JP2003018992A - Ｐａｅｌ受容体、Ｐａｅｌ受容体発現細胞および動物、ならびにパーキンソン病治療薬のスクリーニング法 - Google Patents

Ｐａｅｌ受容体、Ｐａｅｌ受容体発現細胞および動物、ならびにパーキンソン病治療薬のスクリーニング法

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Yuzuru Imai
譲 今居
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Yoshikuni Mizuno
美邦 水野
Mariko Soda
真理子 祖田
Haruhisa Inoue
治久 井上
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Parkinの基質、該基質を用いてパーキンソン
病の病因を解明するための系およびパーキンソン病の治
療薬をスクリーニングする方法を提供することを課題と
する。 【解決手段】 ヒトPael受容体をコードするDNA、また
はその変異体を組み込んだDNAを有する動物細胞、該DNA
を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物、ヒトPael受
容体をコードするDNAの全部または一部からなるプロー
ブおよびPael受容体を特異的に認識する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝性パーキンソ
ン病に関わるParkin遺伝子の発現産物の基質であるPael
受容体およびPael受容体を特異的に認識する抗体に関
し、さらにPael受容体遺伝子を保有しPael受容体を発現
する細胞、Pael受容体遺伝子を保有しPael受容体を発現
するパーキンソン病モデル動物ならびにこれらを用いた
各種試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】パーキンソン病はアルツハイマー病に次
いで二番目に多い神経変性疾患である（有病率 10万人
に50〜60人以上）。パーキンソン病は老齢期に発症し、
臨床的には筋硬直、振戦、無動などを主徴とする運動障
害性疾患であり、中脳黒質緻密帯のドパミンニューロン
の選択的脱落を病理学的特徴とする。パーキンソン病の
病因は全く不明であるが、最近家族性パーキンソン病に
おいて遺伝子変異が見つかったことによって、その分子
メカニズムの理解が進もうとしている。
【０００３】α-シヌクレイン遺伝子における２つのま
れな遺伝子変異（A53TとA30P）は常染色体優性遺伝家族
性パーキンソン病の原因となる(Kruger, R. et al., (1
998)Nat Genet 18, 106-108; Polymeropoulos, M. H. e
t al., (1997) Science 276, 2045-2047)。α-シヌクレ
インはシナプス前領域のタンパク質で、レビー小体（Le
wy body）の主成分である。レビー小体はすべての孤発
性、および一部の家族性パーキンソン病の病理学的特徴
となる高度にユビキチン化された細胞内凝集物である(T
rojanowski, J. Q. et al., (1998) Cell Death Differ
5, 832-837)。レビー小体は黒質のドパミンニューロン
を含む変性ニューロンでみられることが多く、現在、パ
ーキンソン病の発症メカニズムに関与することが強く疑
われている(Goldberg, M. S. et al., (2000) Nat Cell
Biol 2, E115-119; Spillantini, M. G. et al., (199
8) Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6469-6473)。
【０００４】遺伝性パーキンソン病でもっとも頻度が高
い、常染色体劣性遺伝性の若年性パーキンソン病（AR-J
P、以下、本明細書においてAR-JPとする）はParkin遺伝
子の変異が原因である。AR-JPの患者では、レビー小体
形成を伴わないドパミンニューロンの脱落によるパーキ
ンソン病様症状が特徴である(Mizuno, Y. et al., (199
8) J Neurochem 71, 893-902)。
【０００５】Parkin遺伝子は1.5 メガベースで、ヒトの
遺伝子の中でも最も大きい部類である。Parkin遺伝子は
12個のエクソンよりなり、分子量52 kDaの465アミノ酸
のタンパク質をコードしている(Kitada, T. et al., (1
998) Nature 392, 605-608;Shimura, H. et al., (199
9) Ann Neurol 45, 668-672)。Parkinのアミノ末端７６
アミノ酸はユビキチンに６２％ホモロジーがある。Park
inのカルボキシ末端は２つのRINGフィンガーがあり、そ
の間にin between RING fingers (RINGフィンガーの間)
というRINGフィンガーに似たモチーフが存在する(Moret
t, E. et al.,(1999) Trends Biochem Sci 24, 229-23
1)。最近の研究によって多くのRINGフィンガータンパク
はユビキチンリガーゼ（E3）活性を持つことが明らかに
なった(Jackson, P. K. et al., (2000) Trends Cell B
iol 10, 429-439; Joazeiro, C. A. et al., (2000) Ce
ll 102, 549-552)。プロテアソームで分解されるタンパ
ク質はユビキチンの共有結合による修飾を受ける。ユビ
キチン化の反応はユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキ
チン結合酵素（E2）、ユビキチンリガーゼ（E3）の３種
類の酵素によって行われる(Hershko, A. et al., (199
8) Annu Rev Biochem 67, 425-479; Hochstrasser, M.
(1996) Annu Rev Genet 30, 405-439)。基質タンパク質
を特異的に認識、結合し、そのユビキチン化を促進する
役割はE3が担っている。ユビキチン化されるタンパク質
を認識する高度の特異性は、非常に多くの種類があると
予想されるE3によって決定されている。本発明者らのグ
ループを含む複数のグループはParkinがE3であって、AR
-JP患者でみられる変異型のParkinはE3活性を欠いてい
ることを明らかにした(Imai, Y. et al., (2000) J Bio
l Chem 275, 35661-35664; Shimura, H. et al., (200
0) Nat Genet 25, 302-305; Zhang, Y. et al., (2000)
Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13354-13359)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】AR-JPはE3であるParki
nの機能不全によって発症することから、Parkinを介す
るユビキチン化が起こらず、分解されなくなった基質タ
ンパクが細胞内に異常に蓄積し、黒質ドパミンニューロ
ン死を引き起こすと予想される。しかし、従来は、Park
inの基質は見出されていなかった。従ってParkinの基質
タンパク質の同定はAR-JPの病理メカニズムを解明し、
その治療法を開発する鍵になると考えられる。さらに孤
発性パーキンソン病でもAR-JPと共通のメカニズムでド
パミンニューロンが特異的に変性する可能性があること
から、Parkinの基質の同定は全ての種類のパーキンソン
病の病因解明、治療法開発に寄与する期待がもたれる。
すなわち、本発明はParkinの基質、該基質を用いてパー
キンソン病の病因を解明するための系およびパーキンソ
ン病の治療薬をスクリーニングする方法を提供すること
を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討の結果、Gタンパク共役型膜タン
パクと考えられ、Pael(Parkin-associated endothelin
receptor-like)受容体と命名されたタンパクがParkinの
基質であることを見出し、さらにPael受容体の蓄積がAR
-JPにおけるドパミンニューロン死を引き起こす可能性
が高いことを見出し、Pael受容体に関する本発明を完成
させるに至った。すなわち、本発明は、以下の事項を要
旨とする。
【０００８】（１）パーキンソン病治療薬のスクリーニ
ングのための、ヒトPael受容体。 （２）パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パーキンソ
ン病である、前記（１）のヒトPael受容体。 （３）パーキンソン病治療薬のスクリーニングのため
の、外来性ヒトPael受容体をコードするDNA、またはそ
の変異体を組み込んだDNAを有する動物細胞。 （４）外来性ヒトPael受容体をコードするDNAが配列番
号１で示される前記（３）記載の動物細胞。 （５）さらにParkin遺伝子もしくはParkin遺伝子の変異
体を有する前記（３）また（は）４記載の動物細胞。
【０００９】（６）さらに、エンドセリン受容体タイプ
A、エンドセリン受容体タイプB、UBC6、UBC7からなる群
から選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子を有す
る前記（５）記載の動物細胞。 （７）細胞がHEK293T細胞またはSH-SY5Y細胞である、前
記（３）〜（６）のいずれか記載の動物細胞。 （８）パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パーキンソ
ン病である、前記（３）〜（７）のいずれか記載の動物
細胞。 （９）外来性ヒトPael受容体をコードするDNA、または
その変異体を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物。 （１０）外来性ヒトPael受容体をコードするDNAが配列
番号１で示される前記（９）記載の非ヒト哺乳動物。
【００１０】（１１）さらにParkin遺伝子もしくはPark
in遺伝子の変異体を有する前記（９）または（１０）記
載の非ヒト哺乳動物。 （１２）さらに、エンドセリン受容体タイプA、エンド
セリン受容体タイプB、UBC6、UBC7からなる群から選ば
れる少なくとも１つをコードする遺伝子を有する前記
（１１）記載の非ヒト哺乳動物。 （１３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である前記（９）
〜（１２）のいずれか記載の動物。 （１４）ゲッ歯動物がマウスである前記（１３）記載の
動物。 （１５）ヒトPael受容体をコードするDNAまたはその変
異体を導入した全能性細胞を個体発生して得られる哺乳
動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体中に上
記導入遺伝子を保有することを特徴とする前記（９）〜
（１４）のいずれか記載の非ヒト哺乳動物。
【００１１】（１６）前記（９）〜（１５）のいずれか
記載の動物から単離された細胞。 （１７）前記（１）または（２）記載のヒトPael受容体
をパーキンソン病候補治療薬と接触させ、動物細胞にお
けるPael受容体の量を指標としてパーキンソン病治療薬
をスクリーニングする方法。 （１８）前記（３）〜（８）および（１６）のいずれか
記載の動物細胞をパーキンソン病候補治療薬と接触さ
せ、動物細胞におけるPael受容体の量を指標としてパー
キンソン病治療薬をスクリーニングする方法。 （１９）前記（９）〜（１５）のいずれか記載の動物に
パーキンソン病候補治療薬を投与し、該動物の細胞にお
けるPael受容体の量を指標としてパーキンソン病治療薬
をスクリーニングする方法。 （２０）パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パーキン
ソン病である、前記（１７）〜（１９）のいずれか記載
の方法。
【００１２】（２１）パーキンソン病の発症危険因子を
検出するための、ヒトPael受容体をコードするDNAの全
部または一部からなるプローブ。 （２２）パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パーキン
ソン病である、前記（２１）記載のプローブ。 （２３）前記（２１）または（２２）記載のプローブを
用いて、パーキンソン病の発症危険因子を検出する方
法。 （２４）パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パーキン
ソン病である、前記（２３）記載の方法。 （２５）Pael受容体と反応し、Pael受容体ホモログであ
るETBR-LP-2と反応しないPael受容体を認識する抗体。
【００１３】（２６）さらに、Pael受容体ホモログであ
るエンドセリン受容体タイプAおよびエンドセリン受容
体タイプBと反応しない、前記（２５）記載の抗体。 （２７）モノクローナル抗体である前記（２５）または
（２６）記載の抗体。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】１．Pael受容体をコードするDNA
の取得 Pael受容体をコードするDNAは、J. Sambrook, E. F. Fr
itsch & T. Maniatis(1989): Molecular Cloning, a la
boratory manual, second edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press及び Ed Harlow and David Lanc (1
988): Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press等の当業者に良く知られた文
献に記載された方法に従って取得することができる。例
えば、ヒトの脳から抽出したRNAからcDNAライブラリー
を作製し、酵母two-hybrid法によりParkinをベイトとし
て該ライブラリーをスクリーニングすることによりPark
inの基質として得ることができる。ここで「Parkin」と
は、遺伝性パーキンソン病に関連したParkin遺伝子の発
現産物を意味する。また、Pael受容体をコードするDNA
配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを
用いて該ライブラリーをスクリーニングすることにより
得ることができる。Pael受容体をコードするDNAとし
て、配列番号1で表される塩基配列を含むDNA、または配
