CN108129563A - 一种抗aqp4的小分子抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗AQP4的小分子抗体及其应用。该小分子抗体的特异性抗原靶点为水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)蛋白的优势表位，该优势表位为AQP4蛋白3个胞外环中的A、E胞外环组成AQP4蛋白的优势表位，其氨基酸序列特征从N端到C端氨基酸依次为：GNWENHWTINWGGTEKPLP；本发明涉及的小分子抗体(Fab)在预防、诊断和治疗视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSDs)过程中的应用。

Description

一种抗AQP4的小分子抗体及其应用

技术领域

本发明涉及小分子抗体的制备及其应用，具体为一种用于治疗视神经脊髓炎谱系(NMOSDs)的小分子抗体及其应用。

背景技术

水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)家族是近几年来逐渐被认识并研究的一类与水通透有关的膜转运蛋白，在维持体内水、电解质平衡运输过程中发挥着重要的作用，在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白。其中，AQP4为中枢神经系统调节内环境水平衡的受体，广泛存在于哺乳动物体内，主要分布于脑、眼、肺等组织内，兼有维持水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，在维持脑和视网膜内水、电解质运输平衡以及眼内压恒定调节等方面发挥着重要作用。

视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSDs)是视神经与脊髓同时或者相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变，为一种严重的神经系统退行性疾病，在非高加索人中发病比例偏高，东亚地区发病率远高于欧美。绝大多数NMOSD患者体内血液中能够检测出AQP4自身抗体，IgG-AQP4已经成为诊断该疾病的重要标识物。体内存在的AQP4自身抗体穿过血脑屏障后攻击中枢神经系统的星形胶质细胞，通过特异性的细胞毒作用导致中枢神经系统星形胶质细胞凋亡，进而引起中枢神经系统发生脱髓鞘病变。AQP4自身抗体的细胞毒作用与疾病的发生和发展有着密切的联系，如在临床上，通常AQP4自身抗体含量浓度较低的患者能够获得较好的治疗。减轻AQP4自身抗体介导的细胞毒作用将成为治疗NMOSD的有效方法之一。临床上通常采用血浆置换的方法来降低AQP4自身抗体的有效浓度，但是该方法在降低了AQP4自身抗体浓度的同时也降低了其他治疗药物的有效浓度，并且又不能保证百分百有效；再有，通过生产一些AQP4胞外抗原决定簇的多肽用来中和体内存在的AQP4自身抗体，继而减轻血液中特异性自身抗体介导的对中枢神经系统的细胞毒作用，但是抗原多肽表位-自身抗体结合后可激活补体系统发生补体依赖的细胞毒作用和启动抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用来破坏周围附近细胞，导致发生相关副作用。

目前，针对NMOSDs急性期患者的治疗方法主要为大剂量激素冲击、静脉注射大剂量免疫球蛋白和血浆置换等。大剂量糖皮质激素冲击可抑制机体免疫应答的发生，进而减少AQP4自身抗体的产生，但是长时间使用会降低自身机体的免疫能力，增加诱发感染或加重感染的风险，引发新陈代谢、盐水代谢紊乱，导致出现类肾上腺皮质功能亢进综合症；注射大剂量免疫球蛋白目前还缺少足够的证据支持治疗的有效性；血浆置换通过置换血清，在一定程度上能够降低患者急性期血清内的AQP4自身抗体的水平，但是在置换过程中也相应地清除了血清中所有其他治疗药物、细胞因子和趋化因子等，因此在减少AQP4自身抗体的同时也降低了其他治疗方式的作用效果。针对NMOSDs缓解期患者的治疗方法主要为使用免疫抑制剂、利妥昔单抗以及个体化治疗或对症治疗，免疫抑制剂长时间大量使用，会导致免疫相关疾病的发生；利用利妥昔单抗治疗NMO患者要注意预防感染；而个体化治疗需要较多的医疗费用，而且不确定能够稳定有效。

