ES2337716T3 - Osteoprotegerina en la leche. - Google Patents

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ES2337716T3 ES06124157T ES06124157T ES2337716T3 ES 2337716 T3 ES2337716 T3 ES 2337716T3 ES 06124157 T ES06124157 T ES 06124157T ES 06124157 T ES06124157 T ES 06124157T ES 2337716 T3 ES2337716 T3 ES 2337716T3
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Peter Van Den Broek
Elizabeth Offord-Cavin
Anne Donnet-Hughes
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Abstract

Osteoprotegerina obtenida por aislamiento a partir de leche bovina.

Description

Osteoprotegerina en la leche.
La presente invención se refiere a la osteoprotegerina procedente de fuentes lácteas, particularmente de la leche bovina. La presente invención también se refiere a su empleo en la elaboración de un preparado ingerible y/o de una composición farmacéutica, en concreto al uso de dicho preparado/composición para evitar o tratar trastornos relacionados con el metabolismo y la función inmune.
En los mamíferos los huesos prestan soporte al cuerpo y están constituidos por minerales, por una matriz de proteínas colágenas y no colágenas, y por material celular. Su crecimiento y mantenimiento está controlado por varios factores involucrados en la regulación e interacción de sus células constituyentes, es decir los condrocitos formadores de cartílago, los osteoblastos que sintetizan y depositan matriz ósea y los osteoclastos responsables de la resorción de material óseo.
Los condrocitos provienen de células mesenquimales y generan un patrón cartilaginoso inicial, necesario para la formación de hueso endocondral. Los osteoblastos, que promueven la formación de tejido óseo, proceden de células mesenquimales osteoprogenitoras y se encuentran en la superficie de los huesos, donde sintetizan, transportan y ordenan las proteínas matriciales. Por otra parte los osteoclastos, que son responsables de la resorción ósea, proceden de precursores de granulocitos-monocitos presentes en la médula hematopoyética. Las acciones de osteoblastos y osteoclastos están estrechamente ligadas, p.ej. los factores proteicos generados durante el proceso de resorción mediado por los osteoclastos actúan como moléculas señalizadoras para iniciar la renovación ósea por medio de los osteoblastos. A su vez los osteoblastos pueden influir en la función osteoblástica mediante la expresión de reguladores solubles o asociados a membrana. Por lo tanto la remodelación ósea normal depende de un equilibrio preciso entre las funciones opuestas de formación y resorción ósea dirigidas por cada uno de los respectivos tipos celulares.
La matriz extracelular almacena factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y el factor de crecimiento transformador (TGF)-\beta, y, al secretarlos, estimula la liberación local de células progenitoras de hueso. Después, factores tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) y la hormona paratiroidea (PTH) influyen en el desarrollo de dichos progenitores hasta osteoblastos, las células formadoras de hueso, cuya diferenciación y función final es regulada por la interacción de la célula con las proteínas de la matriz ósea.
Al envejecer, una persona se ve sometida a una pérdida gradual de masa ósea, un fenómeno llamado desacoplamiento, considerado como el resultado de una mayor actividad de los osteoclastos respecto a los osteoblastos. Cuando este desacoplamiento persiste durante un largo periodo de tiempo, cada vez se destruye/resorbe más material óseo, dando lugar a un estado denominado osteoporosis.
Aparte del fenómeno dependiente de la edad, la pérdida ósea también puede ser debida a una deficiencia de calcio u hormonal, o a estados que causan diversas enfermedades, tales como osteoporosis, hipercalcemia, enfermedad ósea de Paget, pérdida ósea por osteoartritis o artritis reumatoide u osteomielitis y similares. La menor densidad ósea produce generalmente un descenso de resistencia mecánica y una mayor probabilidad de fracturas.
Las propuestas actuales para el tratamiento de la osteoporosis y/o de enfermedades óseas relacionadas incluyen la administración de calcio a la persona que lo precisa. Recientemente también se ha considerado el uso de agentes implicados en la estimulación y/o inhibición de las células óseas, tales como hormonas, calcitonina, factor de crecimiento similar a la insulina u osteoprotegerina (OPG), para tratar los estados patológicos antedichos. En general dichos agentes se obtienen por medios recombinantes y tienen que formularse/prepararse en forma galénica para que la respectiva sustancia pueda alcanzar el objetivo, el hueso, en una forma activa.