列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするDNAが挙
げられる。
【００１５】Pael受容体をコードするDNAの変異体は、
野生型のPael受容体のcDNAに、公知の方法で変異誘導す
ることによって作製することができる。Pael受容体をコ
ードするDNAの変異体として、配列番号1で表される塩基
配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつParkinの基質となり得るタンパク質をコ
ードするDNA、または配列番号２で表されるアミノ酸配
列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列を含み、かつParkinの基質
となり得るタンパク質が挙げられる。ここで、ストリン
ジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。例えば、相同性が高いDNA同士、すなわち60％
以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士が
ハイブリダイズし、それにより相同性が低い核酸同士が
ハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的に
は、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900
mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件を
いう。
【００１６】配列番号２で表されるアミノ酸配列におい
て1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列として、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列の１〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好まし
くは1個若しくは2個のアミノ酸が欠失してもよく、配列
番号２で表されるアミノ酸配列の1〜10個、好ましくは1
〜5個、さらに好ましくは1個若しくは2個のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換してもよい。また、配列番号２で表
されるアミノ酸配列に1〜10個、好ましくは1〜5個、さ
らに好ましくは1個若しくは2個のアミノ酸が付加してい
てもよい。
【００１７】このような配列番号２のアミノ酸配列にお
いて１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列として、配列番号２のアミノ酸配
列と、BLASTを用いて計算したときに、少なくとも60％
以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは95％以上
の相同性を有しているものが挙げられる。
【００１８】一旦遺伝子の塩基配列が確定されると、そ
の後は化学合成によって、又はクローニングされたcDNA
を鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有す
るDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせること
によって、Pael受容体をコードするDNAまたはその変異
体を得ることができる。このようにして、得られたDNA
により配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは複
数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列を含み、かつParkinの基質となり得るタンパク質を
取得することができる。さらに、Pael遺伝子のORF部分
のみならず、5’非翻訳領域、3’非翻訳領域を含んだも
のも本発明のヒトPael受容体をコードするDNAに含まれ
る。
【００１９】ここで、「Parkinの基質」とは、ATP、E
1、E2、ユビキチンの存在下でParkin依存的にユビキチ
ン化され、分解されるタンパク質を意味し、例えば、in
vitroでATP、E1、E2、ユビキチンおよびParkinと混合
し、ユビキチン化を受け分解されるか否かを確認するこ
とによりParkinの基質であることを確認することが可能
である。また、Pael受容体をコードするDNAの全部また
は一部を用いて遺伝子診断を行い、パーキンソン病の発
症危険因子を保持しているか否かを診断することができ
る。この際、用いるDNA配列の長さは、12塩基から16塩
基以上、好ましくは20塩基以上である。また、これらの
配列を有するポリヌクレオチドと上述のストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドも診断に
用いることができる。
【００２０】２．組換えPael受容体発現細胞およびPael
受容体の取得 配列番号１に示される本発明のPael受容体をコードする
DNAおよびその変異体を発現ベクターに挿入し、適当な
宿主細胞に該ベクターを導入することにより、Pael受容
体発現細胞を得ることができる。ベクターとして、プラ
スミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製
可能である限りいかなるベクターも用いることができ
る。例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC3
0、pCFM536等の大腸菌プラスミド、pUB110等の枯草菌プ
ラスミド、pG-1、YEp13、YCp50等の酵母プラスミド、λ
gt110、λZAPII等のファージのDNA等が挙げられ、哺乳
類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV4
0とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始
点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエ
ンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいて
もよい。プロモータとしては、宿主細胞で効率よく発現
するものであればいかなるプロモータでもよいが、例え
ば、SRαプロモータ、SV40プロモータ、LTRプロモー
タ、CMVプロモータ、HSV-TKプロモータ等が挙げられ
る。また、膜表面へ発現させる場合は、既知シグナルペ
プチドをコードする核酸をN末に付加すればよい。
【００２１】宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミ
セス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の
真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細
胞、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞、H
EK293T、SH-SY5Y、CHO、COS、BHK、3T3、C127等の哺乳
類細胞等が挙げられる。形質転換は、塩化カルシウム、
リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン介在トランスフ
ェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法
で行うことができる。
【００２２】このようにして得られたPael受容体発現細
胞からPael受容体を単離することができる。また、Pael
受容体を発現する動物細胞を、Pael受容体の蓄積を抑制
する物質、Pael受容体のユビキチン化もしくは分解を促
進する物質、Pael受容体の体外への排出を促進する物質
等、パーキンソン病の治療に使用可能な薬剤のスクリー
ニングに用いることができる。
【００２３】さらに、Pael受容体をコードする遺伝子と
同時に、Parkin遺伝子（Kitada, T.et al., (1998) Nat
ure 392, 605-608; Shimura, H, eta al., (1999) Ann
Neurol 45, 668-672）、Parkin遺伝子の変異体、エンド
セリン受容体タイプA若しくはタイプB等のPael受容体関
連受容体をコードする遺伝子（Arai, H et al.(1990) N
ature 348, 730-732, Sakurai, T et al. (1990) Natur
e 348, 732-735）および／または小胞体関連のE2遺伝子
（Katsanis N, Fisher EM(1998) Genomics 51, 128-31,
Lester D, et al. (2000) Biochem Biophys Res Commu
n 269, 474-80）を導入し、共発現させることにより、
パーキンソン病の治療に使用可能な薬剤のスクリーニン
グだけではなく、パーキンソン病の原因解明に使用可能
な細胞系を得ることができる。ここで、Parkin遺伝子の
変異体とは、その発現産物がParkinの生物学的作用、例
えばE3活性等を失ったものであり、AR-JP患者から単離
したParkin遺伝子や（Imai, Y. et al., (2000) J Biol
Chem 275, 35661-35664; Shimura, H. et al., (2000)
Nat Genet 25, 302-305; Zhang, Y. et al., (2000) P
roc Natl Acad Sci U S A 97, 13354-13359）、Parkin
のC末端アミノ酸配列を失ったParkin-N、Q311X、ΔRIN
G、等がある（図２）。
【００２４】３．抗Pael受容体抗体の取得 Pael受容体を抗原として、当業者に良く知られた方法に
従い例えばマウス、モルモット、ウサギ、ヤギ等の動物
の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し、十分に
免疫した後、動物から採血し、血清分離し、抗Pael受容
体抗体を作製することができる。この際、適当なアジュ
バントを使用することもできる。モノクローナル抗体も
公知の方法により作製し得る。例えば、Pael受容体で免
疫したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞との細
胞融合により得られるハイブリドーマを作製し、該ハイ
ブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマを腹腔内に
投与したマウスの腹水から調製することができる。免疫
抗原として用いるPael受容体は、脳組織から抽出した天
然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したもの
でもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良
いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメン
トや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。ペプチドフラ
グメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した
断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の全部ま
たは一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物で
も良い。ポリペプチドフラグメントを適当なキャリア蛋
白質と化学結合により結合させた上で使用することもで
きる。得られた抗体の反応性は、酵素免疫測定法（EI
A）、放射免疫測定法（RIA）、ウエスタンブロッティン
グ等の当業者によく知られた方法により測定することが
できる。この際、反応性検定に用いる抗原にPael受容体
の他にLP-2等のPael受容体のホモログを用いれば、Pael
受容体を認識するが、LP-2等のPael受容体のホモログを
認識しない特異抗体を得ることができる。
【００２５】４．Pael受容体発現モデル動物の取得 Pael受容体発現モデル動物へ導入する遺伝子には、その
発現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー
配列を連結する。これらの配列については特に制限はな
く、通常用いられている配列を適宜に組み合わせて使用
することができる。ただし、導入遺伝子を脳で特異的に
発現させるためには、β−アクチンプロモーター等の使
用が好ましい。
【００２６】トランスジェニック動物の作成は、例え
ば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 1980の方法
等に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に
導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム
中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによ
って作成することができる。哺乳動物としては、近交系
が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精
等の技術が整っているマウスが好ましいが、技術的には
全ての動物種を対象とすることが可能である。遺伝子を
導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や
初期胚のほか、多分化能を有するES細胞のような培養細
胞が挙げられる。培養細胞への遺伝子導入法としては、
公知の静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム
法等も利用できるが、トランスジェニック動物個体の産
出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を勘案した場
合、受精卵へのDNA溶液の物理的注入（マイクロインジ
ェクション）法が好ましい。
【００２７】遺伝子を注入した全能性細胞を、仮親の卵
管に移植し、個体まで発生させることにより、Pael受容
体発現動物を得ることができる。DNAを体細胞から抽出
し、サザンブロット分析やPCRアッセイ等を用いて導入
遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存
在が確認された個体を初代（Founder）として、交配に
よりPael受容体遺伝子またはその変異体を染色体の一部
に安定的に組み込んだ動物を効率よく作出することがで
