JPH10507342A - カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプター - Google Patents
カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプターInfo
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Abstract
(57)【要約】
ヒトCGRPレセプターポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順が、開示される。また、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために、このようなポリペプチドを利用する方法が開示される。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストは、ガン、関節炎、疼痛、糖尿病、片頭痛、および炎症を治療的に処置するために用いられ得、そしてアゴニストは高カルシウム血症、肥満症、高血圧症および骨再構築の疾患を処置するために用いられ得る。レセプターポリペプチドをコードする核酸配列における変異の存在を検出する診断アッセイもまた開示される。
Description
【発明の詳細な説明】
カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプター
本出願は、1994年8月16日に提出された、係属中のPCT出願番号第PCT/US94/09
235号の一部継続出願である。
本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関
する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、ヒト7-膜貫通レセプターであ
り、その7-膜貫通レセプターは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプターと
して同定され、本明細書中以後時々「CGRP」という。本発明はまた、このような
ポリペプチドの作用を阻害することに関する。
医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Gタンパク質および/またはセカ
ンドメッセンジャー(例えば、cAMP)を含むシグナル伝達経路に関与するタンパ
ク質により媒介されることは、十分に確立されている(Lefkowitz,Nature,351
:353-354(1991))。本明細書中では、これらのタンパク質を、Gタンパク質を用
いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク
質のいくつかの例は、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)(例えば、アドレナ
リン作動性薬剤およびドーパミンに対するGタンパク質共役レセプター(Kobilk
a,B.K.ら,PNAS,84:46-50(1987); Kobilka,B.K.ら,Science,238:650-656(1
987); Bunzow,J.R.ら,Nature,336:783-787(1988)))、Gタンパク質それ自
体、エフェクタータンパク質(例えば、ホスホリパーゼC、アデニルシクラーゼ
、およびホスホジエステラーゼ)、ならびにアクチュエータータンパク質(actu
ator protein)(例えば、プロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼC(S
imon,M.I.ら,Science,252:802-8(1991)))を含む。
例えば、シグナル伝達の1つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内にお
ける酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は
、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与
え
る。Gタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる
。Gタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合GDPに
変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル
酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Gタンパク質それ自体によ
り触媒され、Gタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Gタンパク質
は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシ
グナルの持続時間を制御する時計としての2つの役割を果たす。
本発明のレセプターの推定アミノ酸配列は、Gタンパク質共役レセプターに特
有な7つの疎水性領域の存在を実証する。またそれは、セクレチン/グルカゴン
ファミリーのペプチドに属するさらなるホルモンに対するレセプターを含むGタ
ンパク質共役レセプターの明らかなファミリーのメンバーであり得る。セクレチ
ン/グルカゴンファミリーのペプチドはまた、ヒトカルシトニンレセプターと有
意な配列の同一性を表すことが示されている。このファミリーのペプチドのメン
バーはまた、血管作用性腸ペプチド(VIP)(Aishiharaら、Embo J.,10:1635-1
641(1991))、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)(Mayo,K.E.ら、Mol.Endocr
inol.,6:1734-1744(1992))、およびグルカゴン様ペプチド1(Thornes,B.Pn
as,USA,85:8641-8645(1992))に対するレセプターを含む。このリガンドファ
ミリーの他のメンバーの間の交差反応性は、胃抑制性ペプチド(GIP)、下垂体
アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)、ヒスチジンのN末端およびイ
ソロイシンのC末端を有するペプチド(PHI)ならびにヘロデルミン(helodermi
n)を含み、これらのリガンドに対するレセプターもこのファミリーに属するよ
うであることを示唆する。
この新規レセプターファミリーの構造上特色の分析により、7つの膜貫通モチ
ーフならびに保存されたシステインおよび数カ所のN結合グリコシル化部位を含
む長いアミノ末端細胞外領域、ならびにリーダー配列として機能し得るアミノ末
端疎水性ストレッチを含むいくつかの保存された構造モチーフが示される。
調節ペプチドのカルシトニンファミリーは、5つの既知のメンバーを含む:カ
ルシトニン(CT)、2つのカルシトニン遺伝子関連ペプチド(αおよびβ-CGRP
)、小島アミロイドポリペプチド(IAPPまたはアミリン)、サケカルシトニン
(sCT)およびアドレノメジュリン(adrenomedulin)。これらのペプチドはそれ
ぞれ骨粗鬆症、高血圧症、および成人発症型糖尿病の病態生理学に関係している
。CGRPは異なる作用の多血症を伴うペプチドである。神経伝達物質は心臓血管系
および胃腸管に対する効果を有するため、数秒以内に効果を生じ得る。神経モデ
ュレーターは神経系中に存在するため、数分にわたり効果を生じる。炎症におい
て神経モデュレーターはオータコイド因子として作用し、数時間以上の期間、血
管拡張を生じる。栄養因子はCNS内および骨格筋において作用するので、何日間
も変化が続く。CGRPもまた、1つのセカンドメッセンジャー経路以上に刺激し得
る。
本発明のCGRPポリペプチドは、CGRPに特異的に結合することが見出され、そし
てヒトカルシトニンレセプターと55%のアミノ酸配列の同一性を有する。
本発明の1つの局面によれば、新規のCGRPポリペプチド、ならびに生物学的に
活性なおよび診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログ、および誘
導体が提供される。本発明のCGRPレセプターは、ヒト起源のものである。
本発明の別の局面によれば、CGRPレセプターポリペプチドをコードする単離さ
れた核酸分子(mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む)、ならびに生物学的に活性
なおよび診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体
が提供される。
本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により
生成するためのプロセスが提供される。このプロセスは、CGRPレセプターの核酸
配列を含有する組換え原核生物および/または真核生物宿主細胞を、このタンパ
ク質の発現およびその後の該タンパク質の回収を促進する条件下で培養する工程
を包含する。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が
提供される。
別の実施態様によれば、レセプターアンタゴニストおよび/またはアゴニスト
ならびに/あるいはレセプターリガンドをスクリーニングするために、CGRPレセ
プターポリペプチドを用いるためのプロセスが提供される。
本発明のさらに別の実施態様によれば、このようなアゴニストを治療上の目的
、例えば、高カルシウム血症、骨粗鬆症、パジェット病、高血圧症、肥満症、冠
状
動脈疾患、悪性腫瘍における高カルシウム血症を治療するため、免疫反応、脈管
形成を刺激するため、およびスーパーオキシドラジカル産生の阻害に用いるプロ
セスが提供される。
本発明の別の局面によれば、このようなアンタゴニストを疼痛伝達(pain tra
nsmission)、関節炎、成人発症型糖尿病、慢性炎症、片頭痛、および一定のガ
ンの治療に用いるプロセスが提供される。
本発明の別の局面によれば、CGRPレセプター配列に特異的にハイブリダイズす
るに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。
本発明の別の局面によれば、CGRPレセプター核酸配列およびこのような核酸配
列によりコードされるレセプター内の変異に関連する疾患またはこのような疾患
に対する罹病性を診断する方法を提供する。
本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究(DNAの合成、およびDNAベク
ターの製造)に関するインビトロの用途のために、このようなポリペプチド、ま
たはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプ
ロセスを提供する。
本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明
らかであるべきである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、および請求の範囲に含まれる
本発明の範囲を限定することを意味しない。
図1は、本発明のCGRPレセプターポリペプチドのcDNA配列および対応する推定
のアミノ酸配列を示す。最初のメチオニンアミノ酸は、スレオニン(Thr)残基
で終わる21アミノ酸の推定のリーダー配列の一部である。アミノ酸のための標準
的な1文字略記が用いられている。推定の真の開始コドンから−1アミノ酸およ
び−11アミノ酸上流の位置に、2つの隠れたATGコドン(下線)が存在する。
図2。推定されるタンパク質のハイドロパシープロットは7つの疎水性(膜貫
通)領域および推定のN末端シグナル配列の存在を示す。
図3。哺乳動物細胞におけるCGRPレセプタータンパク質の発現のために使用さ
れ得るベクターの環状マップ。cDNAのコード領域を哺乳動物発現ベクターCDNのK
pnI/BamHI部位にクローン化し、構築物pCDNHCGRPrを形成した。
図4。CGRPレセプター発現構築物であるpCDNHCGRPrを用いて一過的にトランス
フェクトした293細胞内におけるcAMP応答:(A)トランスフェクトしない細胞
(コントロール)、0.3μMヒトCGRPに対するcAMPの応答において変化は観察され
なかった。(B)トランスフェクトした細胞、2回の別個の実験においてcAMPの
応答は10〜15倍に変化した。値は平均+/−標準誤差を示す。この結果は、組換
