JPH10504456A - Ｃ５ａレセプターをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトC5aレセプターポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順が、開示される。また、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために、このようなポリペプチドを利用する方法が開示される。アンタゴニストおよびアゴニストはC5aレセプターを阻害または刺激するために治療的に用いられ得る。

Description

【発明の詳細な説明】 C5aレセプターをコードするポリヌクレオチド 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド によりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に 関する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、ヒト7-膜貫通レセプターで ある。その膜貫通レセプターは、Ｇタンパク質共役レセプターである。さらに特 定すると、その7-膜貫通レセプターは、アナフィラトキシンであるC5aのレセプ ターとして推定的に同定されており、本明細書中で以下時々「C5a」という。本 発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 医学的に重要な多数の生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカ ンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパ ク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用 いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク 質のいくつかの例は、GPCレセプター（例えば、アドレナリン作動性薬剤および ドーパミンに対するGPCレセプター（Kobilka，B.K.ら，PNAS，84:46-50(1987); Kobilka,B.K.ら，Science,238:650-656(1987); Bunzow，J.R.ら，Nature，336:7 83-787(1988))）、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、 ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、なら びにアクチュエータータンパク質（actuator protein）（例えば、プロテインキ ナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ(Simon，M.I.ら，Science，252:802-8(199 1))）を含む。 例えば、シグナル伝達の1つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内にお ける酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は 、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与 える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させ る。 Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合GDPに変 換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル酸 シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により 触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は 、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグ ナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。 細菌、ウイルスまたは菌類による感染、ガン細胞による浸潤、アレルギー性ま たは自己免疫性の疾患および物理的または化学的に誘導された外傷を含む広範な 多様な症状は、ヒトにおいて炎症反応を引き起こす。ヒトおよびほとんどの動物 におけるこれらの疾患および症状の全てにおいて、古典経路または代替経路のい ずれかを介する補体系（タンパク質、調節因子およびタンパク質分解酵素の集合 ）の活性化は、生じた炎症を増幅し、そして悪化させる様に作用する生物学的に 活性なペプチドの生成を生じる。 最も活性なペプチドであるアナフィラトキシンC5a（74アミノ酸のポリペプチ ド）は、血液補体系の転換酵素および凝固系の酵素による特異的な部位での天然 C5のα鎖の切断により生成される。インビボにおいて、C5aは炎症反応および多 数の臨床上の障害において重要な役割を果たすと考えられている(Goldstein，I. M.，Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates，309-323，Rav en Press，New York(1988)）。このペプチドは、非常に強力な炎症因子であり、 実験動物において劇的な応答を引き起こし（Bodammer，G.およびVogt，W.，Int. Arch．Allergy Appl．Immunol.，33:417-428(1967)）、そしてインビトロにおい て、肺、心臓、血管および胃腸組織を刺激する（Stimler，N.P.ら、Am．J．Path ol.，100:327-348(1980)）。C5aは、多形核好中球およびマクロファージの強力 なアクチベーターであり、走化性、加水分解酵素の放出、およびスーパーオキシ ドアニオン形成を刺激する（Ward，P.A.およびNewman，L.J.，J．Immunol.，102 :93-99(1969)）。さらにいくつかの報告により、肥満細胞および好塩基球に対す るその作用に加えて、走化性および増大したヘキソースの取り込みを含む、この ペプチドの好酸球に対する作用が証明されている（Hugli，T.E.，Biological Re sponse Mediators and Modulators，99-116，Academic Press，NewYork(1 983)）。さらに、このアナフィラトキシンは、種々の組織に対してスパスモーゲ ン性効果を有することが示されている；このアナフィラトキシンは、平滑筋収縮 を刺激し（Stimler，N.P.ら、J．Immunol.，126:2258-2261(1981)）;肥満細胞か らのヒスタミン放出を誘導し、血小板からのセゴトニン放出を促進し（Meuer, S .ら、J．Immunol.，126:1506-1509(1981)）、そして血管透過性を増大させる（J ose,P.J.ら、J.Immunol.,127:2376-2380(1981)）。 多形核白血球においてC5aにより誘起される応答は、原形質膜上の高親和性レ セプターへのアナフィラトキシンの巻き付き（winding）から生じる（Chenoweth , D.E.およびHugli，T.E.，Mol．Immunol.，17:151-161(1980)）。これらの細胞 において、膜を介するシグナル伝達の機構は、他の走化性レセプターの場合と同 様に、１つ以上のGTP結合タンパク質（Ｇタンパク質）を含んでいるようである 。ヒト好中球上のC5aに対するレセプター分子は、その動力学（kinetics）およ び飽和性（saturability）に関して十分に特徴付けられており、そしてその活性 に対する多くの構造的必要条件が知られている。報告により、好中球C5aレセプ ターがナノモルの親和定数でそのリガンドを結合し、細胞当たり約100,000コピ ーで発現され、そして結合サブユニットが約52kDaの見かけの分子量を有するこ とが示されている。 C5aと多形核白血球ならびに他の標的細胞および標的組織との相互作用は、増 大したヒスタミン放出、血管透過性、平滑筋収縮、ならびに好中球、好酸球、お よび好塩基球を含む炎症細胞の組織への流入を生ずる（Hugli，T.E.，Springer, Semin．Immunopathol.，7:193-219(1981)）。C5aはまた、慢性炎症部位に蓄積 する食作用性単核細胞の炎症効果の媒介において重要な役割を果たす（Allison, A.C.ら、H.U．Agents and Actions，8:27(1978)）。C5aは、単球において走化 性を誘導し得、そしてこれらの因子により誘起される好中球の応答と類似の方法 で、単球にリソゾームの酵素を放出させ得る。C5aは抗体を増強することにより 、特に炎症部位で免疫調節の役割を有し得る（Morgan，E.L.ら、J．Exp．Med.， 155:1412(1982)）。 本発明の１つの局面によれば、C5aレセプターとして推定的に同定された新規 のポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供さ れる。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。 本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド（DNAまたはRNA）が提供される。 本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により 生成するためのプロセスが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が 提供される。 別の実施態様によれば、レセプターアンタゴニストおよび/またはアゴニスト ならびに/あるいはレセプターリガンドをスクリーニングするために、このレセ プターを用いるためのプロセスが提供される。 本発明のさらに別の実施態様によれば、このようなアゴニストを治療上の目的 、例えば、細菌感染に対する防御として、C5aの免疫調節効果を刺激するため、 ガン、免疫不全疾患および重篤な感染を処置するために用いるプロセスが提供さ れる。 本発明の別の局面によれば、このようなアンタゴニストを、喘息、気管支アレ ルギー、慢性炎症、全身エリテマトーデス、血管炎、慢性関節リウマチ、骨関節 症、痛風、いくつかの自己アレルギー疾患、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、特定のシ ョック状態、心筋梗塞、およびウイルス感染後の脳障害（post-viral encephalo pathy）の処置のために用いるプロセスが提供される。 本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明 らかであるはずである。 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲に含まれる 本発明の範囲を限定することを意味しない。 図１は、本発明の推定の成熟Ｇタンパク質共役レセプターのcDNA配列および対 応する推定のアミノ酸配列を示す。アミノ酸のための標準的な１文字略記が用い られている。 図２は、Ｇタンパク質共役レセプターの２次構造特性の図解である。最初の７ つの図解は、αヘリックス、βヘリックス、ターン領域またはコイル領域である アミノ酸配列領域を示す。箱で囲った領域は、示された領域に相当する領域で ある。