JPH11501205A

JPH11501205A - ヒトエンドセリン−ボンベシンレセプター

Info

Publication number: JPH11501205A
Application number: JP8513181A
Authority: JP
Inventors: リ，イ; クマー，チャンドリカ; エイ．ローゼン，クレイグ
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド; スミスクラインビーチャムコーポレイション
Priority date: 1994-10-17
Filing date: 1994-10-17
Publication date: 1999-02-02
Also published as: WO1996011946A1; EP0792282A1; AU8019494A; EP0792282A4

Abstract

(57)【要約】ヒトエンドセリン-ボンベシンレセプターのポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードしているDNA(RNA)、また組換え技術によりこのようなポリペプチドを生産する方法が開示される。また、このようなポリペプチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストの同定のためにこのようなポリペプチドを利用する方法も開示される。本発明のヒトエンドセリン-ボンベシンレセプターのポリペプチドに対するアゴニストは、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症および骨粗鬆症の治療に使用され得る。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストは、高血圧症、潰瘍形成、蜘蛛膜下出血、喘息、腫瘍、サイクロスポリン(ciclosporing)毒性、癌および敗血症ショックの治療に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトエンドセリン−ボンベシンレセプター本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、ヒト7-膜貫通レセプターである。その膜貫通レセプターは、Ｇタンパク質共役レセプターである。さらに特定すると、その7-膜貫通レセプターは、以下で「ETBR」とも呼ばれる、エンドセリン−ボンベシンレセプターとして、推定的に同定されている。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの例は、GPCレセプター（例えば、アドレナリン作動性薬剤およびドーパミンに対するGPCレセプター（Kobilka，B.K.ら，PNAS，84:46-50(1987); Kobilka，B.K.ら，Science，238:650-656(1987); Bunzow，J.R.ら，Nature，336 :783-787(1988)））、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（actuator protein）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）を含む(Simon，M.I.ら，Science，252 :802-8(1991))。例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合GDPに変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。エンドセリンペプチドは２１アミノ酸残基からなるペプチドであり、エンドセリンレセプターを介してインビボで効果を遂行する。エンドセリン（ET）は動物の様々な組織に存在するペプチドであり、強い血管収縮薬として知られている。 ETはすくなくとも４種類の哺乳動物ペプチドからなるファミリーのペプチドのひとつであり、そのペプチドはC末端に２つのジスフィルド架橋および６つの保存されたアミノ酸残基によって特徴づけられている。ファミリーの構成員はエンドセリン−１（ET-１）、エンドセリン−２（ET-２）、およびエンドセリン−３（ET-３）と呼ばれる。４つ目のペプチド（血管腸管(vasointestinal)収縮剤）はまた、時にはマウスもしくはラット形態のET-２として記載されている。これらはCys-３-Cys-11というジスフィルド結合により形成される29員環系において大部分異なっている。エンドセリンはプレプロエンドセリンがプロエンドセリン（それ自体が成熟エンドセリンに代謝される）に代謝されることにより生産される。プロエンドセリンの切断は特異的酵素の活性に起因していると考えられる。ETは広範な血管組織および非血管組織に分布されている（PNAS,USA,86:2863-2867(1989)）。 ET-１およびET-２はET-３に比べて非常により強い血管収縮剤であり、一方３つのETのイソペプチドは一過性の血管拡張の生成においてはおよそ等量の力を有することが以前にインビボで示されている。ETの核酸配列解析により、様々な種類のETイソペプチドの存在が明らかとなった。これらのETイソペプチドはまたそれらの特性が異なっている。それゆえ、ETレセプターの様々なサブタイプが存在するようである。ETレセプターの様々なサブタイプの存在は、Watanabe,H.,ら,B iochem-Biophys,Res.Commun.,161:1252-1259(1989)、およびMartin,E.R.,ら,J.B iol.Chem.,265:14044-14049(1990)らの放射性リガンド結合の研究によって証明されている。これらの研究は少なくとも２種類のETレセプターの存在を示している。それらのうち一つはET-３よりET-１およびET-２とより高い親和性を有し、それ以外のものは細胞活性のないときにET-１、ET-２、およびET-３と親和性を持つ。ET_AレセプターはET-３と低い親和性を示し、ET_Bレセプターは選択的でない。このレセプターは、膜貫通ヘリックスを形成すると予想される７つの疎水性領域を有するロドプシンスーパーファミリーの７ヘリックスレセプター(heptaheli cal receptors)と相同である。胎盤は肺同様、両レセプターのとても高い発現を有する。一般に、選択的でないET_Bレセプターはより広範囲で発現しているようであり（例えば、肝臓、腎臓、および子宮）、そしておそらく中枢神経系においてより顕著であり、この結果は結合および機能についての研究と一致している。心臓は、ET_A型のレセプターが優勢であるといわれている唯一の組織である。ET_Aレセプターは血管と関連し、ET_Bレセプターはグリア細胞、上皮細胞、脳室上衣細胞と関連するが、しかし、わずかではあるが、ニューロンと関連するものもある。腎臓においては、ET_A レセプターは血管平滑筋細胞に位置し、そしてET_Bレセプターの発現は糸球体内皮、直細血管、およびヘンレわなの薄い区域(thin segment)でおこっている。エンドセリンは、ホスホリパーゼCのＧタンパク質共役の活性化および電在依存的なCa²⁺イオンチャンネルの活性化（Kasuya,Y.,ら,Biochem.Biophys.Res.Com mun.,61:1049-1055(1989))を含む様々なシグナル伝達機構により生物学的応答を誘起する。従って、エンドセリンレセプターの異なったサブタイプは、異なったシグナル伝達機構を用い得る。エンドセリンレセプターは膜貫通セグメントIの前方に比較的長いN末端を有し、そしてこの部分は比較的大きいエンドセリンペプチドと結合することに関連し得る。出願人はヒドロパシー(hydropathicity)と、７つの疎水性セグメントの存在を示すアミノ酸相同性および他のＧタンパク質共役レセプターとの重要な配列類似性を有するＧタンパク質共役レセプターを発見した。