JP2002531091A - Ｐｔｈ１ｒおよびｐｔｈ３ｒレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ゼブラフィッシュから単離された、新規な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）のレセプター（ＰＴＨ１ＲおよびＰＴＨ３Ｒ）に関する。本発明のレセプターは、以前に同定された副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）のレセプターと相同性を共有する。ゼブラフィッシュＰＴＨ１ＲレセプターおよびＰＴＨ３Ｒレセプターをコードする単離された核酸分子が、提供される。ＰＴＨ１ＲレセプターおよびＰＴＨ３Ｒレセプターのポリペプチド、これらを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法もまた、提供される。本発明はさらに、ＰＴＨ１ＲおよびＰＴＨ３Ｒのレセプター活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法、ならびに診断および治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （連邦政府の援助による研究および開発の下でなされた発明に対する権利の陳
述） 本発明の開発中になされた研究の一部は、米国政府資金を利用した。米国政府
は、本発明において特定の権利を有する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、分子生物学、発生生物学、生理学、神経生物学および薬学の分野に
関連する。本発明は、ゼブラフィッシュＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするポリ
ヌクレオチドおよび新規のゼブラフィッシュＰＴＨ３Ｒレセプターについてのポ
リヌクレオチド、ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞を提
供する。本発明は、ＲＴＨ１ＲレセプターおよびＰＴＨ３Ｒレセプターについて
のポリペプチドをさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、ＰＴＨ１Ｒレセプターの機能またはＰＴＨ３Ｒレセプターの機能のアゴニ
ストおよびアンタゴニストの同定のために有用であり、そしてＰＴＨ１Ｒの機能
またはＰＴＨ３Ｒの機能と関連する疾患または障害の処置における試薬として有
用である。

【０００３】 （関連技術） 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）レセプター
（ＰＴＨ１Ｒ）は、哺乳動物およびカエルにおいて、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの
作用を媒介する。両方のペプチドは、共通の祖先遺伝子から遺伝子重複事象を介
しておそらく進化し、そしてアミノ末端領域内に維持された限定された相同性を
有する。それらの構造的な保存から、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰは、類似の親和性
でＰＴＨ１Ｒに結合し、そして類似または区別のつかない効力でこの共通のレセ
プターを活性化する。この独特のリガンド特異性のために、ＰＴＨ１Ｒは、哺乳
動物におけるカルシウムホメオスタシスのもっとも重要なペプチド調節因子であ
るＰＴＨの内分泌作用、および正常な軟骨細胞の増殖および分化（Ｋａｒａｐｌ
ｉｓら、（１９９７）；Ｌａｎｓｋｅら、（１９９６））のために、およびおそ
らく他の、まだ完全に規定されていない機能（膵臓の発生、皮膚の発生、および
胸部の発生、ならびに歯の萠出を含む（Ｗｙｓｏｌｍｅｒｓｋｉら、（１９９６
））のために重要である、ＰＴＨｒＰのオートクライン／パラクリン作用を媒介
する。

【０００４】 ＰＴＨ１Ｒに加えて、ＰＴＨ２型レセプター（ＰＴＨ２Ｒ）が、哺乳動物およ
び真骨魚類から単離されており（Ｕｓｄｉｎら、（１９９５）；Ｒｕｂｉｎら、
（１９９９））、そして少なくともヒトＰＴＨ２Ｒは、ＰＴＨおよび最近単離さ
れた視床下部ペプチドにより活性化される（Ｕｓｄｉｎら、（１９９９））。増
えつつある生物学的証拠および薬理学的証拠が存在するさらなるレセプターの重
要性が不確定であるのと同様に、その生物学的重要性は、不確定なままである。
例えば、アミノ末端ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰについての特異性を有するレセプタ
ーが、ケラチノサイト、扁平癌腫細胞株、および中枢神経系細胞について記載さ
れており（Ｏｒｌｏｆｆら、（１９９５および１９９６）；Ｆｕｋａｙａｍａら
、（１９９５））、そして哺乳動物視索上核におけるＰＴＨｒＰ選択的レセプタ
ーについての証拠が存在する（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９９７）および（１９
９８））。さらに、ＰＴＨｒＰの中領域部分は、いくつかの細胞株中の細胞内の
遊離カルシウムの増加を刺激し、そして胎盤カルシウム輸送を増加させ（Ｋｏｖ
ａｃｓら、（１９９６）；Ｗｕら、（１９９６）；Ｏｒｌｏｆｆら、（１９９６
））、そしてＰＴＨのカルボキシ末端部分は、クローン細胞株上の別のレセプタ
ーと結合する（Ｉｎｏｍａｔａら、（１９９５）；Ｔａｋａｓｕら、（１９９８
））。

【０００５】 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）に関する調査は、広範囲にわたる。ＰＴＨの処方
物およびＰＴＨ活性を有する化合物が、記載されており（米国特許第５，４９６
，８０１号；同第５，８１４，６０３号；同第５,２０８,０４１号を参照のこと
）そしてＰＴＨの処方物およびＰＴＨ活性を有する化合物を産生する方法もまた
公知である（米国特許第５,６１６,５６０号および同第５，０１０，０１０号を
参照のこと）。さらに、ＰＴＨのアナログおよびＰＴＨのインヒビターが、先行
技術において見出され得る（米国特許第４，４２３，０３７号；同第５，６９３
，６１６号；同第５，６９５，９５５号および同第５，７９８，２２５号を参照
のこと）。

【０００６】 従って、本発明は、ＰＴＨレセプターに注目し、そしてＰＴＨと異なりかつ別
個である試薬および方法を提供することにより、この技術を促進する。

【０００７】 （本発明の要旨） 本発明は、細菌宿主中に図２Ａにおいて示されるアミノ酸配列（配列番号２）
または特許寄託物ＰＴＡ−９１６として１９９９年１１月４日にＡＴＣＣに寄託
されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する新規のＰＴＨ
１Ｒレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供
する。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およ
び組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法および組換え技術によるＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ１
Ｒペプチドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。本発明は、本明細書中
に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する単離さ
れたＰＴＨ１Ｒポリペプチドをさらに提供する。

【０００８】 本発明はまた、細菌宿主中に図２Ｂにおいて示されるアミノ酸配列（配列番
号４）または特許寄託物ＰＴＡ−９１５として１９９９年１１月４日にＡＴＣＣ
に寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する新規の
ＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を提供する。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター
、および組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿
主細胞を作製する方法および組換え技術によるＰＴＨ３ＲポリペプチドまたはＰ
ＴＨ３Ｒペプチドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。本発明は、本明
細書中に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する
単離されたＰＴＨ３Ｒポリペプチドをさらに提供する。

【０００９】 本発明はまた、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターにより誘導
される細胞応答を増強しまたは阻害することが可能である化合物を同定するため
のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴ
Ｈ３Ｒレセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞応答をア
ッセイする工程、および細胞応答を標準細胞応答と比較する工程を含み、接触が
候補化合物の非存在においてなされる場合、標準がアッセイされ；これにより、
標準に対して増加した細胞応答は、この化合物がアゴニストであることを示し、
そして標準に対して減少した細胞応答は、この化合物がアンタゴニストであるこ
とを示す。

【００１０】 別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニン
グアッセイが提供され、このアッセイは、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３
Ｒレセプターに対するＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ結合に関して候補化合物が有する
効果を決定する工程を包含する。特に、この方法は、ＰＴＨ１Ｒレセプターまた
はＰＴＨ３Ｒレセプターを、ＰＴＨポリペプチドまたはＰＴＨｒＰポリペプチド
および候補化合物と接触させる工程、ならびにＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴ
Ｈ３Ｒレセプターに対するＰＴＨポリペプチドまたはＰＴＨｒＰポリペプチドの
結合が候補化合物の存在に起因して増加するかまたは減少するかを決定する工程
を包含する。

【００１１】 本発明のさらなる局面は、体内で増加したレベルのＰＴＨ１Ｒ活性またはＰＴ
Ｈ３Ｒ活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療的
有効量の本発明の単離されたＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリペプ
チドまたはそのアゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を含む
。

【００１２】 本発明のなおさらなる局面は、体内で減少したレベルのＰＴＨ１Ｒレセプター
活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を必要とする個体を処置するための方法に
関し、この方法は、治療的有効量のＰＴＨ１ＲアンタゴニストまたはＰＴＨ３Ｒ
アンタゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を含む。

【００１３】 本発明は、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒのレセプターの発現または機能と関連
した疾患および障害の診断または予後の間に有用な診断方法をさらに提供する。

【００１４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明は、新規のＰＴＨレセプター核酸およびＰＴＨレセプタータンパク質を
提供する（ＲｕｂｉｎおよびＪｕｅｐｐｎｅｒ、（１９９９））。さらに詳細に
は、本発明は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することにより決定された
、図２Ａ（配列番号２）において示されているアミノ酸配列を有する新規のＰＴ
Ｈ１Ｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を
提供する。本発明のＰＴＨ１Ｒタンパク質は、以前に同定されたＰＴＨ１Ｒ配列
およびＰＴＨ２Ｒ配列との配列相同性を共有する。配列番号１のヌクレオチド配
列は、１９９９年１１月４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａ
ｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され
、そして受託番号ＰＴＡ−９１６を与えられたｃＤＮＡクローン（ｚＰＴＨ１Ｒ
）を配列決定することにより得られた。このｃＤＮＡは、プラスミドｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位とＳｐｈＩ部位との間に
挿入された。

【００１５】 本発明はまた、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することにより決定され
た、図２Ｂ（配列番号４）において示されるアミノ酸配列を有する新規のＰＴＨ
３Ｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提
供する。本発明のＰＴＨ３Ｒタンパク質は、本発明のＰＴＨ１Ｒタンパク質配列
および以前の他のＰＴＨ１Ｒタンパク質配列およびＰＴＨ２Ｒタンパク質配列と
の配列相同性を共有する。図１Ｄにおいて示されるヌクレオチド配列（配列番号
３）は、１９９９年１１月４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖ
ａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９で寄託さ
れ、そして受託番号ＰＴＡ−９１５を与えられたｃＤＮＡクローン（ｚＰＴＨ３
Ｒ）を配列決定することにより得られた。このｃＤＮＡは、プラスミドｐｃＤＮ
ＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位との間
に挿入された。

【００１６】 （核酸分子） そうでないと示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することに
より決定された全てのヌクレオチド配列は、手作業（ｍａｎｕａｌ）配列決定に
より決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポ
リペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳
により予測された。従って、このアプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列
について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレ
オチド配列は、いくつかの誤りを含み得る。手作業の配列決定により決定される
ヌクレオチド配列は代表的に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド
配列に対して、少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。当
該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオ
チド配列における単一の挿入または単一の欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳にお
いてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によ
りコードされる予測されたアミノ酸配列は、このような挿入または欠失の点で始
まって、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされたアミノ酸配列とは
完全に異なる。

【００１７】 配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のような、本明細書中で提供
される情報を使用して、それぞれＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリ
ペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的クローニング手順および標準
的スクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡを
クローニングするための手順）を使用して、得られ得る。本発明の例示として、
配列番号１に記載される核酸分子は、ゼブラフィッシュ成体から単離された総Ｒ
ＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して発見された。配列番号１のＰＴＨ１Ｒ ｃＤＮＡの決定され
たヌクレオチド配列は、約２４のアミノ酸残基の予測されたリーダー配列を有し
、そして非グリコシル化形態について約６１．４ｋＤａの推定分子量を有する約
５３６のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含む。予測された成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターのアミノ酸配列は、アミノ酸残基
約２５〜残基約５３６まで図２Ａに示す。図２Ａ（配列番号２）において示され
るＰＴＨ１Ｒタンパク質は、ヒトＰＴＨ１Ｒ配列に対して約７６％同一であり、
そしてヒトＰＴＨ２Ｒ配列に対して約６８％同一である。

【００１８】 本発明の例示はまた、ゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）において発見された、図１Ｄに記載される核酸分子（配列番号３）である
。図１Ｄの決定されたヌクレオチド配列（配列番号３）は、約２１のアミノ酸残
基の予測されたリーダー配列を有し、そして約５９．２ｋＤａの推定分子量を有
する、約５４２のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディング
フレームを含む。図２Ｂ（配列番号４）において示されるＰＴＨ３Ｒタンパク質
は、それぞれヒトＰＴＨ１ＲおよびヒトＰＴＨ２Ｒに対して約６８％および５７
％類似する。

【００１９】 示されるように、本発明はまた、本発明のＰＴＨ１ＲレセプターおよびＰＴＨ
３Ｒレセプターの成熟形態を提供する。シグナル仮説に従って、哺乳動物細胞に
より分泌されるタンパク質は、一旦粗面小胞体を横切った、成長するタンパク質
鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナル配列または分
泌リーダー配列を有する。大部分の哺乳動物細胞およびさらに昆虫細胞は、分泌
タンパク質を同じ特異性で切断する。しかし、いくつかの場合において、分泌タ
ンパク質の切断は、完全には均一でなく、このタンパク質に関して２つ以上の成
熟種を生じる。さらに、分泌タンパク質の切断特異性は、完全なタンパク質の一
次構造により最終的に決定されること、つまり、そのポリペプチドのアミノ酸配
列において固有であることが、長い間公知であった。従って、本発明は、細菌宿
主中に１９９９年１１月４日に特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託
され、そして図２Ａ（配列番号２）において示されるようなｃＤＮＡクローンに
よりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、細菌宿主中に１９９９年１１月
４日に特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託され、そして図２Ｂ（配
列番号４）において示されるようなｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ
酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提
供する。特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託される細菌宿主中に含
まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１
Ｒタンパク質により、寄託された宿主中のベクターの中に含まれるクローンのゼ
ブラフィッシュＤＮＡ配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレ
ームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載されるようなＣＯＳ細胞）における発
現により産生されるＰＴＨ１Ｒレセプターの成熟形態を意味する。特許寄託物Ｐ
ＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託される細菌宿主中に含まれるｃＤＮＡクロー
ンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒタンパク質により、
寄託される宿主中のベクターの中に含まれるクローンのゼブラフィッシュＤＮＡ
配列によりコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（
例えば、以下に記載されるようなＣＯＳ細胞）における発現により産生されるＰ
ＴＨ３Ｒレセプターの成熟形態を意味する。以下で示されるように、特許寄託物
ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンによりコードされ
るアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターにより、予測される切断の精
度に依存して図２Ａ（約２５〜約５３６のアミノ酸）において示される予測され
た「成熟」ＰＴＨ１Ｒタンパク質と異なってもよいし異ならなくてもよい。特許
寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンによりコー
ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターは、予測される切断部
位の精度に依存して図２Ｂ（約２２〜約５４２のアミノ酸）において示される予
測された「成熟」ＰＴＨ３Ｒタンパク質と異なってもよいし異ならなくてもよい
。

【００２０】 このリーダー配列について、タンパク質が分泌リーダーならびに切断点を有す
るか否かを推定するための方法は、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法およびｖｏｎ
Ｈｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９
０（１９８６））の方法が用いられ得る。これらの方法の各々について、公知の
哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定することの精度は、７５〜８０％の範囲
にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、この２つの方法は、所定のタ
ンパク質について同じ推定切断点を必ずしも生じない。計算的な方法は、コンピ
ュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」（Ｋ．ＮａｋａｉおよびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓ
ａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９９２））において見出され
得、それは、アミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞位置を推定するためのエキ
スパートシステムである。局在のこの計算的な推定の一部として、ＭｃＧｅｏｃ
ｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が援用される。