第２の図のセットは、細胞内、細胞質にさらされるアミノ酸配列または膜 を貫通するアミノ酸配列の領域を示す。親水性プロットは、膜の脂質２重層であ り、それゆえ疎水性であるタンパク質配列の領域、および親水性である脂質２重 膜の外部の領域を示す。抗原性領域は脂質２重膜の外側の領域であり、そして抗 原結合能を有するので、抗原性指数は、親水性プロットに対応する。さらに、表 面確率プロットは、抗原性指数および親水性プロットに対応する。両親媒性プロ ットは、極性および非極性であるタンパク質配列の領域を示す。可動性領域は、 膜の外側にある領域であり、そして可動性でない領域は膜貫通領域であるという 意味において、可変性領域は図解の第２のセットに対応する。 図３は、本発明のＧタンパク質共役レセプターと種々の動物種由来のC5aレセ プターとのアミノ酸配列アラインメントを示す。色を付けた領域は図中で他のア ミノ酸配列と適合した領域である。 配列の間違いが、ポリヌクレオチド配列において生じる一般的な問題であるこ とは、指摘されるべきである。従って、図面の配列は数回の配列決定実験に基づ くものであり、そして配列の正確さは少なくとも97％であると考えられる。 本発明の局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド をコードするか、またはATCC寄託番号75821として1994年６月24日に寄託された クローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核 酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、主に末梢リンパ球に おいて発現される。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト破骨細胞腫間質細胞由来 のcDNAライブラリーにおいて発見された。これは、Ｇタンパク質共役レセプター ファミリーに、構造的に関連する。これは、355アミノ酸残基のタンパク質をコ ードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒトC5aレ セプターに全アミノ酸配列にわたり27％の同一性および54％の類似性で、最も高 い程度の相同性を示す。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは 、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり 得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ り 得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列と同 一であり得るか、または寄託したクローンのコード配列と同一であり得る。ある いは、コード配列が、遺伝コードの重複（redundancy）または縮重（degeneracy ）の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコー ドする異なるコード配列であり得る。 図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドは：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成 熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列（例えば、リーダー配列 または分泌配列もしくはプロタンパク質配列；成熟ポリペプチドのコード配列（ および必要に応じて付加的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イン トロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コー ド配列）を包含し得る。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および /または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託し たクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ 、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関す る。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝 子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。 従って、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したク ローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変 異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされる ポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このよう なヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異 体を包含する。 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列 または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体である コード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１ 以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列 の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化さ せない。 本発明はまた、成熟ポリペプチドをコードする配列がポリヌクレオチド配列に 同じリーディングフレームで融合され得るポリヌクレオチドを包含する。このポ リヌクレオチド配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助ける （例えば、細胞からのポリペプチドの移行を制御するための分泌配列として機能 するリーダー配列）。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であ り、そしてこれは宿主細胞により切断され、成熟形態のポリペプチドを形成する リーダー配列を有し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさら なる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成 熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてそれは不活性型のタンパク質であ る。一旦プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ 配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両 方を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例 えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合 、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチ ニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(198 4)）。 本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存 在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関 する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな 条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられ る用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％および好ましく は少なくとも97％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じ ることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドに ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAにより コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性 を保持するポリペプチドをコードする。すなわちこのポリペプチドは、Ｇタンパ ク質共役レセプターとして機能するか、またはこのポリペプチドがＧタンパク質 共役レセプターとして機能しない（例えばレセプターの可溶性形態）場合でも、 レセプターに対するリガンドに結合する能力を保持する。 本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続きの目的のための微 生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これら の寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄 託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、 本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列のいかなる記 載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、使用、または販売す るためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によ って与えられるわけではない。 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、または寄託したcDNAによ りコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチド 、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に 関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ チド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、この ようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持する ポリペプチドを意味する。すなわちこのポリペプチドは、Ｇタンパク質共役レセ プターとして機能するか、またはこのポリペプチドがＧタンパク質共役レセプタ ーとして機能しない（例えばレセプターの可溶性形態）場合でも、レセプターに 対するリガンドに結合する能力を保持する。