EA024655B1 - ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA024655B1
EA024655B1 EA201100160A EA201100160A EA024655B1 EA 024655 B1 EA024655 B1 EA 024655B1 EA 201100160 A EA201100160 A EA 201100160A EA 201100160 A EA201100160 A EA 201100160A EA 024655 B1 EA024655 B1 EA 024655B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
ligand
ενν
protein
fragment
Prior art date
Application number
EA201100160A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100160A1 (ru
Inventor
Коринн Бернар
Алуа Бернхардт Ланг
Эрве Перрон
Жан-Баптист Бертран
Original Assignee
Женёро Са
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Женёро Са filed Critical Женёро Са
Publication of EA201100160A1 publication Critical patent/EA201100160A1/ru
Publication of EA024655B1 publication Critical patent/EA024655B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к лиганду, связывающемуся с MSRV-ENV, содержащему каждый из участков, определяющих комплементарность (CDR): CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), представленный SEQ ID No. 1, CDR2 VL, представленный SEQ ID No. 2, CDR3 VL, представленный SEQ ID No. 3, CDR4 вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленный SEQ ID No. 4, CDR5 VH, представленный SEQ ID No. 5, и CDR6 VH, представленный SEQ ID No. 6. Указанный лиганд может быть использован при лечении MSRV-ассоциированных заболеваний. Кроме того, изобретение относится к вариантам указанного лиганда, ScFV, Fab фрагментам, антителу, включающим лиганды по изобретению, способу их получения, фармацевтической композиции, включающей их; нуклеиновым кислотам, кодирующим лиганды, вектору, включающему их, клетке-хозяину, содержащей нуклеиновые кислоты; к способу лечения MSRV-ассоциированных заболеваний; к антилиганду, предназначенному для получения антитела; способу и набору для определения антилиганда в образце, а также к применению набора.

Description

Объектом настоящего изобретения является лиганд, который проявляет значительное связывание с молекулой-мишенью, антилигандом.
В соответствии с настоящим изобретением антилигандом является белок ΜδΚν-ΕΝν (оболочки), М§КУ означает РС (рассеянный склероз)-ассоциированный ретровирус (Реггои, с1 а1. (1997). Мо1еси1аг 1беиййсайои оГ а иоуе1 тейоуиик гереа1еб1у 1ко1а1еб Ггот райейк \νί11ι ти1йр1е 8с1ето818. ТЬе СойаЪотайуе РекеатсЬ Огоир оп МиШр1е 8с1ето818. Ргос №11 Асаб 8с1 И8Л 94(14): 7583-8). Белок ΜδΚν-ΕΝν следует понимать как полноразмерный или частичный белковый продукт, кодируемый генами ΜδΚν еиу, как определено в Котштаи-Ртабе1, Р., е1 а1. (1999). Уио1оду 260(1): 1-9, и Ро11аиб А., е1 а1. (2006) 1 1ттиио1 176(12): 7636-44, или любую молекулу, имитирующую антигенные или связывающие свойства ΜΚδνΕΝν (мимеотоп). ΕΝν-Т соответствует полноразмерному белку, который подробно описан в примере 2 (остатки 1-542), а ΕΝν-δυ, также называемый ΕΝν-1, соответствует последовательности 830-К316, как определено в примере 2. На Εΐ'ΐν-δυ также ссылаются в статье Ро11аиб А., е1 а1. (2006) 1 1ттиио1 176(12): 7636-44. Как обычно для ретровирусов, ΜδΚν проявляет вариабельность в его белке оболочки ΕΝν (Реггои, Н. е1 а1. (2000) 1 №игоу1го1 6: 867-75; Уо188с1, С. О. Вои1ои е1 а1. (2000) АГО8 Рез Нит Ре1гоу1ги8е8 16(8): 731-40). Показано, что мимеотопы, имитирующие частичные белковые фрагменты ΜδΚν ΕΝν, существуют и избирательно связываются антителами от пациентов с рассеянным склерозом (1ойуе1-Реуиаиб, С., Н. Реггои, е1 а1. (1999). ’^ресШсШез оГ ти1йр1е 8с1ето818 сетеЪгозртй йшб аиб зегит аийЪоб1е8 адат81 т1то1оре8. Сйи 1ттиио1 93(3): 283-93).
Более конкретно лиганд по настоящему изобретению содержит каждый из участков, определяющих комплементарность (СЭР): СЭР1 вариабельной области легкой цепи (УЬ), представленный δΕΟ ΙΌ №. 1, СЭР2 Уь, представленный δΕΟ ΙΌ №. 2, СЭР3 УБ. представленный δΕΟ ΙΌ №. 3, СЭР4 вариабельной области тяжелой цепи (УН), представленный δΕΟ ΙΌ №. 4, СЭР5 УН, представленный δΕΟ ΙΌ №. 5, и СЭР6 УН, представленный δΕΟ ΙΌ №. 6.
Лиганды по настоящему изобретению обладают способностью связываться с антилигандом по настоящему изобретению.
В соответствии с настоящим изобретением под выражением связывает или связывающий следует понимать, что лиганд значимо распознает антилиганд в соответствии с критериями, приведенными в примере 5.
В другом аспекте изобретения указанный лиганд включает вариабельную область легкой цепи (УЬ), содержащую участки, определяющие комплементарность (СЭР), имеющие аминокислотные последовательности δΕΟ ΙΌ №. 1, представляющую собой СЭРЕ δΕΟ ΙΌ №. 2, представляющую собой СЭР2, и δΕΟ ΙΌ №. 3, представляющую собой СЭР3, и вариабельную область тяжелой цепи (УН), содержащую аминокислотные последовательности δΕΟ ΙΌ №. 4, представляющую собой СЭР4, δΕΟ ΙΌ №. 5, представляющую собой СЭР5, и δΕΟ ΙΌ №. 6, представляющую собой СЭР6.
В следующем аспекте лиганд по изобретению включает вариабельную область легкой цепи (УЬ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ №. 7, и вариабельную область тяжелой цепи (УН), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ №. 8.
Варианты этих последовательностей УН и УЬ в соответствии с настоящим изобретением значимо связываются с антилигандом.
Идентичность последовательности означает, например, что в последовательности, обладающей 80% идентичности последовательности, 80% идентичных аминокислот присутствует в том же положении при выравнивании последовательностей, которое можно осуществлять известными в данной области техники способами, такими как описаны в δе^иеисе - Буо1ийои - Риисйои Сотри1айоиа1 АрргоасЬез ш Сотратайуе деиотюк. Кооиои Ε. е1 а1., 2003: КЬпусг Асабетю РиЪЬкЬетк, или в соответствии с параметрами по умолчанию руководства к программному обеспечению 'Мас Уес1ог (НК).
Лиганд по настоящему изобретению может быть также определен как включенный в рекомбинантный белок ксРУ.
В соответствии со следующими аспектами изобретения лиганд может быть включен в РаЪ фрагмент, в антитело, которое может быть поликлональным, моноклональным, олигоклональным, химеризованным, сконструированным или гуманизированным антителом. В конкретном аспекте изобретения антитело, включающее лиганд, представляет собой ΙμΟ человека, и более конкретно ΙβΟ1 или ΙβΟ4.
Поликлональные, олигоклональные, моноклональные антитела могут быть получены классическими способами, такими как описаны КоЬ1ег аиб ΜίΡκίΐ'ΐ (1975), или используя методики, описанные в δатЪ^оок е1 а1., А Ошбе 1о Μо1еси1а^ С1ойид, А ЬаЪота1оту Μаииа1, 2иб ебЫои (1989), используя вышеописанные антилиганды.
Более конкретно антилиганд по настоящему изобретению, который используют для получения антител, представляет собой антилиганд, состоящий из δΕΟ ΙΌ №. 20 или из δΕΟ ΙΌ №. 32.
В частности, в форме пептида, связанного с белком-носителем, таким как сывороточный альбумин или КЕН, обычно используемый для иммунизации.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей лиганд по изобрете- 1 024655 нию в качестве активного ингредиента. Этот лиганд может также присутствовать в фармацевтической композиции в форме 8сРу, РаЬ фрагмента или антитела.
Фармацевтическую композицию по изобретению применяют для лечения ΜδΚν-ассоциированных заболеваний.
В пределах значения по настоящему изобретению лечение охватывает либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в количествах, которые будут терапевтически эффективными и иммуногенными и, как известно в данной области техники, дозировка, которую вводят, зависит от индивидуума, подлежащего лечению.
В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения, включающему введение лиганда, 8сРу, РаЬ фрагмента или антитела или лиганда в любом молекулярном или подходящем терапевтическом векторе, сохраняющем его связующие свойства, как обсуждено выше, или фармацевтической композиции, как описано выше.
Способ лечения по изобретению направлен на лечение ΜδΚν-ассоциированных заболеваний.
ΜδΚν представляет собой ретровирус человека, впервые выделенный у пациентов с рассеянным склерозом (Реггоп, Н., В. Ьа1апйе, е! а1. (1991), Ьаисе! 337(8745): 862-3; Реггоп, Η., 1. А. Сагкоп, е! а1. (1997), Ргос Иа!1 Асай δα υδΑ 94(14): 7583-8). Ассоциированные заболевания или синдромы определяют присутствием у соответствующих пациентов либо (ί) специфичной РНК ΜδΚν или антигенов, предпочтительно обнаруженных в жидкостях организма (крови, спинномозговой жидкости, моче), либо (ίί) повышенного числа копий ДНК или РНК в клетках или тканях из органов с повреждениями или дисфункциями, либо (ίίί) специфичных белков или антигенов ΜδΚν в клетках или тканях, вовлеченных в процесс заболевания или клинического синдрома, либо (ίν) белков или антигенов ΜδΚν в жидкостях организма индивидуумов с заболеванием или тех, у которых выражен клинический синдром (как описано в примере 8, см. ниже, и в других ниже). Поскольку ΜδΚν обладает генетической гомологией с семейством эндогенных ретровирусов человека типа У (НЕКУ-У) (В1оий е! а1., 1999; Эо1ет 2005; Эо1е1 апй Реггоп, 2008), альтернативное или дополнительное определение ΜδΚν-ассоциированных заболеваний может быть также получено с нуклеиновыми кислотами, антигенами или белками НЕКУ-У, используемыми для таких же тестов на обнаружение (Ап!опу е! а1., 2004; Агт е! а1., 2007; КатНкоп е! а1., 2004; Μ;ιιικ1ί е! а1., 2007). Кроме того, экспрессия ΜδΚν может быть обусловлена повышающей регуляцией некоторых копий НЕКУ-ХУ, совместно обнаруживаемых в патогенных повреждениях (Μ;·ιιικ1ί е! а1., 2009). Таким образом, косвенное определение ΜδΚν-ассоциированных заболеваний включает связь с НЕКУ-У элементами.
ΜδΚν-ассоциированное заболевание выбрано из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению, клинически изолированный синдром (КИС, с неврологическим симптомом), хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет, такой как диабет типа 1 или типа 2, когда он связан с воспалением или нарушением иммунной регуляции и с присутствием продуктов экспрессии ΜδΚν, как определено выше.
В конкретной форме осуществления способ лечения ΜδΚν-ассоциированных заболеваний включает введение антитела 1дС4 или 1дС1 в качестве длительного лечения регулярно повторяющимися инъекциями.
В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей каждую из последовательностей, представленных δΕΟ ΙΌ Ио. 13, кодирующей ΟΌΚ1, δΕΟ ΙΌ Ио. 14, кодирующей СЭК2, δΕΟ ΙΌ Ио. 15, кодирующей СЭК3, δΕΟ ΙΌ Ио. 16, кодирующей ΟΌΚ4, δΕΟ ΙΌ Ио. 17, кодирующей СЭК5, и δΕΟ ΙΌ Ио. 18, кодирующей ΟΌΚ6.
В следующем аспекте нуклеиновая кислота кодирует УН цепь, и более конкретно она представлена δΙΤ) ΙΌ Ио. 10 или 12.
Нуклеиново-кислотная последовательность может также кодировать УЬ цепь, которая представлена последовательностями δΕΟ ΙΌ Ио. 9 или 11.
Любые нуклеиновые кислоты, гибридизующиеся в жестких условиях с нуклеиновыми кислотами, кодирующими по меньшей мере один из пептидов в соответствии с изобретением, также охвачены изобретением. Как используют в данной заявке, термин жесткие условия относится к условиям, которые дают возможность гибридизации между последовательностями зонда и нуклеотидной последовательностью, которую нужно определить. Подходящие жесткие условия могут быть определены, например, концентрациями соли или формамида в растворах прегибридизации и гибридизации, или температурой гибридизации, и хорошо известны в данной области техники. В частности, жесткость можно повысить путем снижения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации. Температурный интервал, соответствующий конкретному уровню жесткости, может быть дополнительно сужен путем вычисления отношения пурина к пиримидину интересующей нуклеиновой кислоты и соответствующего регулирования температуры. Вариации вышеописанных интервалов и условий хорошо известны в данной области техники.
Настоящее изобретение также относится к химерному гену, содержащему в функциональном сцеплении друг с другом по меньшей мере один промотор, который является функциональным в организме- 2 024655 хозяине, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением и терминаторный элемент, который является функциональным в том же организме-хозяине. Различные элементы, которые может содержать химерный ген, представляют собой, во-первых, элементы, регулирующие транскрипцию, трансляцию и созревание белков, такие как промотор, последовательность, кодирующая сигнальный пептид или транзитный пептид, или терминаторный элемент, составляющий сигнал полиаденилирования, и, во-вторых, полинуклеотид, кодирующий белок. Выражение в функциональном сцеплении друг с другом означает, что указанные элементы химерного гена сцеплены друг с другом таким образом, что на функцию одного из этих элементов влияет функция другого. Например, промотор функционально сцеплен с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию указанной кодирующей последовательности. Конструирование химерного гена в соответствии с изобретением и сборку различных его элементов можно осуществить, используя методики, хорошо известные специалистам в данной области техники, в частности, описанные в §атЬгоок е! а1. (1989, Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Νοίαη С еб., Νον Уогк: Со1б 8ргт§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк). Выбор регуляторных элементов, составляющих химерный ген, существенно зависит от организма-хозяина, в котором они должны функционировать, и специалисты в данной области техники способны выбрать регуляторные элементы, которые являются функциональными в данном организме-хозяине. Термин функциональный подразумевают как означающий способность функционировать в данном организме-хозяине.
Промоторы, которые могут содержать химерный ген в соответствии с изобретением, являются либо конститутивными, либо индуцибельными. Например, универсально эффективным промотором, используемым для экспрессии в клетках млекопитающих, является рСМУ (промотор цитомегаловируса).
В соответствии с изобретением химерный ген может также содержать другие регуляторные последовательности, которые локализованы между промотором и кодирующей последовательностью, такие как транскрипционные активаторы (энхансеры).
Настоящее изобретение также относится к клонирующему и/или экспрессионному вектору, содержащему химерный ген в соответствии с изобретением. Вектор в соответствии с изобретением предназначен для использования для трансформации организма-хозяина и экспрессии лиганда в этом организме. Этот вектор может представлять собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус. Предпочтительно вектор трансформации в соответствии с изобретением представляет собой плазмиду. Как правило, основными качествами этого вектора должна быть способность к поддержанию самого себя и самостоятельной репликации в клетках организма-хозяина, в частности, за счет присутствия точки начала репликации, и к экспрессии в них лиганда. В целях стабильной трансформации организма-хозяина вектор может также интегрировать в геном. Тогда композиция вектора может быть ограничена элементами, требующимися для синтеза лиганда в хозяевах. Выбор такого вектора, а также методики вставки химерного гена в соответствии с изобретением в этот вектор подробно описаны в §атЬгоок е! а1. (1989, Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, №1ап С еб., №ν Уогк: Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк) и составляют часть общих знаний специалистов в данной области техники. Предпочтительно вектор, используемый в настоящем изобретении, также содержит, в дополнение к химерному гену в соответствии с изобретением, химерный ген, кодирующий селективный маркер. Этот селективный маркер дает возможность отобрать организмы-хозяева, которые являются эффективно трансформированными, то есть те, которые включили вектор. Можно упомянуть гены, кодирующие легко идентифицируемые ферменты, такие как фермент ОИ8, или гены, кодирующие пигменты или ферменты, регулирующие продуцирование пигментов в трансформированных клетках. Такие селективные маркерные гены, в частности, описаны в заявках на патенты АО 91/02071, АО 95/06128, АО 96/38567 и АО 97/04103.
Настоящее изобретение также относится к трансформированным организмам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением, либо интегрированный в их геном, либо переносимый на экстрахромосомном генетическом элементе, например, на плазмиде. Термин организм-хозяин подразумевают как означающий любой низший или высший одноклеточный или околоклеточный организм, в который можно вводить химерный ген в соответствии с изобретением с целью продуцирования лиганда в соответствии с изобретением. Предпочтительно организм-хозяин представляет собой клетки СНО (яичника китайского хомячка) или НЕК (почечного эпителия человека).
Выражение трансформированный организм-хозяин подразумевают как означающий организмхозяин, имеющий включенный в его геном или в экстрахромосомный генетический элемент, например, плазмиду, по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением, и который, следовательно, продуцирует лиганд в своих тканях или в культуральной среде. Для получения организмов-хозяев в соответствии с изобретением специалисты в данной области техники могут использовать один из многих известных способов трансформации.
Один из этих способов состоит в приведении в контакт клеток или тканей организмов-хозяев, которые нужно трансформировать, с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и с векторами в соответствии с изобретением (СЬапд апб СоЬеп, 1979, Мо1. Оеп. Сепе! 168(1), 111-115; Мегсешег апб Сказку, 1988, Вюскшие 70(4), 503-517). Электропорация является другим способом, который состоит в воздействии на клетки или ткани, которые нужно трансформировать, и векторы по изобретению электрического поля (Апбгеакоп апб Еуапк, 1988, Вю1есктдиек 6(7), 650-660; §Ыдеката апб Оо\уег. 1989, Аикк 1. Вю1ескпо1. 3(1), 56-62). Дру- 3 024655 гой способ состоит в прямой инъекции векторов в клетки или ткани путем микроинъекции (Согбоп апб Кибб1е, 1985, Сепе 33(2), 121-136). Предпочтительно можно использовать биолистический способ. Он состоит в бомбардировке клеток или тканей частицами, на которых адсорбированы векторы по изобретению (Вгисе е! а1., 1989, Ргос. Наб. Асаб. δει. υδΆ 86(24), 9692-9696; К1еш е! а1., 1992, Вю1ееЬпо1оду 10(3), 286-291; υ.δ. Ра!. Ыо. 4945050).
Изобретение также охватывает способ получения лиганда, например, δεΡν, РаЬ фрагмента или антител, описанных выше, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, описанной выше, в условиях, которые дают возможность синтеза лиганда, РаЬ фрагмента или антитела.
Лиганд по изобретению характеризуется его связывающими свойствами с антилигандом. В конкретной форме антилиганд по изобретению характеризуется тем, что он состоит из аминокислотной последовательности, определенной δΕΟ ΙΌ Ыо. 20, где предпочтительный выбор представлен δΕΟ ΙΌ Ыо. 32.
Способ определения антилиганда в биологическом образце с использованием лиганда в форме δεΡν, РаЬ фрагмента или антитела в соответствии с настоящим изобретением также составляет часть настоящего изобретения. Этот способ включает стадии:
(а) приведение в контакт образца с лигандом в соответствии с изобретением, δεΡν, РаЬ фрагментом или антителом, как описано выше, (б) обнаружение специфического связывания антилиганда с указанным лигандом, δεΡν, РаЬ фрагментом или антителом в образце.
Указанный способ определения может быть выполнен с помощью дополнительной стадии приведения в контакт образца с лигандом, который специфично связывается с антигеном ΜδΚν САС, кодируемым геном дад ΜδΚν, как описано в Кошштап-Ргабе1 е! а1. ^то1оду, 1999; 260(1), радек 1-9.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение также относится к набору для иммунологического анализа на определение антилиганда в биологическом образце, включающему лиганд в соответствии с изобретением, δεΡν, РаЬ фрагмент или антитело, как описано выше, и реагенты для обнаружения специфичного связывания антилиганда с вышеописанным лигандом, РаЬ фрагментом или антителом, а также включающему все реагенты, необходимые для иммунологической реакции.
Указанный набор может дополнительно включать лиганд, который специфично связывается с антигеном САС, как определено выше.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение также относится к применению указанного набора для иммунологического анализа, как описано выше, при определении ΜδΚνассоциированного заболевания, выбранного из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению, клинически изолированный синдром, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет, и более конкретно диабет типа 1 или диабет типа 2.
Биологический образец может представлять собой сыворотку, мочу, слюну, материал биопсии и тому подобное.
Схема иммунологических анализов является общепринятой в данной области техники, и протоколы, такие как использование твердых носителей или иммунопреципитация, являются хорошо известными методами. Антитело может быть меченым в целях его обнаружения с использованием ферментативных, флуоресцентных, хемилюминесцентных, радиоактивных или красящих меток. Анализы, которые амплифицируют сигналы от иммунного комплекса, такие как анализы с использованием биотина и авидина или стрептавидина, и иммуноферментные анализы, такие как ΕΟδΆ или сэндвич-анализы, составляют часть настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: (А) аминокислотная последовательность ΫΕ, (В) аминокислотная последовательность νΗ, последовательности СОК подчеркнуты.
Фиг. 2: структура полноразмерного белка ΕΝν (ΕΝν-Τ) и фрагмент расщепления внешнего покрытия (ΕΝν 1 или ΕΝν-δυ).
Фиг. 3: Измерение оптической плотности с помощью колориметрии с субстратом пероксидазы, сравнивающее лиганд, представляющий собой мышиное антитело СЫЬАС1 (мышиный 1дС1 регох), и рекомбинантный фрагмент δεΡν с одним лигандом (δεΡν УН+УБ Ыо!).
Концентрация покрывающего антитела и лиганда каждого определения составляла 5 мкг/мкл каждого; разведение конъюгата стрептавидин-пероксидаза составляло 1/2000.
Фиг. 4: Измерение оптической плотности с помощью колориметрии с субстратом пероксидазы, сравнивающее лиганд, представляющий собой мышиное антитело СЫЬ АС1, и РаЬ связывающий фрагмент с одним лигандом. Концентрация лиганда и 1дС1 каждого определения составляла 10 мкг/мл + Рюкюн анти-РаЬ с пероксидазой или анти-1дС, разведенного при 1/250. Тестировали различные концентрации ΕΝν-Τ.
Фиг. 5: Тест СЫЬАС1 и химерных антител 1дС1 и 1дС4 в соответствии с изобретением на серийном разведении антигена ΕΝν (ΕΝν-Τ). Концентрация антител составляла 1 мг/мл, а разведение второго меченого пероксидазой антитела анти-1дС составляла 1/250. Антитело 2С5Ε12 представляет собой нереле- 4 024655 вантное антитело, которое не связывается с антигеном ΕΝν, используемое в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 6: Тест ΟΝόΛί'Ί и химерных конструкций 1дО1 и 1дО4 на постоянной концентрации антигена (ΕΝν-Τ) на двух партиях лигандов (А) партия 1, (В) партия 2. Концентрация антигена составляла от 1 до 0,0078 исходного мышиного моноклонального антитела (ΟΝόΛί'Ί). указанного как ши1§С, конструкций 1дО1 или 1дО4 человека с лигандом (указанных как йи1§С1 и йц1§С4), мкг/мл. Разведение второго антитела .Тасккоп 1дО против мыши или против человека составляло 1/250.
Фиг. 7: О№АС1, 8сРу, химерные конструкции антитела человека 1дО1 и 1дО4 с лигандом: ингибирование провоспалительной активации МКПК антигеном ΕΝν (ΕΝν δυ), которое представлено снижением 1Ь-6. Соотношение между антителом или §сРу и антигеном ΕΝν составляло 25/1.