きる。また、上述のPael受容体発現細胞と同様に、Park
in遺伝子、AR-JP患者より単離されたParkin遺伝子の変
異体および／またはエンドセリン受容体等のPael受容体
関連受容体をコードする遺伝子を同時に組み込んでもよ
い。
【００２８】このようにして作出されたトランスジェニ
ック動物は、パーキンソン病の原因解明およびパーキン
ソン病の治療に使用可能な薬剤のスクリーニングに最適
のモデル動物となる。さらに、この発明によって提供さ
れるトランスジェニック動物は、全ての体細胞に導入遺
伝子を保有するため、この動物個体から単離した細胞も
Pael受容体を発現する。このため、これらの細胞の培養
系を用いて、上記動物個体の場合と同様にパーキンソン
病の原因解明およびパーキンソン病の治療に使用可能な
薬剤のスクリーニングに利用することができる。
【００２９】５．パーキンソン病の治療に使用可能な薬
剤のスクリーニング 上述のPael受容体、Pael受容体を発現する細胞、トラン
スジェニック動物および該トランスジェニック動物から
得た細胞をパーキンソン病の治療に使用可能な薬剤のス
クリーニングに用いることができる。
【００３０】パーキンソン病の治療に用い得る薬剤とし
て、Pael受容体の蓄積を抑制する物質、Pael受容体のユ
ビキチン化もしくは分解を促進する物質、Pael受容体の
体外への排出を促進する物質等が挙げられる。パーキン
ソン病の治療に用い得る薬剤の候補物質を、Pael受容体
を発現する培養細胞に添加し、またはPael受容体を発現
する動物に投与し、Pael受容体の細胞内、動物体内での
量やユビキチン化の程度を測定することにより、候補物
質の薬剤としての使用可能性を判断することが可能であ
り、治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【００３１】
【実施例】本発明を以下の実施例によって具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるも
のではない。本発明の実施例において、プラスミド、抗
体および培養細胞は以下のようにして調製した。
【００３２】Parkin、Parkinの変異体、UBCH6、UBCH7お
よびUbiquitinの発現プラスミドに関する記述はImai、
Y. et al.(2000) J Biol Chem 275, 35661-35664に記載
されている。ヒトおよびマウスPael受容体、ヒトETBR-L
P-2、ヒトUBC6、UBC7およびE2-25Kの全長相補鎖DNA（cD
NA）は逆転写(RT)-PCRにて得られた。ETA-RとETB-Rの全
長cDNAはRIKEN Gene Bankより得られた。組み換えGST-P
arkin、GST-ΔEx 4、6x HisタグUBC6とUBC7は大腸菌株B
L21(DE3)pLysS (Novagen社)にて作成した。UBC6およびU
BC7の活性中心システインへの部位指定変異導入は、PCR
法にておこなわれた。UBC6の推定上の膜挿入部位の欠損
型（UBC6ΔC; 1〜288アミノ残基）は大腸菌内での発現
が野生型UBC6に較べ良好であり、酵素活性も高いため、
in vitroユビキチネーションアッセイに供された。抗My
c (9E10)、抗HA (Y-11)、抗Ubiquitin (FL-76)、抗BiP
(N-20)および 抗actin (C-2) 抗体はSanta Cruz Biotec
h社より購入した。抗FLAG (M2)、抗HA (3F10)、抗Ubiqu
itin (1B3) 、抗GluR4 (AB1508) および抗NSE (BBS/NC/
VI-H14) は、それぞれSigma社、Roche Diagnostics、MB
L（名古屋、日本）、Chemicon およびDako社より購入し
た。抗UCH-L1抗体は、和田圭司博士(国立精神神経セン
ター)より分与してもらった。 ヒト胎児腎臓由来の293T
および神経芽腫由来 SH-SY5Y 細胞は、Imai et al., 20
00に記載の方法にて遺伝子導入、免疫沈降、ウエスタン
ブロット、免疫細胞化学および細胞死アッセイに供され
た。
【００３３】酵母two-hybridスクリーニング、免疫沈降
およびウエスタンブロット解析、免疫化学分析、パルス
−チェイス実験、In Vitroユビキチネーションアッセイ
ならびにRT-PCRは以下の方法で行った。
【００３４】〔酵母two-hybridスクリーニング〕ヒト全
長ParkinのcDNAを挿入したプラスミドpGBT9（Clontech
社）は、ライブラリースクリーニングのベイトとして作
成された。酵母two-hybridスクリーニングは、pACT2に
挿入されたヒト成人全脳のcDNAライブラリー（Clontech
社）とpGAD424に挿入されたヒト中脳黒質のcDNAライブ
ラリー（当研究室にて作成）を混合したものに対してお
こなわれた。ライブラリースクリーニングは、Clontech
社Matchmaker Two-Hybrid System Kitの使用説明書に従
った。
【００３５】〔免疫沈降およびウエスタンブロット解
析〕細胞は、細胞溶解緩衝液 (20 mM HEPES, pH 7.4, 1
20 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-1
00 およびComplete Protease Inhibitors [Roche Diagn
ostics社]から成る)に懸濁し、4℃で30分間溶解され
た。ヒト大脳前脳皮質は細胞溶解緩衝液に懸濁し、ダウ
ンス型ホモジナイザーにて破砕された。サンプルは界面
活性剤可溶性および不溶性画分に分画され、Ward et a
l. (1995) Cell83, 121-127の変法にて免疫沈降され
た。すなわち、懸濁液は15,000 x g 30分間の遠心分離
にて分画された。1% Triton X 100可溶性分画由来の上
清は直接免疫沈降に供された。不溶性のペレット画分
は、氷冷の細胞溶解緩衝液にて4回洗浄された。その
後、終濃度1% のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)の加えら
れた細胞溶解緩衝液にて60℃、1時間溶解された。10 mM
MgCl2と25 μg/ml DNase Iが含まれた10倍容の細胞溶
解緩衝液を加えられ、37℃、10分間反応させられた。1
5,000 x g 30分間の遠心分離後、1% Triton X 100 不
溶性分画由来の上清は、様々な抗体およびprotein G-co
upledあるいはprotein A/G (50/50%)-coupled Sepharos
e beads (Amersham-Pharmacia社)を用い免疫沈降に供さ
れ、免疫沈降物はComplete Protease Inhibitors不含の
細胞溶解緩衝液にて、4回洗浄された。総細胞抽出液の1
% Triton X 100可溶性および不溶性画分、あるいは1% T
riton X 100可溶性画分および不溶性画分由来の免疫沈
降物は、ECL detection 試薬 (Amersham-Pharmacia社)
を用いてウエスタンブロット解析された。タンパク質の
定量は、Coomassie protein assay 試薬(Pierce社)を用
いた。
【００３６】〔免疫化学〕免疫細胞化学のために、8ウ
ェルチャンバースライドに播種されたSH-SY5Y細胞は、
サンプルあたり1 μgのヒトPael受容体 発現ベクターあ
るいは、calreticulinの小胞体局在配列 またはヒトβ
1, 4-galactosyltransferaseのゴルジ体局在配列をもつ
赤色蛍光タンパク質発現ベクター(pDsRed1-N1, Clontec
h社) 0.3 μgと組み合わせて遺伝子導入された。20時間
の培養後、細胞は20 μMラクタシスチンに16時間さらさ
れた。細胞はリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄後、0.2％
グルタルアルデヒドと2％ホルムアルデヒドにて固定さ
れた。その後、抗ヒトPael受容体抗体あるいは抗BiP抗
体にて染色された。免疫組織化学のために、マウスPael
受容体のカルボキシル末端部位(541-600アミノ残基)をG
ST融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。抗Pael
受容体ポリクローナル抗体は、GST部分を除いたリコン
ビナントタンパク質に対して作成された。厚さ14 μmの
マウスC57BL/6脳組織の凍結切片は、抗Pael受容体抗体
(1:200 希釈)、抗TH抗体(Chemicon社、1:100)、抗NeuN
抗体 (Chemicon社、1:200) あるいは抗CNPase抗体 (Sig
ma社、 1:100)にて反応させられた。一次抗体は、Alexa
488 またはAlexa 546 (Molecular Probes社)標識二次
抗体により染色された。染色した細胞あるいは切片はSl
owFade(Molecular probes社)により封入され、共焦点レ
ーザー蛍光顕微鏡(Fluoview、Olympus社)にて観察され
た。
【００３７】〔パルスーチェイス実験〕SH-SY5Y細胞
は、カルボキシル末端にFLAGタグのついたPael受容体
(Pael受容体-FLAG)とParkinの発現プラスミドあるいは
コントロールプラスミドを遺伝子導入された。36時間
後、細胞は5％牛胎児血清(FCS)を含み、メチオニン/シ
ステインを抜いたダルベッコ変法イーグル培地(M/C-fre
e DMEM) 中にて10 μMラクタシスチン存在下あるいは非
存在下の条件で、1時間培養された。その後、細胞は10
μMラクタシスチン存在下あるいは非存在下で5% FCS含
有M/C-free DMEMに200 μCi/ml 35S-メチオニン/システ
インを加えられ37℃、30分間ラベルされた。細胞はその
後洗浄され、10 μMラクタシスチン存在下あるいは非存
在下の条件で、10%FCS 含有ダルベッコ変法イーグル培
地中にて3時間まで培養された。チェイスのそれぞれの
時間のあと、細胞は溶解され、抗FLAG M2 affinity gel
(Sigma社)にて免疫沈降に供され、SDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて分離後、イメージアナライザー(B
AS-5000; Fujifilm社)にて可視化された。メタボリック
ラベルされたPael受容体は、Image Gauge software (Fu
jifilm社)を用いて定量化された。
【００３８】〔In Vitro ユビキチネーションアッセ
イ〕35S-ラベルPael受容体-FLAG はcanine pancreatic
microsomal membranes (Promega社) の存在下、非存在
下の条件においてTNT quick coupled transcription/tr
anslation systems (Promega社)を用いて作成され、抗F
LAG M2 affinity gelにて免疫沈降された。microsomal
membranesの存在下、非存在下の条件において作成され
た双方のPael受容体は区別なくIn Vitro ユビキチネー
ションアッセイの基質として使用できたため、microsom
al membranesの非存在下の条件において作成されたPael
受容体が、大部分のアッセイに使用された。In Vitro
ユビキチネーションアッセイはSigma社のユビキチンを1
67 pmol使用したことのほかはImai、Y. et al.(2000) J
Biol Chem 275, 35661-35664に記載の方法に従った。
【００３９】〔RT-PCR〕総RNA は、ISOGEN 試薬 (ニッ
ポンジーン, 日本、富山) にて抽出された。一本鎖 cDN
A はSuperScript First Strand Synthesis kit （GIBCO
社、現Invitrogen社）を使用し、5 μgの総RNAから合成
された。oligo-dTでプライミングされたcDNAはPCR法に
て増幅された。 PCRに用いられたプライマーは以下の通
りである。 Pael受容体 forward primer、5’-CCTCCAGC
TCTTCCTTCAGA-3’；Pael受容体 reverse primer、 5’-
TTTCTGCCGGAGCTCGGCCA-3’；Parkin forward primer、
5’-GGAGGCGACGACCCCAGAAAC-3’；Parkin reverse prim
er、5’-GGGACAGCCAGCCACACAAGG-3’；β-actin forwar
d primer、5’-CAAGGCCAACCGCGAGAAGA-3’；β-actin r
everse primer、5’-GGAAGGCTGGAAGAGTGCCT-3’。RNAの
品質はβ-アクチンのメッセンジャーRNAにて確認した。
【００４０】〔実施例１〕 Pael受容体をコードする遺
伝子の単離 Parkinの基質を同定するため酵母two-hybrid法によりPa
rkinをベイトとしてヒト脳cDNAライブラリーをスクリー
ニングした。850万個の独立したクローンをスクリーニ
ングして得られた陽性クローンはBLASTデータベースサ
ーチにより、Gタンパク共役型であるエンドセリン受容
体タイプBのホモログの一部をコードしていることがわ
かった(Donohue, P. J. et al., (1998) Brain Res Mol
Brain Res54, 152-160; Marazziti, D. et al., (199
7) Genomics 45, 68-77; Zeng, Z.et al., (1997) Bioc
hem Biophys Res Commun 233, 559-567)。この受容体を
新たにPael(Parkin-associated endothelin receptor-l
ike) 受容体と名付けた。
【００４１】〔実施例２〕 抗Pael受容体抗体の作製 マウスPael受容体のカルボキシル末端部位(541-600アミ
ノ残基)をGST融合タンパク質として大腸菌内で発現させ
た。抗Pael受容体ポリクローナル抗体は、GST部分を除
いたリコンビナントタンパク質に対して作成された。抗
Parkinモノクローナル抗体は大腸菌に発現させた組み換
え6 x HisタグヒトParkinタンパク質に対して作成され
た。抗ヒトPael受容体モノクローナル抗体は、ヒトPael
受容体を過剰発現させた293T細胞を抗原として作られ
た。
【００４２】〔実施例３〕 Pael受容体発現細胞の作製
およびPael受容体とParkinの相互作用の検討 C末FLAGタグPael受容体あるいは同様のタグつきのPael
受容体関連受容体（エンドセリン受容体タイプAおよび
タイプB）をコードする発現プラスミドをヒトParkinの
