JP2000102390A - Ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 - Google Patents
Ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法Info
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Landscapes
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡ及びそれを用いた蛋白質の製造方法の
提供。 【解決手段】 破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又
は促進する活性を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノ
ムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法に
より該蛋白質を製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用い
て、そのゲノムＤＮＡを遺伝子工学的に発現させて得ら
れる蛋白質の発現を誘導及び／又は抑制する物質をスク
リーニングする方法、及びそのスクリーニング方法によ
り得られた物質を含有する医薬組成物。 【効果】 医薬あるいは研究用試薬として有用。
提供。 【解決手段】 破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又
は促進する活性を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノ
ムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法に
より該蛋白質を製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用い
て、そのゲノムＤＮＡを遺伝子工学的に発現させて得ら
れる蛋白質の発現を誘導及び／又は抑制する物質をスク
リーニングする方法、及びそのスクリーニング方法によ
り得られた物質を含有する医薬組成物。 【効果】 医薬あるいは研究用試薬として有用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ及びそれを
用いて遺伝子工学的手法により破骨細胞の分化及び／又
は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質を製造す
る方法、該ＤＮＡを用いて、そのＤＮＡを遺伝子工学的
に発現させて得られる蛋白質の発現を誘導及び／又は抑
制する物質をスクリーニングする方法、及びその方法に
より得られた物質を含有する医薬に関する。詳しくは、
破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又は促進する活性
を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡ、該ゲ
ノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を
製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノムＤ
ＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の発現
を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングする方
法、及びそのスクリーニング方法により得られた物質を
含有する医薬組成物に関する。本発明は、医薬あるいは
研究用試薬として有用である。
用いて遺伝子工学的手法により破骨細胞の分化及び／又
は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質を製造す
る方法、該ＤＮＡを用いて、そのＤＮＡを遺伝子工学的
に発現させて得られる蛋白質の発現を誘導及び／又は抑
制する物質をスクリーニングする方法、及びその方法に
より得られた物質を含有する医薬に関する。詳しくは、
破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又は促進する活性
を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡ、該ゲ
ノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を
製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノムＤ
ＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の発現
を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングする方
法、及びそのスクリーニング方法により得られた物質を
含有する医薬組成物に関する。本発明は、医薬あるいは
研究用試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と
骨吸収を担当する破骨細胞の総合された活性に依存して
いる。骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより、骨代
謝異常が発生すると考えられている。骨代謝の異常によ
る疾患としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ペー
ジェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及
び変形性関節炎などが知られている。これらの骨代謝異
常疾患の代表として知られる骨粗鬆症は、破骨細胞によ
る骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわることにより
発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減
少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムに
ついては未だ完全には解明されていない。又、この疾患
は骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾
患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり
老人の原因となるこの疾患は社会問題にもなっており、
その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代
謝異常による骨量減少症は、骨吸収の抑制、骨形成の促
進、あるいはこれらのバランスの改善により治療できる
ことが期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する
骨芽細胞の増殖、分化、機能を促進すること、破骨細胞
前駆細胞からの破骨細胞への分化成熟を抑制すること、
あるいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制するこ
とにより促進されると期待される。このような活性を有
するホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質に
ついて、現在精力的な探索及び開発研究が進められてい
る。
骨吸収を担当する破骨細胞の総合された活性に依存して
いる。骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより、骨代
謝異常が発生すると考えられている。骨代謝の異常によ
る疾患としては、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ペー
ジェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチ、及
び変形性関節炎などが知られている。これらの骨代謝異
常疾患の代表として知られる骨粗鬆症は、破骨細胞によ
る骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上まわることにより
発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減
少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムに
ついては未だ完全には解明されていない。又、この疾患
は骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる疾
患である。高齢人口の増加に伴い、骨折による寝たきり
老人の原因となるこの疾患は社会問題にもなっており、
その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代
謝異常による骨量減少症は、骨吸収の抑制、骨形成の促
進、あるいはこれらのバランスの改善により治療できる
ことが期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する
骨芽細胞の増殖、分化、機能を促進すること、破骨細胞
前駆細胞からの破骨細胞への分化成熟を抑制すること、
あるいは破骨細胞の骨吸収活性などの機能を抑制するこ
とにより促進されると期待される。このような活性を有
するホルモン、低分子物質、あるいは生理活性蛋白質に
ついて、現在精力的な探索及び開発研究が進められてい
る。
【０００３】骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮
を図る医薬品として、既にカルシトニン製剤、活性型ビ
タミンＤ3 製剤、エストラジオールを含有するホルモン
製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ2 、ビスフォスフォ
ネート系化合物などがあり、さらに、より副作用が少な
く、有効性に優れた治療薬の開発を目指して、活性型ビ
タミンＤ3 誘導体、エストラジオール誘導体、第２世代
又は第３世代のビスフォスフォネート系化合物などの臨
床試験が実施されている。しかし、これらの薬剤を用い
た治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも
満足出来るものではなく、より安全かつ有効性の高い新
しい治療薬の開発が期待されている。又、骨代謝疾患の
治療に使用されている薬剤の中には、その副作用により
治療可能な疾患が限定されているものもある。更に現
在、骨粗鬆症などの骨代謝疾患の治療は、複数の薬剤を
同時に使用する多剤併用療法が主流になってきている。
このような観点から、従来の医薬品とは異なった作用メ
カニズムを持ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の
少ない医薬品の開発が期待されている。
を図る医薬品として、既にカルシトニン製剤、活性型ビ
タミンＤ3 製剤、エストラジオールを含有するホルモン
製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ2 、ビスフォスフォ
ネート系化合物などがあり、さらに、より副作用が少な
く、有効性に優れた治療薬の開発を目指して、活性型ビ
タミンＤ3 誘導体、エストラジオール誘導体、第２世代
又は第３世代のビスフォスフォネート系化合物などの臨
床試験が実施されている。しかし、これらの薬剤を用い
た治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも
満足出来るものではなく、より安全かつ有効性の高い新
しい治療薬の開発が期待されている。又、骨代謝疾患の
治療に使用されている薬剤の中には、その副作用により
治療可能な疾患が限定されているものもある。更に現
在、骨粗鬆症などの骨代謝疾患の治療は、複数の薬剤を
同時に使用する多剤併用療法が主流になってきている。
このような観点から、従来の医薬品とは異なった作用メ
カニズムを持ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の
少ない医薬品の開発が期待されている。
【０００４】本発明者らは、このような状況に鑑み鋭意
探索を進めた結果、ヒト胎児肺線維芽細胞、IMR-90 (AT
CC CCL186)の培養液中に破骨細胞形成抑制因子(osteocl
astogenesis inhibitory factor, OCIF)を見出した (WO
96/26217号) 。引き続き、本発明者らは、OCIFのcDNAク
ローニング、動物細胞を用いた遺伝子組み換え型OCIFの
生産、遺伝子組み換え型OCIFによるin vivo 薬効（骨代
謝改善効果）の確認などに成功した。OCIFは、従来の医
薬品よりも有効性が高くかつ副作用が少ない、骨代謝異
常に関連する疾患の予防及び治療剤として期待されてい
る。
探索を進めた結果、ヒト胎児肺線維芽細胞、IMR-90 (AT
CC CCL186)の培養液中に破骨細胞形成抑制因子(osteocl
astogenesis inhibitory factor, OCIF)を見出した (WO
96/26217号) 。引き続き、本発明者らは、OCIFのcDNAク
ローニング、動物細胞を用いた遺伝子組み換え型OCIFの
生産、遺伝子組み換え型OCIFによるin vivo 薬効（骨代
謝改善効果）の確認などに成功した。OCIFは、従来の医
薬品よりも有効性が高くかつ副作用が少ない、骨代謝異
常に関連する疾患の予防及び治療剤として期待されてい
る。
【０００５】前述したように、骨代謝を担当する細胞は
骨芽細胞と破骨細胞である。これらの細胞は互いに密接
に相互作用していることが知られており、この現象はカ
ップリングと呼ばれている。即ち、破骨細胞の分化、成
熟には骨芽細胞様ストローマ細胞が分泌するサイトカイ
ン類、インターロイキン1 (IL-1)、3 (IL-3)、6 (IL-
6)、11 (IL-11)、顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF) 、
マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)、インターフ
ェロンガンマー (IFN-γ) 、TNF-α、トランスフォーミ
ング増殖因子β (TGF-β) などが促進的又は抑制的に作
用することが報告されている。骨芽細胞様ストローマ細
胞は、未熟な破骨細胞前駆細胞や破骨細胞との細胞間接
着により、それぞれ破骨細胞の分化、成熟や成熟破骨細
胞による骨吸収などの機能に重要な役割を演じているこ
とが知られている。この細胞間接着による破骨細胞形成
に関与する因子として、骨芽細胞様ストローマ細胞の膜
上に発現される破骨細胞分化誘導因子（osteoclast dif
ferentiation factor, ODF)(Suda et al.: Endocrine R
ev. 13, 66-80, 1992; Suda et al.: Bone 17,87S-91S,
1995)という分子が仮想されており、この仮説によれば
破骨細胞の前駆細胞にODF のレセプターが存在してい
る。しかし、ODF 及びこのレセプターとも未だ精製及び
同定されておらず、それらの性質、作用機作、及び構造
に関する報告もない。このように、破骨細胞の分化成熟
のメカニズムは未だ十分に解明されておらず、このメカ
ニズムの解明は基礎医学領域に多大な貢献をするだけで
なく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨代謝異常
症治療薬の開発にも貢献することが期待される。
骨芽細胞と破骨細胞である。これらの細胞は互いに密接
に相互作用していることが知られており、この現象はカ
ップリングと呼ばれている。即ち、破骨細胞の分化、成
熟には骨芽細胞様ストローマ細胞が分泌するサイトカイ
ン類、インターロイキン1 (IL-1)、3 (IL-3)、6 (IL-
6)、11 (IL-11)、顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF) 、
マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)、インターフ
ェロンガンマー (IFN-γ) 、TNF-α、トランスフォーミ
ング増殖因子β (TGF-β) などが促進的又は抑制的に作
用することが報告されている。骨芽細胞様ストローマ細
胞は、未熟な破骨細胞前駆細胞や破骨細胞との細胞間接
着により、それぞれ破骨細胞の分化、成熟や成熟破骨細
胞による骨吸収などの機能に重要な役割を演じているこ
とが知られている。この細胞間接着による破骨細胞形成
に関与する因子として、骨芽細胞様ストローマ細胞の膜
上に発現される破骨細胞分化誘導因子（osteoclast dif
ferentiation factor, ODF)(Suda et al.: Endocrine R
ev. 13, 66-80, 1992; Suda et al.: Bone 17,87S-91S,
1995)という分子が仮想されており、この仮説によれば
破骨細胞の前駆細胞にODF のレセプターが存在してい
る。しかし、ODF 及びこのレセプターとも未だ精製及び
同定されておらず、それらの性質、作用機作、及び構造
に関する報告もない。このように、破骨細胞の分化成熟
のメカニズムは未だ十分に解明されておらず、このメカ
ニズムの解明は基礎医学領域に多大な貢献をするだけで
なく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨代謝異常