Фиг. 8: Результаты АроН-РБ1ЗА. Сыворотки из европейского многоцентрового исследования по рассеянному склерозу тестировали вслепую в независимой лаборатории.
Фиг. 9: Антигенемия ΜδΚν-ΕΝν и ОАО у пациентов с шизофренией и в контролях. Использованы антитела 2А12А5 и 6А2В2 для ΕΝν и 2Ο5Ε12 для ОАО.
Фиг. 10: Оптическая плотность (ΘΏ) АроН-РБ1§А на определение антигена ΜδΚν-ΕΝν специфичным моноклональным антителом 6А2В2.
Фиг. 11: Клиническое наблюдение гуманизированных мышей §СГО, у которых развивается острое нервное воспаление и демиелинизация (экспериментальный аллергический энцефаломиелит, модель рассеянного склероза на животных): сравнение клинического результата групп, обработанных различными антителами, по сравнению с необработанными группами. Исходное мышиное моноклональное антитело (О№АС1) указано как ти1дО, конструкции 1дО1 или 1дО4 человека с лигандом указаны как йи1§О1 и Ьи1дО4.
Фиг. 12: Кривые выживаемости гуманизированных мышей §СГО, у которых развивается острое нервное воспаление и демиелинизация (экспериментальный аллергический энцефаломиелит, модель рассеянного склероза на животных): сравнение клинического результата групп, обработанных различными антителами, по сравнению с необработанными группами. Исходное мышиное моноклональное антитело (ΟΝΟ АС1) указано как ти1дО, конструкции 1дО1 или 1дО4 человека с лигандом указаны как йи1§О1 и Ьи1дО4.
Фиг. 13: Кривые массы тела каждой мыши ΝΘΟ-δΟΟ, тестируемой в предшествующем эксперименте.
Доза белка ΕΝν, инъецированного каждой мыши, указана в скобках. Последняя инъекция белка ΕΝν, эмульгированного в 1РА и РТХ (Р14), указана стрелкой. Мышей обозначили как М1 - М6, в соответствии с дозой ΕΝν, которую они получили, что указано после кода между скобками (от 0 до 20 микрограммов) в графической легенде. Прерывание кривых соответствует суткам гибели животного в соответствующей категории.
Фиг. 14: Концентрации глюкозы в крови (гликемия) у контрольных (контроль) и ΕΝνинъецированных мышей ΝΘϋ-δΟΟ (ΕΝν): сравнение между сутками первой инъекции (Р0) и одной неделей после последней инъекции (Р30). Гликемия, измеренная на Р30, выражена в виде процента от измерения на Р0 (ось Υ), в инъецированных контролем и ΕΝν-инъецированных группах (ось X: - контроли и ΕΝν).
Фиг. 15: Определение СОК тяжелой цепи антитела ΟΝΟ АС1.
15А: Аминокислоты, идентифицированные в соответствии с определением по Чозиа, представлены буквами меньшего размера. Аминокислоты, идентифицированные в соответствии с определением КаЬаО представлены подчеркнутыми буквами.
15В: В соответствии с предпочтительным определением, объединяющим оба определения, подчеркнуты исходные участки СОК мыши, которые нужно рассматривать для прививания функционального лиганда на вариабельную область тяжелой цепи антитела 1дО4 человека.
Фиг. 16: Определение СОК легкой цепи антитела ΟΝΟΛί'Ί. СОК, идентифицированные в соответствии с определением по Кэбету, подчеркнуты, СОК, идентифицированные в соответствии с определением по Контакту (нестандартным), имеют буквы меньшего размера.
Фиг. 17: Связывающая активность химерного антитела О№АС1 с иммобилизованным белком ΕΝν. Условия описаны в тексте соответствующего примера На оси Υ представлено измерение оптической плотности (ΘΟ) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ΕΝν. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ΕΝν, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете.
Фиг. 18: Связывающая активность гуманизированного антитела Н2/УК3 с иммобилизованным ΕΝν. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Υ представлено измерение оптической плотности (ΘΟ) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ΕΝν. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ΕΝν, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете.
- 5 024655
Фиг. 19: Связывающая активность гуманизированного антитела Н4А/К3 с иммобилизованным ΕΝν. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Υ представлено измерение оптической плотности (ΘΌ) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ΕΝν. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ΕΝν, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете.
Фиг. 20: Сравнение связывающей активности гуманизированного антитела Н2А/К3 (Н2ук3) и химерного антитела (0№АС1 1дС4) с иммобилизованным ΕΝν. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Υ представлено измерение оптической плотности (ΘΌ) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ΕΝν. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ΕΝν, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете.
Фиг. 21: Очищенное антитело Н2УК3 в невосстанавливающем геле. Условия описаны в тексте соответствующего примера. Слева числа кДа указывают уровни (полосы), на которые стандартные белки с определенной молекулярной массой (кДа) мигрировали в геле, как показано на левой дорожке изображения. Очищенное антитело Н2А/К3 показано (стрелка) в виде одной полосы на средней дорожке изображения, где бычий сывороточный альбумин (стандарт в буферах антитела, в качестве контроля, указанного стрелкой при различной молекулярной массе), показан на правой дорожке изображения.
Фиг. 22: Сравнение связывающих активностей очищенного Н2А/К3 (очищенного НН2+НУК3) и очищенного химерного антитела (0№АС1 1дС4) с иммобилизованным ΕΝν (0,5 мкг/мл).
На оси X представлена концентрация химерного 1дС4 или отобранного гуманизированного антитела в нанограммах/мл. На оси Υ представлена оптическая плотность, измеренная путем колориметрии, соответствующая количеству антитела, связанного с иммобилизованным белком ΕΝν постоянной концентрации в анализе.
Фиг. 23: Аминокислотные последовательности тяжелой цепи Н2 и легкой цепи УК3 гуманизированного антитела.
Аминокислоты в буквах полужирным шрифтом подстрочного индекса представляют собой мышиные аминокислоты, содержащиеся в каркасной области, на основании их консенсус-положения с последовательностями человеческого антитела, проанализированными в базах данных.
Фиг. 24: Провоспалительные цитокины претерпевают сильную повышающую регуляцию стимуляцией клеток-астроцитов белками, родственными ΗΕΚν-ν ΕΝν. Результаты представлены в виде средних значений трех повторов. ΕΝν: ΜδΚν-ΕΝν; Синцитин: ΗΕΚν-ν ΕΝν из копии хромосомы 7ς: X: Нерелевантное антитело (контроль изотипа); Мышиное анти-ΕΝν: мышиное антитело 0№АС1; Химерное анти-ΕΝν: Химерный 1дС4 человека и 0№АС1; пг/мл: пикограммы на миллилитр.
Фиг. 25: Культуры мононуклеарных клеток периферической крови.
Результаты представлены в виде средних значений трех повторов. ΕΝν: ΜδΚν-ΕΝν; Синцитин: ΗΕΚν-ν ΕΝν из копии хромосомы 7ς; X: Нерелевантное антитело (контроль изотипа); Мышиное антиΕΝν: мышиное антитело СШАСЕ Химерное анти-ΕΝν: Химерный 1дС4 человека и СШАСЕ пг/мл: пикограммы на миллилитр.
Фиг. 26: Определение гликозилированных белков, родственных ΗΕΚν-ν ΕΝν, человека с тремя формами лиганда С№АС1 (мышиное, химерное и гуманизированное антитело). А) Определение гликозилированных белков, родственных ΗΕΚν-ν ΕΝν, человека с мышиным антителом СШАСЕ В): Определение гликозилированных белков, родственных ΗΕΚν-ν ΕΝν, человека с химерным антителом СШАСИ С): Определение гликозилированных белков, родственных ΗΕΚν-ν ΕΝν, человека с гуманизированным антителом. Ось Υ: Оптическая плотность; Ось X: Бактериальный белок ΜδΚν-ΕΝν (партия ΕΝν-Τ 7А); Бактериальный поверхностный фрагмент ΜδΚν-ΕΝν (партия ΕΝν-δυ 4А); Гликозилированный синцитин человека; Гликозилированный белок ΜδΚν-ΕΝν человека (партия ΕΝν-Τ Р1).
Фиг. 27: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально ΜδΚν ΕΝν или контрольным раствором (контроль):
Г оризонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Υ-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Υ- (В) локомоторная активность после воздействия изобретения в нескольких моментах времени после интрацеребральной инъекции крысам (Р5, Р6, Р7, Р11 и Р12) в контроле (раствор ФСБ - фосфатно-солевой буфер), ΕΝν-ίον (ΕΝν инъецированные интрацеребральные желудочки) и ΕΝν-Ырр (гиппокамп).
Фиг. 28: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально ΜδΚν ΕΝν или контрольным раствором (контроль):
Г оризонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Υ-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Υ- (В) локомоторная активность после инъекции крысам физиологического раствора в контроле, ΕΝν-ίον и ΕΝν-Ырр при Р11.
Фиг. 29: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально ΜδΚν ΕΝν или контрольным раствором (контроль):
- 6 024655
Г оризонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Υ-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Υ - (В) локомоторная активность после стресса ограничения контрольных, ΕΝΥ-ίαν и ΕΝν-Ырр крыс при Р13.
Фиг. 30: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально ΜδΚν ΕΝν, показывающее терапевтический эффект лиганда 1дС4 С№АС1:
(A) Горизонтальная локомоторная активность, измеренная в открытом поле, после воздействия изобретения при Р12 и при Р32 - как показано на оси Х- у контрольных крыс, не обработанных крыс, инъецированных ΕΝν (ΕΝν+), и 1дС4-обработанных ΕΝΥ+ крыс, как указано в легенде (B) Подтверждение терапевтического эффекта лиганда 1дС4, наблюдаемого при Р32 с горизонтальной локомоторной активностью после стресса ограничения; ее измеряли как число пересеченных линий на оси Υ в открытом поле после стресса ограничения после повторной системной инъекции белка ΕΝν у контрольных крыс, необработанных крыс ΕΝν+ и 1дС4-обработанных крыс ΕΝν+, как указано на оси X.
Фиг. 31: Исследование ΕΝν-положительных бестимусных мышей с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда 1дС1 С№АС1.
Селезеночный индекс (ось Υ), вычисленный на контрольных и 1дС1-обработанных мышах (ось X) через 19 суток после инъекции клеток лимфомы. Селезеночный индекс вычисляли следующим образом: [(масса селезенки/масса тела) х 100]. Не перекрывающиеся границы ошибок указывают на статистическую значимость.
Фиг. 32: Исследование ΕΝν-положительных мышей 8СГО с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда 1дС1 С№АС1.
Соотношение массы селезенки/тела (ось Υ) вычислено на необработанных и 1дС1-обработанных мышах 8СГО через 7 суток после инъекции клеток В-лимфомы. Соотношение массы селезенки/тела вычисляли следующим образом: [(масса селезенки/масса тела) х 100].
Фиг. 33: Исследование ΕΝν-положительных мышей 8СГО с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда 1дС1 С№АС1.
Число жизнеспособных и мертвых лимфобластоидных клеток - ось Υ - (А), и других лейкоцитов (В) в перитонеальной жидкости, собранной у контрольных и 1дС1-обработанных мышей - ось X -, через 7 суток после инъекции клеток лимфомы и через 6 суток после инъекции антитела.
Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения без ограничения каким-либо образом настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Анализ мышиного специфичного антитела (С№АС1): идентификация последовательности и структуры молекулярного лиганда, специфичного к белку ΜδΚν ΕΝν и его эквивалентам
Гибридому мыши получали после слияния миеломы мыши и клеток селезенки от мышей Ва1Ь-С, иммунизированных рекомбинантным белком ΜδΚν, продуцированным в Е. сой и очищенным из клона ΜδΚν ΕΝν, как описано в Котштап-Ртабе1, Р., С. РагаиЬо8-Васса1а, е! а1. (1999), Упо1о8у 260(1): 1-9).
ПЦР амплификацию областей УН и УЬ из данной гибридомы, продуцирующей 1дС1/каппа (СИЬАСЦ проводили в соответствии с приведенным ниже протоколу.
Поли(А+) РНК экстрагировали и очищали из 5х 107 клеток гибридомы, продуцирующих 1дС1/каппа, используя набор для очистки мРНК (АтеткЬат Вюкшепсе) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратную транскрипцию проводили с 800 нг мРНК, используя набор для ОТ-ПЦР (АтеткЬат Вюкаепсе) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК, кодирующую последовательности генов вариабельных областей легкой (νκ) и тяжелой (Ун) цепей, получали, используя способ быстрой амплификации концов кДНК (ΚΆΟΕ), как описано ранее (РиЬетй е! а1., 1994, I. 1ттипо1. Мебюбк 173, 33-39).
Прямой праймер представлял собой приведенную ниже последовательность δΕρ ГО №. 21 (ΚΆΟΕГогоатб), обратные праймеры представляли собой приведенные ниже последовательности: δΕρ ГО №. 22 (СЬ_А1а130_РмЦ) для νκ амплицикации и δΕρ ΙΌ №. 23 (СН1_Рго119_Р\\б) для Ун амплификации, с буквенным кодом Р = А/С, К = С/Т, Н = А/Т/С. Обратные праймеры СЬ_А1а130_Васк№атб и СН1_Рто119_Васк№атб, выведенные из консенсус-последовательностей, опубликованных КаЬа! е! а1. (1991) δе^иеηсе8 оГ рго1еш8 оГ 1ттипо1одюа1 иНегекЬ №бопа1 1п8Й1и1е оГ НеаНЪ ВеГОекба, ΜΌ), специфичны к Ν-концам домена каппа/СЬ мыши и домена 1дС/СН1, соответственно.
Продукты ПЦР получали, используя Тас| ДНК полимеразу, и непосредственно лигировали в векторе рСР®2.1-ТОРО®, используя набор для ТА клонирования Дпубтодеп) в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательности клонированных ДНК определяли путем секвенирования на автоматическом секвенаторе АВ1310, используя набор Иуе ТепшпаЮг Сус1е δе^иепс^п§ Кеабу Кеасбоп Кб (АррНеб Вю8у81ет8).
В результате этих ПЦР амплификации с последующими стадиями клонирования и секвенирования получили последовательности νκ и Ун цепей, которые представлены δΕρ ГО №. 7 и 8, соответственно, по их аминокислотным последовательностям, выведенным из исходных нуклеотидных последовательностей. Кроме того, анализ этих аминокислотных последовательностей дал возможность идентификации участков, определяющих комплементарность (СИР), вовлеченных в специфичность лиганда (в соответ- 7 024655 ствии с КаЬа1 (\Уи апБ КаЬа1 1970, Ап апа1у515 оГ (Нс 5сс.|испсс5 оГ (Нс уапаЫе гедюш оГ Вепсе 1оие8 рго1еш8 апБ туе1ота НдН( сНатк апБ (Не1г ЧтрПсайопк Гог апйЬоБу сотр1етеп(ап(у. 1. Ехр. МеБ. 132: 211-250; КаЬа! е1 а1. 1987, 1991, 8ециепсе5 оГ рго1ет5 оГ 1ттипо1од1са1 т1еге51; 4* еБп. И8 Соу(. Рйпйпд ОГГ. Ыо. 165-492), или на основании структуры в соответствии с СНоФ1а (СНоФ1а апБ Ьекк 1987, Сапошса1 5(гис1иге5 Гог Фе НурегуапаЫе гедюп5 оГ Нптипод1оНиПп5. 1. Мо1. Вю1. 196: 901-917; СНоФ1а е1 а1. 1989, СопГогтаНоп5 оГ 1ттипод1оЬи1т НурегуапаЫе гед1оп5. Ыа(иге 342: 877-883).
Три последовательности СОК, идентифицированные на аминокислотной последовательности УН (фиг. 1 В), соответствуют 8ЕО ГО Ыо. 4, 8ЕЦ ГО Ыо. 5 и 8ЕЦ ГО Ыо. 6, и три последовательности СОК, идентифицированные на аминокислотной последовательности УЬ (фиг. 1 А), соответствуют 8ЕО ГО Ыо. 1, 8ЕО ГО Ыо. 2 и 8ЕЦ ГО Ыо. 3. Эти шесть последовательностей СГОК представляют собой коровые минимальные последовательности, требующиеся для связывающей специфичности лиганда, и, следовательно, рассмотрены в любой композиции или молекулярной конструкции, сохраняющей активность настоящим идентифицированного специфичного лиганда. Тем не менее, специалистам в данной области техники известно, что несколько аминокислот могут быть заменены аминокислотами с эквивалентными свойствами, сохраняя, таким образом, специфичность исходных последовательностей лиганда и делая его эквивалентным лигандом. Такие вариации известны как возможные в пределах максимального диапазона 10-12%.
Пример 2: Пример получения и очистки антигена М8КУ ЕЫУ для иммунизации мышей с целью получения анти-ЕЫУ реактивных спленоцитов для образования специфичных гибридом
Источник: плазмида рУ14 из вириона М8КУ (Репой, Боцуш-МагсНе е1 а1. 2001), содержащего белковую последовательность, соответствующую номеру доступа базы данных (ЫСВ1-Еп(ге//СепЬапк): АЕ331500.1.
На фиг. 2 представлена структура полноразмерного белка ЕЫУ (ЕЫУ-Т, 8ЕЦ ГО Ыо. 19) и фрагмент поверхностного отщепления (ЕЫУ 1 или ЕЫУ-8И, 8ЕЦ ГО Ыо. 24). На фиг. 2 сигнальный пептид начинается с остатка № 1 (метионин) и оканчивается остатком № 29 (треонин).
Способ получения
После лигирования кодирующей последовательности ЕЫУ-Т, предоставленной Сепеаг( (США), в экспрессионной плазмиде, экспрессионном векторе рЕТ-15Ь, поставляемом Ыоуадеп (ЕМЭ СНетюа15, 1пс., С1ЬЬ5(о\уп. ЫБ, США), в соответствии с инструкциями изготовителя и трансформации бактерий штамма ВЬ21 Е. сой путем классической пермеабилизации СаСЬ, как описано в ГОЫА 15о1айоп апБ 8ес.]иепсФд (Е55епйа1 ТесНпц.]ие5 8епе5) Ьу Вгисе А. Кое, БиБу 8. СгаЫгее апБ АкЬаг 8. КНап РиЬФНеБ Ьу БоНп М1еу & 8оп5, 18ВЫ 0-471-97324-0 ЦР625.Ы89К64 1996 БоНп М1еу & 8оп5, и в Мо1еси1аг Вю1оду ТесНпк|ие5: Ап НКегМуе ЬаЬогаФгу Соиг5е (РарегЬаск) Ьу КаФаппе С. Ие1Б (АиФог), ^а11 Кеат (АиФог), трансформированные бактерии выращивают в среде ЬВ в присутствии 30 мкг/мл канамицина 37°С до оптической плотности.
Затем экспрессию белка индуцировали 1 мМ ИПТГ (изопропил-в-О-1-тиогалактопиранозид), и культивирование продолжали при 37°С в течение 4 ч.
Способ экстракции
После центрифугирования при 5000 д в течение 20 мин при 4°С бактериальный осадок ресуспендируют в 20 мл/л культуры лизирующего буфера (Трис 20 мМ рН 7,5; ЫаС1 0,15 М; лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин 1 мкг/мл, РМ8Р 1 мМ, МдС12 2 мМ, лизоцим 50 мкг/мл). Раствор инкубируют в течение 30 мин при 4°С при встряхивании, а затем обрабатывают ультразвуком на льду/этаноле (4 стадии по 7 мин при 80% 0,5). Добавляют ДНКазу 1 мМ, и раствор инкубируют один час при 4°С при встряхивании, суспензию центрифугируют при 40000 д в течение 30 мин при 4°С.
Осадок ресуспендируют в 7,5 мл/л культуры солюбилизирующего буфера (Трис 20 мМ рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, мочевина 2 М, ДСН 1,5%, β-меркаптоэтанол 50 мМ). Раствор инкубируют 2 ч при 8°С при встряхивании.
Затем суспензию центрифугируют при 40000 д в течение 30 мин при 10°С.
Способ очистки
Надосадочную жидкость мочевины разводят в 5 раз в буфере Трис 20 мМ рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, ДСН 1,5%.
Очистку проводят на 1 мл/л культуры с помощью аффинной хроматографии на колонке Ы1 8ерНаго5е Ра51 Е1о\у (АтегеНат Вю8с1епсе). Надосадочную жидкость наносят при 2 мл/мин на смолу после уравновешивания буфером Трис 20 мМ, рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, мочевина 500 мМ, ДСН 1,5%, βмеркаптоэтанол 10 мМ. Элюирование Епу осуществляют ступенчато 30 и 50 мМ имидазола.
Очистку проводят обессоливающей колонкой (АтекНат Вю8с1епсе, 25 мл смолы). Пул после аффинной хроматографии наносят при 2 мл/мин на смолу после уравновешивания буфером Трис 20 мМ, рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, ДСН (додецилсульфат натрия) 1,5%, ДТТ 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером.
После этого белки наносят при 1 мл/мин на колонку для гель-фильтрации 8ирегБех 200 (АтекНат Вю5с1епсе), уравновешенную буфером Трис 20 мМ рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, ДСН 1,5%, ДТТ (дитиотреитол) 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером.
- 8 024655
Удаление эндотоксинов
Очистку проводят с помощью колонки Лсйс1еаи (АтегкЬат Вюкаепсе, 8 мл смолы). Пул наносят на смолу при 1 мл/мин после уравновешивания буфером Трис 20 мМ рН 7,5, ЫаС1 150 мМ, ДСН 1,5%, ДТТ 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером.
Контроли качества партии
Масс-спектрометрия ΜΑΒΌΙ-ΤΟΡΡ (времяпролетный спектр с ионизацией лазерной десорбцией из матрицы): нельзя использовать в связи с ДСН.
Ν-Концевое секвенирование: АЬРУХТРЬРТ
Анализ на эндотоксины: < 5 МЕ/мл
Характеристики партии:
Условное насыщение раствора: 100%
Чистота: > 90%
Концентрация: 0,05 мг/мл
Хранение: -80°С
Количество: 1,5 мг
Буфер: Трис 20мМ рН 7,5, №С1 150 мМ, ДСН 1,5%, ДТТ 10 мМ
Пример 3: Данные ίη νίίτο активности связывания лиганда, специфичного к антигену М§КУ ΕΝν
I - Задача
Авторы изобретения оценили сродство лиганда к рекомбинантному антилиганду в форме рекомбинантного белка δсΡν из клонированных последовательностей νΉ+νΕ или в форме РаЬ фрагмента, выщепленного из исходного мышиного С№АС1 (содержащего расщепленные цепи νΗ+νΣ без функции и структуры мышиного антитела), способом иммунологического анализа (ЕЬ18А). Этот лиганд сравнивали с исходным мышиным С№АС1 и с молекулярными конструкциями, содержащими лиганд, встроенный в константные области цепей 1дО1 или 1дО4 человека, и пригодные последовательности для их применения в качестве фармакологических векторов.
II - Материал и способы
a) Клонирование νΗ и νΕ
Клонирование и нуклеотидное секвенирование вариабельной области О№ АС1 легкой (νΣ) и тяжелой (νΗ) цепей
Поли(А+)РНК экстрагировали и очищали из 5х107 клеток гибридомы, продуцирующей антитело СШ АС1, используя набор для очистки мРНК (АтегкЬат Вюкшепсе) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратную транскрипцию проводили с 800 нг мРНК, используя набор для ОТ-ПЦР (АтегкЬат Вюкшепсе) в соответствии с инструкциями изготовителя.