【００２１】 この場合では、本発明の完全なＰＴＨ１ＲポリペプチドおよびＰＴＨ３Ｒポリ
ペプチドの推定アミノ酸配列は、構造的特性について、ラットＰＴＨ１Ｒ配列に
対する比較により分析された。この分析は、図２Ａ（配列番号２）のアミノ酸２
４とアミノ酸２５との間の推定切断部位、および図２Ｂ（配列番号４）のアミノ
酸２１とアミノ酸２２との間の推定切断部位を提供する。従って、ＰＴＨ１Ｒレ
セプタータンパク質についてのこのリーダー配列は、図２Ａにおけるアミノ酸残
基１〜２４（配列番号２におけるアミノ１〜２４）からなると推定されるが、一
方、推定成熟ＰＴＨ１Ｒタンパク質は、残基２５〜５３６（配列番号２における
アミノ酸２５〜５３６）からなる。ＰＴＨ３Ｒレセプタータンパク質についての
このリーダー配列は、図２Ｂにおけるアミノ酸残基１〜２１（配列番号４におけ
るアミノ酸１〜２１）からなると測定されるが、一方、推定成熟ＰＴＨ３Ｒタン
パク質は、残基２２〜５４２（配列番号４におけるアミノ酸２２〜５４２）から
なる。

【００２２】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に生成されることによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）であり得る。このＤＮＡ
は、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、コード鎖（センス鎖としても公知である）であり得、またはそれらは、非
コード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。

【００２３】 しかし、当業者が理解するように、配列決定誤差の可能性に起因して、寄託さ
れたｃＤＮＡによってコードされるＰＴＨ１Ｒレセプターポリペプチドは、約５
３６アミノ酸を含むが、しかし概して５１０〜５６１アミノ酸の範囲であり得；
そしてこのタンパク質のリーダー配列は、約２４アミノ酸であるが、概して約１
０〜約３０アミノ酸の範囲であり得る。しかし、当業者がまた理解するように、
配列決定誤差の可能性に起因して、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるＰ
ＴＨ３Ｒレセプターポリペプチドは、約５４２アミノ酸を含むが、しかし概して
５００〜５５０アミノ酸の範囲であり得；そしてこのタンパク質のリーダー配列
は、約２４アミノ酸であるが、概して約１５〜約３５アミノ酸の範囲であり得る
。

【００２４】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に生成されることによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる）であり得る。このＤＮＡ
は、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたは一本
鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても公知である）であり得、またはそれら
は、非コード鎖（アンチ鎖ともいわれる）であり得る。

【００２５】 「単離された」核酸分子は、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子
、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ
分子は、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子
のさらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中
の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分
子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む
。本発明に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されたそのような分子を
さらに含む。

【００２６】 本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号３に示されるオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含み；ＤＮＡ分子は、
図２Ａに示されるＰＴＨ１Ｒレセプター（配列番号２）、または図２Ｂに示され
るＰＴＨ３Ｒレセプター（配列番号４）に関するコード配列を含み；そして上記
の配列と実質的に異なる（しかしこれは、遺伝コードの縮重に起因する）配列を
含むＤＮＡ分子は、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターをなおコ
ードする。もちろん、遺伝コードは、当該分野で周知である。従って、そのよう
に縮重した改変体を生成することは、当業者にとって慣用的である。

【００２７】 別の局面では、本発明は、１９９９年１１月４日に特許寄託物ＰＴＡ−９１６
としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒポリペプチドをコードする、単離され
た核酸分子を提供する。別の局面では、本発明は、１９９９年１１月４日に特許
寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮ
Ａクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒポリペプチドを
コードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、これらの核酸分子は
、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ポリペプチドをコ
ードする。さらなる実施形態では、ＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポ
リペプチド、あるいはＮ末端のメチオニンを欠くＰＴＨ１Ｒポリペプチドまたは
ＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコードする核酸分子が、提供される。本発明はまた、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上
記の寄託されたクローンに含まれるＰＴＨ１ＲのｃＤＮＡのヌクレオチド配列、
あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのよ
うな単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイ
ズゼーションにより、遺伝子地図のためのプローブとして、および例えば、ノー
ザンブロット分析によって、ヒト組織におけるＰＴＨ１Ｒ遺伝子の発現を検出す
るためのプローブとして有用である。本発明はまた、配列番号３に示されるヌク
レオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の寄託されたクローンに
含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、あるいは上記の配列の１つに相補的な配
列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された分子、特にＤＮＡ分子は
、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションにより、遺伝子地図のための
プローブとして、および例えば、ノーザンブロット分析により、ヒト組織におけ
るＰＴＨ１Ｒ遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。

【００２８】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トにさらに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、あるいは配列番号
１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子の
フラグメントは、本明細書中で議論されるような診断的プローブおよびプライマ
ーとして有用である、長さが少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少な
くとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおよ
り好ましくは少なくとも約４０ｎｔのフラグメントが意図される。もちろん、長
さが約５０ｎｔ〜１５５０ｎｔのより大きなフラグメント、およびより好ましく
は、長さが少なくとも約６００ｎｔのフラグメントもまた、本発明に従って有用
であり、同様に、寄託されたｃＤＮＡまたは配列番号１もしくは配列番号３に示
されるようなヌクレオチド配列の、全てではなくとも、ほぼ対応するフラグメン
トも有用である。例えば、長さが少なくとも２０ｎｔのフラグメントは、寄託さ
れたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１もしくは配列番号３に示され
るようなヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが
意図される。

【００２９】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：Ｐ
ＴＨ１Ｒレセプター細胞外ドメイン（図２Ａにおいて約２５〜約１４７のアミノ
酸残基（または、配列番号２の約２５〜約１４７のアミノ酸残基）を構成するこ
とが推定される）を含むポリペプチド；ＰＴＨ１Ｒレセプター膜貫通ドメイン（
図２Ａにおいて約１４８〜約４１６のアミノ酸残基（または、配列番号２の約１
４８〜約４１６のアミノ酸残基）を構成することが推定される）を含むポリペプ
チド；および膜貫通ドメインの全てまたは一部が欠失した、ＰＴＨ１Ｒレセプタ
ー細胞外ドメインを含むポリペプチド。上記のようにリーダー配列を用いて、Ｐ
ＴＨ１Ｒレセプター細胞外ドメインおよびＰＴＨ１Ｒレセプター膜貫通ドメイン
を含むアミノ酸残基が、推定された。従って、当業者が理解するように、これら
のドメインを構成しているアミノ酸残基は、各々のドメインを定義するために用
いられる判定基準に依存して、わずかに（例えば、約１〜約１５のアミノ酸残基
）変化し得る。

【００３０】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、以下をコードする核酸分子を含む
：ＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメイン（図２Ｂにおいて約２２〜約１４５のア
ミノ酸残基（または、配列番号４の約２２〜約１４５のアミノ酸残基）を構成す
ることが推定される）を含むポリペプチド；ＰＴＨ３Ｒレセプター膜貫通ドメイ
ン（図２Ｂにおいて約１４６〜約４０２のアミノ酸残基（または、配列番号４の
約１４６〜約４０２のアミノ酸残基）を構成することが推定される）を含むポリ
ペプチド；および膜貫通ドメインの全てまたは一部が欠失した、ＰＴＨ３Ｒレセ
プター細胞外ドメインを含むポリペプチド。上記のようにリーダー配列を用いて
、コンピューター分析によりＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメインおよびＰＴＨ
３Ｒレセプター膜貫通ドメインを含むアミノ酸残基が、推定された。従って、当
業者が理解するように、これらのドメインを構成しているアミノ酸残基は、各々
のドメインを定義するために用いられる判定基準に依存して、わずかに（例えば
、約１〜約１５のアミノ酸残基）変化し得る。

【００３１】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、ＰＴＨ１Ｒレセプタータンパク質
またはＰＴＨ３Ｒレセプタータンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸
分子を含む。当業者に公知であるように、核酸配列は、本明細書中にコードされ
るポリペプチド配列を推定するために使用され得る。次いで、そのような情報は
、この分析により同定される抗原決定基をコードする、対応するポリヌクレオチ
ド領域に関連すし得るポリペプチドにおいて、抗原決定基を推定するために使用
され得る。ポリペプチドの抗原決定基を推定するための方法は、当該分野で周知
である。

【００３２】 ＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質の他のそのようなエピトー
プ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。

【００３３】 別の局面では、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、特許寄託物ＰＴ
Ａ−９１５または特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託された細菌宿
主中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部分に対してスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７
．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌの
変性、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃での一晩のインキュベー
ション、続いて、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でそのフィルターを洗浄するこ
とが、意図される。

【００３４】 別の局面では、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、特許寄託物ＰＴ
Ａ−９１５または特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託された細菌宿
主中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部分に対して低ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌク
レオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「低ストリンジェンシーハイ
ブリダイゼーション条件」は、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍ
ｌの変性、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃での一晩のインキュ
ベーション、続いて、約５５℃または約６０℃または約６５℃にて、２×ＳＳＣ
または１×ＳＳＣまたは０．５×ＳＳＣ溶液中でそのフィルターを洗浄すること
が、意図される。

【００３５】 ポリヌクレオチドの一「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、参
照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ま
しくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、
なおより好ましくは約３０〜約７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記に、そして以
下でより詳細に議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして有用で
ある。

【００３６】 「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの一部分は、例えば、参照
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは配列
番号１もしくは配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列）から、２０以上
の連続するヌクレオチドが意図される。

【００３７】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号１に示されるＰＴＨ１Ｒレセプター
ｃＤＮＡの３’末端のポリ（Ａ）トラクトもしくは、配列番号３に示されるＰＴ
Ｈ３ＲレセプターｃＤＮＡの３’末端のポリ（Ａ）トラクト）、またはＴ（もし
くはＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは
、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌ
クレオチドに含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ
）ストレッチまたはその相補体（例えば、特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）
を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。

【００３８】 示されるように、ＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコ
ードする本発明の核酸分子としては、以下が挙げられる得が、これらに限定され
ない：単独で成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリ
ペプチドおよびさらなる配列のコード配列（例えば、アミノ酸リーダー配列また
は分泌配列（例えば、プレタンパク質配列、もしくはプロタンパク質配列、また
はプレプロタンパク質配列）をコードする配列）；さらなる非コード配列（例え
ば、イントロンならびに非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転
写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、リボソーム結合）
を含むｍＲＮＡプロセシング、ならびにｍＲＮＡの安定性において役割を果たす
転写非翻訳配列を含むが、これらに限定されない））と共に、上述のさらなるコ
ード配列を伴うかまたは伴わない、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる機
能性を提供するアミノ酸のようなさらなるアミノ酸をコードする、さらなるコー
ド配列。従って、このポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば
、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され
得る。本発明のこの局面の、特定の好ましい実施形態では、このマーカーアミノ
酸配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ
のようなヘキサヒスチジンペプチドであり、とりわけ、これらの多くは市販され
ている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサヒスチジン
は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ
赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製に有用な別のペプチ
ドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によ
り記載されている。以下で議論するように、他のそのような融合タンパク質とし
ては、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃに融合したＰＴＨ１Ｒレセプターが挙げられる
。

【００３９】 本発明は、さらに、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターの部分
、アナログまたは誘導体をコードする本発明の核酸分子の改変体に関する。改変
体は、天然の対立遺伝子改変体のように、天然に存在し得る。「対立遺伝子改変
体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替形
態の１つを意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない
改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して、生成され得る。

【００４０】 このような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生成
される改変体が挙げられ、これは、１以上のヌクレオチドを含み得る。この改変
体は、コード領域、非コード領域、または両方において変化し得る。コード領域
における変化は、保存的アミノ酸置換、欠失もしくは付加、または非保存的アミ
ノ酸置換、欠失もしくは付加を生じる。これらの中で特に好ましいのは、サイレ
ントな置換、付加および欠失であり、ＰＴＨ１ＲレセプターもしくはＰＴＨ３Ｒ
レセプターまたはその部分の性質および活性を変化しない。また、この点に関し
て特に好ましいのは、保存的置換である。

【００４１】 本発明のさらなる実施形態は、単離された核酸分子を含み、これは、以下と少
なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む：（
ａ）推定リーダー配列を含む、配列番号２における完全アミノ酸配列を有する全
長ＰＴＨ１Ｒポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２
におけるアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコー
ドする、ヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２における約２５〜約５３６の位置
のアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプター（リーダー配列が除去された
全長ポリペプチド）をコードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）特許寄託物ＰＴＡ
−９１６としてＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるリー
ダーを含む完全アミノ酸配列を有する全長ＰＴＨ１Ｒポリペプチドをコードする
、ヌクレオチド配列；（ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託さ
れたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒ
レセプターをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ＰＴＨ１Ｒレセプター細胞
外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；（ｇ）ＰＴＨ１Ｒレセプター膜貫
通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；（ｈ）膜貫通ドメインの全てまた
は一部が欠失したＰＴＨ１Ｒレセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオ
チド配列；および（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（
ｇ）、または（ｈ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオ
チド配列。

【００４２】 本発明の実施形態はまた、単離された核酸分子を含み、これは、以下と少なく
とも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む：（ａ）
推定リーダー配列を含む、図２Ｂ（配列番号４）における完全アミノ酸配列を有
する全長ＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列
番号４におけるアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠くポリペプチド
をコードする、ヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号４における約２２〜約５４２
の位置のアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプター（リーダーが除去され
た全長ポリペプチド）をコードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）特許寄託物ＰＴ
Ａ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるリ
ーダーを含む完全アミノ酸配列を有する全長ＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコードす
る、ヌクレオチド配列；（ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託
されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプ
ターをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメ
インをコードする、ヌクレオチド配列；（ｇ）ＰＴＨ３Ｒレセプター膜貫通ドメ
インをコードする、ヌクレオチド配列；（ｈ）膜貫通ドメインの全てまたは一部
が欠失したＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配
列；および（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、
または（ｈ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配
列。

【００４３】 ＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドをコードする参照ヌク
レオチド配列に、少なくとも、例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、Ｐ
ＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターをコードする参照ヌクレオチド
配列の各１００ヌクレオチドあたり５つのまでの点変異を含み得ることを除き、
このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一であること
を意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレ
オチドの５％までが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得る
か、または参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照
配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照配列中のヌクレオチド
間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかに
分散された、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置か、またはこれ
らの末端位置の間のいずれの場合でも生じ得る。

【００４４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子は、例えば、配列番号１もしくは配列
番号３に示されるヌクレオチド配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクロー
ンのヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来的に
決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４
８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間の相同性
の最適セグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に対
して、９５％同一であるか否かを決定するためのＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他
の配列アラインメント（整列）プログラムを用いる場合、当然ながら、同一性の
パーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出されるように、そ
してこの参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性においてギャップ
が可能になるように、パラメーターを設定する。

【００４５】 本出願は、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に対して、また
は寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子（
それらの核酸分子がＰＴＨ１Ｒレセプター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性
を有するポリペプチドをコードするか否かにかかわらず）に関する。これは、特
定の核酸分子がＰＴＨ１Ｒレセプター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を有
するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子の使用方法、
例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）プライマーとしての使用方法をなお知っているからである。ＰＴＨ１Ｒレセプ
ター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を有するポリペプチドをコードしない
本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ以下：（１）ｃＤＮＡライブラリー
中のＰＴＨ１Ｒレセプター遺伝子もしくはＰＴＨ３Ｒレセプター遺伝子またはそ
れらの対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載
のような、ＰＴＨ１Ｒレセプター遺伝子またはＰＴＨ３Ｒレセプター遺伝子の正
確な染色体位置を提供するための中期染色体分裂へのインサイチュハイブリダイ
ゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；ならびに（３）特定の組織中でのＰＴＨ
１ＲレセプターまたはＰＴＨ３ＲレセプターのｍＲＮＡ発現を検出するためのノ
ーザンブロット分析、が挙げられる。

【００４６】 しかし、配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に対して、または
寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する
核酸分子（これは、実際にＰＴＨ１Ｒレセプター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプタ
ー活性を有するポリペプチドをコードする）が好ましい。「ＰＴＨ１Ｒレセプタ
ー活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を有するポリペプチド」とは、特定の生
物学的アッセイで測定して、本発明のＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレ
セプターの活性に類似である（ただし同一である必要はない）活性を示すポリペ
プチドを意図する。例えば、ＰＴＨ１Ｒレセプター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプ
ター活性は、Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８０〜８３（１９９６
）またはＪｉｎｇら、Ｃｅｌｌ ８５：１１１３〜１１２４（１９９６）に記載
のように、候補のＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドを発現
する細胞に対する、標識したＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの競合結合実験を用いて測
定され得る。