症治療薬の開発にも貢献することが期待される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな状況に鑑み鋭意探索の結果、既にヒト胎児肺線維芽
細胞ＩＭＲ−90 (ATCC寄託−受託番号 CCL186)の培養液
に破骨細胞形成抑制因子、即ち破骨細胞形成抑制活性を
有する蛋白質OCIFを見出している (WO96/26217号) 。ま
た本発明者らは、この破骨細胞形成抑制因子OCIFを用
い、その結合蛋白質の存在を鋭意探索した結果、OCIF結
合蛋白質が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモン（para
thyroid hormone, PTH) などの骨吸収促進因子の存在下
で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現
することを見出した。このOCIF結合蛋白質(OBM) の性質
及びその生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な
破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化成熟に関与す
る、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因
子としての生物活性を有していることを見出し、さらに
そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を決定した。この蛋白
質は、以下の物理化学的性質を有するものである。
うな状況に鑑み鋭意探索の結果、既にヒト胎児肺線維芽
細胞ＩＭＲ−90 (ATCC寄託−受託番号 CCL186)の培養液
に破骨細胞形成抑制因子、即ち破骨細胞形成抑制活性を
有する蛋白質OCIFを見出している (WO96/26217号) 。ま
た本発明者らは、この破骨細胞形成抑制因子OCIFを用
い、その結合蛋白質の存在を鋭意探索した結果、OCIF結
合蛋白質が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモン（para
thyroid hormone, PTH) などの骨吸収促進因子の存在下
で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現
することを見出した。このOCIF結合蛋白質(OBM) の性質
及びその生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な
破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化成熟に関与す
る、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因
子としての生物活性を有していることを見出し、さらに
そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を決定した。この蛋白
質は、以下の物理化学的性質を有するものである。
【０００７】ＯＢＭの物理化学的性質： a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesi
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下におけるSDS ポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約30,000-40,000の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。 d. 塩基及びアミノ酸配列：配列表配列番号９（塩基配
列）及び10 (アミノ酸配列）に示す。このＯＢＭは、破
骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有し、大
理石病などの疾患の予防及び／又は治療を目的とした医
薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診
断を確立するための抗原として有用である。
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下におけるSDS ポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約30,000-40,000の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。 d. 塩基及びアミノ酸配列：配列表配列番号９（塩基配
列）及び10 (アミノ酸配列）に示す。このＯＢＭは、破
骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有し、大
理石病などの疾患の予防及び／又は治療を目的とした医
薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診
断を確立するための抗原として有用である。
【０００８】本発明者らは、OCIFに結合する蛋白質OBM
の由来についてさらに鋭意探索したところ、そのゲノム
ＤＮＡの塩基配列を決定するに至った。即ち本発明は、
破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又は促進する活性
を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡ、該ゲ
ノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を
製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノムＤ
ＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の発現
を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングする方
法、及びそのスクリーニング方法により得られた物質を
含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
の由来についてさらに鋭意探索したところ、そのゲノム
ＤＮＡの塩基配列を決定するに至った。即ち本発明は、
破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持又は促進する活性
を有する蛋白質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡ、該ゲ
ノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により該蛋白質を
製造する方法、該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノムＤ
ＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の発現
を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングする方
法、及びそのスクリーニング方法により得られた物質を
含有する医薬組成物を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、破骨細胞の分
化及び／又は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白
質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡに関する。本発明の
ＤＮＡは、配列表配列番号 1,3,5,7に示される塩基配列
を含む。又、このゲノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手
法により該蛋白質を製造する方法に関する。本発明の方
法により得られる蛋白質は、以下の物理化学的性質を示
す。 a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesi
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下における SDSポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約30,000-40,000 の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。
化及び／又は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白
質(OBM) をコードするゲノムＤＮＡに関する。本発明の
ＤＮＡは、配列表配列番号 1,3,5,7に示される塩基配列
を含む。又、このゲノムＤＮＡを用いて遺伝子工学的手
法により該蛋白質を製造する方法に関する。本発明の方
法により得られる蛋白質は、以下の物理化学的性質を示
す。 a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesi
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下における SDSポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約30,000-40,000 の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。
【００１０】本発明のＤＮＡを発現することにより得ら
れる蛋白質は、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進す
る活性を有し、大理石病などの疾患の予防及び／又は治
療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような
疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用で
ある。又、本発明は該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノ
ムＤＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の
発現を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングす
る方法、及びそのスクリーニング方法により得られた物
質を含有する医薬組成物に関する。本発明は、医薬ある
いは研究用試薬として有用である。
れる蛋白質は、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進す
る活性を有し、大理石病などの疾患の予防及び／又は治
療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような
疾患の免疫学的診断を確立するための抗原として有用で
ある。又、本発明は該ゲノムＤＮＡを用いて、そのゲノ
ムＤＮＡを遺伝子工学的に発現させて得られる蛋白質の
発現を誘導及び／又は抑制する物質をスクリーニングす
る方法、及びそのスクリーニング方法により得られた物
質を含有する医薬組成物に関する。本発明は、医薬ある
いは研究用試薬として有用である。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の破骨細胞の分化・成熟を
支持又は促進する活性を有する蛋白質 OBMをコードする
ゲノムＤＮＡは、マウス肝臓ゲノムＤＮＡのゲノムライ
ブラリーを作製し、このライブラリーをOBMcDNA をもと
に作製したＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニング
することにより得られる。このようにして得られたゲノ
ムＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して OBM発現コス
ミドを作製し、常法により各種の細胞及び菌株などの宿
主にトランスフェクトして発現させることにより、組み
換え型ＯＢＭを製造することができる。得られた破骨細
胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質
は、大理石病などの疾患の治療及び改善を目的とした医
薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診
断を確立するための抗原として有用である。本発明の蛋
白質は、製剤化して経口或いは非経口的に投与すること
ができる。即ち、本発明の蛋白質を含む製剤は、破骨細
胞の分化・成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質
を有効成分として含む医薬組成物としてヒト及び動物に
対して安全に投与されるものである。医薬組成物の形態
としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻
剤、舌下剤、経皮吸収剤等が挙げられる。注射用組成物
の場合は、本発明蛋白質の薬理的有効量及び製薬学的に
許容しうる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、
糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機化合
物等の一般的に注射用組成物に添加される賦形剤／賦活
剤を用いることもできる。又、本発明蛋白質とこれらの
賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に
応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添
加して常法によって各種注射剤とすることができる。
支持又は促進する活性を有する蛋白質 OBMをコードする
ゲノムＤＮＡは、マウス肝臓ゲノムＤＮＡのゲノムライ
ブラリーを作製し、このライブラリーをOBMcDNA をもと
に作製したＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニング
することにより得られる。このようにして得られたゲノ
ムＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して OBM発現コス
ミドを作製し、常法により各種の細胞及び菌株などの宿
主にトランスフェクトして発現させることにより、組み
換え型ＯＢＭを製造することができる。得られた破骨細
胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質
は、大理石病などの疾患の治療及び改善を目的とした医
薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診
断を確立するための抗原として有用である。本発明の蛋
白質は、製剤化して経口或いは非経口的に投与すること
ができる。即ち、本発明の蛋白質を含む製剤は、破骨細
胞の分化・成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質
を有効成分として含む医薬組成物としてヒト及び動物に
対して安全に投与されるものである。医薬組成物の形態
としては、注射用組成物、点滴用組成物、坐剤、経鼻
剤、舌下剤、経皮吸収剤等が挙げられる。注射用組成物
の場合は、本発明蛋白質の薬理的有効量及び製薬学的に
許容しうる担体の混合物であり、その中にはアミノ酸、
糖類、セルロース誘導体、及びその他の有機／無機化合
物等の一般的に注射用組成物に添加される賦形剤／賦活
剤を用いることもできる。又、本発明蛋白質とこれらの
賦形剤／賦活剤を用い注射剤を調製する場合は、必要に
応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添
加して常法によって各種注射剤とすることができる。
【００１２】又、本発明により該ゲノムＤＮＡを用い
て、破骨細胞の分化・成熟を支持又は促進する活性を有
する蛋白質 OBMの発現を誘導及び／又は抑制する物質を
スクリーニングする方法が提供される。その一つとして
ゲルシフトアッセイ（Garner and Revzin, Nucl. Acids
Res., 9, 3047-3060 (1981)）が挙げられる。この方法
は、蛋白質とＤＮＡを適当な溶液中で結合させて、その
混合液を低イオン強度の条件下でポリアクリルアミドゲ
ル中で電気泳動すると、遊離のＤＮＡと、蛋白質の結合
したＤＮＡの移動度が異なることを利用したものであ
る。具体的には、本発明のゲノムＤＮＡを適当な標識体
で標識し、適当な細胞抽出液あるいは核抽出液と混合
し、低イオン強度の条件下でポリアクリルアミドゲル中
で電気泳動することにより、本発明のゲノムＤＮＡと結
合する粗蛋白質を含む細胞抽出液あるいは核抽出液を得
ることができる。この情報をもとにさらにこの粗蛋白質
を含む細胞抽出液あるいは核抽出液を分画して同じ操作
を繰り返すことにより、蛋白質を精製し、特徴付けるこ
とが可能となる。又、別の方法として DNaseI フットプ
リント法（Galas and Schmitz, Nucl. Acids Res., 5,
3157-3170(1978))が挙げられる。この方法は、まず本発
明ゲノムＤＮＡ断片を適当なアイソトープで標識し、あ
る蛋白質存在下で DNaseI で部分消化する。生成物を変
性ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオ
グラフィーを行うと、部分消化されたＤＮＡのラダーが