кДНК, кодирующую последовательности генов вариабельной области легкой (νΕ) и тяжелой (νΗ) цепей, была получена с использованием способа быстрой амплификации концов кДНК (КАСЕ), как описано ранее (КиЬеШ еί а/, 1994, ТЬе ике οί Ые КАСЕ тейюй ίο с1опе ЬуЬпйота с^NΑ \уЬеп ν гедюп рптегк Гай. ί. 1ттипо1. Мейюйк 173, 33-39). Прямой праймер был следующим: КАСЕ прямой (δΕβ ΙΌ Νο. 21). Обратные праймеры были следующими: СЬ_А1а130_обратный (δΕΟ ГО Νο. 25) для амплификации νΕ и СН1_Рго119_обратный (δΕΟ ΙΌ Νο. 26) для амплификации νΗ, с буквенным кодом К = А/С, К = С/Т, Н = А/Т/С.
Обратные праймеры СЬ_А1а130_обратный и СН1_Рго119_обратный, выведенные из консенсуспоследовательностей, опубликованных КаЬаί еί а1. (1991, δе^иеηсек οί р^οίе^ηк οί ^ттиηο1οд^са1 иНегекЕ №йюпа1 ЛкийЦе οί ИенЬИ ВеЛекйа, ΜΌ), специфичны к Ν-концам мышиного домена каппа/СЬ и домена 1дС/СШ, соответственно.
Продукты ПЦР получали, используя Тас.| ДНК полимеразу, и непосредственно лигировали в вектор рСК®2.1-ТОРО®, используя набор для клонирования ТА (ЬгуЦгодеп) в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательности клонированных кДНК определяли путем секвенирования на автоматическом секвенаторе АВ1310, используя набор Эуе ТегттаЮг Сус1е δе^иеηс^ηд Кеайу Веас1юп Кй (АррЬей В^οкукίетк).
b) Конструирование и экспрессия δсΡν δсΡV получали в соответствии с методами, описанными в МаНаю А., еί а1. 2008, Сепепйюп апй сЬа^асίе^^ζайοη οί а Ьитап кшд1е-сЬаш ГгадтеШ \гапаЬ1е (δοΡν) ак^йу адатк! суЮкте йеат1паке Ггот УеакЕ М. ВМС В^есЬюЕ δер 10; 8:68.
c) РаЬ из антитела С№АС1
РаЬ получали в соответствии с методами, описанными в БеЛтс С., БеЛтс М.Р. Ак^йу епдшеегшд апй реткресГОек ш Легару. ВюсЫт1е. 1990 δер; 72(9): 639-51.
II - 1 Материал
II - 1а Моноклональные антитела
Лиганд, молекулярные конструкции на основе ЦС человека или С№АС1, были получены и очищены в приведенных ниже концентрациях:
- 9 024655
Таблица 1. Концентрации различных лигандов, 8сРУ, РаЬ и антител
Название Концентрация
ОЫЬАС1 5,91 мг/мл
Лиганд в 1дО1 человека 1 мг/мл
Лиганд в 1дС4 человека 2 мг/мл
Мышиный РаЬ 1 мг/мл
Рекомбинантный δοΡν 1 мг/мл
II - 1Ь Рекомбинантные белки
Оба рекомбинантных белка, полноразмерный ΜδΚν ΕΝν (ΕΝν-Τ) и фрагмент, представляющий собой поверхностный домен (ΕΝν-δυ), были получены фирмой Рго!еш Ехрей в Е.соП и далее очищены, как описано в примере 2.
Таблица 2. Концентрация рекомбинантных белков
Название белка Концентрация Эндотоксин
ΕΝν-Τ 0,15 мг/мл <5 ед/мл
ΕΝν-δυ 0,20 мг/мл <5 ед/мл
II - 1с Сэндвич-анализ ΕΜδΑ
Микропланшеты покрывали 100 мкл на лунку иммобилизованного антитела анти-ΕΝν (3СГО5, поставляемого фирмой ЬюМепеих), разведенного в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,6. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С.
Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05% (фосфатно-солевого буфера с 0,05% Твин 20; δίβΐηα Р7949). После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 200 мкл ФСБТ 0,05 и 5% молока на лунку. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при КТ при легком встряхивании.
Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Микропланшеты инкубировали с 100 мкл на лунку антигена ΕΝν (ΕΝν-Τ или ΕΝν-δυ), разведенного в ФСБТ 0,05%. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании.
Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 100 мкл на лунку идентифицирующего антитела (О№АС1 или рекомбинантного фрагмента δсРν), разведенного в ФСБТ 0,05 и 5% молока. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании. О№АС1 было мечено пероксидазой, а δсРν было мечено биотином фирмой δΓ|ΐι;·ιπχ. Германия.
Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (1 таблетка ортофенилендиамина (ОРИ), разведенная в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера рН 5) и 10 мкл Н2О2 30% (приготовленного в последний момент). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
Добавляли 50 мкл на лунку останавливающего раствора 2 н. Η2δΟ4.
Поглощение считывали при 490 нм в пределах 30 мин после остановки реакции.
II - 16 Прямой анализ ΕΜδΑ на микропланшетах, покрытых антигеном ΕΝν (ΕΝν-Τ или ΕΝν-δυ, как описано выше)
Микропланшеты покрывали 100 мкл/лунка антигена ΕΝν, разведенного в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,6. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 2 ч при 37°С при легком встряхивании.
Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл/лунка ФСБ (фосфатно-солевого буфера). После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 100 мкл/лунка идентифицирующего антитела в соответствии с настоящим изобретением (0№АС1 или его РаЬ фрагмента), разведенного в ФСБ с БСА 1% (ФСБ с 1% бычьего сывороточного альбумина). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании.
Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл/лунка ФСБ. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 100 мкл/лунка второго идентифицирующего антитела, разведенного в ФСБ с БСА 1% (антиПдО 1аск8ои - разведение 1/250; либо !дС против мыши, пероксидаза 1аск8ои 115-035-146, либо !дС против мыши пероксидаза 1аск8ои 115-035-062, в соответствии с первым антителом). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании.
- 10 024655
Микропланшеты промывали 6 раз 250 мкл/лунка ФСБ. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера.
Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (1 таблетка ортофенилендиамина (ΟΡΌ), разведенная в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера рН 5) и 10 мкл Н2О2 30% (приготовленного в последний момент). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
Добавляли 50 мкл на лунку останавливающего раствора 2 н. Η2δΟ4.
Поглощение считывали при 490 нм в пределах 30 мин после остановки реакции.
III - Результаты
III - 1 Сэндвич-анализ ЕЫБА: 1§С1 мыши (О№АС1) и δοΡν
Таблица 3. Концентрации иммобилизованного антитела против идентифицирующего лиганда с пероксидазой или биотином для каждой концентрации антигена или контрольного буфера. Результаты соответствуют измеренным оптическим плотностям
ЗСЮ5 партия 060405С802 1дС161ЧЬАС1 пероксидаза ЗСЮ5 партия 060405С302 ЗсРу биотин
Меченое Меченое
Εην 8и 0,5 мкг/мл 2,695 1,289
Εην ЗЫ 0,1 мкг/мл 1,036 0,656
Εην ЗЫ 0,02 мкг/мл 0,294 0,455
ФСБТ 0,05% 0,101 0,411
Εην Т 0,5 мкг/мл 1,807 1,085
Εην Т 0,1 мкг/мл 0,862 0,594
Εην Т 0,02 мкг/мл 0,215 0,443
ФСБТ 0,05% 0,143 0,420
ФСБТ: фосфатно-солевой буфер с 0,05% Твин 20
Результаты анализа ЕЫ§А, проведенного в параллели с δοΡν и исходным ΟΝόΆί'Ί. представлены при различных условиях на фиг. 3.
Концентрация иммобилизованного антитела и идентифицирующего лиганда составляла 5 мкл/мл для каждого; разведение конъюгата стрептавидин-пероксидаза составляло 1/2000.
Авторы изобретения анализировали ΟΝόΆί'Ί и рекомбинантное δοΡν в качестве идентифицирующих лигандов в сэндвич-анализе ΕΜδΆ против рекомбинантных белков ΕΝν-δυ и ΕΝν-Τ. Как видно на фиг. 3, при одной и той же концентрации МАЬ и δοΡν способны идентифицировать белки ΕΝν при ΟΌ более половины от для δοΡν, когда !дС является двухвалентным, а δοΡν является одновалентным. Следовательно, относительно числа связывающих сайтов на молекулу, изолированный лиганд дал лучшие результаты, чем полноразмерный мышиный ^О. Таким образом, функции антитела не являются необходимыми, и такие улучшенные результаты для изолированного лиганда были неожиданными.
III - 2 Прямой анализ ΕΜδΆ: О№АС1 и ΡаЬ
Таблица 4. Концентрации иммобилизованного антитела против меченых пероксидазой идентифицирующих лигандов (прямое мечение) для каждой концентрации антигена или контрольного буфера.
Авторы изобретения анализировали ^01 мыши и его ΡаЬ фрагмент в качестве идентифицирующих лигандов в сэндвич-анализе ΕΜδΛ против рекомбинантного белка ΕΝν-Τ. Как видно на фиг. 4, при одной и той же концентрации одновалентный ΡаЬ идентифицирует белок ΕΝν при оптической плотности, более высокой или равной двухвалентному !§О. Опять же, видно, что изолированный лиганд неожиданно дает лучшие результаты, чем полноразмерный ^О.
Таким образом, можно сделать вывод, что повторно функции антитела не являлись необходимыми, и что лиганд сам более эффективен, чем природный ^О мыши.
Пример 4: Схема, конструирование и анализ ίη νίΐτο молекулярный конструкций с константными цепями !β01 и !β04 человека и лигандом
- 11 024655
После подтверждение неожиданно улучшенных характеристик изолированного лиганда, содержащего одновалентные связывающие сайты, либо с природными (РаЬ), либо с рекомбинантными (ксРу) последовательностями УН и УЪ при идентификации антигена-мишени в иммунологическом анализе, авторы изобретения разработали и сконструировали рекомбинантные последовательности для получения химерных молекул 1дО1 или 1дО4 человека, содержащих последовательности лиганда (УН+УР). Таким образом, авторы изобретения получили полноразмерные антитела в качестве молекулярных векторов для лиганда и оценивали их с помощью иммунологических анализов в сравнении с исходным мышиным 1дО.
С целью получения этих рекомбинантных векторов антител со встроенным лигандом клоны были адаптированы для их экспрессии в клетках
СНО, и антитела были получены и очищены фирмой Ро1уттип, Вена, Австрия. Технические условия для получения этих антител с соответствующими векторами суммированы ниже:
Получение рекомбинантных клеточных линий СНО ОНЬАС1_1дО1 и ОНЬАС1_1дО4
В данном разделе описан источник генов рекомбинантного моноклонального антитела ОИЬАС1, экспрессируемого рекомбинантным путем в виде химерного 1дО1 и 1дО4 человек/мышь, где константные области являются человеческими, а вариабельные области представляют собой исходные последовательности УН и УЪ, как описано в 8ЕЦ ГО Νο. 8 и 8ЕЦ ГО Νο. 7 соответственно.
Экспрессионные плазмиды
Химерные легкие цепи (ЬС) СШАС1 1дО1
Базовая экспрессионная плазмида представляет собой имеющуюся в продаже рС1пео (Рготеда), которую использовали на первой стадии для вставки оптимизированной по кодонам (оптимизация использования кодонов в клетках СНО, разработанная фирмой ОЕХЕАКТ, также включающая оптимизацию структуры мРНК) каркасной области легкой цепи каппа человека, включающей секвенированную сигнальную последовательность иммуноглобулина каппа, и константной области цепи каппа человека с промежуточными сайтами рестрикции для вставки любой вариабельной области легкой цепи. В соответствии с первичной последовательностью УЪ (8ЕЦ ГО Νο.7) ΟΕΝΕΛΒΤ АО (Регенсбург, Германия) была синтезирована синтетическая нуклеотидная вставка, включающая сайты рестрикции в 3' конце сигнальной последовательности и 5' сайте области легкой цепи каппа, для вставки оптимизированной по кодонам вариабельной области УЪ (8ЕЦ ГО Νο.27) в открытый ВМ\У1 и Асс111 эукариотический экспрессионный вектор, несущий оптимизированную по кодонам каркасную область легкой цепи каппа человека 1дО1Ь кодоны - под контролем промотора СМУ. Кроме того, вектор содержит неомицинфосфотрансферазу для селекции клеток СНО с О418. 8ЕО ГО Νο.28 указывает нуклеотидную последовательность конструкции, связывающей оптимизированные 1дО1 Ь кодоны и УЪ кодоны, используемой для экспрессии в клетках СНО.
Химерные тяжелые цепи (НС) ОИЬАС1 1дО1
Клонирующий вектор для создания эукариотического экспрессионного вектора О№АС1 1дО1 состоит из двух эукариотических экспрессионных кассет с идентичными регуляторными областями. Этот вектор уже содержит оптимизированную по кодонам (оптимизация использования кодонов в клетках СНО, разработанная фирмой ОЕХЕАКТ, также включающая оптимизацию структуры мРНК) каркасную область 1дО1 человека, включающую сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина и константную область 1дО1 человека с промежуточными сайтами рестрикции для вставки любой вариабельной области тяжелой цепи.
Информация по аминокислотной последовательности вариабельной области (УН) мышиного моноклонального антитела О№АС1 представлена в 8ЕО ГО Νο. 8. В соответствии с этой первичной последовательностью ОЕХЕАКТ была синтезирована синтетическая нуклеотидная вставка, включающая сайты рестрикции (в 3' конце сигнальной последовательности и в 5' сайте области СН1 гамма-цепи, для вставки оптимизированной вариабельной области тяжелой цепи (8ЕО ГО Νο.29) - УН кодоны - в открытый по Аде1 и Мк1 эукариотический экспрессионный вектор, несущий оптимизированный по кодонам каркас 1дО1 человека под контролем промотора 8У40. Кроме того, вектор содержит дигидрофолатредуктазу мыши в качестве второй экспрессионной кассеты для использования в качестве маркера селекции/амплификации в культуре клеток животных. 8ЕО ГО Νο.30 представляет нуклеотидную последовательность конструкции, связывающей оптимизированные кодоны 1дО1Н-каркас человека и оптимизированные УН кодоны, используемой для экспрессии в клетках СНО.
Химерная тяжелая цепь (НС) О№АС1 1дО4
Клонирующий вектор для создания эукариотического экспрессионного вектора О№АС1 1дО4 состоит из двух эукариотических экспрессионных кассет с идентичными регуляторными областями и является таким же, как для конструкции 1дО1
Однако поскольку константная область 1дО4 человека была недоступна, полноразмерная тяжелая цепь, включающая сигнальную последовательность, вариабельная область тяжелой цепи (УН) мышиного О№АС1 и константная область 1дО4 человека были синтезированы фирмой ОЕХЕАКТ.
8ЕО ГО Νο. 31 показывает нуклеотидную последовательность кодирующей области химерной оптимизированной тяжелой цепи О№АС1 1дО4 (1дО4Н кодоны). Затем вставку встраивали в открытый по Νοΐ1 и 8ас11 эукариотический экспрессионный вектор, получая в результате конструкцию, показанную в
- 12 024655 δΕΟ ΙΌ Νο. 32, которая связывает оптимизированные кодоны 1дО4Н и оптимизированные кодоны УН, используемую для экспрессии в клетках СНО.
Все плазмиды были клонированы в 0ΕΝΕΛΚΤ. а затем трансформированы в штамм Е.сой ТОР10. Рекомбинантные бактерии размножали в 50 мл среды ЬВ/Ашр, и плазмиды выделяли с помощью набора Рготеда РигеУ1е1б™ Р1акт1б ΜίάίρΓβρ 8ук1ет5. Выход и чистоту плазмид контролировали фотометрическим путем и по отношению оптической плотности при 260 и 280 нм, определенному по меньшей мере как 1,5.
Получение рекомбинантных клеточных линий СНО 0№АС1_1д01 и 0№АС1_1д04
Методика трансфекции
Клетки яичника китайского хомячка с дефицитом по дигидрофолатредуктазе (называемые СНО бМг-, АТСС по. СКЬ 9096) были выбраны в качестве родительской клеточной линии для создания конечной экспрессионной линии. Эти клетки, имеющие происхождение из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), размножали в культивационной среде, состоящей из ΌΜΕΜ с добавлением 4 мМ Ьглутамина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,016 мМ тимидина (НТ), 0,25 г/л соевого пептона, 0,1% Р1игошс Р-68 и свободной от белка добавки (Ро1утип Заепййс) при отношении деления 1:6 дважды в неделю.
Для трансфекции использовали 5х106 клеток, промытых один раз базовой средой и ресуспендированных в 10 мл полной среды. Полиплексы образовали путем инкубации 900 мкл полиэтиленимина (1 мг/мл ПЭИ линейного, М\У: 25000, Ро1укс1епсе5 1пс.) с 12 мкг плазмиды НС и 12 мкг плазмиды ЬС в суммарном объеме 2 мл в течение 30 мин при КТ. Взаимодействие полиплексов с клетками СНО в 12 мл продолжалось в течение 4 ч, после чего их центрифугировали при 170 д, отбрасывали надосадочную жидкость и ресуспендировали клетки в культивационной среде. Через 24 полную среду заменяли 50 мл селективной среды, состоящей из ΌΜΕΜ с добавлением 4 мМ Ь-глутамина, 0,25 г/л соевого пептона, 0,1% Р1игошс Р-68, свободной от белка добавки (Ро1утип Зшепййс) и 0,5 мкг/мл 0418. Высевали 100 мкл клеточной суспензии на лунку в пять 96-луночных планшетов. В результате четырех экспериментов по трансфекции (конструкцию 1дО1Н кодоны + УН кодоны котрансфицировали с конструкцией 1дО1 Ь кодоны + УЬ кодоны для химерного 0№АС1-1д01; конструкцию 1д04Н кодоны + УН кодоны котрансфицировали с конструкцией 1д01 Ь кодоны + УЬ кодоны для химерного 0№АС1-1д04) получили суммарно 20х 96-луночных планшетов (соответствующих 1920 лункам) на подтип 1дО.
После 10-14 суток в образовавшиеся клоны добавляли 100 мкл среды амплификации, состоящей из 0,048 мкМ МТХ (метотрексата) в селективной среде. К растущим клонам снова добавляли еще 100 мкл среды амплификации, содержащей 0,048 мкМ МТХ, а затем анализировали в двойном сэндвич-анализе ЕЫ8А. В ЕЫ8А использовали поликлональную сыворотку, специфичную против цепи гамма человека для иммобилизации и НКР-конъюгированное поликлональное антитело против цепи каппа человека для идентификации.
Отобранные клоны с высоким продуцированием адаптировали к 0,19 мкМ МТХ в селективной среде.
В табл. 5 описана селекция на лучшие продуценты 0№АС1 1дО1 и 0№АС1 1дО4 при 0,096 и 0,19 мкМ МТХ в колбах Ру Т25 и роллерных сосудах.
В случае ОЫЬАС1_1дО1 авторы изобретения выбрали клон 6В6 и в случае ОЫЬАС1_1дО4 авторы изобретения выбрали клон 7С1. В случае ОШАС.’1_1дО1 провели криоконсервацию трех клонов, 0Ν6 АС1_1д01_6В6, 0Ν6 АС1_1д01_8Н2 и 0№АС1_1д01_18А8, и в случае ОИЬАС1-1дО4 провели криоконсервацию двух клонов, 0ΝΕ АС1_1д04_6С1 и 0ΝΕ АС1_1д04_7С1. Лучший клон был субклонирован способом ограничивающих разведений, например, описанным в 'Мокси^ С1ошпд: А ЬаЬогакгу Μαοικι! (ТЫгб Ебйюп) ккерй ЗатЬгоок, Ре1ег ΜасСа11ит Сапсег ИъШШе. Ι^^νιη-κ. Аиккайа; Нау1б Ки55е11, Со1б Зрппд НагЬоиг ЬаЬогакгу Воокк.
Субклонирование лучших продуцирующих трансфектантов 0№АС1_1д01_6В6 и
ОЫЬАС1_1дО4_7С1
Субклонирование осуществляли в 96-луночных планшетах с 90, 30 и 10 клетками на лунку в среде амплификации, в случае 0№АС1_1д01_6В6: с 0,19 мкМ метотрексатом (81дта, ΜΤΧ) и 50% надосадочной жидкостью культуры 0№АС1_1д01_6В6, фильтрованной через 0,2 мкм; в случае ОИЬАС1_1дО4_7С1: с 0,19 мкМ МТХ и 50% надосадочной жидкостью культуры ОИЬАС1_1дО4_7С1, фильтрованной через 0,2 мкм. Растущие лунки адаптировали к 0,38 мкМ МТХ в 96-луночных планшетах, анализировали с помощью ЕЫ8А и размножали в колбах Т25 для дальнейшего скрининга и адаптации к 0,77 мкМ МТХ.
В табл. 6 описана селекция на лучшие субклоны-продуценты 0№АС1 1дО1_6В6 и 0Ν6 АС1 1дО4_7С1 при 0,77 мкМ МТХ в колбах Ру Т25 и роллерных сосудах.
Лучшим продуцентом в случае ОИЬАС1 _1дО1_6В6 был клон 0№АС1_1д01_6В6_10Е4, а в случае ОИЬАС1_1дО4_7С1 клон 0№АС1_1д04_7С1_15В7. Эти два клона были выбраны для дальнейшего развития клеточной линии.
Провели криоконсервацию двух клонов 0№АС1-1д01: 0№АС1-1д01_6В6_ГО1,
ОЫЬАС1_1дО1_6В6_10Е4 и двух клонов О\Ь АС1-1дО4: 0№>АС1-1д04_7С1_3Е11, О\Ь АС1- 13 024655
1§С4_7С1_15В7.
Субклонирование лучших субклонов-продуцентов СХЬЛС1-1дС1_6В6_10Е4 и СШЛС11§С4_7С1_15В7
Процедуру конечного субклонирования снова проводили в 96 в 96-луночных планшетах с 90, 30 и 10 клетками на лунку в среде амплификации, в случае СХЬЛС1_1дС1_6В6_10Е4 с 0,77 мкМ МТХ и 50% надосадочной жидкостью культуры СХЬЛС1_1дС1_6В6_10Е4, фильтрованной через 0,2 мкм, в случае СХЬЛС1_1дС4_7С1_15В7 с 0,77 мкМ МТХ и 50% надосадочной жидкостью культуры СХЬЛС1_1дС4_7С1_15В7, фильтрованной через 0,2 мкм. Растущие лунки анализировали с помощью ЕЬ18А, лучшие продуценты размножали в колбах Т25 и роллерных колбах (8р125) для дальнейшего скрининга.
В табл. 7 описана селекция на лучшие продуценты субклонов ОИЬЛО 1§С1_6В6_10Е4 и СШЛСИ 1§С4_7С1_15В7 при 0,77 мкМ МТХ в колбах Ру Т25 и роллерных колбах.
В случае СХЬЛС1_1дС1 проводили криоконсервацию двух клонов СХЬЛС1_1дС1_6В6_10Е4_18С7 и СХЬЛС1_1дС1_6В6_10Е4_18П12, в случае С\ЬЛС1_1дС4 двух клонов СХЬЛС1_1дС4_7С1_15В7_3Е4 и СХЬЛС1_1дС4_7С1_15В7_5С10 после роллерных культур.
Таблица 5. Лунки, отобранные после трансфекции и адаптации к различным уровням МТХ 0ИЪЛС1-1§01: 0,096 мкМ МТХ
В Т25: счет клеток Е+05 кл/мл титр мкг/мл сутки удельный титр пг/кл*сут£
6В6 6,9 14,2 4 5,2
8Н2 5,6 4,0 3 2,3
18А8 В5р125: 3,8 3,3 3 2,9
6В6 2,6 11,5 4 11,3
8Н2 5,0 3,5 3 3,1
18А8 4,2 4,0 3 2,4
£: пикограммы на клетку в сутки.