えレセプターがCGRPへの曝露に応答してcAMPと機能的に結合することを示す。
図5。CGRPレセプターcDNAを用いて形質転換した個々の293安定細胞株におけ
るcAMPの応答。細胞を0.3μMのヒトCGRPに曝露した。コントロールの293細胞の
基底値は、29〜130 pmol/ウエルであった。クローン番号22はヒトCGRP処理に対
して最大の応答(約100倍の刺激)を示した。
図6。CGRPレセプターcDNAを用いて安定に形質転換した293細胞(図5のクロ
ーン22の細胞)における、ヒトCGRP媒介性cAMPの蓄積の用量応答。各データポイ
ントは、3連の測定の平均を示す。トランスフェクトしないコントロールの293
細胞は、1,000 nMの濃度で2倍の刺激を示した。計算されたEC50値は、0.9 nMで
あった。この結果は組換えレセプターがヒトCGRPと機能的に結合することを示す
。
図7。CGRPレセプターcDNAを用いて安定に形質転換した293細胞における、CGR
P媒介性cAMPの蓄積に対するCGRPレセプターアンタゴニストであるCGRP(8-37)
の効果。6ウエルプレート内の細胞を37℃で10分間、100 nMのヒトCGRP(8-37)
の非存在下(□)または存在下(■)において漸増濃度のヒトCGRPと共にインキ
ュベートした。サイクリックAMPをRIAによりアッセイした。データは2回の別個
の実験における3連の測定の平均として示される。ヒトCGRP(8-37)(100 nM)
を含む場合、CGRP濃度反応曲線は競合的な様式で右にシフトする。ヒトCGRP(8-
37)はそれ自体、cAMP蓄積に何の影響も有しなかった(データは示さず)。計算
されたpA2値は7.8であった。この結果は組換えレセプターが体質的にCGRPレセプ
ターであることを確実にする。
図8。飽和結合(saturation binding)。(A)CGRPレセプターcDNAを用いて
安定に形質転換した293細胞(クローン22)由来の膜への[125I]ヒトCGRPの結合
。平衡結合を25℃で60分間測定した。特異的な結合(■)を、0.1μMの非標識ヒ
トCGRPの非存在下(□)または存在下(◆)での結合の間の差として得た。デー
タ
は2連で行った3つの独立した実験のうちの1つの代表的な実験に由来する。
(B)[125I]CGRP結合のスキャッチャードプロット。観察されたKdは18.6 pM
およびBmaxは89 fmol/mgタンパク質であった。この結果は高親和性かつ低密度の
結合を示す。
図9。競合的結合のプロフィール。CGRPレセプターcDNAを用いて安定に形質転
換した293細胞(クローン22細胞)から調製した膜に結合する[125I]ヒトCGRPに
対する代表的なCGRPアナログについての競合曲線。各曲線は、それぞれ2連で行
った2〜3の独立した実験を表す。競合研究において、有効性の順位の順序は、
ヒトCGRP(■)>ヒトCGRP(8-37)(□)>ヒトアドレノメジュリン(ADM)(
●)>>>>サケカルシトニン(sCT)(○)、ヒトカルシトニン(hCT)
およびサケカルシトニン(8-32)(sCT(8-32))(▲)であった。これらの結果
は、本CGRPレセプターが天然のCGRPレセプターと類似した薬理学的プロフィール
を有することを示す。
図10。ヒトカルシトニンレセプターポリペプチド(下段)に対するCGRPレセプ
ターポリペプチド(上段)のアミノ酸配列比較。これはアミノ酸レベルで72%の
類似性および55%の同一性を示す。
図11。ラットカルシトニン様レセプター(下段)に対するCGRPレセプターポリ
ペプチド(上段)のアミノ酸配列比較。これはアミノ酸レベルで91%の同一性を
示す。
本発明の局面によれば、図1(配列番号2)の推定のアミノ酸配列を有する成
熟ポリペプチドをコードするか、またはATCC寄託番号75824として1994年6月24
日に寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
る単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、肺、心臓および腎臓
において見出され得る。本発明のポリヌクレオチドが、ヒト滑膜由来のcDNAライ
ブラリーにおいて発見された。これは、Gタンパク質共役レセプターファミリー
に構造的に関係する。これは、461アミノ酸残基のタンパク質をコードするオー
プンリーディングフレームを含む。このタンパク質の最初の約21アミノ酸残基は
推定のリーダー配列であり、それゆえ、成熟タンパク質は440アミノ酸を含む。
このタンパク質は、ラットカルシトニン様レセプターに全アミノ酸配列にわたり
88%の同一性および93%の類似性で、最も高い程度の相同性を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは
、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり
得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図1(配列番号1)に示
すコード配列と同一であり得るか、または寄託したクローンのコード配列と同一
であり得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、コード配列が、遺伝コードの
重複(redundancy)または縮重(degeneracy)の結果として、図1(配列番号1
)のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード
配列であり得る。
図1(配列番号2)の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは:成熟ポリペプチドのコー
ド配列のみ;成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列(例えば
、リーダー配列);成熟ポリペプチドのコード配列(および必要に応じて付加的
なコード配列)ならびに非コード配列(例えば、イントロンまたは成熟ポリペプ
チドのコード配列の5’および/または3’の非コード配列)を包含し得る。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および
/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメ
ント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチド
の変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存
在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であ
り得る。
従って、本発明は、図1(配列番号2)に示すものと同じ成熟ポリペプチドま
たは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含す
る。これらの変異体は、天然のスプライシング変異体または組換えDNA技術由来
の変異体のいずれかであり、図1(配列番号2)のポリペプチドまたは寄託した
クローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、また
はアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換
変異体、および付加または挿入変異体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)に
示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝
子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝
子変異体は、1以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌ
クレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実
質的には変化させない。
本発明はまた、成熟ポリペプチドをコードする配列がポリヌクレオチド配列
に同じリーディングフレーム内で融合され得るポリヌクレオチドを包含する。こ
のポリヌクレオチド配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助
ける(例えば、細胞からのポリペプチドまたはポリペプチドの一部の輸送を制御
するための分泌配列として機能するリーダー配列)。ポリヌクレオチドはまた、
成熟タンパク質およびさらなる5’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコード
し得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてそれ
は不活性型のタンパク質である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タン
パク質が残る。CGRPレセプターの可溶性形態は、推定のリーダー配列または成熟
ポリペプチドの膜に結合しない別の部分を欠く成熟ポリペプチドであり得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する
pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例
えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が使用される場合
、ヘマグルチニン(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチ
ニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson,I.ら、Cell、37:767(19
8
4))。
本発明はさらに、配列間に少なくとも50%および好ましくは70%の同一性が存
在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する
用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95%および好ましくは
少なくとも97%の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じる
ことを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1(配列番号1)のcDNAまたは寄
託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能ま
たは生物学的活性のいずれかを保持するポリペプチドをコードする。すなわちこ
のポリペプチドは、CGRPレセプターとして機能するか、またはこのポリペプチド
がCGRPレセプターとして機能しない(例えばレセプターの可溶性形態)場合でも
、レセプターに対してリガンドが結合する能力を保持する。
本明細書中でいう寄託物(単数または複数)は、特許手続きの目的のための微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これら
の寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄
託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列のいかなる記
載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、使用、または販売す
るためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によ
って与えられるわけではない。
本発明はさらに、図1(配列番号2)の推定アミノ酸配列を有する、または寄
託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するCGRPレセプターポリペプチ
ド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体
に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図1(配列番号
2)のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをい
う場合は、このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的