得られる。この時、蛋白質の結合した領域は DNaseI の
消化から保護されるので、それらの領域に対応するバン
ドの強度が減少する。これらの方法を応用することによ
り、OBM の発現を誘導及び／又は抑制する蛋白質のスク
リーニングが可能となる。又、本発明はそのスクリーニ
ング方法により得られた物質を含有する医薬組成物を提
供するものである。該スクリーニング方法により得られ
た物質は蛋白質、ペプチド、あるいは化合物であること
が考えられ、その物性に従って適当な剤型とすることに
より、医薬組成物として提供することができる。
て、破骨細胞の分化・成熟を支持又は促進する活性を有
する蛋白質 OBMの発現を誘導及び／又は抑制する物質を
スクリーニングする方法が提供される。その一つとして
ゲルシフトアッセイ（Garner and Revzin, Nucl. Acids
Res., 9, 3047-3060 (1981)）が挙げられる。この方法
は、蛋白質とＤＮＡを適当な溶液中で結合させて、その
混合液を低イオン強度の条件下でポリアクリルアミドゲ
ル中で電気泳動すると、遊離のＤＮＡと、蛋白質の結合
したＤＮＡの移動度が異なることを利用したものであ
る。具体的には、本発明のゲノムＤＮＡを適当な標識体
で標識し、適当な細胞抽出液あるいは核抽出液と混合
し、低イオン強度の条件下でポリアクリルアミドゲル中
で電気泳動することにより、本発明のゲノムＤＮＡと結
合する粗蛋白質を含む細胞抽出液あるいは核抽出液を得
ることができる。この情報をもとにさらにこの粗蛋白質
を含む細胞抽出液あるいは核抽出液を分画して同じ操作
を繰り返すことにより、蛋白質を精製し、特徴付けるこ
とが可能となる。又、別の方法として DNaseI フットプ
リント法（Galas and Schmitz, Nucl. Acids Res., 5,
3157-3170(1978))が挙げられる。この方法は、まず本発
明ゲノムＤＮＡ断片を適当なアイソトープで標識し、あ
る蛋白質存在下で DNaseI で部分消化する。生成物を変
性ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオ
グラフィーを行うと、部分消化されたＤＮＡのラダーが
得られる。この時、蛋白質の結合した領域は DNaseI の
消化から保護されるので、それらの領域に対応するバン
ドの強度が減少する。これらの方法を応用することによ
り、OBM の発現を誘導及び／又は抑制する蛋白質のスク
リーニングが可能となる。又、本発明はそのスクリーニ
ング方法により得られた物質を含有する医薬組成物を提
供するものである。該スクリーニング方法により得られ
た物質は蛋白質、ペプチド、あるいは化合物であること
が考えられ、その物性に従って適当な剤型とすることに
より、医薬組成物として提供することができる。
【００１３】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に
説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明
はこれらにより限定されるものではない。
説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明
はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】ＯＢＭｃＤＮＡのクローニング (1) マウスＳＴ２細胞からのＲＮＡの抽出 マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2 (RIKEN CELL BA
NK, RCB0224)は、10％牛胎児血清を含むα-MEM（ギブコ
BRL社）を用いて培養した。付着細胞用225cm2T-フラス
コでコンフルエントになるまで培養した ST2細胞を、ト
リプシン処理してT-フラスコから剥がし洗浄した後、5
枚の225cm2T-フラスコに播種し、10-8M活性型ビタミンD
3（Calcitriol、和光純薬社）、10-7M デキサメサゾ
ン、及び10％牛胎児血清を添加したα-MEMを各々60mlず
つ加えてCO2 インキュベーター中で5日間培養した。培
養した ST2細胞からISOGEN（和光純薬社) を用いて総Ｒ
ＮＡを抽出した。総 RNA約 600μg からOligo(dT)-cell
ulose カラム（5'-3'Prime社）を用いてポリ A+ RNA を
調製した。約 8μg のポリ A+ RNA を得た。
NK, RCB0224)は、10％牛胎児血清を含むα-MEM（ギブコ
BRL社）を用いて培養した。付着細胞用225cm2T-フラス
コでコンフルエントになるまで培養した ST2細胞を、ト
リプシン処理してT-フラスコから剥がし洗浄した後、5
枚の225cm2T-フラスコに播種し、10-8M活性型ビタミンD
3（Calcitriol、和光純薬社）、10-7M デキサメサゾ
ン、及び10％牛胎児血清を添加したα-MEMを各々60mlず
つ加えてCO2 インキュベーター中で5日間培養した。培
養した ST2細胞からISOGEN（和光純薬社) を用いて総Ｒ
ＮＡを抽出した。総 RNA約 600μg からOligo(dT)-cell
ulose カラム（5'-3'Prime社）を用いてポリ A+ RNA を
調製した。約 8μg のポリ A+ RNA を得た。
【００１４】(2) 発現ライブラリーの構築 (1) で得られたポリＡ+ ＲＮＡ 2μg からGreat Length
s ｃＤＮＡ Synthesiskit（Clontech社）を用い、その
説明書に従い二本鎖ｃＤＮＡを合成した。即ち、ポリ A
+ RNA 2μg とOligo(dT)25(dN) プライマーを混合し蒸
留水を加え最終容量を6.25μl とし、70℃で３分保温
後、氷中で2 分冷却した。この溶液に蒸留水2.2 μl 、
5X First-strand buffer 2.5μl 、100 mM DTT（ジチオ
スレイトール） 0.25 μl 、PRIME RNase Inhibitor(1U
/ml)(5'-3' Prime社)0.5μl 、 5倍希釈した〔α-32P]d
CTP(アマシャム社、3000Ci/mmol 、２μCi/ μl) 0.5μ
l 、dNTP（各20mM) 0.65μl 、MMLV（RNaseH -) 逆転写
酵素 1.25 μl(250 ユニット）を加え、42℃で90分保温
した。さらに、蒸留水を 62.25μl 、5X second-strand
buffer 20μl 、dNTP（各20mM） 0.75 μl 、Second-s
trand enzyme cocktail 5 μl を添加し、16℃で2 時間
保温した。この反応液にT4ＤＮＡ polymerase7.5 ユニ
ットを加え、16℃でさらに30分保温後 0.2 M EDTA 5μ
l 添加して反応を停止し、フェノール・クロロフォルム
処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖ｃＤＮＡ
の末端にEcoRI-SalI-NotI リンカー（Clontech社）を付
加し末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション
用カラムにより500bp 以上のｃＤＮＡを分離し、エタノ
ール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡを水に溶解し、あら
かじめ制限酵素 EcoRI (宝酒造社）切断及びCIAP（ウシ
小腸アルカリフォスファターゼ、宝酒造社）処理して調
製したpcDL-SR α296 （Molecular and Cellular Biolo
gy, Vol. 8, pp466-472, 1988)に挿入した。
s ｃＤＮＡ Synthesiskit（Clontech社）を用い、その
説明書に従い二本鎖ｃＤＮＡを合成した。即ち、ポリ A
+ RNA 2μg とOligo(dT)25(dN) プライマーを混合し蒸
留水を加え最終容量を6.25μl とし、70℃で３分保温
後、氷中で2 分冷却した。この溶液に蒸留水2.2 μl 、
5X First-strand buffer 2.5μl 、100 mM DTT（ジチオ
スレイトール） 0.25 μl 、PRIME RNase Inhibitor(1U
/ml)(5'-3' Prime社)0.5μl 、 5倍希釈した〔α-32P]d
CTP(アマシャム社、3000Ci/mmol 、２μCi/ μl) 0.5μ
l 、dNTP（各20mM) 0.65μl 、MMLV（RNaseH -) 逆転写
酵素 1.25 μl(250 ユニット）を加え、42℃で90分保温
した。さらに、蒸留水を 62.25μl 、5X second-strand
buffer 20μl 、dNTP（各20mM） 0.75 μl 、Second-s
trand enzyme cocktail 5 μl を添加し、16℃で2 時間
保温した。この反応液にT4ＤＮＡ polymerase7.5 ユニ
ットを加え、16℃でさらに30分保温後 0.2 M EDTA 5μ
l 添加して反応を停止し、フェノール・クロロフォルム
処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖ｃＤＮＡ
の末端にEcoRI-SalI-NotI リンカー（Clontech社）を付
加し末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション
用カラムにより500bp 以上のｃＤＮＡを分離し、エタノ
ール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡを水に溶解し、あら
かじめ制限酵素 EcoRI (宝酒造社）切断及びCIAP（ウシ
小腸アルカリフォスファターゼ、宝酒造社）処理して調
製したpcDL-SR α296 （Molecular and Cellular Biolo
gy, Vol. 8, pp466-472, 1988)に挿入した。
【００１５】(3) ＯＣＩＦとの結合を指標とした発現ラ
イブラリーのスクリーニング (2)で得られたＤＮＡを用い大腸菌、XL2 Blue MRF'(東
洋紡社）を形質転換し、１ウェルあたり約100 コロニー
となるように細胞培養用24ウェルプラスティックプレー
トに調製したＬ−カーベニシリン寒天培地（1 ％トリプ
トン、0.5 ％イーストエキス、1 ％NaCl、60μg/mlカー
ベニシリン、1.5 ％寒天）上に増殖させた。各ウェル中
の形質転換株を3ml のTerrific Brothアンピシリン培地
（ 1.2％トリプトン、2.4 ％イーストエキス、0.4 ％グ
リセロール、0.017 M KH2PO4、0.072 M K2HPO4、 100μ
g/mlアンピシリン）に懸濁し、37℃で一晩振盪培養し
た。遠心により集菌しQIAwell kit(QIAGEN社）を用いて
プラスミドＤＮＡを調製した。260nm における吸光度に
よりＤＮＡ含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮
し、200ng/μl となるように蒸留水に溶解した。この様
にしてそれぞれ約100 個のコロニーから由来するＤＮＡ
プールを500 プール調製し、 COS-7細胞（RIKENCELL BA
NK, RCB0539）へのトランスフェクションに用いた。 CO
S-7細胞を24ウェルプレートに８×104 細胞／ウェルと
なるように播種し、10％牛胎児血清を含むDMEMを用い
て、CO2 インキュベーター中で37℃にて一晩培養した。
翌日、培地を除いた後、無血清DMEMで細胞を洗浄した。
トランスフェクション用試薬リポフェクトアミン（ギブ
コBRL 社）添付のプロトコールに従い、予めOPTI-MEM
（ギブコBRL 社）を用いて希釈しておいた前記プラスミ
ドＤＮＡとリポフェクトアミン (ギブコBRL 社）を混合
し、15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用い
たＤＮＡ及びリポフェクトアミンの量はそれぞれ1 μg
及び4 μl とした。5 時間後、培地を除去し、1ml の10
％牛胎児血清を含むDMEM（ギブコBRL 社）を添加し、CO
2 インキュベーター中（5 ％CO2)、37℃で2-3 日培養し
た。上記の様にトランスフェクトし2-3 日培養した COS
-7細胞を無血清DMEMで洗浄した後、 125Ｉ標識したOCIF
20ng/mlを加えた結合試験用培地（0.2 ％牛血清アルブ
ミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin及び0.02％
NaN3 を加えた無血清DMEM） 200μlを各ウェルに加え
た。CO2 インキュベーター中（5 ％CO2)で37℃ 1時間培
養した後、細胞を0.1mg/ml heparinを含むリン酸塩緩衝
生理食塩水 500μl で２回洗浄した。洗浄後、0.1 N Na
OH溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置す
ることにより細胞を溶解させ、各ウェル中の 125Ｉの量
をガンマーカウンター（パッカード社）で測定した。計
500 プールをスクリーニングすることにより、OCIFと特
異的に結合する蛋白質をコードするcDNAを含むＤＮＡプ
ール1 つを分離した。さらに本発明のcDNAを含むＤＮＡ
プールを細分化し、前記と同様のトランスフェクション
とスクリーニング操作を繰り返すことにより、OCIFと結
合する蛋白質、即ちＯＢＭをコードするcDNAを単離し
た。このcDNAを含むプラスミドをpOBM291 と名付けた。
このプラスミドを含む大腸菌は、pOBM291 として通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FER
M BP-5953 として平成９年５月23日に寄託されている。
イブラリーのスクリーニング (2)で得られたＤＮＡを用い大腸菌、XL2 Blue MRF'(東
洋紡社）を形質転換し、１ウェルあたり約100 コロニー
となるように細胞培養用24ウェルプラスティックプレー
トに調製したＬ−カーベニシリン寒天培地（1 ％トリプ
トン、0.5 ％イーストエキス、1 ％NaCl、60μg/mlカー
ベニシリン、1.5 ％寒天）上に増殖させた。各ウェル中
の形質転換株を3ml のTerrific Brothアンピシリン培地
（ 1.2％トリプトン、2.4 ％イーストエキス、0.4 ％グ
リセロール、0.017 M KH2PO4、0.072 M K2HPO4、 100μ
g/mlアンピシリン）に懸濁し、37℃で一晩振盪培養し
た。遠心により集菌しQIAwell kit(QIAGEN社）を用いて
プラスミドＤＮＡを調製した。260nm における吸光度に
よりＤＮＡ含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮
し、200ng/μl となるように蒸留水に溶解した。この様
にしてそれぞれ約100 個のコロニーから由来するＤＮＡ
プールを500 プール調製し、 COS-7細胞（RIKENCELL BA
NK, RCB0539）へのトランスフェクションに用いた。 CO
S-7細胞を24ウェルプレートに８×104 細胞／ウェルと
なるように播種し、10％牛胎児血清を含むDMEMを用い
て、CO2 インキュベーター中で37℃にて一晩培養した。
翌日、培地を除いた後、無血清DMEMで細胞を洗浄した。
トランスフェクション用試薬リポフェクトアミン（ギブ
コBRL 社）添付のプロトコールに従い、予めOPTI-MEM
（ギブコBRL 社）を用いて希釈しておいた前記プラスミ
ドＤＮＡとリポフェクトアミン (ギブコBRL 社）を混合
し、15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用い
たＤＮＡ及びリポフェクトアミンの量はそれぞれ1 μg
及び4 μl とした。5 時間後、培地を除去し、1ml の10
％牛胎児血清を含むDMEM（ギブコBRL 社）を添加し、CO
2 インキュベーター中（5 ％CO2)、37℃で2-3 日培養し
た。上記の様にトランスフェクトし2-3 日培養した COS
-7細胞を無血清DMEMで洗浄した後、 125Ｉ標識したOCIF
20ng/mlを加えた結合試験用培地（0.2 ％牛血清アルブ
ミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin及び0.02％
NaN3 を加えた無血清DMEM） 200μlを各ウェルに加え
た。CO2 インキュベーター中（5 ％CO2)で37℃ 1時間培
養した後、細胞を0.1mg/ml heparinを含むリン酸塩緩衝
生理食塩水 500μl で２回洗浄した。洗浄後、0.1 N Na
OH溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置す
ることにより細胞を溶解させ、各ウェル中の 125Ｉの量
をガンマーカウンター（パッカード社）で測定した。計
500 プールをスクリーニングすることにより、OCIFと特
異的に結合する蛋白質をコードするcDNAを含むＤＮＡプ
ール1 つを分離した。さらに本発明のcDNAを含むＤＮＡ
プールを細分化し、前記と同様のトランスフェクション
とスクリーニング操作を繰り返すことにより、OCIFと結
合する蛋白質、即ちＯＢＭをコードするcDNAを単離し
た。このcDNAを含むプラスミドをpOBM291 と名付けた。
このプラスミドを含む大腸菌は、pOBM291 として通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FER
M BP-5953 として平成９年５月23日に寄託されている。