После адаптации к 0,19 мкМ МТХ
ВТ25: счет клеток Е+05 кл/мл титр мкг/мл сутки удельный титр пг/кл^ут^
6В6 5,3 7,4 3 4,7
8К2 4,2 4,0 3 3,2
18А8 5,5 3,4 3 2,0
Пикограммы/клетка
СХЬЛС1-1дС4: 0,096 мкМ МТХ
ВТ25: счет клеток Е+05 кл/мл титр мкг/мл сутки удельный титр [пг/кл*сут]
61С 4,1 9,6 3 7,9
7С1 В5р125: 2,3 3,7 3 5,4
6С1 5,5 14,3 3 8,6
7С1 4,5 10,9 3 8,2
После адаптации к 0,19 мкМ МТХ
ВТ25: счет клеток Е+05 кл/мл титр мкг/мл сутки удельный титр [пг/кл*сут]
6С1 3,6 11,8 3 10,8
7С1 4,7 12,5 3 8,8
- 14 024655
Таблица 6. Отобранные субклоны после первого субклонирования при 0,77 мкМ МТХ
0№АС14§01
счет клеток титр сутки удельный титр
Е+05 кл/мл мкг/мл [пг/кл*сут]
ВТ25:
ОМЬАС1-1дО1„6В6_Ю1 4,8 23,4 4 12,1
СМЬАС1-1дО1_6В6-ЮЕ4 3,4 11,9 3 11,8
В3р125:
0№АС1-1д01_6В6_Ю1 4,0 12,9 3 10,8
ОЫЬАС1-1дО1_6В6-ЮЕ4 3,5 10,9 3 10,4
0ХЬАС1-1§04
ВТ25: счет клеток Е+05 кл/мл титр мкг/мл сутки удельный титр [пг/кл*сут]
СЫЬАС1-1дО1_7С1 _ЗЕ11 3,8 7,8 3 7,0
ОМЬАС1-1дО4_7С1 15В7 3,1 11,5 4 9,3
В3р125: СИЬАС1-1д61_7С1 _ЗЕ11 5,1 16,7 3 10,9
ОЫЬАС1-1дО4_7С1 _15В7 4,5 14,7 3 11,0
Таблица 7. Отобранные субклоны после второго (конечного) субклонирования при 0,77 мкМ МТХ 0№АС14§01
СЫЬАС1- счет клеток Е+05 титр сутки удельный титр
1дО1_6В6_ЮЕ4...: кл/мл мкг/мл [пг/кл*сут]
ВТ25:
18С7 7,2 18,5 4 6,4
18ϋ12 9,6 18,4 4 4,8
В3р125:
1807(160608) 4,1 21,6 4 13,3
18012(160608) 4,0 15,0 4 9,5
1807(190608) 6,2 20,9 3 11,3
18ϋ12 (190608) 6,5 15,7 3 8,1
1807(230608) 4,7 20,9 4 11,1
18ϋ12 (230608) 5,3 18,6 4 8,7
18С7 (260608) 2,7 11,2 3 13,8
18ϋ12 (260608) 3,5 10,6 3 10,1
0№АС14д04
ΟΝ6ΑΟ1- счет клеток Е+05 титр сутки удельный титр
1дО4_7С1_15В7_...: кл/мл мкг/мл [пг/кл*сут]
В Т25:
ЗЕ4 4,1 25,6 4 15,6
5С10 5,2 30,5 4 14,8
В Зр125:
ЗЕ4 (160608) 3,0 20,0 4 16,6
5010(160608) 3,4 20,2 4 14,7
ЗЕ4 (190608) 4,3 20,9 3 16,2
5010(190608) 4,2 23,2 3 18,5
ЗЕ4 (230608) 3,3 20,8 4 15,9
5010(230608) 3,0 21,4 4 18,1
ЗЕ4 (260608) 2,5 16,7 3 22,1
5010(260608) 2,6 16,4 3 21,3
Таким образом, были получены рекомбинантные векторы антитела ^01 и ^04 со встроенным лигандом, соответствующим шести последовательностям СОК, как описано в примере 1. Эти векторы, со- 15 024655 держащие шесть СОК, анализировали в следующем примере, чтобы определить положительное и отрицательное влияние векторов и, таким образом, предложить селекцию и/или адекватное применение для каждого из них.
Пример 5: Исследование лиганда и его химерных конструкций на основе ^01 и ^04 против исходного мышиного Σ§01: сродство ίη νίΙΐΌ
Материалы и методы были такими же, как описано в примерах 3 и 4.
5а ΕΟδΑ с различными концентрациями полноразмерного белка ΜδΚν-ΕΝν (ΕΝν-Τ)
Таблица 8. Оптические плотности (ΟΌ) измеряли с помощью ΕΟδΑ с различными лигандами (1 микрограмм) или нерелевантным контролем (205Ε12) на различных концентрациях (левая колонка, в микрограммах) антилиганда (ΕΝν-Τ), нанесенного на лунки микротитрационного планшета. Связывание выявляют меченым пероксидазой антителом антибд (1/250; .Тасккоп-^А) и взаимодействием с субстратом пероксидазы. Среднее значение всех ΟΌ из нерелевантного контроля составляет 0,1004, и их стандартное отклонение (δΌ) составляет 0,0205, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверительном интервале: среднее+3*δ^ = 0,1618. Все представленные значения с конструкциями 0ИЬАС1, следовательно, являются значимыми для специфичного связывания с белком-мишенью.
[ΕΝν-Τ 7А] 0Ν5Α01 химерное 1дС1 паотия 2 0ЫЬАС1 химерное 1дС4 паотия 2 СЫЬАС1 Мышиное 06041ЗС801 2С5Е12 Мышиное 010227РР01
3 3 2,998 0,082
0,5 3 2,889 2,899 0,12
0,25 2,891 2,524 2,837 0,093
0,125 2,393 1,985 2,285 0,111
0,0625 1,804 1,522 1,565 0,092
0,03125 1,562 1,367 1,341 0,066
0,0156 1,257 1,021 1,299 0,125
0,0078 0,815 0,692 0,625 0,114
Авторы изобретения анализировали антитело 0ИЬАС1 и химерные варианты ^01 и ^04 в качестве идентифицирующих антител в сэндвич-анализе ΕυδΛ против рекомбинантного белка ΕΝν. Как видно на фиг. 5 и в табл. 8, при одинаковой концентрации мышиное и химерные МАЬ способны идентифицировать присутствующие концентрации белков ΕΝν при сходной кинетике. Специфичность и относительное сродство новых конструкций (лиганд в человеческом векторе), таким образом, сохраняется и обе конструкции, как с Σ§01, так и ^04 человека, с лигандом обеспечили человеческие химерные антитела, способные идентифицировать пикограммы рекомбинантного белка ΕΝν. Это неожиданно хорошо и подтверждает оптимизацию, достигнутую на протяжении всех условий схемы, конструирования и экспрессии. Это также подтверждает селекцию стабильной и прочной структуры лиганда, как описано в примере 1.
Кроме того, данный опыт обеспечивает средства идентификации молекул, эквивалентных лиганду, посредством значимости их связывания с исходным антилигандом (ΕΝν), как доказано здесь с лигандом (0ИЬАС1) против нерелевантного несвязывающего лиганда (205Ε12).
Антиген Εην-Τ наносят на лунки микротитрационного планшета Ε^IδΑ с серийными разведениями, находящимися в диапазоне от 1 мкг/мл до примерно 0,01 мкг/мл.
Стандартный лиганд (0ИЬАС1) и нерелевантный лиганд (205Ε12) тестируют при 1 мкг/мл и выявляют вторым антителом (здесь вторым антителом анти-[д0, меченым пероксидазой, от 1аск§оп Ы6, США, разведенным 1/250, на которое здесь далее ссылаются как на ^0 (Η+Ь) против мыши 1аск§оп или ^0 против человека 1аск§оп, США).
Кривая со стандартным лигандом показывает насыщение сигнала (оптическую плотность, более высокую или равную 3) при самой высокой концентрации ΕΝν и прогрессивно снижается до оптической плотности примерно 1,0-0,5, что, таким образом, свидетельствует о кривой доза-ответ, типичной для специфической связывающей активности (выше вычисленного статистического порогового значения 0,1618; см. табл. 8). Параллельно нерелевантная молекула (205Ε12) не показывает кривую доза-ответ (средне пологая кривая) и колеблется между оптической плотностью 0,1 и 0,05 при любой концентрации ΕΝν, ниже вычисленного статистического порогового значения 0,1618 (табл. 8).
Таким образом, о любой молекуле, эквивалентной лиганду, может, таким образом, свидетельствовать либо
1) Существование кривой доза-ответ в данном тесте, в условиях настоящего примера, как показано в параграфе 5а, и
2) Отсутствие пологой кривой, колеблющейся ниже статистического вычисленного порога (среднее + три стандартных отклонения) значений оптической плотности, полученных с нерелевантным антителом (см. 205Ε12 в табл. 8), по сравнению со значениями выше порога, полученными со стандартным 0ИЬАС1 для концентрации ΕΝν 0,01 микрограмма/мл (см. табл. 8);
- 16 024655 либо
3) Существование кривой доза-ответ в тесте, который описан ниже, с серийными разведениями лиганда и фиксированной концентрацией антилиганда, в параграфе 5Ь (табл. 9), и
4) Отсутствие пологой кривой, колеблющейся ниже статистического вычисленного порога (среднее + три стандартных отклонения) значений оптической плотности, полученных с нерелевантным антителом (см. 2С5Ε12 в табл. 9), по сравнению со значениями выше порога, полученными с соответствующим стандартом СЫЬАС1 при концентрации 0,01 микрограмма/мл, в тех же условиях, как описано в параграфе 5Ь (см. табл. 9).
5Ь ББФА с различными концентрациями МАЬ
Таблица 9. Оптические плотности, измеренные с помощью ББФА с серийными разведениями лиганда и фиксированной концентрацией антилиганда (ΕΝν-Τ; 0,01 микрограмма/мл), нанесенного на лунки микротитрационного планшета. Связывание выявляют меченым пероксидазой антителом анти-1дС (1/250; .Тасккоп-ША) и взаимодействием с субстратом пероксидазы.
1дС против мыши (Н +Ι.) Ьасквоп 1/250 1дС против человека Ьасквоп 1/250
Концент рация ОЫЬАС1 мышиное 2С5Е1 2 ΘΝΟΑΟ шяш ΟΝόΑΟ 1-1Я<34 Контроль буфер 2Θ5Ε12 ΘΝΡΑΟΙ- 1яС1 еиьАс 1-1дС4
1 2,065 0,077 0,738 0,753 0,05 0,046 1,78 1,696
0,5 1,926 0,085 0,586 0,43 0,047 0,056 1,724 1,741
0,25 2,149 0,069 0,365 0,374 0,046 0,049 1,535 1,499
0,125 2,029 0,071 0,221 0,238 0,048 0,046 1,544 1,248
0,0625 1,965 0,074 0,221 0,189 0,047 0,045 1,205 1,154
0,03125 1,728 0,074 0,171 0,156 0,047 0,047 0,906 0,929
0,0156 1,681 0,066 0,093 0,105 0,051 0,048 0,55 0,511
0,0078 0,964 0,072 0,073 0,087 0,061 0,073 0,276 0,372
При идентификации второго антитела против мыши среднее значение всех ΘΌ из нерелевантного контроля составляет 0,0735, и их стандартное отклонение (δΌ) составляет 0,0057, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверительном интервале: среднее + 3*δΌ = 0,0907. Все представленные значения с соответствующим мышиным СЫЬАС1, таким образом, являются значимыми для специфического связывания белка-мишени. При идентификации второго антитела против человека среднее значение всех ΘΌ из нерелевантного контроля составляет 0,0513, и их стандартное отклонение (δΌ) составляет 0,0094, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверигельном интервале: среднее + 3*δΌ = 0,0796. Все представленные значения с химерными конструкциями СЫЬАС1, таким образом, являются значимыми для специфического связывания белка-мишени.
На фиг. 6 видно, что как мышиное антитело 1дС СЫЬАС1, так и химерные варианты 1дС1 и 1дС4 эффективны в качестве идентифицирующих антител в сэндвич-анализе ББФА против рекомбинантного белка ΕΝν-Τ в столь низких количествах, как несколько нанограммов очищенного 1дС для определения менее чем нескольких нанограммов белка ΕΝν.
Кроме того, поскольку 1дС против человека или мыши перекрестно не реагирует ни с исходным мышиным антителом, ни с химерными конструкциями с каркасами 1дС1 или 1дС4 человека, встроенный лиганд (УН+УБ) не создает какую-либо нежелательную модификацию и не определяется в человеческих конструкциях в данных условиях.
5с Сродство С№АС1 к ΕΝν-Τ
Таблица 10. Определение связывающего сродства лиганда, встроенного в векторы антитела 1дС4 и 1дС1 (единицы указаны в таблице)
ΕΝν-Τ при половине определения тАЬ [мг/л] Концентрация Εην [М] Сродство [М] ММ Ηΐδ- ΕΝν- Т [г/моль]
|дС1 0,25 1.07Е-09 2.46Е+08 61,440
|дО4 0,35 5.70Е-09 1.76Е+08
5б Изоэлектрическая точка СМЪАС1
Изоэлектрическую точку С№АС1 определяли в соответствии с методами, описанными в Ргас!1опа!юп оБ сотр1ех рго!еш тХигек Ьу Нцшб-рЬаке 1кое1ес1г1с Босикшд. Неу ί., РоксЬ А., СоЬеп А., Бш Ν., НагЬегк А. Мебюбк Мо1 Вю1. 2008; 424: 225-39.
Изоэлектрическая точка конструкций 1дС1 (рь 8,3) и 1дС4 (рь 7,53) весьма полезна и будет определять стабильность и условия хранения для терапевтического применения. Нейтральная рь 1дС4, таким образом, лучше для приготовления препарата терапевтического МАЬ, который можно применять в качестве длительного лечения с регулярно повторяющимися инъекциями. Таким образом, 1дС4 с этой точки зрения является предпочтительной конструкцией.
Пример 6: Исследование лиганда и его конструкций на основе 1дС1 и 1дС4 человека по сравнению с С№АС1: ингибиторная активность в отношении провоспалительных цитокинов в культурах мононукле- 17 024655 арных клеток периферической крови (МКПК) человека
Материалы и методы
Культуральная среда
МКПК культивировали в ΚΡΜΙ С1и!атах (СьЬсо) + 10% ФБС (Βίο^βδΐ δ1810 δοιιΐΐι Атепса) + 1% неэссенциальные аминокислоты + 1% пируват + 1% пенициллин - стрептомицин, при 37°С в атмосфере 6,5% СО2.
Приготовление препарата МКПК из лейкоцитарных пленок
Лейкоцитарные пленки получены от ИиС.
Кровь, разведенную ФСБ-ФБС 2% (4 мл + 31 мл), осторожно наслаивают на 15 мл фиколла и центрифугируют при 2850 об/мин (1650 д)/20 мин/комнатная температура/без перерыва.
Затем МКПК осторожно собирают и промывают 3 раза ФСБ-δνΡ 2% и центрифугируют при 1500 об/мин/10 мин.
Затем клетки считают и замораживают в δΥΡ 90% + ДМСО 10%.
Приготовление препарата МКПК из замороженных клеток
МКПК, хранящиеся при -80°С, оттаивают при 37°С, промывают 3 раза средой и центрифугируют при 1500 об/мин/10 мин.
Затем клетки считают и разводят до концентрации обычно 1 х 106 клеток/мл.
Тест на ингибирование
Смесь ΕΝν + ΜАЬ готовят перед тем, как оттаивают МКПК. ΜАЬ (выбранное отношение с ΕΝν) + ΕΝν (выбранная концентрация) смешивают в каждой лунке 48-луночных планшетов в 100 мкл среды и инкубируют 1 ч при +4°С.
Затем МКПК добавляют в каждую лунку для получения конечной концентрации 1х 106 клеток/мл (конечный объем на лунку 0,5 мл или 1 мл). Клетки инкубируют в течение 24, 48 или 72 ч при 37°С, 5% СО2.
Надосадочные жидкости собирают центрифугированием при 1400 об/мин/10 мин/КТ и хранят при 20°С.
II - 2ά Доза цитокинов
Цитокины дозируют из наборов ДК РЫагттдеи НЕ^А для 1Ь-6, 1Ь-12р40, ΤΝΡ-α и ΙΡΝ-γ. Следовали протоколу поставщика.
Таблица 11. Доза цитокинов в различных надосадочных жидкостях культур МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови) с различными лигандами или без лигандов
И-6 ΙΡΝ-γ
пг/мл Ответ (%) Ингибирование (%) пг/мл Ответ (%) Ингибиро вание(%)
Партия ΕΝν МАЬ Отношение МАЬ/ΕΝν-Τ 72 ч
ΕΝν-зи 4А 0,5 мкг/мл Нет МаЬ 88742 100 558 100
θν8αοι мышиное 1дО1 25/1 42250 48 52 270 48 52
ОЫЬ АС1 3εΡν 25/1 56675 64 36 661 118 -18
Химерное человеческое
ΟΝΟΑΟΙ 1дС1 2008 25/1 32871 37 63 606 109 -9
ΘΝΟΑΟΙ 1дС4 2008 25/1 52954 60 40 318 57 43
Авторы изобретения протестировали с помощью клеточных тестов МКПК потенциал антител по изобретению или δсΡν в отношении ингибирования взаимодействия между белком ΕΝν и клетками (посредством рецептора ΤΡΚ4) и, следовательно, продуцирования провоспалительных цитокинов, таких как
- 18 024655
ГО-6 (врожденный иммунитет) и ГРИ-γ (иммунитет, опосредованный Т-лимфоцитами). различные молекулы тестировали при одинаковом соотношении (моль/моль) с белком (25/1), так чтобы можно было сравнить их характеристики.
Как видно на фиг. 7 и в табл. 11, все молекулы лиганда, как мышиного, так и рекомбинантного происхождения (ксГО или конструкции !дС1 и ШС4 с лигандом) обладают ингибиторными свойствами и сохраняют их, что представлено на основании снижения провоспалительных цитокинов (ГО-6), продуцируемых МКПК.
Тем не менее, видно, что СИЬАС1 и рекомбинантный человеческий ШС4 со встроенным лигандом эффективны при активации лимфоцитов (где оба снижают продуцирование интерферона-гамма), тогда как ксРУ (здесь, наиболее вероятно, в связи с одновалентностью) и конструкция на основе !дС1 человека были значительно менее эффективны в отношении ингибирования интерферона-гамма. Здесь тот факт, что область Рс ШС1 человека обладает проактивными эффектами в отношении иммунных клеток человека, ясно показывает, что это свойство может уравновешивать ингибиторные эффекты лиганда на данный тип активации лимфоцитов ЕИУ. С тем же лигандом в векторе на основе ШС4 человека (который не является иммунологически проактивным) проявляется ингибиторный эффект двухвалентного лиганда, как в исходном мышином Ι§&
По этой причине, как и для описанного в разделе 5й примера, ШС4 был бы предпочтительной конструкцией, когда иммунных функций антител следует избегать. Как выявлено в данном случае, функции антитела не только являются необходимыми для ингибиторного эффекта (при условии, что продуцируется двухвалентный лиганд, поскольку моновалентный ксРУ обладает слабой эффективностью), но также выявлены как вредные для ингибиторного эффекта лиганда.
Что касается эффекта на продуцирование ГО-6 (из моноцитов/макрофагов и, возможно, также Влимфоцитов), !дС1 и ШС4 выявлены как эквивалентные и проявляют хорошее ингибирование, которое отличается от того, которое наблюдали с интерфероном-гамма. Интересно, что одновалентный ксРν проявляет меньшее, но значимое ингибирование данного цитокина врожденного иммунитета. Таким образом, некоторые иммунные активации хорошо ингибируются обоими векторами, на основе ШС1 и ШС4 человека, с лигандом, но ШС4 проявляет уникальное ингибирование как врожденного иммунитета (результаты ГО-6), так и приобретенного иммунитета (результаты ГРИ-гамма) клеток из МКПК человека.
Интересно, что вектор Ι§Ο1, тем не менее, обеспечивает более сильное ингибирование провоспалительных цитокинов врожденного иммунитета (представленных здесь примером ГО-6) и запускает некоторые клоны Т-клеток (что отражено дозами интерферона-гамма), что может проявлять пользу в некоторых механизмах противовирусной защиты.
Таким образом, авторы изобретения подтвердили высокое сродство и биологическую активность лиганда в форме фармацевтической доставки, состоящей из векторов антитела человека, с общим сродством связывания и специфичностями, но различающимися иммунными эффектами в зависимости от их изотипа.
Пример 7: Молекулярная идентификация связывающего сайта лиганда на белке-мишени ЕИУ (связывающей последовательности антилиганда)
Эпитопное картирование исходного мышиного ШСЕкаппа (СИЬАС1) получено Рерксап ВУ., Нидерланды.
На основании этих результатов идентифицирована аминокислотная последовательность связывающего сайта лиганда, которая должна быть включена в последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ Ио. 20.
Включенный в вышеуказанную последовательность, лучший эпитоп-мишень, состоит в С-концевом участке отщепленного домена δυ (ЕИУ1) в полноразмерном белке ЕИУ (ЕИУ-Т) и более конкретно соответствует приведенной ниже выбранной аминокислотной последовательности, представленной в δΕΟ ΙΌ Ио. 32.
Эта последовательность антилиганда (и его выбранная последовательность) не исключительно, но также содержится внутри первичной аминокислотной последовательности белка оболочки ΜδΚν (ЕИУ), как описано в примере 2.
Тем не менее, специалистам в данной области техники известно, что аминокислоты могут быть замещены их функциональным эквивалентом и, в данном случае, могут дать подобный связывающий сайт с другой последовательностью. Кроме того, описаны мимеотопы ΜδΚν ЕИУ, которые могут эффективно связываться со специфическими антителами ОоГОМ-Веупаий, С., Н. Реггоп, е! а1. 1999, ’^ресШсШек оГти1йр1е кс1егок1к сегеЬгокр1па1 йшй апй кегит апйЬоФек адатк! пйтоЮрек, С1т Iттипо1 93; 3: 283-93).
Пример 8: Доказательства присутствия белка-мишени ΜδΚν-ЕИУ у пациентов с ΜδΚνассоциированными заболеваниями: Примеры ассоциированных заболеваний или патологических синдромов при рассеянном склерозе, клинически изолированном (неврологическом) синдроме (КИС), хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии (ХВДП), шизофрении и эпилепсии
8а Рассеянный склероз, клинически изолированные синдромы и полиневропатии
Материалы и методы
Иммунологическая доза антигенемии ЕИУ
- 19 024655
Предварительный сбор сыворотки
Исследование было одобрено этическими комитетами Университетских клиник Кретея и Гренобля, Франция. Были включены неврологические пациенты из обоих центров. Все пациенты давали письменное информированное согласие перед включением. Здоровых доноров крови рекрутировали из центров переливания крови Гренобля и Монпелье. Неневрологические контроли были получены из Гренобля. Клинические данные по пациентам указаны в Результатах. Аликвоты образцов сыворотки от пациентов с РС и здоровых контролей кодировали и посылали в независимую лабораторию для слепого тестирования АроН ЕЫ8А в условиях колориметрического считывания.
Европейский многоцентровой сбор сыворотки:
Исследование было одобрено этическими комитетами медицинского факультета университета Вюрцбурга в Германии, университета Сассари, клиники Дона Карло Ньокки Милана в Италии, клиники университета Марселя во Франции и университета Памплона в Испании. Было включено 74 пациентов с определенным РС в соответствии с критерием Мак-Дональда (МсИопа1б, СотркФп е! а1., 2001) и 14 с клинически изолированными синдромами (КИС). Соответствующие клинические данные и данные по лечению представлены ниже в табл. 12 (МсИопа1б, СотрзЮп е! а1. 2001). В случае рецидива РС образцы крови брали до начала лечения стероидами. Аликвоты образцов сыворотки от пациентов с РС и здоровых контролей кодировали и посылали в независимую лабораторию для слепого тестирования АроН ЕЫБА в условиях колориметрического считывания.