因此，选择AQP4蛋白的优势抗原表位制备单克隆抗体、制备小分子抗体用来结合特定部位的AQP4蛋白，阻止体内存在的AQP4自身抗体对表达水通道蛋白的星形胶质细胞的特异性攻击，对后期制备人源化或人抗体治疗NMOSDs具有重大意义。

发明内容

本发明的目的之一是提出一种能够有效用于制备AQP4单克隆抗体的多肽序列。

本发明的目的之二是提出制备抗AQP4的小分子抗体，通过减少细胞毒副作用，可以一定程度上保护动物中枢神经系统。

本发明的目的之三是提出抗AQP4的小分子抗体在治疗和预防视神经脊髓炎谱系疾病过程中的应用。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：一种用于制备抗AQP4的小分子抗体的多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种抗AQP4的小分子抗体，是以上述的多肽通过基因工程技术或动物免疫学技术制备的抗AQP4小分子抗体。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的小分子抗体为：抗体的Fab片段、抗体的F(ab，)₂片段、单链抗体(ScFv)、Fv抗体(VH+VL)、单域抗体(VH)或多价小分子抗体。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的抗体的Fab片段为多克隆抗体的Fab片段或单克隆抗体的Fab片段。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的抗体的F(ab，)₂片段为多克隆抗体的F(ab，)₂片段或单克隆抗体的F(ab，)₂片段。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的小分子抗体的特异性抗原靶点为AQP4蛋白胞外优势表位，所述的AQP4蛋白胞外优势表位为AQP4蛋白的A、E胞外环组成的优势表位。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的AQP4蛋白的A胞外环的氨基酸序列为：TEKPLP。

上述的一种抗AQP4的小分子抗体，所述的AQP4蛋白的E胞外环的氨基酸序列为：SMNPARSFGPAVIMGNWENHW。

本发明的抗AQP4的小分子抗体，以多肽的DNA为模板，可以采用现有技术中的如噬菌体抗体库技术或核糖体展示技术等基因工程技术获得。

上述的抗AQP4的小分子抗体在制备治疗和预防视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

AQP4由4个具有活性的独立亚基组成四聚体结构，每个亚单位含有6条疏水性的α螺旋结构，构成呈“沙漏”模型的转运水孔道，发明人利用生物信息学手段获得如图1所示的AQP4蛋白的三维结构图。每个亚单位间通过连接环相连，包括B、D2个胞内环和A、C、E3个胞外环。体内星形胶质细胞上的AQP4是NMO-IgG的主要目标，其分子的N端和C端均位于胞内，本发明选择制备小分子抗体的优势抗原表位为水通道蛋白AQP4位于细胞膜外的环状结构，Loop A和Loop E由于该环状结构位于细胞膜外，因此很容易成为小分子抗体结合的靶点，从而阻断AQP4自身抗体对表达水通道蛋白的星形胶质细胞的特异性攻击。

本发明的抗AQP4的小分子抗体能够特异性地和视神经脊髓炎谱系疾病患者中枢神经系统星形胶质细胞上的AQP4结合，覆盖AQP4的部分胞外结构域，减少患者体液中致病的AQP4自身抗体与AQP4结合的机会，甚至不能够结合，来避免发生补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。

附图说明

图1显示为AQP4蛋白的结构示意图。

图2显示利用3个多肽片段获得的抗体与AQP4蛋白的体外结合情况。

图3显示蛋白免疫印迹实验检测单克隆抗体与AQP4蛋白的结合活性。

具体实施方案

下面结合具体实施方案对本发明的技术路线作进一步详细说明如下：

发明人利用生物信息学手段分析了AQP4的抗原信息，AQP4具有3个胞外环(图1所示Loop A、C、E分别为1条寡肽和2条多肽)，并合成了这些AQP4的抗原表位。然后，制备单克隆抗体。接下来，利用酶联免疫吸附测定实验测定抗体的效价和与AQP4蛋白结合相互作用的剂量关系和特异性，确定SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽是AQP4蛋白的优势抗原表位。此外，利用胃蛋白酶对本发明的抗体进行酶切获得小分子抗体。