【００４７】 本明細書において実施例３および４に実証されるように、ＰＴＨ１Ｒ機能およ
びＰＴＨ３Ｒ機能を取り扱うアッセイは、当該分野で周知である。ＰＴＨ１Ｒレ
セプターもしくはＰＴＨ３Ｒレセプター、またはそれらの改変体を発現する任意
の細胞株は、実施例３および４に記載のようにリガンド結合およびセカンドメッ
センジャー活性化をアッセイするために用いられ得る。当然ながら、遺伝子コー
ドの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、また
は配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に対して、少なくとも９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の核酸分
子が「ＰＴＨ１Ｒレセプター活性またはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を有する」ポ
リペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配
列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードするので、これは、上記の比
較アッセイを実施せずとも当業者に明白である。縮重改変体でないこのような核
酸分子について、合理的な数がまたＰＴＨ１Ｒタンパク質活性またはＰＴＨ３Ｒ
タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが当該分野でさらに認識
される。これは、タンパク質機能にそれほど有意に影響しないか、または有意に
影響するようでないかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族ア
ミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸での置換）を、当業者が十分認知しているためで
ある。

【００４８】 例えば、表現型としてサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダン
スは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａ
ｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３０６〜１３１０（１９９０）（ここでは、著者らは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど耐性であることを示している）に提供される。

【００４９】 本発明はまた、核酸分子の単離のための方法を提供するが、この方法は以下を
含む：（ａ）核酸プローブとして配列番号３のフラグメントを選択する工程；（
ｂ）このプローブを、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）
、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断
サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃でのインキュベーションにより、少なくとも１
つの試験配列に一晩ハイブリダイズさせる工程；（ｃ）５５℃もしくは６０℃も
しくは６５℃での、２×ＳＳＣもしくは１×ＳＳＣもしくは０．５×ＳＳＣの溶
液を用いる洗浄により、ハイブリダイズされていないプローブを除去する工程；
ならびに（ｄ）このプローブに結合された標的配列を同定する工程；ここで、こ
の同定された標的配列は、以下：（ｅ）配列番号４における約１〜約５４２位の
完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列
；（ｆ）配列番号４における約２〜約５４２位のアミノ酸配列を有するＰＴＨ３
Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号４における約２２
〜約５４２位のアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするヌ
クレオチド配列；（ｈ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託された
ｃＤＮＡクローンによりコードされる完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレセ
プターをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５として
、ＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされたアミノ酸配列を有
する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）ＰＴＨ３
Ｒ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｋ）ＰＴＨ３Ｒ膜貫通ドメ
インをコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｌ）（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、
（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）における任意のヌクレオチド配列に相補的
なヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列に対して少なくとも約５０
％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一である。

【００５０】 本発明はまた、核酸分子の単離の方法を提供するが、この方法は以下を含む：
（ａ）核酸プローブとして配列番号のフラグメントを選択する工程；（ｂ）この
プローブを、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デ
ンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子
ＤＮＡの溶液中、４２℃でのインキュベーションにより、少なくとも１つの試験
配列に一晩ハイブリダイズさせる工程；（ｃ）５５℃もしくは６０℃もしくは６
５℃での、２×ＳＳＣもしくは１×ＳＳＣもしくは０．５×ＳＳＣの溶液を用い
る洗浄により、ハイブリダイズされていないプローブを除去する工程；ならびに
（ｄ）このプローブに結合された標的配列を同定する工程、ここで、この同定さ
れた標的配列は、以下：（ｅ）配列番号２における約１〜約５３６位の完全なア
ミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列；（ｆ
）配列番号２における約２〜約５３６位のアミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセ
プターをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号２における約２５〜約５
３６位のアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするヌクレオ
チド配列；（ｈ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されたｃＤＮ
Ａクローンによりコードされる完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセプター
をコードするヌクレオチド配列；（ｉ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣ
Ｃに寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟
ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）ＰＴＨ１Ｒ細胞外
ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｋ）ＰＴＨ１Ｒ膜貫通ドメインをコ
ードするヌクレオチド配列；ならびに（ｌ）（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、からなる群より選択される配列に対して少なくとも約５０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である
。

【００５１】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベ
クターで遺伝子操作した宿主細胞、および組換え技術によるＰＴＨ１Ｒポリペプ
チドもしくはＰＴＨ３Ｒポリペプチドまたはそれらのフラグメントの産生に関す
る。

【００５２】 このポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベク
ターに連結され得る。一般にプラスミドベクターは、沈殿（例えば、リン酸カル
シウム沈殿）または荷電脂質との複合体で導入される。このベクターがウイルス
である場合、これは適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケー
ジングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【００５３】 このＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（２〜３例を挙げると、例えば
、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐおよびｔｒｐプ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレト
ロウイルスＬＴＲのプロモーター）と作動可能に連結されるべきである。他の適
切なプロモーターは、当業者に公知である。この発現構築物はさらに転写開始部
位、終止部位、および（転写領域中に）翻訳のためのリボソーム結合部位を含む
。この構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、始めに
翻訳開始コドンおよび翻訳されるべきポリペプチドのほぼ末端に位置する終止コ
ドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。

【００５４】 示されたとおり、この発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マー
カーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物培養細胞に対するジヒドロ
葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉお
よび他の細菌における培養のためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシ
リン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例
えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細
胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞
）；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記の宿主細胞の
ための適切な培養培地および培養条件が当該分野で公知である。

【００５５】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およ
びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ
、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならび
にｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲ
ＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベ
クターの間にはｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。他の適切な
ベクターは当業者に容易に明白である。

【００５６】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によ
りもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的実験マニュアル（例えば、
Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載されている。

【００５７】 このポリペプチドは、改変型（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そし
て分泌シグナルのみでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さら
なるアミノ酸（特に荷電したアミノ酸）の領域は、精製中または引き続く取り扱
いおよび貯蔵の間の、宿主細胞における安定性および持続性を改善するためにポ
リペプチドのＮ末端に付加され得る。また、精製を容易にするために、ペプチド
部分が、このポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの
最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性
を改善するため、および精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部
分の付加は、当該分野で周知でかつ慣用的技術である。好ましい融合タンパク質
は、タンパク質を可溶化するのに有用である、免疫グロブリン由来の異種領域を
含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ４６４５３３（カナダ対応２０４５８６９）は、別
のヒトタンパク質またはその部分と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の種々
の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ
部分は、治療および診断における使用のために十分に利点があり、従って、例え
ば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ０２３２２６２）。一方で
は、いくつかの用途のために、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現
、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失し得ることが所望される。これは、
Ｆｃ部分が治療および診断における使用に対する障害であることが証明される場
合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられるべきである場
合）である。薬物開発において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、ｈＩＬ５−
レセプター）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高性能スクリー
ニングアッセイのためにＦｃ部分と融合された。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、第８巻：５２
〜５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７０巻、第１６号：９
４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと。

【００５８】 ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターは、周知の方法により組換
え細胞培養物から回収および精製され得る。この方法には硫酸アンモニウム沈殿
またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルア
パタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。
最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用さ
れる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、化学合成手順による産
物、ならびに原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、
高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術により産生
された産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明
のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくて
もよい。さらに本発明のポリペプチドはまた、ある場合には、宿主媒介性プロセ
スの結果として、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。

【００５９】 （ＰＴＨ１ＲおよびＰＴＨ３Ｒのポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有す
る単離されたＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチド、または図
２Ａ（配列番号２）もしくは図２Ｂ（配列番号４）中のアミノ酸配列、または上
記のポリペプチドの部分を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。

【００６０】 ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターのいくつかのアミノ酸配列
が、このタンパク質の構造または機能への有意な影響なく変化され得ることが当
該分野で認識される。配列におけるこのような差異が考慮される場合、活性を決
定する重要な領域がタンパク質上に存在することが想起されるべきである。従っ
て、本発明は、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターの改変体（こ
れは、実質的なＰＴＨ１Ｒレセプター活性もしくはＰＴＨ３Ｒレセプター活性を
示すか、またはＰＴＨ１Ｒタンパク質もしくはＰＴＨ３Ｒタンパク質の領域（例
えば、以下に考察するタンパク質部分）を含む）をさらに含む。このような変異
体は、欠失、挿入、逆位、反復および型置換を含む。上記のように、アミノ酸変
化が表現型としてサイレントであることに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ
．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０
（１９９０）に見出され得る。

【００６１】 従って、図２Ａ（配列番号２）または図２Ｂ（配列番号４）のポリペプチド、
または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログは、以下：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的アミノ酸
または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換さ
れたものであり、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによ
りコードされたものであってもなくてもよいポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログ、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む、ポ
リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、または（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を延長するための化合物
（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されている、ポリペプチドのフラ
グメント、誘導体またはアナログ、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が（例えば
、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、また
は成熟ポリペプチド配列もしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列が
その成熟ポリペプチドに融合されている、ポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログ、であり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。

【００６２】 特に目的とするのは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸による置換
、および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸による置換である。後者は、
正電荷が減少したタンパク質を生じ、ＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタ
ンパク質の特徴を改善する。凝集の防止が非常に所望される。タンパク質の凝集
は、活性の損失を生じるだけでなく、それが免疫原生であり得ることにより、薬
学的処方物を調製する場合に問題にもなり得る。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉ
ｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎ
ｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄ
ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７〜３７７（１９９３））。

【００６３】 アミノ酸置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、２つ
の公知のＴＮＦレセプター型の１つのみに対するＴＮＡ−αの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰ
ＴＨ３Ｒレセプターは、天然の変異またはヒト操作のいずれかに由来する、１つ
以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。

【００６４】 示されるとおり、タンパク質のフォールディング（折り畳み）または活性に有
意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、わずかな性質の変化が好ましい。

【００６５】

【表１】 機能に必須である本発明のＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質
のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のよう
な、当該分野で公知の方法により同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷ
ｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者
の手順は、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入する。次に、生じ
た変異体分子は、レセプター結合またはインビボでの増殖活性のような生物学的
活性について試験される。リガンド−レセプター結合に重大な部位はまた、結晶
化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析により決定され得る（Ｓ
ｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およ
びｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。

【００６６】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」によって、それらの自然の環境から取り出されたポリペプチ
ドを意図する。従って、組換え宿主細胞中に産生されたポリペプチドおよび／ま
たは含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと考慮される。
また、「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え宿主細胞から
部分的または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、抗菌ペプチドポ
リペプチドの組換え産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ
、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載された一段階の方法によって
実質的に精製され得る。

【００６７】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプター
の組換え産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ
６７：３１−４０（１９８８）に記載された一段階の方法によって実質的に精
製され得る。

【００６８】 本発明のポリペプチドはまた、リーダーを含む寄託されたＰＴＨ１Ｒ ｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチド、リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）、リーダーを含む
図２Ａ（配列番号２）のポリペプチド、リーダーを含まない図２Ａ（配列番号２
）のポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、配列番号２のアミノ酸お
よそ１〜およそ５３６を含むポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸およそ
２〜およそ５３６のアミノ酸を含むポリペプチド、ならびに、上記のポリペプチ
ドに少なくとも９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９
８％、または９９％同一である、ポリペプチドを含み、また少なくとも３０アミ
ノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有する、そのようなポリ
ペプチドの一部もまた含む。

【００６９】 本発明のポリペプチドはまた、リーダーを含む寄託されたＰＴＨ３Ｒ ｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチド、リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）、リーダーを含む
図２（配列番号４）のポリペプチド、リーダーを含まない図４（配列番号４）の
ポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、配列番号４のアミノ酸およそ
１〜およそ５４２のアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号４のアミノ酸およそ
２〜およそ５４２のアミノ酸を含むポリペプチド、ならびに上記のポリペプチド
に少なくとも９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８
％、または９９％同一である、ポリペプチドを含み、また少なくとも３０アミノ
酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有する、そのようなポリペ
プチドの一部も含む。

【００７０】 ＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴＨＲ３Ｒポリペプチドの参照アミノ酸配列
に、例えば、少なくとも９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドに
より、そのポリペプチド配列がＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプタ
ーの参照アミノ酸の１００アミノ酸ごとに５つまでのアミノ酸の変化を含み得る
ことを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列に同一であること
を意図する。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸
配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の５％までが
、欠失または、別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列の合計アミノ酸
残基の５％までの多数のアミノ酸が、その参照配列に挿入され得る。参照配列の
これらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置かまたはカルボキシ末端位
置でか、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残基間で個
々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいずれかで間に散在
する。

【００７１】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図２Ａ（配列番
号２）または図２Ｂ（配列番号４）示されるアミノ酸配列、あるいは寄託された
ｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも５０％、５５％
、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
かどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉ
ｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用し
て従来のように決定され得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば
９５％同一かどうか決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライ
メントプログラムを使用する場合、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に渡って
同一性の百分率が算出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の合計の
数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメーターは設定され
る。

【００７２】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル、または分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカーとして使用され得
る。

【００７３】 以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドはまた、ＰＴＨ１Ｒま
たはＰＴＨ３Ｒの発現を検出するためのアッセイに有用なポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体を惹気するため、またはＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰ
ＴＨ３Ｒレセプターの機能を増強または阻害することが可能なアゴニストおよび
アンタゴニストとして、使用され得る。さらに、このようなポリペプチドは、本
発明に従うアゴニストおよびアンタゴニストの候補でもあるＰＴＨ１Ｒレセプタ
ー結合タンパク質またはＰＴＨ３Ｒレセプター結合タンパク質を「捕獲する」た
めに、酵母のツーハイブリッド系において使用され得る。酵母ツーハイブリッド
系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（
１９８９）に記載される。

【００７４】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピト
ープは、本明細書中で記載されるポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原
性のエピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、タンパク質全体が免疫原
である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗
体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義され
る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に抗原性エピトープの数より
少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。

【００７５】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の
一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、日常的に、その部分的に模倣される
タンパク質と反応する抗血清を誘発し得ることは当該分野では周知である。例え
ば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ
，ＮおよびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａ
ｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タ
ンパク質反応性の血清を惹起可能なペプチドは、タンパク質の一次配列にて頻繁
に表され、単純な化学法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトな
タンパク質のイムノドミナント領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、ア
ミノ末端またはカルボキシ末端にも制限されない。

【００７６】 ゆえに、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）、７７７頁を参照のこと。本発明の抗原性エピトープ保有ペプ
チドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる
、好ましくは少なくとも７個の、より好ましくは少なくとも９個の、最も好まし
くは少なくとも約１５個と約３０個との間の、アミノ酸の配列を含む。

【００７７】 従って、当該分野の当業者は、図２Ａ（配列番号２）および図２Ｂ（配列番号
４）のポリペプチドから、抗原性エピトープ保有領域を選択するために必要な知
識を有する。

【００７８】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来的な方法
により産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチドの迅速な固
層合成の一般的な方法を提供する（個々のアミノ酸のレベルで抗原抗体相互作用
の特異性、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５））。この「同時複数ペプチド
合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらに米国特許第４，６３１，２１１号（Ｈｏ
ｕｇｈｔｅｎら（１９８６））において記載される。

【００７９】 当業者が理解するように、上記の本発明のＰＴＨ１ＲポリペプチドまたはＰＴ
Ｈ３Ｒポリペプチドおよびそれらのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブ
リン（ＩｇＧ）の定常のドメイン部分と組み合わせられ得、キメラポリペプチド
を生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、インビボでの半減期の
増加を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの第一の２つのドメイ
ンおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメイ
ンからなるキメラタンパク質について示された（ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔｒ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ
部分に起因するジスルフィド結合した２量体構造を有する融合タンパク質はまた
、他の分子と結合して他の分子を中和する際に、単量体のＰＴＨ１Ｒタンパク質
またはＰＴＨ３Ｒタンパク質またはタンパク質フラグメント単独より有効であり
得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：３９５８−
３９６４（１９９５））。

