-Allergens in mindestens drei Fragmente T-Zell-Epitope des Allergens bestimmt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente die Aminosäurereste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurer-
NACHGEREICHT
R 47507 - 22 - A 755/2006 este 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183 oder die Aminosäurereste 226 bis 240 von Phl p 1 umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente die Aminosäurereste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135, die Aminosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168, die Aminosäurereste 169 bis 183 oder die
<EMI ID=21.1>
\
- 22 -
..
..<Amln[theta]SäUrereSte 226 bis>* von P"[chi]p,umfassen,
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 bis 64 (A) , den Aminosäureresten 65 bis 125 (B) , den Aminosäureresten 126-205
(C) und den Aminosäureresten 206 bis 240 (D) von Phl p 1.
6. Verwendung eines Allergen-
Deriv - er vat sammensetzung nach einem der ArZ T^ ^ ^^<Ä1>^rgen-Zueiine.s MMeeddiikkaammeennttss zzuurr aakkttive T"? ?."<b>" Herstellung a[kappa]<t>
Derivats oder einer Allergen-Zu-
NACHGEREICHT
sammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Immunisierung.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bisH H
Rennet, dass die mindestens drei Prallte<9[beta]kenn>-<>¯ ¯ -<,">.":"<(TM)>;tz ;r;:[pi];rPr<[infinity]><><7>- Verfahren nach Anspruch fiH^<R>- - -¯ :n: ¯ :; rs<ass die>
E -xp ihp[iota]i:ernten:v:er ^einig1t1m:1d^zu"<e>(TM)<in[beta]m>P<h><xm [omega]a>--<7>-s -ch akzep -tablen fertig gestelit werden. P<h>-utischen Präparat
.<V>erfahren nach zeichnet, dassdi e Derivate mit einem einem der Ansprüche 1 bi s 7,<d>adurch gekennm vereinigt und2Ueinem pharmazeut[Iota]sh<9>*<[beta]lgneten>^in-Adjuvans rat fertig gestellt werden akzeptablen akzin-Präpa-
K -omebineaitivo;ns-<r>V^aktz<n>^in ^dZ-^+-<9>- ^ " " -"-^- (TM) - ,daSs
M -ischuenig von:W[iota]ildtyp-A .rller^.n^r<er>^<en l>-<st>' insb -esondte,redaeSiSne Derivate von Wildt p-P I ^^<Wildt>^^l rgene, yp Prote<i>n Allergenen oder Mischungen davon.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat B-D-A-C ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem pharmazeutisch akzeptablen Expzipienten vereinigt und zu einem pharmazeutischen Präparat fertig gestellt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit einem geeigneten Vakzin-Adjuvans vereinigt und zu einem pharmazeutisch akzeptablen Vakzin-Präparat fertig gestellt werden.
10 mg, insbesondere 0,5 [mu]g bis 200 [mu]g des rekombinanten Allergen-Derivats umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mit mindestens einem weiteren Allergen zu einem Kombinations-Vakzin vereinigt werden.
10 mg, insbesondere 0,5 [mu]g bis 200 [mu]g des rekombinantenAllergen-Derivats umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Allergen ein Wildtyp-Allergen ist, insbesondere eine Mischung von Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergene, Derivate von Wildtyp-Protein-Allergenen oder Mischungen davon.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9bi, [pi] , kennzeichnet, dass das Präparatwe'<dadUrCh ge¯>enthält.<P>"<at W[theta]lters e[iota]ne>* Allergen-Extrakt
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von WiesenLieschgras-Pollen, insbesondere Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 und
NACHGEREICHT
R 47507 . u .. a > .... .. .......a
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis1. kennzeichnet, dass das weitere Aller[alpha]en ' ^^<g[beta]¯>
Gruppe bestehend aus den Haupta^<aUSgewählt>i-t aus der besondere Bet v 1undBet v4H "' ^ ^^ ^ insLieschgras-Pollen, insbesondere Phl ^ ^ ^ ^ WiesenPhl p 7, den Hauntali '<Phl P 5>'<Phl>P<6>und
Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere
NACHGEREICHT
Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fei d 1 den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe,' Profilmen, insbesondere Phl p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2.
14. Allergen-Derivat, erhältlich nem der Ansprüche 1 bis 7. mit einem Verfahren nach eirtÜrt ^<11>"<g[Theta]n>-<Derivat des>iWtyp-Protein-Allergens Phl p ! dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mindestens drei a mente des Wildtvo-Pro-i-^-in an<t>rageiner Reihenfo,<UeI>'<eM enthält>'<dle>miteinander in e<i>ner Re<i>henfolge fus<i>oniert sind, die sich von der Reihenfol[sigma]e der Fragmente im<W>ildtyp-Allergen unterscheidet, "obe dte 1 [pound] Z, i<ild>^- - nt. eine verringern In fehlt und t " [deg.]<der ihnen d+-[beta] all[beta]r9ene>Aktivität fehlt und "ober m<i>ndestens eines der mindestens drei Fragmente em oder mehrere T-Zell-Epitope umfasst. Fragmente
da s die<1>m1"T<iV>:<t naCh AnSPrUCh 15>'<dadUrCh>kennzeichnet, aurerelte Allergen-Fragmente mindestens 6 Aminosaurereste, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste insbe sondere mindestens 15 Aminosäurereste umfassen.