７つの膜貫通(membrane-sp anning)ドメインと細胞外N末端と細胞内C末端もまた同定した。本発明のＧタンパク質共役レセプターは、既知のエンドセリンレセプターであるET_AおよびET_Bとの相同性の結果、ならびにエンドセリンおよびボンベシンとの結合能の結果をもって、エンドセリン−ボンベシンレセプターとして推定的に同定された。本発明の１つの局面によれば、Ｇタンパク質共役レセプターである新規の推定の成熟ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、組換え技術によりこのようなポリペプチドを生産するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、治療上の目的のため、インビボでエンドセリンの濃度を測定するため、またはアンタゴニストとして可溶型として、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、このアンタゴニストはこのようなポリペプチドの作用を阻害するために使用され得る。さらなる別の実施態様によれば、レセプターアンタゴニストおよび/またはアゴニストおよび/またはレセプターリガンドをスクリーニングするために、このレセプターを用いるためのプロセスが提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定することを意図しない。図１は、本発明のＧタンパク質共役レセプターのcDNA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。最初の26アミノ酸は推定のシグナル配列を表す。アミノ酸のための標準的な１文字略記が用いられている。図２は、Ｇタンパク質共役レセプターの２次構造特性の図解である。最初の７つの図解は、αヘリックス、βシート、ターン領域、またはコイル領域であるアミノ酸配列領域を示す。箱で囲った領域は、示された領域に相当する領域である。第２の図のセットは、細胞内、細胞質にさらされるアミノ酸配列または膜を貫通するアミノ酸配列の領域を示す。親水性部は、膜の脂質二重層であり、それゆえ疎水性であるタンパク質配列の領域、および親水性である脂質二重膜の外側の領域を示す。抗原性領域は脂質二重膜の外側の領域であり、そして抗原結合能を有するので、抗原指数は、親水性プロットに対応する。表面確率プロットは、抗原指数および親水性プロットにさらに対応する。両親媒性プロットは、極性および非極性である13の配列のそれらの領域を示す。可動性領域については、可動性領域は膜の外側に存在する領域であること、また非可動性領域が膜貫通領域であるという意味で第２の図解セットと一致している。図３は、本発明のＧタンパク質共役レセプターと種々の動物種由来のエンドセリンレセプターとのアミノ酸配列アラインメントを示す。色を付けた領域は図中で他のアミノ酸配列と適合した領域である。図４は、pHHPEC49由来のRNA転写物を注入した卵母細胞内での、ET１、ET３、およびボンベシンが誘導したC1電流を示す。グラフの線は、ET１媒介C1電流を示す（ナノアンペア）。矢印はET１の添加を示す。挿入図は10nM AII、神経ペプチドY(NPY)、およびブラジキニンに対する応答の平均ピークを示す。平均ピーク± S.E.ピーク電流はET１に応答するものが150±50(n＝75)であり、ET２に応答するものが156±55(n＝75)であり、そしてボンベジンに応答するものが148±47(n＝7 5)である。配列決定の間違いは、ポリヌクレオチド配列において生じる一般的な問題であることが、指摘されるべきである。従って、図面の配列は数回の配列決定実験に基づくものであり、そして配列決定の正確さは少なくとも97％であると考えられる。本発明の局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードするか、またはATCC受託番号75823として1994年６月24日に寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脳、肝臓、および胎盤において見出され得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト脳由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。これは、Gタンパク質共役レセプターファミリーに、構造的に関連する。これは、613アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち最初のおよそ26アミノ酸残基が推定のリーダー配列であり、これによりこの成熟タンパク質は587アミノ酸を含む。このタンパク質は、ヒトET_Aレセプターに最も高い相同性を示し、420アミノ酸長にわたり30％の同一性および55％の類似性を有する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列と同一であり得るか、または寄託したクローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、コード配列が、遺伝コードの重複（redundancy）または縮重（degene racy）の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列（例えば、リーダー配列または分泌配列もしくはプロタンパク質配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じて付加的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および /または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。従って、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させない。本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列がポリヌクレオチド配列に同じリーディングフレームで融合され得るポリヌクレオチドを包含する。このポリヌクレオチド配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助ける（例えば、細胞からのポリペプチドの移行を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そしてこれは、成熟形態のポリペプチドを形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(198 4)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。すなわちこのポリペプチドは、Ｇタンパク質共役レセプターとして機能するか、またはこのポリペプチドがＧタンパク質共役レセプターとして機能しない（例えばレセプターの可溶型）場合でも、レセプターに対するリガンドに結合する能力を保持する。本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列のいかなる記載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。すなわちこのポリペプチドは、Ｇタンパク質共役レセプターとして機能するか、またはこのポリペプチドがＧタンパク質共役レセプターとして機能しない（例えばレセプターの可溶型）場合でも、レセプターに対するリガンドに結合する能力を保持する。アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれないかまたはないかもしれないフラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(ii)その中で1以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のようなさらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペプチドを生成することに関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはETBR遺伝子を増幅するために適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクターが使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）; 昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A，pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3 、pKK233-3、pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX T1、pSG（Stratagene）；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびPCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、およびtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Methodsi n Molecular Biology、1986)。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版（ Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、 1以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換のための適切な原核宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuri um 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Upps ala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI，USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５'フランキング非転写配列を含有し得る。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。エンドセリンに加えてボンベシンは、本発明のレセプターに結合し、そして刺激することが知られていた。ボンベシンは哺乳動物ホモログとして27アミノ酸ペプチドのガストリン放出ペプチド(GRP)を有するテトラデカペプチドである。ボンベシンは、ラットにおいて温度調節因子として報告されているので(Brown,M. ら,Science,196:998-1000(1977))、中枢神経系に最も影響する可能性があるとみなされているペプチドのうちのひとつである。また、小細胞肺癌によりボンベシン／ガストリン放出ペプチドは合成され、分泌される(Davis,T.P.ら,Peptides,1 3:401-17(1992))。本発明のＧタンパク質共役レセプターは、レセプターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニングのプロセスに用いられ得る。一般に、このようなスクリーニング手順は細胞表面上にレセプターを発現する適切な細胞を提供する工程を包含する。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトするために用いられ、それにより、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する。このようなトランスフェクションは本明細書中上記のような手順によって達成され得る。１つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質共役レセプターを発現するようにトランスフェクトされたメラニン細胞の使用を包含する。このようなスクリーニング技術は1992年２月６日に発行されたPCT WO 92/01810中に記述される。従って、例えば、このようなアッセイは、Ｇタンパク質共役レセプターをコードするメラニン細胞をレセプターリガンドおよびスクリーンされる化合物の両方と接触させることにより、レセプターアンタゴニストのスクリーニングに用いられ得る。リガンドによって生じるシグナルの阻害は、化合物がレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、化合物がレセプターの活性化を阻害することを示す。このスクリーンは、このような細胞とスクリーンされる化合物とを接触させることによりアゴニストを決定するために用いられ得、かつこのような化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、すなわち、このような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定するために用いられ得る。他のスクリーニング技術としては、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外のpH変化を測定する系において、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用が挙げられる。例えば、Scien ce246巻、181〜296頁（1989年10月）に記載される。例えば、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストが効果的か否かを決定するために測定され得る。別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質共役レセプターをコードするRNAをXenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを包含する。次いでそのレセプター卵母細胞は、レセプターリガンドおよびスクリーンされる化合物と接触され得、続いて、カルシウムシグナルの阻害の検出が行われる。別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連結しているＧタンパク質共役レセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが述べられ得る。アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの２次シグナルによるレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。別の方法は、標識リガンドの細胞表面にレセプターを有する細胞への結合の阻害を決定することによるアンタゴニストのスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質共役レセプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、そして標識形態の公知のリガンドの存在下で潜在的なアンタゴニストと細胞とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射活性により標識され得る。