CN114874325B - 抗人pth1r胞外区阻断型单域抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体及其应用。该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明针对野生型及突变型人源PTH1R ECD蛋白，利用噬菌体展示技术进行抗体筛选，通过ELISA、FACS等方法筛选并获得具有阻断作用的抗人PTH1R阻断型单域抗体。该抗体能够与人PTH1R结合，并能阻断PTH与PTH1R的相互作用，在PTH‑PTH1R介导的人体机能异常如慢性肾病继发性甲状旁腺功能亢进中具有潜在的应用价值。

Description

抗人PTH1R胞外区阻断型单域抗体及其应用
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有阻断作用的抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体及其应用。
背景技术：
慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是指各种原因引起的慢性肾脏结构与功能异常(肾脏损害病史大于3个月)，包括肾小球滤过率(glomerular filtrationrate，GFR)的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或不明原因GFR下降(<60mL/min/1.73m2)超过3个月。最近的统计数据表明，全球共有6.98亿全阶段CKD病例，患病率为9.1％，我国有1.32亿患者，是全球CKD患者最多的国家[1]。CKD不同阶段临床表现也不同，前期仅出现乏力、尿频等轻度症状，中度至重度CKD患者常伴有并发症，如电解质异常，矿物质骨代谢异常，中枢神经障碍及继发性甲状旁腺功能亢进等[2]，后期发展为尿毒症，尿毒症患者肾脏功能降低，对患者的生活造成极大的影响。
慢性肾脏病-矿物质和骨代谢疾病(Chronic Kidney Disease-Mineral and BoneDisorder，CKD-MBD)是以矿物质代谢紊乱、骨外钙化和骨脆性改变为特征的全身性综合征，其主要表现为以下三个方面：一、钙、磷、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)或维生素D代谢异常；二、骨转换、矿化、体积、线性生长或强度异常；三、以及血管或其他软组织钙化[3,4]。继发性甲状旁腺功能亢进(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是CKD-MBD的重要表现形式，慢性肾病引发的钙磷代谢紊乱受甲状旁腺调节。肾磷酸盐排泄减少、血清磷酸盐增加、磷脂蛋白成纤维细胞生长因子23(FGF-23)水平升高，以及维生素D的活性形式骨化三醇的合成减少[5]，最终表现为高血磷，低血钙。为了增加血钙浓度，甲状旁腺分泌大量PTH，甲状旁腺受到长期刺激而逐渐病变形成增生，若不加以干预，甲状旁腺最终会形成腺瘤。目前用于SHPT的治疗药物包括活性维生素D化合物(如骨化三醇和一些维生素D类似物)，磷酸盐结合剂以及最新的拟钙剂(如西那卡塞)，但这些药物的治疗具有局限性[6]。严重的患者会进行甲状旁腺切除手术，影响患者身体机能。因此，根据SHPT的发病机理，针对PTH受体进行抗体的筛选，以获得阻断PTH过度行使功能的抗体，是干预SHPT的有效治疗手段。
人甲状旁腺激素(PTH)是一种含有84个氨基酸的单链多肽类激素，由11号染色体短臂上的基因编码，由甲状旁腺响应细胞外离子降低的钙离子而分泌产生[7]。甲状旁腺激素的1-34位是其主要的活性部位，是发挥功能的重要肽段。PTH主要功能是增加血清中钙的含量，当血钙浓度低时，PTH由甲状旁腺分泌，可以刺激骨中钙的释放和远端肾小管的重吸收来增加血钙。在肾近端小管中，PTH还刺激骨化三醇的合成，进而增加肠道对钙的吸收，并对甲状旁腺分泌的PTH施加内分泌反馈[8]。PTH还能降低肾对近端小管中磷酸盐的再吸收，从而减少血清磷酸盐的含量。
人甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)是PTH/PTHrP靶向识别并发挥功能的受体，属B类G蛋白偶联受体，在许多组织中表达，主要在骨骼(成骨细胞和骨细胞)、肾脏(近端和远端小管)和乳腺中高表达,对于组织的发育和功能起着关键作用[9]。PTH1R全长593个氨基酸，其中1-188位为胞外区，是PTH与PTH1R结合的主要部位；PTH1R 189-463位是跨膜区，经七次跨膜所形成6个环形结构；464-593是胞内区，可与G蛋白相偶联，激活下游信号通路。目前，PTH与PTH1R相互作用的机制已被解析出来，PTH(1-34)的C末端部分首先停靠到受体的氨基末端细胞外结构域(ECD)以提供亲和相互作用，然后N端部分插入受体的跨膜结构域(TMD)以诱导构象变化，使G蛋白耦合。