アナログは、プロタンパク質部分の 切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を 包含する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または 合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドの 、フラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残 基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され 、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされる アミノ酸残基であるかもしれないかまたはないかもしれないフラグメント、誘導 体、またはアナログ、あるいは(ii)その中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含 有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(iii)その中で成熟ポ リペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレン グリコール）のような別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、また はアナログ、あるいは(iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポ リペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列のようなさらなる アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるフラグメント、誘導体、またはアナロ グであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書 中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態 で提供され、そして好ましくは均質に精製される。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合 は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動 物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない が、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリ ヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオ チドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドま たはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクターまたは 組成物がその天然の環境の一部ではないのでなお単離され得る。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ チドの産生に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは 発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換または トランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、 ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化 し、形質転換体を選択し、またはC5aレセプター遺伝子を増幅するために適切に 改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど ）は、発現のために選択される宿主細胞て以前に使用された条件であり、そして 当業者には明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す るための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含まれ得る。このようなベクタ ーは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体 ；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラ スミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例え ば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病など）であ る。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他の ベクターが使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配 列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数また は複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であ ると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロ モーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモー ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター 、E.coli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真 核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である 他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位 お よび転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するための 適切な配列を含み得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま たはネオマイシン耐性、あるいはE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性または アンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．Coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母） ；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSま たはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示か ら当業者の範囲内であると考えられる。 さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む 組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま たはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向 または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物 はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含 する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ り、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3 、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX T1、pSG（Stratagene）；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主 において複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたは ベクターも使用され得る。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子 から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびPCM7である。特に よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、およ びtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV4 0および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩ を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベ ルの範囲内にある。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例え ば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞） であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ ョン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーシ ョンによりもたらされ得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Method s in Molecular Biology、1986)。 宿主細胞中の構築物を従来の方法で使用して、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド 合成機により合成的に生成され得る。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク 質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る 。原核宿主および真核宿主での使用のために適切なクローニングベクターおよび 発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２ 版（Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として 援用されている）に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの シス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーター に作用してその転写を増大させる。例は、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エ ンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点 の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含 する。 