標識リガンドがレセプターに結合する量は、例えば、レセプターの放射活性の測定により測定され得る。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。一般に、このようなスクリーニング手順によって決定されるＧタンパク質共役レセプターのアンタゴニストは、多様な治療目的に用いられ得る。例えば、このようなアンタゴニストは、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、鬱病、片頭痛、嘔吐、および良性前立腺肥大の処置に用いられている。Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニストもまた、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、尿停留、および骨粗鬆症の治療のような治療目的に有効である。潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体を含み、またはいくつかの場合においてはオリゴヌクレオチドであり、これはＧタンパク質共役レセプターと結合するが、Ｇタンパク質共役レセプターの活性を阻害するようなセカンドメッセンジャー応答を惹起しない。潜在的なアンタゴニストもまた、Ｇタンパク質共役レセプターのリガンドに密に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含み、これは生物学的機能を損失し、そしてＧタンパク質共役レセプターに結合するときに応答を全く惹起しない。潜在的アンタゴニストはまた、アンチセンス技術の使用により調製されるアンチセンス構築物を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得、これらの方法の両方はポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的に設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooney ら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Science，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質共役レセプターの産生を阻害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のＧタンパク質共役レセプターへの翻訳をブロックする（アンチセンス-Okano、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988) ）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現され得てＧタンパク質共役レセプターの産生を阻害する。別の潜在的なアンタゴニストは、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する小分子であり、Ｇタンパク質共役レセプターのリガンドへの接近を不可能にして、正常な生物学的活性を阻害する。小分子の例としては、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。潜在的アンタゴニストはまた、可溶性Ｇタンパク質共役レセプター（例えば、レセプターのフラグメント）を含み、これはリガンドに結合し、そしてリガンドが膜結合Ｇタンパク質共役レセプターと相互作用することを阻害する。エンドセリンアンタゴニストはエンドセリンの血管収縮効果を相殺するために使用され得、そしてそれゆえ、血管拡張を通して高血圧症の治療に用いられ得る。これらのアンタゴニストはまた、脳脊髄液中および血漿中のエンドセリンレベルの上昇によっておこる、くも膜下出血による長時間持続する血管痙攣の治療に使用され得る。エンドセリンアンタゴニストはまた潰瘍誘発および胃病変の治療に使用され得る。ET-１およびET-３は胃病変を誘発し、そしてアルコール誘発性の病変を増強する。従って、ET-１とET-３とがETBRと相互作用することを阻害することはこれらの状態を防止し得る。エンドセリンは肺平滑筋と関係がある可能性があり、そしてエンドセリンのレベルは喘息の発作の際に肺洗浄液中で増加し、それゆえ、エンドセリンの結合を減少または妨げるアンタゴニストは喘息の治療に使用され得る。エンドセリンレベルは癌組織において増加し、そして癌由来細胞株はエンドセリンを生産するように刺激され得る。ET-１自身癌性細胞の増殖を刺激する。従って、エンドセリンアンタゴニストはガン細胞および腫瘍の増殖を妨げるために用いられ得る。循環エンドセリンレベルの増加はサイクロスポリン(ciclosporin)により増加するが、このことはサイクロスポリンの毒性効果を説明し得る。従って、エンドセリンアンタゴニストはサイクロスポリンの毒性を防ぐおよび／または処置するために使用され得る。エンドセリンアンタゴニストはまたエンドセリンの病的レベルによって引き起こされる敗血症ショックの治療に使用され得る。さらに、高血圧症、充血性心不全、冠動脈障害、アテローム動脈硬化症、再狭窄、良性前立腺肥大、腎不全、および脳卒中の治療もまたETBRのアンタゴニストで治療され得る。ボンベシンアンタゴニストはボンベシン／ガストリン放出ペプチドを合成および分泌する小細胞肺癌の治療に用いられ得る。ボンベシンアンタゴニストはボンベシンが本発明のETBRを刺激することを妨げ得る。アンタゴニストは、例えば下記に記載するような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において用いられ得る。本発明はまた、Gタンパク質共役レセプターに結合し得ることが既知でないリガンドがこのようなレセプターに結合し得るかどうかを決定する方法を提供し、この方法は、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する哺乳動物細胞とリガンドとをリガンドとＧタンパク質共役レセプターとの結合を可能にする条件下で接触させる工程、レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程、およびそれによりリガンドがＧタンパク質共役レセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する。アゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定することについて上記されたシステムは、レセプターに結合するリガンドを決定するために用いられ得る。このETBRポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニスト（これらはポリペプチドである）は、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。 ETBRポリペプチドおよびアンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、ポリペプチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるような簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の処置および／または予防に効果的な量で投与され得る。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10μg /kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。本発明のさらなる局面によれば、本発明のエンドセリンレセプターの可溶型は、インビボでエンドセリンレベルを検出するための診断アッセイの一部として使用され得る。