【００８０】 （診断および予後） 特定の疾患および障害を有する哺乳動物の特定の組織は、対応する「標準的な
」哺乳動物（すなわち、その疾患を有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合
に、有意に減少したレベルのＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプター
およびｍＲＮＡ（ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターをコードす
る）を発現すると考えられる。さらに、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒ
レセプターの増強されたレベルは、癌を有する哺乳動物由来の特定の体液（例え
ば、血清、血漿、尿、および髄液）において、この疾患を有さない同じ種の哺乳
動物由来の血清と比較した場合に、検出され得ると考えられる。従って、本発明
は、疾患および障害の診断中に有用な診断方法（例えば、哺乳動物の細胞または
体液においてＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターをコードする遺
伝子の発現のレベルをアッセイする工程、および標準のＰＴＨ１Ｒレセプターま
たはＰＴＨ３Ｒレセプターの遺伝子発現レベルとこれらの遺伝子の発現レベルを
比較する工程を包含し、それによって、標準に対するその遺伝子の発現レベルの
低下が、特定の障害の指標である、方法を提供する。

【００８１】 従来の方法に従って、障害の診断がすでになされている場合、本発明は、低下
したＰＴＨ１Ｒ遺伝子またはＰＴＨ３Ｒ遺伝子の発現を示す患者は、この遺伝子
をより高いレベルで発現する患者と比べて、悪化した臨床的な結果を体験する予
後指標として有用である。

【００８２】 「ＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質をコードする遺伝子の発
現レベルをアッセイすること」により、第１の生物学的なサンプルにおけるＰＴ
Ｈ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質のレベルあるいはＰＴＨ１Ｒレセ
プターまたはＰＴＨ３ＲレセプターをコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（
例えば、絶対的なタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡのレベルを決定または評価
することによって）または相対的（例えば、第２の生物学的なサンプル中のＰＴ
Ｈ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡのレベル
と比較することによって）のどちらかで、質的または量的に測定または評価する
ことを意図する。

【００８３】 好ましくは、第１の生物学的なサンプルにおけるＰＴＨ１Ｒタンパク質または
ＰＴＨ３Ｒタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡのレベルは、測定または評価され
、そして標準のＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質のレベルまた
はｍＲＮＡのレベルと比較される（この標準は、癌を有さない個体より得た第２
の生物学的なサンプルより採取される）。当該分野で理解されるように、一度標
準のＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質のレベルまたはｍＲＮＡ
のレベルを知ったら、比較のための標準として繰り返してそれを使用し得る。

【００８４】 「生物学的なサンプル」によって、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒのタンパク質
またはｍＲＮＡを含む、個体、細胞株、組織培養、または他の供給源より得られ
る任意の生物学的なサンプルを意図する。生物学的なサンプルは、ＰＴＨ１Ｒタ
ンパク質またはＰＴＨ３Ｒのタンパク質を含む哺乳動物体液（例えば、血清、血
漿、尿、滑液および髄液）、ならびに卵巣組織、前立腺組織、心臓組織、胎盤組
織、膵臓組織、肝臓組織、脾臓組織、肺組織、乳房組織、神経組織、および臍組
織を含む、を含む。

【００８５】 本発明は、哺乳動物のおける障害を検出するために有用である。特に本発明は
、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターの発現または機能に関与す
る哺乳動物における疾患および障害の診断の間に有用である。ＰＴＨ１Ｒ配列ま
たはＰＴＨ３Ｒ配列および／あるいはＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒの発現のレベ
ルに影響する変異は、発達学的性質、生理学的性質、または神経学的性質の疾患
または障害を有する患者を診断可能である。好ましい哺乳動物は、サル（ｍｏｎ
ｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒト
を含む。特に好ましいのは、ヒトである。

【００８６】 全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載される一工程のチオ
シアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム法を使用して生物学的なサンプ
ルより単離され得る。次いで、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプタ
ーをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を使用してアッセイされ
る。これらは、ノーザンブロット分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０
３−３１２（１９９０））、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング（Ｆｕｊｉｔａら、Ｃ
ｅｌｌ ４９：３５７−３６７（１９８７））、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｆｕｊｉｔ
ａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７−３６７（１９８７））およびリガーゼ連鎖反応
と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。

【００８７】 生物学的なサンプルにおいて、ＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパ
ク質のレベルをアッセイすることは、抗体に基づく技術を使用してなされ得る。
例えば、組織におけるＰＴＨ１Ｒタンパク質またはＰＴＨ３Ｒタンパク質の発現
は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１
９８７））。ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターの遺伝子の発現
を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法は、酵素結合イムノソルベント検定
法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセ
イを含む。

【００８８】 適した標識は当該分野において公知であり、そしてのグルコースオキシダーゼ
のような酵素の標識、およびヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵ Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）、およびテクネチウム（^99m
Ｔｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンのよう
な蛍光標識、およびビオチンを含む。

【００８９】 （ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒのアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターにより誘導
される細胞性の応答を増強または阻害することが可能な化合物を同定するための
スクリーニング法を提供し、その方法は、候補化合物とＰＴＨ１Ｒレセプターま
たはＰＴＨ３Ｒレセプターを発現する細胞を接触させる工程、細胞性応答をアッ
セイする工程、およびその細胞性応答を標準の細胞性応答と比較する工程（標準
は、その候補化合物の不在下で接触させられる場合にアッセイされる）を包含し
；それにより、標準よりも増加した細胞性応答は、その化合物がアゴニストであ
ることを示し、そして標準に対して減少した細胞性応答は、その化合物がアンタ
ゴニストであることを示す。

【００９０】 別の局面では、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３ＲレセプターへのＰＴＨ
またはＰＴＨｒＰの結合に対する候補化合物が有する効果を決定する工程にを包
含する、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングアッセイが、提供さ
れる。特に、この方法は、ＰＴＨポリペプチドまたはＰＴＨｒＰポリペプチドお
よび候補化合物とＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターを接触させ
る工程、およびＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３ＲレセプターへのＰＴＨポ
リペプチドまたはＰＴＨｒＰポリペプチドの結合が、その候補化合物の存在に起
因して増加されるかまたは減少されるかどうかを決定する工程を含む。

【００９１】 「アゴニスト」によって、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプター
の応答（例えば、ｃＡＭＰまたはイノシトールリン酸経路を介したシグナル伝達
）を増強（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）、または増強（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ）可
能な天然に存在する化合物および合成化合物を意図する。「アンタゴニスト」に
よって、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレセプターの応答（例えば、ｃ
ＡＭＰまたはイノシトールリン酸経路を介するシグナル伝達）を阻害可能な天然
に存在する化合物および合成化合物を意図する。任意の本発明の「アゴニスト」
または「アンタゴニスト」の候補が、ＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰＴＨ３Ｒレ
セプターの活性を増強または阻害し得るかどうかは、以下により詳細に記載され
るアッセイを含む、当該分野で公知の競合結合アッセイを使用して決定され得る
。

【００９２】 １つのそのようなスクリーニング手順は、本発明のレセプターを発現するよう
にトランスフェクトされたメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリー
ニング技術は、１９９２年２月６日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９２／０１８１
０に記載される。例えば、リガンドとしてＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの両方および
候補アンタゴニスト（またはアゴニスト）を、このレセプターをコードするメラ
ニン保有細胞と接触させることによって本発明のＰＴＨ１ＲレセプターまたはＰ
ＴＨ３Ｒレセプターポリペプチドの活性化を阻害する（または増強する）化合物
をスクリーニングするために、このようなアッセイは使用され得る。リガンドに
より生成されるシグナルの阻害または増強は、その化合物が、リガンド／レセプ
ターシグナル伝達経路のアンタゴニストまたはアゴニストであることを示す。

【００９３】 他のスクリーニング技術は、例えば、Ｓｃｅｉｎｃｅ ２４６：１８１−２９
６（１９８９年１０月）に記載されるようなレセプターの活性化によって起こる
細胞外のｐＨの変化を測定する系における、レセプターを発現する細胞（例えば
、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。例えば、化合物は、本発
明のＰＴＨ１ＲレセプターポリペプチドまたはＰＴＨ３Ｒレセプターポリペプチ
ドを発現する細胞と接触され得、そして、第２メッセンジャー応答（例えばシグ
ナル伝達またはｐＨ変化）が、その潜在的な化合物がそのレセプターを活性化ま
たは阻害するかを決定するために、測定され得る。

【００９４】 別のこのようなスクリーニング技術は、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプタ
ーをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導入して、このレセプターを
一過的に発現する工程を含む。次いで、このレセプター卵母細胞を、レセプター
リガンドおよびスクリーニングされるべき化合物と接触させ、続いてこのレセプ
ターの活性化を阻害すると考えられる化合物をスクリーニングする場合に、カル
シウムシグナル伝達の阻害または活性化を検出し得る。

【００９５】 別のスクリーニング技術は、このレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤに連
結されている構築物を細胞において発現させる工程を含む。このような細胞とし
ては、内皮細胞、平滑筋細胞、胚性腎臓細胞などが挙げられる。このスクリーニ
ングは、本明細書中上記に記載されるように、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセ
プターの活性化あるいはホスホリパーゼシグナル伝達からのＰＴＨ１ＲまたはＰ
ＴＨ３Ｒレセプターの活性化の阻害によって達成され得る。

【００９６】 別の方法は、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの活性化を阻
害する化合物を、その表面上にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合
の阻害を決定することによってスクリーニングする工程を含む。このような方法
は、真核生物細胞を、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３ＲレセプターをコードするＤＮ
Ａでトランスフェクトし、その結果この細胞が、その表面上でこのレセプターを
発現する工程、およびこの細胞を既知のリガンドの標識化形態の存在下で化合物
と接触させる工程、を含む。このリガンドは、例えば、放射線活性により、標識
され得る。このレセプターに結合される標識化リガンドの量は、例えば、このレ
セプターの放射活性を測定することによって測定される。この化合物が、このレ
セプターに結合する標識化リガンドの減少によって決定されるように、このレセ
プターに結合する場合、標識化リガンドのこのレセプターへの結合は阻害される
。

【００９７】 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング
アッセイは、Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）に記
載される。

【００９８】 従って、さらなる局面において、候補アゴニストまたはアンタゴニストが、Ｐ
ＴＨまたはＰＴＨｒＰへの細胞性応答を増強し得るかまたは阻害し得るかを決定
するためのスクリーニング方法が提供される。この方法は、ＰＴＨ１ＲまたはＰ
ＴＨ３Ｒポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物およびＰＴＨまたはＰＴＨ
ｒＰリガンドと接触させる工程、細胞性応答をアッセイする工程、ならびにこの
細胞性応答を標準の細胞性応答とを比較する工程を包含し、この標準の細胞性応
答は、候補化合物の非存在下でリガンドと接触がなされる場合にアッセイされ、
それにより、標準の細胞性応答を超える増加した細胞性応答は、候補化合物が、
リガンド／レセプターシグナル伝達経路のアゴニストであることを示し、そして
標準の細胞性応答と比較して減少した細胞性応答は、候補化合物がリガンド／レ
セプターシグナル伝達経路のアンタゴニストであることを示す。「細胞性応答を
アッセイする」とは、候補化合物および／またはＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰに対
する細胞性応答を定性的または定量的に測定すること（例えば、細胞増殖または
滴定したチミジン標識における増加または減少を決定または評価すること）を意
図する。本発明によって、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３ポリペプチドを発現する細
胞を、内因的または外因的に投与されたＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかと接
触させ得る。

【００９９】 本発明に従うアゴニストは、天然に存在する化合物および合成化合物（例えば
、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰペプチドフラグメント）あるいはＰＴＨまたはＰＴＨ
ｒＰアゴニストとして挙動することが公知のほかの化合物を含む。好ましいアゴ
ニストとしては、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シ
トシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキサート、およびビ
ンクリスチンのような化学療法剤が挙げられる。他のものとしては、エタノール
およびβ−アミロイドペプチドが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５
７−１４５８（１９９５））。さらなる好ましいアゴニストとしては、ＰＴＨ１
ＲまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに対して惹起されたポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる。

【０１００】 本発明に従うアゴニストとしては、天然に存在する化合物および合成化合物例
えば、ＣＤ４０リガンド、中性アミノ酸、亜鉛、エストロゲン、アンドロゲン、
ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスＥｌＢ、バキュロウイルスｐ３５およ
びＩＡＰ、牛痘ウイルスｃｒｍＡ、エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１、Ｌ
ＭＰ−１、アフリカ豚コレラウイルスＬＭＷ５−ＨＬ、およびヘルペスウイルス
ｙｌ３４．５）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒビタ
ー、および腫瘍プロモーター（例えば、ＰＭＡ、フェノバルビタール、およびα
−ヘキサクロロシクロヘキサン）が挙げられる。

【０１０１】 他の潜在的なアンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アン
チセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって、または三重ヘリ
ックス形成によって、遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス
技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｅｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９
１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｄｅｎｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９８）に考察される。三重ヘリ
ックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６
０（１９９１）において議論される。この方法は、ポリヌクレオチドの相補的Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。

【０１０２】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
を設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する
遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それにより、レセプターの転写お
よび産生を阻止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍ
ＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの
転写をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、そ
の結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、インビボで発現されてレセプター
の産生を阻害し得る。

【０１０３】 本発明に従うさらなるアンタゴニストは、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒフラグ
メントの可溶性形態を含み、これは、全長レセプターの細胞外領域からのリガン
ド結合ドメインを含む。レセプターのこのような可溶性形態（天然に存在するか
または合成であり得る）は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰへの結合について、細胞表
面ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒと競合することによって、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴ
Ｈ３Ｒ媒介性シグナル伝達を拮抗する。これらは、好ましくは、二量体または三
量体として発現される。なぜなら、これらは、アンタゴニストとして可溶性レセ
プターの単量形態（例えば、ＩｇＧＦｃ−ＰＴＨ１ＲまたはＩｇＧＦｃ−ＰＴＨ
３Ｒレセプターファミリー融合）より優れていることが示されているからである
。

【０１０４】 （投与の形式） 個体におけるＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプター活性の標準的または正常
レベルにおける減少によって生じる状態は、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒタンパ
ク質の投与によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はさらに、
増加したレベルのＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプター活性が必要な個体を処
置する方法を提供し、この方法は、このような個体に、このような個体において
ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプター活性レベルを増加するに有効な、有効量
の本発明の単離されたＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドを含む薬学的組
成物を投与する工程を包含する。

【０１０５】 本発明はまた、増加したレベルのＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプター活性
が必要な個体を処置する方法に関し、この方法は、このような個体に、有効量の
ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒについてのアゴニストを含む薬学的組成物を投与す
る工程を包含する。本発明はさらに、減少したレベルのＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ
３Ｒレセプター活性が必要な個体を処置する方法に関し、この方法は、このよう
な個体に、有効量のＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒについてのアンタゴニストを含
む薬学的組成物を投与する工程を包含する。

【０１０６】 一般的な提案として、用量あたりの非経口投与されるＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ
３Ｒポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストの薬学的に有効
な総量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のよ
うに、これは、治療的裁量に供される。さらに好ましくは、この用量は、ヒトに
ついて、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、および最も好ましくは、約０．０
１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続して与えられる場合、
ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時
間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度にて、１日あたり１〜４回の注射または
連続皮下注入（例えば、ミニポンプを用いる）のいずれかによって投与される。
静脈内バッグ溶液もまた、使用され得る。

【０１０７】 本発明のＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒポリペプチドあるいはそのアゴニストま
たはアンタゴニストを含む薬学的組成物は、経口的に、直腸的に、非経口的に、
槽内的に、膣内的に、腹腔内的に、局所的に（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮
パッチによって）、口腔内に、または経口もしくは経鼻スプレーとして、投与さ
れ得る。「薬学的に受容可能なキャリア」は、非毒性固体、半固体もしくは液体
充填剤、希釈剤、被包化材料または任意の型の形成補助剤を意味する。用語「非
経口的」とは、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内
、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の形式をいう。

