DE69924392T2

DE69924392T2 - Verfahren zur hemmung der aktivität von osteoprotegerin-liganden

Info

Publication number: DE69924392T2
Application number: DE69924392T
Authority: DE
Inventors: Torben Halkier; Jesper Haaning
Original assignee: Affitech AS
Current assignee: Affitech AS
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: IL141588A; CA2343654A1; NZ510508A; KR20010085807A; CN1318105A; DE69924392D1; HUP0103578A3; EP1114166A1; NO20011304L; CZ2001789A3; NO20011304D0; ES2239457T3; ATE291628T1; PL346698A1; TR200100737T2; ID28386A; HRP20010188A2; JP2002525060A; US20040115199A1; AU754971B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Therapie und Prävention von Osteoporose und anderen Krankheiten, charakterisiert durch anhaltenden Verlust von Knochengewebe. Spezifischer stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herabregulierung von Osteoprotegerin-Ligand (OPGL) durch Ermöglichen der Produktion von Antikörpern gegen OPGL in Subjekten, die unter Osteoporose leiden oder in der Gefahr sind, unter Osteoporose zu leiden, bereit. Die Erfindung sorgt außerdem für Verfahren zum Herstellen modifizierter OPGL, die bei diesen Verfahren verwendbar sind. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren für die Identifikation von OPGL-Analoga, welche im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, bereit.
GEBIET DER ERFINDUNG
Osteoporose ist weltweit ein bedeutendes und wachsendes Gesundheitsproblem. Es beeinflusst eine geschätzte Zahl von 75 Millionen Menschen, wenn man die Vereinigten Staaten von Amerika, Europa und Japan zusammenfasst. Folglich ist sie die am weitesten verbreitete Knochenkrankheit im industrialisierten Teil der Welt.
Osteoporose beeinflusst eine von vier postmenopausalen Frauen und eine Mehrheit der Älteren, einschließlich einer wesentlichen Anzahl von Männern. Die Kosten von Osteoporose in den vereinigten Staaten von Amerika wurde bei 15 Millionen betroffenen Menschen 1984 auf 3,8 Milliarden USD jährlich geschätzt. Dies übersetzt sich durch Extrapolation auf weltweite Kosten zu etwas in der Größenordnung von wenigstens 20 Milliarden USD.
Osteoporose ist eine systemische Skelettkrankheit, charakterisiert durch geringe Knochenmasse und mikro-architektonische Verschlechterung von Knochengewebe, mit einer konsequenten Zunahme der Knochenfragilität und Anfälligkeit gegenüber Brüchen. Obwohl alle Knochen betroffen sind, sind Frakturen des Rückgrates, Handgelenkes und der Hüfte typisch und am verbreitetsten. Das Risiko, Osteoporose zu entwickeln, nimmt mit dem Alter zu und ist bei Frauen höher als bei Männern. Seine Ätiologie scheint in dem Mechanismus zu liegen, der eine Akzentuierung des normalen Verlusts von Knochenmasse zugrunde liegt, welcher bei Frauen der Menopause folgt und in allen Individuen mit zunehmendem Alter auftaucht.
Die Peak-Knochenmasse wird etwa im Alter von 35 Jahren erreicht. Nach Erreichen dieses Peaks verringert sich die Knochenmasse durch das Leben hindurch aufgrund eines Ungleichgewichts bei der Umbildung. Knochen verlieren sowohl Mineral- als auch organische Matrix, aber behalten ihre fundamentale Organisation bei.
Knochen bestehen aus einer mineralisierten extrazellulären Matrix, zusammengesetzt aus einer Vielfalt von Proteinen und Proteoglykanen; wobei die Hauptkomponente Typ I-Collagen ist. Das Mineral, das die extrazelluläre Matrix inkrustiert, ist Hydroxyapatit (Ca₃(PO₄)₂·Ca(OH)₂). Knochen wird während Wachstum und Entwicklung kontinuierlich ge formt und durch das Leben hindurch in Reaktion auf physische und chemische Signale umgeformt.
Das Wachstum, die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Knochen sind in hohem Maße regulierte Prozesse, welche auf zellulärem Level die koordinierte Regulation von Knochen-bildenden Zellen (Osteoblasten) und Knochen-resorbierenden Zellen (Osteoclasten) beinhaltet. Der Level von Knochenmasse reflektiert die Balance von Knochenbildung und -resorption.
Osteoblasten entstehen aus mesenchymalen Stammzellen und produzieren Knochenmatrix während der Entwicklung, nach Knochenverletzung und während dem normalen Umbilden bzw. Remodellieren von Knochen, welches durch das Leben hindurch stattfindet. Osteoclasten differenzieren aus hämatopoietischen Vorläufern der Monozyten-Makrophagen-Linie und resorbieren Knochenmatrix.
Ein Ungleichgewicht von Osteoblasten- und Osteoclasten-Funktionen kann in Skelettanormalitäten, charakterisiert durch erhöhte Knochenmasse (Osteoperose) oder durch verringerte Knochenmasse (Osteoporose) resultieren.
Studien von Osteoperose in mutanten Mäusen haben gezeigt, dass genetisch defekte Osteoclasten-Entwicklung, -Reifung und/oder -Aktivierung zu verringerter Knochenresorption führt und uniform in schwerer Osteoperose resultiert (Marks, 1989). Trotzdem ist bisher relativ wenig über die löslichen Faktoren bekannt gewesen, die physiologisch agieren, um Osteoclasten-Entwicklung zu regulieren.
Kürzlich sind jedoch zwei Proteine beschrieben und charakterisiert worden, die bei dieser Regulation teilnehmen (Simonet et al., 1997; Lacey et al., 1998). Diese zwei Proteine sind Osteoprotegerin und Osteoprotegerin-Ligand.
Osteoprotegerin ist ein neues, sekretiertes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptorfamilie. In vitro blockiert Osteoprotegerin Osteoclastogenese in einer Dosis-abhängigen Weise. Transgene Mäuse, die Osteoprotegerin exprimieren, weisen eine allgemein verbreitete Zunahme bei der Knochendichte (Osteoperose), assoziiert mit einer Abnahme an Osteoclasten, auf. Verabreichung rekombinanten Osteoprotegerins produziert ähnliche Effekte in normalen Mäusen und schützt gegen Ovariektomie-assoziierten Knochenverlust bei Ratten (Simonet et al., 1997). Zusätzlich entwickeln Osteoprotegerin-defiziente Mäuse (knock out-Mäuse), während sie bei der Geburt normal sind, einen frühen Beginn an Osteoporose und Arterienverkalkung (Bucay et al., 1998). Diese Beobachtungen weisen deutlich auf die Möglichkeit hin, dass Osteoprotegerin die Differenzierung von Osteoclasten, dem hauptsächlichen, wenn nicht einzigen Knochen-resorbierenden Zelltyp, blockieren, was nahe legt, dass es als humoraler Regulator von Knochenresorption wirken kann. Osteoprotegerin ist der Gegenstand von WO 97123614.
Es wurde hypothetisiert, dass Osteoprotegerin seine Wirkung durch Binden an und Neutralisieren eines/einen Faktors) ausüben kann, welcher Osteoclasten-Entwicklung stimuliert, und folglich Osteoclasten-Reifung inhibiert (Simonet et al., 1997).
Osteoprotegerin-Ligand (OPGL) ist ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor-Familie von Cytokinen, der sowohl in einer Membran-gebundenen als auch einer löslichen Form existiert. OPGL bindet an Osteoprotegerin mit einer Bindungsaffinität von 4 nM. In vitro aktiviert OPGL reife Osteoclasten und moduliert Osteoclasten-Bildung als Knochenmarkvorläufer in Gegenwart von CSF-1. Es ist außerdem gezeigt worden, dass OPGL an die Oberfläche von Osteoclasten-Vorläufern in CSF-1-behandeltem Knochenmark bindet. Der Rezeptor für OPGL auf diesen hämatopoietischen Vorläuferzellen ist jedoch unbekannt. Rekombinantes lösliches OPGL ist ein potenter Induzierer von Knochenresorption in vivo (Lacey et al., 1998).
Beschreibung von OPGL
OPGL wird als ein Typ II-Transmembranprotein synthetisiert, das aus 317 Aminosäureresten (menschlich, vgl. SEQ ID NO: 2) oder 316 Aminosäureresten (murin, vgl. SEQ ID NOs: 4 und 6) besteht. Die vergleichende Anordnung ("alignement") der beiden Aminosäuresequenzen zeigt, dass bei 87% der homologen Positionen identische Amionsäurereste gefunden werden.
Die OPGL-Aminosäuresequenz enthält eine kurze cytoplasmatische Domäne im N-Terminus, gefolgt von der vermeintlichen bzw. putativen Transmembranregion zwischen Aminosäureresten 49 und 69. Basierend auf seiner Homologie zu Tumornekrosefaktor alpha ist von dem extrazellulären Teil von OPGL vorgeschlagen worden, dass er sich aus zwei Domänen zusammensetzt: einer Stielregion, die sich von Aminosäurerest 70 bis 157 erstreckt, und der aktive Ligand-Anteil, der sich von Aminosäurerest 158 bis zum C-Terminus erstreckt.
Das am engsten mit OPGL in Beziehung stehende Protein scheint das Apoptose-induzierende Cytokin TRAIL mit weniger als 25% identischen Aminosäureresten zu sein. OPGL ist vor sehr kurzer Zeit auch in anderen Zusammenhängen kloniert worden und wurde TRANCE (Wong et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190–25194) bzw. RANKL (Anderson et al., 1997, Nature 390: 175–179) genannt. Das Protein ist außerdem als Osteoclasten-Differenzierungsfaktor (ODF, "osteoclast differentiation factor") bekannt.
Einige N-terminale Deletionsvarianten von murinem OPGL sind in E. coli exprimiert und gereinigt worden. Diese Varianten bestanden aus Aminosäureseresten 75–316, 128–316, 137–316 bzw. 158–316. Die drei kürzesten Varianten hatten ähnliche β-Faltblattstruktur, basierend auf Zirkular-Dichroismus-Studien, und alle waren in der Lage, an Osteoprotegerin zu binden. Wichtiger jedoch ist, dass die drei Varianten in in vitro-Assays aktiv waren (Lacey et al., 1998).
Die kürzeste Variante wurde weiter untersucht. Wie Tumornekrosefaktor alpha, existiert dieser variante OPGL in Lösung als ein Trimer und bildet 3:3 Komplexe, wenn mit Osteoprotegerin inkubiert. Man fand, dass die Bindungsaffinität 4 nM ist. Diese Variante induziert in Mäusen in vivo signifikante Zunahmen beim ionisierten Blutcalcium (Hypercalciämie). Die gleichzeitige Verabreichung von Osteoprotegerin reduzierte diesen hypercalciämischen Effekt von OPGL signifikant.
Die längste Variante (Aminosäurereste 75–316) von OPGL band nicht an Osteoprotegerin und hatte keine biologische Aktivität.
Zur Zeit der Konstruktion der N-terminalen Deletionsvarianten war die natürliche Spaltstelle in OPGL nicht bekannt. Expression von Volllängen-OPGL in menschlichen 293-Fibroblasten resultierte in löslichem OPGL, das bei Aminorest 139 im murinen Protein oder beim homologen Aminosäurerest 140 im menschlichen Protein begann. Diese Expressionsstudien zeigten außerdem, dass löslicher OPGL, resultierend aus Expression in humanen Zellen, glykosyliert ist. Dies ist nicht überraschend, weil sowohl murines als auch humanes bzw. menschliches OPGL drei potentielle N-Glykosylierungsstellen in der C-terminalen Liganden-Domäne enthalten.
Die Konzentrationen von Osteoprotegerin in Blut und Geweben sind nicht bekannt, aber das Protein weist signifikante biologische Aktivität bei einer Konzentration von 1 ng/ml auf.
WO 98/25958 offenbart das Protein "499E9", welches die Sequenz von murinem OPGL aufweist. Die Verwendung und Erzeugung von anti-499E9-Antikörpern werden erwägt, aber es besteht kein Hinweis, dass das 499E9-Protein bei der Knochenhomöostase beteiligt ist, und es gibt keinen Vorschlag, dass das 499E9-Protein als ein Immunogen im autologen Wirt verwendet werden kann, um die Toleranz gegen 499E9 zu brechen.
Biologische Aktivität von OPGL
OPGL ist, wenn kombiniert mit CSF-1, ein wirksamer Osteoclasten-Differenzierungsfaktor. Keine dieser Komponenten alleine ist in der Lage, Osteoclasten-Differenzierung aus Vorläuferzellen zu induzieren.
OPGL ist ein wirksamer bzw. potenter Aktivator von reifen Osteoclasten. Alleine aktiviert OPGL reife Osteoclasten, Knochen zu resorbieren. Bei diesen Experimenten ist nicht beobachtet worden, dass OPGL als ein Osteoclasten-Wachstumsfaktor oder Osteoclasten-Überlebensfaktor wirkt.
Die Wirkung von OPGL scheint nicht Arten-beschränkt zu sein, weil muriner OPGL Osteoclasten-Bildung auch in Kulturen von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen induzierte.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, neue Therapien gegen Zustände bereitzustellen, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, wie z.B. Osteoporose. Eine weitere Aufgabe ist, ein Autovakzin gegen OPGL zu entwickeln, um eine neue Behandlung für Osteoporose und für andere pathologische Störungen, die übermäßige Knochenresorption beinhalten, zu erhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir finden, dass die Daten, auf die oben Bezug genommen wurde, eine pathophysiologische Rolle von OPGL vorschlagen. Der in vivo-Hinweis ergibt sich teilweise aus den Um ständen oder ist indirekt, er ist unserer Meinung nach jedoch überzeugend, insbesondere in Kombination mit dem direkten Hinweis.
Die Beobachtung, dass Injektion der rekombinanten C-terminalen Domäne von OPGL in Mäuse in schwerer Hypercalciämie resultiert, weist unserer Meinung nach direkt auf eine pathophysiologische Rolle hin.
Ein indirekter Hinweis kommt von den Osteoprotegerin-defizienten Mäusen (knock out-Mäusen), die, obwohl sie bei Geburt normal sind, einen frühen Beginn von Osteoporose entwickeln. Dies zeigt, dass das Entfernen eines Proteins, das OPGL bindet und seinen Effekt neutralisiert, zu Osteoporose führt. Wir schließen, dass der wahrscheinlichste Grund für dies eine erhöhte Osteoclasten-Reifung und -Aktivierung, verursacht durch OPGL, ist.
Zwei andere indirekte Beweise sind, dass sowohl Mäuse, die für Osteoprotegerin transgen sind, als auch Mäuse, denen rekombinantes Osteoprotegerin injiziert wurde, Osteoperose entwickeln. Dies zeigt, dass unnatürlich hohe Level eines Proteins, das OPGL bindet und seine Wirkungen neutralisiert, zu Osteoperose führt. Hier schließen wir, dass dies seine Gründe in einer verringerten Osteoclasten-Reifung und -Aktivierung, verursacht durch Neutralisation von OPGL, hat.
Folglich schlagen wir ein Modell vor, bei dem OPGL und Osteoprotegerin als positive bzw. negative Regulatoren der Osteoclasten-Entwicklung wirken. In anderen Worten, fördert OPGL Knochenresorption, während Osteoprotegerin Knochenresorption inhibiert.
Folglich könnte man in Bezug auf Osteoporose von OPGL als einem "pathogenen Wirkstoff" denken, welcher die Knochenresorption fördert, die letztendlich zu Osteoporose führt. Ähnlich kann man sich Osteoprotegerin als einen "therapeutischen Wirkstoff" vorstellen, der dem "pathogenen Wirkstoff" entgegenwirkt, indem er dessen Effekte neutralisiert.
Folglich schlagen wir vor, Osteoclasten-Differenzierung/-Reifung/-Bildung und Osteoclasten-Aktivierung durch in vivo-Produktion von Antikörpern herabzuregulieren, die in der Lage sind, OPGL zu neutralisieren, wodurch sichere und effiziente Mittel bereitgestellt werden, Osteoporose und andere Krankheitsbilder bzw. -zustände, charakterisiert durch eine übermäßige Rate an Knochenresorption, verglichen mit der Rate von Knochenbildung, zu behandeln/verbessern und/oder verhindern.
Folglich betrifft die Erfindung in ihrem weitesten und allgemeinsten Umfang die Verwendung

– eines Tier-OPGL-Polypeptids oder einer Teilsequenz davon, oder
– eines OPGL-Analogons, das von einem Tier-OPGL-Polypeptid abgeleitet ist, in das eine Modifikation eingeführt ist, die als Resultat hat, dass eine Immunisierung des Tiers mit dem Analogon eine Produktion von Antikörpern gegen das Tier-OPGL-Polypeptid induziert,