【００１６】OCIFの 125Ｉ標識ならびにELISA による
125Ｉ標識OCIFの定量法を以下に示す。OCIFはヨードジ
ェン (Iodogen)法により 125Ｉ標識した。2.5 mg/ml Io
dogen−クロロホルム溶液 20 μl を 1.5 ml エッペン
ドルフチューブに移し、40℃でクロロホルムを蒸発させ
て、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。この
チューブを 0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液(Na-Pi, pH
7.0)400μl で３回洗浄した後、0.5 M Na-Pi, pH 7.0,
5μl を加えた。このチューブに Na- 125Ｉ溶液（Amers
ham社、NEZ-033H20)1.3μl(18.5 MBq) を加えた後、直
ちに 1 mg/ml OCIF溶液（モノマー型あるいはダイマー
型) 10μl を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した
後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め 10 mg/m
l 沃化カリウム、0.5 M Na-Pi, pH 7.0 溶液 80 μl と
5％ 牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水
（BSA-PBS ） 5μl を添加しておいたチューブに移し攪
拌した。この溶液をBSA-PBS で平衡化しておいたスピン
カラム（1 ml, G-25 fine, ファルマシア社）に負荷
し、2,000 rpm で５分間遠心した。カラムから溶出され
た画分にBSA-PBS を400 μl 加え攪拌した後、2 μl を
取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。こ
のようにして調製した 125Ｉ標識OCIF溶液の放射化学純
度は 10 ％ TCAにより沈殿する画分の放射能を測定する
ことにより求めた。又、 125Ｉ標識OCIF溶液のOCIF生物
活性は、WO96/26217号公報記載の方法に従い測定した。
又、 125Ｉ標識OCIF濃度は、以下のようにELISA により
測定した。即ち、WO96/26217号公報記載のウサギ抗OCIF
ポリクローナル抗体を2 μg/mlになるように溶解させた
50 mM NaHCO3, pH 9.6 を 100μl ずつ96ウェルイムノ
プレート（Nunc, MaxiSorpTM) の各ウェルに加えて4 ℃
で一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエー
ス（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩水の混合水溶
液（混合比25:75)(B-PBS) を 200μl ずつ各ウェルに加
え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、各
ウェルを0.01％ Polysorbate 80 を含むリン酸塩緩衝生
理食塩水（P-PBS ）で3 回洗浄し、次いで125I標識OCIF
サンプルあるいはOCIF標準品を添加したB-PBS を100 μ
l ずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液
を吸い取った後、P-PBS 200 μl で各ウェルを６回洗浄
した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクロ
ーナル抗体をB-PBS で希釈した溶液を100 μl ずつ各ウ
ェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取っ
た後、P-PBS 200 μl で各ウェルを６回洗浄した。TMB
溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scyte
k 社）を100 μl ずつ各ウェルに加え、室温で２-3分放
置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を10
0 μl ずつ各ウェルに加えた。各ウェルの 450 nm にお
ける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OC
IF標準品を用いて作製した検量線より 125Ｉ標識OCIFの
濃度を求めた。
125Ｉ標識OCIFの定量法を以下に示す。OCIFはヨードジ
ェン (Iodogen)法により 125Ｉ標識した。2.5 mg/ml Io
dogen−クロロホルム溶液 20 μl を 1.5 ml エッペン
ドルフチューブに移し、40℃でクロロホルムを蒸発させ
て、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。この
チューブを 0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液(Na-Pi, pH
7.0)400μl で３回洗浄した後、0.5 M Na-Pi, pH 7.0,
5μl を加えた。このチューブに Na- 125Ｉ溶液（Amers
ham社、NEZ-033H20)1.3μl(18.5 MBq) を加えた後、直
ちに 1 mg/ml OCIF溶液（モノマー型あるいはダイマー
型) 10μl を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した
後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め 10 mg/m
l 沃化カリウム、0.5 M Na-Pi, pH 7.0 溶液 80 μl と
5％ 牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水
（BSA-PBS ） 5μl を添加しておいたチューブに移し攪
拌した。この溶液をBSA-PBS で平衡化しておいたスピン
カラム（1 ml, G-25 fine, ファルマシア社）に負荷
し、2,000 rpm で５分間遠心した。カラムから溶出され
た画分にBSA-PBS を400 μl 加え攪拌した後、2 μl を
取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。こ
のようにして調製した 125Ｉ標識OCIF溶液の放射化学純
度は 10 ％ TCAにより沈殿する画分の放射能を測定する
ことにより求めた。又、 125Ｉ標識OCIF溶液のOCIF生物
活性は、WO96/26217号公報記載の方法に従い測定した。
又、 125Ｉ標識OCIF濃度は、以下のようにELISA により
測定した。即ち、WO96/26217号公報記載のウサギ抗OCIF
ポリクローナル抗体を2 μg/mlになるように溶解させた
50 mM NaHCO3, pH 9.6 を 100μl ずつ96ウェルイムノ
プレート（Nunc, MaxiSorpTM) の各ウェルに加えて4 ℃
で一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエー
ス（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩水の混合水溶
液（混合比25:75)(B-PBS) を 200μl ずつ各ウェルに加
え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、各
ウェルを0.01％ Polysorbate 80 を含むリン酸塩緩衝生
理食塩水（P-PBS ）で3 回洗浄し、次いで125I標識OCIF
サンプルあるいはOCIF標準品を添加したB-PBS を100 μ
l ずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液
を吸い取った後、P-PBS 200 μl で各ウェルを６回洗浄
した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクロ
ーナル抗体をB-PBS で希釈した溶液を100 μl ずつ各ウ
ェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取っ
た後、P-PBS 200 μl で各ウェルを６回洗浄した。TMB
溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scyte
k 社）を100 μl ずつ各ウェルに加え、室温で２-3分放
置した後、停止液（Stopping Reagent, Scytek社）を10
0 μl ずつ各ウェルに加えた。各ウェルの 450 nm にお
ける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OC
IF標準品を用いて作製した検量線より 125Ｉ標識OCIFの
濃度を求めた。
【００１７】(4) ＯＢＭの全アミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡの塩基配列の決定 (3)で得られた OBMcDNAの塩基配列を、タックダイデオ
キシターミネーターサイクルシークエンシングキット
（パーキンエルマー社）を用いて決定した。即ち、pOBM
291 を鋳型とし、直接挿入断片の塩基配列を決定した。
又、pOBM291 を制限酵素EcoRI で切断し得られた約1.0k
b ならびに約0.7kb の断片をpUC19 （宝酒造社）のEcoR
I 部位に挿入し、それらの断片の塩基配列も決定した。
用いたプライマーは、pcDL-SR α296 の挿入断片ＤＮＡ
の塩基配列を決定するためのプライマーSRR2、pUC19 の
挿入断片ＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマー
M13PrimerM3 、M13PrimerRV(ともに宝酒造社）及び OBM
cDNAの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーＯ
ＢＭ#8である。これらプライマーの配列を配列表配列番
号１１〜１４に示す。決定されたOBMcDNAの塩基配列を
配列表配列番号９に、その配列から推定される蛋白質の
アミノ酸配列を配列表配列番号１０にそれぞれ示す。
ｃＤＮＡの塩基配列の決定 (3)で得られた OBMcDNAの塩基配列を、タックダイデオ
キシターミネーターサイクルシークエンシングキット
（パーキンエルマー社）を用いて決定した。即ち、pOBM
291 を鋳型とし、直接挿入断片の塩基配列を決定した。
又、pOBM291 を制限酵素EcoRI で切断し得られた約1.0k
b ならびに約0.7kb の断片をpUC19 （宝酒造社）のEcoR
I 部位に挿入し、それらの断片の塩基配列も決定した。
用いたプライマーは、pcDL-SR α296 の挿入断片ＤＮＡ
の塩基配列を決定するためのプライマーSRR2、pUC19 の
挿入断片ＤＮＡの塩基配列を決定するためのプライマー
M13PrimerM3 、M13PrimerRV(ともに宝酒造社）及び OBM
cDNAの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーＯ
ＢＭ#8である。これらプライマーの配列を配列表配列番
号１１〜１４に示す。決定されたOBMcDNAの塩基配列を
配列表配列番号９に、その配列から推定される蛋白質の
アミノ酸配列を配列表配列番号１０にそれぞれ示す。
【００１８】
【実施例２】マウスOBM ゲノムの分離 (1) マウスゲノムDNA ライブラリーのスクリーニング Molecular Cloning:A Laboratory Manual に書かれた方
法に従い調製したマウス肝臓の染色体DNA100μg を、制
限酵素Sau3AI（宝酒造社）を用い部分消化し、The Lamb
da DASH IIベクター（ストラタジーン社）の制限酵素Ba
mHI 部位に、メーカーの添付したプロトコールに従い、
挿入した。これを、Gigapack Gold （ストラタジーン
社）を用い、in vitro packagingを行うことにより、マ
ウスゲノムDNA ライブラリーを作製し、以下の実験に供
した。
法に従い調製したマウス肝臓の染色体DNA100μg を、制
限酵素Sau3AI（宝酒造社）を用い部分消化し、The Lamb
da DASH IIベクター（ストラタジーン社）の制限酵素Ba
mHI 部位に、メーカーの添付したプロトコールに従い、
挿入した。これを、Gigapack Gold （ストラタジーン
社）を用い、in vitro packagingを行うことにより、マ
ウスゲノムDNA ライブラリーを作製し、以下の実験に供
した。
【００１９】作製したマウスゲノムDNA ライブラリーの
1X106 pfu のファージを37℃で15分間大腸菌XL1-Blue M
RA P2 に感染させ、その大腸菌を45℃に加温した0.7%寒
天を含むLB寒天培地（1%トリプトン、0.5%イーストエキ
ス、1% NaCl)に添加し、1.5%寒天を含むLB寒天培地プレ
ート上に流し込んだ。プレートを一晩37℃でインキュベ
ートした後、生じたファージプラークをナイロン膜（ベ
ーリンガーマンハイム社）に、転写した。このナイロン
膜を1.5M NaCl / 0.5M NaOH 溶液で、湿らせた濾紙上に
１分間乗せ、その後1M Tris-HCl (pH7.5) と1.5M NaCl
/ 0.5M Tris-HCl (pH7.5) でそれぞれ１分間づつ処理し
て中和した後、最後に2XSSC (300 mM NaCl、30 mM クエ
ン酸ナトリウム、pH7.0)で湿らせた濾紙の上に乗せた。
その後、80℃で２時間処理することによって、ファージ
DNA を膜に固定した。次に、このナイロン膜をDIG イー
ジーハイブ（ベーリンガーマンハイム社）に浸透して65
℃１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その
後、ジゴキシゲニン標識したOBMcDNA を加え、65℃にて
一夜ハイブリダイゼーションを行った。このcDNAプロー
ブは、実施例1-(3) で得られたOBMcDNA を有するプラス
ミドpOBM291 を、制限酵素EcoRI を用いて切断し、約1.
5kB のOBMcDNA を1%濃度のアガロースゲル電気泳動によ
って単離した後、DIG-ハイプライム（ベーリンガーマン
ハイム社）を用いてジゴキシゲニン標識することによっ
て作製した。尚、標識及び検出はDIG-ハイプライムDNA
ラベリング＆デテクション スターターキット（ベーリ
ンガーマンハイム社）に添付されたプロトコールに従っ
て行った。ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を室
温にて2XSSC で５分間洗浄し、その後65℃において0.2X
SSC/0.1% SDSで２回それぞれ20分づつ洗浄した。その
後、10,000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ジ
ゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイム社）を基質
CSPD（ベーリンガーマンハイム社）と反応させ、ナイロ
ン膜上に発色させた。検出した４個のシグナルに相当す
るLB寒天培地プレート上の位置からファージプラークを
かきとり、1%のクロロホルムを添加した0.5 mlのSMバッ
ファーに浸しファージを抽出した。それぞれのファージ
抽出液を1,000 倍希釈し、約500 pfu に相当するファー
ジを再び上記大腸菌に感染させ、上記の方法でLB寒天培
地上に蒔いた。ファージをナイロン膜に転写後、上記の
方法でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼー
ション、洗浄、乾燥、シグナルの検出を行った。これら
の操作を陽性のファージプラークが単一になるまで２回
繰り返した。こうして得られたOBM ゲノムDNA を含む４
種類の単一ファージを、それぞれλOBM1、λOBM2、λOB
M3、λOBM4と名付けた。
1X106 pfu のファージを37℃で15分間大腸菌XL1-Blue M
RA P2 に感染させ、その大腸菌を45℃に加温した0.7%寒
天を含むLB寒天培地（1%トリプトン、0.5%イーストエキ
ス、1% NaCl)に添加し、1.5%寒天を含むLB寒天培地プレ
ート上に流し込んだ。プレートを一晩37℃でインキュベ
ートした後、生じたファージプラークをナイロン膜（ベ
ーリンガーマンハイム社）に、転写した。このナイロン
膜を1.5M NaCl / 0.5M NaOH 溶液で、湿らせた濾紙上に
１分間乗せ、その後1M Tris-HCl (pH7.5) と1.5M NaCl
/ 0.5M Tris-HCl (pH7.5) でそれぞれ１分間づつ処理し
て中和した後、最後に2XSSC (300 mM NaCl、30 mM クエ
ン酸ナトリウム、pH7.0)で湿らせた濾紙の上に乗せた。
その後、80℃で２時間処理することによって、ファージ
DNA を膜に固定した。次に、このナイロン膜をDIG イー
ジーハイブ（ベーリンガーマンハイム社）に浸透して65
℃１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その
後、ジゴキシゲニン標識したOBMcDNA を加え、65℃にて
一夜ハイブリダイゼーションを行った。このcDNAプロー
ブは、実施例1-(3) で得られたOBMcDNA を有するプラス
ミドpOBM291 を、制限酵素EcoRI を用いて切断し、約1.