La patente WO 00/24771 revela ácidos nucleicos que codifican proteínas análogas a la osteoprotegerina y su uso p.ej. en el tratamiento de la osteoporosis. El polipéptido se sintetiza por medios recombinantes y luego se formula de manera que sea compatible con la ruta de administración pretendida. Como tales se proponen las vías intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p.ej. inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal.
Generalmente es engorroso y lleva bastante tiempo encontrar una forma galénica adecuada a una sustancia determinada, porque los ingredientes empleados para ello deben ser compatibles con la sustancia activa y también deben proporcionar suficiente protección contra los diversas medios corporales. No obstante, como los agentes estimuladores del crecimiento óseo se sintetizan localmente - en/sobre el tejido óseo - es difícil administrar este tipo de sustancias. Normalmente hay que diseñar cápsulas que ayuden a pasar la sustancia a través del tracto gastrointestinal, sin que se destruya en las condiciones reinantes dentro del mismo. Sin embargo esta vía de administración también tiene algunos inconvenientes, pues la sustancia tiene que atravesar el hígado y ser transportada por fluidos corporales antes de llegar al hueso. Además es frecuente que solo llegue al tejido diana una cantidad reducida de material biológicamente activo.
Por consiguiente un problema de la presente invención es el de facilitar medios para administrar una sustancia activa a una persona, de manera que la sustancia actúe en un tejido específico de dicha persona.
Consecuentemente dicho problema se ha resuelto proporcionando osteoprotegerina según la reivindicación 1.
En las ilustraciones,
La fig. 1 muestra la concentración de osteoprotegerina en la leche materna humana durante varias etapas de lactancia.
La fig. 2 muestra un análisis "Western blot" de fracciones de leche humana en condiciones reductoras usando gel SDS al 10%. Las bandas de OPG se revelaron con el anticuerpo policlonal anti-OPG biotinilado BAF805 de R&D Systems y estreptavidina-fosfatasa alcalina (SAPP).
La fig. 3 muestra el mapa de restricción del plásmido que se integró en el ADN genómico de transformantes de Yarrowia.
La fig. 4 representa un análisis PCR-RT de células de leche materna humana y de células epiteliales de glándula mamaria humana MCF-7; líneas 1 y 2: \beta-actina (tamaño de banda esperado: 460 bp); líneas 3 y 4: OPG (tamaño de banda esperado: 603 bp); 1. Células de leche materna humana; 2. MCF-7; 3. Células de leche materna humana; 4. MCF-7.
La fig. 5 muestra los resultados de un experimento en el que la OPG de la presente invención inhibe la apoptosis de células Jurkat inducida por TRAIL.
La osteoprotegerina (OPG), también conocida como factor inhibidor de osteoclastogénesis (OCIF) y molécula similar al receptor de TNF 1 (TR1), es un miembro recientemente descrito de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR). Inhibe el desarrollo osteoclástico, tanto in vitro como in vivo, e incrementa la densidad ósea (osteopetrosis). En embriones normales de ratón la OPG se ha localizado en los rudimentos cartilaginosos de huesos en desarrollo y también en el intestino delgado.
Sin embargo, a diferencia de otros miembros de la familia de receptores del TNF, la OPG no posee un dominio transmembrana. Además se ha podido demostrar que la OPG también es un receptor del ligando citotóxico TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionada con el TNF) y es idéntica al receptor-1 derivado de células dendríticas foliculares. Como tal se presume que regula la muerte celular y también juega un papel importante en la formación de tejidos linfoides. Justamente se ha demostrado que los animales que carecen de OPG presentan tejidos linfoides subdesarrollados.
En los estudios previos a la presente invención se ha encontrado sorprendentemente que, además de su presencia en los tejidos óseos, p.ej., la osteoprotegerina también puede hallarse en la leche materna humana. Por lo tanto durante la lactancia la madre está aportando obviamente al recién nacido dicha sustancia bioactiva en una forma capaz de perdurar en el tracto gastrointestinal. De ahí se desprende que la OPG producida por las células de las glándulas mamarias difiere indudablemente de la OPG aislada de otras fuentes, por lo que respecta a su estabilidad y/o resistencia a la degradación.