Der attraktivste Aspekt dieser Vorgehensweise ist, dass z.B. Osteoporose durch periodische, aber nicht sehr häufige Immunisierungen kontrolliert werden kann, im Gegensatz zu einer therapeutischen Vorgehensweise, die häufige (z.B. tägliche) Verabreichung von Osteoprotegerin oder Molekülen, die eine Bindungsaffinität zu OPGL, die analog damit ist, beinhaltet. Es wird erwartet, dass 1–4 jährliche Injektionen mit einer immunogenen Zusammensetzung ausreichend sein werden, um die gewünschte Wirkung zu erhalten, wohingegen die Verabreichung von Osteoprotegerin oder anderen Inhibitoren von OPGL-Aktivität tägliche Verabreichungen erfordern würde. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines Nucleinsäurefragments, das für OPGL, eine Teilsequenz von OPGL oder ein OPGL-Analogen codiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Nucleinsäurefragment enthält, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Vektors, der ein Nucleinsäurefragment trägt, welches für OPGL, eine Teilsequenz von OPGL oder ein OPGL-Analogon codiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Vektor umfasst, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer nicht-pathogenen transformierten Zelle, die einen Vektor trägt und exprimiert, der ein Nucleinsäurefragment trägt, welches für OPGL, eine Teilsequenz von OPGL oder ein OPGL-Analogon codiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die transformierte Zelle umfasst, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Die Erfindung betrifft sowohl ein Verfahren zur Identifizierung von Analogen von OPGL, als auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die aus OPGL-Analogen besteht.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Im Folgenden wird eine Anzahl von Ausdrücken, die in der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen verwendet, definiert und im Detail erklärt werden, um die Grenzen der Erfindung klarzustellen.
Die Ausdrücke "T-Lymphozyt" und "T-Zelle" werden in austauschbarer Art und Weise für Lymphozyten thymischen Ursprungs verwendet werden, welche für verschiedene Zell-vermittelte Immunantworten sowie für Helferaktivität bei der humoralen Immunantwort ver antwortlich sind. Ähnlich werden die Ausdrücke "B-Lymphozyt" und "B-Zelle" in austauschbarer Art und Weise für Antikörper-produzierende Lymphozyten verwendet werden.
Ein „OPGL-Polypeptid" soll hierin Polypeptide bezeichnen, die die Aminosäuresequenz des oben diskutierten OPGL-Proteins, abgeleitet aus Menschen und Mäusen, aufweisen (oder Verkürzungen ("truncates") davon, die eine wesentliche Menge von B-Zell-Epitopen mit intaktem OPGL teilen), es sind aber auch Polypeptide von dem Ausdruck umfasst, die die Aminosäuresequenz, identisch zu Analoga dieser zwei Proteine, isoliert aus anderen Arten, aufweisen. Auch unglykosylierte Formen von OPGL, die in einem prokaryotischen System hergestellt sind, sind innerhalb der Grenzen des Ausdrucks eingeschlossen, wie es auch Formen sind, die variierende Glykosylierungsmuster, bedingt durch die Verwendung von z.B. Hefen oder anderen eukaryotischen Nicht-Säuger-Expressionssystemen, aufweisen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass beim Verwenden des Ausdrucks "ein OPGL-Polypeptid" beabsichtigt ist, dass das zur Frage stehende Polypeptid normalerweise nicht immunogen ist, wenn es dem zu behandelnden Tier dargereicht wird. In anderen Worten, ist das OPGL-Polypeptid ein Selbst-Protein oder ist es ein Analogon eines solchen Selbst-Proteins, welches normalerweise keine Immunantwort gegen OPGL des zur Debatte stehenden Tiers verursachen wird.
Ein "OPGL-Analogon" ist ein OPGL-Polypeptid, das Änderungen in seiner Primärstruktur unterworfen worden ist. Eine solche Änderung kann z.B. in der Form einer Fusion eines OPGL-Polypeptids an einen geeigneten Fusionspartner sein (d.h., eine Änderung in der Primärstruktur, die exklusiv C- und/oder N-terminale Additionen von Aminosäureresten beinhaltet) und/oder sie kann in Form von Insertionen und/oder Deletionen und/oder Substitutionen in der Aminosäuresequenz des OPGL-Polypeptids sein. Von dem Ausdruck sind außerdem derivatisierte OPGL-Moleküle umfasst, vgl. die untenstehende Diskussion der Modifikationen von OPGL.
Es sollte angemerkt werden, dass die Verwendung eines Xeno-Analogons (z.B. ein Hunde- oder Schweine-Analogon) von menschlichem OPGL als ein Vakzin bzw. ein Impfstoff in einem Menschen vorstellbar ist, um die gewünschte Immunität gegen OPGL zu produzieren. Eine derartige Verwendung eines Xeno-Analogons zur Immunisierung wird außerdem als Teil der Erfindung angesehen.
Der Ausdruck "Polypeptid" soll im vorliegenden Zusammenhang sowohl kurze Peptide von 2 bis 10 Aminosäureresten, Oligopeptide von 11 bis 100 Aminosäureresten und Polypeptide von mehr als 100 Aminosäureresten bedeuten. Weiterhin soll der Ausdruck außerdem Proteine einschließen, d.h., funktionelle Biomoleküle, umfassend wenigstens ein Polypeptid; wenn umfassend wenigstens zwei Polypeptide, können diese Komplexe bilden, kovalent verknüpft sein oder sie können nicht-kovalent verknüpft sein. Das Polypeptid/die Polypeptide in einem Protein kann/können glykosyliert und/oder an Lipid gebunden ("lipidated") sein und/oder prosthetische Gruppen umfassen.
Der Ausdruck "Teilsequenz" bedeutet einen beliebigen, fortlaufenden Abschnitt von wenigstens 3 Aminosäuren oder, wenn zutreffend, von wenigstens 3 Nucleotiden, direkt abgeleitet von einer natürlich vorkommenden OPGL-Aminosäuresequenz bzw. -Nucleinsäuresequenz.
Der Ausdruck "Tier" soll im vorliegenden Zusammenhang im Allgemeinen eine Tierspezies bzw. -art (vorzugsweise einen Säuger), wie z.B. Homo sapiens, Canis domesticus, etc., bedeuten und nicht nur ein einzelnes Tier. Jedoch bezeichnet der Ausdruck außerdem eine Population solch einer Tierspezies, weil es wichtig ist, dass die immunisierten Individuen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren alle im Wesentlichen dasselbe OPGL tragen, das die Immunisierung der Tiere mit demselben Immunogen/denselben Immunogenen erlaubt. Wenn beispielsweise genetische Varianten von OPGL in verschiedenen menschlichen Populationen existieren, kann es notwendig sein, verschiedene Immunogene bei diesen verschiedenen Populationen zu verwenden, um in der Lage zu sein, die Autotoleranz gegenüber OPGL in jeder Population zu brechen. Es wird dem Fachmann klar sein, dass ein Tier im vorliegenden Zusammenhang ein Lebewesen ist, welches ein Immunsystem aufweist. Es ist bevorzugt, dass das Tier ein Vertebrat, wie z.B. ein Säuger, ist.
Mit dem Ausdruck "in vivo-Herabregulierung von OPGL-Aktivität" ist hierin im lebenden Organismus die Reduktion der Anzahl von Wechselwirkungen zwischen OPGL und seinem (unbekannten) Rezeptor (oder zwischen OPGL und anderen möglichen biologisch wichtigen Bindungspartnern für dieses Molekül) gemeint. Die Herabregulierung kann mittels verschiedener Mechanismen erhalten werden: von diesen ist die einfache Interferenz mit dem aktiven Zentrum in OPGL durch Antikörperbindung die einfachste. Jedoch liegt es außerdem im Bereich der vorliegenden Erfindung, dass das Antikörperbinden im Entfernen von OPGL durch Fängerzellen ("scavenger cells") (wie z.B. Makrophagen und anderen phagozytischen Zellen) resultiert.
Der Ausdruck " auslösende Präsentation ... gegenüber dem Immunsystem" soll bezeichnen, dass das Immunsystem des Tieres einer immunogenen Herausforderung ("challenge") auf eine kontrollierte Weise unterworfen wird. Wie aus der untenstehenden Offenbarung hervorgehen wird, kann eine derartige Herausforderung des Immunsystems auf eine Anzahl von Wegen bewirkt werden, von denen die wichtigsten Impfung mit Polypeptid, enthaltend "Pharmazine" ("pharmaccines", d.h., ein Vakzin bzw. ein Impfstoff, der verabreicht wird, um bestehende Krankheit zu behandeln oder zu verbessern) oder Nucleinsäure-"Pharmazin"-Impfung sind. Das wichtige zu erreichende Ergebnis ist, dass immunkompetente Zellen im Tier mit dem Antigen auf eine immunologisch wirksame Weise konfrontiert werden, wohingegen die genaue Art, dieses Ergebnis zu erreichen, von geringerer Bedeutung für die erfinderische Idee, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ist.
Der Ausdruck "immunogen wirksame Menge" hat seine gewöhnliche Bedeutung im Fachgebiet, d.h., eine Menge eines Immunogens, welches in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, welche sich signifikant mit pathogenen Wirkstoffen befasst, welche immunologische Eigenschaften mit dem Immunogen teilen.
Wenn der Ausdruck verwendet wird, dass das OPGL "modifiziert" worden ist, ist hierin eine chemische Modifikation des Polypeptids gemeint, welche das Rückgrat des OPGL begründet. Solch eine Modifikation kann z.B. eine Derivatisierung (z.B. Alkylierung) gewisser Aminosäurereste in der OPGL-Sequenz sein, aber, wie es von der untenstehenden Offenbarung erkannt werden wird, umfassen die bevorzugten Modifikationen Änderungen der Primärstruktur der OPGL-Aminosäuresequenz.
Wenn die "Autotoleranz gegenüber OPGL" diskutiert wird, wird verstanden, dass normale Individuen in der Population keine Immunantwort gegen OPGL aufstellen, da OPGL ein Eigenprotein in der zu impfenden Population ist; es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass gelegentlich Individuen in einer Tierpopulation in der Lage sein könnten, z.B. als Teil einer Autoimmunkrankheit, Antikörper gegen nativen OPGL zu produzieren. Auf jeden Fall wird ein Tier normalerweise nur gegen seinen eigenen OPGL autotolerant sein, es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass OPGL-Analoga, abgeleitet von anderen Tierarten oder von einer Population, die einen unterschiedlichen OPGL-Phänotyp aufweisen, von dem Tier außerdem toleriert werden würden.
Ein "fremdes T-Zell-Epitop" (oder: "fremdes T-Lymphozyten-Epitop") ist ein Peptid, welches in der Lage ist, an ein MHC-Molekül zu binden, und welches T-Zellen in einer Tierart stimuliert. Bevorzugte fremde T-Zell-Epitope der Erfindung sind "promiskuitive" Epitope, d.h., Epitope, welche an einen wesentlichen Anteil einer bestimmten Klasse von MHC-Molekülen in einer Tierart oder -population binden. Nur eine sehr beschränkte Anzahl von solchen promiskuitiven T-Zell-Epitopen ist bekannt, und diese werden im Detail unten diskutiert werden. Es sollte angemerkt werden, dass es nötig sein kann, 1) mehrere fremde T-Zell-Epitope in das gleiche OPGL-Analogon einzufügen, oder 2) mehrere OPGL-Analoga herzustellen, wobei jedes Analogon ein unterschiedliches promiskuitives Epitop eingefügt hat, damit die Immunogene, welche erfindungsgemäß verwendet werden, in einer so großen Fraktion einer Tierpopulation wie möglich wirksam sind. Es sollte außerdem angemerkt werden, dass das Konzept der fremden T-Zell-Epitope ebenfalls die Verwendung kryptischer T-Zell-Epitope umfasst, d.h., von Epitopen, welche von einem Selbst-Protein abgeleitet sind, und welche nur ein immunogenes Verhalten entwickeln, wenn sie in isolierter Form vorliegen, ohne Teil des zur Debatte stehenden Selbst-Proteins zu sein.
Ein "fremdes T-Helfer-Lymphozyten-Epitop" (ein fremdes T_H-Epitop) ist ein fremdes T-Zell-Epitop, welches an ein MHC-Klasse Klasse II-Molekül bindet und auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC), gebunden an das MHC-Klasse II-Molekül, präsentiert werden kann.
Ein "funktioneller Teil" eines (Bio)moleküls soll im vorliegenden Zusammenhang den Teil des Moleküls bedeuten, welcher für mindestens eine der biochemischen oder physiologi schen Wirkungen, die von dem Molekül ausgeübt werden, verantwortlich ist. Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass viele Enzyme und andere Effektormoleküle ein aktives Zentrum aufweisen, welches für die von dem betreffenden Molekül ausgeübten Wirkungen verantwortlich ist. Andere Teile des Moleküls können einem stabilisierenden oder die Löslichkeit verbessernden Zweck dienen und können deshalb ausgelassen werden, wenn diese Zwecke im Zusammenhang einer gewissen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht von Relevanz sind. Beispielsweise ist es möglich, gewisse Cytokine als einen modifizierenden Anteil in OPGL zu verwenden (vgl. die detaillierte untenstehende Diskussion), und in einem solchen Fall kann das Problem der Stabilität irrelevant sein, da die Kopplung an OPGL die notwendige Stabilität verleiht.
Der Ausdruck "Adjuvans" besitzt eine übliche Bedeutung im Fachgebiet der Impfstoff- bzw. Vakzintechnologie, d.h., eine Substanz oder eine Zusammensetzung von Material, welche 1) nicht selbst in der Lage ist, eine spezifische Immunantwort gegen das Immunogen des Impfstoffs hervorzurufen, aber welche 2) trotzdem in der Lage ist, die Immunantwort gegen das Immunogen zu verstärken. Oder, in anderen Worten, die Vakzinierung bzw. Impfung mit dem Adjuvans alleine bewirkt keine Immunantwort gegen das Immunogen, die Vakzinierung mit dem Immunogen kann eine Immunantwort gegen das Immunogen hervorrufen oder nicht, aber die kombinierte Vakzinierung mit Immunogen und Adjuvans induziert eine Immunantwort gegen das Immunogen, welche stärker ist als die, die von dem Immunogen alleine induziert wird.
"Targeting" eines Moleküls soll im vorliegenden Zusammenhang die Situation bedeuten, in der ein Molekül nach dem Einführen in das Tier bevorzugt in einem bestimmten Gewebe bzw. in bestimmten Geweben auftauchen wird oder bevorzugt mit bestimmten Zellen oder Zelltypen assoziiert sein wird. Die Wirkung kann auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden, einschließlich der Formulierung des Moleküls in einer Zusammensetzung, die das Targeting erleichtert, oder durch die Einführung von Gruppen in das Molekül, welche das Targeting erleichtern bzw. ermöglichen. Diese Punkte werden im Detail unten diskutiert.
"Stimulation des Immunsystems" bedeutet, dass eine Substanz oder eine Zusammensetzung von Material eine allgemeine, nicht-spezifische immunstimulatorische Wirkung aufweist. Eine Vielzahl von Adjuvantien und vermutlichen bzw. putativen Adjuvantien (wie z.B. gewisse Cytokine) teilen das Vermögen, das Immunsystem zu stimulieren. Das Ergebnis der Verwendung eines immunstimulatorischen Mittels ist eine erhöhte "Wachsamkeit" des Immunsystems, was bedeutet, dass die gleichzeitige oder darauffolgende Immunisierung mit einem Immunogen eine signifikant wirksamere Immunantwort, verglichen mit der isolierten Verwendung des Immunogens, induziert.
Bevorzugte Ausführungsformen von Herabregulierung von OPGL-Aktivität
Es ist bevorzugt, dass das OPGL-Polypeptid, das bei der Erfindung als ein Immunogen verwendet wird, ein modifiziertes Molekül ist, wobei wenigstens eine Änderung bei der OPGL-Aminosäuresequenz vorliegt, weil die Möglichkeiten des Erhaltens des überaus wichtigen Durchbruchs der Autotoleranz gegenüber OPGL auf diese Weise außerordentlich erleichtert werden. Es sollte angemerkt werden, dass dies die Möglichkeit nicht ausschließt, einen so modifizierten OPGL bei Formulierungen zu verwenden, welche den Durchbruch der Autotoleranz gegenüber OPGL weiter erleichtern, z.B. Formulierungen, die Adjuvantien enthalten.
Es ist gezeigt worden (in Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796–4804), dass potentiell selbstreaktive B-Lymphozyten-erkennende Selbst-Proteine in normalen Individuen physiologisch vorhanden sind. Jedoch ist Assistenz von Cytokin-produzierenden T-Helfer-Lymphozyten (T_H-Zellen oder T_H-Lymphozyten) erforderlich, damit diese B-Lymphozyten induziert werden, um tatsächlich Antikörper zu produzieren, die mit den relevanten Selbst-Proteinen reaktiv sind. Normalerweise wird diese Hilfe nicht zur Verfügung gestellt, weil T-Lymphozyten im Allgemeinen T-Zell-Epitope, abgeleitet von Selbst-Proteinen, nicht erkennen, wenn sie von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert werden. Jedoch werden, durch Bereitstellen eines Elements an "Fremdartigkeit" bei einem Selbst-Protein (d.h., durch Einführen einer immunologisch signifikanten Modifikation), T-Zellen, die das fremde Element erkennen, beim Erkennen des fremden Epitops auf einer APC (wie z.B., anfangs eine mononukleare Zelle) aktiviert. Polyklonale B-Lymphozyten (die auch APCs sind), fähig zum Erkennen von Selbst-Epitopen auf dem modifizierten Selbst-Protein, internalisieren das Antigen außerdem und präsentieren das fremde T-Zell-Epitop/die fremden T-Zell-Epitope davon nachfolgend, und die aktivierten T-Lymphozyten stellen diesen selbstreaktiven polyklonalen B-Lymphozyten nachfolgend Cytokin-Hilfe bereit. Nachdem die von diesen polyklonalen B-Lymphozyten produzierten Antikörper mit verschiedenen Epitopen auf dem modifizierten Polypeptid reaktiv sind, einschließlich jenen, die außerdem im nativen Polypeptid vorhanden sind, wird ein Antikörper, kreuzreagierend mit dem nicht-modifizierten Selbst-Protein, induziert. Folglich können die T-Lymphozyten dazu gebracht werden, zu wirken, wie wenn die Population polyklonaler B-Lymphozyten ein völlig fremdes Antigen erkannt haben, wobei tatsächlich nur das eingefügte Epitop/die eingefügten Epitope für den Wirt fremd ist/sind. Auf diese Weise werden Antikörper induziert, die in der Lage sind, mit nicht-modifizierten Selbst-Antigenen kreuz zu reagieren.
Im Fachgebiet sind mehrere Wege des Modifizierens eines Peptid-Selbst-Antigens bekannt, um den Durchbruch der Autotoleranz zu erhalten. Folglich kann die Modifikation gemäß der Erfindung einschließen, dass

– wenigstens ein fremdes T-Zell-Epitop eingeführt wird, und/oder
– wenigstens eine erste Gruppierung bzw. ein erster Anteil eingeführt wird, welcher das Targeting des modifizierten Moleküls zu einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) bewirkt, und/oder
– wenigstens eine zweite Gruppierung bzw. ein zweiter Anteil eingeführt wird, welcher das Immunsystem stimuliert, und/oder
– wenigstens eine dritte Gruppierung bzw. ein dritter Anteil eingeführt wird, welcher Präsentation des modifizierten OPGL-Polypeptids gegenüber dem Immunsystem optimiert.