このようなアッセイの例として、患者よりサンプルを取り出し、エンドセリンレセプターを単離し、そしてエンドセリンと相互作用および結合しているエンドセリンレセプターのパーセントを決定するということを包含する。エンドセリンレベルの変化はある種の障害または疾患の指標となる。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相関において重要な第１工程である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよりも大きいクローンの方が、簡便な検出に十分なシグナル強度で独特の染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、合理的な割合の時間で（a resonab le percentage of the time）良好な結果を得るためにはおそらく必ずしも必要でない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick．Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univers ity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして 20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37 ℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物は望ましいフラグメントを単離するために直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。切断されたフラグメントのサイズの分離はGoddel,D.ら,Nucleic Acids Res.,8 :4057(1990)に記載されている８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを言い、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVan der Eb，A.、Virology 、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。実施例１ ETBR の細菌発現および精製 ETBRをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75823号）をまず、プロセスされた ETBRタンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およびETBR遺伝子に対して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。ETBRに対応するさらなるヌクレオチドを、５'および３'配列それぞれに添加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’CACTAAGCTTAATGCGA GCCCCGGGCGCG ３'を有し、Hind III制限酵素部位、続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する18ヌクレオチドのETBRコード配列を含む。３'配列、５’GAACTTCTAGACCGTCAGCAATGAGTACCGAC ３'は、Xba I部位に相補的な配列を含み、そして続いてETBRの18ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen，Inc．9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA， 91311）の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーター／オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE- 9をHind IIIおよびXba Iで消化した。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列にインフレームに挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli HB101をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A Labo ratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換した。形質転換体をLBプレート上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ m l）とKan（25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N ）増殖させた。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度(O.D.⁶⁰⁰)が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル−B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTGはIacIリプレッサーを不活性化することにより、遺伝子発現を増加させるためのP/Oの解放（clear）を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MグアニジンHClで可溶化させた。澄明化後、可溶化されたETBR を、6-Hisタグを含むタンパク質により堅く結合させる条件下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（Hochuli，E.ら、J．Chromatography 411:177-184(1984)）。ETBRを、６MグアニジンHCl pH 5.0 でカラムから溶出し、そして再生の目的のために、３MグアニジンHCl 100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整する。この溶液で12時間インキュベーションした後、タンパク質を10mM リン酸ナトリウムに対して透析した。実施例２ COS 細胞における組換えETBRの発現発現プラスミド、pETBR HAを、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）により誘導する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロンそしてポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。完全なETBRタンパク質、およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．W ilson、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR.Lerner、 1984，Cell 37，767）。本発明者らの標的タンパク質へのHAタグの融合により、 HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。