Sin pretender estar ligado por ninguna teoría, se cree actualmente que el patrón de glicosilación específico transmitido a la proteína en las células de las glándulas mamarias hace el polipéptido más estable al fluido ácido gástrico y/o al entorno básico encontrado en el intestino, de modo que el dominio activo permanece intacto durante la absorción intestinal y el transporte al tejido óseo y es capaz de ejercer su actividad biológica.
La OPG de la presente invención, es decir en una forma obtenida de una fuente láctea, tiene una secuencia de polipéptidos identificada como SEQ ID. Nº 1 y tamaños aproximados de 80, 130 y 200 kDa, respectivamente, que difieren de los obtenidos por medios recombinantes (55 kDa).
La OPG de la presente invención se puede incluir en un preparado ingerible, que puede ser un producto alimenticio como p.ej. leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos lácteos fermentados, helados, productos fermentados a base de cereales, leches en polvo, fórmulas infantiles e incluso alimentos para animales. La OPG de la presente invención puede incluirse igualmente en una composición entérica o farmacéutica, elegida p.ej. del grupo formado por soluciones, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentación seca por sonda o alimentación líquida por sonda.
De hecho - como la OPG conforme a la presente invención es estable - no hace falta preparar el componente activo en una forma galénica que lo proteja contra los diversos medios potencialmente agresivos del tracto gastrointestinal y contra los fluidos corporales.
En otro aspecto la presente invención también propone el empleo de la osteoprotegerina de la presente invención para elaborar un preparado ingerible, tal como un producto alimenticio o una composición entérica o farmacéutica.
La osteoprotegerina de la presente invención y el preparado ingerible antes citado pueden usarse para el tratamiento y/o profilaxis de los trastornos de la remodelación ósea.
La enfermedad ósea más común es la osteopenia, un estado relacionado generalmente con cualquier reducción de masa ósea por debajo de los niveles normales. La causa de tal trastorno puede ser un descenso de la tasa de síntesis ósea o un incremento de la tasa de destrucción ósea o ambos. La forma más corriente de osteopenia es la osteoporosis primaria, también denominada osteoporosis postmenopáusica y osteoporosis senil. Esta forma de osteoporosis es la consecuencia de una pérdida general de hueso con la edad, y suele ser el resultado de un aumento de la resorción ósea, siendo normal la tasa de formación ósea. Otras formas dignas de mención son la osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing y acromegalia), formas de osteoporosis hereditarias y congénitas (osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes y síndrome de Riley-Day) y la osteoporosis debida a la inmovilización de extremidades.
Muy recientemente se ha admitido que la osteoporosis en poblaciones humanas está relacionada con una mayor incidencia de calcificación arterial, un componente de muchas lesiones ateroscleróticas.
Por consiguiente, un producto alimenticio como el arriba descrito se puede usar para evitar la aparición en los huesos de síntomas y/o cambios estructurales relacionados con osteopenia u osteoporosis, respectivamente, o para aliviarlos. Se entiende que la sustancia activa está incluida en el producto alimenticio en cantidad suficiente para producir la respuesta biológica deseada. Como se ha visto que la OPG es un componente de la leche materna, los productos lácteos son naturalmente muy convenientes para administrar esta sustancia a una persona.
Por otra parte, para tratar casos graves de osteopenia u osteoporosis, respectivamente, se prefiere la administración a través de una composición farmacéutica que contenga mayores cantidades de la osteoprotegerina de la presente invención, es decir, en cantidades suficientes para detener o incluso revertir el proceso patológico. Dichas composiciones pueden contener la OPG de la presente invención como única sustancia activa, lo cual evita tener que formularla. Por tanto, en la presente invención basta con prensar una tableta formada por "OPG en polvo" suplementada opcionalmente con soportes o con agentes saborizantes. No obstante, en el caso de que la OPG de la presente invención deba formularse junto con otras sustancias activas, hay que tener en cuenta la naturaleza de estas sustancias adicionales y su propensión a degradarse en el tracto gastrointestinal. La OPG según la presente invención, formulada en dosis unitarias, permitirá al médico responsable controlar con mayor cuidado la dosificación diaria o semanal del compuesto activo.