【０１０８】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に価値がある。配列が、個々のヒト染色
体の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズし得る
。本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピングは、疾患に関連する遺伝子とそれ
らの配列の相関における重要な第１工程である。

【０１０９】 この点に関する特定の好ましい実施形態において、本明細書中に開示されるｃ
ＤＮＡは、ＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ３Ｒレセプター遺伝子のゲノムＤＮＡをクロ
ーニングするために使用される。これは、種々の周知の技術およびライブラリー
を使用知れ達成され得るが、このライブラリーは、一般に市販されている。次い
で、このゲノムＤＮＡは、この目的のための周知の技術を使用して、インサイチ
ュ染色体マッピングのために使用される。さらに、いくつかの場合において、配
列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることによって、染色体にマッピングされ得る。この遺伝子の３’未翻訳領域の
コンピューター分析は、ゲノムＤＮＡ中の１つより多いエキソンにわたらないプ
ライマーを迅速選択するために使用され、従って、増幅プロセスを複雑化する。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングのために使用される。

【０１１０】 ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１つの工程において正確な染色体位置を提供す
るために使用され得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡか
らのプローブとともに使用され得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら
、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９８８）を参照のこと。

【０１１１】 一旦、配列が、正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物
理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｅｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｔａｎｃｅ Ｉｎ
Ｍａｎに見出され、Ｊｈｏｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能である
。次いで、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患との間の関係は
、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）
）と通じて同定される。

【０１１２】 次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡ配列またはゲノム
配列における差異を決定することが必要である。変異が、いくらかまたは全ての
罹患した個体において観察されるが、任意の正常な個体においては観察されない
場合、この変異は、おそらく疾患原因因子である。

【０１１３】 本発明を一般的に記載してきたが、同じものが、以下の実施例（これは、例示
のために提供され、限定することは意図されない）を参照することによってより
容易に理解される。

【０１１４】 （実施例） （実施例１：ゼブラフィッシュＰＴＨ１Ｒおよび新規な３型レセプターである
ＰＴＨ３ＲをコードするゲノムＤＮＡクローンの単離） ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡならびにいくつかの縮重正方向および逆方向プ
ライマー（図１）を使用して、それぞれ、約２００および８４０ｂｐの２つの個
別の産物を、ストリンジェントな条件下で得た。ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣ
Ｒ（ｎＰＣＲ）のための正方向（Ｆｏｒ）および逆方向（Ｒｅｖ）縮重プライマ
ー（ＭＧＨ Ｐｌｙｍｅｒ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成された）は
、以前に単離された哺乳動物およびカエルのＰＴＨ１Ｒ配列に基づいた。プライ
マーを、エキソンＭ６／７（これは、哺乳動物において、第３の細胞外ループお
よび膜貫通（ＴＭ）ヘリックス７のアミノ末端部分をコードする）およびエキソ
ンＭ７（これは、ＴＭ７のカルボキシ末端部分および細胞内テイルの開始をコー
ドする）に位置した（Ｋｏｎｇら、（１９９４）；Ｓｃｈｉｐａｎｉら、（１９
９５））（図１）。

【０１１５】 第１のＰＣＲ反応のためのプライマーは、以下である：Ｆｏｒ Ｍ６ａ（５’
ＴＴＹＧＧＩＧＴＳＣＡＹＴＡＹＡＴＨＧＴＶＴＴ；（配列番号２６）５７６倍
縮重）またはＦｏｒ Ｍ６ｂ（５’ＧＴＳＹＴＢＲＴＧＣＣＩＣＴＨＹＴＹＧＧ
（配列番号６）１１５２倍縮重）、およびＲｅｖＭ７（ＣＴＣＤＣＣＡＴＴＲＣ
ＡＧＷＡＲＣＡＧＴＡＤＡＴ；（配列番号７）７２倍縮重）（図１）。ＰＣＲを
、１ｍｇのゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ゲノムＤＮＡ、Ｇｉｂ
ｃｏ Ｔａｑ（５ユニット）、および以下のＰＣＲプロフィール［９５℃にて３
分間、開始変性（９４℃にて１分間変性、５０℃にて１分間アニール、そして７
２℃にて４〜６分間重合化）を３５サイクル］を使用して、ＭＪリサーチサーマ
ルサイクラー（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）にて行った。ｎＰＣＲを、２μｌの
１：１００希釈した開始ＰＣＲ産物を、縮重ネスト化プライマーＲｅｖ Ｍ７＃
２（５’ＧＴＡＤＡＴＲＡＴＤＧＭＭＡＣＡＡＡＲＡＡＤＣＣ；（配列番号８）
４３２倍縮重）とともに使用し、そして以前と同じＰＣＲプロフィールを使用し
て、Ｆｏｒ Ｍ６ａまたはＦｏｒ Ｍ６ｂのいずれかを用いて行った（図１）。
ｎＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドを用いて１．５％アガロースゲル上で同
定し、そして約２１０ｂｐおよび８５０ｂｐのＤＮＡ種を切り出し、スピンカラ
ム（Ｂｉｏ１０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によってスピンし、一晩エタノー
ル沈殿させ［（１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加した、２容量のエタノ
ール、１μｌのグリコーゲン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄ
ｅｎ）］、そしてｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に連
結した。コンピテントなＤＨ５ａ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の形質転換の後、単一のコロニーからのプラスミドＤＮ
Ａを、標準的なプロトコルを使用して精製し、そして³³Ｐサイクル配列決定（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）によって、８Ｍ
尿素６％ポリアクリルアミドフィールド勾配ゲル（Ｒｕｂｉｎら、１９９８）上
で配列決定した。ＤＮＡ配列（Ｆｏｒ Ｍ６ａまたはＦｏｒ Ｍ６ｂを使用して
ネスト化したＰＣＲから）を、ＧＣＧパッケージプログラム（ＧＣＧ，Ｕｎｉｖ
．ＷＩ）によって分析し、続いて、それぞれ、ｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ６／７）／Ｇ
ＥＭ−ＴおよびｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ６／７）／ＧＥＭ−Ｔと称した。

【０１１６】 ヌクレオチド配列分析は、両方のクローンが、その５’および３’末端で、ｈ
ｐＴＨ１Ｒと有意な相同性を示したことを明らかにした（それぞれ、７８％およ
び７３％同一性）。クローン＃１（ｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ６／７））は、８４ｂｐ
のイントロン性配列（８１ｂｐのｈｐＴＨ１Ｒと比較して）を含んだが（Ｓｃｈ
ｉｐａｎｉら、（１９９５））、クローン＃２（ｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ６／７））
は、７００ｂｐを超えるイントロンを含んだ。これらの発見は、２つの個別の遺
伝子の部分が単離され、その両方が、ＰＴＨ２Ｒとの相同性より高いＰＴＨ１Ｒ
との相同性（それぞれ、６４％および７０％同一性）を共有することを示した。

【０１１７】 （実施例２：ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒをコードする部分ｃＤＮＡクロ
ーンの単離） 成体ゼブラフィッシュからの総ＲＮＡを、以前に記載（Ｒｕｂｉｎら、（１９
９９））の通りに単離し、そしてテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｉｂｃｏ
）に使用した。ＲＴ−ＰＣＲのためのＦｏｒプライマーおよびＲｅｖプライマー
は、哺乳動物エキソンＭ６／７およびＭ７に対応するｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴ
Ｈ３ＲゲノムＤＮＡ配列（それぞれ、ｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ６／７）／ＧＥＭ−Ｔ
およびｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ６／７）／ＧＥＭ−Ｔ（図１））のいずれかに基づい
た。逆転写（ＲＴ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ ＲＮＡａｓｅＨ^-逆転写
酵素および５μｇの総ＲＮＡを、それぞれｚＰＴＨ１Ｒ／Ｒｅｖ ６（１）（５
’ＧＣＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ）（配列番号９）また
はｚＰＴＨ３Ｒ／Ｒｅｖ ６（１）（５’ＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡ
ＧＣＡＴＣＴＣ（配列番号１０）とともに用いて４２℃にて行った。ＰＣＲを、
Ｆｏｒ ３１３（５’ＡＣＭＡＡＣＴＡＣＴＡＹＴＧＧＡＴＹＣＴＧＧＴＧ（配
列番号１１）；８倍縮重）および２つのＲｅｖ６（１）プライマーのいずれかを
用いて、Ｇｉｂｃｏ Ｔａｑ（５ユニット）および以下のＰＣＲプロフィール［
９５℃にて３分間、開始変性（９４℃にて１分間変性、５６℃にて１分間アニー
ル、そして７２℃にて２分間重合化）を３５サイクル）］を使用して行った。ｎ
ＰＣＲを、開始ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒ ＲＴ−ＰＣＲ産物からの２μ
ｌの１：１００希釈物、およびｚＰＴＨ１Ｒ／Ｒｅｖ ６（２）（５’ＡＧＡＡ
ＡＣＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＧＣ）（配列番号１２）またはｚＰＴＨ
３Ｒ／Ｒｅｖ ６（２）（５’ＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＡＡ
ＴＧ）（配列番号１３）のいずれか、およびＦｏｒ ３１３プライマーを用いて
、３５サイクル以外は以前のＰＣＲプロフィールを使用して行った。

【０１１８】 ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒ産物を、エチジウムブロマイドを用いて１．
５％アガロースゲル上で同定し、約４５ｂｐのｃＤＮＡ種を上記の通りにｐＧＥ
Ｍ−Ｔにクローニングして、それぞれ、ｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ３／６）／ｐＧＥＭ
ＴおよびｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ３／６）／ｐＧＥＭＴを得た。

【０１１９】 （実施例３：ｚＰＴＨ１Ｒをコードする全長ｃＤＮＡの単離） ＲＴ−ＰＣＲは、Ｆｏｒ３１３およびｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ６／７）に特異的な
プライマーを使用して、４５０ｂｐのｃＤＮＡであるｚＰＴＨ１Ｒ（ＴＭ３／６
）（哺乳動物ＰＴＨ１ＲのＴＭ３からＴＭ６に対応する）を産生した。続いて、
５’および３’ＲＡＣＥ反応を行って、重複配列を生成し、そして全長ｚＰＴＨ
１Ｒクローンを、唯一のＭｆｅＩエンドヌクレアーゼ制限部位を使用して構築し
た（図１）。

【０１２０】 ５’および３’ＲＡＣＥ反応（Ｇｉｂｃｏ）を、総ＲＮＡ、およびｚＰＴＨ１
Ｒ（ＴＭ３／６）／ｐＧＥＭＴヌクレオチド配列に基づくプライマーを使用して
行った。５’ＲＡＣＥについてのＲＴを、Ｒｅｖ６（２）を使用したことを除い
て上記の通りに行った。第１の５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを、Ｒｅｖ６（３）（５’
ＧＡＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡ）（配列番号１４）、Ｇｉ
ｂｃｏ Ｔａｑ（２．５ユニット）、および以下のＰＣＲプロフィール［９５℃
にて３分間、開始変性（９４℃にて１分間変性、５５℃にて１分間アニール、そ
して７２℃にて２分間重合化）を７サイクル、続いて６４℃のアニーリングを２
８サイクル］を用いて行った。第１のｎＰＣＲを、以前のＰＣＲからの５μｌの
１：１００希釈物、Ｒｅｖ ＴＭ５プライマー（５’ＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＣＴ
ＧＧＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴ）（配列番号１５）、（ＫｌｅｎＴａｑ、５．０ユニ
ット）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）、および以下のＰＣＲプロフィール［９５℃
にて３分間、開始変性（９４℃にて１分間変性、６２℃にて１分間アニール、そ
して７２℃にて２分間重合化）を３５サイクル｝７２℃にて１０分間の最終伸長
］を用いて行った。第２のｎＰＣＲを、第１のｎＰＣＲからの５μｌの１：１０
０希釈物、Ｒｅｖ ４×プライマー（５’ＣＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＡＡ
ＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣ）（配列番号１６）、Ｇｉｂｃｏ Ｔａｑ（５．０ユニッ
ト）および第１のｎＰＣＲと同じＰＣＲプロフィールを用いて行った。第２のｎ
ＰＣＲ産物を、上記の通りに精製し、そしてｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）に連結して、ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の
転写のためのｚＰＴＨ１Ｒ（５’）／ｐＧＥＭＴｅａｓｙを得た。

【０１２１】 ３’ＲＡＣＥについて、ＲＴを、以前の通りだが、オリゴｄＴアンカープライ
マー（Ｇｉｂｃｏ）を用いて行った。ＰＣＲを、Ｆｏｒ ＴＭ３プライマー（５
’ＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣ）（配列番号１７）、Ｇ
ｉｂｃｏ Ｔａｑ（２．５ユニット）、および以下のプロフィール［９５℃にて
３分間、開始変性（９４℃にて１分間変性、６４℃にて１分間アニール、そして
７２℃にて３分間重合化）を３５サイクル｝７２℃にて１０分間の最終伸長］を
用いて行った。ｎＰＣＲを、以前のＰＣＲプロフィールを、以前のＰＣＲからの
５μｌの１：１００希釈物、およびＦｏｒ ４（１）（５’ＡＧＧＡＡＧＴＡＣ
ＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡ）（配列番号１８）とともに用いて行った。３’Ｒ
ＡＣＥ ｎＰＣＲ産物を精製し、そしてクローニングして、ｚＰＴＨ１Ｒ（３’
）／ｐＧＥＭＴｅａｓｙを得た。

【０１２２】 ｚＰＴＨ１Ｒ（５’）／ｐＧＥＭＴｅａｓｙおよびｚＰＴＨ１Ｒ（３’）／ｐ
ＧＥＭＴｅａｓｙのＭｉｄｉｐｒｅｐ ＤＮＡを、Ｍｆｅ ＩおよびＮｄｅ Ｉ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で消化し
、そしてｚＰＴＨ１Ｒ（３’）由来の１．０Ｋｂのフラグメントを、ｚＰＴＨ１
Ｒ（５’）／ｐＧＥＭＴｅａｓｙ由来の約４．５Ｋｂのフラグメントに連結して
、全長ｚＰＴＨ１Ｒクローンである、ｚＰＴＨ１Ｒ（ＦＬ）／ｐＧＥＭＴｅａｓ
ｙを得た。ｚＰＴＨ１Ｒ（ＦＬ）／ｐＧＥＭＴｅａｓｙプラスミドＤＮＡを、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の
対応する部位中にクローニングして、ｚＰＴＨ１Ｒ（ＦＬ）／ｐＧＥＭ３を得た
。続いて、ｚＰＴＨ１ＲのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩフラグメント（コード領域全体
を含むｚＰＴＨ１Ｒ（ＦＬ）／ｐＧＥＭ３のインサート由来）を、ｐｃＤＮＡＩ
／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の対応する部位中にクローニングして、ｚＰ
ＴＨ１Ｒ（ＦＬ）／ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（ｚＰＴＨ１Ｒ）を得た。

【０１２３】 ５’ＲＡＣＥ反応は、２つのＰＣＲ産物（同一のＫｏｚａｋ配列およびコード
領域（推定シグナル配列を含む）を含む）を生成したが、５’ＵＴの長さが変化
した；５’ＲＡＣＥ＃２９は１４９ｂｐであり、５’ＲＡＣＥ＃２５は３９１ｂ
ｐであった。両方のクローン（ｚＰＴＨ１Ｒ＃２５およびｚＰＴＨ１Ｒ＃２９）
を、放射リガンドアッセイ、総ＩＰ生成およびｃＡＭＰ蓄積によって特徴付けた
。