活性のいずれかを保持するポリペプチドを意味する。すなわちこのポリペプチド
は、CGRPレセプターとして機能するか、またはこのポリペプチドがCGRPレセプタ
ーとして機能しない(例えばレセプターの可溶性形態)場合でも、リガンドまた
はレセプターに結合する能力を保持する。アナログは、プロタンパク質部分の切
断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包
含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または
合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図1(配列番号2)のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされる
ポリペプチドの、フラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で1
つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ
酸残基)で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コード
によりコードされるアミノ酸残基であるかもしれないかまたはないかもしれない
フラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(ii)その中で1つ以上のアミ
ノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは
(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物(
例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物に融合されているフラグ
メント、誘導体、またはアナログ、あるいは(iv)その中でリーダー配列または分
泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列のようなさらなるアミ
ノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログで
あり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の
教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境(例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが
、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌ
ク
レオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチド
はベクターの一部であり得、および/またはこのようなポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクターまたは組成
物がその天然の環境の一部ではないのでなお単離され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペ
プチドを生成することに関する。
宿主細胞は、本発明のベクター(これは例えば、クローニングベクターまたは
発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入または形質転換または
トランスフェクト)される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、またはCRT遺伝子を増幅するために適切に改変された
従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現
のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には
明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか1つに含まれ得る。このようなベクター
は、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体;
細菌性プラスミド;ファージDNA;バキュロウイルス;酵母プラスミド;プラス
ミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA(例えば
、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病など)である
。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベ
クターが使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(単数また
は複数)に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲
内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列(1つまたは複数)(プロ
モーター)に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモー
ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る:LTRまたはSV40プロモーター
、E.coli lacまたはtrp、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真
核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である
他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するため
の適切な配列を含み得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性(例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、またはE .coliにおけるテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性)を提供する1つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る:細菌細胞(例えば、E .coli
、Streptomyces、Salmonella typhimurium);真菌細胞(例えば酵母)
;昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9);動物細胞(例え
ば、CHO、COSまたはBowes黒色腫);アデノウイルス;植物細胞など。適切な宿
主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した1つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター)を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向
または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物
はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを包含
する)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性:pQ
E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript
SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene);ptrc99a、pKK223-
3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、
pXT1、pSG(Stratagene);pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿
主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまた
はベクターも使用され得る。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。2つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特に
よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、およ
びtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV4
0および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインI
を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベ
ルの範囲内にある。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核細胞(例え
ば、酵母細胞)であり得るか、あるいは宿主細胞は原核細胞(例えば、細菌細胞
)であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレ
ーションにより達成され得る(Davis,L.、Dibner,M.、Battey,I.、Basic Meth
ods in Molecular Biology,(1986))。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来
のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク
質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る
。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現
ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(
Cold Spring Harbor、N.Y.,(1989))(この開示は、本明細書中に参考として援
用されている)に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの
シス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーター
に作用してその転写を増加させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側の
SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複
製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー
が挙げられる。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー(例えば、E .coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS .cerevi siae
のTRPI遺伝子)および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来
するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素(例え
ば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は
、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質ま
たはその一部を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダ
ー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴(
例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製)を与えるN末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み