発現プラスミドとともにHEK293T細胞に一過性にトラン
スフェクションし、発現させた。
【００４３】遺伝子挿入のないベクター（Control）、F
LAGタグのついたPael受容体(Pael受容体-FLAG)、FLAGタ
グのついたエンドセリン受容体タイプAあるいはB(ETA-R
-あるいは ETB-R-FLAG) およびParkinの遺伝子を挿入さ
れたプラスミドを遺伝子導入された293T細胞からの細胞
溶解液は、抗Parkinポリクローナル抗体にて免疫沈降さ
れた。免疫沈降物 (IP) および可溶性総細胞抽出液 (To
tal lysate) は、ウエスタンブロットにて解析された(W
B)。結果を図１に示す。Pael受容体が特異的に、エンド
セリン受容体タイプBはごく弱く、Parkinとともに免疫
沈降されることが確認された（図１上段）。
【００４４】また、Pael 受容体またはエンドセリン受
容体タイプBを293T細胞で過剰発現すると、これらのタ
ンパクはウエスタンブロットで高分子量のスメア状のバ
ンドとなって出現した。この結果は、これらのタンパク
質が糖化やユビキチン化などの修飾をうけることを示唆
している。尚、Pael 受容体またはエンドセリン受容体
タイプBを発現した細胞は死ぬ細胞の割り合いが高く
（それぞれ４０％、２０％）、Parkinの発現レベルが低
かった（図１下段）。
【００４５】〔実施例４〕 ParkinのPael受容体との結
合部位の検討 次に、ほ乳類細胞内でParkinのどの領域がPael受容体と
結合するか、検討した。Parkinの一連の変異体と野生型
をFLAGタグつきのタンパクとして、HAタグつきのPael受
容体とともに293T細胞で共発現させ、共沈させた。ヘム
アグルチニン(HA)タグのついたPael受容体と遺伝子挿入
のないベクター（Control）、FLAGタグのついたParkin
(Wild type)、Parkin-N、Parkin-C,、Q311X あるいはΔ
RINGの遺伝子を挿入されたプラスミドを遺伝子導入され
た293T細胞からの細胞溶解液は、抗FLAGモノクローナル
抗体にて免疫沈降され (FLAG-IP)、ウエスタンブロット
にて解析された(WB)。図２は、ParkinおよびParkin の
変異体とPael受容体の結合の検討の結果を示す。Parkin
のC末端部分（217-465アミノ酸部分）とParkin全長は
同じ程度効率良くPael受容体と共沈されたが、C末端部
分に変異のあるParkinでは共沈の効率は下がるか、また
は共沈しなかった（図２）。右下部の模式図は、Pael受
容体の結合領域を同定するのに用いられたParkin およ
びParkin の変異体を表す。括弧内の数字は、Parkinタ
ンパク質がコードするアミノ残基に相当する。アスタリ
スク（＊）は、点変異の部位を示す。 Ublは、ユビキチ
ン様領域。RINGはRING-finger motif。IBRはin between
RING fingerを意味する。この結果より、Pael受容体と
の結合にはParkinのC末端部分が不可欠であることがわ
かった。
【００４６】さらに、内因性のParkinとPael受容体の生
理的な結合をドパミン作動性の神経芽細胞腫SH-SY5Y細
胞とヒト脳組織（ともに内因性のPael受容体のmRNAを発
現している）でチェックした。ヒト脳あるいは神経芽腫
由来のSH-SY5Y細胞は、上述の方法で溶解され、上清分
画は免疫前血清(C)あるいは抗Parkin抗血清(P)にて免疫
沈降された（IP）。共沈降してきたPael受容体は、抗Pa
el受容体モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロ
ットにて検出された(WB)。図３に、内因性のParkinと内
因性のPael受容体の脳組織および培養細胞内での結合の
検討の結果示す。図３に示すようにPael受容体免疫陽性
バンドが内因性のParkinとともに共沈された。図中、ア
スタリスク（＊）は、約120 kDaの抗Pael受容体抗体反
応性のバンドを示す。このバンドは、in vivoにおいて
しばしば観察されるが、明らかにされていないPael受容
体の一つの状態を示すものと思われる。Pael受容体発現
細胞をもちいた実施例２〜４に記載の検討の結果より、
ParkinはPael受容体に結合するが、Parkinの変異体は結
合しないことが明らかになった。
【００４７】〔実施例５〕 Pael受容体発現細胞におけ
るParkinによるPael受容体のユビキチン化 次に、培養細胞で過剰発現したPael受容体が図１に示す
ようにウエスタンブロットで高分子量化されてみえるこ
とから、Pael受容体がユビキチン化されているかどうか
調べた。HAタグつきのユビキチン（HA-Ub）をFLAGタグ
つきのPael受容体とともに293T細胞で過剰発現させ、抗
FLAG抗体で免疫沈降した。遺伝子挿入のないベクター
（Control）あるいはPael受容体-FLAGは、HAタグのつい
た Ub (HA-Ub)またはベクターのみ(-)と組み合わせて、
SH-SY5Y細胞に遺伝子導入された。抗FLAGモノクローナ
ル抗体にて免疫沈降された免疫沈降物(FLAG-IP) および
可溶性総細胞抽出液 (Total lysate) は、抗FLAG、抗HA
あるいは抗Ub抗体を用いてウエスタンブロットにて解
析された(WB)。免疫沈降されたPael受容体はHA-Ubでユ
ビキチン化をうけ、さらにHA-Ubを発現させなくとも、P
ael受容体の高分子量化したバンドは抗ユビキチン抗体
で認識された（図４）。これらの事実はPael受容体タン
パクの正常な折り畳みがうまくいかず、異常な構造を持
つタンパクとしてユビキチン・プロテアソーム蛋白分解
系で分解されることを示唆している。
【００４８】本発明者らは、先にParkinが折り畳み不全
タンパク誘発性ストレスで発現増加し、折り畳み不全タ
ンパク誘発性ストレスによる細胞死を抑制する効果のあ
ることを報告した(Imai、Y. et al.(2000) J Biol Chem
275, 35661-35664)。小胞体ストレスに対しては、小胞
体関連蛋白分解系（ERAD）を含む一連の遺伝子発現を制
御する折り畳み不全蛋白反応（UPR）が誘発される(Trav
ers, K. J. et al., (2000) Cell 101, 249-258)。ERAD
は折り畳みに失敗した膜蛋白や分泌蛋白を細胞質内の分
解系で分解する(Plemper, R. K. et al., (1999) Trend
s Biochem Sci24, 266-270)。ERADの基質は小胞体膜を
逆行輸送されて細胞質に運ばれ、そこで、UBC6,UBC7、
プロテアソーム複合体などの働きで、ユビキチン化さ
れ、分解される（Biederer, T. et al., (1997) Scienc
e 278, 1806-1809; Bordallo, J. et al., (1998) Mol
Biol Cell 9, 209-222; Gilon, T. et al., (2000) Mol
Cell Biol 20, 7214-7219; Wilhovsky, S. et al., (2
000) Mol Biol Cell 11, 1697-1708）。これらのデータ
はParkinがUPR によって発現増加するRINGタイプのE3で
あり、ERADに関係している可能性を示しているので、Pa
rkinと小胞体関連のE2との結合をチェックした。ヒト29
3T細胞でMycタグつきのさまざまなE2のプラスミドをFLA
GタグのParkinと共発現して、共沈を試みた。遺伝子挿
入のないベクターあるいはFLAG-Parkin cDNAは、ベクタ
ーのみ(-)、MycタグのついたUBC6 (Myc-UBC6)、Myc-UBC
7、Myc-UBCH6あるいはMyc-E2-25Kと組み合わせて、293T
細胞に遺伝子導入された。抗FLAGモノクローナル抗体に
て免疫沈降された免疫沈降物(FLAG-IP) および可溶性総
細胞抽出液 (Total lysate) は、抗FLAGあるいは抗Myc
抗体を用いてウエスタンブロットにて解析された(WB)。
その結果、Parkinは小胞体関連のE2、UBC6、UBC7と結合
するが、コントロールとして用いたE2(UbcH6, E2-25K)
とは細胞内では結合しないことがわかった（図５）。
【００４９】さらに、Parkinが小胞体関連のE2と協力し
てPael受容体をインビトロでユビキチン化できるかどう
か評価した。Pael受容体のユビキチン化反応をインビト
ロで再現するため、SH-SY5Y細胞から免疫沈降したParki
nか、もしくは単なるSH-SY5Y細胞の抽出液を純品のUb、
E1とともに加えた。35S-ラベルされたPael受容体-FLAG
は、UbおよびE1の存在下、以下に示す因子を加え反応さ
せられた。SH-SY5Yの可溶性総細胞抽出液であるWCE、免
疫前血清を用いたSH-SY5Y細胞からの免疫沈降物であるM
ock-IP、抗Parkin抗血清を用いたSH-SY5Y細胞からの免
疫沈降物であるParkin-IP。その結果、Parkinの免疫沈
降物が単なる細胞抽出液よりはるかに顕著にPael受容体
のユビキチン化を促進することがわかった（図６）。図
６中、Inputと ‘-‘ は、反応前のPael受容体 と、Ub
およびE1のみでPael受容体 を 90 分間反応させたもの
をそれぞれ表す。注目すべきことにParkinの免疫沈降物
はE2を加えない場合でもPael受容体をユビキチン化した
（図６, レーン 6 と 7）。これらの結果は細胞から免
疫学的に単離されたParkinが、細胞内ですでにParkinと
複合体をつくっていた細胞のE2からPael受容体へのユビ
キチンの受け渡しを仲介していることを示唆する。
【００５０】この可能性を検証するため、大腸菌で融合
蛋白、GST-ParkinとAR-JP患者でみられるexon 4 欠損型
のParkinをGSTとの融合蛋白にしたGST-ΔE4をE3として
用いてインビトロのユビキチン化アッセイを行った。Pa
el 受容体は組み込まれるタイプの膜タンパクであり、
異常な構造をもつ新生Pael受容体はERADで分解されると
予想されるので、このアッセイではParkinのE2として働
くことが知られているUbcH7の他に小胞体関連のE2であ
るUBC6（または膜に入り込む疎水性のカルボキシ末端領
域を除いたUBC6ΔC；1-288アミノ酸）とUBC7を使用し
た。35S-ラベルされたPael受容体-FLAGは、上述の検討
と同様にUbおよびE1の存在下、リコンビナントE2 (H7、
UBCH7；6/7、UBC6ΔC とUBC 7)、GST融合Parkinあるい
はGST融合exon 4欠損変異型Parkinを組み合わせて反応
させられた。図７に示すように、GST-ParkinがE2を添加
しないにもかかわらず、Pael受容体のユビキチン化をか
なり促進しており、網状赤血球のライセートで転写／翻
訳されたPael受容体に内因性のE2が結合していたことが
窺われた（図７）。図中、アスタリスク（＊）は、E2の
活性中心のシステインをセリンに置換したことを示す。
対照的に欠損変異体Parkinの組み換えタンパクはE2を加
えてもPael受容体をユビキチン化する作用はなかった
（図７, レーン 1-3, 7と8）。UBC6ΔC、UBC7、Parkin
の組み合わせはユビキチン化を顕著に増強したが、UBC6
ΔC、UBC7の不活性型変異体をかわりに使うと、Pael受
容体のユビキチン化は基準値のレベルまで減弱した（図
７, レーン４と９と10 との比較）。
【００５１】さらに、35S-ラベルされたPael受容体、ET
B-RあるいはETBR-LP-2 (LP-2)は、UBC6ΔCとUBC 7の存
在下上述の検討と同様に反応させられた。組み換えUBC6
(またはUBC6ΔC)、UBC7とGST-Parkinの組み合わせで起
こるユビキチン化反応はPael受容体に極めて特異的で、
Pael受容体と非常に近縁の分子、ETB-RやETBR-LP-2はユ
ビキチン化されない（図８）。ParkinとUBC6/7が結合す
る事実（図５）とあわせ、このインビトロユビキチン化
アッセイはPael受容体の分解系にParkinとともにUBC6と
UBC7が関与することを示唆している。
【００５２】〔実施例６〕 ParkinによるPael受容体の
分解 次にParkinがPael 受容体をユビキチンプロテアソーム
系で分解するかどうか調べるため、Pael受容体のターン
オーバーの早さをパルス−チェイス実験により、Parkin
存在、非存在の条件下で測定した（図９）。Pael受容
体-FLAGの発現プラスミドは、遺伝子挿入のないベクタ
ー(Control)あるいはFLAG-Parkin 発現プラスミドと組
み合わせて、SH-SY5Y細胞に遺伝子導入され、その後細
胞は10μMラクタシスチン存在下あるいは非存在下の条
件で培養された。その後、35S-メチオニン/システイン
を加えられラベルされ、図９に示す時間まで10μMラク
タシスチン存在下(Lc +)あるいは非存在下(Lc -)チェイ
スされた。35SでラベルされたPael受容体は免疫沈降さ
れ、ラジオオートグラフィにて検出され（図９左）phos
phorimagingにより定量化された（図９右）。ラベルさ
れたPael受容体のレベルは、時間0分の際の量に比較し
てプロットされた。プロテアソーム阻害剤のラクタシス
チン非存在下、180分のチェイスで新生Pael受容体の18
％がコントロールの細胞で残っていた。ラクタシスチン
はコントロール細胞でもParkinを過剰発現した細胞でも
Pael受容体の分解速度を低下させ、それぞれ180分後で
５４％、５８％のPael受容体が残存していた。対照的に
Parkinを過剰発現する細胞でのPael受容体の分解は著明
に促進され、180分後にはわずかに0.8%しか残っていな
かった。これらの結果はParkinがユビキチンプロテアソ
ーム蛋白分解系を通じてPael受容体を分解することを示
している。
【００５３】〔実施例７〕 Pael受容体発現細胞におけ
るPael受容体の蓄積 Pael受容体はプロテアソーム阻害剤の非存在下において
も培養細胞で過剰発現されると、高度にユビキチン化さ
れる（図４）。この知見はやはり高度にユビキチン化さ
れるCFTRやδオピオイド受容体での知見を想起させる。
新生CFTRの75%、新生δオピオイド受容体の60%は小胞体
での折り畳みがうまくいかない(Jensen, T. J. et al.,
(1995) Cell 83, 129-135; Petaja-Repo, U. E. et a
l., (2001) J Biol Chem 276, 4416-4423; Ward, C. L.
et al., (1995) Cell 83, 121-127)。
【００５４】そのような蛋白質はSec61pなどより構成さ
れるトランスロコン（小胞体に特異的なチャネル）を通
って、小胞体から細胞質へ逆行輸送される(Plemper, R.