La osteoprotegerina de la presente invención también se puede emplear para evitar la aparición de la enfermedad ósea de Paget, de osteomielitis, de lesiones infecciosas de huesos con pérdida ósea, de hipercalcemia, osteonecrosis, de pérdida ósea debida a osteoartritis o artritis reumatoide, de pérdida ósea periodontal y/o de metástasis osteolítica, y/o para el tratamiento de dichos trastornos.
Asimismo se ha encontrado que la OPG es un receptor del ligando afín al tumor de necrosis tumoral (TRAIL) que induce la apoptosis al fijarse a sus receptores que contienen dominios de muerte. Se supone que regula la muerte celular y que desempeña un papel importante en la formación de tejidos linfoides y en la regulación de respuestas inmunes. Además la OPG es un receptor señuelo del RANKL (ligando del receptor activador de NF-\kappaB), el cual ha sido descrito como producto de las células T activadas. La ligación del receptor de RANKL en células dendríticas maduras eleva la supervivencia de las células dendríticas. El acoplamiento de RANKL con su receptor también intensifica el crecimiento de las células T y la función de las células dendríticas.
Por lo tanto la presente invención prevé el uso de la osteoprotegerina de la presente invención para elaborar un preparado ingerible, tal como p.ej. una composición dietética o entérica, o un medicamento, respectivamente, a fin de contribuir al desarrollo normal de los tejidos inmunes y a la función inmunitaria normal, e incluso para evitar y/o tratar trastornos del sistema inmune.
Los trastornos del sistema inmune contemplados en la presente invención incluyen alergia, autoinmunidad, septicemia, cáncer, enfermedades inflamatorias del intestino grueso, estados autoinmunes sistémicos, enfermedades cardiovasculares y estados inmunopatológicos de la piel, de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal, urogenital o respiratorio.
La osteoprotegerina de la presente invención también se puede aplicar a la regulación de la proliferación celular y la apoptosis, para promover la tolerancia oral, la modulación de los procesos infecciosos y la colonización bacteriana del neonato. En el caso especial de los neonatos los trastornos arriba citados pueden relacionarse generalmente con prematuridad y/o bajo peso al nacer, por lo cual, en estos casos, la osteoprotegerina de la presente invención puede administrarse al bebé simplemente mediante su alimentación.
Se entiende que la persona objeto del tratamiento puede ser un individuo de cualquier edad, aunque los bebés y los ancianos son los principales sujetos considerados, debido a su necesidad inherente de osteoprotegerina exógena. Concretamente, sujetos tales como los recién nacidos necesitan osteoprotegerina para el desarrollo del material óseo y/o del sistema inmune, y por tanto en estos casos puede administrarse ventajosamente el compuesto y/o el producto alimenticio y/o la composición farmacéutica de la presente invención.
No obstante se entiende que la presente invención también puede aplicarse a los adultos, con el fin de evitar la aparición de cualquiera de los trastornos arriba citados. Se entiende igualmente que aparte de individuos humanos también pueden tratarse animales, como los domésticos, incluyendo la OPG de la presente invención en su comida.
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La OPG de la presente invención puede obtenerse a partir de una fuente láctea procedente de un mamífero, sobre todo de leche humana o bovina o de calostro. La OPG de leche humana tiene una secuencia aminoácida de 380 aa y presenta un peso molecular de 80, 130 y 200 kda aproximadamente respecto a los marcadores proteicos usados como patrones de pesos moleculares (BioRad). Presenta 4 sitios de N-glicosilación y se puede hallar en forma monomérica o en una forma dímera mediante un enlace S-S vía Cys379.
La OPG de la presente invención se obtiene de la leche bovina.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitarse a ellos.
Ejemplos (comparativos) Muestras de leche humana y de suero humano
Se recogieron muestras de leche materna (10-60 ml) de madres sanas, hasta 17 días después del parto, en condiciones estériles, por expresión del pecho con bomba u ocasionalmente manual. La leche se exprimió en tubos de centrifugación estériles de 50 ml y se procesó antes de pasadas 2 horas desde la recogida. Después de la centrifugación (200 x g, 10 min.), el precipitado celular se separó inmediatamente y se trató para extraer el ARN. El resto de la leche se congeló a -20ºC. Las muestras de suero humano se obtuvieron de donantes sanos y se conservaron a -20ºC.