Jedoch sollten all diese Modifikationen durchgeführt werden, während ein wesentlicher Anteil der ursprünglichen B-Lymphozyten-Epitope in OPGL erhalten werden, weil die B-Lymphozyten-Erkennung des nativen Moleküls dadurch verstärkt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Seitengruppen (in der Form von fremden T-Zell-Epitopen oder den oben genannten ersten, zweiten oder dritten Gruppierungen bzw. Anteilen) kovalent oder nicht-kovalent eingeführt. Das soll bedeuten, dass Abschnitte von Aminosäureresten, abgeleitet von OPGL, derivatisiert werden, ohne die primäre Aminosäuresequenz zu verändern, oder wenigstens ohne Einführen von Änderungen bei den Peptidbindungen zwischen den einzelnen Aminosäuren in der Kette.
Eine alternative und bevorzugte Ausführungsform verwendet Aminosäure-Substitution und/oder -Deletion und/oder -Insertion und/oder -Addition (die mit rekombinanten Mitteln oder mit Mitteln der Peptidsynthese bewirkt werden; Modifikationen, welche längere Abschnitte von Aminosäuren betreffen, können Fusionspolypeptide ergeben). Eine besonders bevorzugte Version dieser Ausführungsform ist die Technik, beschrieben in WO 95/05849, welche ein Verfahren zur Herabregulierung von Selbst-Proteinen durch Immunisieren mit Analoga der Selbst-Proteine offenbart, wobei eine Anzahl von Aminosäuresequenz(en) mit einer korrespondierenden Anzahl von Aminosäuresequenz(en) substituiert worden ist, die jeweils ein fremdes immundominantes T-Zell-Epitop umfassen, während zur selben Zeit die allgemeine Tertiärstruktur des Selbst-Proteins in dem Analogon beibehalten wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es jedoch ausreichend, wenn die Modifikation (sei es eine Insertion, Addition, Deletion oder Substitution) ein fremdes T-Zell-Epitop zur Folge hat, und zur selben Zeit eine wesentliche Anzahl der B-Zell-Epitope in OPGL erhält, jedoch ist es, um maximale Wirksamkeit der induzierten Immunantwort zu erhalten, bevorzugt, dass die gesamte Tertiärstruktur von OPGL in dem modifizierten Molekül aufrecht erhalten wird.
Die folgende Formel beschreibt die im Allgemeinen von der Erfindung abgedeckten OPGL-Konstrukte: (MOD1)s1(OPGLe1)n1(MOD2)s2(OPGLe2)n2 .... (MODx)sx(OPGLex)nx (I)– wobei OPGL_e1 – OPGL_ex x B-Zell-Epitope sind, die Teilsequenzen von OPGL enthalten, welche unabhängig identisch oder nicht-identisch sind und welche fremde Seitengruppen enthalten oder nicht enthalten, x eine ganze Zahl ≥ 3 ist, n₁ – n_x x ganze Zahlen ≥ 0 sind (wenigstens eine ist ≥ 1), MOD₁ – MOD_x x Modifikationen, eingeführt zwischen den erhaltenen B-Zell-Epitopen, sind, und s₁ – s_x x ganze Zahlen ≥ 0 sind (wenigstens eine ist ≥ 1, wenn in die OPGL_e-Sequenzen keine Seitengruppen eingeführt werden). Folglich ermöglicht, in Anbetracht der allgemeinen funktionellen Beschränkungen auf die Immunogenität der Konstrukte, die Erfindung alle Arten von Permutationen der ursprünglichen OPGL-Sequenz und alle Arten von Modifikationen darin. Folglich sind in die Erfindung alle modifizierten OPGL, erhalten durch Weglassen von Teilen der OPGL-Sequenz, welche z.B. nachteilige Wirkungen in vivo aufwei sen, oder Weglassen von Teilen, die normalerweise intrazellulär sind und folglich unerwünschte immunologische Reaktionen zur Folge haben könnten, eingeschlossen.
Die Aufrechterhaltung einer wesentlichen Fraktion von B-Zell-Epitopen oder sogar der gesamten Tertiärstruktur eines Proteins, welches, wie hierin beschrieben, Modifikationen unterworfen wird, kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Einer ist, einfach ein polyklonales, gegen OPGL gerichtetes Antiserum herzustellen (z.B. ein Antiserum, hergestellt in einem Kaninchen) und anschließend dieses Antiserum als ein Testreagens (z.B. in einem kompetitiven ELISA) gegen die modifizierten Proteine, welche produziert werden, zu verwenden. Modifizierte Versionen (Analoga), welche im selben Ausmaß mit dem Antiserum reagieren, wie es OPGL tut, müssen angesehen werden, die selbe Gesamt-Tertiärstruktur wie OPGL aufzuweisen, wohingegen Analoga, die eine limitierte (aber immer noch signifikante und spezifische) Reaktivität mit so einem Antiserum aufweisen, angesehen werden, eine wesentliche Fraktion der ursprünglichen B-Zelle-Epitope beibehalten zu haben.
Alternativ kann eine Auswahl monoklonaler Antikörper, die mit eindeutigen Epitopen auf OPGL reaktiv sind, hergestellt werden und als Testpanel verwendet werden. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass sie 1) eine Epitop-Kartierung ("epitope mapping") von OPGL und 2) eine Kartierung von Epitopen, welche bei den hergestellten Analoga aufrecht erhalten sind, erlaubt.
Natürlich wäre eine dritte Vorgehensweise, die dreidimensionale Struktur von OPGL oder von einer biologisch aktiven Verkürzung ("truncate") davon (vgl. oben) aufzulösen, und diese mit der aufgelösten dreidimensionalen Struktur des hergestellten Analogons zu vergleichen. Eine dreidimensionale Struktur kann mit Hilfe von Röntgenstrahlenbeugungs-Studien und NMR-Spektroskopie aufgelöst werden. Weitere Informationen, betreffend die Tertiärstruktur, können in gewissem Ausmaß von Zirkular-Dichroismus-Studien erhalten werden, welche den Vorteil haben, dass sie das Polypeptid lediglich in reiner Form erfordern (wohingegen Röntgenstrahlenbeugung das Bereitstellen von kristallisiertem Polypeptid erfordert und NMR das Bereitstellen von isotopischen Varianten des Polypeptids erfordert), um nützliche Informationen über die Tertiärstruktur eines gegebenen Moleküls bereitzustellen. Jedoch sind letztlich Röntgenstrahlenbeugung und/oder NMR notwendig, um schlüssige Daten zu erhalten, weil Zirkular-Dichroismus nur indirekten Hinweis einer korrekten dreidimensionalen Struktur via Informationen der Sekundärstrukturelemente liefern kann.
Eine bevorzugte Ausfürungsform der Erfindung verwendet multiple Präsentationen von B-Lymphozyten-Epitopen von OPGL (d.h., Formel I, wobei wenigstens ein B-Zell-Epitop an zwei Positionen vorliegt). Dieser Effekt kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z.B. indem einfach Fusionspolypeptide hergestellt werden, die die Struktur (OPGL)_m umfassen, wobei m eine ganze Zahl ≥ 2 ist, und man die hierin diskutierten Modifikationen dann in wenigstens eine der OPGL-Sequenzen einführt. Es ist bevorzugt, dass die eingeführten Modifikationen wenigstens eine Duplikation eines B-Lymphozyten-Epitops und/oder das Einführen eines Haptens beinhaltet.
Wie oben erwähnt, kann das Einführen eines fremden T-Zell-Epitops durch Einführen wenigstens einer Aminosäure-Insertion, -Addition, -Deletion oder -Substitution erreicht werden. Natürlich wird die normale Situation das Einführen von mehr als einem Austausch bei der Aminosäuresequenz sein (z.B. Insertion von oder Substitution durch einen/ein kompletten/komplettes T-Zell-Epitop), aber das wichtige zu erreichende Ziel ist, dass das OPGL-Analogon, wenn von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) prozessiert, so ein fremdes immundominantes T-Zell-Epitop, das im Zusammenhang eines MCH-Klasse II-Moleküls auf der Oberfläche der APC präsentiert wird, zur Folge haben wird. Folglich kann, wenn die OPGL-Aminosäuresequenz in geeigneten Positionen eine Anzahl von Aminosäureresten umfasst, die außerdem in einem fremden T_H-Epitop gefunden werden können, das Einführen eines fremden T_H-Epitops dann erreicht werden, indem die verbleibenden Aminosäuren des fremden Epitops mittels Aminosäure-Insertion, -Addition, -Deletion und -Substitution bereitgestellt werden. In anderen Worten ist es nicht erforderlich, ein komplettes T_H-Epitop durch Insertion oder Substitution einzuführen, um den Zweck der vorliegenden Erfindung zu erfüllen.
Es ist bevorzugt, dass die Anzahl von Aminosäure-Insertionen, -Deletionen, -Substitutionen oder -Additionen wenigstens 2 ist, wie z.B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 und 25 Insertionen, Substitutionen, Additionen oder Deletionen. Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Anzahl von Aminosäure-Insertionen, -Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen nicht höher als 150 ist, wie z.B. höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80 und höchstens 70. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die Anzahl von Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Additionen 60 nicht überschreitet, und insbesondere sollte die Anzahl nicht über 50 oder sogar 40 hinausgehen. Am bevorzugtesten ist eine Anzahl von nicht mehr als 30. Im Hinblick auf Aminosäure-Additionen sollte angemerkt werden, dass diese, wenn das resultierende Konstrukt in der Form eines Fusionspolypeptids ist, oft beträchtlich höher als 150 ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung schließen Modifikation durch Einführen von wenigstens einem fremden immundominanten T-Zell-Epitop ein. Es wird verstanden werden, dass die Frage von Immundominanz eines T-Zell-Epitops von der betreffenden Tierart abhängt. Wie hierin verwendet, betrifft der Ausdruck "Immundominanz" einfach Epitope, welche in dem geimpften Individuum/der geimpften Population zu einer signifikanten Immunantwort führen, jedoch ist es eine wohlbekannte Tatsache, dass ein T-Zell-Epitop, welches in einem Individuum/einer Population immundominant ist, nicht notwendigerweise in einem anderen Individuum derselben Art immundominant ist, selbst wenn es in der Lage sein kann, im letzteren Individuum MHC-II-Moleküle zu binden. Folglich ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein immundominantes T-Zell-Epitop ein T-Zell-Epitop, welches wirksam bei der Gewährleistung für T-Zell-Hilfe sein wird, wenn es in einem Antigen vorhanden ist. Typischerweise haben immundominante T-Zell-Epitope als eine inhärente Eigenschaft, dass sie im Wesentlichen immer gebunden an MHC-Klasse II-Moleküle präsentiert werden, unabhängig von dem Polypeptid, worin sie auftreten.
Ein anderer wichtiger Punkt ist das Thema der MHC-Restriktion bzw. -Beschränkung von T-Zell-Epitopen. Im Allgemeinen sind natürlich vorkommende T-Zell-Epitope MHC-beschränkt, d.h., ein gewisses Peptid, das ein T-Zell-Epitop darstellt, wird nur effektiv an eine Teilmenge von MHC-Klasse II-Molekülen binden. Dies hat wiederum den Effekt, dass in den meisten Fällen die Verwendung eines spezifischen T-Zell-Epitops in einer Vakzinkomponente resultieren wird, die nur in einer Fraktion der Population effektiv ist, und abhängig von der Größe dieser Fraktion kann es notwendig sein, mehrere T-Zell-Epitope im selben Molekül einzuschließen, oder alternativ ein Multi-Komponenten-Vakzin herzustellen, worin die Komponenten OPGL-Varianten sind, welche voneinander über die Art des eingeführten T-Zell-Epitops unterschieden werden.
Wenn die MHC-Restriktion der verwendeten T-Zellen vollständig unbekannt ist (z.B. in einer Situation, in der das vakzinierte Tier eine schlecht definierte MHC-Zusammensetzung aufweist), kann der Anteil der Population, der von einer spezifischen Vakzin-Zusammensetzung abgedeckt wird, mittels der folgenden Formel bestimmt werden

– wobei p_i die Häufigkeit von reagierenden Individuen bzw. Respondern in der Population gegen das i-te Fremd-T-Zell-Epitop, das in der Vakzin-Zusammensetzung vorhanden ist, und n die Gesamtzahl fremder T-Zell-Epitope in der Vakzin-Zusammensetzung ist. Folglich würde eine Vakzin-Zusammensetzung, die 3 fremde T-Zell-Epitope mit Reaktionshäufigkeiten in der Population von 0,8, 0,7 bzw. 0,6 enthält, 1 – 0,2 × 0,3 × 0,4 = 0,976ergeben,
– d.h., 97,6 Prozent der Population werden statistisch eine MHC-II-vermittelte Antwort auf das Vakzin entwickeln.

Die obige Formel ist in Situationen nicht anwendbar, in denen ein mehr oder weniger präzises MHC-Restriktionsmuster der verwendeten Peptide bekannt ist. Wenn z.B. ein bestimmtes Peptid nur an die humanen MHC-II-Moleküle bindet, das von den HLA-DR-Allelen DR1, DR3, DR5 und DR7 codiert wird, dann wird die Verwendung dieses Peptids zusammen mit anderen Peptiden, welche an die übrigen MHC-II-Moleküle, die von HLA-DR-Allelen codiert werden, binden, 100% Abdeckung in der fraglichen Population erreichen. Wenn das zweite Peptid gleichermaßen nur DR3 und DR5 bindet, wird die Zugabe dieses Peptids die Abdeckung überhaupt nicht erhöhen. Wenn man die Berechnung der Populationsantwort lediglich auf MHC-Restriktion von T-Zell-Epitopen in dem Vakzin stützt, kann der Anteil der Populati on, der von einer spezifischen Vakzin-Zusammensetzung abgedeckt wird, mittels der folgenden Formel bestimmt werden:

– wobei φ_j die Summe der Häufigkeiten in der Population von allelischen Haplotypen ist, die für MHC-Moleküle codierert, welche irgendeines der T-Zell-Epitope in dem Vakzin binden und welche zum j-sten der drei bekannten HLA-Loci (DP, DR und DQ) gehören; in der Praxis wird zuerst bestimmt, welche MHC-Moleküle jedes T-Zell-Epitop im Vakzin erkennt, und danach werden diese mittels des Typs (DP, DR und DQ) aufgelistet; dann werden die individuellen Häufigkeiten der unterschiedlichen aufgelisteten allelischen Haplotypen für jeden Typ summiert, wodurch man φ₁, φ₂ und φ₃ erhält.

Es kann vorkommen, dass der Wert p_i in der Formel II den entsprechenden theoretischen Wert π_i übersteigt:

– wobei ν_j die Summe der Häufigkeiten in der Population des allelischen Haplotyps ist, welche MHC-Moleküle codieren, welche das i-te T-Zell-Epitop im Vakzin binden und welche zu dem j-sten der 3 bekannten HLA-Loci (DP, DR und DQ) gehören. Dies bedeutet, dass in 1 – π_i der Population eine Häufigkeit von Respondern von f_{residual_i} = (p_i – π_i)/(1 – π_i) ist. Daher kann Formel (III) so angepasst werden, dass sie Formel (V) ergibt.
– wobei der Ausdruck 1 – f_{residual_i} auf 0 gesetzt wird, wenn er negativ ist. Es sollte erwähnt werden, dass Formel (V) es erfordert, dass alle Epitope gegen identische Haplotyp-Sätze Haplotyp-kartiert worden sind.