プラスミド構築戦略を以下に記述する： ETBRをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75823号）を、２つのプライマーを用いて、クローン化された元来のESTに対してPCRにより構築した：５'プライマー５’GTCCAAGCTTGCCACCATGCGAGCCCCGGGCGCG ３'は、Hind III部位、続いて開始コドンから始まるETBRコード配列の18ヌクレオチドを含む；３'配列５’CTAGCTC GAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAGCAATGAGTTCCGACAGA ３'は、Xho I部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびETBRコード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、Hind III 部位、インフレーム融合したHAタグが続くETBRコード配列、HAタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびXho I部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、Hind IIIおよびXho I制限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，1109 9 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験した。組換えETBRタンパク質の発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでトランスフェクトした（J．Sambrook、E ．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spr ing Laboratory Press，(1989)）。ETBR HAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した。（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％NP-40、0.1 ％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した(Wilson，I.ら、同上 37:767 (1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体により沈降させた。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲル上で分析した。実施例３バキュロウイルス発現系を用いるETBRのクローニングおよび発現全長のETBRタンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75823号）を、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。５'プライマーは、配列５’CGGGATCCGCCACCATGCGAGCCCCGGGCGCG ３'を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）、続いて真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する６ヌクレオチド（J．Mol．Blol．1987，196，947-950， Kozak，M.）、そしてその直後には、ETBR遺伝子の最初の18ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ATG」が下線される）を含む。３'プライマーは、配列５’CGGGATCCCGCTCAGCAATGAGTTCCGAC ３'を有し、制限エンドヌクレアーゼBam HIの切断部位およびETBR遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclean」 BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消化し、そして次いで１％アガロースゲルで再度精製した。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpRG1(pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるETBRタンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and in sect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bu lletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californic a核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター、続いて制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウイルスDNA の細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、 pVL941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology，1 70:31-39）。プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを１％アガロースゲルより単離した。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて、 ETBR遺伝子を有するプラスミド（pBacETBR）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBacETBRを、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Natl . Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego, CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacETBRを、50μl の血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（A TCC CRL 1711）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（上述）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue GaI」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、 200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm 皿で播種されたSf9細胞に感染するために用いた。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスＶ-ETBRで感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCiの³⁵ Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。実施例４リガンド同定のためのXenopus卵母細胞アッセイ RNA転写キットを用いて、RNAをATCC受託番号75823の線状DNAからインビトロで合成した。このRNAをXenopus卵母細胞にマイクロインジェクションした（10ngの RNA／卵母細胞）。卵母細胞は、マイクロインジェクションを行う前に人為的に卵胞内にて成熟させ、卵胞膜内に存在し得るすべての内因性レセプターを取り除いた。