一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点お よび選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来 するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、とりわけ解糖酵素（ 例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ 、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配 列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク 質を周辺腔または細胞外の培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切 な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現 された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチ ドを含む融合タンパク質をコードし得る。 細菌の使用のために有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能 な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始 シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクタ ーは、１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を確実にし、そ して所望であれば宿主内での増幅を提供する複製起点を含有する。形質転換のた めの適切な原核宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々 の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、 周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝子エレメントを含む市 販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。こ のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Up psala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。 これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造 配列と組み合わされる。 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖の後、選択さ れたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によ り誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により採集され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ り破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載される サル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞 株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物 発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに さらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ ー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキ ング非転写配列を含有し得る。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由来 するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る 。 Ｇタンパク質共役レセプターポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え 細胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈澱ま たはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー 、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、 アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ ー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク 質のリフォールディング工程が、成熟タンパク質の配置を完全にすることにおい て使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精 製工程に用いられ得る。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物 であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主から（例えば、培養物中の細菌 、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により）組換え技術により生成さ れ得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは 、 グリコシル化されているかもしれないか、あるいはグリコシル化されていないか もしれない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み 得る。 本発明のＧタンパク質共役レセプターは、レセプターに対するアンタゴニスト および／またはアゴニストのスクリーニングのプロセスに用いられ得る。 一般に、このようなスクリーニング手順は細胞表面上にレセプターを発現する 適切な細胞を提供する工程を包含する。特に、本発明のレセプターをコードする ポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトするために用いられ、それにより 、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する。このようなトランスフェクションは 本明細書中上記のような手順によって達成され得る。 １つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質共役レセプタ ーを発現するようにトランスフェクトされた黒色素胞の使用を包含する。このよ うなスクリーニング技術は1992年２月６日に公開されたPCT WO 92/01810中に記 述される。 従って、例えば、このようなアッセイは、Ｇタンパク質共役レセプターをコー ドする黒色素胞細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合 物の両方と接触させることにより、レセプターアンタゴニストのスクリーニング に用いられ得る。リガンドによって生じるシグナルの阻害は、化合物がレセプタ ーの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、化合物がレセプターの活性 化を阻害することを示す。 このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされるべき化合物と を接触させ、そしてこのような化合物がシグナルを生じるか否かを決定する、す なわち、このような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定することによ りアゴニストを決定するために用いられ得る。 他のスクリーニング技術としては、レセプターの活性化により引き起こされる 細胞外のpH変化を測定する系において、Ｇタンパク質共役レセプターを発現する 細胞（例えば、トランスフェクトされたCHO細胞）の使用が挙げられる。例えば これは、Science、246巻、181〜296頁（1989年10月）に記載される。例えば、潜 在的なアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｇタンパク質共役レセプターを発現 する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル トランスダクションまたはpH変化）が、潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト が有効であるか否かを決定するために測定され得る。 別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質共役レセプターをコード するRNAをxenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させる工程を包 含する。次いでそのレセプター卵母細胞は、アンタゴニストスクリーニングの場 合、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物と接触され得、 続いて、カルシウムシグナルの阻害の検出が行われる。 別のスクリーニング技術は、レセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと連結す るＧタンパク質共役レセプターを発現させる工程を包含する。このような細胞の 代表例としては、言及した内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などであり得る。 アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングは、本明細書中上記のように 、レセプターの活性化またはホスホリパーゼの２次シグナルによるレセプターの 活性化の阻害の検出により達成され得る。 別の方法は、標識リガンドの、細胞表面にレセプターを有する細胞への結合の 阻害を決定することによるアンタゴニストのスクリーニングを包含する。このよ うな方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質共役レ セプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識 形態の既知のリガンドの存在下で潜在的なアンタゴニストと細胞とを接触させる 工程を包含する。リガンドは、例えば、放射能により標識され得る。レセプター に結合した標識リガンドの量は、例えば、レセプターの放射能を測定することに より測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定したとこ ろ潜在的なアンタゴニストがレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプ ターへの結合は阻害される。 本発明はまた、Ｇタンパク質共役レセプターと結合し得ることが知られていな いリガンドが、このようなレセプターと結合し得るか否かを決定する方法を提供 する。