Wenn man daher T-Zell-Epitope auswählt, die in das Analogon eingeführt werden sollen, ist es wichtig, alles Wissen über die Epitope, welches verfügbar ist, mit einzubringen: 1) Die Häufigkeit von Respondern in der Population gegenüber jedem Epitop, 2) die MHC-Restriktionsdaten, und 3) die Häufigkeit der relevanten Haplotypen in der Population.
Es existiert eine Anzahl von natürlich vorkommenden "promiskuitiven" T-Zell-Epitopen, welche in einem großen Teil der Individuen einer Tierart oder einer Tierpopulation aktiv sind, und diese werden bevorzugt in das Vakzin eingefügt, wobei das Erfordernis einer großen Anzahl unterschiedlicher Analoga in demselben Vakzin verringert wird.
Das promiskuitive Epitop kann erfindungsgemäß ein natürlich vorkommendes, humanes T-Zell-Epitop sein, wie beispielsweise Epitope von Tetanustoxoid (z.B. die P2- und P30-Epitope), Diphterietoxoid, Influenzavirus-Hämagluttinin (HA) und P. falciparum CS-Antigen.
Über die Jahre ist eine Anzahl anderer promiskuitiver T-Zell-Epitope identifiziert worden. Insbesondere Peptide, die in der Lage sind, einen großen Anteil von HLA-DR-Molekülen, codiert von den unterschiedlichen HLA-DR-Allelen, zu binden, sind identifiziert worden, und diese sind alle möglichen T-Zell-Epitope, die in die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten OPGL-Analoga eingeführt werden können. Vgl. auch die Epitope, die in den folgenden Referenzen diskutiert sind, welche hierbei alle durch Referenz hierin eingeschlossen sind: WO 98123635 (Frazer I. H. et al., der University of Queensland zugeteilt); Southwood S. et al., 1998, J. Imunol. 160: 3363–3373; Sinigaglia F. et al., 1988, Nature 336: 778–780; Chicz R. M. et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27–47; Hammer J. et al., 1993, Cell 74: 197–203; und Falk K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230–242. Die letzte Referenz beschäftigt sich außerdem mit HLA-DQ- und -DP-Liganden. Alle in diesen 5 Referenzen aufgelisteten Epitope sind relevant als zur Auswahl stehende natürliche Epitope, um sie in der vorliegenden Erfindung zu verwenden, ebenso wie Epitope, welche mit diesen allgemeine Motive teilen.
Alternativ kann das Epitop ein beliebiges künstliches T-Zell-Epitop sein, welches in der Lage ist, einen großen Anteil von MHC-Klasse II-Molekülen zu binden. In diesem Zusammenhang sind die pan-DR-Epitop-Peptide ("PADRE"), beschrieben in WO 95/07707 und in der entsprechenden Veröffentlichung Alexander J. et al., 1994, Immunity 1: 751–761 (beide Offenbarungen sind hierin durch Referenz inkorporiert) interessante Kandidaten für gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Epitope. Es sollte angemerkt werden, dass die effektivsten PADRE-Peptide, die in diesen Veröffentlichungen offenbart sind, D-Aminosäuren in den C- und N-Termini tragen, um, wenn verabreicht, die Stabilität zu verbessern. Die vorliegende Erfindung zielt jedoch vorwiegend darauf ab, die relevanten Epitope als Teil des modifizierten OPGL einzubauen, welches dann nachfolgend im Inneren des lysosomalen Kompartiments von APCs enzymatisch abgebaut werden sollte, um nachfolgende Präsentation im Kontext eines MHC-II-Moleküls zu erlauben, und folglich ist es nicht zweckdienlich, D-Aminosäuren in die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Epitope einzubauen.
Ein besonders bevorzugtes PADRE-Peptid ist dasjenige, welches die Aminosäuresequenz AKFVAAWTLKAAA oder eine immunologisch wirksame Teilsequenz davon aufweist. Dieses und andere Epitope, die den gleichen Mangel an MHC-Restriktion aufweisen, sind bevorzugte T-Zell-Epitope, welche in den OPGL-Analoga, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, vorhanden sein sollten. Solche super-promiskuitive Epitope werden die einfachsten Ausführungsformen der Erfindung ermöglichen, wobei dem Immunsystem des geimpften Tiers nur ein einzelner modifizierter OPGL präsentiert wird.
Wie oben erwähnt, kann die Modifikation von OPGL außerdem das Einführen einer ersten Gruppierung bzw. eines ersten Anteils beinhalten, welche/welcher den modifizierten OPGL zu einer APC oder einem B-Lymphozyten targetiert. Beispielsweise kann die erste Gruppierung bzw. der erste Anteil ein spezifischer Bindungspartner für ein B-Lymphozyten-spezifisches Oberflächenantigen oder für ein APC-spezifisches Oberflächenantigen sein. Viele derartige spezifische Oberflächenantigene sind im Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann der Anteil ein Kohlenhydrat sein, für welches es einen Rezeptor auf dem B-Lymphozyten oder der APC gibt (z.B. Mannan oder Mannose). Alternativ kann der zweite Anteil ein Hapten sein. Auch ein Antikörperfragment, welches ein Oberflächenmolekül auf APCs oder Lymphozyten spezifisch erkennt, kann als ein erster Anteil verwendet werden (das Oberflächenmolekül kann z.B. ein FCγ-Rezeptor von Makrophagen und Monozyten sein, wie z.B. FCγRI, oder alternativ irgendein anderer spezifischer Oberflächenmarker, wie z.B. CD40 oder CTLA-4). Es sollte angemerkt werden, dass alle diese beispielhaften Targeting-Moleküle außerdem als Teil eines Adjuvans verwendet werden können, vgl. unten.
Als eine Alternative oder ein Ersatz zum Targeting des modifizierten OPGL-Polypeptids an einen bestimmten Zelltyp ist es, um eine erhöhte Immunantwort zu erreichen, möglich, den Grad an Ansprechbarkeit des Immunsystems durch Einschließen des oben genannten zweiten Anteils, welcher das Immunsystem stimuliert, zu erhöhen. Typische Beispiele solcher zweiten Anteile sind Cytokine und Hitzeschockproteine oder molekulare Chaperone sowie effektive Teile davon.
Geeignete Cytokine zur erfindungsgemäßen Verwendung sind jene, welche normalerweise auch als Adjuvans in einer Vakzin-Zusammensetzung funktionieren, d.h., beispielsweise Interferon γ (IFN-γ), Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 12 (IL-12), Interleukin 13 (IL-13), Interleukin 15 (IL-15) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, "granulocyte-macrophage colony stimulating factor"); alternativ kann der funktionelle Teil des Cytokinmoleküls als der zweite Anteil ausreichen. Im Hinblick auf die Verwendung solcher Cytokine als Adjuvans-Substanzen vgl. die untenstehende Diskussion.
Erfindungsgemäß können geeignete als der zweite Anteil verwendete Hitzeschockproteine oder molekulare Chaperone HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (außerdem bekannt als gp96, vgl. Wearsch P. A. et al., 1998, Biochemistry 37: 5709–19) und CRT (Calreticulin) sein.
Alternativ kann der zweite Anteil ein Toxin sein, wie z.B. Listeriolycin (LLO), Lipid A und Hitze-labiles Enterotoxin. Außerdem sind eine Anzahl mycobakterieller Derivate, wie z.B. MDP (Muramyldipeptid), CFA (vollständiges Freund'sches Adjuvans) und die Trehalosediester TDM und TDE, interessante Möglichkeiten.
Auch die Möglichkeit des Einführens eines dritten Anteils, welcher die Präsentation des modifizierten OPGL gegenüber dem Immunsystem verstärkt, ist eine wichtige Ausführungsform der Erfindung. Das Fachgebiet hat einige Beispiele dieses Prinzips gezeigt. Beispielsweise ist bekannt, dass der Palmitoyl-Lipidanker in dem Borrelia burgdorferi-Protein OspA verwendet werden kann, um Polypeptide bereitzustellen, die Selbst-Adjuvans sind (vgl. z.B. WO 96/40718) – es scheint, dass die mit Lipid versehenen Proteine Micellen-ähnliche Strukturen mit einem Kern ausbilden, der aus den Lipidankerteilen der Polypeptide besteht, und wobei die verbleibenden Teile des Moleküls daraus hervorragen, was in multiplen Präsentationen der antigenen Determinanten resultiert. Daher sind die Verwendung dieser und verwandter Vorgehensweisen unter Verwendung verschiedener Lipidanker (z.B. einer Myristylgruppe, einer Farnesylgruppe, einer Geranylgeranylgruppe, eines GPI-Ankers und einer N-Acyldiglyceridgruppe) die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere weil das Bereitstellen solch eines Lipidankers in einem rekombinant produzierten Protein ziemlich unkompliziert ist und lediglich die Verwendung von z.B. einer natürlich vorkommenden Signalsequenz als ein Fusionspartner für das modifizierte OPGL-Polypeptid erfordert. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung des C3d-Fragments von Komplementfaktor C3 oder C3 selbst (vgl. Dempsey et al., 1996, Science 271, 348–350, und Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458–462).
Eine alternative Ausführungsform der Erfindung, welche außerdem in der bevorzugten Präsentation multipler (z.B. wenigstens 2) Kopien der wichtigen epitopischen Regionen von OPGL gegenüber dem Immunsystem resultiert, ist das kovalente Koppeln von OPGL, einer Teilsequenz oder Varianten davon an bestimmte Moleküle. Beispielsweise können Polymere verwendet werden, z.B. Kohlenhydrate, wie z.B. Dextran, vgl. z.B. Lees A. et al., 1994, Vaccine 12: 1160–1166; Lees A. et al., 1990, J Immunol. 145: 3594–3600, aber auch Mannose und Mannan sind verwendbare Alternativen. Integrale Membranproteine von z.B. E. coli und anderen Bakterien sind außerdem verwendbare Konjugationspartner. Die traditionellen Trägermoleküle, wie z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH, "keyhole limpet hemocyanin"), Tetanustoxoid, Diphterietoxoid und Rinderserumalbumin (BSA), sind außerdem bevorzugte und verwendbare Konjugationspartner.
Bestimmte Bereiche von nativem OPGL scheinen die Geeignetsten für das Durchführen von Modifikationen zu sein. Aufgrund der strukturellen Beziehung von OPGL mit TNF-α und anderen Mitgliedern der Tumornekrosefaktor-Familie wird vorhergesagt, dass Einführungen von T-Zell-Epitopen oder anderen Modifikationen in Bereichen, die durch Positionen 170–192, 198–218, 221–246, 256–261 oder 285–316 (die Aminosäure-Nummerierung von SEQ ID Nos: 4, 6 und 12), definiert sind, am wahrscheinlichsten die gewünschten Ergebnisse ergeben werden. Diese Positionen beziehen sich auf den murinen OPGL – die korrespondierenden Positionen im menschlichen Molekül sind 171–193, 199–219, 222–247, 257–262 und 286–317 (die Aminosäure-Nummerierungen von SEQ ID NO: 2).
Überlegungen, die diesen ausgewählten Bereichen zugrunde liegen sind a) Konservierung bekannter und vorhergesagter B-Zell-Epitope, b) Konservierung von Tertiärstruktur, etc. Auf jeden Fall ist es, wie oben diskutiert, ziemlich einfach, einen Satz modifizierter OPGL-Moleküle, welche alle der Einführung eines T-Zell-Epitops an verschiedenen Stellen unterworfen worden sind, zu durchmustern.
Weil die bevorzugtesten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Herabregulierung von menschlichem OPGL einbeziehen, ist es konsequenterweise bevorzugt, dass das oben diskutierte OPGL-Polypeptid ein menschliches OPGL-Polypeptid ist. Bei dieser Ausführungsform ist es insbesondere bevorzugt, dass das menschliche OPGL-Polypeptid durch Substituieren wenigstens einer Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 (oder in einem Polypeptid, wo Cys-221 in SEQ ID NO: 2 mit Serin ersetzt worden ist) mit wenigstens einer Aminosäuresequenz gleicher oder unterschiedlicher Länge, welche ein fremdes T_H-Epitop enthält, modifiziert worden ist. Die substituierten Aminosäurereste sind ausgewählt aus Resten 257–262, 289–303 und 222–243 in SEQ ID NO: 2. Das Grundprinzip hinter solchen Konstrukten wird im Detail in den Beispielen diskutiert.
Formulierung von OPGL und modifizierten OPGL-Polypeptiden
Wenn Präsentation des OPGL-Polypeptids oder des modifizierten OPGL-Polypeptids gegenüber dem Immunsystem eines Tiers mittels dessen Verabreichung an das Tier bewirkt wird, folgt die Formulierung des Polypeptids in allgemein im Fachgebiet anerkannten Prinzipien.
Die Herstellung von Vakzinen, welche Peptidsequenzen als aktive Bestandteile enthalten, ist generell im Fachgebiet gut verstanden, wie von US-Patenten 4 608 251, 4 601 903, 4 599 231, 4 599 230, 4 596 792 und 4 578 770 veranschaulicht, die alle hierin durch Referenz inkorporiert sind. Typischerweise werden solche Vakzine als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die sich zur Lösung oder zur Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion eignen, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann außerdem emulgiert werden. Der aktive immunogene Inhaltsstoff wird oft mit Exzipientien gemischt, welche pharmazeutisch annehmbar sind und mit dem aktiven Inhaltsstoff kompatibel sind. Solche Exzipientien sind z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches, und Kombinationen davon. Zusätzlich kann das Vakzin, wenn dies erwünscht ist, geringe Mengen von Hilfssubstanzen, wie Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffer oder Adjuvantien, enthalten, welche die Wirksamkeit der Vakzine verstärken; vgl. die detaillierte Diskussion von Adjuvantien unten.
Die Vakzine werden konventionell parenteral verabreicht, beispielsweise durch Injektion, entweder subkutan, intrakutan, intradermal, subdermal oder intramuskulär. Zusätzliche Formulierungen, welche für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, umfassen Zäpfchen (bzw. Suppositorien), und in einigen Fällen orale, bukkale, sublinguale, intraperitoneale, intravaginale, anale, epidurale, spinale und intrakraniale Formulierungen. Zäpfchen können traditionelle Bindemittel und Trägerstoffe, z.B. Polyalkylenglykole oder Triglyceride, umfassen; solche Suppositorien können aus Gemischen gebildet sein, die den Inhaltsstoff im Bereich von 0,5% bis 10%, bevorzugt 1–2%, enthalten. Orale Formulierungen umfassen solche normalerweise verwendeten Exzipientien, wie beispielsweise pharmazeutische Grade von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnli che. Diese Zusammensetzungen haben die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Retardpräparaten oder Pudern und enthalten 10–95% des aktiven Bestandteils, vorzugsweise 25–70%. Für orale Formulierungen ist Choleratoxin ein interessanter Formulierungspartner (und außerdem ein möglicher Konjugationspartner).
Die Polypeptide können als neutrale Formen oder Salzformen in das Vakzin formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Peptids), welche mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren, gebildet werden, oder mit derartigen organischen Säuren, wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und ähnlichen. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können außerdem von anorganischen Basen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen, abgeleitet sein.