5kB のOBMcDNA を1%濃度のアガロースゲル電気泳動によ
って単離した後、DIG-ハイプライム（ベーリンガーマン
ハイム社）を用いてジゴキシゲニン標識することによっ
て作製した。尚、標識及び検出はDIG-ハイプライムDNA
ラベリング＆デテクション スターターキット（ベーリ
ンガーマンハイム社）に添付されたプロトコールに従っ
て行った。ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を室
温にて2XSSC で５分間洗浄し、その後65℃において0.2X
SSC/0.1% SDSで２回それぞれ20分づつ洗浄した。その
後、10,000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ジ
ゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイム社）を基質
CSPD（ベーリンガーマンハイム社）と反応させ、ナイロ
ン膜上に発色させた。検出した４個のシグナルに相当す
るLB寒天培地プレート上の位置からファージプラークを
かきとり、1%のクロロホルムを添加した0.5 mlのSMバッ
ファーに浸しファージを抽出した。それぞれのファージ
抽出液を1,000 倍希釈し、約500 pfu に相当するファー
ジを再び上記大腸菌に感染させ、上記の方法でLB寒天培
地上に蒔いた。ファージをナイロン膜に転写後、上記の
方法でプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼー
ション、洗浄、乾燥、シグナルの検出を行った。これら
の操作を陽性のファージプラークが単一になるまで２回
繰り返した。こうして得られたOBM ゲノムDNA を含む４
種類の単一ファージを、それぞれλOBM1、λOBM2、λOB
M3、λOBM4と名付けた。
【００２０】(2) 制限酵素消化及びサザンブロットハイ
ブリダイゼーション法によるマウスOBM ゲノムDNA クロ
ーンの分析 (1) で得られた純化された４種のファージ（λOBM1、λ
OBM2、λOBM3、λOBM4）のDNA を、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual に書かれた方法に従って液体培養
法によって精製した。これらのDNA を制限酵素BamHI 、
EcoRI 、HindIII(宝酒造社）によって消化し、得られた
フラグメントを1%濃度のアガロース電気泳動によって分
離した。このフラグメントを、 Molecular Cloning:A L
aboratory Manualに書かれた方法に従ってナイロン膜に
転写させた後、OBMcDNA をプローブとしてサザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った。これらの分析の結
果、それぞれ純化された４種のファージは異なったクロ
ーンであることが判明した。また、それら４種のファー
ジDNA は、OBM ゲノムDNA のエキソン３，４及び５を含
んでいた。制限酵素消化によって得られたフラグメント
のうち、OBMcDNA とハイブリダイズしたフラグメント
は、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の
方法で塩基配列の分析を行った。
ブリダイゼーション法によるマウスOBM ゲノムDNA クロ
ーンの分析 (1) で得られた純化された４種のファージ（λOBM1、λ
OBM2、λOBM3、λOBM4）のDNA を、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual に書かれた方法に従って液体培養
法によって精製した。これらのDNA を制限酵素BamHI 、
EcoRI 、HindIII(宝酒造社）によって消化し、得られた
フラグメントを1%濃度のアガロース電気泳動によって分
離した。このフラグメントを、 Molecular Cloning:A L
aboratory Manualに書かれた方法に従ってナイロン膜に
転写させた後、OBMcDNA をプローブとしてサザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った。これらの分析の結
果、それぞれ純化された４種のファージは異なったクロ
ーンであることが判明した。また、それら４種のファー
ジDNA は、OBM ゲノムDNA のエキソン３，４及び５を含
んでいた。制限酵素消化によって得られたフラグメント
のうち、OBMcDNA とハイブリダイズしたフラグメント
は、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の
方法で塩基配列の分析を行った。
【００２１】(3) マウスゲノムBAC クローンの分析 実施例１-(3)で得られたOBMcDNA を有するプラスミドpO
BM291 を、制限酵素EcoRI,BamHI を用いて消化し、OBMc
DNA の部分断片（約370 bp）をアガロースゲル電気泳動
によって分離した。これをプローブとして用い、マウス
ゲノムの制限酵素Hind IIIを用い部分消化されたマウス
ゲノムDNA とpBeloBACベクターを用いて作製されたゲノ
ムシステムズ社のゲノムライブラリーより、陽性となる
BAC クローンOBMBAC1 を得た。このBAC クローンOBMBAC
1 より、BACDNAをKim らの方法(Genomics 34, 213-218
(1996)) に従って、精製した。このBACDNAを、制限酵素
Sau3AIを用い部分消化しのち、そのDNA の3'末端に修飾
酵素Klenow fragment を用いてアデニン塩基、グアニン
塩基を挿入した。それらDNA を、あらかじめ制限酵素Xh
oI消化し、そのXhoI部位にチアミン塩基シトシン塩基を
部分挿入したTheLambda FIX II ベクター（ストラタジ
ーン社）に、修飾酵素T4 DNAリガーゼ（宝酒造社）を用
い挿入した。それらDNA をGigapack Gold(ストラタジー
ン社）を用いて、in vitro packagingを行い、OBMBACDN
A ミニライブラリーとして、以下の実験に供した。OBMB
ACDNA ミニライブラリーより、上記(1) マウスゲノムDN
A ライブラリーのスクリーニングに準じ、OBMDNAのスク
リーニングを行った。即ち、pOBM291 を制限酵素EcoRI,
BamHI を用いて消化し、 OBMcDNAの部分断片（約370 b
p）を1%濃度のアガロースゲル電気泳動によって分離し
た後、メガプライムDNA ラベリングシステム（アマシャ
ム社）を用いて、 [α32P]dCTP（アマシャム社）で標識
する事によってプローブとした。ファージを転写したナ
イロン膜（ハイボンドN+、アマシャム社）をラピッドハ
イブリダイゼーションバッファー（アマシャム社）中
で、プレハイブリダイゼーションを行った後、上記プロ
ーブを添加しハイブリダイゼーションを行った。ナイロ
ン膜を室温にて2XSSC で５分間洗浄し、その後65℃にお
いて0.2XSSC/0.1% SDSで２回それぞれ20分づつ洗浄し
た。次に、コダックフィルム社製X 線フィルムに密着さ
せ、-80 ℃下で一晩オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラム上にシグナルが検出されたので、そ
れに相当するLB寒天培地プレート上の位置からファージ
プラークをかきとり、1%のクロロホルムを添加した0.5
mlのSMバッファーに浸しファージを抽出した。それぞれ
のファージ抽出液を希釈し、再び上記大腸菌に感染さ
せ、上記の方法でLB寒天培地プレート上に蒔いた。さら
に、ファージを純化するために、再度スクリーニングを
行った。こうして得られた４種類の単一ファージを、そ
れぞれλBP1 、λBP2 、λBP3 、λBP4 と名付けた。
BM291 を、制限酵素EcoRI,BamHI を用いて消化し、OBMc
DNA の部分断片（約370 bp）をアガロースゲル電気泳動
によって分離した。これをプローブとして用い、マウス
ゲノムの制限酵素Hind IIIを用い部分消化されたマウス
ゲノムDNA とpBeloBACベクターを用いて作製されたゲノ
ムシステムズ社のゲノムライブラリーより、陽性となる
BAC クローンOBMBAC1 を得た。このBAC クローンOBMBAC
1 より、BACDNAをKim らの方法(Genomics 34, 213-218
(1996)) に従って、精製した。このBACDNAを、制限酵素
Sau3AIを用い部分消化しのち、そのDNA の3'末端に修飾
酵素Klenow fragment を用いてアデニン塩基、グアニン
塩基を挿入した。それらDNA を、あらかじめ制限酵素Xh
oI消化し、そのXhoI部位にチアミン塩基シトシン塩基を
部分挿入したTheLambda FIX II ベクター（ストラタジ
ーン社）に、修飾酵素T4 DNAリガーゼ（宝酒造社）を用
い挿入した。それらDNA をGigapack Gold(ストラタジー
ン社）を用いて、in vitro packagingを行い、OBMBACDN
A ミニライブラリーとして、以下の実験に供した。OBMB
ACDNA ミニライブラリーより、上記(1) マウスゲノムDN
A ライブラリーのスクリーニングに準じ、OBMDNAのスク
リーニングを行った。即ち、pOBM291 を制限酵素EcoRI,
BamHI を用いて消化し、 OBMcDNAの部分断片（約370 b
p）を1%濃度のアガロースゲル電気泳動によって分離し
た後、メガプライムDNA ラベリングシステム（アマシャ
ム社）を用いて、 [α32P]dCTP（アマシャム社）で標識
する事によってプローブとした。ファージを転写したナ
イロン膜（ハイボンドN+、アマシャム社）をラピッドハ
イブリダイゼーションバッファー（アマシャム社）中
で、プレハイブリダイゼーションを行った後、上記プロ
ーブを添加しハイブリダイゼーションを行った。ナイロ
ン膜を室温にて2XSSC で５分間洗浄し、その後65℃にお
いて0.2XSSC/0.1% SDSで２回それぞれ20分づつ洗浄し
た。次に、コダックフィルム社製X 線フィルムに密着さ
せ、-80 ℃下で一晩オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラム上にシグナルが検出されたので、そ
れに相当するLB寒天培地プレート上の位置からファージ
プラークをかきとり、1%のクロロホルムを添加した0.5
mlのSMバッファーに浸しファージを抽出した。それぞれ
のファージ抽出液を希釈し、再び上記大腸菌に感染さ
せ、上記の方法でLB寒天培地プレート上に蒔いた。さら
に、ファージを純化するために、再度スクリーニングを
行った。こうして得られた４種類の単一ファージを、そ
れぞれλBP1 、λBP2 、λBP3 、λBP4 と名付けた。
【００２２】(4) 制限酵素消化及びサザンブロットハイ
ブリダイゼーション法によるBACDNA由来のマウスOBM ゲ
ノムDNA クローンの分析 (3)で得られたOBMBAC1 由来の純化された４種のファー
ジ（λBP1 、λBP2 、λBP3 、λBP4)のDNA を、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual の方法に従って液体
培養法によって精製した。これらのDNA を制限酵素BamH
I 、EcoRI 、HimdIII(宝酒造社）によって消化し、得ら
れたフラグメントを1%濃度のアガロースゲル電気泳動に
よって分離した。このフラグメントを、 Molecular Clo
ning:A Laboratory Manualに書かれた方法に従ってナイ
ロン膜に転移させた後、OBMcDNAをプローブとしてサザ
ンブロットハイブリダイゼーションを行った。これらの
分析の結果、それぞれ純化された４種のファージは異な
ったクローンであることが判明した。また、これら４種
のファージDNA は、OBM ゲノムDNA のエキソン1 、２を
含んでいた。制限酵素消化によって得られたフラグメン
トのうち、OBMcDNAとハイブリダイズしたフラグメント
は、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の
方法で塩基配列の分析を行った。
ブリダイゼーション法によるBACDNA由来のマウスOBM ゲ
ノムDNA クローンの分析 (3)で得られたOBMBAC1 由来の純化された４種のファー
ジ（λBP1 、λBP2 、λBP3 、λBP4)のDNA を、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual の方法に従って液体
培養法によって精製した。これらのDNA を制限酵素BamH
I 、EcoRI 、HimdIII(宝酒造社）によって消化し、得ら
れたフラグメントを1%濃度のアガロースゲル電気泳動に
よって分離した。このフラグメントを、 Molecular Clo
ning:A Laboratory Manualに書かれた方法に従ってナイ
ロン膜に転移させた後、OBMcDNAをプローブとしてサザ
ンブロットハイブリダイゼーションを行った。これらの
分析の結果、それぞれ純化された４種のファージは異な
ったクローンであることが判明した。また、これら４種
のファージDNA は、OBM ゲノムDNA のエキソン1 、２を
含んでいた。制限酵素消化によって得られたフラグメン
トのうち、OBMcDNAとハイブリダイズしたフラグメント
は、プラスミドベクターにサブクローンした後に下記の
方法で塩基配列の分析を行った。
【００２３】(5) ゲノムDNA クローンから制限酵素消化
によって得られたDNA フラグメントのプラスミドベクタ
ーへのサブクローニング (1)で得られたλOBM1の DNAを制限酵素BamHI 、EcoRI
、HindIII によってそれぞれ消化し、得られたフラグ
メントを0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離し
た。それぞれ、約6.0 kbのBamHI フラグメント、約3.5
kb及び約3.0 kbのEcoRI フラグメント、約7.0 kb及び約
3.0 kb のHindIII フラグメントをGeneCleanII(バイオ
101 社）を用いて、添付されたプロトコールに従ってゲ
ルから抽出した。これらフラグメントを、前もってBamH
I 、EcoRI 、HindIII によってそれぞれ切断しておいた
pBluescript KS- （ストラタジーン社）をベクターとし
て、T4DNA リガーゼ（宝酒造社）を用いてライゲーショ
ンを行った。得られたリコンビナントプラスミドを、コ
ンピテント DH5α大腸菌（東洋紡社）に導入した後、 1
00μg/ml濃度のアンピシリンを含有するアガロースプレ
ート上に蒔いてプラスミドを有する大腸菌を選択した。
こうして作製した約6.0 kbのBamHI フラグメントを有す
るリコンビナントプラスミドをpBSB6.0 と命名した。ま
た、約3.5 kbあるいは約3.0 kbのEcoRI フラグメントを
有するリコンビナントプラスミドをpBSE3.5 とpBSE3.0A
及びpBSE3.0Bと、そして約7.0 kbあるいは約3.0 kbのHi
ndIII フラグメントを有するリコンビナントプラスミド
をそれぞれpBSH7.0 及び pBSH3.0と命名した。
によって得られたDNA フラグメントのプラスミドベクタ
ーへのサブクローニング (1)で得られたλOBM1の DNAを制限酵素BamHI 、EcoRI
、HindIII によってそれぞれ消化し、得られたフラグ
メントを0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離し
た。それぞれ、約6.0 kbのBamHI フラグメント、約3.5
kb及び約3.0 kbのEcoRI フラグメント、約7.0 kb及び約
3.0 kb のHindIII フラグメントをGeneCleanII(バイオ
101 社）を用いて、添付されたプロトコールに従ってゲ
ルから抽出した。これらフラグメントを、前もってBamH
I 、EcoRI 、HindIII によってそれぞれ切断しておいた
pBluescript KS- （ストラタジーン社）をベクターとし
て、T4DNA リガーゼ（宝酒造社）を用いてライゲーショ
ンを行った。得られたリコンビナントプラスミドを、コ
ンピテント DH5α大腸菌（東洋紡社）に導入した後、 1
00μg/ml濃度のアンピシリンを含有するアガロースプレ
ート上に蒔いてプラスミドを有する大腸菌を選択した。
こうして作製した約6.0 kbのBamHI フラグメントを有す
るリコンビナントプラスミドをpBSB6.0 と命名した。ま
た、約3.5 kbあるいは約3.0 kbのEcoRI フラグメントを
有するリコンビナントプラスミドをpBSE3.5 とpBSE3.0A
及びpBSE3.0Bと、そして約7.0 kbあるいは約3.0 kbのHi
ndIII フラグメントを有するリコンビナントプラスミド
をそれぞれpBSH7.0 及び pBSH3.0と命名した。
【００２４】一方、(3) で得られたλBP1 のDNA を制限
酵素HindIII によって、消化し、得られたフラグメント
を0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離した。得ら
れた、DNA フラグメントを、上記と同様の方法に従って
pBluescript KS- ベクターに挿入してクローニングし
た。こうして作製した約5.0 kb及び約3.0 kbのHindIII
フラグメントを有するリコンビナントプラスミドをそれ
ぞれpBPH5.0 、pBPH3.0と命名した。
酵素HindIII によって、消化し、得られたフラグメント
を0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離した。得ら
れた、DNA フラグメントを、上記と同様の方法に従って
pBluescript KS- ベクターに挿入してクローニングし
た。こうして作製した約5.0 kb及び約3.0 kbのHindIII
フラグメントを有するリコンビナントプラスミドをそれ
ぞれpBPH5.0 、pBPH3.0と命名した。
【００２５】(6) OBMゲノムDNA の塩基配列の決定 (5)項で得られたOBM ゲノムDNA の塩基配列を、 Dye Te
rminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（P
Eアプライドバイオシステムズ社）と373 DNASequencing
System（PEアプライドバイオシステムズ社）を用い
て、決定した。即ち、pBPH3.0 を鋳型とし、直接、挿入
断片のエキソン１近傍の塩基配列を決定した（配列表配
列番号１）。また、pBPH5.0 を鋳型とし、エキソン２近
傍の塩基配列を決定した（配列表配列番号３）。また、
pBSE3.0A及びpBSH3.0 を鋳型とし、エキソン３及び４近
傍の塩基配列を決定した (配列表配列番号５）。また、
pBSE3.0B、pBSH7.0 、pBSE3.5 及びpBSB6.0 を鋳型と
し、エキソン5 近傍の塩基配列を決定した（配列表配列
番号７）。尚、エキソン１とエキソン２の間、エキソン
２とエキソン３の間、エキソン４とエキソン５の間に介
在する塩基配列は必ずしも全部は決定されていない。こ
れらの決定されたゲノムＤＮＡ断片を全て含む、実施例
２−(3) で得られたBAC クローンOBM BACIは、DHIOB/pB
elo-mOBMとして通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に、受託番号 FERM P-16961 として平成10年８月
26日付で寄託されている。また、本発明ゲノムＤＮＡの
構造を図１に示す。
rminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（P
Eアプライドバイオシステムズ社）と373 DNASequencing
System（PEアプライドバイオシステムズ社）を用い
て、決定した。即ち、pBPH3.0 を鋳型とし、直接、挿入
断片のエキソン１近傍の塩基配列を決定した（配列表配
列番号１）。また、pBPH5.0 を鋳型とし、エキソン２近
傍の塩基配列を決定した（配列表配列番号３）。また、
pBSE3.0A及びpBSH3.0 を鋳型とし、エキソン３及び４近
傍の塩基配列を決定した (配列表配列番号５）。また、
pBSE3.0B、pBSH7.0 、pBSE3.5 及びpBSB6.0 を鋳型と
し、エキソン5 近傍の塩基配列を決定した（配列表配列
番号７）。尚、エキソン１とエキソン２の間、エキソン
２とエキソン３の間、エキソン４とエキソン５の間に介
在する塩基配列は必ずしも全部は決定されていない。こ
れらの決定されたゲノムＤＮＡ断片を全て含む、実施例
２−(3) で得られたBAC クローンOBM BACIは、DHIOB/pB
elo-mOBMとして通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に、受託番号 FERM P-16961 として平成10年８月
26日付で寄託されている。また、本発明ゲノムＤＮＡの
構造を図１に示す。
【００２６】
【実施例３】COS-7 細胞による組み換え型ＯＢＭの生産 (i) 動物細胞用発現コスミドの作製 OBM ゲノムＤＮＡを動物細胞で発現させるために、コス
ミドベクターpWE15(ストラータジーン社) に発現プラス
ミドpcDL-SR α296 (Molecular and CellularBiology,
vol.8, p466-472, 1988) の発現ユニットを挿入した。
まず、発現プラスミドpcDL-SR α296 を制限酵素SalIで
消化してSRαプロモーター、SV40後期スプライス信号、
ポリ（A)付加信号などを含む約 1.7kbの発現ユニットを
切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX
IIゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用い
て精製した。一方、コスミドベクターpWE15 を制限酵素
EcoRI で消化し、アガロース電気泳動によって分離後、
8.2kb のpWE15 DNA をQIAEX IIゲルエクストラクション
キット（キアゲン社）を用いて精製した。これら二つの
ＤＮＡ断片末端をＤＮＡブランティングキット（宝酒造
社) を用いて平滑化し、ＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社) を用いて結合させ、大腸菌DH5 α(ギブコ
BRL社）に導入した。得られた形質転換株を増殖させ、
発現ユニットを含む発現コスミドpWESR αをキアゲンカ
ラム（キアゲン社) を用いて精製した。
ミドベクターpWE15(ストラータジーン社) に発現プラス
ミドpcDL-SR α296 (Molecular and CellularBiology,
vol.8, p466-472, 1988) の発現ユニットを挿入した。
まず、発現プラスミドpcDL-SR α296 を制限酵素SalIで
消化してSRαプロモーター、SV40後期スプライス信号、
ポリ（A)付加信号などを含む約 1.7kbの発現ユニットを
切り出し、アガロース電気泳動によって分離後、QIAEX
IIゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を用い
て精製した。一方、コスミドベクターpWE15 を制限酵素
EcoRI で消化し、アガロース電気泳動によって分離後、
8.2kb のpWE15 DNA をQIAEX IIゲルエクストラクション
キット（キアゲン社）を用いて精製した。これら二つの
ＤＮＡ断片末端をＤＮＡブランティングキット（宝酒造
社) を用いて平滑化し、ＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社) を用いて結合させ、大腸菌DH5 α(ギブコ
BRL社）に導入した。得られた形質転換株を増殖させ、
発現ユニットを含む発現コスミドpWESR αをキアゲンカ
ラム（キアゲン社) を用いて精製した。
【００２７】(ii)全エキソンを含む OBMコスミドの作成 実施例２で得られたファージλBP1 を鋳型として、第
一、第二エキソンを含む約７kb領域のPCR 反応を行っ
た。この時、両末端にNotI部位、SalI部位を導入した。
増幅した約7kb のＤＮＡを制限酵素NotI、SalIで消化し
た後に、QIAEX IIゲルエクストラクションキット（キア
ゲン社）を用いて精製した。一方、実施例２で得られた
ファージλOBM の挿入断片、第三、第四、第五エキソン
を含む約15kbのDNA を制限酵素NotI、SalIで消化した後
に、QIAEX IIゲルエクストラクションキット（キアゲン
社）を用いて精製した。増幅した第一、第二エキソンを
含む約7kb のDNA と第三、第四、第五エキソンを含む約
15kbのDNA 及びNotI消化したコスミドベクターpWE15
（ストラタジーン社）をT4DNA リガーゼ（宝酒造社）を
用いて結合し、ギガパックIIパッケージングエクストラ
クト（ストラタジーン社）に感染させた。得られた形質
転換株を増殖させ、OBM ゲノムDNA が挿入されたコスミ
ドを選択し、pWEOBMと名付け、DNA を精製した。得られ
た約22kbのＯＢＭゲノムＤＮＡを切り出し、アガロース
電気泳動によって分離後、QIAEX IIゲルエクストラクシ
ョンキット（キアゲン社）を用いて精製した。
一、第二エキソンを含む約７kb領域のPCR 反応を行っ
た。この時、両末端にNotI部位、SalI部位を導入した。
増幅した約7kb のＤＮＡを制限酵素NotI、SalIで消化し
た後に、QIAEX IIゲルエクストラクションキット（キア
ゲン社）を用いて精製した。一方、実施例２で得られた
ファージλOBM の挿入断片、第三、第四、第五エキソン
を含む約15kbのDNA を制限酵素NotI、SalIで消化した後
に、QIAEX IIゲルエクストラクションキット（キアゲン
社）を用いて精製した。増幅した第一、第二エキソンを
含む約7kb のDNA と第三、第四、第五エキソンを含む約
15kbのDNA 及びNotI消化したコスミドベクターpWE15
（ストラタジーン社）をT4DNA リガーゼ（宝酒造社）を
用いて結合し、ギガパックIIパッケージングエクストラ
クト（ストラタジーン社）に感染させた。得られた形質
転換株を増殖させ、OBM ゲノムDNA が挿入されたコスミ
ドを選択し、pWEOBMと名付け、DNA を精製した。得られ
た約22kbのＯＢＭゲノムＤＮＡを切り出し、アガロース
電気泳動によって分離後、QIAEX IIゲルエクストラクシ
ョンキット（キアゲン社）を用いて精製した。
【００２８】一方、発現コスミドpWESR αを制限酵素Ec
oRI で消化し、フェノール、クロロホルムで抽出した
後、エタノール沈殿し、TEに溶解した。この制限酵素Ec
oRI で消化されたpWESR αとEcoRI-XmnI-NotI アダプタ
ー(#1105、#1156 ；ニューイングランドバイオラボ社）
をT4 DNAリガーゼ（宝酒造社) を用いて結合し、アガロ
ース電気泳動によってフリーのアダプターと分離後、QI
AEX IIゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を
用いて精製した。制限酵素NotIで消化された約22kbのＯ
ＢＭゲノムＤＮＡとアダプターを付加したpWESR αをT4
DNAリガーゼ（宝酒造社) を用いて結合し、ギガパック
IIパッケージングエクストラクト（ストラタジーン社)
を用いてインヴィトロパッケージングを行い、大腸菌XL
1-Blue MR(ストラタジーン社）に感染させた。得られた
形質転換株を増殖させ、OBM ゲノムＤＮＡが挿入された
発現コスミドpWESR αOBM をキアゲンカラム（キアゲン
社)を用いて精製した。OBM 発現コスミドpWESR αOBM
をエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解
し以下の操作に用いた。
oRI で消化し、フェノール、クロロホルムで抽出した
後、エタノール沈殿し、TEに溶解した。この制限酵素Ec
oRI で消化されたpWESR αとEcoRI-XmnI-NotI アダプタ
ー(#1105、#1156 ；ニューイングランドバイオラボ社）
をT4 DNAリガーゼ（宝酒造社) を用いて結合し、アガロ
ース電気泳動によってフリーのアダプターと分離後、QI
AEX IIゲルエクストラクションキット（キアゲン社）を
用いて精製した。制限酵素NotIで消化された約22kbのＯ
ＢＭゲノムＤＮＡとアダプターを付加したpWESR αをT4
DNAリガーゼ（宝酒造社) を用いて結合し、ギガパック
IIパッケージングエクストラクト（ストラタジーン社)
を用いてインヴィトロパッケージングを行い、大腸菌XL
1-Blue MR(ストラタジーン社）に感染させた。得られた
形質転換株を増殖させ、OBM ゲノムＤＮＡが挿入された
発現コスミドpWESR αOBM をキアゲンカラム（キアゲン
社)を用いて精製した。OBM 発現コスミドpWESR αOBM
をエタノールによって沈澱させた後、無菌蒸留水に溶解
し以下の操作に用いた。
【００２９】(iii) ＯＢＭの発現 pWESR αOBM を６ウェルプレートの各ウェル中でCOS-7
細胞にリポフェクトアミンを用いトランスフェクション
し、10％牛胎児血清を含むDMEM中で２日間培養した。5
％透析牛胎児血清を添加した、システイン・メチオニン
不含DMEM（大日本製薬社）に培地交換し(800μl/wel
l）、15分培養した後、Express Protein Labeling Mix
(NEN 社、10mCi/ml) を14μl 添加した。４時間培養
後、10％牛胎児血清を含むDMEMを 200μl 加え1 時間培
養した。細胞をPBS で２回洗浄後、１％TritonX-100、1
％ bovine hemoglobin、10μg/ml leupeptin、0.2 TIU
/ml aprotinin、1mM PMSFを含むTSA バッファ− (0.14M
NaCl、0.025 ％ NaN3 を含む10mM Tris-HCl(pH 8.0))
を0.5 ml加え、氷上１時間静置した。ピペッティングに
より細胞を破砕した後、4 ℃で3000×g 10分間遠心分離
し上清を得た。この上清100 μl に 200μl の希釈バッ
ファ−(0.1％ TritonX-100、0.1 ％ bovine hemoglobi
n、10μg/ml leupeptin、0.2 TIU/ml aprotinin、1mM P
MSFを含むTSA バッファ−）を加え、 protein A Sephar
ose（50μl)とともに4 ℃で1 時間振とうさせた後、4
℃で 1500 ×g にて1 分間遠心分離し上清を回収するこ
とにより、protein A Sepharose に非特異的に吸着する
分画を除いた。この上清にOCIF(1μg)を加え、4 ℃で1
時間振とうさせながらOBM とOCIFを結合させた後、抗OC
IFポリクローナル抗体 (50μg)を加えて４℃で１時間振
とうした。これにprotein A Sepharose(10μl)を加えさ
らに4 ℃で 1時間振とうした。4 ℃で1500×g にて１分
間遠心分離し沈澱画分を回収した。４℃、1500×g で１
分間の遠心分離による沈澱を、希釈バッファ−で２回、
bovine hemoglobin を含まない希釈バッファ−で２回、
TSA バッファ−で１回、50mM Tris-HCl(pH 6.5）で１
回、それぞれ洗浄した。洗浄後、沈澱に10％βメルカプ
トエタノールを含むSDS バッファー（0.125 MTris-HC
l、４％ドデシル硫酸ナトリウム、20％グリセロール、
0.002 ％ブロモフェノールブルー、pH 6.8）を加え、10
0 ℃で５分加熱後 SDS-PAGE(12.5％ポリアクリルアミド
ゲル、第一化学社) を行った。常法によりゲルを固定し
乾燥させ、Amplify(アマシャム社) により、アイソトー
プのシグナルを増強した後、Bio Max MRフィルム(KODAK
社）を用いて-80 ℃で感光させた。結果を図２に示す。
本発明ゲノムＤＮＡにコードされる蛋白質の分子量は約
40,000であることが示された。
細胞にリポフェクトアミンを用いトランスフェクション
し、10％牛胎児血清を含むDMEM中で２日間培養した。5
％透析牛胎児血清を添加した、システイン・メチオニン
不含DMEM（大日本製薬社）に培地交換し(800μl/wel
l）、15分培養した後、Express Protein Labeling Mix
(NEN 社、10mCi/ml) を14μl 添加した。４時間培養
後、10％牛胎児血清を含むDMEMを 200μl 加え1 時間培
養した。細胞をPBS で２回洗浄後、１％TritonX-100、1
％ bovine hemoglobin、10μg/ml leupeptin、0.2 TIU
/ml aprotinin、1mM PMSFを含むTSA バッファ− (0.14M
NaCl、0.025 ％ NaN3 を含む10mM Tris-HCl(pH 8.0))
を0.5 ml加え、氷上１時間静置した。ピペッティングに
より細胞を破砕した後、4 ℃で3000×g 10分間遠心分離
し上清を得た。この上清100 μl に 200μl の希釈バッ
ファ−(0.1％ TritonX-100、0.1 ％ bovine hemoglobi
n、10μg/ml leupeptin、0.2 TIU/ml aprotinin、1mM P
MSFを含むTSA バッファ−）を加え、 protein A Sephar
ose（50μl)とともに4 ℃で1 時間振とうさせた後、4
℃で 1500 ×g にて1 分間遠心分離し上清を回収するこ
とにより、protein A Sepharose に非特異的に吸着する
分画を除いた。この上清にOCIF(1μg)を加え、4 ℃で1
時間振とうさせながらOBM とOCIFを結合させた後、抗OC
IFポリクローナル抗体 (50μg)を加えて４℃で１時間振
とうした。これにprotein A Sepharose(10μl)を加えさ
らに4 ℃で 1時間振とうした。4 ℃で1500×g にて１分
間遠心分離し沈澱画分を回収した。４℃、1500×g で１
分間の遠心分離による沈澱を、希釈バッファ−で２回、
bovine hemoglobin を含まない希釈バッファ−で２回、
TSA バッファ−で１回、50mM Tris-HCl(pH 6.5）で１
回、それぞれ洗浄した。洗浄後、沈澱に10％βメルカプ
トエタノールを含むSDS バッファー（0.125 MTris-HC
l、４％ドデシル硫酸ナトリウム、20％グリセロール、
0.002 ％ブロモフェノールブルー、pH 6.8）を加え、10
0 ℃で５分加熱後 SDS-PAGE(12.5％ポリアクリルアミド
ゲル、第一化学社) を行った。常法によりゲルを固定し
乾燥させ、Amplify(アマシャム社) により、アイソトー
プのシグナルを増強した後、Bio Max MRフィルム(KODAK
社）を用いて-80 ℃で感光させた。結果を図２に示す。
本発明ゲノムＤＮＡにコードされる蛋白質の分子量は約
40,000であることが示された。
【００３０】
【実施例４】本発明ゲノムＤＮＡにコードされる蛋白質
とOCIFとの結合 pWESR αOBM を24ウェルプレートの各ウェル中でCOS 細
胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、
その細胞を2-3 日培養したのち無血清DMEMで洗浄し、こ
れに 125Ｉ標識したOCIF 20ng/mlを加えた結合試験用培
地（0.2 ％牛血清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1m
g/ml heparin、0.2 ％ NaN3 を加えた無血清DMEM） 200
μl を加えた。又、別のウェルには、 125Ｉ標識したOC
IF 20ng/mlに加えて8 μg/mlの非標識OCIFを更に添加し
た結合試験用培地を200 μl 加えて実験を行った。CO2
インキュベーター中（5 ％ CO2）で37℃にて1 時間培養
した後、細胞を0.1mg/mlのheparin を含むリン酸緩衝生
理食塩水500 μl で2 回洗浄した。洗浄後、0.1 N NaOH
溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置する
ことにより細胞を溶解させ、ウェル中の 125Ｉの量をガ
ンマーカウンターで測定した。その結果、図３に示した
ようにpWESR αOBM をトランスフェクトした細胞にのみ
125Ｉ標識したOCIFが結合することが確認された。又、
その結合は、400 倍濃度のOCIFを添加することで著しく
阻害されることが確認された。以上の結果から、pWESR
αOBM 中のゲノムＤＮＡにコードされる蛋白質 OBMは、
COS-7細胞表面でOCIFと特異的に結合することが明らか
となった。
とOCIFとの結合 pWESR αOBM を24ウェルプレートの各ウェル中でCOS 細
胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、
その細胞を2-3 日培養したのち無血清DMEMで洗浄し、こ
れに 125Ｉ標識したOCIF 20ng/mlを加えた結合試験用培
地（0.2 ％牛血清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1m
g/ml heparin、0.2 ％ NaN3 を加えた無血清DMEM） 200
μl を加えた。又、別のウェルには、 125Ｉ標識したOC
IF 20ng/mlに加えて8 μg/mlの非標識OCIFを更に添加し
た結合試験用培地を200 μl 加えて実験を行った。CO2
インキュベーター中（5 ％ CO2）で37℃にて1 時間培養
した後、細胞を0.1mg/mlのheparin を含むリン酸緩衝生
理食塩水500 μl で2 回洗浄した。洗浄後、0.1 N NaOH
溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置する
ことにより細胞を溶解させ、ウェル中の 125Ｉの量をガ
ンマーカウンターで測定した。その結果、図３に示した
ようにpWESR αOBM をトランスフェクトした細胞にのみ
125Ｉ標識したOCIFが結合することが確認された。又、
その結合は、400 倍濃度のOCIFを添加することで著しく
阻害されることが確認された。以上の結果から、pWESR
αOBM 中のゲノムＤＮＡにコードされる蛋白質 OBMは、
COS-7細胞表面でOCIFと特異的に結合することが明らか
となった。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、破骨細胞の分化及び／又
は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質(OBM) を
コードするゲノムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡを用いて遺伝
子工学的手法により該蛋白質を製造する方法、該ゲノム
ＤＮＡを用いて、破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持
又は促進する活性を有する蛋白質 OBMの発現を誘導及び
／又は抑制する物質をスクリーニングする方法、及びそ
のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医
薬組成物が提供される。本発明は、医薬あるいは研究用
試薬として有用である。
は成熟を支持又は促進する活性を有する蛋白質(OBM) を
コードするゲノムＤＮＡ、該ゲノムＤＮＡを用いて遺伝
子工学的手法により該蛋白質を製造する方法、該ゲノム
ＤＮＡを用いて、破骨細胞の分化及び／又は成熟を支持
又は促進する活性を有する蛋白質 OBMの発現を誘導及び
／又は抑制する物質をスクリーニングする方法、及びそ
のスクリーニング方法により得られた物質を含有する医
薬組成物が提供される。本発明は、医薬あるいは研究用
試薬として有用である。
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ 〈１１０〉 YUKIJIRUSHI NYUGYO KABUSHIKIGAISHA (Snow Brand Milk products Co., Ltd.) YS NEW TECHNOLOGY INST., INC. 〈１２０〉 DNA and protein preparing process by using said DNA 〈１３０〉 ＳＮＭＦＰ９８３７６ 〈１６０〉 １４ 〈２１０〉 １ 〈２１１〉 ２０２６ 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 mouse genome 〈２２０〉 〈２２１〉 CDS 〈２２２〉 (1505)・・・・(1726) 〈４００〉 １ tatcagatac tttgaacatg tatactgtga acttgtatca aaatttgtaa gagctaatat 60 ttgtcaccta aaggcacaat tctgattcaa gacatttttt taaaaaactt ttaaaacata 120 ttttttaaaa catacattta ttctagttgt gtggtacata cctttaatcc caccattgag 180 gaggcagaga ggcacagaca gacagaggca cacaaaggac gcgagggcag gtgcagaagc 240 cgacgaggca gaggcagggg caggggcagg ggcaggggca ggggcagggg caggggcagg 300 ggcacgggca cgggcacggg cagggggcac gggcacgagc acaggcacag gcagaggagg 360 cagagatggc agagaggcac aggcagaggc gagtggatct ctgagtttga ggtcagcctg 420 gttcatatag caagctccag gccagcctag tttacataca gagaacttgt ctcaaacaaa 480 taaaccaaaa cgacaacaaa acaataacaa aaatatttgt gcgcgcgcgc gtgtgcgtgc 540 ttgcgcacat gccggaggaa aaggatgagg attcttctgg tcaaattcag gtcctcaaga 600 taagttgcaa gtgccttcac cagctgagcc gtcttattgg ccctcagcat aaggatttct 660 taagcagtga ggcttaactc tgacattagc tctgctaaca gctctttcct gactgttcca 720 tcatcccctc gctgggaagc ctgcatgcag ttttgtaccc tctacccatc cctttgtcta 780 gttcttcctg gctcacccac cccattcttt tcctacttca ttcctctctt acgggagtct 840 ataggctcat tggagcatct gccccatttg aagtcacttt tgagatgaag ataaaggcac 900 ttgggaggga gttctagaat ttccccaagt cttcccaata gcccgtgagg ctatatttgg 960 agggataact gaggctaaac ctcacgattc ttgatggtgg tctcctctaa gattttgaga 1020 gtggtgtaca ggaaagggct tcggacggag ttcactagag ctgacttttt aaatcttaca 1080 gaggaaactg aggcccagag atgcaaagga taggggccag cctagagagc cagaaaccaa 1140 ccactggacc caacccacag cctccacctc agagggccct gatggggagg gaggaggcgg 1200 gtccctgaga gcgaagaaga gtgggagggc gaaggaaagg aaggagggca gatgtgggag 1260 tgaaagaggc accctcctgg aggctgattg gctctggagg ccagctctct ccacgaggtt 1320 tataagagtt agggctgcct ggggtaccct gccatctctc ccacgtcccg gggagccact 1380 gccaggacct ctgtgaaccg gtcggggcgg gggccgcctg gccgggagtc tgctcggcgg 1440 tgggtggccg aggaagggag agaacgatcg cggagcaggg cgcccgaact ccgggcgccg 1500 cgcc atg cgc cgg gcc agc cga gac tac ggc aag tac ctg cgc agc tcg 1549 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser 1 5 10 15 gag gag atg ggc agc ggc ccc ggc gtc cca cac gaa ggt ccg ctg cac 1597 Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His 20 25 30 ccc gcg cct tct gca ccg gct ccg gcg ccg cca ccc gcc gcc tcc cgc 1645 Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg 35 40 45 tcc atg ttc ctg gcc ctc ctg ggg ctg gga ctg ggc cag gtg gtc tgc 1693 Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys 50 55 60 agc atc gct ctg ttc ctg tac ttt cga gcg cag gtga gtgattgaca 1740 Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln 65 70 tccctgtccg agtctctgcg gtgagttggg gggtggggtg ggggctgagt ctggttctag 1800 gacttattct ggaagggaaa gagacccaac cccccacaag gaagggaagt tgggggcctc 1860 cagccaagct catctcctac cagcgcagcg tgcagaagct gaactctgat tctggctgag 1920 gatgggtttg aatttccccc cattggccgc tcccctcgtg tgcctcaagt gatcgcacgc 1980 tttctcccca ccgtgaattt ttcacttgga gttaagaacc aacttc 2026 〈２１０〉 ２ 〈２１１〉 ７４ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 ２ Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro 20 25 30 Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser 35 40 45 Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser 50 55 60 Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln 65 70 〈２１０〉 ３ 〈２１１〉 ４９８ 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 mouse genome 〈２２０〉 〈２２１〉 CDS 〈２２２〉 (169) ・・・(360) 〈４００〉 ４９８ ctgcttctgc cttccatatg ctgggattaa aggtgtatac gaacatgcct ggcttgagga 60 taattttatt atcaaccact ggaggataga aaagtctaag catgaccctt ctcttatcaa 120 gtcacagttc attaactata acccctttca tatcctttcc cctcgtag atg gat cct 177 Met Asp Pro 75 aac aga ata tca gaa gac agc act cac tgc ttt tat aga atc ctg aga 255 Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg 80 85 90 ctc cat gaa aac gca ggt ttg cag gac tcg act ctg gag agt gaa gac 303 Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp 95 100 105 aca cta cct gac tcc tgc agg agg atg aaa caa gcc ttt cag ggg gcc 351 Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala 110 115 120 125 gtg cag aag gtaagtcctc cctgacgtcg taaagtcaag ggtcttgatg 400 Val Gln Lys atgctacagt aactgaatgt taaggcttgt gaagggctaa ctaaaaaatc tatatttcat 460 ctctgctacc ccagacccaa ttggcgaagt gacaccca 498 〈２１０〉 ４ 〈２１１〉 ５４ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 ４ Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg 1 5 10 15 Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu 20 25 30 Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe 35 40 45 Gln Gly Ala Val Gln Lys 50 〈２１０〉 ５ 〈２１１〉 ５７５ 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 mouse genome 〈２２０〉 〈２２１〉 CDS 〈２２２〉 (146) ・・・(191),(274) ・・・(372) 〈４００〉 ５ tcagcttctg gcttcatttt aaagcatcct aactgatttt gcatctggta gtcctgcgta 60 aatatatata tatatatata tttttttttt tcccgctgct ttacacaaag aatgagttta 120 tgaatacagt tctcctttat ttcag gaa ctg caa cac att gtg ggg cca cag 172 Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln 130 135 cgc ttc tca gga gct cca g gtaactatga gtaatttgaa tgagtgtttg 221 Arg Phe Ser Gly Ala Pro A 140 aagtcctgta tgggtggtag tctttaagct catgaacttc tgtcatcccc ag ct atg 278 la Met 145 atg gaa ggc tca tgg ttg gat gtg gcc cag cga ggc aag cct gag gcc 326 Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala 150 155 160 cag cca ttt gca cac ctc acc atc aat gct gcc agc atc cca tcg g 372 Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser G 165 170 175 gtaagttaca tttccaccca gcctgagaac attgtttcaa tctttcattc ttcggccagt 432 ggacttactc aaaccttcta aaccatgagg aggaggtaaa cccttcagtt gaaccctacc 492 ttgccaatcc tgtcacatca tccctgtatt cactctcagg gacggaagtg ggtgtttgag 552 ctcctgccgg ttggtgggtg taa 575 〈２１０〉 ６ 〈２１１〉 ４８ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 ６ Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala 1 5 10 15 Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Aap Val Pro Gln Arg Gly Lys Pro Glu 20 25 30 Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser 35 40 45 〈２１０〉 ７ 〈２１１〉 ２０２９ 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 mouse genome 〈２２０〉 〈２２１〉 CDS 〈２２２〉 (159) ・・・(580) 〈４００〉 ７ aggcccatat agaaaatgag tatcaaagta agttattgtg ttggaataag gattgttatg 60 ttagtgtatg atgctacccc accagcctgt ggaaataatg aggaactttt ctcatccaag 120 tagtggattc taaatcctgt gcctttgttt ctctctag gt tcc cat aaa gtc act 175 ly Ser His Lys Val Thr 180 ctg tcc tct tgg tac cac gat cga ggc tgg gcc aag atc tct aac atg 223 Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met 185 190 195 acg tta agc aac gga aaa cta agg gtt aac caa gat ggc ttc tat tac 271 Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr 200 205 210 ctg tac gcc aac att tgc ttt cgg cat cat gaa aca tcg gga agc gta 319 Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Ser Val 215 220 225 230 cct aca gac tat ctt cag ctg atg gtg tat gtc gtt aaa acc agc atc 367 Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile 235 240 245 aaa atc cca agt tct cat aac ctg atg aaa gga ggg agc acg aaa aac 415 Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn 250 255 260 tgg tcg ggc aat tct gaa ttc cac ttt tat tcc ata aat gtt ggg gga 463 Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly 265 270 275 ttt ttc aag ctc cga gct ggt gaa gaa att agc att cag gtg tcc aac 511 Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn 280 285 290 cct tcc ctg ctg gat ccg gat caa gat gcg acg tac ttt ggg gct ttc 559 Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe 295 300 305 310 aaa gtt cag gac ata gac tga gactcatttc gtggaacatt agcatggatg 610 Lys Val Gln Asp Ile Asp 315 tcctagatgt ttggaaactt cttaaaaaat ggatgatgtc tatacatgtg taagactact 670 aagagacatg gcccacggtg tatgaaactc acagccctct ctcttgagcc tgtacaggtt 730 gtgtatatgt aaagtccata ggtgatgtta gattcatggt gattacacaa cggttttaca 790 attttgtaat gatttcctag aattgaacca gattgggaga ggtattccga tgcttatgaa 850 aaacttacac gtgagctatg gaagggggtc acagtctctg ggtctaaccc ctggacatgt 910 gccactgaga accttgaaat taagaggatg ccatgtcatt gcaaagaaat gatagtgtga 970 agggttaagt tcttttgaat tgttacattg cgctgggacc tgcaaataag ttcttttttt 1030 ctaatgagga gagaaaaata tatgtatttt tatataatgt ctaaagttat atttcaggtg 1090 taatgttttc tgtgcaaagt tttgtaaatt atatttgtgc tatagtattt gattcaaaat 1150 atttaaaaat gtctcactgt tgacatattt aatgttttaa atgtacagat gtatttaact 1210 ggtgcacttt gaattcccct gaaggtactc gtagctaaag gggcagaata ctgtttctgg 1270 tgaccacatg tagtttattt ctttattctt tttaacttaa tagagtcttc