单域抗体为仅含有抗体重链可变区的抗体片段，具有分子量小、蛋白表达水平较高、免疫原性弱、易于生产制备等优势[10]。单域抗体能够更好地靶向抗原表面隐蔽的精细结构，对抗原的微小结构改变具有更加灵敏的识别能力[11]，因此筛选靶向PTH1R ECD的单域抗体，精准阻断PTH与受体的结合，对干预SHPT的发展具有重要意义。
在本项申请中，我们利用噬菌体展示技术，通过靶向人PTH1R ECD与PTH的结合位点进行抗体筛选，获得了1个抗人PTH1R ECD特异性全人源单克隆单域抗体。获得的单域抗体能与人PTH1R特异性结合，且具有阻断人PTH1R与PTH相互作用，调节钙磷代谢的功能。此抗体为SHPT的治疗提供了有效的备选抗体药物，具有潜在的临床应用前景。
发明内容：
本发明的目在于提供一种抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体，该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体的编码基因。该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体中的应用。
上述的抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体在制备治疗由PTH-PTH1R介导的人体机能异常疾病药物中的应用。所述的由PTH-PTH1R介导的人体机能异常疾病为慢性肾病继发性甲状旁腺功能亢进。
一种制备抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体。
一种治疗慢性肾病继发性甲状旁腺功能亢进的制剂，其包含上述的抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体。
本发明的有益效果：
慢性肾病为我国常见的慢性疾病，具有肾小球滤过率下降、血液或尿液成分异常、钙磷代谢紊乱等症状，晚期患者常见继发性甲状旁腺功能亢进。为调控因肾脏引起的钙磷失衡，甲状旁腺过度分泌激素，腺体过度行使功能最终导致增生。除此之外，大量的甲状旁腺激素促使骨钙过多的入血，从而引起矿物质和骨代谢疾病。目前对甲状旁腺功能亢进的治疗方法包括药物治疗和手术治疗。早中期患者通过服用维生素D、拟钙剂、磷结合剂等药物易导致软组织钙化，且疗效欠佳。晚期患者只有通过手术全部或部分切除甲状旁腺，或通过热消融的方法降低甲状旁腺的功能，手术治疗风险大，且抑制了甲状旁腺正常的功能。本发明针对甲状旁腺功能亢进的病理机制，筛选一种能阻断甲状旁腺激素与受体结合的抗体，以抑制甲状旁腺激素发挥功能，调节钙磷代谢的紊乱，缓解因甲状旁腺功能亢进所引起的高血钙、骨炎、骨质疏松症。本发明基于野生型及突变型人源PTH1R ECD蛋白，利用噬菌体展示技术进行抗体筛选，通过ELISA、FACS等方法筛选并获得具有阻断作用的抗人PTH1R阻断型单域抗体。该抗体能够与人PTH1R结合，并能阻断PTH与PTH1R的相互作用，在PTH-PTH1R介导的人体机能异常如慢性肾病继发性甲状旁腺功能亢进中具有潜在的应用价值。
附图说明：
图1为构建野生型和突变型人PTH1R ECD-hFc质粒；
其中，A为PTH1R ECD结构示意图；B为PTH1R ECD-hFc表达载体质粒图谱
图2为人PTH1R ECD-hFc蛋白分子量大小及活性验证；
其中，A为SDS-PAGE实验验证PTH1R ECD分子大小；B为ELISA检测抗原活性
图3为利用噬菌体展示技术筛选抗体。
图4为ELISA检测富集噬菌体对抗原的结合情况。
图5为pFUSE-7MD5-hFC质粒图谱。
图6为单域抗体7MD5纯度鉴定。
图7为ELISA检测单域抗体7MD5对人PTH1R ECD-hFc蛋白的结合特异性。
图8为FACS检测单域抗体7MD5结合过表达人PTH1R细胞能力分析。
图9为FACS检测单域抗体7MD5与PTH竞争结合人PTH1R能力分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
1.抗原制备
1.1野生型及突变型人PTH1R ECD-hFc质粒的构建及纯化
根据人PTH1R ECD的结构，将其与PTH结合的关键位点进行突变，以此作为阴性抗原进行后续抗体特征的鉴定。构建以pFUSE为载体的野生型及突变型人PTH1R ECD-hFc质粒(图1)，人源Fc标签有利于Protein A吸附柱进行抗体的纯化，利用所纯化出来的野生型和突变型的人PTH1R ECD-hFc蛋白，期望能获得与PTH竞争性结合PTH1R关键位点的抗体，阻断PTH与PTH1R的相互作用。