K.et al., (1999) Trends Biochem Sci 24, 266-27
0)。これらの蛋白質は引き続いて細胞質のユビキチンプ
ロテアソーム系に依存する小胞体関連蛋白分解系（ERA
D）によって処理される。
【００５５】細胞をプロテアソーム阻害剤に曝すと、非
イオン性変性剤（non-ionic detergent）に不溶性のき
わめて高度にユビキチン化されたCFTR分子の蓄積が増加
する事実があるため、変性剤に可溶性と不溶性のPael受
容体がどの程度あるか調べた。
【００５６】SH-SY5Y細胞は、遺伝子挿入のないベクタ
ー(-)あるいはPael受容体 発現プラスミド(+)を遺伝子
導入され、20時間培養された。その後、細胞はラクタシ
スチン(10μM)存在下非存在下、ツニカマイシン(1μg/m
l) あるいは 2-メルカプトエタノール(2-ME; 1 mM)存在
下、16時間培養された。細胞は、1% Triton X-100を含
む緩衝液で溶解され、Ward et al., 1995 Cell 83, 121
-127に記載の方法にて分画された。それぞれの分画は図
１０に示すタンパク質に対する抗体にてウエスタンブロ
ットされた。不溶性Pael受容体は上述の通り、同一のサ
ンプルの不溶性分画から免疫沈降され、抗Ubポリクロー
ナル抗体で解析された（図１０）。SH-SY5Y細胞にPael
受容体cDNAをトランスフェクトしない場合（−）とした
場合（＋）、様々な条件下で1%トリトン-X100不溶性と
可溶性の分画をとってウエスタンブロットに供した。何
も処理しない状態でもすでにPael受容体の不溶性分画中
の量は可溶性分画中の量に比肩しうる程度存在してい
た。
【００５７】さらにプロテアソーム阻害剤であるラクタ
シスチン、またはUPRを引き起こすツニカマイシン（糖
化の阻害剤）や2-ME（還元剤）で不溶性分画のPael受容
体は高分子量シフトを伴いつつ、増加した。次いで、同
じサンプルの不溶性分画から不溶性Pael受容体を抽出
し、ユビキチン化の有無を抗体で調べた。不溶性分画に
おけるPael受容体の蓄積に比例して、不溶性分画からの
Pael受容体の免疫沈降物の抗ユビキチン抗体によるウエ
スタンブロットでユビキチン化された高分子量バンドが
検出された。対照的にそのような高分子量バンドは薬剤
で処理しないサンプルでは認められなかった。また、Pa
el受容体を過剰発現した細胞にラクタシスチンやUPRを
誘発する薬剤（ツニカマイシン、2-ME）を加えると、可
溶性分画でのERシャペロンのBiP(GRP78)と内因性Parkin
の発現が上昇し、不溶性分画にもある程度増加すること
が判明した（図１０）。これらの結果はUPR誘発剤がPar
kinとBiP の発現を上昇させるという本発明者らの過去
の発見と一致する(Imai、Y. et al.(2000) J Biol Chem
275, 35661-35664)。
【００５８】このように、Pael受容体が高度にユビキチ
ン化されることから（図４）、また不溶性のPael受容体
が蓄積するときにBiPの発現上昇がみられることから
（図１０）、Pael受容体の蓄積で特異的に起こる細胞死
は、折り畳み不全タンパク誘発性胞死であると予測され
た。
【００５９】このことを確かめるため、Pael受容体の過
剰発現による細胞死に対するプロテアソーム阻害剤とUP
R誘発剤の効果を検討した（図１１）。SH-SY5Y細胞は、
強化型緑色蛍光タンパク質 (EGFP)の発現プラスミドと
ともに遺伝子挿入のないベクター(-)あるいはPael受容
体 発現プラスミド(+)を遺伝子導入され、ラクタシスチ
ン存在下(Lc、20μM)非存在下(non)、ツニカマイシン(T
m, 5μg/ml) あるいは2-ME(2 mM)存在下、16時間培養さ
れた。細胞死の計数は、Imai、Y. et al.(2000) J Biol
Chem 275, 35661-35664に記載の方法にておこなわれ
た。図１１中、誤差線は、3回の実験から計算した標準
偏差(S.D.)を示す。
【００６０】約20%の細胞がPael受容体の過剰発現で死
ぬ。ラクタシスチン 20μMで16時間、SH-SY5Y細胞を処
理しても未処理の細胞と比べて特に細胞死は増加してい
なかった。それに対し、UPR誘発剤であるツニカマイシ
ン（5μg/ml）と2-ME（2 mM）ではコントロール細胞で
も40%の細胞が死んだ。同じ条件のもとで、ラクタシス
チン存在下では約50%のPael受容体過剰発現細胞が細胞
死に陥った（図１１、１２）。図１２は、Pael受容体を
発現した死細胞の形態を示す。SH-SY5Y細胞は、Pael受
容体 発現プラスミドを遺伝子導入され、ラクタシスチ
ン存在下非存在下培養された。Pael受容体を発現した細
胞は、抗Pael受容体モノクローナル抗体にて可視化され
（緑、左図上下の白く見える細胞）、4', 6-diamidino-
2-phenylindole(青、灰色に見える細胞)にて細胞核を対
比染色された。Pael受容体を発現し核濃縮を起こしてい
る死細胞は、矢頭にてしめす。同様に、約60%がツニカ
マイシンか2-MEで細胞死を起こした（図１１）。
【００６１】さらにPael受容体過剰発現による細胞死へ
の折り畳み不全タンパク誘発性細胞死の関与を確かめる
ため、ラクタシスチン存在下、非存在下でのPael受容体
の細胞内分布を検討した。結果を図１３に示す。図１３
は、SH-SY5Y細胞にて過剰発現されたPael受容体の免疫
局在を示す。SH-SY5Y細胞は、Pael受容体 発現プラスミ
ドを遺伝子導入され、ラクタシスチン存在下(中段、下
段)非存在下（上段）6時間培養された。Pael受容体を発
現した細胞は、抗Pael受容体モノクローナル抗体にて可
視化され（緑、左行の上中下列の白く見える部分）、抗
BiP抗体およびDsRed-Golgiにてそれぞれ小胞体とゴルジ
体を対比染色された（赤、中行の上中下列の黒く見える
部分）。Pael受容体の局在がゴルジ体ではなく小胞体に
完全一致していることを黄色で表す（右行の上中下列の
白く見える部分、小胞体と対比染色させた中列ではすべ
て白く見えるが、上下列では白以外に染まった部分が存
在する）。矢印は核周囲に蓄積するPael受容体を示す。
【００６２】Pael受容体プラスミドをトランスフェクト
したSH-SY5Y細胞をラクタシスチン（＋）または（−）
の条件で培養し、Pael受容体またはBiPに対する抗体で
免疫細胞化学を行った。Pael受容体は過去の報告に一致
して、一部は核周囲や細胞質にみられるものの、主とし
て未処理のSH-SY5Y細胞の表面に発現しており、細胞膜
タンパクであると考えられた。対照的にラクタシスチン
で６時間処理すると、Pael受容体は小胞体に集積し、細
胞膜への発現は妨げられる。Pael受容体の小胞体への集
積は抗BiP抗体との共染、および小胞体ターゲティング
シグナルを有する赤色蛍光タンパクをコードするプラス
ミド、pDsRed-ERによって確認された（データ未提
示）。Pael 受容体のゴルジ体ではなく、小胞体への特
異的な分布はゴルジ体ターゲティングシグナルを有する
赤色蛍光タンパク（DsRed-Golgi）やローダミンでラベ
ルしたWGAとの共染でさらに確認された。
【００６３】以上の結果はツニカマイシンや2-MEで処理
した場合と同じであった（データ未提示）。事実、この
ような薬剤で8〜16時間培養を続けると、核に隣接して
アグレソームに似た封入体が出現する。図１４は、Pael
受容体の細胞内封入体を示す。この時点では、細胞体は
小さく丸まって、いまにも細胞死に陥りそうな様子とな
る。Pael受容体 発現プラスミドを遺伝子導入されたSH-
SY5Y細胞は、20μMラクタシスチン存在下、表示の時間
培養された。Pael受容体の細胞での局在は、抗Pael受容
体モノクローナル抗体にて可視化された（緑、図中白く
染まって見える部分）。核周囲のPael受容体封入体は矢
頭で示す。
【００６４】先のウエスタンブロッティングの結果とあ
わせ、これらの免疫細胞化学的実験は過剰発現したPael
受容体の小胞体への集積の結果、BiPの発現上昇を伴う
ことからもわかるように、折り畳み不全タンパク誘発性
小胞体ストレスが生じ、結局は細胞死を引き起こすもの
と考えられる(Kozutsumi, Y. et al., (1988) Nature33
2, 462-46429)。
【００６５】〔実施例８〕 Pael受容体発現細胞におけ
るParkinによるPael受容体の蓄積と細胞死の抑制 Parkinは折り畳み不全タンパク誘発性細胞死を抑制する
ことから、Parkinの過剰発現はPael受容体過剰発現によ
る細胞死から細胞を救出するのではないかと予測し、SH
-SY5Y細胞にベクタープラスミドまたはPael受容体とと
もにFLAG-Parkin、およびFLAG-Parkinの一連の変異体を
トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の抽
出液は1%トリトン可溶性と不溶性の分画にわけられ、抗
FLAG抗体で免疫沈降し、それをウエスタンブロットで解
析した。遺伝子挿入のないベクター(-)あるいはPael受
容体-HA 発現プラスミド(+)を、コントロールベクター
(Control)あるいはFLAG-Parkin (Wild type)、FLAG-ΔE
4,、FLAG-T240RまたはFLAG-Parkin-C発現プラスミドと
組み合わせて遺伝子導入されたSH-SY5Y細胞は、可溶化
され1% Triton X 100可溶性 (S) あるいは 1% Triton X
100不溶性(I)分画に分けられ、抗FLAG モノクローナル
抗体 (IP).にて免疫沈降された。共沈降してきたPael受
容体は、抗HAモノクローナル抗体を用いたウエスタンブ
ロットにて検出された。ポリユビキチン化を受けたPael
受容体は、同一メンブレンを抗Ub抗体でウエスタンブロ
ットすることによって確認され(データは未発表)、Ubn-
Pael受容体と表した。また、発現プラスミドの組み合わ
せを、レポーターとしてのEGFP発現プラスミドとともに
SH-SY5Y細胞に遺伝子導入され、48時間培養された。細
胞死の計数は、図１１に結果を示す検討と同様な方法に
て行われた。結果を図１５および１６に示す。
【００６６】図１〜３に示す解析結果に一致して、可溶
性のPael受容体は可溶性分画のParkin, Parkin-Cそして
部分的にT240Rの点変異体の免疫沈降によって特異的に
共沈された。不溶性分画での結果も同様にPael受容体と
Parkin, Parkin-Cそして部分的にT240Rの点変異体との
共沈が確認された。FLAG-Parkinまたはその変異体で共
沈されたPael受容体は高分子量シフトしたスメア状のバ
ンドとなり、ユビキチン化されたものと考えられた。不
溶性分画のPael受容体の量は野生型のParkin存在下で著
明に減少していた。対照的に、Parkinによる不溶性のPa
el受容体の減少の効果は変異型ParkinつまりT240R, Par
kin-CまたはΔE4で部分的、あるいは完全に無くなって
いた。不溶性Pael 受容体のデータと一致して、Pael受
容体過剰発現による細胞死は野生型Parkinで顕著に、T2
40RまたはParkin-C変異体で部分的に抑制されたが、ΔE
4では全く抑制されなかった（図１６）。これらの結果
から、野生型のParkinは、Pael受容体が不溶性分画に蓄
積する前にプロテアソームを介して分解してしまうが、
変異型Parkinにはその作用がないことが明らかになっ
た。
【００６７】〔実施例９〕抗Pael受容体抗体を用いたPa
el受容体蓄積の測定 上の結果から、AR-JPにおける特異的なドパミン細胞死
はParkinの基質であるPael受容体の蓄積によって引き起
こされる可能性が高いと考えられ、その直接的な証拠を
得るため、人脳における内因性のPael受容体の量を測定
した。AR-JPの患者４名、コントロール２名の剖検脳を
ホモゲナイズし、1%トリトンX100可溶性と不溶性の分画
にわけた。これらの分画はさらにPael 受容体のモノク
ローナル抗体またはコントロールの抗体で免疫沈降され
た。さらに免疫沈降されたPael受容体の量はグルタミン
酸受容体であるGluR4の免疫沈降物の量で標準化され
た。
【００６８】AR-JPおよび対照のヒト大脳前葉皮質、SH-
SY5Y細胞および293T細胞は、1% Triton X 100可溶性あ
るいは不溶性分画に分けられ、抗Pael受容体モノクロー
ナル抗体（クローン1、P）またはアイソタイプの同じコ
ントロールIgG(mouse IgG2b、C)にて免疫沈降された(I
P)。続いて、それぞれの分画は抗GluR4モノクローナル
抗体にて免疫沈降された。免疫沈降物は、別の抗Pael受
容体モノクローナル抗体（クローン7）あるいは抗GluR4
モノクローナル抗体にてウエスタンブロット解析され
た。抗Pael受容体モノクローナル抗体による免疫沈降物
はQuantity One software (BioRAD社)にて定量化され、
対応するレーンの抗GluR4モノクローナル抗体による免
疫沈降物に対して標準化された（図１７）。
【００６９】コントロールとAR-JPのサンプルの可溶性
分画から免疫沈降されたPael受容体はコントロールのサ
ンプル(Normal 1)に比べて0.4-1.0倍であり、差はなか
った。ところが、不溶性分画ではPael受容体はAR-JP脳
でコントロール脳（Normal 1）にくらべて12-35倍の増
加を示した。SH-SY5Y細胞と293T細胞(293T細胞はParkin
mRNAはあるが、Pael受容体のmRNAはない)から可溶性、
不溶性の分画をともに調製して、同様に解析した。同じ
バンドがSH-SY5Y 細胞の可溶性分画のPael受容体の免疫
沈降物中には認められるが、293T細胞の可溶性分画のPa
el受容体の免疫沈降物中には認められなかった。これは
Pael受容体の抗体の特異性を保証する結果である。
【００７０】正常脳ホモゲネート同様、SH-SY5Y細胞の
不溶性分画からもPael受容体はきわめて少量しか抽出で
きなかった。これはPael受容体の発現が正常レベルの場
合、不溶性のPael受容体の蓄積は起こらないことを示唆
している。さらに、正常脳でもAR-JP脳でもPael受容体
の免疫沈降物を抗ユビキチン抗体で調べてもユビキチン
化したPael受容体は見つからなかった。
【００７１】Parkinの欠損でPael受容体の蓄積が起こる