agacttgtca 1330 aaactatgca agcaaaataa ataaataaaa ataaaatgaa taccttgaat aataagtagg 1390 atgttggtca ccaggtgcct ttcaaattta gaagctaatt gactttagga gctgacatag 1450 ccaaaaagga tacataatag gctactgaaa tctgtcagga gtatttatgc aattattgaa 1510 caggtgtctt tttttacaag agctacaaat ttgtaaattt tgtttctttt ttttcccata 1570 caaaatgtac tatagtttat cagccaaaaa acaatccact ttttaattta gtgaaagtta 1630 ttttattata ctgtacaata aaagcattgt ctctgaatgt ttaatttttt ggtacaaaaa 1690 ataaatttgt acgaaaacct gcctggtgct ttttgttctt gttcgctttc gtgtgggtct 1750 tgctctgcga tcctgttctt tccaatatga taatgtggct tctatctttc tccaaaggtt 1810 actgggagaa gtgcagattt aattaaaaac taggaacaga ttcaattaaa ttaatgaacc 1870 ttggaatttg aaaaataatt tgcaggggat ttgtatgcaa ggatgtagcc agagagaaaa 1930 cagacttttc actcaaaaaa ggaaaagttt tctctcctca aatcatgaga aaaatatggt 1990 gctttgagct ggggggaaat tggggcttgc tttccctta 2029 〈２１０〉 ８ 〈２１１〉 １３９ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 ８ Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala 1 5 10 15 Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln 20 25 30 Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu 35 40 45 Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val 50 55 60 Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly 65 70 75 80 Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser 85 90 95 Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser 100 105 110 Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr 115 120 125 Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp 130 135 〈２１０〉 ９ 〈２１１〉 ９５１ 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 ９ atgcgccggg ccagccgaga ctacggcaag tacctgcgca gctcggagga gatgggcagc 60 ggccccggcg tcccacacga gggtccgctg caccccgcgc cttctgcacc ggctccggcg 120 ccgccacccg ccgcctcccg ctccatgttc ctggccctcc tggggctggg actgggccag 180 gtggtctgca gcatcgctct gttcctgtac tttcgagcgc agatggatcc taacagaata 240 tcagaagaca gcactcactg cttttataga atcctgagac tccatgaaaa cgcaggtttg 300 caggactcga ctctggagag tgaagacaca ctacctgact cctgcaggag gatgaaacaa 360 gcctttcagg gggccgtgca gaaggaactg caacacattg tggggccaca gcgcttctca 420 ggagctccag ctatgatgga aggctcatgg ttggatgtgg cccagcgagg caagcctgag 480 gcccagccat ttgcacacct caccatcaat gctgccagca tcccatcggg ttcccataaa 540 gtcactctgt cctcttggta ccacgatcga ggctgggcca agatctctaa catgacgtta 600 agcaacggaa aactaagggt taaccaagat ggcttctatt acctgtacgc caacatttgc 660 tttcggcatc atgaaacatc gggaagcgta cctacagact atcttcagct gatggtgtat 720 gtcgttaaaa ccagcatcaa aatcccaagt tctcataacc tgatgaaagg agggagcacg 780 aaaaactggt cgggcaattc tgaattccac ttttattcca taaatgttgg gggatttttc 840 aagctccgag ctggtgaaga aattagcatt caggtgtcca acccttccct gctggatccg 900 gatcaagatg cgacgtactt tggggctttc aaagttcagg acatagactg a 951 〈２１０〉 １０ 〈２１１〉 ３１６ 〈２１２〉 PRT 〈２１３〉 mouse 〈４００〉 １０ Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro 20 25 30 Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser 35 40 45 Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser 50 55 60 Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu 85 90 95 Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro 100 105 110 Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys 115 120 125 Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala 130 135 140 Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu 145 150 155 160 Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser 165 170 175 Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp 180 185 190 Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn 195 200 205 Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His 210 215 220 Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr 225 230 235 240 Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys 245 250 255 Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr 260 265 270 Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile 275 280 285 Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala 290 295 300 Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp 305 310 315 〈２１０〉 11 〈２１１〉 21 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 Artificial Sequence 〈２２０〉 〈２２３〉 Description of Artificial sequence: Synthesized DNA 〈４００〉 11 AAACGCAAAA AACCAGAAAG G 21 〈２１０〉 12 〈２１１〉 17 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 Artificial Sequence 〈２２０〉 〈２２３〉 Description of Artificial sequence: Synthesized DNA 〈４００〉 12 GTAAAACGAC GGCCAGT 17 〈２１０〉 13 〈２１１〉 17 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 Artificial Sequence 〈２２０〉 〈２２３〉 Description of Artificial sequence: Synthesized DNA 〈４００〉 13 CAGGAAACAG CTATGAC 17 〈２１０〉 14 〈２１１〉 22 〈２１２〉 DNA 〈２１３〉 Artificial Sequence 〈２２０〉 〈２２３〉 Description of Artificial sequence: Synthesized DNA 〈４００〉 14 AAGCCCCAAA GTACGTCGCA TC 22
【図１】本発明ゲノムＤＮＡの構造を示す。
（Ａ）：ＯＢＭｃＤＮＡ （Ｂ）：本発明ゲノムＤＮＡ（ＯＢＭゲノムＤＮＡ） ５’−ＵＴ及び３’−ＵＴ：非翻訳領域 ＩＣ：細胞内領域 ＴＭ：細胞膜領域 ＥＣ：細胞外領域 Ｂ：制限酵素Ｂａｍ ＨＩにより消化される部位 Ｅ１：配列表配列番号１に示されるエキソン領域 Ｅ２：配列表配列番号３に示されるエキソン領域 Ｅ３：配列表配列番号５に示されるエキソン領域 Ｅ４：配列表配列番号５に示されるエキソン領域 Ｅ５：配列表配列番号７に示されるエキソン領域
【図２】実施例３における、SDS-PAGEの結果を示す。
レーン１：分子量マーカー レーン２：pWESR αOBM をトランスフェクトした COS-7
細胞の蛋白質を、OCIF無添加で免疫沈降させたもの。 レーン３：pWESR αOBM をトランスフェクトした COS-7
細胞の蛋白質を、OCIFを添加して免疫沈降させたもの。
細胞の蛋白質を、OCIF無添加で免疫沈降させたもの。 レーン３：pWESR αOBM をトランスフェクトした COS-7
細胞の蛋白質を、OCIFを添加して免疫沈降させたもの。
【図３】実施例４における、125Iで標識したOCIFの、pW
ESR αOBM をトランスフェクトした COS-7細胞への結合
試験の結果を示す。
ESR αOBM をトランスフェクトした COS-7細胞への結合
試験の結果を示す。
レーン１及び２：125Iで標識したOCIFの、pWESR αOBM
をトランスフェクトした COS-7細胞への結合量。 レーン３及び４：125Iで標識したOCIFの、pWESR αOBM
をトランスフェクトした COS-7細胞への結合量(400倍濃
度の未標識OCIF添加時) 。
をトランスフェクトした COS-7細胞への結合量。 レーン３及び４：125Iで標識したOCIFの、pWESR αOBM
をトランスフェクトした COS-7細胞への結合量(400倍濃
度の未標識OCIF添加時) 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小平 邦彦 栃木県河内郡南河内町緑６−28−２ アヴ ェニールソルティー Ｂ−202 (72)発明者 小平 耕子 栃木県河内郡南河内町緑６−28−２ アヴ ェニールソルティー Ｂ−202 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA06 GA11 GA18 HA01 4B063 QA01 QA08 QQ02 QQ79 QR32 QR38 QR56 QS03 QS16 QS28 QX07 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4H045 AA20 AA30 CA40 EA51 FA74 HA05 HA06
Claims (5)
- 【請求項１】 以下の物理化学的性質を有する蛋白質を
コードするゲノムＤＮＡ。 a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesi
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下における SDSポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約 30,000-40,000の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン（ＰＴＨ）などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス
骨芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養にお
いて、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を
有する。 - 【請求項２】 配列表配列番号1, 3, 5 及び７に記載さ
れた配列を含む、請求項１記載のゲノムＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡを発現ベク
ターに挿入し、遺伝子工学的手法により製造することを
特徴とする、次の物理化学的性質を有する蛋白質の製造
法。 a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子(OCIF)に特異的に結
合し、高い親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9
以下) を有する。 b. 分子量：非還元条件下における SDSポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約 30,000-40,000の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡを用いて、
以下の物理化学的性質を有する蛋白質（OCIF binding m
olecule; OBM) の発現を誘導及び／又は抑制する物質を
スクリーニングする方法。 a. 親和性：破骨細胞形成抑制因子（osteoclastogenesi
s inhibitory factor；OCIF) に特異的に結合し、高い
親和性（細胞膜上での解離定数、Kd値が10-9以下) を有
する。 b. 分子量：非還元条件下における SDSポリアクリルア
ミド電気泳動による分子量測定で、約 30,000-40,000の
分子量を示し、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさ
せた場合の見かけ上の分子量は、約90,000-110,000を示
す。 c. 生物活性：活性型ビタミンＤ3 及び副甲状腺ホルモ
ン(PTH) などの、骨吸収促進因子存在下でのマウス骨芽
細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養におい
て、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有
する。 - 【請求項５】 請求項４記載の方法により得られた物質
を含有する医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10292971A JP2000102390A (ja) | 1998-09-30 | 1998-09-30 | Ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10292971A JP2000102390A (ja) | 1998-09-30 | 1998-09-30 | Ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000102390A true JP2000102390A (ja) | 2000-04-11 |
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ID=17788805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10292971A Pending JP2000102390A (ja) | 1998-09-30 | 1998-09-30 | Ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000102390A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023549A1 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | University Of Western Australia | Rat osteoclast differentiation factor |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7749960B2 (en) | 2001-04-03 | 2010-07-06 | Nestec S.A. | Osteoprotegerin in milk |
-
1998
- 1998-09-30 JP JP10292971A patent/JP2000102390A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023549A1 (en) * | 1999-09-29 | 2001-04-05 | University Of Western Australia | Rat osteoclast differentiation factor |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7785873B2 (en) | 2001-01-19 | 2010-08-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7749960B2 (en) | 2001-04-03 | 2010-07-06 | Nestec S.A. | Osteoprotegerin in milk |
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