【０１２４】 ｚＰＴＨ１Ｒ ｃＤＮＡ（５３６残基、図２Ａ）によってコードされるアミノ
酸配列は、カエルＰＴＨ１Ｒおよび哺乳動物ＰＴＨ１Ｒに対する最高の配列相同
性を示した（Ｂｅｒｗｉｔｚら（１９９８）；Ｋｏｎｇら（１９９４））。ｈＰ
ＴＨ１Ｒに対するアミノ酸配列全体の相同性は、７６％であったが、ｈＰＴＨ２
Ｒと比較した場合には６８％に過ぎなかった。哺乳動物ＰＴＨ１Ｒと類似して、
ｚＰＴＨ１Ｒの３’非コード領域は、代表的なポリアデニル化シグナル配列を含
まなかったが、しかし、不完全な配列が、ポリＡ_(n)テイルの４９ｂｐ上流に見
出された（ＴＡＴＡＡＡ）。

【０１２５】 （実施例４：ｚＰＴＨ３Ｒをコードする全長ｃＤＮＡの単離） ゲノムクローンであるｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ６／７）は、５’末端および３’末
端で、ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ２Ｒに類似しているが異なるヌクレオチド配
列を含み、そして、イントロン配列の約７００ｂｐ（８４ｂｐではなく）を含ん
だ。この情報は、新規な遺伝子の部分が単離されたことを示し、続いて、ｚＰＴ
Ｈ３Ｒといわれた。Ｆｏｒ３１３およびｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ６／７）に特異的な
プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲは、４５０ｂｐのｃＤＮＡクローンであるｚ
ＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ３／６）を生成した。これは、ｚＰＴＨ３ＲのＴＭ３〜ＴＭ６
をコードする。

【０１２６】 ゼブラフィッシュ１ ｇｔｌ １ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）を、ｚＰＴＨ３Ｒ（ＴＭ３／６）／ｐＧＥＭＴからのＰＣＲによって生成した
４５０ｂｐの³²Ｐ放射標識化ｃＤＮＡプローブを使用する、プラークハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングした。１．５×１０⁶ｐｆｕを有するフィ
ルターを、５０％ホルムアミド中で（４２℃で１８時間）ハイブリダイズし（Ｒ
ｕｂｉｎら、１９９９）、そして洗浄を、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて
、室温、５０℃、および５５℃で、それぞれ各３０分間実施した。オートラジオ
グラフィ−を、ＤｕＰｏｎｔ Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンおよびＫｏｄａｋ
ＸＡＲフィルムを用いて、５日間、−７０℃で実施した。単一のファージを、プ
ラーク精製し（ｐｌａｑｕｅ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、そしてλＴＲＡＰファージ
キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐのＥｃｏＲＩ部位
中にサブクローニングして、ｚｅｂ３−３’／ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを得た。

【０１２７】 ５’ＲＡＣＥ反応（Ｇｉｂｃｏ）を、３つの首尾よい逆ｚＰＴＨ３Ｒプライマ
ー：

【０１２８】

【化１】 を使用して、上記の通りに実施した。このｃＤＮＡ産物を、ｐＧＥＭＴ−ＥＡＳ
Ｙに連結し（ｚｅｂ３−５’／ｐＧＥＭＴを生じる）、ミニプレップ（ｍｉｎｉ
ｐｒｅｐ）し、そしてこれらの配列を、ＧＣＧを使用して、既知のＰＴＨレセプ
ターに対する相同性について分析した。インサート（哺乳動物ＰＴＨ１Ｒのシグ
ナル配列に対する相同性を有するヌクレオチド配列を含むように決定された）を
、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＬＩ、およびＮｏｔＩについての部位を使用してｚｅｂ３
−３’／ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ中に連結して、ｚＰＴＨ３Ｒ（ＦＬ）ｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐ（ｚＰＴＨ３Ｒ）を得た。

【０１２９】 １．５×１０⁶のスクリーニングされたＰＦＵから、単一のファージクローン
を同定し、そして２．５Ｋｂのインサートをサブクローニングしてｚｅｂ３−３
’／ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを得た。配列分析は、このクローンが、哺乳動物エキ
ソンＥ１に対応する領域からエキソンＴによってコードされるカルボキシ末端領
域まで、公知のＰＴＨ１Ｒに密接に関連することを示した（Ｋｏｎｇら（１９９
４））。しかし、このアミノ末端をコードするｃＤＮＡ部分、細胞外ドメイン、
および終止コドン直前の３’非翻訳領域のほとんどが、失われていた。ゼブラフ
ィッシュの総ＲＮＡ上での５’ＲＡＣＥは、いくつかの推定スプライス改変体の
存在を示した。このことは、ｚＰＴＨ２Ｒでの知見に類似する（Ｒｕｂｉｎら（
１９９９））。１０個のｚｅｂ３−５’クローンのうちの７つを、哺乳動物のエ
キソンＥ３およびエキソンＥ１に類似するｃＤＮＡ配列を含むと同定した。これ
らは、ＰＴＨ１Ｒのアミノ末端の細胞外ドメインの部分をコードする。これれら
のクローンはまた、Ｋｏｚａｋ配列および哺乳動物ＰＴＨ１Ｒにおいて見出され
たシグナルペプチド配列に対する相同性を有するヌクレオチド配列を含んだ（Ｋ
ｏｎｇら（１９９４）；Ｓｃｈｉｐａｎｉら（１９９５））。他の３つのｚｅｂ
３−５’クローン（これはまた、Ｅ３等価物およびＥ１等価物を含んだ）は、異
なる５’末端を有した。そして従って、推定スプライス改変体を示し得る。ｚＰ
ＴＨ２Ｒ（Ｒｕｂｉｎら（１９９９））およびヒトＰＴＨ１Ｒ（Ｊｏｕｎら（１
９９７）、Ｂｅｔｔｏｕｎら（１９９７））に類似して、これらのｚＰＴＨ３Ｒ
推定スプライス改変体の１つは、シグナルペプチド配列を欠如したが、しかし、
エキソンＥ１等価物の上流に２つの開始ＡＵＧコドンを含んだ。第２の推定スプ
ライス改変体は、Ｋｏｚａｋ配列、開始ＡＵＧを欠如し、そしてＥ１の等価物の
上流に高度に変化した配列（これは、シグナルペプチドを示すようである）を含
んだ。Ｋｏｚａｋ配列、インフレームＡＵＧ、およびｚＰＴＨ１Ｒに対する相同
性を有する５’コード領域を含んだこれらのクローンのみを、ｚｅｂ３−３’／
ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐのＡｐａＬＩ部位中に連結して、全長ｚＰＴＨ３Ｒを得た
（図１）。

【０１３０】 全体として、この新規なレセプターによってコードされる配列（５４２残基、
図２Ｂ）は、ｚＰＴＨ１Ｒと６６％のアミノ酸類似性および５９％のアミノ酸同
一性を共有したが、ｚＰＴＨ２Ｒとは５５％の類似性を共有したに過ぎなかった
。カエルＰＴＨ１Ｒ、ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒに類似して、エキソンＥ
２によってコードされるｃＤＮＡの等価物を欠如し、このことは、この非必須の
エキソンの出現が，哺乳動物の進化的革新を示すことを示唆する（Ｌｅｅら（１
９９４））。

【０１３１】 この哺乳動物Ｅ２子孫形（ａｐｏｍｏｒｐｈｙ）と対照的に、ｚＰＴＨ１Ｒお
よびｚＰＴＨ３Ｒは、Ｇタンパク質共役型レセプターのこのファミリーの全ての
既知の哺乳動物および非哺乳動物メンバーと同じ８つの細胞外システイン、なら
びにいくつかの他の「指示（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）残基」を含む（Ｇタンパク質
共役型レセプターデータベース：Ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｒｄｂ．ｕｔｈａ
ｃｓａ．ｅｄｕ）。しかし、ｚＰＴＨ１ＲとｚＰＴＨ３Ｒとの間に、潜在的なＮ
グリコシル化についてのコンセンサス配列（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ）の数
における差異が、存在する：全てのゼブラフィッシュＰＴＨレセプターについて
は、２つのみが保存される（図２Ｃ）。さらに、細胞内テイル残基の分析は、こ
の領域が、ＰＴＨレセプターサブタイプ間でより高い割合の配列バリエーション
を有し、そしてそれゆえに、さらなる比較について使用されることを示す（表２
）。例えば、この領域におけるｚＰＴＨ１ＲとｈＰＴＨ１Ｒとの間の相同性は、
５６％であり、これは、ｚＰＴＨ２ＲおよびｈＰＴＨ２Ｒについての５８％のア
ミノ酸類似性に類似する。対照的に、ｚＰＴＨ３Ｒのテイル領域とｈＰＲＨ１Ｒ
のテイル領域との間の相同性は、３８％であり、そしてｈＰＴＨ２Ｒと比較した
場合は、２８％である（表２）。従って、ｚＰＴＨ３Ｒを、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ
レセプターファミリーにおける新規なメンバーとして同定した。

【０１３２】 （実施例５：ＣＯＳ−７細胞におけるｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒの機能
的特徴付け） ２つの全長ｚＰＴＨ１Ｒ（＃２５および＃２９）ならびにｚＰＴＨ３Ｒをコー
ドするプラスミドＤＮＡを、ＣＯＳ−７細胞中で一過的に発現した。ＣＯＳ−７
アフリカミドリザル腎臓細胞（２４ウェルプレート中に約２００，０００細胞／
ウェル）を、上記のように、培養し、そしてプラスミドＤＮＡ（２００ｎｇ／ウ
ェル）を用いてトランスフェクトした（Ｒｕｂｉｎら（１９９８））。トランス
フェクション後、細胞を、毎日培地を交換しながら３７℃で７２時間培養し、続
いて、これらが９６時間後に機能的に評価されるまで、さらに３３℃で２４時間
培養した（Ｇａｒｄｅｌｌａら（１９９７））。

【０１３３】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒのいずれかを発現するＣＯＳ−７細胞を用い
る放射リガンド研究を、¹²⁵Ｉ標識化［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］ｒＰＴＨ−（１
−３４）アミド（ｒＰＴＨ）（配列番号２２）または¹²⁵Ｉ標識化［Ｔｙｒ³⁶］
ｈＰＴＨｒＰ−（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ）（配列番号２３）のいずれか
、および漸増濃度の［Ｔｙｒ³⁴］ｈＰＴＨ（１−３４）アミド（ＰＴＨ）（配列
番号２４）または［Ｔｙｒ³⁶］ｈＰＴＨｒＰ（１−３６）アミド（ＰＴＨｒＰ）
（配列番号２５）のいずれかを使用して、上記の通りに実施した（Ｂｅｒｗｉｔ
ｚら（１９９７））。ペプチドを、Ｇａｒｄｅｌｌａら（１９９６）に記載され
るようにＭＧＨポリマーコアファミリーによって合成した。特異的結合を、結合
全体から、過剰な非標識ペプチドの存在における放射リガンド結合を減じること
によって算出した。全ての点は、２つ以上の独立な実験からの２〜３回の繰り返
しの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。ＩＣ₅₀値（放射リガンド結合の５０％阻害を生
じる競合リガンドの用量）を、以前に記載される通りに算出した（Ｇａｒｄｅｌ
ｌａら（１９９６））。

【０１３４】 ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒを発現するＣＯＳ−７細胞のアゴニスト依存
性ｃＡＭＰ蓄積を評価するために、実験を、漸増濃度のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ
のいずれかの存在下で刺激されるＣＯＳ−７細胞を用いて２４ウェルプレートで
行い、そして細胞内ｃＡＭＰを、記載される通りに決定した（Ｂｅｒｇｉｗｔｚ
ら（１９９８））。ＥＣ₅₀値を、以前に記載される通りに決定した（Ｇａｒｄｅ
ｌｌａら（１９９６））。

【０１３５】 ｚＰＴＨ１Ｒ、ｚＰＴＨ３ＲおよびｈＰＴＨ１Ｒを発現するＣＯＳ−７細胞に
ついての総イノシトールホスフェート代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）を決定する
ために、細胞を、ＣＯＳ−７細胞を用いて６ウェルプレートで増殖した（ｚＰＴ
Ｈ１Ｒ、ｚＰＴＨ３ＲまたはｈＰＴＨ１Ｒのいずれかの１μｇ／ウェルを用いて
トランスフェクトした約２００，００細胞／ウェル（ｓｔｉｎａ））。細胞を、
毎日培地を交換しながら、３７℃でＤＭＥＭ／７％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で
３日間培養した。次いで、この細胞を、イノシトール非含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃ
ｏ）／７％ＦＢＳ中で、３μＣｉ／ｍｌのｍｙｏ−［³Ｈ］イノシトール（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともにプレロー
ディング（ｐｒｅｌｏａｄ）した（３３℃で１８時間）。翌日、プレートをリン
スし、次いで、３０ｍＭ ＬｉＣｌの存在下で、ＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中で
ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰのいずれかの１０^-6Ｍとともにか、またはＤＭＥＭ／０．１
％ＢＳＡ単独で、インキュベートした（３７℃で４０分）。総イノシトールホス
フェート（ＩＰ）を、以前に記載される通りに（Ｉｉｄａ−Ｋｌｅｉｎら（１９
９４および１９９５））、アニオン交換カラムクロマトグラフィーによって単離
し、そして１ｍｌの溶出物（総量の１／８）を、液体シンチレーションカウンタ
ー（モデルＬＳ ６０００ＩＣ、Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）
中で計数した。全ての点は、２つ以上の独立な実験からの２〜３回の繰り返しの
平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。

【０１３６】 両方のｚＰＴＨ１Ｒクローンは、放射標識化ｒＰＴＨおよび放射標識化ＰＴＨ
ｒＰの高親和性結合を示した（表２、図４）。明らかに、より短い５’ＵＴに起
因して、ｚＰＴＨ１Ｒ＃２９は、＃２５と比較して、わずかに高い発現レベルお
よびより高い最大ｃＡＭＰ蓄積を示した（ｈＰＴＨｒＰについて１０１．６ｐｍ
ｏｌｅ／ウェルおよびｈＰＴＨについて１０６．２ｐｍｏｌｅ／ウェル、対、ｈ
ＰＴＨｒＰについて９２．４ｐｍｏｌｅ／ウェルおよびｈＰＴＨについて９０．
４ｐｍｏｌｅ／ウェル；表２を参照のこと）が、さもなければ、両方のクローン
は、識別不可能であった。従って、ｚＰＴＨ１Ｒ＃２９についての機能的データ
のみが、提示される（図３、表３）。興味深いことに、ｚＰＴＨ３Ｒは、放射標
識化ＰＴＨｒＰについて、ｒＰＴＨよりもより高い特異的結合を示した。さらに
、ｚＰＴＨ３Ｒは、ＰＴＨｒＰについて、ＰＴＨよりもより高い見かけのＫｄを
示した（それぞれ、約３ｎＭ対約１００ｎＭ）。これらの結果は、ｚＰＴＨ３Ｒ
が、ＰＴＨｒＰと優先的に相互作用することを示す。

【０１３７】 これらの結合データと類似して、ｚＰＴＨ１Ｒを発現するＣＯＳ−７細胞は、
ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかに応答するｃＡＭＰ蓄積について非常に類似
したＥＣ₅₀を示した。これは、哺乳動物ＰＴＨ１Ｒでの知見と類似する（ＥＣ₅₀ ：ＰＴＨについて０．８±０．０３ｎＭおよびＰＴＨｒＰについて０．３±０．
０４ｎＭ、表２）。ｚＰＴＨ３Ｒは、より高い最大ｃＡＭＰ蓄積を示した（ＰＴ
Ｈについて２８５．４ｎＭおよびＰＴＨｒＰについて２２７．４ｎＭ）が、ｚＰ
ＴＨ１Ｒとは対照的に、ｚＰＴＨ３Ｒは、ＰＴＨについて減少した効力を示した
（ＥＣ₅₀：ＰＴＨについて５．９８±０．２４ｎＭおよびＰＴＨｒＰについて０
．４９±０．１７ｎＭ、表２、図４）。さらに、ＰＴＨｒＰによって、より有効
に活性化されることに加えて、ｚＰＴＨ３Ｒは、１０^-11Ｍで有意な活性を示し
た（図４）。これらの結果は、ｚＰＴＨ３ＲがＰＴＨｒＰと優先的に相互作用す
ることを示した放射レセプター研究を確証した。