と仮定して、Pael受容体の蓄積とその結果として起こる
UPRの関係を調べてみた。コントロールとAR-JP脳サンプ
ルの可溶性、不溶性の分画を抗BiP抗体のウエスタンブ
ロットで調べた。BiPはコントロールに比べてほとんど
のAR-JP脳の可溶性分画で増加していた。さらにBiPはほ
とんどのAR-JP脳の不溶性分画にも認められた。これはU
PRがAR-JP脳で誘導され、不溶性分画にはBiP が結合す
るような折り畳み不全タンパクが存在していることを示
している。 抗NSE、抗UCH-L1、抗アクチン抗体を用いた
ウエスタンブロットではサンプル中のニューロンやグリ
ア細胞由来のこれらの蛋白質の量に大きな違いがないこ
とがわかった。
【００７２】さらに、パーキンソン病で特異的に変性死
滅する黒質緻密帯のドパミンニューロンにPael 受容体
が発現しているかどうかチェックした。まず、Pael受容
体に対する抗血清を作製した。この抗血清はマウスとヒ
トのPael受容体を認識するが、Pael受容体のホモログで
あるLP-2、ETA-R,ETB-Rは認識しないきわめて特異性の
高い抗体である。図２０は抗Pael受容体抗体の特異性を
示す。マウス(mouse)、ヒト(human)Pael受容体-FLAGあ
るいはETB-LP-2-FLAG (LP-2)を過剰発現した293T細胞の
抽出液は、抗FLAG抗体（左）あるいは抗Pael受容体抗体
（右）にてウエスタンブロット解析された。
【００７３】図２１は、免疫組織化学の解析結果を示
す。図２１のA〜Dは、マウス脳の頭頂に沿って薄切され
た切片においてのPael受容体(A、緑、図21A中白く染ま
って見える部分)およびチロシン水酸化酵素(B、赤、図2
1B中白く染まって見える部分)の免疫局在を示す。黄
は、黒質緻密質においてのチロシン水酸化酵素陽性神経
細胞がPael受容体を発現していることを示す（CとD、図
21C中特に白く染まって見える部分で、図21Bの白く染ま
っている部分と重なっている。図21D中白く染まって見
える部分）。原倍率 x 40 (A-C) あるいは x 400 (D)。
図２１のE〜Gは、Pael受容体はおもに脳においてオリゴ
デンドロサイトに発現していることを示す。(EとG) (A-
D)の連続切片において、CNPase陽性細胞（赤）がPael受
容体を発現（緑）していることを黄で示す。(FとG) 大
脳皮質においてのPael受容体（緑）とNeuN(F、赤) ある
いは CNPase (G、赤)の局在。原倍率 x 40 (E) あるい
は x 100(F とG)。
【００７４】免疫組織化学的にはPael受容体は中脳黒質
を含めて脳に広く発現している（図２１A）。ほとんど
のPael受容体はCNPase陽性のオリゴデンドロサイトであ
った（図２１EおよびG）。他方、ほとんどのNeuroN陽性
細胞、つまり神経細胞はPael受容体をもっていないか、
きわめて弱い発現しかしていない（図２１F）。しかし
ながらチロシンハイドロキシレース陽性細胞は大部分が
Pael受容体陽性であり、黒質緻密帯のドパミンニューロ
ンはPael受容体を発現する例外的なニューロンであるこ
とが明らかになった（図２１A-D）。
【００７５】以上のように、本発明者らは、Pael受容体
と命名したParkinと結合する予想上の膜７回貫通型蛋白
を同定し、その特徴を明らかにした。次の事実に基づ
き、本発明者らはこの蛋白がParkinの生体内における本
来の基質蛋白質であるとの結論を得た。
【００７６】まず第一に、ParkinはUPRによってBiPとと
もに発現が上昇すること、および小胞体関連E2であるUB
C6、UBC7と結合することから、ERADに関係していると考
えられる。第２にPael受容体はUBC6、UBC7の存在下でin
vitroでParkin依存的なユビキチン化経路で特異的にユ
ビキチン化される。第３にPael受容体の分解は細胞内で
Parkinを過剰発現させることによって促進される。最後
にPael受容体蛋白質はAR-JP脳の洗浄剤不溶性分画に蓄
積する。
【００７７】最近の知見により、ユビキチンプロテアソ
ーム系と連関するER膜透過のモデルが提唱されている(P
lemper, R. K. et al., (1999) Trends Biochem Sci 2
4, 266-270)。Pael受容体はプロテアソーム阻害の早期
の段階でERに蓄積しているが、これはプロテアソームが
逆行輸送される蛋白質をERADの際、ERから引きずり出す
よう働くとの最近のいくつかの報告に一致している（図
１３）(Mayer, T. U. eta l., (1998) Embo J 17, 3251
-3257; Yu, H. et al., (1999) J Biol Chem 274, 3685
2-36858)。
【００７８】逆にプロテアソーム阻害を長く続けると、
ほとんどの細胞形態はアポトーシス様となり、丸くな
り、縮んで、細胞内凝集を形成するようになる（図１
４）。ERADにおけるユビキチン化とプロテアソームによ
る分解は折り畳み不全蛋白の小胞体からの逆行輸送を前
提条件とした、細胞質内のできごとなので、Pael受容体
の細胞質内の凝集はウエスタンブロットで検出されるユ
ビキチン化された不溶性のPael受容体に対応すると考え
られる（図１０）。
【００７９】培養細胞での実験結果に基づき、Parkinは
小胞体から細胞質に移動させられたPael受容体の凝集
を、分解系を動かすことで防ぎ、細胞死を抑制している
ように見える。さらにParkinは小胞体からのPael受容体
の逆行輸送をトランスロコン複合体やプロテアソーム複
合体と協力して促進することで小胞体ストレスを抑制し
ているかもしれない。
【００８０】AR-JPの病理学的特徴はレビー小体の欠如
であるが、これはPael受容体の蓄積がAR-JPの発症要因
であるとする仮説でうまく説明がつく。予想上の膜蛋白
質であるPael受容体はプロテアソーム阻害剤であるラク
タシスチンやUPR誘発剤処理で明らかに小胞体に滞留す
るが、これはPael受容体の折り畳みが非効率的であるこ
とを示している。小胞体における折り畳み不全蛋白質の
量が多くなりすぎて制御不能になると、（少なくとも酵
母では）細胞はUPRによって分子シャペロンやERAD関連
蛋白質など多くの遺伝子の発現を活性化して対応する(T
ravers, K. J. et al., (2000) Cell 101, 249-258; Fr
iedlander, R. et al., (2000) Nat CellBiol 2, 379-3
84)。しかしながら小胞体が折り畳み不全蛋白質に対応
する能力には限りがあり、小胞体はルーメン内のカルシ
ウムホメオスターシスの乱れや折り畳み不全蛋白質の蓄
積などの小胞体ストレスに対して特別のアポトーシスの
経路を持っているようである(Nakagawa, T. et al., (2
000) Nature 403, 98-103;Urano, F. et al., (2000) S
cience 287, 664-666)。従って小胞体ストレスによる神
経細胞死は凝集を形成することなく起こりうる。同様
に、AR-JP患者においても、Pael受容体の蓄積によって
細胞内凝集を形成することなく小胞体特異的なアポトー
シスの経路が発動され、疾患発症にいたるのかもしれな
い。
【００８１】Pael受容体の組織分布もAR-JPでみられる
ドパミンニューロン選択的な神経変性に一致する。Pael
受容体mRNAはとくに中枢神経系に高度に発現する。脳内
ではPael受容体はとくに脳梁と黒質に発現が高い(Donoh
ue, P. J. et al, (1998) Brain Res Mol Brain Res 5
4, 152-160; Zeng, Z. et al., (1997) Biochem Biophy
s Res Commun 233, 559-567)。本研究では我々はPael受
容体を特異的に認識する抗血清を用いてマウス脳におけ
るPael受容体の免疫組織化学的分布を検討した（図２
０）。ほとんどのPael受容体陽性細胞はCNPase陽性の、
線維束のオリゴデンドロサイトであった。他方、Pael受
容体はまた黒質、海馬CA3領域、プルキンエ細胞など、
一部のニューロンにも発現がみられた（図２１およびデ
ータ未提示）。
【００８２】神経細胞はオリゴデンドロサイトに比べて
小胞体ストレスに対してより脆弱であると考えると、AR
-JPにおける選択的なドパミンニューロン死の原因はPae
l受容体のユニークな発現パターンによって部分的に説
明できる。Pael受容体を発現するニューロンのうち、ど
うしてドパミンニューロンだけが選択的に障害されるの
かはよくわからないが、黒質ニューロンにおけるPael受
容体の発現レベルは過去の報告でのノーザンブロットか
ら判断すると相当高いので、そのせいかもしれない(Don
ohue, P. J. et al, (1998) Brain Res Mol Brain Res
54, 152-160; Zeng, Z. et al., (1997) Biochem Bioph
ys Res Commun 233, 559-567)。
【００８３】ごく最近、ZuscikたちはPael受容体と同じ
くG蛋白共役型受容体に属するアルファ1Bアドレナリン
受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスの脳
で、他の部位と同様、黒質が変性し、パーキンソン病様
の症状を示すことを報告した(Zuscik, M. J. et al.,
(2000) Nat Med 6, 1388-1394)。アルファ1アドレナリ
ン受容体のシグナル伝達をブロックすると、症状は部分
的に改善する。しかし、改善の効果は不十分であること
から、このトランスジェニックマウスにおいても折り畳
み不全蛋白による小胞体ストレスが黒質変性の原因にな
っている可能性が考えられる。黒質はERADや小胞体での
蛋白質の品質管理システムが障害されたとき発生する折
り畳み不全蛋白質誘発性ストレスにとりわけ脆弱なよう
である。
【００８４】総括すると、本発明者らは折り畳み不全の
Pael受容体蛋白質の蓄積がAR-JPの原因となるという強
力な証拠を提出した。近年、変性蛋白質の蓄積が筋萎縮
性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポ
リグルタミン病など多くの神経変性疾患で病因に関与す
るのではないかと考えられている(Julien, J. (2001)Ce
ll 104, 581-591; Sherman, M. Y. et al., (2001) Neu
ron 29, 15-32)。以上の疾患の研究から続々と得られつ
つある病理学的・生化学的証拠はユビキチン・プロテア
ソーム経路と分子シャペロンの障害が関与する、神経変
性疾患に共通の病因メカニズムを提示している。今やAR
-JPもまた、折り畳み不全蛋白質の蓄積が関与する神経
変性疾患のリストに加えられてよいだろう。
【００８５】
【発明の効果】本発明のPael受容体は、実施例の結果か
ら明らかなように、Parkinの基質であり、Pael受容体の
蓄積がAR-JPの発症要因となっている。従って、本発明
のPael受容体を発現する細胞、トランスジェニック動物
を用いて、パーキンソン病の病因の解明が可能であり、
パーキンソン病の治療薬を開発するためのPael受容体の
量を指標としたスクリーニングシステムを得ることがで
きる。また、Pael受容体遺伝子はパーキンソン病発症の
危険因子として遺伝子診断の対象となり得、本発明のPa
el受容体遺伝子の全部または一部を用いて遺伝子診断を
行うことが可能である。さらに、本発明のPael受容体に
特異的な抗体も診断、パーキンソン病の原因解明等に用
いることができる。
【００８６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Pael receptor, a cell and animal which express the Pael receptor, and a method for screening a medication for Parkinson disease <130> RJH13-038N <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1842 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1839) <400> 1 atg cga gcc ccg ggc gcg ctt ctc gcc cgc atg tcg cgg cta ctg ctt 48 Met Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Ala Arg Met Ser Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 ctg cta ctg ctc aag gtg tct gcc tct tct gcc ctc ggg gtc gcc cct 96 Leu Leu Leu Leu Lys Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Gly Val Ala Pro 20 25 30 gcg tcc aga aac gaa act tgt ctg ggg gag agc tgt gca cct aca gtg 144 Ala Ser Arg Asn Glu Thr Cys Leu Gly Glu Ser Cys Ala Pro Thr Val 35 40 45 atc cag cgc cgc ggc agg gac gcc tgg gga ccg gga aat tct gca aga 192 Ile Gln Arg Arg Gly Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Asn Ser Ala Arg 50 55 60 gac gtt ctg cga gcc cga gca ccc agg gag gag cag ggg gca gcg ttt 240 Asp Val Leu Arg Ala Arg Ala Pro Arg Glu Glu Gln Gly Ala Ala Phe 65 70 75 80 ctt gcg gga ccc tcc tgg gac ctg ccg gcg gcc ccg gac cgt gac ccg 288 