とり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナ
ルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、
1つ以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、お
よび所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換
のための適切な原核宿主は、E .coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimu rium
、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、
周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市
販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。こ
のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals、Up
psala、Sweden)およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。
これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造
配列と組み合わされる。
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選
択されたプロモーターは、適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)
により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載され
ているサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他
の細胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)を包含する。哺
乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、お
よびまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド
ナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および5’フラン
キング非転写配列を含有し得る。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由
来するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得
る。
CGRPレセプターポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物か
ら回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノー
ル沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレ
クチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りた
たみ(refolding)工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され
得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用
いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により)から組換え技術により生成さ
れ得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは
、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペ
プチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
本発明のレセプターはCGRPと結合し、そしてカルシトニンレセプターと高度の
アミノ酸配列の相同性を有する。それゆえ、本発明のレセプターは、レセプター
のアンタゴニストおよび/またはアゴニスト(共に天然のペプチドおよび非ペプ
チド)のスクリーニングのプロセスに用いられ得る。
一般に、このようなスクリーニング手順は細胞表面上にレセプターを発現する
適切な細胞を提供する工程を包含する。特に、本発明のレセプターをコードする
ポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトするために用いられ、それにより
、細胞表面上にCGRPレセプターを発現する。このようなトランスフェクションは
本明細書中上記のような手順によって達成され得る。
1つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のCGRPレセプターを発現する
ようにトランスフェクトされたメラニン細胞の使用を包含する。このようなスク
リーニング技術は1992年2月6日に公開されたPCT WO 92/01810中に記述される
(本明細書中に参考として援用される)。
従って、例えば、このようなアッセイは、CGRPレセプターをコードするメラニ
ン細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングされる化合物の両方と接触さ
せることにより、レセプターアンタゴニストのスクリーニングに用いられ得る。
リガンドによって生じるシグナルの阻害は、化合物がレセプターの潜在的なアン
タゴニストであること、すなわち、化合物がレセプターの活性化を阻害すること
を示す。
このスクリーニング法は、このような細胞とスクリーニングされる化合物とを
接触させることによりアゴニストを決定するために用いられ得、かつこのような
化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すなわち、このような化合物がレ
セプターを活性化しcAMPの蓄積を刺激するか否かを決定するために用いられ得る
。
他のスクリーニング技術としては、レセプターの活性化により引き起こされる
細胞外のpH変化を測定する系において、CGRPレセプターを発現する細胞(例えば
、トランスフェクトCHO細胞)の使用が挙げられる。例えば、Science 246巻、18
1〜296頁(1989年10月)に記載される。この開示内容は本明細書中に参考として
援用される。例えば、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、CGRPレセプ
ターを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答(例えば
、シグナルトランスダクションまたはpH変化)またはレポーター遺伝子系(例え
ば、ルシフェラーゼ)を使用することが、潜在的アゴニストまたはアンタゴニス
トが効果的か否かを決定するために測定され得る。
別のこのようなスクリーニング技術は、CGRPレセプターをコードするRNAをXen
opus卵母細胞に導入し、一過的にレセプターを発現させることを包含する。次い
でそのレセプター卵母細胞はレセプターリガンドおよびスクリーニングされる化
合物と接触され得、続いて、アンタゴニストスクリーニングの場合にはカルシウ
ムまたはcAMPシグナルの阻害の検出が行われ、あるいはアゴニストの場合にはカ
ルシウムまたはcAMPシグナルの刺激の検出が行われる。
別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼCまたはDと連
結されるCGRPレセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、
内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが述べられ得る。アンタゴニストまたは
アゴニストのスクリーニングは、本明細書中上記のように、ホスホリパーゼの2
次シグナルによるレセプターの活性化またはレセプターの活性化の阻害の検出に
より達成され得る。
別の方法は、その表面にレセプターを有する細胞または膜への標識リガンドの
結合の阻害を決定することによるCGRPレセプターインヒビターのスクリーニング
を包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するように
CGRPレセプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、およ
び標識形態の公知のリガンドの存在下で潜在的なアンタゴニストと細胞とを接触
させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得る。標
識リガンドがレセプターに結合する量は、例えば、レセプターの放射活性の測定
により測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定される
ように潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合する場合、標識リガンドのレ
セプターへの結合は阻害される。
別の方法は、CGRP媒介cAMPおよび/またはアデニル酸シクラーゼの蓄積の阻害
を決定することによりCGRPインヒビターをスクリーニングする工程を包含する。
このような方法は真核細胞をCGRPレセプターでトランスフェクトし、細胞表面上
にレセプターを発現させる工程を包含する。次いで、この細胞はCGRPの存在下で
潜在的なアンタゴニストに曝露される。cAMPの蓄積量を続いて測定する。潜在的
なアンタゴニストがレセプターに結合し、そしてそれゆえCGRPの結合を阻害する
ならば、CGRP媒介cAMPのレベル、またはアデニル酸シクラーゼ活性は減少される
。
本発明はまた、CGRPレセプターと結合し得ることが知られてないリガンドが、
このようなレセプターと結合し得るか否かを決定する方法を提供する。この方法
は、リガンドのCGRPレセプターへの結合が可能な条件下で、CGRPレセプターを発
現する哺乳動物細胞とリガンドとを接触させる工程、レセプターに結合するリガ
ンドの存在を検出する工程、およびそれによりリガンドがCGRPレセプターと結合
するか否かを決定する工程を包含する。アゴニストおよび/またはアンタゴニス
トを決定するための本明細書中上記の系はまた、レセプターに結合するリガンド
の決定のために用いられ得る。
一般に、CGRPレセプターのアゴニストは、パーキンソン病、急性心不全、低血
圧症、尿停留、および骨粗鬆症の処置のような治療目的に用いられる。
CGRPレセプターのアンタゴニストは、多様な治療目的に用いられ得る。例えば
、このようなアンタゴニストは、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、ア
レルギー、精神病、鬱病、片頭痛、嘔吐、および良性前立腺肥大の処置に用いら
れている。
潜在的CGRPレセプターアンタゴニストの例としては、抗体、またはいくつかの
場合オリゴヌクレオチドが挙げられ、これはGタンパク質共役レセプターと結合
するが、Gタンパク質共役レセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセン
ジャー応答を誘起しない。
潜在的なアンタゴニストはまた、CGRPレセプターのリガンドに密に関連するタ
ンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能を損
失し、そしてCGRPレセプターに結合するときに応答を全く誘起しない。
潜在的アンタゴニストはまた、アンチセンス技術の使用により調製されるアン
チセンス構築物を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセン
スDNAもしくはRNAを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの
方法の両方はポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5’コ
ード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計
するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域
に相補的に設計され(三重らせん-Leeら、Nocl.Acids Res.,6:3073(1979); Co
oneyら、Science,241:456(1988);およびDervanら、Science,251: 1360(1991)
を参照のこと)、それにより、転写およびCGRPレセプターの産生を阻害する。ア
ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAとハイブリダイズし、そし
てmRNA分子のCGRPレセプターへの翻訳をブロックする(アンチセンス-Okano、J
.Neurochem.,56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitor
s of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上記のオリゴヌ
クレオチドはまた、細胞に送達され得、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで
発現され得、CGRPレセプターの産生を阻害する。
別の潜在的なアンタゴニストは、CGRPレセプターに結合する小分子であり、CG
RPレセプターのリガンドへの接近を不可能にして、正常な生物学的活性を阻害す
る。小分子の例としては、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
潜在的アンタゴニストはまた、CGRPレセプターの可溶形態(例えば、レセプタ
ーのフラグメント)を含み、これはリガンドに結合し、そしてリガンドが膜結合
CGRPレセプターと相互作用することを阻害する。
上記で概説したスクリーニング手順により同定されたアゴニストは、CGRPの神
経調節機能を増強し、高血圧症を処置するために用いられ得る。なぜなら、CGRP
は冠状動脈の血流を増加する効果的な血管拡張神経薬であるからである。アゴニ
ストはまた、閉塞した心臓弁で冠状動脈の血流を増加させるためにも用いられ得
る。同様に、CGRPは心収縮に強力な興奮作用を有し、そして心収縮の刺激に用い
られ得る。アゴニストはまた、成長ホルモン放出の減少により、巨大症の処置に
も用いられ得る。
アゴニストはまた、骨粗鬆症の処置に用いられ得る。なぜなら、CGRPは破骨細
胞を介した骨の再吸収を阻害し、そして骨生成を刺激するからである。これと同
様の形式で、高カルシウム血症も処置され得る。同様に、アゴニストはパジェッ
ト病の処置に用いられ得る。
アゴニストはまた、内皮細胞増殖におけるCGRPの刺激作用を介して、血管形成
の刺激および創傷治癒の促進に用いられ得る。
アゴニストはまた、肥満の処置に用いられ得る。なぜなら、CGRPは食欲および
腸運動の減衰により食物摂取挙動を制御するからである。
アゴニストはまた、神経再生の刺激に用いられ得る。なぜなら、CGRPはCNSに
おける栄養因子であるからである。
アゴニストはまた、脈管透過性の増加による免疫応答の増強に用いられ得る。
アゴニストはまた、スーパーオキシド生成の阻害に用いられ得る。スーパーオ
キシド生成は、細胞傷害を引き起こし、そしてガンのような疾患を誘発し得るこ
とが当該分野において公知である。
CGRPレセプターアンタゴニストはまた、CNS疼痛伝達の阻害、長期血管拡張、
関節炎、成人発症型糖尿病、心血管疾患により引き起こされる慢性炎症の処置、
および片頭痛の処置に用いられ得る。
アンタゴニストはまた、肺のカルチノイド腫瘍の抑制に用いられ得る。なぜな
ら上昇されたCGRPレベルが、この疾患の間、肺において見出されているからであ
る。
アンタゴニストおよびアゴニストは、例えば、本明細書中以下に記載の薬学的
に受容可能なキャリアとともに組成物において用いられ得る。
CGRP核酸配列およびCGRPペプチドはまた、科学的研究(DNAの合成およびDNAベ
クターの製造)に関連するインビトロでの目的のために、およびヒトの疾患を処
置するための診断薬および治療薬の生産のために用いられ得る。
全長CGRPレセプター遺伝子のフラグメントは、全長CGRPレセプター遺伝子を単
離する、およびその遺伝子に対する高い配列類似性または同様の生物学的活性を
有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼ
ーションプローブとして用いられ得る。一般にこのタイプのプローブは、少なく
とも20塩基を有する。しかし、好ましくは、プローブは少なくとも30塩基を有し
、そして一般に、それらはより多くの数の塩基を有し得るが、1000塩基対を超え
ない。プローブはまた、cDNAクローン(全長転写物に対応する)およびゲノムク
ローン(単数または複数)(調節領域およびプロモーター領域、エキソン、なら
びにイントロンを含む完全CGRPレセプター遺伝子を含む)の同定に用いられ得る
。スクリーニング法の一例としては、オリゴヌクレオチドプローブを合成するた
めに公知のDNA配列を用いることによってCGRPレセプター遺伝子のコード領域を
単離することが挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識
オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのいずれのメンバーにプローブがハイブリ
ダイズするかを決定するために、ヒトのcDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラ
リーまたはmRNAライブラリーのスクリーニングに用いられる。
このCGRPレセプターポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニスト(こ
れらは、ポリペプチドである)は、本発明に従って、インビボでのこのようなポ
リペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれ
る。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞
がこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該
分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを
含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作
され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの(例えば、アデノウイルス)であり得る。これは、適切な送達ビ
ヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
CGRPレセプターポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニストは、適切
な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効
量のポリペプチドまたはアンタゴニストまたはアゴニスト、および薬学的に受容
可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩液
、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および
それらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態
様に合わせるべきである。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1以上の成分で満たされた1以上の容
器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、薬剤
または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定さ
れた形式の製品表示をし得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用
、または販売におけるこの機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他
の治療化合物と併用して用いられ得る。
薬学的組成物は、局所、静脈内、腹膜内、筋肉内、鼻腔内、または皮内経路に
よるような好都合な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異的適応の処置お
よび/または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくと
も約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは1日に約8mg/k
g体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、1日に約10μg/kg体
重から約1mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。
本発明はさらに、細胞表面上のヒトCGRPレセプターポリペプチドと特異的に相
互作用および結合する薬物のスクリーニング法または同定法を提供する。この方
法は、CGRPレセプターをコードする単離DNA分子を含む哺乳動物細胞と多数の薬
物とを接触させる工程、哺乳動物細胞と結合するこれらの薬物を決定する工程、
およびその結果、本発明のCGRPレセプターポリペプチドと特異的に相互作用およ
び結合する薬物を同定する工程を包含する。
本発明はまた、CGRPレセプターポリペプチドをコードするmRNAの存在を検出す
ることにより、細胞表面上のCGRPレセプターの発現を検出する方法を提供する。
この方法は、細胞から全RNAを採集する工程、そしてこのように得られたmRNAと
核酸プローブ(ハイブリダイズする条件下で、ヒトCGRPレセプターをコードする
核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも15
ヌクレオチドの核酸分子を含む)とを接触させる工程、そのプローブとハイブリ
ダイズしたmRNAの存在を検出する工程、およびその結果、細胞によるCGRPレセプ
ターの発現を検出する工程を包含する。
本発明はまた、CGRPレセプター核酸配列中の変異の存在に関連する疾患の検出
、またはこのような疾患に対する罹病性の検出のための診断アッセイの一部とし
てのCGRPレセプター遺伝子の使用に関する。
CGRPレセプター遺伝子中に変異を有する個体は、多様な技術によりDNAレベル
で検出され得る。診断用の核酸は、患者細胞(例えば、血液、尿、唾液、組織バ
イオプシーおよび解剖材料)より入手され得る。ゲノムDNAは、検出のために直
接用いられ得るか、または分析前に、PCR(Saikiら、Nature,324:163-166(1986
))の使用により酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた同目的のために用
いられ得る。一例として、CGRPレセプターをコードする核酸に相補的なPCRプラ
イマーは、CGRPレセプターの変異の同定および分析に用いられ得る。例えば、欠
失物および挿入物は、正常な遺伝子型との比較において、増幅産物のサイズの変
化により検出され得る。点変異は、増幅DNAと放射標識CGRPレセプターRNA配列と
の、あるいは放射標識CGRPレセプターアンチセンスDNA配列とのハイブリダイズ
により同定され得る。完全に一致した配列は、RNase A消化によりまたは融解温
度の差異により生じたミスマッチ二重鎖と区別され得る。あるいは、点変異は、
PCR産物の直接配列決定またはクローン化PCR産物の配列決定により検出され得る
。
DNA配列の差異に基づく遺伝的試験は、変性剤の存在下または非存在下でのゲ
ル中でのDNAフラグメントの電気泳動における移動度の変化の検出により達成さ
れ得る。小配列欠失物および挿入物は高解像度ゲル電気泳動により可視化され得
る。異なる配列のDNAフラグメントは変性ホルムアミドグラジエントゲル上で区
別され得、ここでは、異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異的な融
解温度または部分融解温度により、ゲル中の異なる場所において遅延される(例
えば、Myersら、Science,230:1242(1985)を参照のこと)。
特定の位置における配列の変化はまた、RNaseおよびS1保護または化学切断法