Fraccionamiento de la leche materna humana
Se extrajo la crema de la leche entera centrifugando a alta velocidad. La capa superior de crema se separó, se lavó en agua y los lavados se congelaron a -20ºC hasta que se necesitaron. El suero y la caseína se separaron por tratamiento enzimático del cuajo o por acidificación química (con HCl) de la leche descremada, provocando la coagulación de la caseína. Después, centrifugando la leche tratada, se separa el suero dulce de la caseína del cuajo y el suero ácido de la caseína ácida, respectivamente. Por último se prepararon proteínas lácteas solubles (suero ultracentrifugado) y caseína micelar insoluble por ultracentrifugación. Todas las fracciones de la caseína y del suero se congelaron a -20ºC hasta que se necesitaron.
Línea celular mamaria humana
La MCF-7 (American Type Culture Center (ATCC), Manassas, VA., HTB-22) - una línea celular mamaria humana procedente de la efusión pleural de un carcinoma de mama - conserva varias características de epitelio mamario diferenciado. Las células se cultivaron en DMEM (Amimed Bioconcept, Allschwill, Suiza) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS, Amimed Bioconcept) y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO_{2}. El medio de cultivo se cambió 2 a 3 veces por semana. Al alcanzar la confluencia, las células se diso-ciaron con tripsina/EDTA (GibcoBRL) a 37ºC y luego se prepararon para la extracción del ARN.
Análisis Western blot
Las muestras de leche se diluyeron 1/25 con tampón reductor Laemmli y se hirvieron durante 5 min. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad). Las manchas se sondaron con un anticuerpo policlonal anti-OPG humana biotinilado (BAF805 a 0,2 \mug/ml, R&D Systems) y estreptavidina-fosfatasa alcalina (Pierce). La inmunorreactividad se visualizó con substrato de fosfatasa alcalina BCIP/NBT (Zymed Laboratories). Como patrón de pesos moleculares se utilizaron marcadores proteicos preteñidos (BioRad). Como control positivo se cargó OPG recombinante humana (R&D systems) a 25 ng/banda.
Expresión de OPG por células de leche materna humana y células epiteliales de glándula mamaria humana
Se usó transcripción inversa seguida de PCR para amplificar transcriptos de OPG en la población total de células de leche materna humana de una sola madre a los 18 días de postparto y en la línea MCF-7 de células epiteliales de glándula mamaria humana. El ARN total se extrajo de las células usando el método Trizol (Gibco-BRL). En resumen, el Trizol (1 ml por 5-10 x 10^{6} células) se añadió al precipitado celular, se pipeteó varias veces arriba y abajo, y se transfirió a un tubo Eppendorf. Se agregó cloroformo (0,2 ml para 1 ml de Trizol) y los tubos se incubaron durante 5 minutos antes de centrifugarlos a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El ARN se precipitó con un volumen igual de isopropanol y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos. Los precipitados se lavaron con etanol al 70% y luego se resuspendieron en agua desionizada y esterilizada. El ARN se conservó a -20ºC hasta que se necesitó.
Las muestras de ARN se trataron con DNasa I, exenta de RNasa, para eliminar la contaminación mediante ADN genómico. El ARN se cuantificó en un espectrofotómetro por absorbancia a 260 nm y 280 nm de una dilución apropiada (100-200 veces). La concentración de ARN (\mug/ml) se calculó de la siguiente manera: Absorbancia a A_{260} x factor de dilución x 40 mg/ml. Una muestra de ARN total básicamente libre de proteínas debería tener una relación A_{260}/A_{280} de 1,8-2,2.