Сбор образцов: Собирали одну пробирку крови (7мл сухая пробирка Β&Ό). Образцы обрабатывали в пределах 2 ч после сбора. После свертывания крови их центрифугировали в течение 10 мин при 2800 д при 14°С. Затем сыворотку собирали и делили на аликвоты по 250 мкл в эппендорфовские пробирки. Аликвоты хранили замороженными при -20°С.
Иммунологический анализ АроН-ЕЫБА
Колориметрический способ: На микротитрационные планшеты, покрытые АроН (АРОН ТесЬпо1одьек, Монпелье, Франция), наносили образцы сывороток, разведенные в Трис-НС1 50 мМ рН 7,6; планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С; затем планшеты промывали четыре раза ФСБ; очищенное мышиное тАЬ анти-ΒΝν разводили ФСБ, содержащим 5% БСА, до концентрации 10 мкг/мл и добавляли. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем промывали четыре раза ФСБ. Добавляли меченый пероксидазой 1дС козы против мыши (Н+Ь; §1§та), разведенный 1:5000 в ФСБ, содержащем 5% БСА, планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем промывали шесть раз ФСБ. Добавляли раствор субстрата ОРИ, и планшеты инкубировали в течение 30 мин в темноте. Цветовую реакцию останавливали 2 н. Н2§О4. Поглощение считывали при 490 нм с помощью считывающего устройства Тесап. Статистическое пороговое значение (С.О., сШ-оГГ) данного теста определяли на серии отрицательных сывороток от 50 здоровых доноров крови (ДК) с получением результата от трех повторов от индивидуальных сывороток в виде оптической плотности (ОИ). С.О., таким образом, вычисляли на основании статистически значимой серии отрицательных контролей в виде их среднего значения плюс три стандартных отклонения (Λ+35Ό; значимость положительности р<0,01) и подтверждали экспериментально на панели стандартов положительных и отрицательных образцов. Доверительный интервал для определения положительности теста, таким образом, представляет собой 99,9%.
Люминометрический способ: Образцы, разведенные в Трис-НС1 50 мМ рН 7,6, наносили на покрытые АроН микротитрационные планшеты (АРОН ТесЬпо1од1ек, Монпелье, Франция). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С, промывали четыре раза ФСБ. Добавляли очищенное мышиное тАЬ анти-ΗΝν (1 мкг/мл в ФСБ-БСА 5%). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и промывали четыре раза ФСБ. Добавляли меченое пероксидазой антитело козы против мыши Цасккоп, разведенное 1/2000 в ФСБ-БСА 5%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и промывали шесть раз ФСБ. Добавляли раствор субстрата 8ирег§1дпа1 ГеиНо (Рьегсе) и считывали с помощью считывающего устройства ТЕСАК
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела (МаЬ) были разработаны фирмой ЬюМепеих (Магсу ГЕюПе, Франция) после иммунизации мышей рекомбинантным белком оболочки М8КК (ΞΝν), экспрессируемым с клонированных участков, амплифицированных с помощью ОТ-ПЦР из очищенных внеклеточных вирионов М8КК. После тестирования мышиных сывороток с помощью ЕЫ8А клетки селезенки подвергали слиянию с несекретирующей клеточной линией миеломы 8р2/0-Ад14 с целью получения гибридом. Специфические клоны были отобраны путем скрининга на их продуцирование антител в таком же анализе ЕЬ18А. Таким образом, было выделено примерно 40 МаЬ, специфичных к белку М8КК/ЕК^ и примерно 28 МаЬ было подвергнуто дальнейшей селекции, и оценена их связывающая специфичность. Используя метод АроН-ЕЬРЗА на сыворотках человека, лучшим связывающим МаЬ было 2А12А5.
Результаты
Иммунологическая доза белка М8КК ΞΝν в сыворотке
Авторы изобретения разработали оригинальный иммунологический анализ на микропланшетах, в котором фаза иммобилизации основана на особенно эффективных свойствах аполипопротеина-Н (АроН)
- 20 024655 при связывании с белками микроорганизмов при ассоциации со структурами оболочки и/или липидами (З!е£аз е! а1., 1997; З!е£аз е! а1., 2001). АроН дает возможность первого взаимодействия с низким сродством с аминокислотными участками самого белка, которое затем активирует аллостерическое взаимодействие, вызывающее ковалентно-подобное связывание С-концевого домена АроН с липидо- или мембраносвязывающими доменами. Таким образом, белки оболочки вируса или частицы вирионов могут быть обратимо иммобилизованы, и после стадий отмывки, удаляющих исходный образец, специфические антигены могут быть определены путем добавления моноклонального антитела, мишенью которого является все еще доступный эпитоп после стадии иммобилизации АроН.
Для технической оценки теста как вирион МЗКУ, осажденный и очищенный из надосадочных жидкостей культуры В-клеток РС в соответствии с ранее описанными условиями (Реггоп е! а1., 1997а; Реггоп е! а1., 1997Ь), так и очищенный рекомбинантный белок оболочки МЗКУ (ΕΝν) тестировали с серийными разведениями и различными МаЬ анти-МЗКУ ΕΝν. Сравнение проводили с хорошо известными вирусами, такими как вирус гепатита С (НСУ) и вирус гепатита В (ΗΒν), определяемыми соответствующим специфическим МаЬ. После дополнительных испытаний с реальными образцами сывороток было показано, что МаЬ 2А12А5 наиболее эффективно для диагностического иммунологического определения после стадии иммобилизации АроН, и оно было сохранено для последующих исследований.
Первое слепое предварительное исследование: Рассеянный склероз (РС) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП).
Для предварительной оценки данного иммунологического анализа в различных группах пациентов с различными заболеваниями авторы изобретения сначала анализировали сыворотки от 29 пациентов с РС, от 28 пациентов с другими неврологическими заболеваниями, от 60 пациентов с не неврологическими заболеваниями и от 50 здоровых доноров крови (всего 167 образцов сыворотки). Результаты представлены в табл. 12 для РС и других неврологических заболеваний.
Таблица 12. Тест на иммунологическое определение ΕΝν для идентификации МЗКУ-ассоциированных заболеваний или МЗКУ-ассоциированных подгрупп пациентов. Результаты АРО-Н 'Е1ЗА на первой серии сывороток - пациенты с рассеянным склерозом (РС), пациенты с другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ), пациенты с хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией (ХВДП) и здоровые доноры крови (ДК). Тесты 'Е1ЗА со стадией иммобилизации АРО-Н (З!е£аз е! а1, 1997) проводили с моноклональным 1дО (2А12А5 для МЗКУ ΕΝν), полученным и подвергнутым скринингу на специфичность фирмой ЬюМепеих, Магсу I.'! ДоПе, Франция. Ν= число пациентов, нз = не зарегистрирован, ΟΏ = оптическая плотность, П = прогрессирующая, РП = ремитирующая прогрессирующая, ВР = возвратно-ремиттирующая. СО= пороговое значение, определяющее предельное значение, ниже которого результат теста является отрицательным. Оно определено из серии здоровых доноров крови, как показано внизу, с их средним значением плюс его трехкратное стандартное отклонение (99% доверительный интервал). Отношение ΟΏ/СО = ОН деленная на СО эксперимента, позволяющая различить положительные результаты (>1) и отрицательные (<1).
(а) Пациенты с рассеянным склерозом (N=29)
Пациент Клиническая форма Продолжительность (годы) Отношение Οϋ/СО
1 РП 6 1,84
2 РП 1,64
3 ВР 3 1,62
4 ВР 4 1,54
5 нз 2 1,54
6 нз нз 1,35
7 нз нз 1,31
8 нз нз 1,37
9 8 8 1,11
10 19 19 1,19
11 2 2 1,12
12 нз нз 1,19
13 нз нз 1,12
14 нз нз 1,11
15 нз нз 1,06
16 1 1 1,21
17 5 5 1,18
18 7 7 1,18
19 1 1 1,06
20 4 4 1,09
21 3 3 1,18
22 4 4 1,28
23 2 2 1,03
24 26 26 0,95
25 22 22 0,99
26 4 4 0,90
27 22 22 0,70
28 14 14 0,96
29 18 18 0,92
- 21 024655
(б) Пациенты с ДНЗ (N=20)
Пациент Тип заболевания Отношение ОЭ/СО
1 Эпилепсия 0,910
2 Хронический полимиозит 0,940
3 Первичная опухоль головного мозга 0,640
4 Ишиас 0,940
5 Синдром Гийена-Барре 1,000
6 Удар 0,840
7 Первичная опухоль головного мозга 0,880
8 Мультисистемная атрофия 0,88
9 Паралич лицевого нерва 0,940
10 Синдром Гийена-Барре 1,000
11 Эпилепсия 0,930
12 БАС 0,680
13 Синдром Гийена-Барре 0,830
14 Церебральный метастаз (рак легкого) 0,910
15 Болезнь Лея 1,000
16 Эпилепсия 0,800
17 Травма спинного мозга 0,810
18 Церебральный абсцесс (и$1еПа) 0,930
19 Эпилепсия 0,800
20 Удар 0,960
(в) Пациенты с ХВДП (N=8)
Пациент Отношение Οϋ/ΟΟ
1 1,13
2 1,27
3 1,06
4 1,08
5 1,06
6 0,90
7 0,86
8 0,93
Результаты, равные 1, считают неопределенными, и соответствующие образцы или новые образцы от тех же индивидуумов должны быть протестированы снова в отдельном эксперименте для определения. Среднее значение (среднее) и стандартное отклонение - 5.6. - всех оптических плотностей определено в каждой группе и подгруппе субъектов, как указано ниже:
ДК (Ν=50): среднее значение 0,53, 5.6. 0,16.
РС (Ν=29): среднее значение положительных РС (Ν=23) 1,27 5.6. 0,22, среднее отрицательных РС (Ν=6) 0,90 5.6. 0,25, среднее значение всех РС 1,20 5.6. 0,25.
ДНЗ (Ν=20): среднее значение отрицательных ДНЗ 0,88 5.6. 0,10.
ХВДП (Ν=8): среднее значение положительных ХВДП (Ν=5) 1,12 5.6. 0,09, среднее отрицательных ХВДП (Ν=3) 0,9 5.6. 0,03, среднее всех ХВДП 1,04 5.6. 0,13.
Авторы изобретения проанализировали сыворотки от 29 пациентов РС из Франции (19 из Кретея, 10 из Гренобля) в качестве первичной оценки данного иммунологического анализа в различных группах пациентов с различными заболеваниями. Результаты у пациентов РС представлены в табл. 12а. Десять здоровых доноров крови использовали в качестве отрицательных стандартов для определения предела положительности (пороговое значение или СО, пороговое значение, ниже которого специфический сигнал не определяется). В соответствии со статистическим пороговым значением этих серий 23 пациента РС имеют значимо положительную антигенемию М8К.У-Е№У (средняя ΘΌ = 0,88), тогда как 6 можно считать отрицательными, хотя скорее близкими к порогу (средняя ΘΌ отрицательных РС = 0,62). Интересно, что отрицательные случаи РС имели более длительную продолжительность вероятнее доброкачественных форм (#24, 25, 28) или следовали протоколу лечения циклофосфамидом.
Параллельно авторы изобретения проанализировали сыворотки от 28 пациентов с другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ) (12 из Кретея, 16 из Гренобля). Пятеро пациентов имело положитель- 22 024655 ный результат, таким образом, представляя примерно 18% протестированных пациентов с ДНЗ. Тем не менее, все положительные случаи ДНЗ имели сходный диагноз: хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), тогда как пациенты с ДНЗ с другими диагнозами все были отрицательными (или неопределенными на пороговом пределе, как для одного случая острого синдрома Гийена-Барре). Таким образом, результаты от пациентов с ДНЗ представлены в табл. 12б как ДНЗ без ХВДП отдельно от пациентов ХВДП (табл. 12в). Примерно половина случаев ХВДП является положительной, но, с учетом настоящих низких чисел, авторы здесь не подразумевали исследование воспалительных против невоспалительных неврологических заболеваний.
Кроме того, авторы изобретения параллельно протестировали сыворотки от других не неврологических заболеваний (ДННЗ), таких как 15 пациентов с хронической вирусной инфекцией гепатита В, а также 15 пациентов с хронической вирусной инфекцией гепатита С. Из этих 30 образцов ни один не был обнаружен как положительный. Полиреактивные сыворотки от 30 пациентов с анти-ДНК, противоядерным и противоревматоидным факторами, обычно препятствующими различным серологическим тестам, не дали никакого положительного результата. Пятьдесят сывороток от здоровых доноров крови были также параллельно протестированы. Ни одна не была обнаружена как положительная.
Сравнение результатов группы РС с любой другой группой показывает значимое различие, за исключением подгруппы ХВДП. Значения оптической плотности от полных групп РС и ДНЗ (включая отрицательные РС и ХВДП) при сравнении с помощью непараметрического критерия (критерий нормальности был неудачным) достаточно значительно различаются (р = <0,001; критерий суммы рангов МаннаУитни Т = 517000). При сравнении полной группы РС со всеми случаями ХВДП статистическое различие более не обнаруживалось (р = 0,053; критерий суммы рангов Манна-Уитни Т = 99000). Никакого статистического различия не подтвердили для значений ΘΌ положительных РС и положительных ХВДП (р = 0,072; критерий суммы рангов Манна-Уитни Т = 42000).
Европейская многоцентровая серия сывороток при слепом тестировании: Рассеянный склероз (РС) и клинически изолированный синдром (КИС)
С целью подтверждения первых результатов с большей группой пациентов РС из различных географических областей авторы изобретения рекрутировали сыворотки в рамках многоцентрового сотрудничества с неврологическими отделениями из различных европейских стран. В этих образцах авторы изобретения использовали люминометрическое считывание с целью улучшения обнаружения сигнала и дифференциации с неспецифическим фоновым шумом.
После внутренних оценок сывороток колориметрическим способом сравнение с люминометрическим считыванием подтвердило усиленное обнаружение и динамику сигнала. Таким образом, взятие образцов сыворотки для анализа в четырех повторах проводили у случайно отобранных пациентов РС со всеми формами и продолжительностями заболевания, в основном, при продолжающемся специфическом лечении, но представляющих каждое географическое происхождение из настоящей сети клиник. Их кодировали и посылали для слепого тестирования в централизованную лабораторию (АРО-Н технологии, Монпелье, Франция). Не кодированные сыворотки (10 отрицательных контролей и 10 положительных РС) посылали для технической оценки на определение порогового значения. Кроме того, 14 сывороток от клинически изолированного синдрома (КИС, отдельный неврологический эпизод и дополнительное проявление и/или биологические аномалии) посылали в кодированном виде на слепое тестирование в рамках данной серии. Это была первая оценка при КИС, и ожидали, что она включает большинство первых эпизодов РС.
Результаты представлены на фиг. 8 (результаты АроН-БЬ^А сывороток из европейского многоцентрового исследования, протестированных вслепую в независимой лаборатории). Они выражены в виде отношения люминометрических единиц (РЬи), деленных на пороговое значение, определенное в таких же экспериментах, которое, таким образом, сравнимо с отношением для предшествующей серии (см. табл. 9). Действительно, диапазон отношений (1-6), полученных здесь в пределах сывороток положительного РС с помощью люминометрии, подтверждает техническую оптимизацию динамики сигнала по сравнению с колориметрией (от 1 до 2).
Результаты АроН-БЬ^А сывороток из европейского многоцентрового исследования, протестированных вслепую в независимой лаборатории
Используемым способом считывания была люминометрия, и результаты представлены на оси Υ в виде отношения индивидуальных люминометрических единиц (РЬи), поделенных на пороговое значение, определенное на серии стандартных отрицательных сывороток в том же эксперименте. Таким образом, значения >1 являются положительными.
Статистические анализы люминометрических результатов АРО-Н РЕКА между группами дали следующие результаты (значения р критерия Фишера): (ί) сравнение ДК против всех РС, ДК против всех РС + КИС, ДК против ВР-РС, ДК против ПП-РС, ДК против ВП-РС, ДК против КИС: р<0,001; (ίί) сравнение КИС против ВР-РС: р=0,759, КИС против ПП-РС: р=0,704, КИС против ВП-РС: р=0,749, ВР-РС против ПП-РС, ВП-РС: р=1, ПП-РС против ВП-РС: р=1.
В данном случае 54 из 74 неотобранных случаев РС (73%), имеющих происхождение из различных стран и регионов исследования, имели положительную антигенемию по белку ΜδРV ΕΝν, но ни один из
- 23 024655 закодированных 26 ДК (как для 10 незакодированных ДК, используемых в качестве стандартных образцов для эксперимента) не имел. Присутствующее различие между РС и ДК было в высокой степени значимым (критерий Хи-квадрат: р<0,0001), но в отдельных неслепых сериях с большими числами (более ста) обнаружено несколько положительных здоровых или бессимптомных доноров крови (4/103; не показано). Интересно, что 9 из 14 КИС (примерно 64%) были положительными, но с более низкими значениями.
Значения от различных групп (РС, ДК, КИС), а также от различных подгрупп, представляющих различные формы РС: первичную прогрессирующий (ППРС), вторичную прогрессирующий (ВПРС) и возвратно-ремиттирующий (ВРРС), сравнивали с помощью критерия Фишера. Результаты от здоровых доноров значимо отличались от всех комбинаций РС и КИС (постоянно р<0,001), тогда как никакого значимого различия в обнаружении антигенемии ΜδКV ΕΝν не наблюдали между любыми подгруппами, представляющими либо возможный (КИС), либо определенный РС, или различными формами развития заболевания РС (71% были положительными при ВРРС, 78% при ППРС, 70% при ВПРС). Тем не менее, некоторая тенденция гетерогенности в подгруппах КИС по сравнению с РС проиллюстрирована более низкими значениями р: р = от 0,7 до 0,75, против р = 1 между формами РС, где последнее значение выявляет статистически идентичное распределение результатов.
8Ь Серия психиатрических заболеваний: Шизофрения - δСΖ.
Пациенты и способы
Пациенты и здоровые контроли
Пациенты, соответствующие критериям ^δΜ-IV (Американская психиатрическая ассоциация: Руководство по диагностике и статистике психических расстройств, ^δΜ-IV; 1994) для шизофрении, были случайным образом отобраны в конце госпитализации по поводу острого эпизода в филиале кафедры психиатрии Французского университета. Неврологическое расстройство, острая или хроническая инфекция и положительная серология на вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ 1+2), вирусы гепатита В и С составляли критерии исключения. Распределение по возрасту и полу в этих нормальных контролях статистически не отличалось от настоящей группы пациентов. Психотические симптомы оценивали с помощью французской версии Шкалы признаков и симптомов психотического заболевания - δδРI (Ηοικюи еί а1., 2007). Симптомы настроения оценивали с помощью оценочной шкалы мании ВесЬ апй КайеВ кеп и оценочной шкалы депрессии Монтгомери и Асберга - МАИ^ (ВесЬ еί а1., 1978; Μοηίдοте^у апй АкЬегд, 1979). Протокол был одобрен местным этическим комитетом. От всех субъектов получали подписанное информированное согласие после полного описания исследования психиатром, ответственным за клинические оценки пациентов.
Сбор сыворотки
Одну пробирку (сухую 7 мл пробирку В&И) крови обрабатывали в пределах 2 ч после сбора: после свертывания их центрифугировали в течение 10 мин при 2800 д и 14°С. Сыворотку собирали, делили на аликвоты в слабо связывающие пробирки и хранили при -80°С.
Иммунологический анализ
Тесты БЕЛА со стадией иммобилизации АРО-Н (δίеίак еί а1., 1997) проводили с моноклональными ЦС (2А12А5, 6А2В2 для ΜδКV ΕΝν и 2С5Ε12 для ΜδКV САС), полученными и подвергнутыми скринингу на специфичность фирмой ЬюМепеих, Магсу БЕюНе. Франция.
100 мкл на лунку образцов, разведенных 1/10 в Трис-ЫС1 50 мМ рН 7,6, наносили на микропланшеты, покрытые АроН (АРОН ТесЬюЛдхек, Монпелье, Франция). Микропланшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С, промывали четыре раза 250 мкл ФСБ на лунку. Добавляли 100 мкл на лунку первого антитела (10 мкг/мл в ФСБ-БСА 2%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и промывали четыре раза ФСБТ 0,05% и дважды ФСБ. Добавляли 100 мкл на лунку меченого пероксидазой антитела (против мыши .Таскбюп, 1/250 в ФСБ-БСА 2%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и промывали, как описано выше. Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (ОРИ), микропланшеты инкубировали в течение 30 мин в темноте, и реакцию останавливали Η2δΟ4 2 н. (50 мкл на лунку). Поглощение считывали при 490 нм с помощью считывающего устройства Вю1ек.
Статистические анализы
Статистические анализы проводили с помощью программного обеспечения δ^дтаδίаί. Для сравнения серии данных был выбран непараметрический критерий суммы рангов Манна-Уитни, поскольку их распределение никогда не соответствовало нормальному распределению (критерий нормальности не выполнялся). Критерий хи-квадрат использовали для сравнения преобладания положительной антигенемии против отрицательной в каждой популяции, для каждого антигена и/или каждого используемого антитела. Пороговое значение для каждого состояния, при котором получены результаты, вычисляли на основании статистической серии отрицательных контролей как их среднее значение плюс три стандартных отклонения (М+П^И; значимость положительности: р<0,01) и подтверждали на стандартных положительных и отрицательных образцах. Включены результаты 49 пациентов с шизофренией и 49 контроля, соответствующих по возрасту (33 +/- 6,5 лет) и полу (73% мужчин, 27% женщин). Было включено восемь пациентов при первичном возникновении шизофренического расстройства, тогда как большинство (Ν =
- 24 024655
41) страдало тяжелой хронической шизофренией. Они были эутимическими при включении как для депрессивных баллов (среднее ΜΆΌΚ8 = 5,6 + 6,6) и для маниакальных баллов (средний балл Бека = 4,8 + 4,5). Все пациенты, кроме одного без лечения, принимали нейролептические лекарственные средства (27% классические и 71% атипичные нейролептики). Одна треть пациентов (Ν = 13) были устойчивыми к лекарственным средствам согласно критерию Кена (Капе, 1996).
Для антигена М8К.У ОАО было протестировано 49 контролей и 49 пациентов с шизофренией. Для М8К.У ЕКУ было протестировано 30 контролей (вследствие технических ограничений) и 49 пациентов с шизофренией. Результаты иммунологического анализа выражали в виде средней оптической плотности, полученной на дубликатах сыворотки, деленной на пороговое значение, чтобы сделать все серии сравнимыми с нормализованными значениями (фиг. 22 и табл. 10).
47% (Ν = 23) и 43% (Ν = 21) субъектов с шизофренией обладали положительной антигенемией М8К.У ЕКУ, соответственно, с антителами 2А12А5 и 6А2В2. 49% (Ν = 24) пациентов с шизофренией обладали положительной антигенемией М8КУ ОАО, где один был положительным, и один был пограничным только для ОАО. Сравнение со здоровыми контролями выявило значимое различие в преобладании положительных (критерий хи-квадрат р<0,001 для обоих определений ЕNV; р<0,0001 для ОАО). Сравнение значений ЕЫ8А у пациентов против контролей с помощью критерия суммы рангов МаннаУитни также подтвердило в высокой степени значимые различия (р<0,001; табл. 2). Среди контролей один субъект обладал значимо положительной антигенемией. Интересно, что присутствовала положительная корреляция между результатами для белка ЕКУ и результатами, полученными для белка ОАО. Сравнение значений ЕЫ8А, полученных с анти-ЕКУ 6А2В2, со значениями, полученными с анти-ОАО 2О5Е12, с помощью критерия суммы рангов Манна-Уитни не выявило значимого различия (р = 0,744), как и для анти-ЕКУ-2А12А5 по сравнению с аНТН-ОАО-2О5Е12 (р = 0,290) и для анти-ЕКУ-6А2В2 по сравнению с аНТН-ЕКУ-2А12А5 (р = 0,159). таким образом, эти антитела определяли эквивалентную и/или параллельную экспрессию антигенов М8КУ.