のようなヌクレアーゼ保護アッセイにより明示され得る(例えば、Cottonら、PN
AS,USA,85:4397-4401(1985))。
従って、特異的DNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学
的切断、直接DNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制限フラグメント長
多型(RFLP))、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法により達
成され得る。
より簡便なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまたインサイチ
ュ分析により検出され得る。
本発明はまた、種々の組織中のCGRPレセプタータンパク質の変化レベルを検出
するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サンプルと
比較されたタンパク質の過剰発現は、例えば、ガンのような疾患の存在または疾
患に対する罹病性を検出し得るからである。宿主由来サンプル中のCGRPレセプタ
ータンパク質レベルの検出に用いられるアッセイは当業者に周知であり、そして
、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISA
アッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを包含する。ELISAアッセイ(Colig
anら、Current Protocols in Immunology,1(2),第6章,(1991))は、最初
に、CGRPレセプター抗原に特異的な抗体(好ましくはモノクローナル抗体)を調
製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して
調製される。レポーター抗体に、放射活性、蛍光色素、または、本実施例におい
ては、西洋ワサビペルオキダーゼ酵素のような検出試薬が付着される。サンプル
は宿主から除去され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体支持体(例
えば、ポリスチレン皿)上でインキュベートされる。次いで、皿上の任意の遊離
タンパク質結合部位は、BSAのような非特異的タンパク質とともにインキュベー
トすることによってカバーされる。次に、モノクローナル抗体は、モノクローナ
ル抗体とポリスチレン皿に付着された任意のCGRPレセプタータンパク質とが付着
する間、皿中でインキュベートされる。すべての非結合モノクローナル抗体は緩
衝液で洗
浄除去される。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合されたレポーター抗体は皿中
に入れられ、その結果、レポーター抗体とCGRPレセプタータンパク質に結合され
た任意のモノクローナル抗体との結合が生じる。次いで、非付着レポーター抗体
は洗浄除去される。ペルオキシダーゼ基質を、次いで、皿に添加し、そして標準
曲線を対比した場合の一定時間の呈色量が、患者のサンプルの一定容量中に存在
するCGRPレセプタータンパク質の量の測定値である。
競争アッセイ(ここで、CGRPレセプターポリペプチドに特異的な抗体が固体支
持体に付着され、そして標識CGRPレセプターおよび宿主由来のサンプルが固体支
持体上を通され、そして検出される(例えば、液体シンチレーションクロマトグ
ラフィーによる)標識量が、サンプル中のCGRPレセプタータンパク質に量と相関
し得る)が用いられ得る。
「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイと同様のアッセイである。「サ
ンドイッチ」アッセイにおいて、CGRPレセプタータンパク質に固体支持体上を通
され、そして固体支持体に付着された抗体と結合する。次いで、2次抗体はCGRP
レセプタータンパク質に結合される。標識され、そして2次抗体に特異的な3次
抗体は、次いで、固体支持体上を通過され、そして2次抗体と結合され、次いで
、定量され得る。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒ
ト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染
色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体標
識試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの
配列と疾患に関連する遺伝子との相関において、重要な第1工程である。
簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは15〜25bp)を
調製することにより染色体にマップされ得る。3’非翻訳領域のコンピューター
解析が、ゲノムDNA内で1つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセ
スを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これ
らのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスク
リーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリ
ッドのみが増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て
るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に
使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな
ゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され
得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した
(flow-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA
ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含す
る。
cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン(FISH)は、1工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技
術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る;しかし、2,000bpより
も大きいクローンの方が、簡便な検出のために十分なシグナル強度で独特の染色
体位置に結合しやすい。FISHは、発現配列タグ(CGRPレセプター遺伝子の短いセ
グメント)が由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンは長いほ
ど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして
4,000bpを超える長さは、合理的な割合の時間で(a resonable percentage of t
he time)良好な結果を得るためにはおそらく必ずしも必要でない。この技術の
総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques,
pergamon press、New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V.M
cKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med
ical Libraryからオンラインで入手可能である)に見出される。次いで、同一の
染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する
必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体
には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。
物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関
連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因
遺伝子の1つであり得る。(これは、1メガ塩基のマッピング解像度で、そして
20kbあたり1遺伝子と仮定する。)
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるため
の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およ
びヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を
包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメント
の生成のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗
体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Ko
hlerおよびMilstein、1975、Nature、256:495-497)、トリオーマ技術、ヒトB
細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983、Immunology Today 4:72)、および
ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、198
5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77-96頁
)が挙げられる。
単鎖抗体を生成するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本
発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得
る。また、トランスジェニックマウスは、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に
対するヒト化抗体を発現させるために用いられ得る。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する;しかし、本発明はこのよ
うな実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明
記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および
/または用語を記載する。
「プラスミド」は、小文字のpの前および/または後の大文字および/または
数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準
なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラス
ミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等
価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には1μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントを、約2単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する
。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的に
は5〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定
の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37
℃での約1時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の
説明書に従って変化し得る。消化後、反応溶液をポリアクリルアミドゲル上で直