14. Allergen-Derivat, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
15. Allergen-Derivat des Wildtyp-Protein-Allergens Phl p 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mindestens drei Fragmente des Wildtyp-Protein-Allergens enthält, die miteinander in e<i>ner Reihenfolge fusioniert sind, die sich von der Reihenfolge der Fragmente im Wildtyp-Allergen unterscheidet, wobei die mindestens drei Wildtyp-Allergen-Fragmente eine verringerte allergene Aktivität aufweisen oder ihnen die allergene Aktivität fehlt, und wobei mindestens eines der mindestens drei Fragmente e<i>n oder mehrere T-Zell-Epitope umfasst.
16. Allergen-Derivat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass<di>e mindestens drei Allergen-Fragmente mindestens 6 Aminosaurereste, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, insbesondere mindestens 15 Aminosäurereste umfassen.
17. Allergen-Derivat nach einem Anspruch 15 oder 16, dadurch [iota]s:aurre[iota]st:e<c>22r5 b<i>.s<d>3r9,<d>d<i>i<e>e<m>A<i>m<n>i<d>n<e>o<s>s<t>ä<e>u<n>r<s>e<d>re<re>st<i>e -3-4 bis 45 *, die -Aminosaurereste 1 bis64, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosaurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 11 i Li nosaurereste !09 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135dAminosäurereste 65 bis 12S Hi. - '<dle>
. .<125>'<dle>Am<i>nosäurereste 126 bis 205di
Am<i>nosäurereste 127 bis 13 H<" .. '<e>
.. " . "'<Dls 1J8>' d<i>e Aminosäurereste 157 bis16Sd<i>e Am<i>nosäurereste 169 bis 183, die Aminosäurereste 2b'240oder d<i>e Aminosäurereste 226 bis 240 von Phl p ! umfassen
17. Allergen-Derivat nach einem Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente die Aminosäurreste 25 bis 39, die Aminosäurereste 34 bis 45, die Aminosaurereste 1 bis 64, die Aminosäurereste 73 bis 84, die Aminosäurereste 91 bis 102, die Aminosäurereste 100 bis 111, die Aminosäurereste 109 bis 133, die Aminosäurereste 121 bis 135 die Aminosäurereste 65 bis 125, die Aminosäurereste 126 bis 205 die Am<i>nosäurereste 127 bis 138, die Aminosäurereste 157 bis 168 d<i>e Aminosäurereste 169 bis 183, die Aminosäurereste 206 bis' 240 o<d>er d<i>e Aminosäurereste 226 bis 240 von Phl p 1 umfassen.
18. Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 15 bis 17 dawähl l<ek nZeiChnSt>'<daSS dle mi>"<d>- drei Fragment ausgev 1 s nd aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten re t n 2 S2^ ^ " ^ "<5 <B>> '<d>Aminosäureresten 126-205 ,C<)>und den Aminosäureresten 206 bis 240(D)von
NACHGEREICHT
R 47507 - 24 -
A 755/2006
Phl p 1,
18. Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 15 bis 17 dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Fragmente ausgew<ä>hlt s<i>nd aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäureresten 1 b<i>s 64<(>A<)>, den Aminosäureresten 65 bis 125 (B) , den Aminosäureresten 126-205<(>C<)>und den Aminosäureresten 206 bis 240(D)von Phl p 1.
NACHGEREICHT
19. Allergen-Derivat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, ddaasss die Reihenfolge der Fragmente im Allergen-Derivat B-D-A-C ist
20. Allergen-Zusammensetzung, umfassend ein Allergen-Derivat nach einem der Ansprüche 14 bis 19, und weiters Allergene, vorzugsweise Wildtyp-Allergene, insbesondere eine Mischung aus Wildtyp-Allergenen, rekombinante Wildtyp-Allergene, Derivate von W<i>ldtyp-Protein-Allergenen, oder Mischungen davon.
21. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters einen Allergen-Extrakt enthält.
- 21 -
.. .. . ....