【０１３８】 哺乳動物ＰＴＨ１Ｒと類似して、ｚＰＴＨ１Ｒを発現するＣＯＳ−７細胞は、
ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰのいずれかで刺激される場合に、ＩＰ蓄積の等価な増加
（２倍）を示した。対照的に、より高い発現レベルにもかかわらず、いずれのリ
ガンドを用いてチャレンジされる場合にも、ＩＰは蓄積されなかった（図５）。
このセカンドメッセンジャーによるシグナル伝達の欠如は、ｚＰＴＨ３Ｒの第２
の細胞内ループにおける有意な構造的変化に関連し得る（図４）。ラットＰＴＨ
１Ｒを用いる以前の研究は、レセプターのこの部分が、ＩＰシグナル伝達に重要
であることを示した。なぜなら、この「ＥＫＫＹ」カセット中のいくつかの残基
の置換が、ホスホリパーゼＣ活性化を減じるかまたは消失させるかのいずれかで
あったからである。ｚＰＴＨ１Ｒは、哺乳動物ＥＫＫＹの代わりに、保存された
ＤＲＫＹｈ配列を含むが、ｚＰＴＨ３Ｒの対応するアミノ酸残基は、ＤＫＮＣで
ある（図３）。従って、この２つの最も重要な残基は、新規なレセプターにおい
て変更され、これは、ｚＰＴＨ３Ｒのシグナル伝達選択性を説明し得る。従って
、ｚＰＴＨ３Ｒは、天然に存在するＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターであり、これ
は、ＩＰを通じてシグナル伝達し得るようである。

【０１３９】 （実施例６：ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡのサザンブロット分析） ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒが別個の遺伝子によってコードされることを
確認するために、稀に切断する３つの制限エンドヌクレアーゼを利用して、ゼブ
ラフィッシュゲノムＤＮＡを完全に消化した（データは示さず）。約１６μｇの
ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩ
Ｉのいずれかで完全に消化して、エチジウムブロマイドを含有する０．８％アガ
ロースゲルによる電気泳動のために２つの等量のアリコートに分け、そしてニト
ロセルロース膜（ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上に転写した。８０
℃で２時間、真空下で熱した後、このブロットを、ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ
３Ｒのいずれかのカルボキシ末端テイル（それぞれ、２４０ｂｐおよび３３５ｂ
ｐ）をコードするＰＣＲ生成³²Ｐ標識化プローブ（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒおよび
Ｓｏｍｍｅｒ，１９８９）とともに、５０％ホルムアミド中でハイブリダイズし
た（４２℃で１８時間）。洗浄を、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温および
４２℃で各３０分間、ならびに０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５０℃で実
施し、続いて、ＤｕＰｏｎｔ Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンおよびＫｏｄａｋ
ＸＡＲフィルムを用いて、７日間、−７０℃でオートラジオグラフィーを実施し
た。

【０１４０】 いずれかのレセプターのＴＭ３〜ＴＭ６に対応するプローブを使用する、最初
のサザンブロットデータは、これらのプローブが、互いの遺伝子とまたは密接に
関連する遺伝子と交叉反応することを示す、複数のハイブリダイズするＤＮＡ種
を示した（データは示さず）。いずれかのサブタイプについての特異性を増大す
るために、ハイブリダイゼーションを、各レセプターのテイル領域、ｚＰＴＨ１
Ｒ／テイルまたはｚＰＴＨ３Ｒ／テイル、のみを含む放射標識化プローブを用い
て実施し、これは、ＰＴＨレセプターサブタイプ間の配列バリエーションの最高
の割合を示した。各々の消化について、このテイルのプローブは、ストリンジェ
ントな条件下で、ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒをコードする別個の遺伝子を
示す、単一であるが異なるゲノムＤＮＡフラグメントにハイブリダイズした（デ
ータは示さず）。

【０１４１】 （実施例７：全ての公知のＰＴＨＲの系統発生的分析および構造的分析） 公知のｚＰＴＨ１Ｒ、ｚＰＴＨ２Ｒ、キンギョＶＩＰレセプター（＃Ｕ５６３
９１）およびヒトＣＲＦレセプター（＃Ｐ３４９９８）の配列のアラインメント
を、以前に記載の通りに実施した（Ｒｕｂｉｎら（１９９９））。続いて、配列
を、ＭａｃＣｌａｄｅ ３．０（ＭａｄｄｉｓｏｎおよびＭａｄｄｉｓｏｎ、１
９９２）内に整列させ、そしてギャップを、ネイティブタンパク質の相同性を最
大にするように与えた。ＰＡＵＰ ３．１（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，１９９３）の分
岐限定検索選択（ｂｒａｎｃｈ−ａｎｄ−ｂｏｕｎｄ ｓｅａｒｃｈ ｏｐｔｉ
ｏｎ）を使用して分析した場合に、各アミノ酸を、非重みつき（ｕｎｗｅｉｇｈ
ｔｅｄ）特徴として処理した。１００個の複製に対する分岐限定選択を使用する
ブートストラッピング分析（Ｈｅｄｇｅｓ（１９９２））を実施し、そして５０
％の主要な役割のコンセンサスと適合性の群のみを保持した（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ
およびＯｌｓｅｎ（１９９０）；Ｓｗｏｆｆｏｒｄ（１９９３））。

【０１４２】 ＧＣＧを、ｚＰＴＨ１Ｒ、ｚＰＴＨ２Ｒ、ｚＰＴＨ３Ｒ、ｈＰＴＨ１Ｒおよび
ｈＰＴＨ２Ｒのテイル領域を比較するために使用した。さらなる分析を、Ｍａｃ
Ｃｌａｄｅ内で実施して、あいまいな残基（これは、各ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセ
プターサブタイプについて特徴依存性であり得る）を決定した（Ｍａｄｉｓｏｎ
およびＭａｄｄｉｓｏｎ、１９９２；Ｓｗｏｆｆｏｒｄ、１９９３；Ｒｕｂｉｎ
ら、１９９９）。

【０１４３】 単一の最も節減した（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）Ｂｏｏｔｓｔｒａｐコンセ
ンサスツリーは、２つの統計学的に有意なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター分岐群
；ＰＴＨ１Ｒ／ＰＴＨ３Ｒ分岐群およびＰＴＨ２Ｒ分岐群（図７）、を示した。
さらに、ＰＴＨ１Ｒ／ＰＴＨ３Ｒ分岐群において、ＰＴＨ３Ｒと有意に異なるＰ
ＴＨ１Ｒ群および、少なくともＰＴＨ１Ｒについて、含まれる末端分岐は、形態
学に基づく系統発生と一致する（Ｐｏｕｇｈら（１９８９））。

【０１４４】 ｚＰＴＨ１ＲとｚＰＴＨ３Ｒとの間のアミノ酸全体の変換は、特に膜貫通領域
において、比較的高いが、一方多変量の分析は、ＰＴＨ３Ｒに特異的であり得る
アミノ酸残基の同定を導いた（図３）。他の種由来のさらなるＰＴＨ３Ｒ配列は
、これらの残基のレセプター特異性について確認する必要があるが、制限された
数のアミノ酸変化は、すでに、それらの機能的重要性（特に、ホスホリパーゼＣ
活性化に関して）を調査するための変異研究を可能にし得る。

【０１４５】 （実施例７：マウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析） 哺乳動物におけるＰＴＨ３Ｒの発生を確立するために、サザンブロット分析を
、野生型マウス由来（図７、左レーン、１０μｇ）およびＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレ
セプター遺伝子の両方のコピーを欠如するマウス由来（図７、右レーン、２μｇ
）のゲノムＤＮＡを用いて行った。

【０１４６】 簡潔には，ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて完全に消化し、アガ
ロースゲル電気泳動に供し、そして放射標識化ＰＴＨ３Ｒ ＤＮＡ（ｚＰＴＨ３
Ｒのテイル部分をコードする約３００ｂｐ）でプローブするために膜に転写した
。ハイブリダイゼーションを、４２℃で一晩、３０％ホルムアミドの条件下で実
施した。このブロットを、６０℃で１×ＳＳＣの最後の洗浄に供した。ラジオグ
ラフィーを、増感スクリーンを用いて、−８０℃で３日間、このブロットをフィ
ルムに曝露することによって実施した。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターノックア
ウト（ＫＯ）ＤＮＡにおけるバンドの検出は、マウスゲノムＤＮＡにおけるｚＰ
ＴＨ３Ｒの存在を示した。

【０１４７】 （表２．異なるＰＴＨレセプターの細胞内カルボキシ末端テイルのアミノ酸配
列の比較） ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒのテイル領域を含む残基を、ｚＰＴＨ２Ｒ、
およびヒトＰＴＨ１ＲまたはＰＴＨ２Ｒの対応する領域と比較した。パーセント
類似性およびパーセント同一性を示す。

【０１４８】

【表２】 （表３．ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３Ｒに対するＰＴＨアナログおよびＰＴ
ＨｒＰアナログの、結合特性およびｃＡＭＰシグナル伝達特性） 競合的結合およびｃＡＭＰ刺激アッセイを、室温でインタクトなＣＯＳ−７細
胞を用いて実施した。このＣＯＳ−７細胞は、材料および方法に記載されるよう
に、ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒのいずれかを発現した。相同性結合反応は
、非標識化ｒＰＴＨとともに¹²⁵Ｉ−ｒＰＴＨ、および非標識化ｈＰＴＨｒＰと
ともに¹²⁵Ｉ−ｈＰＴＨｒＰを利用し、異種結合反応は、非標識化ｒＰＴＨとと
もに¹²⁵Ｉ−ｈＰＴＨを利用した。ＥＣ₅₀値およびＩＣ₅₀値を、以前に記載され
るように決定した（Ｇａｒｄｅｌｌａら、１９９６）。値は、少なくとも３つの
独立したトランスフェクションの平均±ＳＥＭである。ＮＤは、測定していない
。

【０１４９】

【表３】 本明細書中に引用される他の参考文献のリスト：

【０１５０】

【表４】

【０１５１】

【表５】

【０１５２】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 Ａ）エキソンＭ６／７およびＭ７の模式図（Ａ）、ならびにＰＴＨ１Ｒまたは
ＰＴＨ３ＲをコードするｃＤＮＡの模式図（Ｂ）。縦型のボックスは、膜貫通（
ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）へリックスの予測された位置を示し；制
限酵素について認識部位は、／／により示される。正方向（Ｆｏｒ）の矢印 お
よび逆方向（Ｒｅｖ）の矢印は、ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３ＲについてＲＴ
−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ、および３’ＲＡＣＥのために使用されるプライマーの
およその位置を示す。

【図１Ｂ】 Ｂ）エキソンＭ６／７およびＭ７の模式図（Ａ）、ならびにＰＴＨ１Ｒまたは
ＰＴＨ３ＲをコードするｃＤＮＡの模式図（Ｂ）。縦型のボックスは、膜貫通（
ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）へリックスの予測された位置を示し；制
限酵素について認識部位は、／／により示される。正方向（Ｆｏｒ）の矢印 お
よび逆方向（Ｒｅｖ）の矢印は、ｚＰＴＨ１ＲおよびｚＰＴＨ３ＲについてＲＴ
−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ、および３’ＲＡＣＥのために使用されるプライマーの
およその位置を示す。

【図１Ｃ】 Ｃ）ＰＴＨ３ＲレセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列。

【図１Ｄ】 Ｄ）ＰＴＨ３ＲレセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列。

【化２】

【図２Ａ】 Ａ）ＰＴＨ１Ｒレセプターのアミノ酸配列。

【図２Ｂ】 Ｂ）ＰＴＨ３Ｒレセプターのアミノ酸配列。

【図３】 ｚＰＴＨ１Ｒ、ｚＰＴＨ２Ｒ、およびｚＰＴＨ３Ｒのアミノ酸配列のアライン
メント。この配列は、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用のＧＡＰアルゴリズムおよびパイル
アップアルゴリズムを使用して、整列された。潜在的なＮ−グリコシル化につい
ての保存されたコンセンサス部位が、＃により同定される。ギャップは、配列相
同性を最大にするために導入された。特徴付けられたｚＰＴＨ２Ｒ（Ｒｕｂｉｎ
ら、（１９９９））の１つのスプライス改変体において欠けている１７残基は、
箱で囲まれ；シグナルペプチドを含むと予測される残基は、点刻されたボックス
によって輪郭を描かれ；そしておそらくＰＴＨ３Ｒ特異的である残基は、箱で囲
まれる。

【図４Ａ】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞は、放射
性リガンド結合の競合阻害（Ａ、Ｂ）およびアゴニスト刺激ｃＡＭＰ産生（Ｃ、
Ｄ）について評価された。結合研究（材料および方法で記載される通り）は、放
射性リガンドとして¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］ｒＰＴＨ−（１−３４）
アミド（パネルＡ）または¹²⁵Ｉ−［Ｔｙｒ³⁶］ｈＰＴＨｒＰ−（１−３６）ア
ミド（パネルＢ）のいずれかおよび種々の量の非標識ペプチドを使用した。デー
タは、最大結合の％として表される。サイクリックＡＭＰ蓄積は、ｚＰＴＨ１Ｒ
（Ｃ）またはｚＰＴＨ３Ｒ（Ｄ）について最大の％として表され；基底ｃＡＭＰ
蓄積は、いずれのレセプターについても３〜４ｐｍｏｌ／ウェルであり；ｚＰＴ
Ｈ１Ｒについて最大の蓄積が１０６．２ｐｍｏｌ／ウェルであり、およびｚＰＴ
Ｈ３Ｒについて最大の蓄積が２８５．４ｐｍｏｌ／ウェルであった。黒四角白四
角、ＰＴＨ；黒丸白丸、ＰＴＨｒＰ；塗りつぶされた記号は、ｚＰＴＨ１Ｒを表
し、白い記号は、ｚＰＴＨ３Ｒを表す。全てのデータが、少なくとも３つの独立
したトランスフェクションの平均値±ＳＥＭを表す。

【図４Ｂ】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞は、放射
性リガンド結合の競合阻害（Ａ、Ｂ）およびアゴニスト刺激ｃＡＭＰ産生（Ｃ、
Ｄ）について評価された。結合研究（材料および方法で記載される通り）は、放
射性リガンドとして¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］ｒＰＴＨ−（１−３４）
アミド（パネルＡ）または¹²⁵Ｉ−［Ｔｙｒ³⁶］ｈＰＴＨｒＰ−（１−３６）ア
ミド（パネルＢ）のいずれかおよび種々の量の非標識ペプチドを使用した。デー
タは、最大結合の％として表される。サイクリックＡＭＰ蓄積は、ｚＰＴＨ１Ｒ
（Ｃ）またはｚＰＴＨ３Ｒ（Ｄ）について最大の％として表され；基底ｃＡＭＰ
蓄積は、いずれのレセプターについても３〜４ｐｍｏｌ／ウェルであり；ｚＰＴ
Ｈ１Ｒについて最大の蓄積が１０６．２ｐｍｏｌ／ウェルであり、およびｚＰＴ
Ｈ３Ｒについて最大の蓄積が２８５．４ｐｍｏｌ／ウェルであった。黒四角白四
角、ＰＴＨ；黒丸白丸、ＰＴＨｒＰ；塗りつぶされた記号は、ｚＰＴＨ１Ｒを表
し、白い記号は、ｚＰＴＨ３Ｒを表す。全てのデータが、少なくとも３つの独立
したトランスフェクションの平均値±ＳＥＭを表す。