接電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。
切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら、Nucleic Acids Res.,8:4
057(1980)に記載の8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、1本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを言い、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5’リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でATPを用いてリン酸を添加しなければ別のオリゴヌクレオチド
に連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメン
トに連結する。
「連結」は、2つの2本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis,T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、
連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT
4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達
成され得る。
他に記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb,A.、Virology
、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。
実施例1 CGRP レセプターの細菌発現および精製
CGRPレセプターをコードするDNA配列(ATCC寄託番号第75824号)を、まず、プ
ロセスされた遺伝子配列(シグナルペプチド配列を除く)の5’および3’末端
配列ならびにCGRPレセプター遺伝子に対して3'側のベクター配列に対応するPCR
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させる。CGRPレセプターコード配列
に対応するさらなるヌクレオチドを、5’配列および3’配列のそれぞれに付加
する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’GACTAAAGCTTAATGTTATACAG
CATATTT 3’(配列番号3)を有し、HindIII制限酵素部位、続いてプロセスさ
れたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する18ヌクレオチドのCGRPレ
セプターコード配列を含む。3'配列、5’GAACTTCTAGACCGTCAATTATATAAATTTTTC
3’(配列番号4)は、XbaI部位に相補的な配列を含み、続いて18ヌクレオチ
ドのCGRPレセプターコード配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-
9(Qiagen,Inc.Chatsworth,CA)の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生
物質耐性(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調節可能プロモーター/オペ
レーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6-Hisタグ、および制限酵素部
位をコードする。次いで、pQE-9をHindIIIおよびXbaIで消化する。増殖配列をpQ
E-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列にインフレーム
に挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E .coli M15/rep4株(Qiagen,Inc.
)をSambrook,J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Sprin
g Laboratory Press,(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4は、プ
ラスミドpREP4の多数のコピーを含み、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナ
マイシン耐性(Kanr)も与える。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの
能力により同定し、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する
。プラスミドDNAを単離して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むク
ローンを、Amp(100μg/ml)とKan(25μg/ml)との両方を補充したLB培地にお
ける液体培養で一晩(O/N)増殖させる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で
大量培養物に接種する。細胞を、600の光学密度(O.D.600)が0.4と0.6との間に
なるまで増殖させる。次いで、IPTG(「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノ
シド」)を加えて1mMの最終濃度にする。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化す
ることにより、遺伝子発現を増加させるためのP/Oの解放(clear)を誘導する。
細胞をさらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により採集する。
細胞ペレットをカオトロピック剤である6MグアニジンHClで可溶化する。澄明化
後、可溶化物を、6-Hisタグを含むタンパク質により堅く結合させる条件下でニ
ッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製する(Ho
chuli,E.ら、J.Chromatography 411:177-184(1984))。CGRPレセプタータンパ
ク質を、6MグアニジンHCl pH5.0でカラムから溶出し、そして再生の目的のため
に、3MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン(還元型)
、および2mMグルタチオン(酸化型)に調整する。この溶液で12時間インキュベ
ーションした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。
実施例2 バキュロウイルス発現系を用いるCGRPレセプターのクローニングおよび発現
全長のCGRPレセプタータンパク質をコードするDNA配列(ATCC寄託番号第75824
号)を、遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて増幅させる:
5'プライマーは、配列5’GTCCGGATCCGCCACCATGTTATACAGCATATTT 3’(配列
番号5)を有し、BamHI制限酵素部位(太字)、続いて真核生物細胞における翻
訳の開始に効率的なシグナル(J.Mol.Biol.1987,196,947-950,Kozak,
M.)に類似する6ヌクレオチドを含み、これはCGRPレセプター遺伝子の最初の18
ヌクレオチドの直ぐ上流域に存在する(翻訳開始コドン「ATG」に下線を付す)
。
3'プライマーは、配列5’GTCCGGATCCGCCACCATGTTATACAGCATATTT 3’(配列
番号6)を有し、制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位およびCGRPレセプタ
ー遺伝子の3'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販
のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて、1%アガロ
ースゲルより単離する。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消
化し、そして1%アガロースゲルで精製する。このフラグメントを、F2と称する
。
ベクターpRG1(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用
いるCGRPレセプタータンパク質の発現のために用いる(総説について、Summers
,M.D.およびSmith,G.E.1987,A manual of methods for baculovirus vector
s and insect cell culture procedures,Texas Agricultural Experimental St
ation Bulletin No.1555を参照のこと)。この発現ベクターは、Autographa ca
lifornica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強いポリヘドリンプロモーター、続
いて制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイルス(SV)4
0のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウ
イルスを容易に選択するために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、
ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーター
と同方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、コトランスフェクト野生型ウイルス
DNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列により両端で隣接される。多
くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、
pAc373、pVL941およびpAcIM1である(Luckow,V.A.およびSummers,M.D.、Virol
ogy,170:31-39)。
プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔
ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、上記のように、DNAを
単離し、1%アガロースゲル上で精製する。このベクターDNAをV2と称する。
フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連
結させる。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて
、
CGRPレセプター遺伝子を有するプラスミド(pBacCGRP receptor)を含む細菌を
同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。
5μgのプラスミドpBac-CGRPレセプターを、リポフェクション法(Felgnerら
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販
の線状化したバキュロウイルス(「BaculoGoldTM baculovirus DNA」,Pharming
en,San Diego,CA.)とコトランスフェクトする。
1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBacCGRPレセプタ
ーを、50μlの血清非含有グレース培地(Life Technologies Inc.,Gaithersbur
g, MD)を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、1
0μlリポフェクチンと90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて1