Die Vakzine werden auf eine Weise verabreicht, welche mit der Dosisformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Patienten, einschließlich z.B. der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, eine Immunantwort hervorzubringen und dem Grad an Schutz, der erwünscht wird, ab. Geeignete Dosierungsbereiche liegen im Bereich von mehreren hundert Mikrogramm aktiver Bestandteile pro Impfung, mit einem bevorzugten Bereich von ungefähr 0,1 μg bis 2000 μg (obwohl sogar höhere Mengen im Bereich von 1 bis 10 mg erwogen werden), beispielsweise im Bereich von ungefähr 0,5 μg bis 1000 μg, bevorzugt im Bereich von 1 μg bis 500 μg, und insbesondere im Bereich von ungefähr 10 μg bis 100 μg. Geeignete Schemata ("regimens") zur anfänglichen Verabreichung und zu Wiederholungsimpfungen ("booster shots") sind außerdem variabel, aber werden durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Impfungen, exemplifiziert.
Die Art der Anwendung kann weit variiert werden. Jedes der konventionellen Verfahren zur Verabreichung eines Vakzins ist anwendbar. Diese schließen orale Anwendung auf einer festen, physiologisch annehmbaren Basis oder in einer physiologisch annehmbaren Dispersion, parenteral, durch Injektion oder ähnliches, ein. Die Dosierung des Vakzins wird vom Verabreichungsweg abhängen und wird je nach Alter der zu impfenden Person und der Formulierung des Antigens variieren.
Einige der Polypeptide des Vakzins sind in einem Vakzin ausreichend immunogen, aber für einige der anderen wird die Immunantwort erhöht werden, wenn das Vakzin außerdem eine Adjuvans-Substanz umfasst.
Verschiedene Verfahren zum Erreichen einer Adjuvanswirkung für das Vakzin sind bekannt. Allgemeine Prinzipien und Verfahren sind in "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (Hrsg.), John Wiley & Sons Ltd., ISBN 0-471-95170-6, und außerdem in "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, welche hierdurch beide durch Referenz hierin inkorporiert sind, detailliert beschrieben.
Es ist insbesondere bevorzugt, ein Adjuvans zu verwenden, von dem gezeigt werden kann, dass es das Durchbrechen der Autotoleranz gegenüber Autoantigenen ermöglicht; tatsächlich ist dies in Fällen essentiell, wo unmodifizierter OPGL als der aktive Bestandteil in dem Autovakzin verwendet wird. Nicht-limitierende Beispiele geeigneter Adjuvantien sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Immun-Targeting-Adjuvans; einem immunmodulierenden Adjuvans, wie z.B. ein Toxin, ein Cytokin und ein mykobakterielles Derivat; einer Öl-Formulierung; einem Polymer; einem Micellen-bildenden Adjuvans; einem Saponin; einer Immun-stimulierenden Komplexmatrix (ISCOM-Matrix); einem Partikel; DDA; Aluminium-Adjuvantien; DNA-Adjuvantien; γ-Inulin; und einem einkapselnden Adjuvans. Im Allgemeinen sollte angemerkt werden, dass die obigen Offenbarungen, welche sich auf Verbindungen und Mittel beziehen, welche als erste, zweite und dritte Anteile in den Analoga verwendbar sind, sich mutatis mutandis außerdem auf ihre Verwendung in dem Adjuvans eines erfindungsgemäßen Vakzins beziehen.
Die Anwendung von Adjuvantien umfasst die Verwendung von Mitteln, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder -phosphat (Alaun), im Allgemeinen als 0,05- bis 0,1-%ige Lösung in gepufferter Salzlösung verwendet, eine Beimischung mit synthetischen Polymeren von Zuckern (z.B. Carbopol^®), verwendet als 0,25-%ige Lösung, und beide, sowohl Aggregation des Proteins in dem Vakzin durch Hitzebehandlung mit Temperaturen im Bereich zwischen 70° und 101°C für Zeiträume von 30 Sekunden bis 2 Minuten, als auch Aggregation mittels quervernetzenden Mitteln sind möglich. Aggregation durch Reaktivierung mit Pepsin-behandelten Antikörpern (Fab-Fragmente) an Albumin, das Mischen mit bakteriellen Zellen, wie z.B. C. parvum oder Endotoxinen oder Lipopolysaccharid-Komponenten von gram-negativen Bakterien, Emulsion in physiologisch annehmbaren Öl-Vehikeln, wie z.B. Mannidmonooleat (Aracel A), oder Emulsion mit einer 20-%igen Lösung eines Perfluorcarbons (Fluosol-DA), verwendet als ein Blockersatz ("block substitute"), können außerdem eingesetzt werden. Vermischung mit Ölen, wie z.B. Squalen und IFA, ist außerdem bevorzugt.
Gemäß der Erfindung ist DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid) ein interessanter Kandidat für ein Adjuvans, genauso wie DNA und γ-Inolin, aber auch Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans sowie Quillaja-Saponine, wie z.B. QuilA und QS21, sind interessant, genau wie RIBI. Weitere Möglichkeiten sind Monophosphoryl-Lipid A (MPL), die oben genannten C3 und C3d und Muramyldipeptid (MDP).
Von Liposomen-Formulierungen ist außerdem bekannt, dass sie Adjuvanswirkungen verleihen und folglich sind Liposom-Adjuvantien gemäß der Erfindung bevorzugt.
Außerdem sind Adjuvantien vom Immun-stimulatorischen Komplexmatrix-Typ (ISCOM^®-Matrix) bevorzugte Auswahlen gemäß der Erfindung, insbesondere da gezeigt worden ist, dass dieser Typ von Adjuvantien in der Lage ist, die MHC-Klasse II-Expression durch APCs hoch zu regulieren. Eine ISCOM^®-Matrix besteht aus (wahlweise fraktionierten) Saponinen (Triterpenoiden) von Quillaja saponaria, Cholesterin und Phospholipid. Wenn mit dem immunogenen Protein gemischt, ist die daraus hervorgehende partikuläre Formulierung das, was als ISCOM-Partikel bekannt ist, wobei das Saponin 60–70% Gew./Gew., das Cholesterin und Phospholipid 10–15% Gew./Gew. und das Protein 10–15% Gew./Gew. ausmacht. Details, die sich auf Zusammensetzung und Verwendung von Immun-stimulierenden Komplexen beziehen, können beispielsweise in den oben genannten Lehrbüchern, die sich mit Adjuvantien befassen, gefunden werden, aber auch Morein B. et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461–475, sowie Barr I. G. und Mitchell G. F., 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8–25 (beide hierin durch Referenz inkorporiert), stellen nützliche Instruktionen für die Herstellung von kompletten Immunstimulierenden Komplexen bereit.
Eine andere hochinteressante (und folglich bevorzugte) Möglichkeit zum Erreichen einer Adjuvanswirkung ist, die Technik einzusetzen, die in Gosselin et al., 1992 (welche hierin durch Referenz inkorporiert ist) beschrieben ist. Kurz gesagt, kann die Präsentation von einem relevanten Antigen, wie z.B. einem Antigen der vorliegenden Erfindung, durch Konjugieren des Antigens an Antikörper (oder Antigen-bindende Antikörperfragmente) gegen die FCγ-Rezeptoren auf Monozyten/Makrophagen verstärkt werden. Insbesondere ist von Konjugaten zwischen Antigen und Anti-FCγ-RNI gezeigt worden, dass sie Immunogenität für die Zwecke von Impfung verstärken.
Andere Möglichkeiten beziehen die Verwendung von Targeting- und immunmodulierenden Substanzen (u.a. Cytokine), die oben als Kandidaten für den ersten und zweiten Anteil in den modifizierten Analoga erwähnt sind, ein. In diesem Zusammenhang sind auch synthetische Induktoren von Cytokinen, wie Poly-I:C, Möglichkeiten.
Geeignete mykobakterielle Derivate werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Muramyldipeptid, vollständigem Freund'schen Adjuvans, RIBI und einem Diester aus Trehalose, wie TDM und TDE.
Geeignete Immun-Targeting-Adjuvantien werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CD40-Ligand und CD40-Antikörpern oder spezifisch bindenden Fragmenten davon (vgl. die obige Diskussion), Mannose, einem Fab-Fragment und CTLA-4.
Geeignete Polymer-Adjuvantien werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenhydraten, wie z.B. Dextran, PEG, Stärke, Mannan und Mannose; einem Kunststoffpolymer zum Beispiel; und Latex, wie z.B. Latexkügelchen.
Ein noch weiterer interessanter Weg, eine Immunantwort zu modulieren, ist es, das OPGL-Immunogen (optional zusammen mit Adjuvans und pharmazeutisch annehmbaren Trägern bzw. Carriern und Vehikeln) in einen "virtuellen Lymphknoten" (VLN, "virtual lymph node") einzuschließen (ein geschütztes medizinisches Gerät, entwickelt von ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). Der VLN (ein dünnes, röhrenförmiges Gerät) ahmt die Struktur und Funktion eines Lymphknoten nach. Insertion eines VLN unter die Haut erzeugt eine Stelle einer sterilen Entzündung mit einem Anstieg von Cytokinen und Chemokinen. T- und B-Zellen sowie APCs reagieren rasch auf die Gefahrensignale, richten sich auf die entzündete Stelle und akkumulieren im Inneren der porösen Matrix des VLN. Es ist gezeigt worden, dass die notwendige Antigen-Dosis, erforderlich, um eine Immunantwort gegen ein Antigen zu entwickeln, reduziert ist, wenn der VLN verwendet wird, und dass Immunschutz, verliehen durch Impfung unter Verwendung eines VLN, konventionelle Immunisierung unter Verwendung von Ribi als ein Adjuvans übertraf. Die Technologie ist u.a. kurz in Gelber C. et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node" in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12.–15. Oktober 1998, Seascape Resort, Aptos, California," beschrieben.
Man erwartet, dass das Vakzin 1–6 Mal pro Jahr, wie z.B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Mal pro Jahr, an ein Individuum, das diese benötigt, verabreicht werden sollte. Früher ist gezeigt worden, dass die durch die Verwendung der bevorzugten Autovakzine gemäß der Erfindung induzierte Gedächtnisimmunität nicht permanent ist, und deshalb muss das Immunsystem periodisch mit dem OPGL oder modifizierten OPGL-Polypeptiden herausgefordert werden.
Aufgrund der genetischen Variation können verschiedene Individuen mit Immunantworten variierender Stärke auf dasselbe Polypeptid reagieren. Daher kann das erfindungsgemäße Vakzin mehrere unterschiedliche Polypeptide umfassen, um die Immunantwort zu erhöhen, vgl. außerdem die obenstehende Diskussion, betreffend die Auswahl der Einführungen fremder T-Zell-Epitope. Das Vakzin kann zwei oder mehr Polypeptide umfassen, wobei alle Polypeptide wie oben definiert sind.
Das Vakzin kann dementsprechend 3–20 verschiedene modifizierte oder nicht-modifizierte Polypeptide, wie z.B. 3–10 verschiedene Polypeptide, umfassen.
Nucleinsäure-Impfung
Als eine Alternative zur klassischen Verabreichung eines Peptid-basierenden Vakzins bietet die Technologie der Nucleinsäure-Impfung (auch als "Nucleinsäure-Immunisierung", "genetische Immunisierung" und "Gen-Immunisierung" bekannt) eine Anzahl attraktiver Eigenschaften.
Als Erstes erfordert, im Gegensatz zum traditionellen Vakzin-Ansatz, Nucleinsäure-Impfung keine Rohstoff-verbrauchende Produktion des immunogenen Mittels in großem Maßstab (z.B. in der Form einer Fermentation im industriellen Maßstab von Mikroorganismen, die modifizierten OPGL produzieren). Ferner besteht kein Bedürfnis nach Gerätereinigung und Rückfaltungsschemata für das Immunogen. Und schließlich erwartet man, da sich Nucleinsäure-Impfung auf den biochemischen Apparat des geimpften Individuums verlässt, um das Expressionsprodukt der eingeführten Nucleinsäure zu produzieren, optimales posttranslationales Prozessieren des Expressionsprodukts; dies ist insbesondere im Fall von Autovakzinierung wichtig, da, wie oben erwähnt, ein signifikanter Anteil der ursprünglichen OPGL-B-Zell- Epitope im modifizierten Molekül erhalten sein sollte, und weil B-Zell-Epitope im Prinzip aus Teilen von einem beliebigen (Bio-)molekül (z.B. Kohlenhydrat, Lipid, Protein, etc.) gebildet werden können. Daher können native Glykosylierungs- und Lipidmuster des Immunogens sehr wohl für die Gesamt-Immunogenität von Bedeutung sein, und dies wird am besten sichergestellt, indem man den Wirt das Immunogen produzieren lässt.
Daher stützt sich eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung auf die auslösende Präsentation von modifiziertem OPGL gegenüber dem Immunsystem durch Einführen von Nucleinsäure(n), codierend das modifizierte OPGL, in die Zellen des Tiers und dadurch das Erhalten von in vivo-Expression der eingefügten Nucleinsäure(n) durch die Zellen.
In dieser Ausführungsform ist die eingeführte Nucleinsäure bevorzugt DNA, welche in Form von nackter DNA, DNA, formuliert mit geladenen oder ungeladenen Lipiden, DNA, formuliert in Liposomen, DNA, eingeschlossen in einen viralen Vektor, DNA, formuliert mit einem Transfektions-erleichternden Protein oder Polypeptid, DNA, formuliert mit einem Targeting-Protein oder -Polypeptid, DNA, formuliert mit Calcium-präzipitierenden Mitteln, DNA, gekoppelt an ein inertes Trägermolekül, DNA und DNA, eingekapselt mit Chitin oder Chitosan, formuliert mit einem Adjuvans, vorliegen kann. In diesem Zusammenhang wird angemerkt, dass praktisch alle Überlegungen, die die Verwendung von Adjuvantien in traditionellen Impfstoff-Formulierungen betreffen, für die Formulierung von DNA-Vakzinen zutreffen. Folglich treffen alle Offenbarungen hierin, welche die Verwendung von Adjuvantien im Zusammenhang mit Polypeptid-basierten Vakzinen betreffen, mutatis mutandis auf ihre Verwendung bei der Nucleinsäure-Impftechnologie zu.
Was Verabreichungswege und Verabreichungsschemata Polypeptid-basierter Impfstoffe betrifft, welche oben im Detail beschrieben worden sind, so sind diese außerdem für die Nucleinsäure-Impfstoffe der Erfindung anwendbar, und alle obigen Diskussionen, betreffend Verabreichungswege und Verabreichungsschemata für Polypeptide, treffen mutatis mutandis auch auf Nucleinsäuren zu. Diesem sollte hinzugefügt werden, dass Nucleinsäure-Impfstoffe geeignet intravenös und intraarteriell verabreicht werden können. Ferner ist im Fachgebiet wohlbekannt, dass Nucleinsäure-Impfungen durch Verwendung einer sogenannten Genkanone verabreicht werden können, und folglich werden auch diese Art und äquivalente Arten der Verabreichung als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Schließlich wurde berichtet, dass auch die Verwendung eines VLN bei der Verabreichung von Nucleinsäuren gute Ergebnisse ergibt, und folglich ist diese spezielle Art von Verabreichung besonders bevorzugt.
Ferner kann/können die als Immunisierungsmittel verwendete(n) Nucleinsäure(n) Regionen enthalten, die den ersten, zweiten und/oder dritten Anteil codieren, z.B. in der Form der immunmodulierenden Substanzen, die oben beschrieben sind, wie z.B. die als verwendbare Adjuvantien diskutierten Cytokine. Eine bevorzugte Version dieser Ausführungsform umfasst, dass man die codierende Region für das Analogon und die codierende Region für den Immunmodulator in unterschiedlichen Leserahmen hat oder wenigstens unter der Kontrolle verschie dener Promotoren. Folglich wird vermieden, dass das Analogon oder Epitop als ein Fusionspartner mit dem Immunmodulator hergestellt wird. Alternativ können zwei unterschiedliche Nucleotidfragmente verwendet werden, aber dies ist weniger bevorzugt, aufgrund des Vorteils von gewährleisteter Co-Expression, wenn man beide codierenden Regionen in demselben Molekül eingeschlossen hat.
Dementsprechend betrifft die Erfindung außerdem die Verwendung einer Zusammensetzung für das Induzieren von Antikörperproduktion gegen OPGL, wobei die Zusammensetzung umfasst