Patentansprüche:
22. Allergen-Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten enthält.
22, dadurch gekennzeichnet d ss [Iota]e z"" ^ **""***<2>[deg.]<Ws>nes oder mehrere Allere Zusammensetzung weiters ei-
- * H ptailer T r i¯ [iota][iota]r "^ -und Bet v 4, den Hauptallercenen^besondere Bet v 1 insbesondere Phl p ^ ^"T " T "<l[beta]8[beta]n>-<L1>"*<[beta]>-Poll[beta]fHauptallergenen der Hausstaubmilbe * t "<6>^<PW P 7>'<de>P 2- dem Hauptallergen der Ka" ^ "7 " ^<P>* ^ [deg.]" der Biene, den Hauptaller[alpha]enn H*'<den>Hauptallergenen
* Phl P 12, und [Lambda]l g:: rd<er>v<WeSp[beta]>' ^"^ insbesonD 2, umfasst. " "*"<der Vor>tsmilbe, insbesondere Lep
22-<A1>lergen-Zusammensetzun[sigma] naagekennzeichnet, dass sie einen ^ ^ [deg.]<d[beta]r 21>'<dad>-ch<i>en<e e>men pharmazeutisch a akzeptablen Exzi-
23. Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiters eines oder mehrere Allergene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Hauptallergenen von Birkenpollen, insbesondere Bet v 1 und Bet v 4, den Hauptallergenen von Wiesen-Lieschgras-Pollen insbesondere Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 und Phl p 7, den Hauptallergenen der Hausstaubmilbe, insbesondere Der p 1 und Der P 2, dem Hauptallergen der Katze Fei d 1, den Hauptallergenen der Biene, den Hauptallergenen der Wespe, Profilinen, insbesondere Phl p 12, und Allergenen der Vorratsmilbe, insbesondere Lep D 2, umfasst.
- 23 -
Der p ^dV^<1l[beta]rg[beta]n[beta]n>""<HaUSStaubmi1>^ insbesondere Der p 1 und Der p 2, dem Hauptallergen der Katze Fei d 1 den Hauptallergenen der Biene denHa^[pi]linon. i<[Theta]>'<den Ha>uptallergenen der Wespe, Profi<li>nen, insbesond<u>e<[beta]>r<i>e<[beta]>P<t>-hnl<i>pD1<i>^?, undHAalnlergenen der Vorratsmilbeinsbesondere Lep D 2 "sm<iiss>e,
A 755/2006
23.<A1>lergen-Zusammensetzun[sigma]3fh
24.<V>erwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Allergen-spezifischen Immuntherapie-Medikaments.
24. Verwendung eines Allergen-Derivat, "Hsammensetzung nach einemder A<atS>[deg.]<der [beta]lner>AUergen-Zue [pi]es Allergen-sp zir s g peez<i>fi<i>sccnh n un en [tau] Immunthera<[beta]>i "e ^ " ^<HerSts11><><!>rap[iota]e--MMedi >_-,",,...<!>rraapp[iota]ee--MMeeddii >k_am-,e"n,,t.s... ung
- 24 -9- Allergen-Derivat nach Anspruch 18ri,H
- <Reihenfolge der .agmente ^^ ^ ^
- zugshwe ei:se Wil[iota]drty:P-:A¯ller[alpha]-e<e>n[iota]erb i'<ss>[tau]<Wei stien>^ - Allerg -ene, vor-
W^dtyp-Protein-Aller nen,oderMi."^ ^ ' ^^ (TM)
t -rakcthenrthäl[iota]t:r[iota]r::::<S>etzzung we<ai>(TM)ters ein *e>n.A ^ller[alpha]en- "[iota]v^-.
P<i>enten enthält,
25.<V>erwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments zur aktiven Immunisierung.
NACHGEREICHT
R 47507 - 25 - A 755/2006
25
Verwendung eines Allergen-Derivat eiine.s MMeeddiikkaammeennttss zzuurr aakkttive T .a[kappa]<t>[iota]ven Immunisierung.
26. Verwendung eines Allergen-Derivats oder einer Allergen-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Immunisierung.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiters Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel oder Mischungen davon enthält.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass es 10 ng bis 1 g, vorzugweise 100 ng bis
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass es 10 ng bis 1 g, vorzugweise 100 ng bis
29. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäss einem der Ansprüche 15 bis 18 codiert,
Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und Exprimieren des Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
29. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Vorsehen eines DNA-Moleküls, das für ein Allergen-Derivat gemäss einem der Ansprüche 15 bis 18 codiert,
Transformieren einer Wirtszelle mit dem DNA-Molekül, und Exprimieren<d>es Derivats in der Wirtszelle und Isolieren des Derivats.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise Escherichia coli ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine Hefe- oder e<i>ne Pflanzenzelle, oder eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise Escherichia coli ist.
31. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-Derivat durch chemische Synthese hergestellt wird.
NACHGEREICHT
R 47507 - 21 - A 755/2006
Patentansprüche:
31. Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Derivats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-Derivat durch chemische Synthese hergestellt wird.
NACHGEREICHT
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