5分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清
非含有グレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫
細胞(ATCC CRL 1711)に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を混合
するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で5時間インキュベート
する。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10%
ウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキ
ュベーターに戻し、そして27℃で4日間培養を続ける。
4日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(上述)による記載と同様
にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単
離を可能にする、「Blue Gal」(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)を有
するアガロースゲルを用いる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li
fe Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキ
ュロウイルス学の使用者ガイド(9〜10頁)においても見い出され得る)。
連続希釈4日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークをエ
ッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、
200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁させる。寒天を、
簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を用い
て、35mm皿に播種されたSf9細胞を感染させる。4日後、これらの培養皿の上清
を回収し、次いで4℃で保存する。
Sf9細胞を、10%熱失活化FBSを補充したグレース培地中で培養する。細胞を、
感染多重度(MOI)2で組換えバキュロウイルスV-CGRPレセプターで感染させる
。6時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF
900 II培地(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)に置き換える。42時間後
、5μCiの35S-メチオニンおよび5μCiの35Sシステイン(Amersham)を添加
する。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採
集し、そして標識タンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可
視化する。
実施例3 培養細胞中での一過的および安定な発現
CGRPレセプターポリペプチドをコードするDNA配列(ATCC寄託番号第75824号)
を、哺乳動物発現ベクターpCDNにおける発現(C末端DETタグ(KSIRIQRGPGR)を付
随してまたは付随しないで)のために再配置した。これは、発現に潜在的にネガ
ティブに影響し得る、選択されたメチオニンより上流に位置する推定アミノ酸位
置-11および-1の2つの隠れたメチオニン残基の欠失を伴う、完全な3’および
5’非翻訳領域の欠失を包含する。発現効率を増加させるために、フランキング
Kozakコンセンサス配列(CCACC)を選択された開始メチオニン残基に付加した。
得られた構築物を、DEAEデキストラン硫酸およびリポフェクチン試薬プロトコル
のそれぞれにより、別々に、COS細胞およびヒト腎臓293細胞の両方にトランスフ
ェクトした。一過的発現のために、トランスフェクション後72時間に、細胞をリ
ガンド曝露に応じたcAMPの蓄積についてアッセイした。1回の試験において、29
3細胞のみが発現を示した。安定な細胞株のために、トランスフェクトされた293
細胞を400μg/mlのGeneticin(G418硫酸)の存在下で選択し、そしてCGRPに応じた
cAMPの蓄積についてアッセイした。
本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、した
がって、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 45/00 ABU A61K 45/00 ACL
ACL ACV
ACV ADD
ADD ADP
ADP C07K 14/705
C07K 14/705 16/28
16/28 C12N 1/21
C12N 1/21 C12P 21/02 C
5/10 C12Q 1/68 A
C12P 21/02 C12N 5/00 B
C12Q 1/68 A61K 37/02 ABE
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(72)発明者 アダモウ, ジョン
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19087,
セント デイビッズ, アイベン アベ
ニュー 258−3ディー
(72)発明者 アイヤール, ナンビ
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19312,
バーウィン,ラッドビル サークル
1430
(72)発明者 バーグスマ, ダーク
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19312,
バーウィン,アイリッシュ ロード
271
(72)発明者 エルシヨアバジー, ナビル
アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19380,
ウエスト チェスター, ボウツリー
ドライブ 1648
(72)発明者 リ, イ
アメリカ合衆国 メリーランド 20878,
ガイザースバーグ,ホワード ランディ
ング ドライブ 16125
(72)発明者 リー, ノーマン エイチ.
アメリカ合衆国 メリーランド 21163,
ウッドストック,ウェザーバーン ロー
ド 10344
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.単離されたポリヌクレオチドであって: (a)配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドあるいは該ポリペプ チドのフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド; (b)ATCC寄託番号75824に含有されるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有 するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または 誘導体をコードするポリヌクレオチド、 からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。 2.前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 3.前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 4.前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1に記載のポリヌクレオ チド。 5.前記ポリヌクレオチドが配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドをコードする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 6.前記ポリヌクレオチドがATCC寄託番号75824のcDNAによりコードされるポリ ペプチドをコードする、請求項2に記載のポリヌクレオチド。 7.配列番号1に示されるコード配列を有する、請求項1に記載のポリヌクレオ チド。 8.ATCC寄託番号75824として寄託されるコード配列を有する、請求項2に記載 のポリヌクレオチド。 9.請求項2に記載のDNAを含有するベクター。 10.請求項9に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。 11.ポリペプチドを生産するプロセスであって、以下の工程: 請求項10に記載の宿主細胞から、前記DNAによりコードされる前記ポリペプ チドを発現させる工程、 を包含する、プロセス。 12.ポリペプチドを発現する能力を有する細胞を生成するプロセスであって、 請求項9に記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、プロ セス。 13.請求項2に記載のDNAとハイブリダイズ可能であり、かつCGRPレセプター 活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。 14.ポリペプチドてあって、(i)配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポ リペプチドならびにそのフラグメント、アナログおよび誘導体、および(ii)AT CC寄託番号75824のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポリペプ チドのフラグメント、アナログおよび誘導体、からなる群より選択される、ポリ ペプチド。 15.前記ポリペプチドが配列番号2の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド である、請求項14に記載のポリペプチド。 16.請求項14に記載のポリペプチドに対する抗体。 17.請求項14に記載のポリペプチドを活性化する、化合物。 18.請求項14に記載のポリペプチドの活性化を阻害する、化合物。 19.請求項14に記載のポリペプチドの活性化の必要性を有する患者を処置す る方法であって、以下の工程: 請求項17に記載の化合物の治療的有効量を該患者に投与する工程、 を包含する、方法。 20.請求項14に記載のポリペプチドの活性化を阻害する必要性を有する患者 を処置する方法であって、以下の工程: 請求項18に記載の化合物の治療的有効量を該患者に投与する工程、 を包含する、方法。 21.前記ポリペプチドがCGRPレセプターポリペプチドの可溶性フラグメントで あり、かつ該レセプターに対するリガンドを結合する能力を有する、請求項14 に記載のポリペプチド。 22.請求項14に記載のCGRPレセプターポリペプチドのアンタゴニストおよび アゴニストを同定するためのプロセスであって、以下の工程: 細胞表面上でレセプターポリペプチドを発現させる工程; 該細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物に接触さ せる工程; 2次シグナルが該リガンドおよび該レセプターポリペプチドの相互作用から生 じるかどうかを決定する工程;および 該スクリーニングされるべき化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである かどうかを同定する工程、 を包含する、プロセス。 23.CGRPレセプターに結合する能力を有することが既知でないリガンドが、そ れに結合し得るかどうかを決定するプロセスであって、以下の工程: CGRPレセプターを発現する哺乳動物細胞を潜在的なリガンドと接触させる工程 ; 該レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程;および 該リガンドが該CGRPレセプターに結合するかどうかを決定する工程、を包含す る、プロセス。 24.前記CGRPレセプター核酸配列内の変異に関連する疾病またはこのような疾 病に対する罹病性を診断するプロセスであって: 宿主由来のサンプル中の該CGRPレセプター核酸配列内の変異を決定する工程を 包含する、プロセス。
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