注入された卵母細胞を、レセプタータンパク質を発現させるために、改変バース培地で18℃で48時間維持した。電気生理学は電圧クランプ技術を用いて行った。卵母細胞は-60mVにし、そしてカルシウム活性化塩化物チャンネル活性を室温でバース培地中において計測した。データはAxotapeソフトを用いて解析した。図４に示すように、ATCC受託番号75823由来のDNAに相補的な合成RNAを注入した卵母細胞は、10nMのET１，ET３ならびにボンベシンを添加した際にかなり強い Cl^-電流を誘導(illicite)した。一方注入を行っていない卵母細胞にET１、ET３およびボンベシンを添加しても、膜電位においていかなる変化も引き出さなかった（データ不記載）。ET１およびET３を媒介した反応はETレセプターペプチドアンタゴニストであるBQ123によって阻止された。AII、神経ペプチドY、およびブラジキニンのような関連ペプチドリガンドの添加ではいかなる反応も誘導(illic ite)しなかった（図４）。このことは、ETBRが機能的であり、そしてイノシトール３リン酸の生産を通じてカルシウム細胞間堆積物の流動化に至るセカンドメッセンジャーシステムに共役し得ることを示している。それはETおよびボンベシンの両方に応答するので、これは新規のエンドセリンーボンベシンレセプターを表す。本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者リ，イアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ホワードランディングドライブ 16125 (72)発明者クマー，チャンドリカアメリカ合衆国ニュージャージー 08512，ウエストウィンドソー，ウィルソンウェイノース 31 (72)発明者ローゼン，クレイグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20882, レイトンズビル，ローリングヒルロード 22400

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって：（a）図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド；（b）ATCC受託番号75823に含有されるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、ポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが、図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号75823のcDNAによりコードされるＧタンパク質共役レセプターポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示されるＧタンパク質共役レセプターのコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ATCC受託番号75823として寄託されたＧタンパク質共役レセプターのコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のDNAを含有するベクター。１０．請求項９に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。１１．ポリペプチドを生産するプロセスであって：請求項１０に記載の宿主細胞から、前記DNAによりコードされる前記ポリペプチドを発現させる工程を包含する、プロセス。１２．ポリペプチドを発現する能力を有する細胞を産生するプロセスであって、請求項９に記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、プロセス。１３．請求項２に記載のDNAとハイブリダイズ可能であり、かつＧタンパク質共役レセプター活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。１４．ポリペプチドであって、（i）図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチドならびにそのフラグメント、アナログおよび誘導体、および（ii）ATCC受託番号75823のcDNAによりコードされるＧタンパク質共役レセプターポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体からなる群より選択される、ポリペプチド。１５．前記ポリペプチドが、図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターである、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドを活性化する、化合物。１８．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドの活性化を阻害する、化合物。１９．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドのボンベジン活性化を阻害する、化合物。２０．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターの活性化の必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１７に記載の化合物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。２１．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターの活性化を阻害する必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１８に記載の化合物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。２２．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターの活性化を阻害する必要性を有する患者の処置方法であって：ボンベシンによりＧタンパク質共役レセプターの活性化を阻害する化合物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。２３．前記ポリペプチドが、前記Ｇタンパク質共役レセプターの可溶性フラグメントであり、かつ該レセプターに対するリガンドを結合する能力を有する、請求項１４に記載のポリペプチド。２４．Ｇタンパク質共役レセプターに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するためのプロセスであって：その表面上でＧタンパク質共役レセプターを発現する適切な細胞を提供する工程；該細胞とレセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物とを接触させる工程；該リガンドの結合に応じて該細胞により生じたシグナルを決定する工程；および該Ｇタンパク質共役レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを同定する工程を包含する、プロセス。２５．Ｇタンパク質共役レセプターに結合する能力を有することが既知でないリガンドが、それに結合し得るかどうかを決定するプロセスであって：該Ｇタンパク質共役レセプターを発現する哺乳動物細胞と潜在的なリガンドとを接触させる工程；該レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程；および該リガンドが該Ｇタンパク質共役レセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する、プロセス。