この方法は、リガンドのＧタンパク質共役レセプターへの結合が可能な条 件下で、リガンドとＧタンパク質共役レセプターを発現する哺乳動物細胞と接触 させる工程、レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程、およびそれ により、リガンドがＧタンパク質共役レセプターと結合するか否かを決定する工 程を包含する。アゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定する本明細書中 上記の系はまた、レセプターに結合するリガンドの決定に用いられ得る。 一般に、スクリーニング手順によって決定されるＧタンパク質共役レセプター のアンタゴニストは、多様な治療目的に用いられ得る。例えば、このようなアン タゴニストは、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病 、鬱病、片頭痛、嘔吐、および良性前立腺肥大の処置に用いられている。 Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニストはまた、喘息、パーキンソン病、急 性心不全、低血圧症、尿閉、および骨粗鬆症の処置ような治療目的に有用である 。 潜在的なアンタゴニストは抗体、またはいくつかの場合においてはオリゴヌク レオチドであり、これはＧタンパク質共役レセプターと結合するが、Ｇタンパク 質共役レセプターの活性を妨げるようなセカンドメッセンジャー応答を誘起しな い。潜在的なアンタゴニストはまた、Ｇタンパク質共役レセプターのリガンドに 近縁のタンパク質、すなわち、生物学的機能を損失し、そしてＧタンパク質共役 レセプターに結合するときに応答を全く誘起しないリガンドのフラグメントを含 む。 潜在的アンタゴニストはまた、アンチセンス技術の使用により調製されるアン チセンス構築物を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成あるいはアンチセ ンスDNAまたはRNAを介した遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの 方法の両方はポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コ ード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計 するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域 に相補的に設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Co oneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Science，251:1360(1991)を 参照のこと）、それにより、転写およびＧタンパク質共役レセプターの産生を防 止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイ ズし、そしてmRNA分子のＧタンパク質共役レセプターへの翻訳をブロックする（ アンチセンス-Okano、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleoti des as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，F L(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、アンチセン スRNAまたはDNAがインビボて発現されてＧタンパク質共役レセプターの産生を阻 害し得る。 別の潜在的なアンタゴニストは、Ｇタンパク質共役レセプターに結合する小分 子であり、これはＧタンパク質共役レセプターのリガンドへの接近を不可能にし て、正常な生物学的活性が防止される。小分子の例としては、小ペプチドまたは ペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。 潜在的アンタゴニストはまた、Ｇタンパク質共役レセプターの可溶形態（例え ば、レセプターのフラグメント）を含み、これはリガンドに結合し、そしてリガ ンドが膜結合Ｇタンパク質共役レセプターと相互作用することを防止する。 本発明のＧタンパク質共役レセプターは、C5aレセプターとして推定的に同定 されている。この同定はアミノ酸配列相同性の結果としてなされている。 アンタゴニストは、C5aポリペプチドにより刺激され、そしてC5aレセプターに より媒介される過敏症から生じるすべての病理学的症状の処置に用いられ得る。 これらの病理学的症状としては以下が挙げられる：喘息、気管支アレルギー、慢 性炎症、全身性エリテマトーデス、脈管炎、血清病、血管性水腫、慢性関節リウ マチ、変形性関節症、痛風、水泡性皮膚病、過敏症、肺炎、特発性肺線維症、免 疫複合体媒介糸球体腎炎、乾せん、アレルギー性鼻炎、成人性呼吸困難症候群、 急性肺障害、エンドトキシンショック、肝硬変、膵炎、炎症性腸疾患（クローン 病および潰瘍性大腸炎を含む）、火傷、グラム陰性敗血症、心筋梗塞中の壊死、 リューコフォレシス(leukophoresis)、医療デバイスへの曝露（血液透析膜およ び生体外血液循環装置を含むが、これらに限定されない）、慢性肝炎、移植拒絶 、ウイルス感染後脳障害、および／あるいは虚血誘導性の心臓または脳障害。こ れらのアンタゴニストはまた、デング尿素熱を伴うショックのような症状の予防 としても用いられ得る。アンタゴニストは、例えば、本明細書中以下に記載の薬 学的に受容可能なキャリアとともに組成物中で用いられ得る。 上記のスクリーニング方法により同定されたアゴニストは、C5aレセプターを 媒介したC5a反応を増強するために用いられ得る。これは、細菌感染に対する防 御、C5aの免疫調節効果の刺激、ガン、免疫不全疾患、および重篤な感染の処置 を包含する。 C5aレセプターおよびアンタゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャ リアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプ チド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャ リアとしては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロース、水、グリセロ ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定さ れない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容 器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、薬品また は生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された 形式の製品表示を伴い得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用、 または販売における機関による認可を表す。さらに、本発明のポリペプチドは、 他の治療化合物と併用して用いられ得る。 薬剤組成物は、局所、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経 路によるような簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特異症状の処置お よび／または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくと も約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８mg/k g体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10μg/kg体 重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。 このC5aレセプターポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストま たはアゴニストはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチド の発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。 従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド（DNAまたはRNA）を用いてエクスビボで操作され得、次いで、操作された細 胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当 該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNA を含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野て公知の手順によって操 作され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めの産生細胞(producer cell)は、インビボで細胞を操作し、そしてインビボで のポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発 明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教 示から当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現 ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る 。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するた めに使用され得る。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染 色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得 る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体 位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試 薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの配列 と疾患に関連する遺伝子とを相関させることにおいて重要な、第１工程である。 簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を 調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ ノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化 しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライ マーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニング に使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが 増幅フラグメントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に 使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな ゲノムクローンのプールを用いて詳細な位置決め(sublocalization)が達成され 得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで 選別した（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特 異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択(p reselection)を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ ン(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技 術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpより も大きいクローンの方が、簡便な検出のための十分なシグナル強度で独特の染色 体位置に結合しやすい。FISHは、ESTか由来するクローンの使用を必要とし、そ してこのクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bp はより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、合理的な割合の時間で（a r esonable percentage of the time）良好な結果を得るためにはおそらく必ずし も必要でない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manu al of Basic Techniques，Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な 位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med ical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同一の 染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣 接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する 必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが全ての正常 な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。 物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関 連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因 遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度であること 、および20kbあたり１遺伝子であることを仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、あるいはそれらのア ナログ、もしくはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるた めの免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体お よびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物 を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン トの生成のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ 得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた 抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体 を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド を発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。 モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗 体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ 細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、および ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁 ）が挙げられる。 単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本 発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得 る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ うな実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明 記しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または 数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準 なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラス ミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等 価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触 媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市 販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者 に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた はDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する 。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的に は５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定 の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37 ℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の 説明書に従って変化し得る。消化後、反応液をポリアクリルアミドゲル上で直接 電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。 切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res.，8:4 057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行われる。 「オリゴヌクレオチド」は、1本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを言い、これらは化学的に合成さ れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキ ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連 結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに 連結する。 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、 連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達 成され得る。 他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVander Eb，A.、Virology 、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。 実施例１ C5a レセプターの細菌発現および精製 C5aレセプターをコードするDNA配列（ATCC寄託番号第75821号）を、プロセス された（シグナルペプチド配列を欠く）C5aレセプタータンパク質の５'末端配列 および遺伝子に対して３'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて最初に増幅をする。C5aレセプターに対応するさらなるヌクレ オチドを、５'および３'配列それぞれに付加した。５'オリゴヌクレオチドプラ イマーは、配列５’GACTAAAGCTTAATGGAAGATTTGGAGGAA ３’を有し、HindIII制限 酵素部位、続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始 する19ヌクレオチドのC5aレセプターコード配列を含む。３’配列、５’GAACTTC TAGACCGTTATTGAGCTGTTTCCAGGAG ３’は、XbaI部位に相補的な配列を含み、続い て遺伝子の18ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Q iagen，Inc．9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）の制限酵素部位に対 応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可 能プロモーター／オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタ グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をHindIIIおよびXbaIで消 化した。増殖配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードす る配列にインフレームで挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株（M 15/rep4の商標でQiagenから入手可能）をSambrook，J.ら、Molecular loning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順によ り形質転換する。M15/rep4は、プラスミドpREP4の多数のコピーを含み、これはl acIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）も与える。