– ein oben diskutiertes Nucleinsäurefragment oder einen oben diskutierten Vektor, und
– einen/ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren/annehmbares Träger und/oder Vehikel und/oder Adjuvans,

Unter normalen Umständen wird die eine OPGL-Variante codierende Nucleinsäure in der Form eines Vektors eingeführt, wobei Expression unter Kontrolle eines viralen Promotors ist. Für detailliertere Diskussionen von erfindungsgemäßen Vektoren vgl. die untenstehende Diskussion. Außerdem sind detaillierte Offenbarungen bezüglich der Formulierung und Verwendung von Nucleinsäure-Vakzinen verfügbar, vgl. Donnelly J. J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617–648, und Donnelly J. J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163–172. Beide dieser Referenzen sind hierin durch Referenz inkorporiert.
Lebend-Impfstoffe
Eine dritte Alternative für eine auflösende Präsentation von modifiziertem OPGL gegenüber dem Immunsystem ist die Verwendung von Lebend-Impfstoff-Technologie. Bei der Lebend-Impfung wird Präsentation gegenüber dem Immunsystem durch das Verabreichen eines nicht-pathogenen Mikroorganismus, welcher mit einem Nucleinsäurefragment, codierend ein modifiziertes OPGL, oder mit einem Vektor, der so ein Nucleinsäurefragment enthält, transformiert worden ist, an das Tier bewirkt. Der nicht-pathogene Mikroorganismus kann ein beliebiger, geeignet attenuierter Bakterienstamm (attenuiert mittels Passagierung oder mittels Entfernen von pathogenen Expressionsprodukten durch rekombinante DNA-Technologie) sein, z.B. Mycobacterium bovis BCG., nicht-pathogenes Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. Reviews, die sich mit den nach dem neuesten Stand der Technik hergestellten Lebend-Vakzinen befassen, können z.B. in Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492–1496, und Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977–990, beide hierin durch Referenz inkorporiert, gefunden werden. Für Details über die in solchen Lebend-Impfstoffen verwendeten Nucleinsäurefragmente und Vektoren vgl. die untenstehende Diskussion.
Als eine Alternative zu bakteriellen Lebend-Impfstoffen kann das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment, das unten diskutiert wird, in einen nicht-virulenten viralen Vakzin-Vektor, wie z.B. einen Vaccinia-Stamm oder einen beliebigen anderen Pockenvirus, eingeschlossen werden.
Normalerweise wird der nicht-pathogene Mikroorganismus oder das nicht-pathogene Virus dem Tier nur einmal verabreicht, aber in bestimmten Fällen kann es notwendig sein, den Mikroorganismus mehr als einmal im Leben zu verabreichen, um schützende Immunität aufrecht zu erhalten. Es wird sogar erwägt, dass Immunisierungsschemata, wie jene, die oben im Detail für Polypeptid-Impfung beschrieben sind, nützlich sein werden, wenn Lebend- oder Virus-Impfstoffe verwendet werden.
Alternativ wird Lebend- oder Virus-Impfung mit vorangehender oder nachfolgender Polypeptid- und/oder Nucleinsäure-Impfung kombiniert. Beispielsweise ist es möglich, primäre Immunisierung mit einem Lebend- oder Virus-Impfstoff zu bewirken, gefolgt von nachfolgenden Wiederholungs ("booster")-Immunisierungen unter Verwendung der Polypeptid- oder Nucleinsäure-Vorgehensweise.
Der Mikroorganismus oder das Virus können mit Nucleinsäure(n), enthaltend Regionen, codierend den 1., 2. und/oder 3. Anteil, z.B. in der Form der immunmodulierenden Substanzen, die oben beschrieben sind, wie z.B. die als verwendbare Adjuvantien diskutierten Cytokine, transformiert werden. Eine bevorzugte Version dieser Ausführungsform umfasst, dass man die codierende Region für das Analogon und die codierende Region für den Immunmodulator auf verschiedenen Leserahmen oder wenigstens unter der Kontrolle verschiedener Promotoren hat. Dadurch wird vermieden, dass das Analogon oder die Epitope als Fusionspartner an den Immunmodulator produziert werden. Alternativ können zwei unterschiedliche Nucleotidfragmente als transformierende Mittel verwendet werden. Natürlich kann es ein erfindungsgemäßes Analogon als ein Expressionsprodukt bereitstellen, wenn man den 1. und/oder 2. und/oder 3. Anteil im gleichen Leserahmen hat, und solch eine Ausführungsform ist besonders bevorzugt gemäß der vorliegenden Erfindung.
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Krankheitsbehandlung
Wie es von den obigen Diskussionen gewürdigt werden wird, erlaubt das Bereitstellen der Erfindung die Kontrolle von Krankheiten, charakterisiert durch übermäßigen Verlust an Knochenmasse. In diesem Zusammenhang ist die Krankheit Osteoporose das Hauptziel ("key target") für das erfindungsgemäße Verfahren, aber auch Knochenverlust, assoziiert mit komplizierten Knochenfrakturen, ist ein denkbares Ziel für Behandlung/Besserung. Folglich ermöglicht eine wichtige Ausführungsform der Erfindung zum Herabregulieren von OPGL-Aktivität das Behandeln und/oder Verhindern und/oder Verbessern von Osteoporose oder anderen, durch übermäßige Knochenresorption charakterisierten Zuständen, wobei das Verfahren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Herabregulierung von OPGL-Aktivität in einem solchen Ausmaß umfasst, dass die Rate an Knochenresorption signifikant verringert wird.
Im vorliegenden Zusammenhang ist eine signifikante Verringerung bei der Knochenresorption wenigstens 3%, verglichen mit der pathologischen Rate, aber höhere Prozentsätze werden erwägt, wie z.B. wenigstens 5%, wenigstens 7%, wenigstens 9%, wenigstens 11%, wenigstens 13%, wenigstens 15% und wenigstens 17%, jedoch werden selbst höhere Prozentsätze erwartet, wie z.B. wenigstens 20% oder sogar wenigstens 30%. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die Verringerung der Knochenresorption in einer Umkehr der Bilanz zwischen Knochenbildung und Knochenresorption resultiert, d.h., dass die Rate an Knochenbildung dazu gebracht wird, die Rate an Knochenresorption zu übertreffen. Natürlich sollte dieses Ungleichgewicht nicht aufrecht erhalten werden (da es in Osteoperose resultieren würde), aber durch das sorgfältige Kontrollieren der Anzahl und des immunologischen Einflusses von Immunisierungen des Individuums, das dieser bedarf, ist es möglich, eine Balance über die Zeit zu erhalten, welche in einer Nettokonservierung der Knochenmasse resultiert. Alternativ kann, wenn bei einem Individuum das erfindungsgemäße Verfahren Knochenverlust nicht terminieren kann, das erfindungsgemäße Verfahren (optional in Kombination mit anderen bekannten Verfahren zum Reduzieren von Knochenverlust bei Osteoporose-Patienten) verwendet werden, um eine signifikante Reduktion des Knochenverlusts zu erhalten, wodurch die Zeit verlängert wird, in welcher dem Individuum ausreichend Knochenmasse vorliegt.
Verfahren zum Messen der Rate an Knochenresorption und Knochenbildung sind im Fachgebiet bekannt. Mittels biochemischer Assays ist es möglich, die Rate der Knochenresorption durch Messen der Konzentrationen gewisser Fragmente vom Collagen-Typ I zu beurteilen (vgl. WO 93/15107 und WO 93/14844). Alternativ kann die Rate des Knochenverlusts durch physikalische Mittel untersucht werden; repräsentative Offenbarungen von Verfahren zum Untersuchen von Knochenmasse durch nicht-invasive physikalische Verfahren im Fachgebiet können WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95114431 und WO 97/00643 gefunden werden.
Peptide Polypeptide und Zusammensetzungen der Erfindung
Wie von dem Obenstehenden ersichtlich sein wird, basiert die vorliegende Erfindung auf dem Konzept des Immunisierens von Individuen gegen das OPGL-Antigen, um indirekt eine reduzierte Osteoclasten-Aktivität zu erhalten. Der bevorzugte Weg, so eine Immunisierung zu erhalten, ist es, modifizierte Versionen von OPGL zu verwenden und dadurch Moleküle bereitzustellen, die zuvor noch nicht im Fachgebiet offenbart worden sind.
Es sollte angemerkt werden, dass bevorzugte modifizierte OPGL-Moleküle Modifikationen umfassen, die in einem Polypeptid resultieren, das eine Sequenzidentität von wenigstens 70% mit OPGL oder mit einer Teilsequenz davon von wenigstens 10 Aminosäuren Länge aufweist. Höhere Sequenzidentitäten sind bevorzugt, z.B. wenigstens 75% oder sogar wenigstens 80, 85, 90 oder 95%. Die Sequenzidentität für Proteine und Nucleinsäuren kann als (N_ref – N_dif)·100/N_ref berechnet werden, wobei N_dif die Gesamtzahl nicht-identischer Reste bei den zwei Sequenzen, wenn vergleichend angeordnet, ist, und wobei N_ref die Anzahl von Resten in einer der Sequenzen ist. Folglich wird die DNA-Sequenz AGTCAGTC eine Sequenzidentität von 75% mit der Sequenz AATCAATC (N_dif= 2 und N_ref = 8) haben.
Die Erfindung verwendet außerdem beim Ausüben der Erfindung verwendbare Zusammensetzungen. Folglich verwendet die Erfindung außerdem eine immunogene Zusammensetzung, umfassend eine immunogen wirksame Menge eines OPGL-Polypeptids, welches ein Eigen-Protein in einem Tier ist, wobei das OPGL-Polypeptid zusammen mit einem immunologisch annehmbaren Adjuvans formuliert ist, um die Autotoleranz des Tiers gegenüber dem OPGL-Polypeptid zu brechen, wobei die Zusammensetzung ferner ein/einen pharmazeutisch und immunologisch annehmbares/en Verdünnungsmittel und/oder Vehikel und/oder Träger und/oder Exzipiens umfasst. In anderen Worten betrifft dieser Teil der Erfindung die Formulierungen von natürlich vorkommenden OPGL-Polypeptiden, die im Zusammenhang mit Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben worden sind.
Die Erfindung verwendet außerdem eine immunogene Zusammensetzung, umfassend eine immunologisch wirksame Menge eines oben definierten OPGL-Analogons, wobei die Zusammensetzung ferner ein/einen pharmazeutisch und immunologisch annehmbares/en Verdünnungsmittel und/oder Vehikel und/oder Träger und/oder Exzipiens und optional ein Adjuvans umfasst. In anderen Worten, betrifft dieser Teil der Erfindung Formulierungen von modifiziertem OPGL, im Wesentlichen wie oben beschrieben. Die Auswahl von Adjuvantien, Trägern und Vehikeln ist entsprechend im Einklang mit dem, was oben diskutiert worden ist, wenn auf die Formulierung von modifiziertem und nicht-modifiziertem OPGL für die Verwendung im erfinderischen Verfahren zur Herabregulierung von OPGL Bezug genommen wurde.
Die Polypeptide werden gemäß im Fachgebiet gut bekannter Verfahren hergestellt. Längere Polypeptide werden normalerweise mittels rekombinanter Gentechnologie hergestellt, was Einführen einer Nucleinsäuresequenz, codierend das OPGL-Analogon, in einen geeigneten Vektor, Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor, Expression der Nucleinsäuresequenz, Rückgewinnen des Expressionsprodukts aus den Wirtszellen oder ihrem Kulturüberstand und nachfolgende Reinigung und optional weiterer Modifikation, z.B. Rückfaltung oder Derivatisierung, einschließt.
Kürzere Peptide werden vorzugsweise mittels der gut bekannten Techniken der Fest- oder Flüssigphasen-Peptidsynthese hergestellt. Jedoch haben kürzliche Fortschritte in dieser Technologie die Produktion von Volllängen-Polypeptiden und Proteinen durch diese Mittel möglich gemacht, und folglich ist es außerdem im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die langen Konstrukte mit synthetischen Mitteln herzustellen.
Erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente und Vektoren
Von der oberstehenden Offenbarung wird verstanden werden, dass modifizierte OPGL-Polypeptide mittels rekombinanter Gentechnologie, aber außerdem mittels chemischer Synthese oder Semi-Synthese hergestellt werden können. Die letzten zwei Optionen sind insbesondere relevant, wenn die Modifikation in der Kopplung an Proteinträger (wie z.B. KLH, Diphterie toxoid, Tetanustoxoid und BSA) und nicht-proteinösen Molekülen, wie z.B. Kohlenhydratpolymeren, besteht, und natürlich außerdem, wenn die Modifikation die Addition von Seitenketten oder Seitengruppen an eine OPGL-Polypeptid-abgeleitete Peptidkette umfasst.
Zum Zwecke der rekombinanten Gentechnologie, und natürlich außerdem zum Zwecke von Nucleinsäure-Immunisierung, sind Nucleinsäurefragmente, die modifizierten OPGL codieren, wichtige chemische Produkte. Folglich verwendet ein wichtiger Teil der Erfindung ein Nucleinsäurefragment, welches ein OPGL-Analogon codiert, d.h., ein OPGL-abgeleitetes Polypeptid, welches entweder die natürliche OPGL-Sequenz, an welche ein Fusionspartner addiert oder eingefügt worden ist, oder, vorzugsweise, ein OPGL-abgeleitetes Polypeptid, worin ein fremdes T-Zell-Epitop mittels Insertion und/oder Addition, vorzugsweise mittels Substitution und/oder Deletion, eingefügt worden ist. Die Nucleinsäurefragmente der Erfindung sind entweder DNA- oder RNA-Fragmente.
Die Nucleinsäurefragmente werden normalerweise in geeignete Vektoren eingefügt, um Klonierungs- oder Expressionsvektoren zu bilden, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente tragen; solche neuen Vektoren sind außerdem Teil der Erfindung. Details betreffend die Konstruktion dieser erfindungsgemäßen Vektoren werden im Zusammenhang mit transformierten Zellen und Mikroorganismen unten diskutiert werden. Die Vektoren können, abhängig von Zweck und Typ der Anwendung, in der Form von Plasmiden, Phagen, Cosmiden, Mini-Chromosomen oder einem Virus sein, aber auch nackte DNA, die in gewissen Zellen nur transient exprimiert wird, ist ein wichtiger Vektor. Bevorzugte Klonierungs- und Expressionsvektoren der Erfindung sind zur autonomen Replikation imstande und ermöglichen dadurch hohe Kopienzahlen zum Zwecke der Expression in hohem Level oder Replikation im hohen Level für nachfolgendes Klonieren. Der allgemeine Umfang eines Vektors, der in der Erfindung verwendet wird, umfasst die folgenden Eigenschaften in der 5'-3'-Richtung und in funktioneller Verknüpfung: einen Promotor zum Steuern des erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragments, optional eine Nucleinsäuresequenz, codierend ein Leaderpeptid, das die Sekretion (zur extrazellulären Phase oder, wo zutreffend, in das Periplasma) des Polypeptidfragments oder die Integration des Polypeptidfragments in die Membran ermöglicht, das Nucleinsäurefragment der Erfindung und optional eine Nucleinsäuresequenz, die einen Terminator codiert. Wenn man mit Expressionsvektoren in Produktions-Stämmen oder -Zelllinien arbeitet, ist es zum Zwecke der genetischen Stabilität der transformierten Zellen bevorzugt, dass der Vektor, wenn eingefügt in eine Wirtszelle, in das Wirtszellgenom integriert wird. Im Gegensatz dazu ist es, wenn man mit Vektoren arbeitet, die für das Auslösen von in vivo-Expression in einem Tier verwendet werden sollen (d.h., wenn ein Vektor bei DNA-Impfung verwendet wird), aus Sicherheitsgründen bevorzugt, dass der Vektor nicht in der Lage ist, in das Wirtszellgenom integriert zu werden; typischerweise werden nackte DNA oder nicht-integrierende virale Vektoren verwendet, deren Auswahl dem Fachmann gut bekannt ist.
Die bei der Erfindung verwendeten Vektoren werden verwendet, um Wirtszellen zu transformieren, um das modifizierte OPGL-Polypeptid der Erfindung zu produzieren. Solche transformierten Zellen, welche außerdem Teil der Erfindung sind, können kultivierte Zellen sein oder Zelllinien, verwendet zur Vermehrung der erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente und Vektoren, oder verwendet zur rekombinanten Produktion des modifizierten OPGL-Polypeptids der Erfindung. Alternativ können die transformierten Zellen geeignete Lebend-Impfstoff-Stämme sein, wobei das Nucleinsäurefragment (eine einzelne Kopie oder multiple Kopien) so eingefügt worden sind, dass Sekretion oder Integration des modifizierten OPGL in die bakterielle Membran oder Zellwand bewirkt wird.
Bevorzugte, bei der Erfindung verwendete transformierte Zellen sind Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien (wie z.B. die Spezies Escherichia [z.B. E. coli], Bacillus [z.B. Bacillus subtilis], Salmonella oder Mycobacterium [vorzugsweise nicht-pathogen, z.B. M. bovis BCG]), Hefen (wie z.B. Saccharomyces cerevisiae) und Protozoen. Alternativ sind die transformierten Zellen von einem multizellulären Organismus, wie z.B. einem Pilz, einer Insektenzelle, einer Pflanzenzelle oder einer Säugerzelle abgeleitet. Am bevorzugtesten sind Zellen, die von einem Menschen abgeleitet sind, vgl. die untenstehende Diskussion von Zelllinien und Vektoren. Kürzliche Ergebnisse bei der Verwendung einer kommerziell erhältlichen Drosophila melanogaster-Zelllinie (die Schneider-2 (S₂)-Zelllinie und Vektorsystem, erhältlich von Invitrogen) für die rekombinante Produktion von Polypeptiden im Labor der Anmelderin waren sehr vielversprechend, und deshalb ist dieses Expressionssystem insbesondere bevorzugt.
Zum Zwecke der Klonierung und/oder optimierten Expression ist es bevorzugt, dass die transformierte Zelle in der Lage ist, das erfindungsgemäße Nucleinsäurefragment zu replizieren. Zellen, die das Nucleinfragment exprimieren, sind bevorzugte verwendbare Ausführungsformen der Erfindung; sie können zur Präparation des modifizierten OPGL in kleinem Maßstab oder großem Maßstab verwendet werden oder, im Falle nicht-pathogener Bakterien, als Vakzin-Bestandteile bei einem Lebend-Impfstoff.
Bei der Herstellung des modifizierten OPGL der Erfindung mittels transformierter Zellen ist es zweckdienlich, wenngleich bei weitem nicht essentiell, dass das Expressionsprodukt entweder hinaus in das Kulturmedium exportiert wird oder auf der Oberfläche der transformierten Zelle getragen wird.
Wenn eine effektive Produktionszelle identifiziert worden ist, ist es bevorzugt, auf deren Basis eine stabile Zelllinie zu etablieren, welche den erfindungsgemäßen Vektor trägt, und welche das Nucleinsäurefragment exprimiert, das den modifizierten OPGL codiert. Vorzugsweise sezerniert oder trägt diese stabile Zelllinie das erfindungsgemäße OPGL-Analogon und erleichtert dadurch dessen Reinigung.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Arten abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Zusammenhang mit den Wirten verwendet. Der Vektor besitzt für gewöhnlich eine Replikationsstelle so wie Markersequenzen, welche in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu ermöglichen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art abgeleitet ist (siehe z.B. Bolivar et al., 1977). Das pBR322-Plasmid enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher einfache Mittel zur Identifikation von transformierten Zellen bereit. Das PBR-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage muss außerdem Promotoren enthalten oder modifiziert sein, um Promotoren zu enthalten, welche von dem prokaryotischen Mikroorganismus zur Expression verwendet werden können.
Jene Promotoren, die bei der Konstruktion rekombinanter DNA am häufigsten verwendet werden, schließen die B-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) und ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 36 776) ein. Während diese die am häufigsten Verwendeten sind, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet, und Details, die ihre Nucleotidsequenzen betreffen, wurden veröffentlicht, was es einem Fachmann ermöglicht, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (Siebwenlist et al., 1980). Bestimmte Gene von Prokaryoten können in E. coli effizient von ihren eigenen Promotorsequenzen exprimiert werden, was das Bedürfnis nach Addition eines anderen Promotors durch künstliche Mittel ausschließt.
Zusätzlich zu Prokaryoten können außerdem eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, verwendet werden, und hier sollte der Promotor in der Lage sein, die Expression zu steuern. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Bäckerhefe ist der unter eukaryotischen Mikroorganismen am häufigsten verwendete, obwohl eine Anzahl anderer Stämme kommerziell verfügbar sind. Für die Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid Yrp7 häufig verwendet (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, welches für einen mutanten Hefestamm, dem das Vermögen fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977), einen Selektionsmarker bereitstellt. Das Vorhandensein der trp1-Läsion als ein Charakteristikum des Hefe-Wirtszell-Genoms bietet dann eine effektive Umgebung zum Detektieren von Transformation mittels Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die Terminationssequenzen, die mit diesen Genen assoziiert sind, ebenfalls 3' von der gewünschten Sequenz gelegen, die exprimiert werden soll, in den Expressionsvektor ligiert, um Polyadenylierung der mRNA und Termination zu gewährleisten.
Andere Promotoren, welche den zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen kontrollierter Transkription aufweisen, sind die Promotorregion für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, degradierende Enzyme, die mit dem Stickstoff-Stoffwechsel in Verbindung stehen, und die zuvor genannte Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Nutzung verantwortlich sind. Jeder Plasmidvektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, einen Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen als Wirte verwendet werden, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind. Im Prinzip kann jede solche Zellkultur verwendet werden, ob sie nun von Vertebraten- oder Invertebraten-Kultur stammt. Das Interesse war jedoch am größten bei Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde in den jüngsten Jahren ein Routineverfahren (Tissue Culture, 1973). Beispiele solcher nützlicher Wirtszelllinien sind VERO und HeLa-Zellen, CHO ("Chinese hamster ovary")-Zelllinien und W138-, BHK-, COS-7 293-Zelllinien, Spodoptera frugiperda (SF)-Zellen (kommerziell erhältlich als komplette Expressionssysteme von u.a. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA, und von Invitrogen) und MDCK-Zelllinien. Bei der vorliegenden Erfindung ist eine besonders bevorzugte Zelllinie S₂, erhältlich von Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Niederlande.
Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen für gewöhnlich (wenn dies notwendig ist) einen Replikationsursprung, einen Promotor, der sich vor dem zu exprimierenden Gen befindet, zusammen mit irgendwelchen notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminatorsequenzen.
Zur Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressionsvektoren oft von viralem Material bereitgestellt. Allgemein verwendete Promotoren sind beispielsweise von Polyoma, Adenovirus 2, und am häufigsten Affenvirus 40 (SV40, "Simian Virus 40") abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders nützlich, da beide recht einfach als Fragment aus dem Virus gewonnen werden können, welches auch den viralen Replikationsursprung von SV40 enthält (Fiers et al., 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die sich von der HindIII-Schnittstelle bis zur BglI-Schnittstelle erstreckt, lokalisiert im viralen Replikationsursprung, ist davon umfasst. Weiterhin ist es auch möglich und oft wünschenswert, Promotor- oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise der gewünschten Gensequenz zugeordnet sind, vorausgesetzt, solche Kontrollsequenzen sind mit dem Wirtszellsystemen kompatibel.
Ein Replikationsursprung kann entweder bereitgestellt werden, indem der Vektor so konstruiert ist, dass er einen exogenen Replikationsursprung enthält, wie er von SV40 oder anderen Viren abgeleitet sein kann (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV), oder er kann von dem chromosomalen Replikationsmechanismus bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist Letzteres oft ausreichend.
Identifikation verwendbarer OPGL-Analoga
Es wird dem Fachmann klar sein, dass nicht alle möglichen Varianten oder Modifikationen von nativem OPGL das Vermögen haben werden, Antikörper in einem Tier auszulösen, welche kreuzreaktiv mit der nativen Form sind. Es ist jedoch nicht schwierig, eine wirksame Standarddurchmusterung für modifizierte OPGL-Moleküle aufzustellen, welche die minimalen Erfordernisse für hierin diskutierte immunologische Reaktivität erfüllen. Folglich betrifft ein weiterer Teil der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten OPGL-Polypeptids, das fähig ist, Antikörper gegen nicht-modifizierten OPGL in einer Tierspezies, in der das nicht-modifizierte OPGL-Polypeptid ein Eigen-Protein ist, zu induzieren, wobei das Verfahren umfasst:

– mit Hilfe der Peptidsynthese oder Gentechnologie Herstellung eines Sets von untereinander verschiedenen, modifizierten OPGL-Polypeptiden, in denen Aminosäuren in die Aminosäuresequenz eines OPGL-Polypeptids der Tierspezies angefügt, insertiert, daraus deletiert oder darin substituiert wurden, wodurch Amionsäuresequenzen in dem Satz erhalten wurden, die T-Zell-Epitope umfassen, welche für die Tierspezies fremd sind, oder Herstellen eines Satzes von Nucleinsäurefragmenten, die für den Satz untereinander verschiedener, modifizierter OPGL-Polypeptide codieren,
– Testen von Mitgliedern des Sets modifizierter OPGL-Polypeptide oder Nucleinsäurefragmente auf ihre Fähigkeit, die Produktion von Antikörpern gegen den nicht-modifizierten OPGL durch die Tierspezies zu induzieren, und
– Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren des Mitglieds (der Mitglieder) des Sets modifizierter OPGL-Polypeptide, das/die eine Antikörperproduktion gegen nicht-modifizierten OPGL in der Spezies signifikant induziert/induzieren, oder Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren der Polypeptidexpressionsprodukte, die durch Mitglieder des Sets von Nucleinsäurefragmenten codiert werden, die eine Antikörperproduktion gegen nicht-modifizierten OPGL in der Tierspezies signifikant induzieren.

In diesem Zusammenhang ist das "Set von untereinander verschiedenen modifizierten OPGL-Polypeptiden" eine Sammlung von nicht-identischen, modifizierten OPGL-Polypeptiden, die z.B. auf Basis der oben diskutierten Kriterien (z.B. in Kombination mit Studien von Zirkular-Dichroismus, NMR-Spektren und/oder Röntgenstrahlenbeugungsmustern) ausgewählt worden sind. Das Set kann aus nur ein paar Mitgliedern bestehen, es wird jedoch erwägt, dass das Set einige hundert Mitglieder enthalten kann.
Der Test von Mitgliedern des Sets kann letztlich in vivo durchgeführt werden, es kann jedoch eine Anzahl von in vitro-Tests angewendet werden, welche die Anzahl modifizierter Moleküle eingrenzen, welche dem Zweck der Erfindung dienen werden.
Nachdem das Ziel des Einführens fremder T-Zell-Epitope ist, die B-Zell-Antwort mit T-Zell-Hilfe zu unterstützen, ist eine Voraussetzung, dass durch den modifizierten OPGL T-Zell-Proliferation induziert wird. T-Zell-Proliferation kann durch standardisierte Proliferations-Assays in vitro getestet werden. Kurz gesagt wird eine für T-Zellen angereicherte Probe aus einem Subjekt erhalten und nachfolgend in Kultur gehalten. Die kultivierten T-Zellen werden mit APCs des Subjekts, welche zuvor das modifizierte Molekül aufgenommen haben und prozessiert haben, um dessen T-Zell-Epitope zu präsentieren, in Kontakt gebracht. Die Proliferation von T-Zellen wird verfolgt und mit einer geeigneten Kontrolle (z.B. T-Zellen in Kultur, kontaktiert mit APCs, welche intakten nativen OPGL prozessiert haben) verglichen. Alternativ kann Proliferation gemessen werden, indem man die Konzentration relevanter Cytokine bestimmt, die von den T-Zellen als Antwort auf ihre Erkennung fremder T-Zellen freigesetzt wurden.
Wenn weitgehend sichergestellt worden ist, dass wenigstens ein modifizierter OPGL von beiden Arten an Sets fähig ist, Antikörperproduktion gegen OPGL zu induzieren, ist es möglich, eine immunogene Zusammensetzung herzustellen, die wenigstens ein modifiziertes OPGL-Polypeptid umfasst, welches in der Lage ist, Antikörper gegen nicht-modifizierten OPGL in einer Tierspezies zu induzieren, in der nicht-modifiziertes OPGL-Polypeptid ein Eigen-Protein ist, wobei das Verfahren das Vermischen des Mitgliedes (der Mitglieder) des Sets, das eine Produktion von Antikörpern in der Tierspezies deutlich induziert, welche mit OPGL reaktiv sind, mit einem pharmazeutisch oder immunologisch annehmbaren Träger und/oder Vehikel und/oder Verdünnungsmittel und/oder Exzipiens, gegebenenfalls in Kombination mit wenigstens einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Adjuvans, umfasst.
Die obigen Aspekte der Erfindung, betreffend den Test von Sets an Polypeptiden, werden in geeigneter Weise durchgeführt, indem anfänglich eine Anzahl untereinander verschiedener Nucleinsäuresequenzen oder Vektoren der Erfindung hergestellt werden, diese in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, geeignete Wirtszellen mit den Vektoren transformiert werden und die Nucleinsäuresequenzen der Erfindung exprimiert werden. Diese Schritte können von Isolation der Expressionsprodukte gefolgt werden. Es wird bevorzugt, dass die Nucleinsäuresequenzen und/oder Vektoren durch Verfahren, umfassend das Gebrauchen einer molekularen Amplifikationstechnik, wie z.B. PCR, oder mittels Nucleinsäuresynthese hergestellt werden.
BEISPIELE
Es ist entschieden worden, cDNAs, codierend murinen und humanen OPGL, in der verkürzten Version, umfassend Aminosäurereste 158–316 im Falle von murinem OPGL und Reste 159–317 im Fall von humanem OPGL (die Zahlen korrespondieren zu der Nummerierung in SEQ ID NOs: 2 bzw. 4), zu klonieren oder synthetisieren. Weil diese verkürzten Versionen biologische Aktivität aufweisen, ist es logisch, die Autoantikörper gegen diesen Teil von OPGL zu richten. Zusätzlich macht es die Proteine kleiner und folglich leichter zu handhaben.
Eine synthetische cDNA, codierend die murinen OPGL-Reste 158–316, ist synthetisiert worden, indem suboptimale Escherichia coli- und Pichia pastoris-Kodons von der publizierten Sequenz entfernt wurden. Zusätzlich sind ein N-terminaler Histidin-Anhang (tag), ein Teil der Spaltstelle der Paarungsfaktor alpha-Signalsequenz von Saccharomyces cerevisiae, und geeignete Restriktionsenzyme in den offenen Leserahmen eingebaut worden (vgl. SEQ ID NO: 7).
Diese cDNA, codierend murinen Wildtyp-OPGL, wurde in einen Standard-Escherichia coli-Expressionsvektor (pTrc99a) unter Verwendung der Restriktionsenzyme BspHI und HindIII und eines Standard-Klonierungsvektors (pBluescript KS+) unter Verwendung der Restriktionsenzyme SacI und KpnI kloniert (was SEQ ID NO: 9 ergab).
Expression in Escherichia coli-Zellen resultierte in ungefähr 30% rekombinantem OPGL des gesamten Escherichia coli-Proteins. Das Protein wurde unter Verwendung der folgenden Vorgehensweise neu gefaltet und gereinigt:

1. Zellen werden durch Zentrifugation geerntet.
2. Zellen werden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert und zentrifugiert.
3. Der Überstand wird verworfen, und die Zellen werden in drei Volumina (100 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 5 mM Dithiotreitol (DTT), 0,5 mM NaCl, pH 8,0) resuspendiert.
4. Zu den Zellen werden zu 8 μl 50 mM PMSF und 80 μl Lysozym (10 mg/ml) pro Gramm Zellen gegeben und sie werden bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubiert.
5. Für jedes Gramm Zellpellet werden 4 mg Desoxychlorsäure zugegeben und die Suspension bei 37°C inkubiert, bis sie viskos erscheint.
6. 20 μl DNase (1 mg/ml) pro Gramm Zellgewicht werden zugegeben und MgCl₂ auf 5 mM, und die Suspension wird 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Die Suspension wird auf Eis mit Ultraschall behandelt, bis die Viskosität verschwindet.
8. Nach Zentrifugation (20000 × g, 30 min) wird das Pellet in H₂O resuspendiert, zentrifugiert und in 3 ml 1 M Harnstoff pro Gramm Zellgewicht resuspendiert.
9. Nach Zentrifugation (20000 × g, 30 min) wird das Pellet in 1 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, pH 7,5, resuspendiert.
10. Nach Zentrifugation (20000 × g, 30 min) wird das Pellet in 6 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 5% Ethanol, 1% beta-Mercaptoethanol, pH 8,0, resuspendiert und bei 4°C über Nacht gerührt.
11. Nach Zentrifugation (40000 × g, 1–4 Stunden) wird der Überstand filtriert und bei –20°C gelagert.
12. Die solubilisierten Einschlusskörper ("inclusion bodies") werden durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Superdex 200-Material (Pharmacia) abgetrennt.
13. Die Fraktionen, die den rekombinanten OPGL enthalten, werden vereinigt bzw. gepoolt und mit 1,5 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 1 mM DTT, pH 7,5, auf 0,1 mg/ml verdünnt.
14. Das Material wird über Nacht bei 4°C gegen 10 Volumina 1,5 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 1 mM DTT, pH 7,5, dialysiert.
15. Das Material wird über Nacht bei 4°C gegen 10 Volumina 1,0 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 1 mM DTT, pH 7,5, dialysiert.
16. Das Material wird über Nacht bei 4°C gegen 10 Volumina 0,5 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 1 mM DTT, pH 7,5, dialysiert.
17. Das Material wird über Nacht bei 4°C gegen 10 Volumina 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 150 mM Arginin, 1 mM DTT, pH 7,5, dialysiert.
18. Das Material wird über Nacht bei 4°C gegen 10 Volumina 20 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid, 150 mM Arginin, pH 7,5, dialysiert.
19. Das neu gefaltete Material wird gefriergetrocknet und bei –20°C gelagert.

Die Neufaltungseffizienz unter Verwendung dieser Vorgehensweise ist ungefähr 40% und die Reinheit über 65%. Das Reinigungsverfahren und der Neufaltungsprozess unterliegen nach wie vor weiteren Verbesserungen. Immobilisiertes Neufalten wird untersucht. Das enzymatische Entfernen des Histidin-Anhangs wird im Wesentlichen wie von Pedersen et al., 1999, beschrieben durchgeführt. Die Beschaffenheit des rekombinanten Proteins wurde unter Verwendung von SDS-PAGE, N-terminalem Sequenzieren, Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie charakterisiert und verifiziert.
Eine Cystein-Substitutionsmutante des murinen Wildtyp-OPGL ist in Konstruktion (wobei ein Cystein, korrespondierend zu Aminosäurerest in SEQ ID, NO: 4 mit Serin substituiert ist; vgl. SEQ ID NOs: 11 und 12). Dies wird durchgeführt, um potentielle Stabilitätsprobleme mit dem gereinigten rekombinanten Protein zu eliminieren. Diese mutierte OPGL-Verkürzung wird in vollständiger Analogie mit der untenstehenden Beschreibung, welche von der DNA, die SEQ ID NO: 9 aufweist, ausgeht, als Basis für Vakzin-Konstrukte dienen. Ferner wird auch eine korrespondierende Cys → Ser-Mutante (in der Cys-221 substituiert ist) von humanem OPGL für dieselben Zwecke hergestellt werden.
Die Vakzin-Moleküle werden ursprünglich durch Insertion oder In-Substitution von entweder dem P2- oder P30-Epitop von Tetanustoxoid bei ausgewählten Positionen konstruiert. Andere geeignete immundominante T-Zell-Epitope können bei einer späteren Stufe verwendet werden.
Die ausgewählten Positionen für die Einführung von Variationen werden, basierend auf Wissen über existierende oder vorhergesagte B-Zell-Epitope und vorhergesagte Sekundärstrukturelemente des nativen Moleküls, sowie der Verwendung von vergleichenden Anordnungen mit den existierenden dreidimensionalen Strukturen von TNFα (1a8m.pdb) und CD40-Ligand (1a1y.pdb) zum Modellieren der Sekundär- und Tertiärstruktur des extrazellulären Teils von OPGL ausgewählt. Die Einführung in das murine Molekül wird in Bereichen stattfinden, die zu Aminosäureresten 170–192, 198–218, 221–246, 256–261 und 285–316 (vgl. die Aminosäure-Nummerierung in SEQ ID NO: 4) korrespondieren, wohingegen die Einführung in das humane Molekül in Bereichen stattfinden werden, die zu Aminosäureresten 171–193, 199–219, 222–247, 257–262 und 286–317 korrespondieren.
Vier Varianten von murinem OPGL sind nun konstruiert worden und rekombinant in Escherichia coli exprimiert worden:
DNA, codierend mOPGL [158–316]_P30[256–261], mit einem N-terminalen Histidin-Anhang (SEQ ID NO: 13):
PCR von SEQ ID NO: 9 wurde unter Verwendung von SEQ ID NOs: 22 und 25 als Primer durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit SacII und KpnI restriktionsverdaut und nachfolgend aus einem Agarosegel gereinigt. Eine zweite PCR unter Verwendung von SEQ ID NO: 9 als Matrize wurde unter Verwendung von Primer SEQ ID NO: 26 und einem Vektor-spezifischen Primer durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit KpnI und HindIII restriktionsverdaut. Beide Fragmente wurden dann an SEQ ID NO: 9 in pBluescript KS+, restriktionsverdaut mit SacII und HindIII, ligiert. Um eine Einzelbasenmutation in diesem Konstrukt zu korrigieren, wurde mit den Primern SEQ ID NOs: 33 und 29 unter Verwendung des Konstrukts als Matrize PCR durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit PstI + EcoRI restriktionsverdaut, gelgereinigt und nachfolgend in das mit PstI und EcoRI verdaute, fehlerhafte Konstrukt ligiert. Das verifizierte Konstrukt (SEQ ID NO: 13) wurde dann unter Verwendung der Restriktionsenzyme BspHI und HindIII in pTrc99a transferiert.
DNA, codierend mOPGL [158–316]_P2[256–261], mit einem N-terminalen Histidin-Anhang (SEQ ID NO: 15):
Unter Verwendung der Primer SEQ ID NOs: 27 und 28 wurde ohne Matrize PCR durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit PstI und EcoRI restriktionsverdaut und nachfolgend aus einem Agarosegel gereinigt. Das resultierende Fragment wurde dann an SEQ ID NO: 9 in pBluescript KS+, restriktionsverdaut mit SacII und HindIII, ligiert. Das verifizierte Konstrukt (SEQ ID NO: 15) wurde nachfolgend unter Verwendung der Restriktionsenzyme BspHI und HindIII in pTrc99a transferiert.
DNA, codierend mOPGL [158–316]_P2[288–302], mit einem N-terminalen Histidin-Anhang (SEQ ID NO: 17):
PCR von SEQ ID NO: 9 wurde unter Verwendung der Primer SEQ ID NOs: 22 und 29 durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit PstI und BstBI restriktionsverdaut und nachfolgend aus einem Agarosegel gereinigt. Eine zweite PCR unter Verwendung von SEQ ID NO: 9 als Matrize wurde unter Verwendung von Primer SEQ ID NO: 30 und einem Vektor-spezifischen Primer durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BstBI und KpnI restriktionsverdaut und nachfolgend gelgereinigt. Beide Fragmente wurden dann an SEQ ID NO: 9 in pBluescript KS+, restriktionsverdaut mit PstI und KpnI, ligiert. Das verifizierte Konstrukt (SEQ ID NO: 17) wurde dann unter Verwendung der Restriktionsenzyme BspHI und HindIII in pTrc99a transferiert.
DNA, codierend mOPGL [158–316]_P30[221–241], mit einem N-terminalen Histidin-Anhang (SEQ ID NO: 19):
PCR von SEQ ID NO: 9 wurde unter Verwendung der Primer SEQ ID NOs: 22 und 23 durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit SacII und KpnI restriktionsverdaut und nachfolgend aus einem Agarosegel gereinigt. Eine zweite PCR unter Verwendung von SEQ ID NO: 9 als Matrize wurde unter Verwendung der Primer SEQ ID NOs: 24 und 31 durchgeführt. Das PCR-Fragment wurde mit KpnI und EcoRI restriktionsverdaut und nachfolgend gelgereinigt. Beide Fragmente wurden dann an SEQ ID NO: 9 in pBluescript KS+, restriktionsverdaut mit SacII und EcoRI, ligiert. Das verifizierte Konstrukt (SEQ ID NO: 19) wurde dann unter Verwendung der Restriktionsenzyme BspHI und HindIII in pTrc99a transferiert.
Expression dieser verkürzten Varianten von OPGL fanden in E. coli statt und erzielten über 20% Gesamt-Protein für alle Varianten. Eine weitere Entwicklung der oben beschriebenen Reinigungs- und Neufaltungsvorgehensweise für das Wildtyp-Protein (SEQ ID NO: 9) werden durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise wird als Basis für die Entwicklung optimaler Prozeduren für jede der Varianten dienen. Immobilisiertes Neufalten der Varianten-Proteine unter Verwendung des Histidin-Anhangs ist ein weiterer Ansatz, der verfolgt wird.
Alternativ können die Varianten direkt, unter Verwendung von Restriktionsenzymen, in Pichia pastoris-Expressionsvektoren, oder andere Hefe-Expressionssysteme unter Verwendung von PCR, transferiert werden, falls Glykosylierung erwünscht ist. Es sollte angemerkt werden, dass die Glykosylierung in vivo für die biologische Aktivität von OPGL nicht erforderlich ist. Es ist außerdem möglich, verkürzten OPGL in menschlichen 293-Fibroblasten zu exprimieren, wie es in Lacey et al. berichtet wurde. Expression in Insektenzellen wird auch erwägt werden (z.B. die Schneider-2 (S₂)-Zelllinie und Vektorsysteme oder die Spodoptera frugiperda (SF)-Zell- und -Vektorsysteme, beide erhältlich von Invitrogen).
Die gereinigten Varianten werden zur Antikörperproduktion in Kaninchen zur späteren Verwendung als Detektionswerkzeuge verwendet werden, weil es keine kommerziell verfügbaren Antikörper gibt. Zusätzlich wird dieses Material ein sehr wertvolles Werkzeug in den biologischen Assays sein, die erforderlich sind, um die Autovakzin-Kandidaten zu beurteilen. Die Herstellung der Antikörper wird unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt werden.
Das Selektieren des besten Autovakzin-Kandidaten basiert auf der Bewertung inhibitorischer Aktivität in den in vitro-Assays für Osteoclasten-Reifung/-Aktivierung oder in in vivo-Tiermodellen für Osteoporose. Nützliche Assays und Modellsysteme sind in der Literatur beschrieben (z.B. in Lacey et al., Fuller et al. und Simonet et al.).
Die Aktivität der rekombinanten Proteine wird durch intravenöse Injektion von 100 μl in nicht-anästhesierte, männliche Balb/C-Mäuse (0, 0,1 und 1,0 mg Protein pro kg Maus) und, eine Stunde später, Entnahme von 125 μl Blut aus der Haupt-Augenvene unter Verwendung von Kapillarröhrchen, beschichtet mit Calcium-gesättigtem Heparin, analysiert werden. Die Calcium-Spiegel werden unter Verwendung eines ICA2 (Radiometer, Dänemark) gemessen. Gereinigter und neu gefalteter rekombinanter muriner OPGL (SEQ ID NO: 9) ist in diesem Assay reaktiv und erhöht die Zirkulationsspiegel von ionisiertem Calcium um bis zu 10%.
Die Autovakzin-Kandidaten werden z.B. unter Verwendung von Autovakzinierung und nachfolgendem Verfolgen ihrer Inhibition der Freisetzung von ionisiertem Calcium in peripherales Blut nach Injektion von rekombinantem mOPGL in Mäuse beurteilt werden (wie von Burgess et al. beschrieben).
Es sollte angemerkt werden, dass alternativ zu modifizierten OPGL gegen den Idiotyp eines Anti-OPGL-Antikörpers gerichtete anti-idiotypische Antikörper außerdem als nützliche Immunogene dienen werden. Ähnlich wird auch die Verwendung von mimotypischen Polypeptiden, die z.B. in einem Phagen-Displaysystem unter Verwendung von Anti-OPGL oder Osteoprotegerin als fangende Sonde ("catching probe") isoliert werden können, als Teil der Immunogene der Erfindung bewertet.
LISTE DER REFERENZEN