根据本发明的又一方面，本发明对Lewis大鼠进行髓鞘置管手术，然后向大鼠髓鞘内注射视神经脊髓炎谱系疾病患者的血清及补体，利用患者血清中致病的AQP4自身抗体及补体联合发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用和补体介导的细胞毒作用，来完成视神经脊髓炎谱系疾病的大鼠建模。然后将一定量本发明所述的小分子抗体局部注入机体，由于本小分子抗体的制备依据AQP4细胞膜外环状结构设计，因此能够特异性结合AQP4，进而血清中特定的AQP4自身抗体将失去结合抗原的能力，从而避免抗体抗原结合后激活补体系统以及发生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，最终大大降低了细胞毒作用，能够在大鼠动物模型的基础上有效地降低视神经脊髓炎谱系组织学和行为学上的疾病症状。

本发明所述的小分子抗体是根据人体AQP4膜外抗原决定簇的氨基酸序列设计制备的，能够特异性的结合中枢神经系统的星形胶质细胞上的水通道蛋白AQP4，屏蔽血液中的AQP4自身抗体的结合位点，使自身抗体不能够结合AQP4而失去攻击中枢神经系统星形胶质细胞的能力。

实施例

(一)抗原肽序列的确定与合成

发明人根据AQP4蛋白的胞外环多肽段设计3条多肽片段(即SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:5)。其中，

SEQ ID NO:1为根据Loop A和Loop E组合设计的多肽，其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO:2。

SEQ ID NO:3为根据AQP4第137-154氨基酸设计的多肽，其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO:4。

SEQ ID NO:5为根据AQP4第201-221氨基酸设计的多肽，其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO:6。

(二)单克隆抗体的制备

以步骤(一)获得的3个多肽片段免疫动物，分离小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，制备单克隆抗体，具体如下：

1、合成抗原：按照SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，分别人工合成3条多肽，与多肽载体KLH耦联。

2、免疫动物：选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行抗原免疫注射，刺激相应的B淋巴细胞活化、增殖和分化为致敏B淋巴细胞。

3、细胞融合：分离制备已免疫的小鼠脾细胞悬液，用血球计数板计数；从-80℃冰箱取出骨髓瘤细胞复苏2周后，将1×10⁸脾细胞与2-5×10⁷同系骨髓瘤细胞进行混合，低转速离心后弃上清，加入50％PEG诱导膜融合后加入HAT培养基。

4、筛选阳性杂交瘤细胞：在HAT选择性培养基上筛选成功膜融合的杂交瘤细胞，体外培养增殖，收集上清液即为单克隆抗体并及时进行冻存母细胞，对小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，约1-2周后抽取腹水，可获得大量单克隆抗体，即为抗AQP4的单克隆抗体。

(三)单克隆抗体与AQP4蛋白的结合，利用ELISA实验和蛋白免疫印迹实验方法将步骤(二)中获得的3个抗体进行AQP4蛋白结合检测，具体方法如下：

1、取适量孔数的酶标板进行抗原包埋，将适量的AQP4蛋白包埋到酶标板的每个孔中，以及进行蛋白免疫印迹实验；

2、用漂洗液清洗酶标板5次，分别加入步骤(二)获得的单克隆抗体，37℃孵育1h；

3、漂洗液清洗5次，加入带有辣根过氧化物酶标或碱性磷酸酯酶标的二抗，37℃孵育1h，漂洗液清洗5次；

4、加入底物显色10-20min，加入终止液，终止反应，利用酶标仪进行OD值读取。

蛋白免疫印迹实验结果如图2所示，第一泳道有明显目的条带，中间泳道观察不到目的条带，第三泳道有很浅的目的条带。由图2表明，SEQ ID NO:1多肽是AQP4蛋白的优势抗原表位，利用其制备的抗体可以特应性结合AQP4蛋白。