1.2野生型及突变型人PTH1R ECD-hFc蛋白的鉴定
纯化后的野生型及突变型人PTH1R ECD-hFc蛋白通过琼脂糖凝胶电泳实验验证蛋白分子量大小，变性还原和变性非还原蛋白条带位置与预期一致。所纯化的野生型和突变型人PTH1R ECD-hFc蛋白均能被商品化的PTH1R抗体所识别，证明纯化的蛋白具有活性(图2)，可以作为抗体筛选的抗原。
2.噬菌体展示技术筛选靶向人PTH1R ECD的全人源单域抗体
2.1筛选靶向PTH1R ECD的全人源单域抗体
构建单域抗体噬菌体文库，采用噬菌体展示技术，以两种对照hFc-融合蛋白[12][13]作为预吸附蛋白，以排除能结合hFc标签的噬菌体，为后续带有hFc标签的抗体的纯化、特征鉴定排除干扰，并将野生型人PTH1R ECD-hFc(27Asp-188Gly)蛋白作为筛选的抗原在单域抗体文库中进行筛选(图3)。ELISA检测富集的噬菌体对抗原的亲和力显著升高(图4)。
2.2噬菌体多克隆ELISA
从第三轮富集的噬菌体中随机挑取100个单克隆，ELISA检测单克隆对人PTH1RECD-hFc的结合情况。设定高于对照抗原本底信号3.5倍以上为阳性克隆，对阳性克隆进行序列分析，获得富集克隆7MD5。7MD5克隆DNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白质序列如SEQ IDNO：2所示，其中下划线标记部分为抗体CDR区域。7MD5：CDR1：氨基酸26-32，CDR2：氨基酸48-67，CDR3：氨基酸96-107。
2.3单域抗体7MD5的表达与纯化
通过分子克隆技术，将7MD5抗体DNA序列克隆至真核细胞表达载体,并加上人Fc标签，构建为pFUSE-7MD5-hFC融合蛋白表达(Invivigen，San Diego，CA)载体(图5)，转染293T细胞后收集上清，并用protein A-Agarose分离柱进行亲和纯化，SDS-PAGE检测单域抗体7MD5的纯度(图6)。
3单域抗体7MD5抗体特征及功能分析
3.1单域抗体7MD5与人PTH1R ECD-hFc的结合特异性分析
ELISA检测纯化的7MD5抗体与人PTH1R ECD-hFc蛋白结合情况。结果显示7MD5单域抗体特异性识别生物素标记的野生型人PTH1R ECD-hFc蛋白，但不识别突变型人PTH1RECD-hFc蛋白，结合能力随着抗体浓度的升高而增强(图7)。
3.2单域抗体7MD5结合过表达人PTH1R细胞能力分析
FACS检测单域抗体7MD5结合过表达人PTH1R细胞能力分析。
3.3单域抗体7MD5与PTH竞争结合PTH1R能力分析
FACS检测单域抗体7MD5与PTH竞争结合人PTH1R能力分析
通过分子克隆技术，将人PTH1R的DNA序列克隆至慢病毒过表达载体，构建为pLVX-hPTH1R质粒且与病毒包装质粒psPAX2和pMD2G(Cambridge，MA)共转染进HEK293细胞，利用上述慢病毒包装系统构建HEK293-hPTH1R过表达细胞系。将单域抗体7MD5与HEK293-hPTH1R过表达细胞系共孵育，通过细胞流式仪在细胞水平检测单域抗体7MD5与人PTH1R的结合。白色峰为HEK293细胞，灰色峰为HEK293过表达人PTH1R细胞系，结果说明单域抗体7MD5可以结合过表达人PTH1R的HEK293细胞(图8)。在加入PTH后，单域抗体7MD5对人PTH1R的结合减少，说明7MD5与PTH竞争性结合人PTH1R(图9)。
4.实验方法：
野生型及突变型人PTH1R ECD-hFc质粒的构建及纯化：为获得特异性识别PTH与PTH1R ECD结合位点的抗体，根据已解析的PTH与PTH1R相互作用的蛋白结构，对PTH与PTH1RECD结合的关键位点进行一系列的突变，根据有效干预PTH与PTH1R ECD结合，且不影响PTH1R ECD内部氨基酸折叠的原则，将选取的PTH1R ECD表面氨基酸突变成对蛋白质影响较小的丙氨酸。突变后的PTH1R ECD构建为表达质粒，与野生型PTH1RECD(NCBI数据库NP_000307.1)表达为蛋白并纯化。
ELISA检测富集噬菌体对抗原蛋白的结合情况：使用10μg/ml野生型PTH1R ECD-hFc抗原于4℃包被酶标板过夜，50ul/孔；用含有5％(w/w)脱脂奶粉，0.1％(v/v)Tween-20的PBS溶液(PBSTM)室温封闭酶标板30分钟；单域抗体噬菌体文库以1012pfu与10％脱脂奶粉PBS溶液(PBSM)以1:1的体积比混合后室温孵育，同时将10ug/ml对照抗原-hFc融合蛋白与5％(w/w)PBSM孵育30分钟。预吸附：将孵育好的对照抗原加入到包被好的野生型PTH1RECD-hFc抗原中，室温孵育30分钟后，弃对照抗原把封闭后的单域抗体噬菌体文库加入酶标板中，室温孵育1小时。用0.1％Tween-20的PBS溶液(PBST)洗涤酶标板20次；100μl 100mMTriethylamine室温洗脱30分钟；洗脱后的噬菌体感染对数生长期的TG1细胞，扩增和回收后用于下一轮淘选。共进行四轮筛选，第二轮第三轮降低抗原量，用5ug/ml的人野生型PTH1R ECD蛋白进行抗体筛选，以此提高噬菌体特异性，第四轮用2ug/ml低抗原浓度进行抗体筛选。淘选后通过ELISA分析阳性噬菌体富集情况。