Значения антигенемии ЕКУ по ЕЫ8А варьировали среди положительных, как показано в табл. 10 повышенными стандартными отклонениями (0,28 для антитела 2А12А5, 0,48 для 6А2ВА), по сравнению с отрицательными контролями (0,09 и 0,08 соответственно). Это подтверждает обнаружение динамичного продуцирования антигенов М8К.У у некоторых пациентов с шизофренией.
Эмпирический коэффициент иммунологического анализа (ЕЫ8А) (ось Υ) представляет собой среднюю оптическую плотность, измеренную на дублированных лунках от одной и той же сыворотки, деленную на пороговое значение соответствующей серии (см. Материалы и методы). Антиген ЕКУ дозируют либо моноклональным антителом 2А12А5, либо моноклональным антителом 6А2В2, и антиген ОАО дозируют моноклональным антителом 2О5Е12, как указано в соответствующих колонках со значениями по графику.
На фиг. 9 среднее значение и доверительные интервалы (0,01 и 0,001) представлены столбиками и прямоугольниками, а распределение максимальных и минимальных значений для каждого антигена и антитела (указанных сверху каждой колонки) представлено точками. Серия значений от пациентов с шизофренией указана как δί','Ζ внизу соответствующих графиков, а значения от здоровых доноров крови отмечены Контроли (внизу оси X).
Таблица 13. Дозы капсида (ОАО) и оболочки (ЕКУ) М8К.У в сыворотках пациентов с шизофренией (δί',’Ζ) и контролей
МЗКУ ΕΝν
МЗРУ САО
антитело 2А12А5 антитело 6А2В2 антитело 2С5Е12
Число положительных на сыворотки протестированных популяций зег Контроли зег Контроли зег Контроли
23/49 1/30 21/49 0/30 24/49 2/49
46,94% 3,33% 42,86% 0,00% 48,98% 4,08%
Число положительных в 5ΟΖ против ДК: критерий хи- квадрат Хи2=16,73 <Р<0,001) Хи2= 17,51 (Р<0,001) Хи'= 25,34 (Р<0,0001)
Стандартное отклонение: Положительные ЗС2 сыворотки/отрицательные контрольные сыворотки Положительные зег 0,28 Отр. контроли 0,09 Положительные εεζ 0,48 Отр. контроли 0,08 Положительные зег 0,47 Отр. контроли 0,15
Число положительных при 5ΟΖ против ДК, критерий суммы рангов Манна-Уитни Т=603,000 (Р=<0,001) Т-638,000 (Р=<0,001) Т=1451,500(Р=<0,001)
8СΖ: Пациенты с шизофренией; ДК: здоровые доноры
- 25 024655
8с Другие неврологические заболевания: Эпилепсия
Тесты ΕΜδΛ проводили, как описано выше (8Ь). Пациентов с эпилепсией и нормальные контроли тестировали параллельно на присутствие белка ΜδΚν-ΕΝν в их сыворотках. Результаты представлены на фиг. 10.
Каждый вертикальный столбик представляет среднюю ΟΌ дублированных результатов сыворотки от одного пациента с эпилепсией (38 слева) или контроля (24 справа).
Горизонтальная черная полоса представляет пороговое значение теста, выше которой определенный сигнал является специфичным для присутствия антигена в сыворотке. Его определяют как среднее результатов от здоровых доноров крови (контролей) плюс три стандартных отклонения.
Таким образом, здесь авторы изобретения определили подгруппу из 8 пациентов с ΜδΡν-ΕΝνассоциированной эпилепсией, которые могут просто соответствовать подгруппе с данной конкретной этиологией среди других случаев с другой этиологической причиной. Только ΜδΚν-положительная эпилепсия является релевантной для лечения лигандом анти-ΕΝν, например, в векторах антител.
8б Пациенты с псориазом
Давно известно, что у пациентов с псориазом экспрессируется подобный ретровирус (1уег8еп, О. ί. (1990), ТЬе ехрте88юп оГ ге1го\аги8-Пке раЫс1е8 ш р8опа818 ί 1пуе8! Эегта1о1 95 (5 δирр1): 4ГО-4п^/В)егке, ί. К., С. Наикепе8, е! а1. (1983), АсЬуа1еб Т 1утрЬосу!е8, пИегГегоп, апб ге1гоу1ги8-Нке раЫс1е8 т р8опайс 1е8юп8 АгсЬ Эегта1о1 119(12): 955-6). Поэтому их релевантность для настоящих терапевтических векторов, содержащих лиганд, очевидна для специалиста в данной области техники.
Пример 9: Эффективность ш У1уо фармацевтических векторов, содержащих лиганд и сохраняющих сродство лиганда с характеристиками активности против С№АС1 Данные ш У1уо по противовоспалительным, иммунопротективным и нейропротективным эффектам лиганда, доставляемого в форме лиганда, включенного в вектор, с соответствующим фармакологическим векторным соединением: Пример терапевтического эффекта в животных нейровоспалительных моделях, моделях демиелинизации и/или нейрональной дегенерации
Материалы и методы
ΜδΚν/ΕΝν-индуцированный ЭАЭ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) в гуманизированной модели мышей δΟΌ (ΙκιδΟΩ)
Свободных от патогенов мышей с δΟΌ (тяжелый комбинированный иммунодефицит) в возрасте 68 недель покупали в СЬаг1е8 Р1ует, Франция. Гуманизация мышей была достигнута, используя МКПК от здоровых доноров крови (ΕίаЬ1^88етеηΐ Ргапда18 би δаид, Лион, Франция), в соответствии с ранее описанным протоколом (ΡίΐΌΐιζί е! а1., 2003). В частности, мыши были облучены гамма-излучением и получали антитело анти-ИК, после чего их гуманизировали 50х106 МКПК человека путем внутрибрюшинной (ьр.) инъекции. Затем качество гуманизации контролировали путем специфичного определения иммуноглобулина человека в сыворотке мыши. Когда был нужен более чем один донор на серию, все подгруппы ΙιιιδСГО делали сравнимыми за счет одинаковой доли мышей, гуманизированных от каждой сдачи крови.
Была необходима задержка на 2 недели перед включением в протокол ЭАЭ (перед первой инъекцией миелинового антигена). Затем группам мышей инъецировали либо основной миелиновый белок (МВР) и неполный адъювант Фрейнда (1РА, содержащий только разбавители) для ложно-контрольных групп, либо инъецировали МВР и очищенный, свободный от эндотоксинов белок ΜδΚν ΕΝν, гомогенизированный в разбавителях 1РА для ΕΝν-индуцированного ЭАЭ. Когда активность заболевания наблюдали клинически и по МРВ по наличию вызванных повреждений и прогрессирующих клинических нарушений, эффект отобранных лигандов анти-ΕΝν по сравнению с исходным мышиным моноклональным антителом (С№АС1) исследовали при инъекции больным мышам (МВР-ЭАЭ, индуцированный ΕΝν у мышей ΙκιδΟΩ).
Для индукции или ложной индукции животных с ЭАЭ сначала инъецировали 8.с. (подкожно) в шею на сутки 0 либо 50 мкг МВР человека + 150 мкг пептида МВР (пептида МВР 87-99) + 20 мкг рекомбинантного белка ΕΝν + 1РА (группа ΕΝν), либо 50 мкг МВР человека + 150 мкг пептида МВР (пептида МВР 87-99) + только 1РА (контрольная группа). Также инъецировали 200 нг коклюшного токсина (РТХ) на животное 1.р. спустя 2 суток во всех группах. Вторую инъекцию внутрибрюшинным (ьр.) путем тех же компонентов в той же дозе (включая пептид МВР и полноразмерный белок МБР человека), соответствующей предшествующему описанию для каждой группы, проводили на указанные сутки (табл. 11). Ее также сопровождали такой же инъекцией 200 нг РТХ на животное. Третью и последнюю инъекцию тех же иммуногенных агентов проводили 8.с. на противоположной стороне шеи на указанные сутки (табл. 14), сопровождая такой же инъекцией РТХ.
- 26 024655
Таблица 14. Серия доклинической оценки обработки антителом: описание различных групп и протоколов для ΕΝν-индуцированных и контрольных МВР-ЭАЭ у мышей Ηι,ι-δΟΩ
Группы Описание Инъекции Компоненты МАЬ Клиническая оценка
ΙΡΑ ΕΝΫ (20 мкг) (100 мкг на сутки) Клинический балл МРВ (сутки)
1 Контрольные мыши X X ежесуточно 17;24;31;43; 50
2 Контрольные мыши X X 19;35 ежесуточно 17;24;31;43; 50
3 Мыши с ЭАЭ X X X ежесуточно 17;24;31,43; 50
4 Мыши с ЭАЭ X X X 35 ежесуточно 17;24;31;43; 50
5 Мыши с ЭАЭ X X X 19;35 ежесуточно 17;24;31;43; 50
Для наблюдения животных взвешивали 5 суток в неделю и оценивали клинический балл. Клинический балл оценивали по приведенному ниже критерию: 0 = нет признаков; 1 = паралич хвоста или гиперрефлексия задней конечности(ей) или односторонняя слабость задней конечности; 2 = двухсторонняя слабость задних или передних конечностей; 3 = дополнительно односторонний паралич или общее нарушение; 4 = полный паралич задних или передних конечностей; 5 = дополнительно частичный паралич или общее нарушение противоположных конечностей; 6 = агония или смерть.
Общая продолжительность экспериментов с Ηι,ι-δΟΩ не превышала двух месяцев, за исключением исследований выживаемости, включающих обработанных тАЬ и контрольных мышей (четыре месяца).
МРВ и иммуногистохимический анализ (изображения не показаны в настоящем примере)
Мониторинг животных проводили с помощью Т2-взвешенного анализа МРВ и посмертной гистологии, которая подтвердила оба типа повреждений с воспалением и демиелинизацией в центральной нервной системе, а также визуализацию (МРВ) резкого улучшения картины воспаления у обработанных мышей с клиническим улучшением.
Результаты
Мыши δΟΊΩ с лимфоидной системой человека (привитой, как указано выше) обеспечивают гибридных животных с функциональной иммунной системой человека. В данном случае эти животные получали три инъекции белка ΜδΚν ΕΝν, эмульгированного с МВР в масляных разбавителях (ΙΡΆ), на сутки, указанные синими стрелками. Когда животные имели повышенный клинический балл при продолжающемся воспалении нервной системы, визуализированном с помощью МРВ (ЭАЭ), им инъецировали однократную дозу (10 мкг внутрибрюшинно) исходного мышиного моноклонального антитела (С№АС1, указанного как ти1дС на фиг. 10) или одной из конструкций на основе 1дС1 или 1дС4 человека с лигандом (указанной как Ыи1дС1 и Ыи1дС4 на фиг. 11). Группа, оставленная необработанной с целью сравнения с обработанными животными, и ложно-контрольная группа, инъецированная МВР в 1РА без ΕΝν, оставались здоровыми, но получали инъекцию исходного мышиного антитела (С№АС1) на те же сутки, что и обработанные больные животные.
Как видно на основании результатов, проиллюстрированных на фиг. 11 и 12, все необработанные мыши погибли через 30 суток и имели тяжелое клиническое прогрессирование после последней из трех инъекций белка ΜδΚν ΕΝν. Тяжелые повреждения были видны на гистологии и иммуногистологии, выявляющих демиелинизацию, инфильтрацию лимфоидных клеток, гибель нейронов, разрушение гематоэнцефалического барьера и астроглиоз. Интересно, что при рассеянном склерозе разрушение гематоэнцефалического барьера также является характерным признаком активных повреждений ЦНС.
Таким образом, мышиное антитело или химерный 1дС1 или 4 человека, содержащий лиганд, направленный на ΕΝν, могли диффундировать в результате внутрибрюшинной инъекции по всему организму и, в частности, в активные повреждения ЦНС у больных животных.
Удивительно, что кривые выживания показали 100% выживания у животных, обработанных либо 1дС1, либо 1дС4 химерными антителами, по сравнению с 0% у необработанных животных на сутки 35. Неожиданно исходное мышиное антитело 1дС1/каппа (С№АС1) обладало меньшей эффективностью при инъекции в такой же дозе, поскольку одно животное погибло на сутки 28. Кроме того, клинические кривые на фиг. 11 показывают очень хорошее и длительное улучшение у животных, обработанных конструкциями на основе 1дС1 или 4 человека, но только стабилизацию и слабое улучшение у животных, обработанных исходным мышиным антителом.
Такое резкое улучшение у животных, обработанных лигандом в векторах 1дС1 или 1дС4 человека, было также доказано МРВ мониторингом по сравнению с необработанными контролями.
Таким образом, клиническая эффективность химерного 1дС1 или 4 человека подтверждена на животных моделях, проявляющих воспаление нервной системы, демиелинизацию, гибель нейронов, разрушение гематоэнцефалического барьера и астроглиоз в центральной нервной системе (ЦНС; см. модели Ηιι-δΟΩ и С57/Ы6, инъецированные белком ΜδΚν ΕΝν). Неожиданно эффективность улучшена по
- 27 024655 сравнению с исходным мышиным ^0, содержащим тот же лиганд (УН+УЪ цепи).
Таким образом, терапевтическая эффективность в настоящей нейровоспалительной животной модели делает ее очевидной для других применений при ΜδΚν-ассоциированных заболеваниях или синдромах, как определено в тексте настоящего изобретения.
Кроме того, неожиданный эффект лиганда минимальной композиции или конструкции, содержащей 6 СОК, определенной в примере 1, дает возможность применять лиганд полностью независимо от функций антитела, но также варьировать и выбирать дополнительную ценность и относительный интерес различных векторов (не исключительно относящихся к ^0 изотипам) для каждого возможного терапевтического применения.
Пример 10: Белок ΜδΚν-ΕΝν обнаруживается с большой интенсивностью в некоторых клетках из биопсий у пациентов с солидной опухолью или из биопсий у пациентов с лимфопролиферативными расстройствами или лимфоидными раками
Материалы и методы:
Тестируемое антитело
0ИЬАС1, 1,0 мл, концентрация: 5,918 мг/мл
Отрицательное контрольное антитело
Белок миеломы мыши ^01 каппа (МОРС-21, δ^дта), 1,0 мл, концентрация: 1,0 мг/мл
Данное антитело использовали одновременно с тестируемым антителом.
Ингибируемый белок
ΕΝν-Τ (ΜδΚν ΕΝν, 0е№иго 8А), 10 мл (10 х 1 мл флаконы), концентрация: 0,05 мг/мл
Этот антилиганд использовали одновременно с тестируемым антителом.
Образцы тканей человека
Этически собранные ткани человека при полном согласии пациента были получены из внешнего источника.
Все ткани подвергали тестированию на антигенность. Перед поиском тканей, приемлемых для использования в данном исследовании, проводили оценку белка с распространенной экспрессией на срезе с иммуногистохимическим окрашиванием; δ100, СЭ45, десмина, цитокератина или виментина, связанных с каждой тканью.
Валидизация анализа
Исследуемые параметры включали:
1. Сравнение окрашивания в положительной контрольной ткани с использованием фиксации нейтральным забуференным формалином, параформальдегидом и ацетоном.
2. Использование подходящего способа обнаружения иммуногистохимическим окрашиванием.
3. Определение оптимального титра тестируемого антитела, исследовали от 0 до 5,0 мкг/мл (изотипический контроль антитела ставили при тех же концентрациях).
4. Достоверность специфичности окрашивания подтверждали путем исключения тестируемого антитела, заменяя его буфером. Кроме того, антигенные связывающие сайты ΜδΚν блокировали, используя белок ΕΝν-Τ перед инкубацией ткани.
5. Использовали любое необходимое блокирование эндогенных веществ, которые могут препятствовать сигналу антигена-мишени.
Способ иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания
В результате полученных данных фазы валидизации каждый из образцов ткани подвергали скринингу одновременно, как описано ниже: СИЬАС1 исключали из методики окрашивания антитело МОРС21 при 1,0 мкг/мл СИЬАС1 при 0,25, 1,0 и 3,0 мкг/мл.
Каждый образец ткани оценивали, используя световой микроскоп. Система оценки позволяла идентифицировать тип ткани и клеток и субъективно отражать интенсивность этого окрашивания.
Все окрашивание в тканях, обработанных либо отрицательным контрольным антителом, либо без антитела, и которое специфично не очерчивало индивидуальные клетки, считали неспецифическим. Специфическое окрашивание не было зарегистрировано для тканей, обработанных тестируемым антителом, когда иммуногистохимическое окрашивание в этих тканях было сходным по интенсивности и распределению с тканями, которые не были обработаны тестируемым антителом, и где индивидуальные клетки не были специфично очерчены.
Положительное окрашивание регистрировали под названием тканевой структуры или типа клеток, а затем указывали интенсивность, как описано ниже
О Отрицательная + Слабая ++ Умеренная +++ Выраженная
Частоту окрашивания, идентифицированного в каждом типе клеток, указывали, как описано ниже
- 28 024655
<10% Мало
11-40% Несколько
41-75% Много
>76% Большинство
Если срез не считали пригодным для оценки, в таблице результатов для него не указывали никаких данных, пока по возможности не повторяли окрашивание.
При 0,25 мкг/мл было меньше мембранного окрашивания по сравнению с другими протестированными разведениями.
Ткань печени была включена в качестве сравнения между известным положительным контролем и тканью, которая первоначально не была идентифицирована как положительная.
Значимое окрашивание не было идентифицировано ни в отрицательном контроле с буфером, ни в контроле изотипа. Положительное окрашивание в сравнении с положительно окрашенными тканями было практически исключено, когда ЕЫУ-Т взаимодействовал с антителом анти-М8КУ/ЕЫУ СпЬАС1.
Для дальнейшей работы по скринингу тестируемых МаЬ использовали СЫЬАС1 при 1,00 мкг-мл-1 в качестве оптимальной концентрации, при 3,00 мкг-мл-1 в качестве концентрации на одну ступень выше нее и 0,25 мкг-мл-1 в качестве низкой концентрации.
В результате полученных данных приведенная ниже методика ИГХ окрашивания была адаптирована для скрининга замороженной нормальной ткани человека.
Методика
Высушивание на воздухе тканевых срезов Фиксация в ацетоне и высушивание на воздухе Промывание в проточной водопроводной воде 0,3% пероксид водорода в метаноле Промывание в водопроводной воде Промывание в ФСБ Инкубация с моноклональным антителом СЫЬАС1 при 0,25,1,0 и 3,0 мкг/мл и с контролем изотипа при 1,0 мкг/мл
Время
Ν/Α примерно 10 минут
Ν/Α примерно 10 минут примерно 5 мин примерно 5 мин в течение ночи при 2-8*С
Также первоначальное исключение методики окрашивания и ингибирование ΕΝ\ΛΤ при 10 мкг/мл с ОМЬАС1 при 1,0 мкг/мл
Данные микроскопического исследования ΕΝν-Τ Изотип 0,00 <ЗпЬАС1 Концентрация антитела мкг/мл
10,00 1,00 0,25 1,00 3,00
Молочная железа Дуктальный/гландулярный эпителий Цитоплаз ма/Мемб рана 0 0 0 Мало + Несколько ++ Мало *
Содержимое полости 0 0 0 0 Несколько Мало
(карцинома
ίη 5(1и) Поверхность полости 0 0 0 0 Несколько ++ Много -ни-
Сосуды - эндотелий Цитоплазма/Мембрана 0 0 0 0 Много ++ мало +
Дуктальный/гландулярный эпителий Цитоплазма/Мембрана 0 0 0 0 Мало + Много +++
Содержимое полости 0 Неско лько ί- Несколь ко Ι- Неско лько + Несколько ++ Неско лько +++
{аденокарци нома Поверхность полости 0 Ο Ο 0 Мало + Много +++
молочной
железы) Сосуды - эндотелий Цитоплазма/Мембрана 0 0 0 0 Несколько ++ Много ++
Дуктальный/гландулярный эпителий Цитоплазма/Мембрана 0 0 0 0 Мало Ι- Неско лько ++
Содержимое полости 0 0 0 0 Ο 0
(аденокарци нома МОЛОЧНОЙ Поверхность полости 0 0 0 0 Несколько + Боль шинст во++
железы) Сосуды - эндотелий Цитоплазма/Мембрана 0 0 0 0 Несколько + Неско лько
++
Промывание в ФСБ примерно 5 мин
Инкубация с Εηνίδΐοη/ΗΡΡ примерно 30 мин
Промывание в ФСБ Х2 примерно 5 мин каждое
Обработка субстратом 6АВ фермента примерно 5 мин
Промывание в проточной водопроводной воде Контрастирующее окрашивание в гематоксилине Мауегз Промывание в проточной водопроводной воде Обезвоживание, очистка и заливка в среду примерно 5 мин примерно 15 сек по необходимости по необходимости
Результаты
Рак молочной железы
Таблица 15. Результаты, полученные с тканями карциномы молочной железы от различных индивидуумов
ИНТЕНСИВНОСТЬ Отрицательная 0 Слабая + Умеренная ++ Выраженная +++
ЧАСТОТА Мало Несколько Много Большинство
Таким образом, получены данные, что М8КУ ЕNУ в высокой степени экспрессируется в дуктальных/гландулярных эпителиальных клетках и в эндотелиальных клетках окружающих кровеносных сосудов в 3/3 опухолей молочной железы, протестированных специфичным О№АС1
Таким образом, в соответствии с обозначением М8КУ-ассоциированные заболевания теперь получены данные, что карцинома молочной железы является одним из этих заболеваний человека.
Лимфоидный рак и лимфопролиферативные расстройства
Таблица 16. Результаты, полученные с гиперплазией лимфоидной ткани от различных индивидуумов
ИНТЕНСИВНОСТЬ Отрицательная 0 Слабая + Умеренная ++ Выраженная +++ ЧАСТОТА Мало Несколько Много Большинство
ΝΓ: Практически невозможно Данные микроскопического исследования
ΕΝν-Τ Изотип Концентрация антитела мкг/мл
СлЬАС!
Миндали Лимфоидная ткань на цитоплазма мембрана
Сосуды эндотелий цитоплазма мембрана (фоллику лярная гиперлла Лимфоидная ткань зия) цитоплазма мембрана
10,00
1,00
0,00 о
0,25
Несколько +++
Мало
1,оо
Много
3,00
Несколько +++
Много Много
Много Большинство Большинство
Сосуды эндотелий цитоплазма мембрана
Мало Много Много ++ ++ +++ (фоллику лярная гиперпла эия)
Лейкоциты в Много 0 кровеносном сосуде цитоплазма мембрана ++
ΝΙ
ΝΙ
ΝΙ
Таким образом, подтверждено, что М8КУ ЕNУ в высокой степени экспрессируется в лимфоидных клетках и в эндотелиальных клетках окружающих кровеносных сосудов 2/2 биопсий миндалин с выраженной гиперплазией от пациентов с лимфопролиферативным расстройством при тестировании с ОпЬАС1.
Таким образом, в соответствии с обозначением М8КУ-ассоциированные заболевания теперь получены данные, что лимфопролиферативные расстройства, включая раки лимфоидных клеток, находятся среди этих заболеваний человека.