(四)蛋白免疫印迹实验检测单克隆抗体与AQP4蛋白的结合活性

具体如下：

1、制备AQP4蛋白，与对照组蛋白样一同进行SDS-PAGE实验；

2、转膜，将蛋白样转移到硝酸纤维素膜上；

3、用0.5％BSA(或脱脂奶粉)进行封闭2h；

4、加入一抗(本发明SEQ ID NO:1制备的抗体)，37℃，1h；

5、用漂洗液清洗3-5次，每次10min，加入酶标二抗，37℃40min；

6、加入底物反应显色或者ECL显色液压片显影。

结果如图3所示，利用抗原抗体特异性结合特点，能够明显印记出目的条带，表明该抗体可以特异性结合AQP4蛋白。由图3可见，本发明设计的SEQ ID NO:1为AQP4蛋白的优势表位，通过该表位制备的单克隆抗体可以特异性的与AQP4结合，后期通过胃蛋白酶降解获得Fab小抗体用于动物模型实验，最终完成人源小分子抗体用于治疗NMOSDs。

上面对本专利的较佳实施方式进行了详细说明，本发明是制备小分子抗体来屏蔽体内存在的AQP4自身抗体的结合位点，从而避免AQP4自身抗体与抗原表位的结合，失去激活补体依赖介导的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，最终保护中枢神经系统的星形胶质细胞以及髓鞘，用于治疗视神经脊髓炎谱系疾病。

〈110〉 辽宁何氏医学院

〈120〉 一种抗AQP4的小分子抗体及其应用

〈160〉 6

〈210〉 1

〈211〉 19

〈212〉 PRT

〈213〉 人工序列

〈400〉 1

Gly Asn Trp Glu Asn His Trp Thr Ile Asn Trp Gly Gly Thr Glu Lys Pro Leu Pro

1 5 10 15

〈210〉 2

〈211〉 57

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 2

ggaaactggg caaaccactg gaccataaac tggggtggct cagaaaaccc cttacct

〈210〉 3

〈211〉 18

〈212〉 PRT

〈213〉 人工序列

〈400〉 3

Thr Pro Pro Ser Val Val Gly Gly Leu Gly Val Thr Met Val His Gly Asn Leu

1 5 10 15

〈210〉 4

〈211〉 54

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 4

acacctccca gtgtggttgg aggattggga gtcaccacgg ttcatggaaa cctc

〈210〉 5

〈211〉 21

〈212〉 PRT

〈213〉 人工序列

〈400〉 5

Ser Met Asn Pro Ala Arg Ser Phe Gly Pro Ala Val Ile Met Gly Asn

1 5 10 15

Trp Glu Asn His Trp

〈210〉 6

〈211〉 63

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 6

agcatgaatc cagctcgatc ttttggaccc gcagttatca tgggaaactg ggcaaaccac tgg

Claims (7)

1.一种用于制备抗AQP4的小分子抗体的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种抗AQP4的小分子抗体，其特征在于，是以权利要求1所述的多肽通过基因工程技术或动物免疫学技术制备的抗AQP4小分子抗体。

3.根据权利要求2所述的一种抗AQP4的小分子抗体，其特征在于，所述的小分子抗体为：抗体的Fab片段、抗体的F(ab’)₂片段、单链抗体(ScFv)、Fv抗体(VH+VL)、单域抗体(VH)或多价小分子抗体。

4.根据权利要求3所述的一种抗AQP4的小分子抗体，其特征在于，所述的抗体的Fab片段为多克隆抗体的Fab片段或单克隆抗体的Fab片段。

5.根据权利要求3所述的一种抗AQP4的小分子抗体，其特征在于，所述的抗体的F(ab’)₂片段为多克隆抗体的F(ab’)₂片段或单克隆抗体的F(ab’)₂片段。

6.根据权利要求2、3、4或5所述的一种抗AQP4的小分子抗体，其特征在于，所述的小分子抗体的特异性抗原靶点为AQP4蛋白胞外优势表位，所述的AQP4蛋白胞外优势表位为AQP4蛋白的A、E胞外环组成的优势表位。

7.权利要求2、3、4或5所述的抗AQP4的小分子抗体在制备治疗和预防视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。