Polyclonal phage ELISA：以5μg/ml的野生型PTH1R ECD-hFc和阴性对照蛋白-hFc分别于4℃包被酶标板过夜，50ul/孔，每种抗原3个复孔；用含有3％PBSTM温封闭酶标板1小时；将每轮扩增回收的噬菌体以1:1的体积比与6％PBSM室温孵育2小时，加入封闭好的酶标板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％PBST洗涤酶标板5次；将HRP/Anti-M13Monoclonal conjugate以1：4000比例与5％PBSTM溶液混合，加入洗涤好的酶标板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％PBST溶液洗涤酶标板5次；将TMB显色液加入酶标板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸溶液终止显色(100μl/孔)；用酶标仪检测450nm波长下吸光值，并分析每轮扩增后噬菌体的结合情况。
Monoclonal phage ELISA：在第四轮富集的噬菌体中随机挑取100个单克隆，扩增回收噬菌体单克隆。以5μg/ml的野生型和突变型PTH1R ECD-hFc于4℃包被酶标板过夜，50ul/孔；用含有3％PBSTM室温封闭酶标板1小时；将噬菌体单克隆以1:1比例与6％PBSM室温孵育2小时，加入封闭好的酶标板中(100μl/孔)，室温孵育1小时；用0.1％PBST洗涤酶标板5次；将HRP/Anti-M13 Monoclonal conjugate以1：4000比例与5％PBSTM溶液混合，加入洗涤好的酶标板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％PBST溶液洗涤酶标板5次；将TMB显色液加入酶标板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸溶液终止显色(100μl/孔)；用酶标仪检测450nm波长下吸光值，设定野生型PTH1R ECD蛋白与阴性抗原蛋白的结合信号大于3.5倍以上的为阳性克隆，提取质粒并测序，并对序列进行分析。
单域抗体7MD5的表达与纯化：
将7MD5抗体序列克隆至真核细胞表达载体，构建pFUSE-7MD5-hFc(Invivigen，SanDiego，CA)质粒。用添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基在10cm细胞培养皿中种5×106个HEK293T细胞，置于5％CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养。当细胞密度到达70-80％时，利用PEI将10μg pFUSE-7MD5-hFc质粒转染入HEK293T细胞；每天收集上清，连续收集5天。将收集的上清液3500rpm、4℃离心20分钟，并用0.45μm的微孔滤膜过滤，进一步去除细胞碎片；将上清液通过Protein A-Agarose(GE Healthcare，Piscataway，NJ)亲和柱分离纯化7MD5-hFc重组蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度，取5μg7MD5-hFc重组蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定7MD5-hFc重组蛋白的纯度。
单域抗体7MD5结合特异性分析：
用1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的单域抗体7MD5-hFc于4℃包被酶标板过夜；用含有3％PBSTM室温封闭酶标板1小时；以5μg/ml生物素标记的野生型人PTH1R ECD-hFc biotin蛋白、生物素标记的突变型人PTH1R ECD-hFc蛋白为一抗，室温孵育1小时；用0.05％PBST洗涤酶标板3次(340ul/孔)；将Goat anti human Fcr HRP以1：4000比例与5％PBSTM混合，加入洗涤好的酶标板中(50μl/孔)，室温孵育1小时；用0.05％PBST洗涤酶标板3次；将TMB显色液加入酶标板中(100μl/孔)，室温显色3分钟后，加入0.5M硫酸溶液终止显色(100μl/孔)；用酶标仪检测450nm波长下吸光值，并分析单域抗体7MD5与抗原结合特异性。