形質転 換体はLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定され、そしてアンピシリ ン／カナマイシン耐性コロニーが選択された。プラスミドDNAを単離し、そして 制限解析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）と Kan（25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖 させた。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大量培養物に接種する。細胞を 、光学密度600（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IP TG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度 に した。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化し、P/Oの解放（clear）をして、遺伝 子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。 次いで、細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカオトロピック剤であ る６MグアニジンHCl中で可溶化させた。澄明化後、可溶化されたC5aレセプター を、6-Hisタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下でのニッ ケルキレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（Hoch uli，E.ら、J．Chromatography 411:177-184(1984)）。C5aレセプターを、６Mグ アニジンHCl pH5.0中にカラムから溶出し、そして再生の目的のために、3Mグア ニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および2mM グルタチオン(酸化型)に調整した。この溶液で12時間インキュベーションした後 、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。 実施例２ COS 細胞における組換えC5aレセプターの発現 発現プラスミド、pC5a HAは、ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)に由来する。 ベクターpcDNAI/Ampは：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３E ．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化 部位が続くCMVプロモーター、を含有する。完全なpC5aタンパク質、およびその ３’末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、 ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発 現はCMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたようにイン フルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(I．Wi1son) 、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984 ,Cell37，767)。標的タンパク質へのHAタグの融合(infusion)は、HAエピトープ を認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。 プラスミド構築ストラテジーを以下に記述する： C5aレセプターをコードするDNA配列（ATCC寄託番号第75821号）を、２つのプ ライマーを用いて、クローン化された完全長の遺伝子に対するPCRにより構築し た：５'プライマー５’GTCCGAAGCTTGCCACCATGGAAGATTTGGAGGAA ３'は、HindIII 部位、続いて開始コドンから開始する18ヌクレオチドのC5aレセプターコード配 列を含む;３'配列５’CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCATTGAGCTGT TTCCAGGAG ３'は、XhoI部位、翻訳終止コドン、HAタグ、およびC5aレセプターコ ード配列の最後の18ヌクレオチド（終止コドンは含まない）に相補的な配列を含 む。それゆえ、PCR産物は、HindIII部位、インフレームで融合されたHAタグが続 くC5aレセプターコード配列、HAタグに隣接する翻訳終結終止コドン、およびXho I部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、HindI IIおよびXhoI制限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jo lla，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシ リン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを 形質転換体より単離し、そして適正なフラグメントの存在を制限分析て試験した 。組換えC5aレセプターの発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベ クターでトランスフェクトした。（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Mo lecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(198 9)）。C5aレセプター HAタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法により 検出した。（E．Harlow,D.Lane，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Laboratory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日 後、³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を 界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％NP-40、0.1％SDS、１％NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した。（Wilson，I.ら、同上37:767(1984)）。 細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体により沈澱さ せた。沈澱したタンパク質を15％SDS-PAGEゲル上で分析した。 実施例３ バキュロウイルス発現系を用いるC5aレセプターのクローニングおよび発現 完全長のC5aレセプタータンパク質をコードするDNA配列（ATCC寄託番号第7582 1号）を、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマ ーを用いて増幅した。 ５'プライマーは、配列５’GCCGGATCCGCCACCATGGAAGATTTGGAGGAA ３'を有し、 そしてBamHI制限酵素部位（太字）、続いて真核生物細胞における翻訳の開始に 効率的なシグナルに類似する6ヌクレオチド（J．Mol．Biol．1987，196，947-95 0，Kozak，M.）を含み、そしてこれは遺伝子の最初の18ヌクレオチドのすぐ後で ある（翻訳開始コドン「ATG」に下線を付す）。 ３'プライマーは、配列５’GCCGGATCCGTTATTGAGCTGTTTCCAG ３’を有し、そし て制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位およびC5aレセプター遺伝子の３’非 翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Gene clean」 BIO 101 Inc.，LaJolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単 離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIで消化し、そして１ ％アガロースゲルで再度単離した。このフラグメントを、F2と称する。 ベクターRGl(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用 いるC5aレセプタータンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers, M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Stat ion Bulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa cali fornica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強いポリヘドリンプロモーター、続い て制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40 のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイ ルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポ リヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと 同方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、同時トランスフェクトされた野生型ウ イルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列により両端て隣接され る。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。こ れらは例えば、pAc373、pVL941およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummer s，M.D.、Virology，170:31-39）。 プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔 ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを１％アガロース ゲルより上記のように単離した。このベクターDNAをV2と称する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4DNAリガーゼを用いて連 結した。次いて、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIを用いて、 C5aレセプター遺伝子を有するプラスミド（pBacC5a）を含む細菌を同定した。ク ローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。 ５μgのプラスミドpBacC5aを、リポフェクション法（Felgnerら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化した バキュロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Dieg o,CA.）と同時トランスフェクトした。 １μgのBaculoGo1d^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacC5aを、50μl の無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマ イクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェ クチンと90μlのグレース培地とを添加し、混合し、そして室温にて15分間イン キュベートた。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレー ス培地１mlを含む35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後 に振とうした。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後 、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を 補充した１mlのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻 し、そして27℃で４日間培養を続けた。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様 にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な 単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を 有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布される昆虫細胞培養およびバ キュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る ）。 ４日後、ウイルスの連続希釈物を細胞に加え、青く染色されたプラークをエッ ペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、 200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。寒天を、 簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35 mmディッシュ中に播種されたSf9細胞を感染させるために用いた。４日後、これ らの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で培養した。細胞を、 感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスＶ-C5aで感染させた。６時間後 、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地 （Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCiの³⁵ Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞 を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そし てSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化 した。 実施例４ ヒト組織におけるC5aレセプターの発現パターン ヒト組織におけるC5aレセプターの発現レベルを試験するために、ノーザンブ ロット分析を行った。全細胞RNAサンプルをRNAzol^TMBシステム（Biotecx Labora tories，Inc．6023 South Loop East，Houston，TX 77033）を用いて単離した。 特定された各ヒト組織から単離された約10μgの全RNAを１％アガロースゲル上で 分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした（Sambrook、Fritsch、お よびManiatis、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標 識反応を、50ngのDNAフラグメントを用いてStratagene Prime-Itキットに従って 行った。標識DNAを、Select-G-50カラムを用いて精製した。（5 Prime-3 Prime, Inc．5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303）。次いで、フィルターを、0.5 M NaPO₄(pH7.4)および７％ SDS中の1,000,000cpm/mlの、放射能標識完全長C5aレ セプター遺伝子と一晩、65℃でハイブリダイズした。室温で２回ならびに60℃で ２回0.5×SSC、0.1％ SDSで洗浄後、次いでフィルターを増感スクリーンととも に一晩、-70℃で曝露した。C5aレセプターのメッセージRNAは末梢リンパ球中に 豊富に存在する。 本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、した がって、添付の請求の範囲の範囲内であれば、本発明は、特に記載された以外に も実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離されたポリヌクレオチドであって： （a）図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レセプターポリペプチ ドあるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体をコードする ポリヌクレオチド； （b）ATCC寄託番号75821に含有されるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有 するＧタンパク質共役レセプターポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラ グメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド、 からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオ チド。 ５．前記ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役 レセプターをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ６．前記ポリヌクレオチドがATCC寄託番号75821のcDNAによりコードされるＧタ ンパク質共役レセプターポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌク レオチド。 ７．図１に示されるＧタンパク質共役レセプターのコード配列を有する、請求項 １に記載のポリヌクレオチド。 ８．ATCC寄託番号75821として寄託されるＧタンパク質共役レセプターのコード 配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ９．請求項２に記載のDNAを含有するベクター。 １０．請求項９に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。 １１．ポリペプチドを生産するプロセスであって、以下の工程： 請求項１０に記載の宿主細胞から、前記DNAによりコードされる前記ポリペプ チドを発現させる工程、 を包含する、プロセス。 １２．ポリペプチドを発現する能力を有する細胞を産生するプロセスであって、 請求項９に記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、プロ セス。 １３．請求項２に記載のDNAとハイブリダイズ可能であり、かつＧタンパク質共 役レセプター活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。 １４．ポリペプチドであって、（i）図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパ ク質共役レセプターポリペプチドならびにそのフラグメント、アナログおよび誘 導体、および(ii)ATCC寄託番号75821のcDNAによりコードされるＧタンパク質共 役レセプターポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ および誘導体、からなる群より選択される、ポリペプチド。 １５．前記ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＧタンパク質共役レ セプターである、請求項１４に記載のポリペプチド。 １６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。 １７．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドを活性化す る、化合物。 １８．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドの活性化を 阻害する、化合物。 １９．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターポリペプチドの活性化の 必要性を有する患者の処置方法であって、以下の工程： 請求項１７に記載の化合物の治療的有効量を該患者に投与する工程、 を包含する、方法。 ２０．請求項１４に記載のＧタンパク質共役レセプターの活性化を阻害する必要 性を有する患者の処置方法であって、以下の工程： 請求項１８に記載の化合物の治療的有効量を該患者に投与する工程、 を包含する、方法。 ２１．前記ポリペプチドが前記Ｇタンパク質共役レセプターの可溶性フラグメン トであり、かつ該レセプターに対するリガンドを結合する能力を有する、請求項 １４に記載のポリペプチド。 ２２．Ｇタンパク質共役レセプターのアンタゴニストおよびアゴニストを同定す るためのプロセスであって、以下の工程： 細胞表面上でＧタンパク質共役レセプターを発現させる工程； 該細胞をレセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物に接触さ せる工程； ２次シグナルが該リガンドおよび該レセプターの相互作用から生じるかどうか を決定する工程；および 該スクリーニングされるべき化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである かどうかを同定する工程、 を包含する、プロセス。 ２３．Ｇタンパク質共役レセプターに結合する能力を有することが既知でないリ ガンドが、Ｇタンパク質共役レセプターに結合し得るかどうかを決定するプロセ スであって、以下の工程： Ｇタンパク質共役レセプターを発現する哺乳動物細胞を潜在的なリガンドに接 触させる工程； 該レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程；および 該リガンドがＧタンパク質共役レセプターに結合するかどうかを決定する工程 、 を包含する、プロセス。