El ARN se sometió a transcripción inversa con transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney (Perkin-Elmer). Las muestras de ARN (0,5 \mug de ARN total), 0,5 unidades de inhibidor RNasa, dNTPs 1 mM cada uno, 0,5 nmol/ml de cebador 3' específico, MgCl_{2} 5 mM y 1,25 unidades de transcriptasa inversa se incubaron en un volumen total de 10 \mul de una mezcla reactiva que contenía el tampón enzimático facilitado por el fabricante. La mezcla reactiva se incubó 30 min a 42ºC y luego se calentó 5 min a 95ºC. Los productos de transcripción inversa se amplificaron después con Gold DNA polimerasa (Perkin Elmer) en un termociclador (Biolabo, Scientific Instruments, Chatel St Denis, Suiza). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se efectuó en volumen total de 50 \mul, utilizando 10 \mul de los productos de transcripción inversa en tampón de PCR, MgCl_{2} 2 mM, dNTPs 5 \muM cada uno, 0,2 nmol/ml del cebador específico de OPG antisentido
ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG
\vskip1.000000\baselineskip
y sentido
GGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTG,
respectivamente, y 1,25 unidades de ADN polimerasa. Tras una etapa inicial de desnaturalización de 10 min a 95ºC las muestras se amplificaron mediante 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos, templado a 60ºC durante 1 min y extensión a 72ºC durante 1 min 30 segundos, seguida de una etapa de 7 min de extensión a 72ºC. Todas las muestras fueron sometidas a PCR-RT con \beta-actina como control positivo. Se cargaron muestras de los productos de la PCR-RT sobre geles de agarosa 1,2% (con bromuro de etidio) en tampón TAE 1 x y se separaron por electroforesis a 150 V durante 1 h. Los productos de la PCR-RT se visualizaron bajo luz UV. El tamaño correcto de las bandas se determinó por comparación con marcadores de tamaño de ADN (Boehringer Mannheim).
ELISA para OPG humana (inmunoensayo enzimático sándwich)
La concentración de OPG presente en la leche materna y en distintas fracciones lácteas se midió por ELISA. Para ello se añadieron anticuerpos monoclonales anti-OPG (1 \mug/ml de MAB8 05; R&D Systems, UK) a placas de 96 pocillos (Nunc) y se incubó por la noche a 4ºC. Después se lavaron las placas dos veces con Tween-20 al 0,05% en PBS. La fijación no específica se bloqueó incubando las placas con albúmina de suero bovino (BSA) 2% en PBS durante 2 horas más a temperatura ambiente. Se incubaron muestras o concentraciones patrón de OPG recombinante (0,119 a 121,5 ng/ml; R&D Systems) en PBSBSA durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego las placas se lavaron cuatro veces con PBS-Tween antes de añadirles el anticuerpo policlonal anti-OPG humana marcado con biotina (0,5 \mug/ml de BAF805; R&D Systems) e incubarlas una hora más a temperatura ambiente. Tras cuatro lavados adicionales se agregó estreptavidina-peroxidasa (SAAP, 0,5 \mug/ml, Kirkegaard & Perry KPL) durante 1 h a temperatura ambiente. Después se lavaron las placas cuatro veces y se añadió el substrato TMB peroxidasa (KPL). Las placas se taparon y se incubaron en la oscuridad durante cinco minutos. La reacción enzimática se terminó con la adición de HCl 1N. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector ELISA (Dynex Technologies). El límite de detección fue de aproximadamente 30 \mug/ml.
Actividad biológica de la OPG de leche humana
La OPG es un receptor del ligando afín al factor de necrosis tumoral (TRAIL), el cual induce apoptosis al fijarse a sus receptores que contienen el dominio de muerte, DR4 y DR5. Se desarrolló un ensayo biológico que permitía analizar la capacidad de la OPG de leche materna humana para bloquear la apoptosis de estas células inducida por el TRAIL.
A este respecto se cultivaron células Jurkat, clon E6-1 (ATCC), en RPMI 1640 modificado por el suministrador ATCC, que contenía 10% de FCS (a 37ºC y 5% de CO_{2}). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Nunc) con una densidad de 5 x 10^{4} células/pocillo. Se agregaron a cada pocillo diversas concentraciones de TRAIL humano recombinante soluble (0 hasta 20 ng/ml) en presencia de 2 \mug/ml de proteína estimulante, un anticuerpo que reacciona con TRAIL humano recombinante soluble aumentando su actividad (Alexis, Läufelfingen, CH). Algunos pocillos también contenían 50 ng/ml de OPG humana recombinante (R&D Systems), muestras de lecha materna humana (HM; dilución final 1/80; recogida a 1 d o 9 d del postparto) y/o 20 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-OPG (MAB805, R&D Systems). Las placas se incubaron 16 horas a 37ºC. La viabilidad de las células se midió agregando timidina-H (1 \muCi/pocillo) durante las últimas 6 horas de cultivo.