单域抗体7MD5与过表达人PTH1R的HEK293细胞结合能力分析：
取1million HEK293细胞以及过表达人PTH1R的HEK293细胞，PBS洗涤细胞1次，将5μg/ml的单域抗体7MD5与细胞在冰上孵育1小时；用PBS洗涤细胞1次，将细胞混合入Goatanti human IgG Fc PE抗体与FACS buffer以1：2000比例制备的混合液中，冰上孵育1小时；用PBS洗涤细胞1次；300ul PBS重悬细胞并转移至FACS tube中；用细胞流式仪检测抗体与过表达人PTH1R的HEK293细胞的结合情况。在加入单域抗体7MD5之前用PTH与细胞孵育30分钟以验证单域抗体7MD5是否与PTH竞争性结合人PTH1R。
序列表
序列1(全人源单域抗体7MD5 DNA序列)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGATTTCGATTTCGATGATTATGAAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTTCTATAATGGGAACACCTTCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCATATATTACTGTGCACGGTCGCTCCCTGGGGACTGGGCCCCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
序列2(全人源单域抗体7MD5氨基酸序列)
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASDFDFDDYEMSWVRQAPGKALEWIGSIFYNGNTFYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAIYYCARSLPGDWAPDYWGQGTLVTVSS
4.参考文献
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序列表
<110> 南京医科大学
<120> 抗人PTH1R胞外区阻断型单域抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgattt cgatttcgat gattatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ccctggagtg gattgggagt atcttctata atgggaacac cttctacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca ccctgagagc cgaggacaca gccatatatt actgtgcacg gtcgctccct 300
ggggactggg cccctgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Asp Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Phe Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Leu Pro Gly Asp Trp Ala Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (6)

1.一种抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体，其特征在于：该抗体的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
2.权利要求1所述抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：该编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
4.含有权利要求3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体中的应用。
6.一种制备抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体的方法，其特征在于将包含权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到抗人PTH1R的全人源单克隆单域抗体。
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