- 30 024655
Рак почки
Таблица 17. Результаты, полученные с тканями карциномы почки от различных индивидуумов ИНТЕНСИВНОСТЬ Отрицательная 0 Слабая + Умеренная ++ Выраженная +++
ЧАСТОТА Мало Несколько Много Большинство
ΝΓ: Практически невозможно
Данные микроскопического исследования ΕΝν-Τ Концентрация антитела мкг/мл Изо СпЬАС1 тип
10,00 1,0 0,00 0,25 1,00 3,00
Поверхность просвета 0 0 0 Мало Мало Много
канальцев
Цитоплазма/Мембрана + + +++
Гломерулярные 0 0 0 0 0 0
мезангиальные
Рак почки Мембрана/Цитоплазма
Гломерулярные петли 0 0 0 Мало Мало N1
сосудов
Эндотелий/Цитоплазма +++ +++ N1
Канальцы 0 Много Боль
+++ ш-во
Поверхность просвета Мало Несколько Неско
канальцев лько
Цитоплаэма/Мембрана + ++ ++
Гломерулярные Мало Мало Мало
мезангиальные
Мембрана/Цитоплазма +++ +++ +++
Почечно- Капсула Боумена 0 Несколько Неско
клеточная +++ лько
карцинома +++
Гломерулярные петли 0 Много Боль
сосудов ш-во
Эндотелий/Цитоплазма +++ +++
Канальцы Мало Мало Мало
+ +
Несмотря на небольшое фоновое окрашивание в одном типе клеток (разном в каждом случае), анализ был практически возможен, и, таким образом, могут быть получены данные, подтверждающие, что Μ§КΥ ΕNУ в высокой степени экспрессируется в почечных клетках и в эндотелиальных клетках окружающих кровеносных сосудов в 2/2 почечных биопсиях от пациентов с раком почки при тестировании со специфичным антителом анти-Μ§КΥ ΕNУ (0№АС1).
Таким образом, в соответствии с обозначением '^БКУ-ассоциированные заболевания сейчас получены данные, подтверждающие, что раки почек являются одним из этих заболеваний человека.
Соответствующие фотографии визуализации световой микроскопии тканевых срезов, окрашенных либо специфичным антителом анти-ΕNУ (0№АС1), либо нерелевантным контрольным антителом (МОРС-21), подтверждают данные, представленные в табл. 15-17, для раков почки, для лимфоидных раков или лимфопролиферативных заболеваний и для рака молочной железы.
Пример 11: А. Белки Μ§КΥ ΕNУ и ОАО обнаруживаются при значимых и конкордантных уровнях в сыворотке некоторых острых случаев развивающегося диабета
Сыворотки от пациентов с острым инсулинзависимым диабетом были анонимно собраны из остаточных объемов после рутинного тестирования в целях диагностики и последующего наблюдения. Сыворотки от здоровых доноров крови были получены от организации готового банка крови.
Сыворотки тестировали в соответствии с методикой иммунологического определения, используя планшеты с иммобилизованным АРО-Н и специфичное обнаружение лиганда, как описано ранее в примерах настоящего изобретения.
В таблице ниже приведена средняя оптическая плотность на трех повторах тестов, измеренная в сыворотках от пациентов с острым диабетом (Диаб.) и от репрезентативных доноров крови (ДК).
Использовали лиганды, представляющие собой мышиное моноклональное антитело анти-Μ§КΥ:
Одно антитело против оболочки (ΕΝΥ) 0№АС1 (Ое№иго, Швейцария).
Одно антитело против полипротеина матрикса и капсида (ОАО): 2О5Е12 (Ь^οΜе^^еиx Франция).
Специфичное связывание этих антител выявляли с помощью второго антитела против мыши (.Гасккоп, США, ссылка 115-035-146). Используемые разведения или концентрации указаны в таблице ниже.
Результаты являются значимыми, когда отношение (Р/Ν) средней оптической плотности, деленной
- 31 024655 на пороговое значение (определенное как среднее значение от здоровых контролей плюс два стандартных отклонения -З1) - соответствующей серии), выше единицы.
Такие значения выделены полужирным и крупным шрифтом в 2 рядах Р/Ν.
Таким образом, могут быть получены данные, что десять из восемнадцати пациентов обладают значимой антигенемией по меньшей мере по белку ΕΝν, определенной с помощью лиганда, представляющего собой мышиное моноклональное антитело. Всех МЗКУ-положительных пациентов определяют с помощью двух антител, и получены значимые результаты для обоих белков ОАО и ΕΝν.
Такие результаты с совпадающим определением двух различных моноклональных антител, направленных на два различных эпитопа, представляющих два различных белка МЗКУ (ΕΝν и ОАО), являются, очевидно, значимыми и показательными в отношении ассоциации с МЗКУ, как описано в настоящем изобретении в другом месте, для определения МЗКУ-ассоциированных заболеваний.
Таким образом, диабет типа I или другой диабет, сопровождающийся воспалением, включает подгруппу пациентов, у которых патогенез заболевания может быть вызван провоспалительными и иммунопатогенными эффектами белка МЗКУ ΕΝν.
Таблица 18. Результаты антигенемии по АРОН-ВИЗА у пациентов с диабетом (Диаб.) по сравнению со здоровыми донорами (ДК). См. подробные комментарии в тексте примера.
Р/Ν 2 = Отношение оптической плотности, вычисленное как результат для образца, деленный на пороговое значение. Последнее определяют со здоровыми донорами в виде среднего здоровой группы + два ее стандартных отклонения
- 32 024655
Пример 12: Неожиданное открытие подходящей животной модели для ΕΝν-индуцированного диабета
1. Введение
Спонтанная мутантная модель мышей-диабетиков δΟΌ, не страдающих ожирением (ΝΟΌ-δΟΌ), имеет мутацию δΟΊΩ, перенесенную на генетический фон склонности к диабету ΝΟΌ. Неожиданно предварительные эксперименты, проведенные автором изобретения, выявили, что первичная иммунизация гуманизированных мышей ΝΟΩ-δί'ΊΩ белком ΕΝν (25 мкг) и мышиным МВР (белком и пептидом) систематически приводит к быстрой гибели всех тестируемых животных, тогда как все гуманизированные мыши δΟΊΩ, которые получили те же иммуногены без белка ΕΝν (ложно-контрольные), выжили. На первой стадии авторы изобретения дозозависимо оценивали вредные эффекты белка ΕΝν у мышей ΝΟΌ-δΟΌ, используя клинический мониторинг в сочетании с гистологическим методом. На второй стадии авторы изобретения оценивали полезные эффекты химерного лиганда на основе ЦО4 по изобретению при предупреждении повреждения, вызванного белком ΕΝν.
2. Оценка вредных эффектов белка ΕΝν у мышей ΝΟΩ-δΟΊΩ
а. Материалы и методы
а.1. Животные
Шесть свободных от патогенов мышей δίΊΩ (6-8 недель) покупали в СЬаг1е8 К|усг, Франция. Животных содержали по 3 на клетку при стандартном цикле света и темноты со свободным доступом к пище и воде и не беспокоили в течение 8-суточного периода акклиматизации. Особое внимание уделяли очень чистым условиям содержания. В частности, животных содержали в специальных клетках, оборудованных крышкой с фильтром.
a. 2. Гуманизация мышей ΝΟΩ-δί'ΊΩ
С целью получения мышей ΝΟΩ-δί'ΊΩ без лимфоидной иммунной системы с привитой человеческой иммунной системой мышей гуманизировали периферическими мононуклеарными клетками человека, таким образом, обеспечивая потенциал для исследования функциональной роли иммунной системы человека в иммунопатогенных животных моделях. Это позволяет получить результаты, значительно приближенные к реальной ситуации у человека в отношении иммунопатологии и ответа на патогенные белки человека, такие как ΜδΚνΕΝν. Гуманизация мышей была достигнута в соответствии с ранее описанным протоколом ΡίΐΌΐιζί еΐ а1., 2003 за исключением того, что животных не облучали гамма-излучением и не обрабатывали лигандом анти-ΝΚ, поскольку мыши ΝΟΩ-δί'ΊΩ спонтанно истощены по ΝΚ клеткам. Кровь (лейкоцитарнотромбоцитарный слой, 45-50 мл) от 2 здоровых контролей получали из центра переливания крови (ΕΡδ) в Лионе. Качество и безопасность крови была гарантирована иммунологическим и гематологическим анализом. Все экспериментальные процедуры проводили под ламинарным потоком воздуха и с использованием стерильных перчаток. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) получали методом разделения в градиенте плотности фиколла и вводили мышам ΝΟΩ-δί'ΊΩ путем ί.ρ. инъекции (50.106 клеток). Поскольку для гуманизации всех животных использовали кровь от двух различных доноров, одинаковую долю мышей гуманизировали от каждого донора крови. В данном случае уже можно утверждать, что никакого различия между животными, привитыми от каждого донора, не наблюдали во всех дальнейших экспериментах, как описано ниже.
3. Оценка вредных эффектов белка ΕΝν у мышей ΝΟΩ-δΟΊΩ
Инъекции белка ΕΝν
На сутки 0 (Р0) мыши получали однократную внутрибрюшинную (ί.ρ.) инъекцию (0,5 мл) белка ΕΝν (РХТЬетареийск, Франция) в следующих дозах: 0,1, 1,5, 10 и 20 мкг. Белок ΕΝν был разведен в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (Ьо^а, Франция). Одна мышь получила инъекцию только ФСБ.
Во избежание какого-либо снижения концентрации белка ΕΝν и его биологической активности проводили вторую инъекцию белка ΕΝν, эмульгированного в 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда ^1дта, Франция) на Р7. Каждая мышь получила однократную подкожную инъекцию в шею. Дозы белка ΕΝν, используемые для каждой мыши, были такими же, как для первой инъекции на сутки Р0.
Третью 5.с. инъекцию белка ΕΝν, эмульгированного в минеральном масляном разбавителе -ГТА(0,5 мл) проводили в шею на сутки Р14. На те же сутки мыши получали ί.ρ. инъекцию 200 нг (0,5 мл) коклюшного токсина -РТХ-(\Уако, Германия) на животное для временного открытия гематоэнцефалического барьера для прохождения иммунных клеток вне ЦНС.
Клиническая оценка
Мониторинг общего состояния здоровья (состояния шерстного покрова, манеры движений по клетке, позы) и массы животных проводили 5 суток в неделю в течение периода Р14-Р37.
Гистологическое исследование
Головной мозг и внутренние органы всех погибших животных извлекали и консервировали в формалине (10%) для последующего гистологического исследования.
b. Результаты
1. Клинический мониторинг
- 33 024655
В течение первых нескольких суток после инъекции белка ЕИУ, эмульгированного в ГОА, и РТХ все мыши, которые получили самые высокие дозы белка ЕИУ, показывали снижение массы тела (см. Фиг. 13), сопровождающееся сильным ухудшением их общего состояния здоровья, на которое указывает низкая активность в клетке и поведение прострации. Наконец, все эти мыши погибли в течение четырех суток после последней инъекции. Интересно, что мыши, инъецированные более низкими дозами белка ЕИУ, проявляли небольшое увеличение массы тела, сопровождающееся хорошим общим состоянием здоровья, несмотря на постепенное появление чуть встопорщенной шерсти у двух остальных мышей, инъецированных низкими дозами белка ЕИУ.
В течение недели после последней инъекции масса тела выживших мышей стабилизировалась или слегка снизилась (см. фиг. 13), но их общее состояние здоровья было неизменным.
В течение второй недели после последней инъекции выжившие мыши продолжали набирать массу (см. фиг. 13), и их общее состояние здоровья стабилизировалось.
2. Гистологическое исследование Цели исследования
Гистопатологическое исследование поджелудочных желез мышей ИОЭ М4, М5 и М6.
Материалы и методы
Получили образцы ткани поджелудочной железы, фиксированные в формалине. Образцы ткани заливали в парафин, резали на срезы толщиной 5 мкм. Тканевые срезы окрашивали гематоксилиномэозином-шафраном и исследовали с помощью светового микроскопа. Снимали репрезентативные пронумерованные изображения.
Результаты
Поджелудочная железа М4: общее строение поджелудочной железы сохранено. Присутствуют очаговые воспалительные повреждения: они образуют небольшие инфильтраты полиморфного состава при преимущественно периваскулярном и перидуктальном распределении. Отсутствует значительное изменение экзокринной поджелудочной железы. Наблюдаются повреждения эндокринных островков: воспалительные клетки присутствуют параллельно их периферии, и видны апоптические эндокринные клетки.
Поджелудочная железа М5: Присутствует панкреатит. Большие воспалительные инфильтраты присутствуют в пределах экзокринной поджелудочной железы и сопровождаются очаговым некрозом ацинарных клеток. Иногда присутствует фибриноидный некроз.
Поджелудочная железа М6: Присутствуют тяжелые повреждения. В поджелудочной железе присутствуют большие слитые области некроза и приводят в результате к полному некрозу большого числа ацинарных клеток. Кроме того, в воспалительные повреждения также вовлечена перипанкреатическая жировая ткань с очагами цитостеатонекроза. Гистологический аспект типичен для острого некротизирующего панкреатита.
В итоге:
Очаговые и слабые воспалительные повреждения в поджелудочной железе от М4.
Острый панкреатит умеренной интенсивности в поджелудочной железе от М5.
Тяжелый острый некротизирующий панкреатит в поджелудочной железе от М6.
с. Обсуждение
В целом, результаты авторов изобретения позволяют предположить, что инъекция белка ЕИУ летальна у мышей ИОО^СГО только в дозе выше 5 мкг. Поскольку у животных, инъецированных высокими дозами белка ЕИУ, проявлялось ухудшение их общего состояния здоровья до инъекции белка РТХ, маловероятно, что обширное повреждение ЦНС могло бы объяснить вредные эффекты белка ЕИУ, наблюдаемые у мышей ИОО^СГО. Более вероятно, что белок ЕИУ запустил сильную дисфункцию в одном или в нескольких других органах, приводящую к гибели животных. Поскольку мыши ИОО^СГО несут склонный к диабету генетический фон, гистологическое состояние поджелудочной железы погибших животных, как представлено выше, в высокой степени позволяет предположить воспаление поджелудочной железы, индуцированное ЕИУ. Интересно, что самая низкая летальная доза индуцирует повреждения только в бета-островках и эндокринной поджелудочной железе, что явно соответствует диабетическим повреждениям и достаточно для объяснения гибели мышей при данной дозе в отсутствие инсулин-секретирующих клеток, уничтоженных ЕИУ-индуцированным воспалением.
При более высоких дозах оказывается, что они, вероятно, находятся за пределами относительных доз на массу, которые могли бы встречаться при диабете у человека, и что такие высокие уровни ЕИУ индуцируют значительно большее воспаление, захватывающее всю поджелудочную железу, включая ее экзокринную часть, при остром некротизирующем панкреатите. Тем не менее, эти наблюдения релевантны для панкреатита, который, как показано в данном случае, встречается при более высоких инъецируемых дозах белков ΜδΚν-ЕИУ.
4: Мониторинг гликемии при повторных инъекциях белка ЕИУ у мышей ИОО^СГО
А. Введение
В предыдущем эксперименте авторы изобретения показали, что повторные подкожные инъекции 5 мкг белка ЕИУ у гуманизированных мышей ИОО^СГО могут привести к гибели соответствующей группы животных, которая может быть связана с острым разрушением островков β-клеток поджелудочной железы. Чтобы предотвратить неопределенную интерпретацию развития кинетики гликемии при состоя- 34 024655 ниях, вызывающих внезапную гибель животных, в настоящем исследовании авторы изобретения использовали повторные инъекции сублетальной дозы белка ΕΝν для исследования гликемии у гуманизированных мышей ΝΘΌ-δΟΌ.
B. Материалы и методы
1. Животные см. выше 2.а.1
2. Гуманизация мышей ΝΘΌ-δΟΌ см. выше 2.а.2
3. Инъекции белка ΕΝν
В данном исследовании мышей инъецировали один раз в неделю (Р0, Р9, Р16 и Р23) в течение 4 недель. На каждый момент времени две мыши получали подкожную инъекцию в шею 2,5 мкг белка ΕΝν (РХТЬетареийск, Франция), эмульгированного в 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (δίβΗκι, Франция). Две остальные мыши (контрольные мыши) подкожную инъекцию в шею 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда.
4. Измерение гликемии
На Р0 и Р30 собирали образцы крови из латеральной хвостовой вены у животных в сознании. Концентрации глюкозы в крови оценивали, используя глюкометр (Орбит Хсееб, Эббот, Франция).
C. Результаты
Как ожидали при сублетальной дозе, мыши, которые получили четыре инъекции белка ΕΝν, были еще живы, несмотря на постепенное появление слабо встопорщенной шерсти, как описано ранее.
На Р0 (сутки первой инъекции ΕΝν или пустого раствора в контролях) невозможно было обнаружить никакого видимого различия между контрольными и ΕΝν-инъецированными мышами. Интересно, что на Р30 было обнаружено, что концентрация глюкозы в крови (гликемия) ΕΝν-инъецированных мышей была повышена по сравнению с контрольными мышами, тогда как у контрольных мышей она не отличалась от прежних значений при Р0 (фиг. 14).
Выявлено, что это изменение гликемии у ΕΝν-обработанных животных достаточно значимо для развития в направлении гипергликемии у ΕΝν-инъецированных животных, которая является характерным признаком диабета у человека и подтверждает предшествующие гистопатологические данные.
Таким образом, эти результаты дополнительно подтверждают экспериментальные условия авторов изобретения как релевантную доклиническую модель исследования ΕΝν-направленных терапевтических лекарственных средств при диабете.
Пример 13: Данные по терапевтическому эффекту лиганда С№АС1 в форме химерного лиганда 1дС4 при предупреждении заболевания, родственного диабету, в подходящей животной модели
1. Материалы и методы а.1. Животные
Данное исследование проводили на двух выживших мышах, инъецированных низкими дозами белка ΕΝν (0,1 и 1 мкг), использованных в предыдущем эксперименте.
2. Экспериментальные методики
Поскольку показано, что повторная инъекция 5 мкг белка ΕΝν приводит к быстрой гибели мыши, авторы изобретения использовали эту провокационную дозу для оценки полезных эффектов лиганда по изобретению. Как описано в предыдущем эксперименте, мыши получали три к.с. инъекции белка ΕΝν, эмульгированного в 1РА (0,5 мл), в шею на Р50, Р57 и Р64. На каждый момент времени мыши получали на те же сутки однократную 1.р. инъекцию (0,5 мл) 100 мкг химерного лиганда С№АС1 1дС4. Мониторинг клинического состояния и массы каждой мыши проводили 5 суток в неделю от Р50 до Р81.
3. Результаты
Наблюдение обработанных животных вплоть до 120 суток последующего наблюдения четко показывает, что эти животные обладают долгосрочным выживанием. Таким образом, инъекция С№АС1 защитила их и позволила им выжить при смертельной дозе ΜδΚν-ΕΝν, инъецированной три последовательных раза.
В течение этого периода наблюдения их общее состояние здоровья оставалось хорошим, и они продолжали набирать массу в физиологическом интервале (ожирение не наблюдали).
Можно сделать вывод, что в данной животной модели, подтверждающей диабетические повреждения и, кроме того, которые могут привести к панкреатиту, лиганд С№АС1 1дС4 эффективен против смертельных доз ΜδΚν
ΕΝν и обладает интересующими терапевтическими эффектами при заболеваниях, таких как диабет и панкреатит, обусловленных воспалением и экспрессией ΜδΚν ΕΝν или антигенемией.
Пример 14: Схема, конструирование и анализ ш νίΙΐΌ гуманизированного антитела С№АС1 с цепями изотипа 1дС4, содержащими 6 аминокислотных последовательностей СОК от лиганда, с (ί) оптимизациями на первой стадии вставки в гуманизированные 1дС4 вариабельные цепи, (ίί) отбор лучшей комбинации последовательностей СОК для оптимальной связывающей активности мишени (белка ΕΝν) в векторе 1дС4 и (ίίί) выбор оптимизации стабильной экспрессии 1дС4 в клетках СНО
А. Конструирование молекулярных конструкций, получение и отбор конструкций для получения
- 35 024655 гуманизированного и стабилизированного 1дО4 вектора антитела с лигандом
1. Анализы Ρν областей мышиного антитела 0№АС1 анти-ΒΝν
Для того, чтобы найти подходящие каркасные области человека для гуманизации мышиного антитела 0№АС1, аминокислотные последовательности Ρν областей тяжелой и легкой цепи 0№АС1 выравнивали с базой данных генов зародышевой линии человеческих антител из Рапогата КекеатсЬ ПгкПЦЦе (1230 Вогбеаих Опте, 8нппууа1е, СаПГогша 94089, США). Были идентифицированы лучшие соответствия генов ν зародышевой линии человека в качестве кандидатов гена ν человека.
На основании поиска в базе данных было идентифицировано, что гены УН1-46 и УН1-69 человека обладают самыми близкими последовательностями к тяжелой цепи мышиного 0№АС1. Таким образом, авторы изобретения отобрали ген УН1-69 в качестве каркасных областей человека для гуманизации. Используя ту же базу данных, авторы изобретения идентифицировали последовательность Ш4 человека для использования в качестве каркасной области 4 в гуманизированной тяжелой цепи.
Для легкой цепи антитела νΚ1-5, νΚ3-11, νΚ1-33, νΚ1-39 показали самую высокую гомологию с легкой цепью мышиного антитела. Таким образом, авторы изобретения выбрали νΚ1-39 для гуманизации легкой цепи. Используя тот же способ, авторы изобретения идентифицировали Ж4 для конструирования каркасной области 4 легкой цепи антитела человека.
Для определения СОК участков, пригодных для прививания на человеческую УН цепь гуманизированного антитела, авторы изобретения повторно оценили адаптированное и оптимизированное выравнивание этих СОК участков с вариабельной областью тяжелой цепи исходного мышиного антитела. Таким образом, авторы изобретения использовали комбинацию определения по Кэбету и определения по Чозиа ЦоПпкоп О., Аи Т.Т. 1<аЬа1 Эа1аЬаке апб Ьк аррИсаЧопк: Ги!иге биесЧопк. ШсШс Асьбк Кек 2001; 29: 205-6. апб СПоПиа С., Ое1Гапб I., КлЧег А. 8Чис1ита1 беЮгпипаШк ш (Пе кесщепсек оГ 1ттипод1оЬи1ш уапаЫе ботат. 1 Мо1 Вю1 1998; 278: 457-79) в качестве предпочтительного определения авторов изобретения. В итоге, определение по Чозиа предпочтительно для конформационной вариабельности, тогда как определение по Кэбету предпочтительно для вариабельности последовательностей. СОК участки тяжелой цепи мышиного антитела О№АС1 показаны на фиг. 15 (8ЕЦ ГО Ко. 33, 34 и 35) с выбором предпочтительных участков для функциональной вставки в вариабельную область тяжелой цепи 1дО4 (УН) в соответствии с вышеописанным предпочтительным определением.
Для определения СОК участков, пригодных для прививания на человеческую УЬ цепь гуманизированного антитела, авторы изобретения также повторно оценили адаптированное и оптимизированное выравнивание этих СОК участков с вариабельной областью легкой цепи исходного мышиного антитела. Таким образом, авторы изобретения использовали комбинацию определения по Кэбету ЦоПпкоп О., Аи Т.Т. 1<аЬа( ЭаШЬаке апб Ик аррЧсаЧопк: Ги(иге биесЧопк. ШсШс Аабк Кек 2001; 29: 205-6) и контактное определение (Рапогата КекеатсЬ 1пк111и1е, СА, И8А). После оценки для легкой цепи мышиного антитела авторы изобретения использовали определения по Кэбету в качестве предпочтительного определения авторов изобретения для определения СОК участков. Выбранные СОК участки для легкой цепи антитела показаны на фиг. 16 (8ЕЦ ГО 36 и 8ЕЦ ГО 38).
2. Гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи
На основе СОК участков мышиного антитела и гена УН1-69 зародышевой линии человека семь последовательностей УН было сконструировано для гуманизации тяжелой цепи ОКЬАС1. Они были обозначены как Н1, Н2, Н3, Н4, Н4А, Н4В и Н4С. Фрагменты ДНК этих V областей синтезировали и сливали с 5' концом кДНК константной области 1дО4 человека с образованием 7 полноразмерных тяжелых цепей 1дО4. Полноразмерные тяжелые цепи 1дО4 встраивали в каркас плазмиды рСМУ ниже промотора СМУ (см. пример 4). Клоны, которые содержали правильные вставки тяжелой цепи, идентифицировали с помощью расщепления ферментами рестрикции, а затем их последовательности ДНК подтвердили путем анализов последовательностей как соответствующие 8ЕЦ ГО Ко. 39 - 8ЕЦ ГО Ко. 45 соответственно.