En el medio de control se apreció una inhibición de la proliferación celular inducida por TRAIL, a concentraciones mayores de 5 ng/ml. Sin embargo las muestras de HM impidieron esta inhibición. Este efecto era obvio debido a la presencia de OPG, porque el anticuerpo monoclonal anti-OPG invirtió el efecto. Los resultados están representados en la figura 5.
Análisis Western blot
La OPG se sintetiza como un monómero de 55 kDa dentro de las células, pero se convierte en un dímero unido por enlace disulfuro, de unos 110 kDa, una vez secretado extracelularmente. En la leche se detectaron bandas de 80, 130 y 200 kDa aproximadamente.
Concentraciones de OPG en leche materna humana
Se examinaron por ELISA los niveles de OPG en muestras de leche materna de 10 madres lactantes en diferentes tiempos durante los 17 primeros días de lactancia. Las concentraciones subieron a valores máximos durante los 1-3 primeros días de lactancia y luego bajaron. Las concentraciones en la leche oscilaron desde 50 ng/ml hasta casi 2 \mug/ml (fig. 1).
Fuente celular de OPG láctea
El análisis por PCR-TR reveló que la OPG de la presente invención se puede hallar en células de leche materna humana y en células epiteliales de glándula mamaria. En ambos tipos de células no tratadas fue patente la expresión constitutiva del ARNm para OPG (figura 4).
Clonación de la OPG láctea humana en levadura
Las células se aislaron de la leche materna humana (a los 18 días de postparto) mediante centrifugación (200 x g, 10 min). Del precipitado celular se extrajo el ARN total utilizando TRIzol® (Life Technologies, Basel, Suiza), se trató con DNAsa I y luego se purificó en columnas de centrifugación RNeasy (Qiagen, Basel) tal como recomiendan los fabricantes. A partir de este ARN total se amplificó un producto de PCR codificador de la forma madura de OPG, empleando el sistema PCR-TR Titan®One tube, siguiendo el protocolo facilitado por el fabricante (Roche Diagnostics, Rotkreuz).
Con el cebador específico de OPG antisentido
CC GGCCTCTTCGGCC GCCAAGCGAGAAACGTTTCCTCCAAAGTACC,
\vskip1.000000\baselineskip
y el cebador sentido
ACTAGT TATAAGCAGCTTATTTTTACTG,
se amplificó un fragmento de PCR de 1174 bp a partir de este ADNc. El producto de PCR se digirió con SfiI-SpeI, se purificó por cromatografía de gel y el fragmento resultante de 1156 bp se ligó al pINA1267 digerido con SfiI-XbaI y tratado con SAP, creando el pNFF270. Luego este plásmido pNFF270 se introdujo por transformación en la levadura Yarrowia lipolytica. La figura 3 indica el mapa de restricción del plásmido integrado en el ADN genómico de transformantes de Yarrowia y la SEQ ID. Nº 1 la proteína codificada por este plásmido de OPG.
En la figura 6 se muestra la secuencia de un clon de OPG en pGEM-T. La OPG madura está en negrita y traducida. En la secuencia de OPG/OCIF publicada el resto de aminoácido 242 de la OPG madura es un resto de Ala (A), mientras que todos los clones pGEM-T OPG analizados codificaron un resto de Asp (D) en esta posición. El fragmento SfiI-SpeI OPG de este clon fue transferido a pINA1267 digerido con SfiI-XbaI. El plásmido resultante tenía el mapa de restricción representado en la figura 3. Una copia sencilla de este plásmido fue integrada en el ADN genómico de transformantes de Yarrowia. La proteína codificada por este plásmido se muestra en la figura 4. La OPG madura está indicada en negrita. El plásmido pNFF270 se introdujo en Yarrowia lipolytica mediante transformación. Los transformantes obtenidos secretaron una proteína que efectúa una reacción cruzada con anticuerpos específicos de OPG en el medio de cultivo, mientras que los transformantes de Y. lipolytica que llevan el vector de expresión vacío no secretaron dicha proteína.