Leu Ala Gly Pro Ser Trp Asp Leu Pro Ala Ala Pro Asp Arg Asp Pro 85 90 95 gct gca ggc aga ggg gcg gag gcg tcg aca gcc gga ccc ccg gga cct 336 Ala Ala Gly Arg Gly Ala Glu Ala Ser Thr Ala Gly Pro Pro Gly Pro 100 105 110 cca acc agg cca cct gtc ccc tgg agg tgg aaa ggt gct cgg ggt cag 384 Pro Thr Arg Pro Pro Val Pro Trp Arg Trp Lys Gly Ala Arg Gly Gln 115 120 125 gag cct tct gaa act ttg ggg aga ggg aac ccc acg gcc ctc cag ctc 432 Glu Pro Ser Glu Thr Leu Gly Arg Gly Asn Pro Thr Ala Leu Gln Leu 130 135 140 ttc ctt cag atc tca gag gag gaa gag aag ggt ccc aga ggc gct gtc 480 Phe Leu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys Gly Pro Arg Gly Ala Val 145 150 155 160 att tcc ggg cgt agc cag gag cag agt gtg aag aca gtc ccc gga gcc 528 Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Gln Ser Val Lys Thr Val Pro Gly Ala 165 170 175 agc gat ctt ttt tac tgt cca agg aga gcc ggg aaa ctc cag ggt tcc 576 Ser Asp Leu Phe Tyr Cys Pro Arg Arg Ala Gly Lys Leu Gln Gly Ser 180 185 190 cac cac aag ccc ctg tcc aag acg gcc aat gga ctg gcg ggg cac gaa 624 His His Lys Pro Leu Ser Lys Thr Ala Asn Gly Leu Ala Gly His Glu 195 200 205 ggg tgg aca att gca ctc ccg ggc cgg gcg ctg gcc cag aat gga tcc 672 Gly Trp Thr Ile Ala Leu Pro Gly Arg Ala Leu Ala Gln Asn Gly Ser 210 215 220 ttg ggt gaa gga atc cat gat cct ggg ggt ccc cgc cgg gga aac agc 720 Leu Gly Glu Gly Ile His Asp Pro Gly Gly Pro Arg Arg Gly Asn Ser 225 230 235 240 acg aac cgg cgt gtg aga ctg aag aac ccc ttc tac ccg ctg acc cag 768 Thr Asn Arg Arg Val Arg Leu Lys Asn Pro Phe Tyr Pro Leu Thr Gln 245 250 255 gag tcc tat gga gcc tac gcg gtc atg tgt ctg tcc gtg gtg atc ttc 816 Glu Ser Tyr Gly Ala Tyr Ala Val Met Cys Leu Ser Val Val Ile Phe 260 265 270 ggg acc ggc atc att ggc aac ctg gcg gtg atg tgc atc gtg tgc cac 864 Gly Thr Gly Ile Ile Gly Asn Leu Ala Val Met Cys Ile Val Cys His 275 280 285 aac tac tac atg cgg agc atc tcc aac tcc ctc ttg gcc aac ctg gtc 912 Asn Tyr Tyr Met Arg Ser Ile Ser Asn Ser Leu Leu Ala Asn Leu Val 290 295 300 ttc tgg gac ttt ctc atc atc ttc ttc tgc ctt ccg ctg gtc atc ttc 960 Phe Trp Asp Phe Leu Ile Ile Phe Phe Cys Leu Pro Leu Val Ile Phe 305 310 315 320 cac gag ctg acc aag aag tgg ctg gtg gag gac ttc tcc tgc aag atc 1008 His Glu Leu Thr Lys Lys Trp Leu Val Glu Asp Phe Ser Cys Lys Ile 325 330 335 gtg ccc tat ata gag gtc gct tct ctg gga gtc acc act ttc acc tta 1056 Val Pro Tyr Ile Glu Val Ala Ser Leu Gly Val Thr Thr Phe Thr Leu 340 345 350 tgt gct ctg tgc ata gac cgc ttc cgt gct gcc acc aac gta cag atg 1104 Cys Ala Leu Cys Ile Asp Arg Phe Arg Ala Ala Thr Asn Val Gln Met 355 360 365 tac tac gaa atg atc gaa aac tgt tcc tca aca act gcc aaa ctt gct 1152 Tyr Tyr Glu Met Ile Glu Asn Cys Ser Ser Thr Thr Ala Lys Leu Ala 370 375 380 gtt ata tgg gtg gga gct cta ttg tta gca ctt cca gaa gtt gtt ctc 1200 Val Ile Trp Val Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Pro Glu Val Val Leu 385 390 395 400 cgc cag ctg agc aag gag gat ttg ggg ttt agt ggc cga gct ccg gca 1248 Arg Gln Leu Ser Lys Glu Asp Leu Gly Phe Ser Gly Arg Ala Pro Ala 405 410 415 gaa agg tgc att att aag atc tct cct gat tta cca gac acc atc tat 1296 Glu Arg Cys Ile Ile Lys Ile Ser Pro Asp Leu Pro Asp Thr Ile Tyr 420 425 430 gtt cta gcc ctc acc tac gac agt gcg aga ctg tgg tgg tat ttt ggc 1344 Val Leu Ala Leu Thr Tyr Asp Ser Ala Arg Leu Trp Trp Tyr Phe Gly 435 440 445 tgt tac ttt tgt ttg ccc acg ctt ttc acc atc acc tgc tct cta gtg 1392 Cys Tyr Phe Cys Leu Pro Thr Leu Phe Thr Ile Thr Cys Ser Leu Val 450 455 460 act gcg agg aaa atc cgc aaa gca gag aaa gcc tgt acc cga ggg aat 1440 Thr Ala Arg Lys Ile Arg Lys Ala Glu Lys Ala Cys Thr Arg Gly Asn 465 470 475 480 aaa cgg cag att caa cta gag agt cag atg aac tgt aca gta gtg gca 1488 Lys Arg Gln Ile Gln Leu Glu Ser Gln Met Asn Cys Thr Val Val Ala 485 490 495 ctg acc att tta tat gga ttg ggc att att cct gaa aat atc tgc aac 1536 Leu Thr Ile Leu Tyr Gly Leu Gly Ile Ile Pro Glu Asn Ile Cys Asn 500 505 510 att gtt act gcc tac atg gct aca ggg gtt tca cag cag aca atg gac 1584 Ile Val Thr Ala Tyr Met Ala Thr Gly Val Ser Gln Gln Thr Met Asp 515 520 525 ctc ctt aat atc atc agc cag ttc ctt ttg ttc ttt aag tcc tgt gtc 1632 Leu Leu Asn Ile Ile Ser Gln Phe Leu Leu Phe Phe Lys Ser Cys Val 530 535 540 acc cca gtc ctc ctt ttc tgt ctc tgc aaa ccc ttc agt cgg gcc ttc 1680 Thr Pro Val Leu Leu Phe Cys Leu Cys Lys Pro Phe Ser Arg Ala Phe 545 550 555 560 atg gag tgc tgc tgc tgt tgc tgt gag gaa tgc att cag aag tct tca 1728 Met Glu Cys Cys Cys Cys Cys Cys Glu Glu Cys Ile Gln Lys Ser Ser 565 570 575 acg gtg acc agt gat gac aat gac aac gag tac acc acg gaa ctc gaa 1776 Thr Val Thr Ser Asp Asp Asn Asp Asn Glu Tyr Thr Thr Glu Leu Glu 580 585 590 ctc tcg cct ttc agt gcc ata cgc cgt gaa atg tcc act ttt gct tct 1824 Leu Ser Pro Phe Ser Ala Ile Arg Arg Glu Met Ser Thr Phe Ala Ser 595 600 605 gtc gga act cat tgc tga 1842 Val Gly Thr His Cys 610 <210> 2 <211> 613 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Ala Arg Met Ser Arg Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Lys Val Ser Ala Ser Ser Ala Leu Gly Val Ala Pro 20 25 30 Ala Ser Arg Asn Glu Thr Cys Leu Gly Glu Ser Cys Ala Pro Thr Val 35 40 45 Ile Gln Arg Arg Gly Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Asn Ser Ala Arg 50 55 60 Asp Val Leu Arg Ala Arg Ala Pro Arg Glu Glu Gln Gly Ala Ala Phe 65 70 75 80 Leu Ala Gly Pro Ser Trp Asp Leu Pro Ala Ala Pro Asp Arg Asp Pro 85 90 95 Ala Ala Gly Arg Gly Ala Glu Ala Ser Thr Ala Gly Pro Pro Gly Pro 100 105 110 Pro Thr Arg Pro Pro Val Pro Trp Arg Trp Lys Gly Ala Arg Gly Gln 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Thr Leu Gly Arg Gly Asn Pro Thr Ala Leu Gln Leu 130 135 140 Phe Leu Gln Ile Ser Glu Glu Glu Glu Lys Gly Pro Arg Gly Ala Val 145 150 155 160 Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Gln Ser Val Lys Thr Val Pro Gly Ala 165 170 175 Ser Asp Leu Phe Tyr Cys Pro Arg Arg Ala Gly Lys Leu Gln Gly Ser 180 185 190 His His Lys Pro Leu Ser Lys Thr Ala Asn Gly Leu Ala Gly His Glu 195 200 205 Gly Trp Thr Ile Ala Leu Pro Gly Arg Ala Leu Ala Gln Asn Gly Ser 210 215 220 Leu Gly Glu Gly Ile His Asp Pro Gly Gly Pro Arg Arg Gly Asn Ser 225 230 235 240 Thr Asn Arg Arg Val Arg Leu Lys Asn Pro Phe Tyr Pro Leu Thr Gln 245 250 255 Glu Ser Tyr Gly Ala Tyr Ala Val Met Cys Leu Ser Val Val Ile Phe 260 265 270 Gly Thr Gly Ile Ile Gly Asn Leu Ala Val Met Cys Ile Val Cys His 275 280 285 Asn Tyr Tyr Met Arg Ser Ile Ser Asn Ser Leu Leu Ala