【図４Ｃ】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞は、放射
性リガンド結合の競合阻害（Ａ、Ｂ）およびアゴニスト刺激ｃＡＭＰ産生（Ｃ、
Ｄ）について評価された。結合研究（材料および方法で記載される通り）は、放
射性リガンドとして¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］ｒＰＴＨ−（１−３４）
アミド（パネルＡ）または¹²⁵Ｉ−［Ｔｙｒ³⁶］ｈＰＴＨｒＰ−（１−３６）ア
ミド（パネルＢ）のいずれかおよび種々の量の非標識ペプチドを使用した。デー
タは、最大結合の％として表される。サイクリックＡＭＰ蓄積は、ｚＰＴＨ１Ｒ
（Ｃ）またはｚＰＴＨ３Ｒ（Ｄ）について最大の％として表され；基底ｃＡＭＰ
蓄積は、いずれのレセプターについても３〜４ｐｍｏｌ／ウェルであり；ｚＰＴ
Ｈ１Ｒについて最大の蓄積が１０６．２ｐｍｏｌ／ウェルであり、およびｚＰＴ
Ｈ３Ｒについて最大の蓄積が２８５．４ｐｍｏｌ／ウェルであった。黒四角白四
角、ＰＴＨ；黒丸白丸、ＰＴＨｒＰ；塗りつぶされた記号は、ｚＰＴＨ１Ｒを表
し、白い記号は、ｚＰＴＨ３Ｒを表す。全てのデータが、少なくとも３つの独立
したトランスフェクションの平均値±ＳＥＭを表す。

【図４Ｄ】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３Ｒを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞は、放射
性リガンド結合の競合阻害（Ａ、Ｂ）およびアゴニスト刺激ｃＡＭＰ産生（Ｃ、
Ｄ）について評価された。結合研究（材料および方法で記載される通り）は、放
射性リガンドとして¹²⁵Ｉ−［Ｎｌｅ^8,21，Ｔｙｒ³⁴］ｒＰＴＨ−（１−３４）
アミド（パネルＡ）または¹²⁵Ｉ−［Ｔｙｒ³⁶］ｈＰＴＨｒＰ−（１−３６）ア
ミド（パネルＢ）のいずれかおよび種々の量の非標識ペプチドを使用した。デー
タは、最大結合の％として表される。サイクリックＡＭＰ蓄積は、ｚＰＴＨ１Ｒ
（Ｃ）またはｚＰＴＨ３Ｒ（Ｄ）について最大の％として表され；基底ｃＡＭＰ
蓄積は、いずれのレセプターについても３〜４ｐｍｏｌ／ウェルであり；ｚＰＴ
Ｈ１Ｒについて最大の蓄積が１０６．２ｐｍｏｌ／ウェルであり、およびｚＰＴ
Ｈ３Ｒについて最大の蓄積が２８５．４ｐｍｏｌ／ウェルであった。黒四角白四
角、ＰＴＨ；黒丸白丸、ＰＴＨｒＰ；塗りつぶされた記号は、ｚＰＴＨ１Ｒを表
し、白い記号は、ｚＰＴＨ３Ｒを表す。全てのデータが、少なくとも３つの独立
したトランスフェクションの平均値±ＳＥＭを表す。

【図５】 ｚＰＴＨ１ＲまたはｚＰＴＨ３ＲまたはｈＰＴＨ１Ｒを一時的に発現するＣＯ
Ｓ−７細胞中のＩＰ総量の蓄積。ＩＰ総量の加水分解を、ＰＴＨｒＰ（１０^-6Ｍ
）またはＰＴＨ（１０^-6Ｍ）の存在下または非存在下において記載されるように
評価した。データは、基底に対する倍数として表され、そして少なくとも２つの
独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。

【図６】 材料および方法に記載されるような、系統分析は、単一の最も極度に倹約され
たツリーが、１５４９ステップの長さを有すること、および０．８６３の情報価
値のない特性を排除した一貫性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）指数を示した。ブー
トストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）信頼区間は、分岐点の次に示され、そして
１００回の分岐と境界との反復（ｂｒａｎｃｈ−ａｎｄ−ｂｏｕｎｄ ｉｔｅｒ
ａｔｉｏｎ）における所定の分岐を支持する試行の百分率を示す。

【図７】 ＰＴＨ３Ｒを用いてプローブした野生型マウスゲノムＤＮＡ（左レーン）およ
びＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターノックアウトマウスゲノムＤＮＡ（右レーン）
のサザンブロット分析。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルビン， デイビッド エイ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01867， リーディング， プレザント ストリート 97 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA03 CA04 DA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ20 QQ53 QR55 QR62 QX07 4B064 AG01 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA06 AA07 AA17 BA01 BA02 BA22 CA53 DB32 ZC06 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA52 DA50 DA76 EA21 EA27 EA28 EA50 FA74

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一
   であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
   ： （ａ）配列番号２における約１〜約５３６位の完全アミノ酸配列を有するＰＴ
   Ｈ１Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２における約２〜約５３６位のアミノ酸配列を有するＰＴＨ１
   Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２における約２５〜約５３６位のアミノ酸配列を有する成熟Ｐ
   ＴＨ１Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｄ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
   ンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセプターをコー
   ドする、ヌクレオチド配列； （ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡによっ
   てコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードする、
   ヌクレオチド配列； （ｆ）ＰＴＨ１Ｒ細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｇ）ＰＴＨ１Ｒ膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列；および （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけ
   る該ヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の完全ヌクレオチド配
   列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、図２Ａ（配列番号２）における完
   全アミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセプターをコードする配列番号１のヌクレ
   オチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、図２Ａ（配列番号２）におけるア
   ミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードする配列番号１のヌクレ
   オチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１６として
   ＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列を有する、請求
   項１に記載の核酸分子。
6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１６として
   ＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列を有する
   ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載
   の核酸分子。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１６として
   ＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有
   する成熟ＰＴＨ１Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項
   １に記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
   、（ｆ）または（ｇ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有
   するポリヌクレオチドに、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハ
   イブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここ
   で、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみか
   らなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントハイブ
   リダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
   、（ｆ）または（ｇ）におけるアミノ酸配列を有するＰＴＨ１Ｒレセプターのエ
   ピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離さ
   れた核酸分子。
10. 【請求項１０】 ＰＴＨ１Ｒレセプター細胞外ドメインをコードする、請求
    項１に記載の単離された核酸分子。
11. 【請求項１１】 ＰＴＨ１Ｒレセプター膜貫通ドメインをコードする、請求
    項１に記載の単離された核酸分子。
12. 【請求項１２】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項１
    に記載の単離された核酸分子をベクター内に挿入する工程を包含する、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法によって産生された、組換えベク
    ター。
14. 【請求項１４】 組換え宿主細胞を作製する方法であって、請求項１３に記
    載の組換えベクターを宿主細胞内に導入する工程を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法によって産生された、組換え宿主
    細胞。
16. 【請求項１６】 ＰＴＨ１Ｒポリペプチドを産生するための組換え方法であ
    って、請求項１５に記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件
    下で培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
17. 【請求項１７】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸配列を有する、単離されたＰＴＨ１Ｒポリペプチド： （ａ）配列番号２における約１〜約５３６位の完全アミノ酸配列を有する、Ｐ
    ＴＨ１Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２における約２〜約５３６位のアミノ酸配列を有する、ＰＴＨ
    １Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２における約２５〜約５３６位のアミノ酸配列を有する、成熟
    ＰＴＨ１Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｄ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされる完全アミノ酸配列を有する、ＰＴＨ１Ｒポリペプチドの
    アミノ酸配列； （ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１６としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＰＴＨ１Ｒポリペプチドの
    アミノ酸配列； （ｆ）ＰＴＨ１Ｒレセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）ＰＴＨ１Ｒレセプター膜貫通ドメインのアミノ酸配列；および （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のいず
    れか１つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
18. 【請求項１８】 ＰＴＨ１Ｒレセプタータンパク質のエピトープ保有部分を
    含む、単離されたポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１７に記載のＰＴＨ１Ｒレセプターポリペプチドに
    特異的に結合する、単離された抗体。
20. 【請求項２０】 減少したＰＴＨ１Ｒ活性に関連する疾患および障害を処置
    する方法であって、有効量の請求項１７に記載のポリペプチドまたはそのアゴニ
    ストを、それらを必要とする患者に対して投与する工程を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 増加したＰＴＨ１Ｒ活性に関連する疾患および障害を処置
    する方法であって、有効量の請求項１７に記載のポリペプチドのアンタゴニスト
    を、それを必要とする患者に対して投与する工程を包含する、方法。
22. 【請求項２２】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同
    一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分
    子： （ａ）配列番号４における約１〜約５４２位の完全アミノ酸配列を有するＰＴ
    Ｈ３Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号４における約２〜約５４２位のアミノ酸配列を有するＰＴＨ３
    Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号４における約２２〜約５４２位のアミノ酸配列を有する成熟Ｐ
    ＴＨ３Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｄ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレセプターをコー
    ドする、ヌクレオチド配列； （ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコー
    ドする、ヌクレオチド配列； （ｆ）ＰＴＨ３Ｒ細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｇ）ＰＴＨ３Ｒ膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）におけ
    る該ヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。
23. 【請求項２３】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ｄ（配列番号３）の完全ヌ
    クレオチド配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
24. 【請求項２４】 前記ポリヌクレオチドが、図２Ｂ（配列番号４）における
    完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレセプターをコードする、図１Ｄ（配列番
    号３）のヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
25. 【請求項２５】 前記ポリヌクレオチドが、図２Ｂ（配列番号４）における
    アミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコードする、図１Ｄ（配列番
    号３）のヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
26. 【請求項２６】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１５とし
    てＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列を有する、請
    求項２２に記載の核酸分子。
27. 【請求項２７】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１５とし
    てＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配
    列を有するＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求
    項２２に記載の核酸分子。
28. 【請求項２８】 前記ポリヌクレオチドが、特許寄託物ＰＴＡ−９１５とし
    てＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を
    有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコードするヌクレオチド配列を有する、請求
    項２２に記載の核酸分子。
29. 【請求項２９】 請求項２２に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
    ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオ
    チド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントハイブリダイゼーショ
    ン条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子で
    あって、ここで、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたは
    Ｔ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジ
    ェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸
    分子。
30. 【請求項３０】 請求項２２に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
    ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）におけるアミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレ
    セプターのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを
    含む、単離された核酸分子。
31. 【請求項３１】 ＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメインをコードする、請求
    項２２に記載の単離された核酸分子。
32. 【請求項３２】 ＰＴＨ３Ｒレセプター膜貫通ドメインをコードする、請求
    項２２に記載の単離された核酸分子。
33. 【請求項３３】 組換えベクターを作製するための方法であって、請求項２
    ２に記載の単離された核酸分子をベクター内に挿入する工程を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 請求項３３に記載の方法によって産生された、組換えベク
    ター。
35. 【請求項３５】 組換え宿主細胞を作製する方法であって、請求項３４に記
    載の組換えベクターを宿主細胞内に導入する工程を包含する、方法。
36. 【請求項３６】 請求項３５に記載の方法によって産生された、組換え宿主
    細胞。
37. 【請求項３７】 ＰＴＨ３Ｒポリペプチドを産生するための組換え方法であ
    って、請求項３６に記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件
    下で培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
38. 【請求項３８】 以下からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸配列を有する、単離されたＰＴＨ３Ｒポリペプチド： （ａ）配列番号４における約１〜約５４２位の完全アミノ酸配列を有する、Ｐ
    ＴＨ３Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）配列番号４における約２〜約５４２位のアミノ酸配列を有する、ＰＴＨ
    ３Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号４における約２２〜約５４２位のアミノ酸配列を有する、成熟
    ＰＴＨ３Ｒポリペプチドのアミノ酸配列； （ｄ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされる完全アミノ酸配列を有する、ＰＴＨ３Ｒポリペプチドの
    アミノ酸配列； （ｅ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＰＴＨ３Ｒポリペプチドの
    アミノ酸配列； （ｆ）ＰＴＨ３Ｒレセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）ＰＴＨ３Ｒレセプター膜貫通ドメインのアミノ酸配列；および （ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）のいず
    れか１つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
39. 【請求項３９】 ＰＴＨ３Ｒレセプタータンパク質のエピトープ保有部分を
    含む、単離されたポリペプチド。
40. 【請求項４０】 請求項３８に記載のＰＴＨ３Ｒレセプターポリペプチドに
    特異的に結合する、単離された抗体。
41. 【請求項４１】 減少したＰＴＨ３Ｒ活性に関連する疾患および障害を処置
    する方法であって、有効量の請求項３８に記載のポリペプチドまたはそのアゴニ
    ストを、それらを必要とする患者に対して投与する工程を包含する、方法。
42. 【請求項４２】 増加したＰＴＨ３Ｒ活性に関連する疾患および障害を処置
    する方法であって、有効量の請求項３８に記載のポリペプチドのアンタゴニスト
    を、それを必要とする患者に対して投与する工程を包含する、方法。
43. 【請求項４３】 改変されたＰＴＨ３Ｒタンパク質をコードする、単離され
    たポリヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を
    除いて、該改変されたタンパク質は、以下： （ａ）配列番号４のアミノ酸１〜５４２； （ｂ）配列番号４のアミノ酸２〜５４２；および （ｃ）配列番号４のアミノ酸２２〜５４２ からなる群より選択されるメンバーに同一である、アミノ酸配列を有する、 単離されたポリヌクレオチド。
44. 【請求項４４】 改変されたＰＴＨ３Ｒタンパク質であって、ここで、少な
    くとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、該改変されたタンパク質は、以下： （ａ）配列番号４のアミノ酸１〜５４２； （ｂ）配列番号４のアミノ酸２〜５４２；および （ｃ）配列番号４のアミノ酸２２〜５４２ からなる群より選択されるメンバーに同一である、アミノ酸配列を有する、 改変されたＰＴＨ３Ｒタンパク質。
45. 【請求項４５】 改変されたＰＴＨ１Ｒタンパク質をコードする、単離され
    たポリヌクレオチドであって、ここで、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を
    除いて、該改変されたタンパク質は、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５３６； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜５３６；および （ｃ）配列番号２のアミノ酸２５〜５３６ からなる群より選択されるメンバーに同一である、アミノ酸配列を有する、 単離されたポリヌクレオチド。
46. 【請求項４６】 改変されたＰＴＨ１Ｒタンパク質であって、ここで、少な
    くとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、該改変されたタンパク質は、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５３６； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜５３６；および （ｃ）配列番号２のアミノ酸２５〜５３６ からなる群より選択されるメンバーに同一である、アミノ酸配列を有する、 改変されたＰＴＨ１Ｒタンパク質。
47. 【請求項４７】 核酸分子を単離するための方法であって、以下 （ａ）配列番号３のフラグメントを核酸プローブとして選択する工程； （ｂ）３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭク
    エン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デ
    ンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子
    ＤＮＡの溶液中、４２℃でのインキュベーションによって、少なくとも１つの試
    験配列に該プローブを一晩ハイブリダイズさせる工程；および （ｃ）２×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣまたは０．５×ＳＳＣの溶液で、約５５℃
    または６０℃または６５℃で洗浄することによって、ハイブリダイズされなかっ
    たプローブを除去する工程； （ｄ）該プローブによって結合された標的配列を同定する工程、 を包含する、方法であって、 ここで、該同定された標的配列は、以下： （ｅ）配列番号４における約1〜約５２３位の完全アミノ酸配列を有するＰＴ
    Ｈ３Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号４における約２〜約５２３位のアミノ酸配列を有するＰＴＨ３
    Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｇ）配列番号４における約２２〜約５２３位のアミノ酸配列を有する成熟Ｐ
    ＴＨ３Ｒレセプターをコードする、ヌクレオチド配列； （ｈ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するＰＴＨ３Ｒレセプターをコー
    ドする、ヌクレオチド配列； （ｉ）特許寄託物ＰＴＡ−９１５としてＡＴＣＣに寄託されるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＰＴＨ３Ｒレセプターをコー
    ドする、ヌクレオチド配列； （ｊ）ＰＴＨ３Ｒ細胞外ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｋ）ＰＴＨ３Ｒ膜貫通ドメインをコードする、ヌクレオチド配列； （ｌ）（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）におけ
    る該ヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列 からなる群より選択される配列に少なくとも約７０％同一である、方法。