<110> Société des Produits Nestlé, S.A.
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<120> Osteoprotegerina en leche y su empleo en la regulación del metabolismo óseo
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<130> 80280
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<140>
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<141>
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 380
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens sapiens 
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<400> 1
\hskip1cm
1 
\hskip1cm
2 
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<210> 2
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<211> 1182
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens sapiens 
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<400> 2
\hskip1cm
3 
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<210> 3
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<211> 537
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
\hskip1cm
4 
\hskip1cm
5 
\hskip1cm
6 
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<210> 4
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
actagttata agcagcttat ttttactg 
\hfill
28 
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<210> 5
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens sapiens 
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggcattc ttcaggtttg ctg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 46
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens sapiens 
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggcctctt cggccgccaa gcgagaaacg tttcctccaa agtacc 
\hfill
46 
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<210> 7
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<400> 7
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actagttata agcagcttat ttttactg 
\hfill
28

Claims (12)

1. Osteoprotegerina obtenida por aislamiento a partir de leche bovina.
2. La osteoprotegerina según la reivindicación 1, cuyo patrón de glicosilación da origen a un polipéptido que tiene un peso molecular de 80, 130 y 200 kDa, aproximadamente.
3. Osteoprotegerina según una de las reivindicaciones 1 o 2 para usar como composición farmacéutica.
4. Uso de osteoprotegerina según la reivindicación 1 o 2 para elaborar un preparado ingerible.
5. Uso según la reivindicación 4, en que el preparado ingerible es un producto alimenticio consistente en leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos lácteos fermentados, helados, productos fermentados a base de cereales, leches en polvo, fórmulas infantiles y comida para animales, o una composición elegida del grupo formado por soluciones, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentación seca por sonda o alimentación líquida por sonda.
6. Uso de osteoprotegerina según la reivindicación 1 o 2 para preparar un producto o una composición elegida del grupo formado por leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos lácteos fermentados, helados, productos fermentados a base de cereales, leches en polvo, fórmulas infantiles y comida para animales, o del grupo formado por soluciones, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentación seca por sonda o alimentación líquida por sonda, para el tratamiento de trastornos relacionados con la remodelación ósea.
7. El uso según la reivindicación 6, en que el trastorno es osteoporosis, enfermedad ósea de Paget, osteomielitis, lesiones infecciosas del hueso con pérdida ósea, hipercalcemia, osteopenia, osteonecrosis, pérdida ósea por osteoartritis o artritis reumatoide, pérdida ósea periodontal y/o metástasis osteolítica.
8. Uso de osteoprotegerina según la reivindicación 1 o 2 para preparar un producto o una composición elegida del grupo formado por leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos lácteos fermentados, helados, productos fermentados a base de cereales, leches en polvo, fórmulas infantiles y comida para animales, o del grupo formado por soluciones, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentación seca por sonda o alimentación líquida por sonda, para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos inmunes.
9. El uso según la reivindicación 8, en que el trastorno es alergia, autoinmunidad, enfermedades inflamatorias del intestino grueso, estados autoinmunes sistémicos, desregulación de la proliferación celular y de la apoptosis, y estados inmunopatológicos de la piel, de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal, urogenital o respiratorio.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en que los trastornos están relacionados con prematuridad o bajo peso al nacer.
11. Uso de osteoprotegerina según la reivindicación 1 o 2 para preparar un producto o una composición elegida del grupo formado por leche, yogur, requesón, queso, leches fermentadas, productos lácteos fermentados, helados, productos fermentados a base de cereales, leches en polvo, fórmulas infantiles y comida para animales, o del grupo formado por soluciones, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentación seca por sonda o alimentación líquida por sonda, para el desarrollo del material óseo y/o del sistema inmune.
12. Osteoprotegerina según la reivindicación 1 o 2 para el tratamiento de trastornos relacionados con la remodelación ósea, para el tratamiento de y/o profilaxis de los trastornos inmunes, de los trastornos relacionados con prematuridad o bajo peso al nacer, y/o para el desarrollo del material óseo y/o del sistema inmune.
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