Asn Leu Val 290 295 300 Phe Trp Asp Phe Leu Ile Ile Phe Phe Cys Leu Pro Leu Val Ile Phe 305 310 315 320 His Glu Leu Thr Lys Lys Trp Leu Val Glu Asp Phe Ser Cys Lys Ile 325 330 335 Val Pro Tyr Ile Glu Val Ala Ser Leu Gly Val Thr Thr Phe Thr Leu 340 345 350 Cys Ala Leu Cys Ile Asp Arg Phe Arg Ala Ala Thr Asn Val Gln Met 355 360 365 Tyr Tyr Glu Met Ile Glu Asn Cys Ser Ser Thr Thr Ala Lys Leu Ala 370 375 380 Val Ile Trp Val Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Pro Glu Val Val Leu 385 390 395 400 Arg Gln Leu Ser Lys Glu Asp Leu Gly Phe Ser Gly Arg Ala Pro Ala 405 410 415 Glu Arg Cys Ile Ile Lys Ile Ser Pro Asp Leu Pro Asp Thr Ile Tyr 420 425 430 Val Leu Ala Leu Thr Tyr Asp Ser Ala Arg Leu Trp Trp Tyr Phe Gly 435 440 445 Cys Tyr Phe Cys Leu Pro Thr Leu Phe Thr Ile Thr Cys Ser Leu Val 450 455 460 Thr Ala Arg Lys Ile Arg Lys Ala Glu Lys Ala Cys Thr Arg Gly Asn 465 470 475 480 Lys Arg Gln Ile Gln Leu Glu Ser Gln Met Asn Cys Thr Val Val Ala 485 490 495 Leu Thr Ile Leu Tyr Gly Leu Gly Ile Ile Pro Glu Asn Ile Cys Asn 500 505 510 Ile Val Thr Ala Tyr Met Ala Thr Gly Val Ser Gln Gln Thr Met Asp 515 520 525 Leu Leu Asn Ile Ile Ser Gln Phe Leu Leu Phe Phe Lys Ser Cys Val 530 535 540 Thr Pro Val Leu Leu Phe Cys Leu Cys Lys Pro Phe Ser Arg Ala Phe 545 550 555 560 Met Glu Cys Cys Cys Cys Cys Cys Glu Glu Cys Ile Gln Lys Ser Ser 565 570 575 Thr Val Thr Ser Asp Asp Asn Asp Asn Glu Tyr Thr Thr Glu Leu Glu 580 585 590 Leu Ser Pro Phe Ser Ala Ile Arg Arg Glu Met Ser Thr Phe Ala Ser 595 600 605 Val Gly Thr His Cys 610 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 3 cctccagctc ttccttcaga 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 4 tttctgccgg agctctcggc ca 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 5 ggaggcgacg accccagaaa c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 6 gggacagcca gccacacaag g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 7 caaggccaac cgcgagaaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 8 ggaaggctgg aagagtgcct 20
【００８７】
【配列表フリーテキスト】配列番号３〜８：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】 ParkinとPael受容体の結合を示す図である。
【図２】 ParkinおよびParkin変異体とPael受容体の結
合を示す図である。
【図３】 内因性のParkinと内因性のPael受容体の脳組
織および培養細胞内での結合を示す図である。
【図４】 Pael受容体のユビキチン化の検討の結果を示
す図である。
【図５】 Parkinと小胞体関連のE2との結合の検討の結
果を示す図である。
【図６】 培養細胞由来の内因性Parkinを用いた Pael
受容体のIn vitroユビキチネーションアッセイの結果を
示す図である。
【図７】 リコンビナントParkinおよびE2を用いた In
vitroユビキチネーションアッセイの結果を示す図であ
る。
【図８】 Pael受容体とそのホモログを基質として用い
た In vitroユビキチネーションアッセイの結果を示す
図である。
【図９】 ParkinがPael受容体をユビキチンプロテアソ
ーム系で分解するか否かを確認するためのパルス−チェ
イス実験の結果を示す図である。
【図１０】 Pael受容体が、容易に折り畳み不全が起こ
り、小胞体ストレスにより不溶化することを示す図であ
る。
【図１１】 Pael受容体の過剰発現による細胞死に対す
るプロテアソーム阻害剤とUPR誘発剤の効果の検討の結
果を示す図である。
【図１２】 Pael受容体を発現した死細胞の形態を示す
図である。
【図１３】 SH-SY5Y細胞にて過剰発現されたPael受容
体の免疫局在を示す図である。
【図１４】 Pael受容体の細胞内封入体を示す図であ
る。
【図１５】 Parkinによる折り畳み不全のPael受容体に
よりおこる細胞死の抑制を示す図である。
【図１６】 Parkinによる折り畳み不全のPael受容体に
よりおこる細胞死の抑制を示すグラフである。
【図１７】 ヒト脳における内因性のPael受容体の量を
示す図である。
【図１８】 20μgの可溶性、または10μgの不溶性分画
由来の総タンパク質は、ウエスタンブロット解析の結果
を示す図である。
【図１９】 SH-SY5Y細胞および293T細胞から抽出され
た総RNAを鋳型としたRT-PCRの結果を示す図である。
【図２０】 抗Pael受容体抗体の特異性を示す図であ
る。
【図２１】 脳におけるPael受容体の発現を示す図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 Ａ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 45/00 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 45/00 5/00 Ｂ (72)発明者 服部 信孝 東京都文京区千石３−９−２−103 (72)発明者 水野 美邦 東京都北区田端６−３−20 (72)発明者 祖田 真理子 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 (72)発明者 井上 治久 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 BA79 CA04 CA07 CA09 CA20 DA03 EA04 GA11 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR32 QR35 QR40 QR56 QR77 QR80 QS34 QX02 QX10 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 NA14 ZA02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA75 DA76 EA20 EA50 FA71 FA72 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 パーキンソン病治療薬のスクリーニング
    のための、ヒトPael受容体。
  2. 【請求項２】 パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パ
    ーキンソン病である、請求項１のヒトPael受容体。
  3. 【請求項３】 パーキンソン病治療薬のスクリーニング
    のための、外来性ヒトPael受容体をコードするDNA、ま
    たはその変異体を組み込んだDNAを有する動物細胞。
  4. 【請求項４】 外来性ヒトPael受容体をコードするDNA
    が配列番号１で示される請求項３記載の動物細胞。
  5. 【請求項５】 さらにParkin遺伝子もしくはParkin遺伝
    子の変異体を有する請求項３または４記載の動物細胞。
  6. 【請求項６】 さらに、エンドセリン受容体タイプA、
    エンドセリン受容体タイプB、UBC6、UBC7からなる群か
    ら選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子を有する
    請求項５記載の動物細胞。
  7. 【請求項７】 細胞がHEK293T細胞またはSH-SY5Y細胞で
    ある、請求項３〜６のいずれか１項記載の動物細胞。
  8. 【請求項８】 パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子パ
    ーキンソン病である、請求項３〜７のいずれか１項記載
    の動物細胞。
  9. 【請求項９】 外来性ヒトPael受容体をコードするDN
    A、またはその変異体を組み込んだDNAを有する非ヒト哺
    乳動物。
  10. 【請求項１０】 外来性ヒトPael受容体をコードするDN
    Aが配列番号１で示される請求項９記載の非ヒト哺乳動
    物。
  11. 【請求項１１】 さらにParkin遺伝子もしくはParkin遺
    伝子の変異体を有する請求項９または１０記載の非ヒト
    哺乳動物。
  12. 【請求項１２】 さらに、エンドセリン受容体タイプ
    A、エンドセリン受容体タイプB、UBC6、UBC7からなる群
    から選ばれる少なくとも１つをコードする遺伝子を有す
    る請求項１１記載の非ヒト哺乳動物。
  13. 【請求項１３】 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請
    求項９〜１２のいずれか1項記載の動物。
  14. 【請求項１４】 ゲッ歯動物がマウスである請求項１３
    記載の動物。
  15. 【請求項１５】 ヒトPael受容体をコードするDNAまた
    はその変異体を導入した全能性細胞を個体発生して得ら
    れる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色
    体中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とする請求
    項９〜１４のいずれか１項記載の非ヒト哺乳動物。
  16. 【請求項１６】 請求項９〜１５のいずれか１項記載の
    動物から単離された細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１または２記載のヒトPael受容
    体をパーキンソン病候補治療薬と接触させ、動物細胞に
    おけるPael受容体の量を指標としてパーキンソン病治療
    薬をスクリーニングする方法。
  18. 【請求項１８】 請求項３〜８および請求項１６のいず
    れか1項記載の動物細胞をパーキンソン病候補治療薬と
    接触させ、動物細胞におけるPael受容体の量を指標とし
    てパーキンソン病治療薬をスクリーニングする方法。
  19. 【請求項１９】 請求項項９〜１５のいずれか１項記載
    の動物にパーキンソン病候補治療薬を投与し、該動物の
    細胞におけるPael受容体の量を指標としてパーキンソン
    病治療薬をスクリーニングする方法。
  20. 【請求項２０】 パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子
    パーキンソン病である、請求項１７〜１９のいずれか１
    項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 パーキンソン病の発症危険因子を検出
    するための、ヒトPael受容体をコードするDNAの全部ま
    たは一部からなるプローブ。
  22. 【請求項２２】 パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子
    パーキンソン病である、請求項２１記載のプローブ。
  23. 【請求項２３】 請求項２１または２２記載のプローブ
    を用いて、パーキンソン病の発症危険因子を検出する方
    法。
  24. 【請求項２４】 パーキンソン病が常染色体劣性遺伝子
    パーキンソン病である、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 Pael受容体と反応し、Pael受容体ホモ
    ログであるETBR-LP-2と反応しないPael受容体を認識す
    る抗体。
  26. 【請求項２６】 さらに、Pael受容体ホモログであるエ
    ンドセリン受容体タイプAおよびエンドセリン受容体タ
    イプBと反応しない、請求項２５記載の抗体。
  27. 【請求項２７】 モノクローナル抗体である請求項２５
    または２６記載の抗体。
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