1. Bucay, N. et al. (1988), Genes Dev. 12, 1260–1268.
2. Lacey, D. L. et al. (1998), Cell 93, 165–176.
3. Marks, S. C., Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34, 43–53.
4. Simonet, W. S. et al. (1997), Cell 89, 309–319.
5. Fuller, K. et al. (1998), J. Exp. Med. 188, 997–1001.
6. Burgess, T. L. et al. (1999), J. Cell Biol. 145, 527–538.
7. Pedersen J. et al. (1999), Protein Expr. Purif. 15, 389–400.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung – eines Tier-OPGL-Polypeptids oder einer Teilsequenz davon oder – eines OPGL-Analogons, das von einem Tier-OPGL-Polypeptid abgeleitet ist, in das eine Modifikation eingeführt ist, die als Resultat hat, dass eine Immunisierung des Tiers mit dem Analogon eine Produktion von Antikörpern gegen das Tier-OPGL-Polypeptid induziert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das OPGL-Polypeptid, die Teilsequenz oder das Analogon umfasst, zur Herabregulierung des OPGL in dem Tier, wobei das OPGL-Polypeptid ein Eigenprotein ist, um Osteoporose oder andere Krankheitsbilder bzw. -zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Modifikation als Resultat hat, dass eine wesentliche Fraktion der OPGL-B-Zell-Epitope konserviert wird und dass – wenigstens ein fremdes T-Helfer-Lymphozyten-Epitop (T_H-Epitop) eingeführt wird, und/oder – wenigstens eine erste Gruppierung eingeführt wird, die ein Targeting des modifizierten Moleküls auf eine ein Antigen präsentierende Zelle (APC) oder einen B-Lymphozyten bewirkt, und/oder – wenigstens eine zweite Gruppierung eingeführt wird, die das Immunsystem stimuliert und/oder – wenigstens eine dritte Gruppierung eingeführt wird, die eine Präsentation des modifizierten OPGL-Polypeptids dem Immunsystem optimiert.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Modifikation eine Einführung des fremden T_k-Epitops und/oder der ersten und/oder der zweiten und/oder der dritten Gruppierung durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung an geeignete chemische Gruppen in OPGL oder eine Teilsequenz davon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Modifikation Aminosäure-Substitution und/oder -Deletion und/oder -Insertion und/oder -Addition umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Modifikation in der Bereitstellung eines Fusionspolypeptids resultiert.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei eine Einführung der Aminosäure-Substitution und/oder -Deletion und/oder -Insertion und/oder -Addition zu einer wesentlichen Konservierung der gesamten Tertiärstruktur von OPGL führt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Modifikation die Duplikation wenigstens eines OPGL-B-Zell-Epitops und/oder eine Einführung eines Haptens umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das fremde T-Zell-Epitop im Tier immundominant ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das fremde T-Zell-Epitop fähig ist, an einen großen Teil der MHC-Klasse II-Moleküle zu binden.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei wenigstens ein fremdes T-Zell-Epitop aus einem natürlichen T-Zell-Epitop und einer künstlichen MHC-II-Bindungs-Peptidsequenz ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das natürliche T-Zell-Epitop ausgewählt ist aus einem Tetanus-Toxoid-Epitop, z.B. P2 oder P30, einem Diphtherie-Toxoid-Epitop, einem Influenza-Virus-Hämagglutinin-Epitop und einem P. falciparum-CS-Epitop.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei die erste Gruppierung ein spezifischer Bindungspartner für ein B-Lymphozyten-spezifisches Oberflächenantigen oder für ein APC-spezifisches Oberflächenantigen ist, z.B. ein Hapten oder ein Kohlenhydrat, für das es einen Rezeptor am B-Lymphozyten oder APC gibt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei die zweite Gruppierung aus einem Cytokin, einem Hormon und einem Hitzeschockprotein ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Cytokin aus Interferon γ (IFN-γ), Flt3L, Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 12 (IL-12), Interleukin 13 (IL-13), Interleukin 15 (IL-15) und Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) ausgewählt ist oder ein wirksamer Teil davon ist, und das Hitzeschockprotein ausgewählt ist aus HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 und Calreticulin (CRT) oder ein wirksamer Teil davon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei die dritte Gruppierung Lipidnatur hat, z.B. eine Palmitoylgruppe, eine Myristylgruppe, eine Farnesylgruppe, eine Geranyl-Geranyl-Gruppe, ein GPI-Anker und eine N-Acyldiglyceridgruppe ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Modifikation umfasst, dass ein OPGL-Polypeptid oder eine Teilsequenz davon in irgendeiner der Positionen 170 bis 192, in irgendeiner der Positionen 198 bis 218, in irgendeiner der Positionen 221 bis 246, in irgendeiner der Positionen 256 bis 261 oder in irgendeiner der Positionen 285 bis 316 modifiziert wurde, wobei die Aminosäurenummerierung der einer der SEQ ID NOs: 4, 6 und 12 entspricht, oder wobei das OPGL-Polypeptid in irgendeiner der Positionen 171–193, in irgendeiner der Positionen 199–219, in irgendeiner der Positionen 222–247, in irgendeiner der Positionen 257–262 oder in irgendeiner der Positionen 286–317 modifiziert wurde, wobei die Aminosäurenummerierung der von SEQ ID NO: 2 entspricht, während eine wesentliche Fraktion der Tier-OPGL-B-Zell-Epitope konserviert ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modifikation eine Substitution mindestens einer Aminosäuresequenz innerhalb einer Position, die in Anspruch 16 definiert ist, mit einer Aminosäuresequenz gleicher oder unterschiedlicher Länge, die ein fremdes T_H-Epitop enthält, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Aminosäuresequenz, die das fremde T_H-Epitop enthält, Aminosäuren 256–261 und/oder 288–302 und/oder 221–241, die in SEQ ID NO: 4 gefunden werden, oder Aminosäuren 257–262 und/oder 289–303 und/oder 222–243 in SEQ ID NO: 2 oder in einem Polypeptid, in dem ein Cystein, das Cys-221 entspricht, durch Ser ersetzt wurde, ersetzt.
Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, umfassend – eine immunogen wirksame Menge eines OPGL-Polypeptids, das in einem Tier autolog ist, wobei das OPGL-Polypeptid zusammen mit einem immunologisch akzeptablen Adjuvans formuliert ist, um so die Autotoleranz des Tiers gegenüber dem OPGL-Polypeptid zu brechen, wobei die Zusammensetzung außerdem einen pharmazeutisch und immunologisch akzeptablen Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch akzeptables Vehikel umfasst, oder – eine immunogen wirksame Menge eines OPGL-Analogons, das in einem der Ansprüche 1 bis 18 definiert ist, wobei die Zusammensetzung außerdem einen pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbares Vehikel und gegebenenfalls ein Adjuvans, umfasst, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die immunogene Zusammensetzung umfasst, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch eine übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verwendung eines Nucleinsäurefragments, das für OPGL, eine Teilsequenz von OPGL oder ein OPGL-Analogon, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 18 definiert ist, codiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Nucleinsäurefragment enthält, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verwendung eines Vektors, der das Nucleinsäurefragment, das in Anspruch 20 definiert ist, trägt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Vektor umfasst, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Vektor zur autonomen Replikation fähig ist.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Vektor aus der Gruppe, bestehend aus einem Plasmid und einem Virus, ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21–23, wobei der Vektor in 5' → 3'-Richtung und in funktioneller Verknüpfung einen Promotor zur Steuerung der Expression des Nucleinsäurefragments, das in Anspruch 20 definiert ist, gegebenenfalls eine Nucleinsäuresequenz, die ein Leader-Peptid codiert, das zur Sekretion des Polypeptidfragments oder zur Integration des Polypeptidfragments in die Membran fähig ist, wobei das Nucleinsäurefragment in Anspruch 20 definiert ist, und gegebenenfalls einen Terminator umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei der Vektor, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt ist, fähig ist oder unfähig ist, in das Wirtszellgenom integriert zu werden.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, wobei ein Promotor in dem Vektor eine Expression in einer eukaryotischen Zelle und/oder in einer prokaryotischen Zelle steuert.
Verwendung einer nicht-pathogenen transformierten Zelle, die den Vektor, der in einem der Ansprüche 21 bis 26 definiert ist, trägt und exprimiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die transformierte Zelle umfasst, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die transformierte Zelle fähig ist, das in Anspruch 20 definierte Nucleinsäurefragment zu replizieren.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die transformierte Zelle ein Bakterium ist.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Bakterium aus der Gruppe, bestehend aus Mycobacterium bovis BCG., Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae und Shigella, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die transformierte Zelle das OPGL, die OPGL-Teilsequenz oder das OPGL-Analogon, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 definiert, sezerniert oder an ihrer Oberfläche trägt.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend – ein Nucleinsäurefragment, das in Anspruch 20 definiert ist, oder einen Vektor, der in einem der Ansprüche 21–26 definiert ist, und – einen pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Träger und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbares Vehikel und/oder ein pharmazeutisch und immunologisch annehmbares Adjuvans, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die diese Zusammensetzung umfasst, zur Induzierung einer Produktion von Antikörpern, zur Herabregulierung von OPGL in einem Tier, um Osteoporose oder andere Zustände, die durch übermäßige Knochenresorption gekennzeichnet sind, zu behandeln, zu verhindern oder zu verbessern.
Verfahren zur Identifizierung eines modifizierten OPGL-Polypeptids, das fähig ist, Antikörper gegen nicht-modifiziertes OPGL in einer Tierspezies, in der das nicht-modifizierte OPGL-Polypeptid ein Eigenprotein ist, zu induzieren, wobei das Verfahren umfasst: – mit Hilfe der Peptidsynthese oder der Gentechnologie Herstellung eines Satzes von untereinander verschiedenen modifizierten OPGL-Polypeptiden, in denen Aminosäuren in die Aminosäuresequenz eines OPGL-Polypeptids der Tierspezies angefügt, insertiert, daraus deletiert oder darin substituiert wurden, wodurch Aminosäuresequenzen in dem Satz erhalten wurden, die T-Zell-Epitope umfassen, welche für die Tierspezies fremd sind, oder Herstellen eines Satzes von Nucleinsäurefragmenten, die für den Satz untereinander verschiedener, modifizierter OPGL-Polypeptide codieren, – Testen von Gliedern des Satzes modifizierter OPGL-Polypeptide oder Nucleinsäurefragmenten auf ihre Fähigkeit, die Produktion von Antikörpern gegen das nicht-modifizierte OPGL durch die Tierspezies zu induzieren, und – Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren des Glieds (der Glieder) des Satzes modifizierter OPGL-Polypeptide, der eine Antikörperproduktion gegen nicht-modifiziertes OPGL in der Spezies signifikant induziert, oder Identifizieren und gegebenenfalls Isolieren der Polypeptidexpressionsprodukte, die durch Glieder des Satzes aus Nucleinsäurefragmenten codiert werden, der eine Antikörperproduktion gegen nicht-modifiziertes OPGL in der Tierspezies signifikant induziert.
Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein modifiziertes OPGL-Polypeptid, das fähig ist, Antikörper gegen nicht-modifiziertes OPGL in einer Tierspezies, in der das nicht-modifizierte OPGL-Polypeptid ein Eigenprotein ist, zu induzieren, wobei das Verfahren umfasst: – durch Peptidsynthese oder Gentechnologie Herstellung eines Satzes untereinander unterschiedlicher modifizierter OPGL-Polypeptide, in denen Aminosäuren in die Aminosäuresequenz eines OPGL-Polypeptids der Tierspezies angefügt, insertiert, daraus deletiert oder darin substituiert wurden, wodurch Aminosäuresequenzen in dem Satz, der T-Zell-Epitope umfasst, erhalten werden, die für das Tier fremd sind, – Testen von Gliedern des Satzes auf ihre Fähigkeit, eine Produktion von Antikörpern gegen das nicht-modifizierte OPGL durch die Tierspezies zu induzieren, und – Vermischen des Gliedes (der Glieder) des Satzes, der eine Produktion von Antikörpern in der Tierspezies deutlich induziert, das/die mit OPGL reaktiv ist/sind, mit einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Träger und/oder einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Vehikel, gegebenenfalls in Kombination mit wenigstens einem pharmazeutisch und immunologisch annehmbaren Adjuvans.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Herstellung der Glieder des Satzes Herstellung von untereinander unterschiedlichen Nucleinsäuresequenzen, wobei jede Sequenz eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 20 ist, Insertion der Nucleinsäuresequenzen in geeignete Expressionsvektoren, Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Vektoren und Expression der Nucleinsäuresequenzen, gegebenenfalls gefolgt von einer Isolierung der Expressionsprodukte, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Herstellung der Nucleinsäuresequenzen und/oder Vektoren mit Hilfe einer molekularen Amplifikationstechnik, z.B. PCR, oder mit Hilfe der Nucleinsäuresynthese erreicht wird.