3. Гуманизированные вариабельные области легкой цепи
На основе СОК участков легкой цепи мышиного антитела и гена УК.1-39 зародышевой линии человека было сконструировано и синтезировано три гуманизированных УЬ последовательности. Эти последовательности были обозначены как У1<1, У1<2 и У1<3. Три фрагмента ДНК УН сливали с константной областью каппа на каркасе плазмиды рТТ5, содержащей последовательность каппа-цепи человека. Открытая рамка считывания каждой легкой цепи управляется промотором СМУ. С целью повышения экспрессии гена последовательность легкой цепи каппа также включает интрон на стыке УЬ и константных областей легкой цепи. Плазмидные клоны с правильными вставками идентифицировали с помощью расщепления ферментами рестрикции, а затем их последовательности ДНК подтвердили путем анализов последовательностей как соответствующие 8ЕЦ ГО Ко. 46 - 8ЕЦ ГО Ко. 48.
4. Экспрессия гуманизированных вариантов антител
Для экспрессии антител плазмиды семи тяжелых цепей и трех легких цепей очищали, используя набор для очистки плазмидной ДНК Махь (Цьадеп). Кроме того, плазмиды с химерной тяжелой цепью ОКЬАС1 1дО4 и химерной легкой цепью каппа ОКЬАС1 (полученные от ОеКеиго) очищали, используя тот же набор. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) культивировали в среде без сыворотки (ПгуЦгодеп) в 6-луночных планшетах и котрансфицировали различными комбинациями плазмид тяжелой и лег- 36 024655 кой цепей при соотношении ДНК 1:1. Трансфекции осуществляли, используя реагент трансфекции Ιηνί!годеп Ггее81у1е Мах. суммарно было проведено 32 трансфекции, которые включали комбинации 8 тяжелых цепей (7 гуманизированных тяжелых цепей и одной химерной тяжелой цепи) и четырех легких цепей (3 гуманизированных легких цепей и одной химерной легкой цепи). На сутки 3 после трансфекции собирали надосадочные жидкости клеточных культур. Концентрации антитела в надосадочных жидкостях определяли с помощью анализа 'ЫЗА 1дО4 человека, в котором использовали очищенное химерное антитело ОИЬАС1 1дО4 (поставляемой фирмой Ое№иго) для построения стандартной кривой.
5. Предварительный скрининг вариантов гуманизированных антител
Для оценки вариантов гуманизированных антител авторы изобретения использовали химерное антитело, образованное в результате котрансфекции химерной тяжелой и химерной легкой цепей в клетки СНО, в качестве эталона/положительного контроля на связывающую активность с белком ΕΝν. Поскольку химерное антитело ОИЬАС1 и все гуманизированные варианты антител находятся в формате 1дО4, анализ связывания на основе 'ЫЗА с иммобилизованным белком МЗКУ ΕΝν можно удобно использовать для оценки относительных связывающих активностей антител. В данном анализе связывания планшеты 'ЫЗА покрывали очищенным рекомбинантным белком ΕΝν (полученным от фирмы Ое№иго) при 1 мкг/мл. Планшеты блокировали 1% БСА и наносили в лунки антитела анти-ΕΝν с различными разведениями. Связанные антитела определяли с помощью второго антитела 1дО Рс против человека, конъюгированного с НКР, с последующим проявлением окрашивания субстратом НКР (КРЬ). Используя этот анализ, авторы изобретения показали, что химерное антитело анти-ΕΝν 1дО4 обладает очень хорошей связывающей активностью с иммобилизованным ΕΝν (фиг. 17).
Используя такой же анализ связывания, авторы изобретения оценивали надосадочные жидкости, собранные с культуры СНО, которая была трансфицирована различными комбинациями гуманизированных тяжелых и легких последовательностей. Для определения лучшего антитела было установлено два критерия:
гуманизированное антитело должно обладать связывающими активностями, близкими к химерному антителу ОИЬАС1;
гуманизированное антитело должно иметь разумный уровень экспрессии, то есть более 100 нг/мл, в надосадочных жидкостях после котрансфекции плазмид тяжелой и легкой цепи.
На основании этих критериев отбора Н2А/К3 было отобрано как лучшее антитело благодаря его хорошей связывающей активности (фиг. 18) и экспрессии (более 1 мкг/мл в 6-луночном планшете). Н4А/К3 было вторым лучшим антителом, поскольку его связывающая активность с белком ΕΝν ниже, чем Н2А/К3 (фиг. 19). Третье антитело, Н1/УК3, обладало хорошей связывающей активностью, но слабой экспрессией антитела (менее 10 нг/мл в 6-луночном планшете) (данные не представлены). На основании этого предварительного скрининга авторы изобретения решили остановиться на Н2/УК3 при дальнейшей оценке.
6. Дальнейшая оценка Н2/УК3
После предварительного скрининга авторы изобретения дополнительно сравнивали Н2/УК3 с химерным антителом анти-ΕΝν 1дО4 в анализе связывания, используя нормализованные концентрации антител. Концентрацию антитела Н2/УК3 в надосадочной жидкости тщательно измеряли с помощью 1дО4 'ЫЗА авторов изобретения, используя очищенное химерное антитело ОИЬАС1 в качестве стандарта. Антитело Н2/УК3 в надосадочных жидкостях и очищенное химерное антитело ОИЬАС1 1дО4 разводили до одинаковых концентраций и сравнивали в ΕΝν-связывающем анализе 'ЫЗА. Анализ показал, что гуманизированное антитело Н2/УК3 обладало почти идентичной ΕΝν-связывающей активностью с химерным антителом 1дО4 анти-ΕΝν (фиг. 20).
Затем авторы изобретения повышали экспрессию Н2/УК3, так чтобы можно было очистить достаточное количество антитела Н2А/К3. Плазмиды рСМУ Н2 и рТТ5 УК3 были получены с использованием набора для очистки плазмид Махь (Цьадеп). Клетки СНО культивировали в среде СНО без сыворотки и трансфицировали двумя плазмидами, используя реагент трансфекции 1^Ьгодеп Ргее$1у1е Мах. Через пять суток после трансфекции надосадочные жидкости клеточных культур собирали и центрифугировали при 3400 об/мин в течение 15 мин. Затем надосадочные жидкости пропускали через колонку с белком А (О'), промывали ФСБ и элюировали буфером для элюирования рН 3,5. Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до соответствующего объема с помощью спин-колонок Атюоп с отсечением молекулярной массы 10 кДа. Концентрации антитела определяли с помощью 'ЫЗА с 1дО4 человека и подтверждали анализом белка по Брэдфорду (Вю-Каб). Очищенное антитело Н2А/К3 проверяли в невосстанавливающем ДСН-ПААГ электрофорезе и наблюдали единственную полосу молекулярной массы примерно 150 кДа (фиг. 21).
Наконец, очищенное Н2/УК3 сравнивали с очищенным химерным антителом О№АС1 в ΕΝνсвязывающем анализе. Результаты показали, что очищенное Н2А/К3 обладает связывающей активностью, почти идентичной очищенному химерному антителу (фиг. 22). На основании этих данных авторы изобретения сделали вывод, что Н2/УК3 соответствует их критериям, и оно было выбрано в качестве гуманизированного антитела О№АС1 С учетом предыдущих данных по связывающей активности (фиг. 3-6 и 8) 6 последовательностей СОК, необходимых для сохранения активности лиганда в гуманизиро- 37 024655 ванном антителе, встроены в аминокислотные последовательности цепей Н2 и УК3 выбранного гуманизированного ЦО4 вектора антитела (фиг. 22) и представлены в δΕΟ ΙΌ №. 49 - δΕΟ ΙΌ №. 54.
Эти последовательности оптимизированы путем отбора и мутации из проанализированных последовательностей СЭР в мышиных УН и УЬ цепях, которые были первоначально выбраны для адекватного встраивания в первичные конструкции человеческих УН и человеческих УЬ (δΕΟ ΙΌ 33-38). Аминокислотные последовательности для выбранной гуманизированной тяжелой цепи Н2 и легкой цепи УК3 (для отобранной гуманизированной конструкции ЦО4) и их оставшиеся мышиные остатки также показаны на фиг. 23.
Авторы изобретения получили 1 мг полноразмерной конструкции гуманизированного антитела Н2/УК3 из клеток СНО путем котрансфекции плазмид рСΜV Н2 и рТТ5 УК3 в среде СНО без сыворотки, и это антитело Н2А/К3 было очищено с помощью колонки с белком А.
7. Создание гуманизированного анти-ΕΝν тАЪ с мутацией 8241Р
Обнаружено, что антитела ЦО4 иногда являются функционально моновалентными ш у1уо. Недавние исследования объяснили, что это является следствием обмена ш у1уо половинными молекулами ЦО (одной Н и одной Ь цепи) среди молекул ЦО4. Этот процесс приводит в результате к биспецифическим антителам, которые в большинстве ситуаций ведут себя как функционально моновалентные антитела (Аа1Ъег8е аиб 8сЬиигтаи 2002, ЦО4 Ъгеакшд (Не ги1е8, ЕптшкНоду. 2002, 105: 9-19). Это вызвано по большей части нестабильностью межцепочечных дисульфидных мостиков за счет замены Р на δ в положении остатка 241 (шарнирная область) и, вероятно, снизит специфичность и эффективность антитела. Во избежание этой проблемы авторы изобретения осуществили 3Ό оценку белка на возможную аминокислотную замену (используя программные обеспечения, такие как доступны на сайте \ν\γ\γ.Νί'.'ΒΙВЭТРВ2, например, визуализатор РгоШи Си3Э, или такие как М СЬС Μа^и ^огкЪеисН, СЬС Вю сотраиу, Орхус, Дания, или разработанные в Раиогата РекеагсЬ ЕъЦЦЦе. СА, США). Поэтому авторы изобретения полагают, что исходная модификация первичной нуклеотидной последовательности, состоящая в замене существующего остатка серина (δ) в положении 241 остатком пролина (Р) оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей их, внутри нуклеотидной конструкции является решением проблемы возможной нестабильности вектора антитела ЦО4 с лигандом. Следовательно, был проведен сайт-направленный мутагенез, и продукт ПЦР был клонирован в плазмиде рСΜV, обозначенной как Н2 8241Р. Последовательность ДНК мутированной тяжелой цепи Н2 была подтверждена анализом последовательности.
Теперь данную оптимизацию объединили с модификацией последовательности легкой цепи каппа включением интрона на стыке УЬ и константных областей легкой цепи, как уже упомянуто выше, для повышения экспрессии гена.
Эта оригинальная комбинация последовательностей, оптимизированных из ранее отобранных клонов путем нуклеотидных мутаций или инсерций с влиянием на первичную аминокислотную структуру или на скорость продуцирования конечного продукта, показана на фиг. 24, при которой последовательности, соответствующие продукту антитела ЦО4 с аминокислотным составом и свойственной ему структурой, обеспечивают оптимизированный, стабильный и высоко экспрессируемый вектор для лиганда по настоящему изобретению, сохраняющий его связывающие свойства с антигеном-мишенью, представляющим собой белок ΕΝν. Показаны конечные последовательности тяжелой цепи гуманизированного антитела анти-ΕΝν Н2 8241Р с ее кодирующей нуклеотидной последовательностью (8ΕΟ ГО 55) и ее аминокислотной последовательностью (8ΕΟ ГО 56). Также показаны конечные последовательности легкой цепи гуманизированного антитела анти-ΕΝν УК3 с ее кодирующей нуклеотидной последовательностью (8ΕΟ ГО 57), в которой интрон подчеркнут: (8ΕΟ ГО 58). Далее следует сплайсированная нуклеотидная последовательность легкой цепи УК3 без интрона (8ΕΟ ГО 59). Последней показана кодируемая аминокислотная последовательность, соответствующая конечной оптимизированной легкой цепи УК3 (81(0 ГО 60).
Наконец, авторы изобретения получили 2 мг конечного варианта гуманизированного антитела с мутацией 8241Р из клеток СНО. Плазмиды рСΜV Н2 8241Р и рТТ5 УК3 очищали с помощью набора для плазмидной ДНК 01адеи Μ;·ιχί. Клетки СНО культивировали в среде СНО без сыворотки и трансфицировали плазмидами рСΜV Н2 8241Р и рТТ5 УК3, используя реагент трансфекции Ргее5(у1е Μаx Диукгодеи).
Через 5 суток надосадочные жидкости клеточных культур собирали и центрифугировали при 3400 об/мин в течение 15 мин, белок антитела очищали, используя колонку с белком А (ΟΕ).
В. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность, оптимизированная для экспрессии в клетках СНО векторов химерного и гуманизированного антитела ЦО4 с лигандом
В1. Белковая и оптимизированная по кодонам (для экспрессии в клетках СНО) нуклеотидная последовательность химерного и гуманизированного варианта антитела тАЪ О№АС1
В1.1 Химерное О№АС1
Последовательность, соответствующая зрелому белку сЬО№АС1 ЦО4, представлена в 8ΕΟ ГО 61.
Последовательность, соответствующая зрелому белку сЬО№АС1 ЬС, представлена в 8ΕΟ ГО 62.
- 38 024655
В1.2 Гуманизированное 0№АС1
Соответствующая последовательность зрелого белка ПиСНЬАС1 ^04 представлена в δΕβ ГО 63. Соответствующая последовательность зрелого белка ПиСНЬАС1 ЬС представлена в δΕβ ГО 64.
В2. Нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепи 0ИЬАС1, включая плазмидные последовательности
Нуклеотидные последовательности ПиСНЬАС1 ЬС представлены в δΕβ ГО 65.
Нуклеотидные последовательности 1ηι0Νό АС1 ^04 НС представлены в δΕβ ГО 67.
С. Комплементарные анализы ίη νίΐΐΌ связывающей активности отобранного гуманизированного ^04 лиганда (стабилизированного и оптимизированного по кодонам вектора гуманизированного антитела ^04)
С1. Биохимические анализы связывания антитела Протокол
Инкубация 2 ч при 37°С ΕΝν в бикарбонатном буфере 50 мМ рН 9,6
Обнаружение антителами, разведенными в ФСБ БСА 1%, в течение 1 ч при комнатной температуре Обнаружение вторым антителом против мыши и против человека, мечеными пероксидазой, соответственно (ссылка 115-035-146 и ссылка 109-035-088, ГОскюн, США), разведенными 1/1000 в ФСБ БСА 1% и инкубированными в течение 1 ч при комнатной температуре. Проявление осуществляют путем добавления субстрата ΟΡΌ и считывания оптической плотности спектрофотометром через 30 мин (Стадии отмывки ФСБ проводят перед каждой стадией).
Таблица 19. Кинетика связывания по системе доза-ответ гуманизированного антитела СИЬАС1 с белком-мишенью ΜδΚν-ΕΝν
ΕΝν-т 7 А 1 мкг/мл против человека 109-035-088 Ьаскзоп 1/1000 или против мыши 115-035-146 Ьасквоп 1/1000
НиМАЬ СЫЬАС 1 Эксп. №1 НиМАЬ СпЬАС1 Эксп, №2 СпЬАС1 мышиное 5О08АК111 6пЬАС1 1дб1 химерное Ро1утип партия 3 6пЬАС1 дО4 химерное Ро1утип партия 3 2Θ5Ε12 мышиное
Концентрац ия МАЬз [мкг/мл] 2,583 2,454 2,001 2,539 2,375 0,114
0,5 2,458 2,694 1,854 2,54 2,493 0,041
0,25 2,141 2,248 1,211 2,638 2,166 0,04
0,125 1,848 1,897 0,945 2,442 1,806 0,043
0,0625 1,316 1,578 0,585 2,508 1,66 0,041
0,03125 0,729 0,894 0,406 1,979 1,259 0,073
0,0156 0,501 0,52 0,166 1,274 0,777 0,042
0,0078 0,286 0,324 0,13 0,85 0,474 0,043
МАЬ 1 мкг/мл
против человека 109-035-088 Ьасквоп 1/1000 или против мыши 115-035-146 Ьэскзоп 1/1000
НиМАЬ ЕК1ЬАС 1 Эксп. №1 НиМАЬ ЕпЬАС1 Эксп. №2 6пЬАС1 мышиное дооБАкт СпЬАС1 1дС1 химерное Ро1утип партия 3 СпЬАС1 1дС4 химерное Ро1утип партия 3 2Θ5Ε12 мышиное 080604СР01
Концентрам ия ΕΝν [мкг/мл] 1 2.576 2,602 2,221 2,519 2,67 0,053
0,5 2,501 2,346 1,867 2,533 2,26 0,084
0,25 2,183 1,719 1,418 2,273 2,296 0,087
0,125 1,728 1,48 0,975 1,822 1,558 0,093
0,0625 1,27 1,4 0,837 1,855 1,548 0.081
0.03125 0,907 0,703 0,367 1,6 1,095 0,091
0,0156 0,547 0,403 0,186 0,888 0,71 0,09
0,0078 0,36 0,211 0,111 0,642 0,313 0,082
Эти результаты четко показывают, что гуманизированное антитело ^04 в двух экспериментах обладает воспроизводимой кинетикой доза-ответ как с фиксированным белком-мишенью ΕΝν и серийны- 39 024655 ми разведениями антитела (верхняя часть таблицы), так и с фиксированной концентрацией антитела и разведениями белка-мишени (нижняя часть таблицы). Они эквивалентны таковым для химерного антитела того же изотипа, но намного лучше, чем для исходного антитела О№АС1, тогда как никакой значимой кинетики связывания не наблюдали для нерелевантного контрольного антитела (2О5Е12).
С2. Тест на реактивность МКПК
Материалы и методы: см. пример 6.
Таблица 20. Ингибирование провоспалительных цитокинов 1Ь-6 и ΙΡΝ-γ в культурах МКПК с белком М8КУ ЕNУ лигандом О№АС1, встроенным как в гуманизированный, так и в химерный вектор антитела 1дО4. ΝΒ. Фоновый сигнал без ЕNУ показан ниже (без Е№У), и контрольная положительная индукция бактериальным ЬР8 показана внизу.
Эти результаты свидетельствуют о значительном ингибировании: (ί) Индукция интерлейкина 6 (1Ь6) белком М8КУ ЕNУ, имеющая пик при 24 ч в клеточных культурах периферических мононуклеарных клеток (с полноразмерным белком ЕNУ, ЕNУ-Τ, используемым при 0,1 мкг/мл), значительно ингибируется в присутствии как гуманизированных, так и химерных антител.
(ίί) Индукция интерферона гамма (ΙΡΝ-γ) белком М8КУ ЕNУ, имеющая пик при 72 ч в клеточных культурах периферических мононуклеарных клеток (с поверхностным фрагментом белка ЕNУ, ЕNУ-8υ, используемым при 0,5 мкг/мл), сильно ингибируется в присутствии гуманизированного антитела, но не в присутствии химерного антитела. Это свидетельствует, таким образом, об улучшенном эффекте гуманизированного антитела на Т-клеточную активацию по сравнению с химерным антителом. В последнем химерном векторе оставшиеся цепи УН и УЪ мыши могут вызвать вредную иммунную активацию посредством распознавания Т-клетками человека ксеноантигенов (белковых цепей мыши, привитых в каркасную область). Этого не происходит с отобранным гуманизированным вектором 1дО4 лиганда, связывающегося с белками ЕNУ. Это различие не наблюдают с 1Ь-6 при 24 ч, поскольку он не вовлечен в специфичное распознавание антигена (приобретенный иммунитет с Т-лимфоцитами), а только в активацию врожденного иммунитета, блокируемую лигандом при связывании с иммунопатогенными белкамимишенями ЕNУ.
Пример 15: Как белки оболочки НЕЕУ-\У из хромосомы 7с| (синцитин), так и частицы М8КУ индуцируют провоспалительные ответы на иммунных клетках и астроцитах, которые ингибируются антителом анти-М8ΚУ-ЕNУ О№АС1 и его химерной конструкцией 1дО4 с лигандом
Взаимоотношения между иммунопатогенными признаками у людей и биологическим эффектом этих белков ЕNУ повышено. Поскольку последовательности М8ΚУ-ЕNУ и синцитина имеют более 81% идентичности последовательности (Ма11е1, ΒοιιΙοη е1 а1. 2004; Матей, А5ΐοηе е1 а1. 2007), авторы изобретения исследовали, могут ли эти два сестринских белка проявлять сходные провоспалительные эффекты. Поскольку предшествующие исследования на мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) и астроцитах головного мозга показали реактивность как на М8ΚУ-ЕNУ, так и на синцитин соответственно, авторы изобретения в данном случае провели параллельный анализ на обоих типах клеток.
Методы
Получение и выделение белков
См. пример 2.
Выделение и получение клеток
МКПК человека выделяли из лейкотромбоцитарных слоев здоровых доноров (Центр переливания крови - НИО - Женева) центрифугированием в градиенте плотности через среду фиколл-пак. Астроциты человека заказывали в фирме IηУ^νοдеη.
Стимуляция клеток
МКПК высевали в 24- или 48-луночные планшеты при концентрации 1х106/лунка в 1 мл среды, состоящей из КРМ1 О1и1атах 1640 Дпуйгодеп) с добавлением 1% неэссенциальных аминокислот, 1% пени- 40 024655 циллина/стрептомицина, 1% пирувата натрия и 10% инактивированной нагреванием ФСТ (Вю^екБ). Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в увлажненной атмосфере в течение 24, 48 или 72 ч.
Для экспериментов на культурах клеток синцитин, ΜδКV-ΕNV и Б-Εδ предварительно инкубировали в 100 мкл среды с антителами, направленными против ΕΝν (СИЬАС1 моноклональное ЦС мыши, Се№иго), в течение 1 ч при 4°С, после чего добавляли к клеткам.
Анализы продуцирования цитокинов
Надосадочные жидкости клеточных культур собирали при 24, 48 или 72 ч и хранили при -20°С до оценки продуцирования цитокинов с помощью ШЕЛА. Для определения цитокинов человека использовали набор ОрИА ВБЛА от ИС Вюкаепсе в соответствии с инструкциями изготовителя.
Результаты
ΜδКV-ΕNV и синцитин являются ΗΕΒν-Χν-родственными белками
С целью сравнения биологических свойств, связанных с белком оболочки ΗΕΒν-\ν синцитином (номер доступа NСВI АР072056.2), со свойствами ΜδКV-ΕNV (номер доступа NСВI АР331500.1) для настоящего исследования авторы изобретения экспрессировали и продуцировали эти два белка в сходных условиях (условия описаны в Примере 2).
Для адресации и сравнения биологических эффектов двух белков, родственных ΗΕΒν-\ν. авторы изобретения исследовали их эффект при индукции провоспалительных цитокинов. Авторы изобретения обнаружили, что стимуляция белков, родственных ΗΕΒν-\ν ΕΝν, приводила к сильной повышающей регуляции провоспалительных ответов интерлейкина 6 (ГБ-6) астроцитов. Важнее всего, что на эту стимуляцию не влияло нерелевантное антитело (не связывающееся ни с одним ΕΝν), но она была сильно ингибирована мышиным антителом СИЬАС1 и химерным антителом СИЬАС1 ЦС4 человека, что явно демонстрирует, что лиганд по изобретению в любых формах вектора антитела ингибирует провоспалительные эффекты родственных вариантов ΗΕΒν-\ν ΕΝν, а не только ΜδКV-ΕNV.
На фиг. 24 пример этого аналогичного биологического эффекта выявлен на основании дозы высвобождения ББ-6 в надосадочной жидкости культуры в присутствии каждого белка, родственного ΗΕΒν-\ν ΕΝν. Этот эффект является специфичным, поскольку также ингибируется лигандом СИЬАС1 в форме мышиного или ЦС4 химерного антитела. Посредством этого также получены данные о сходной эффективности ингибирования лиганда на различных белках, родственных ΗΕΒν-\ν ΕΝν.
Кроме астроцитов, которые вовлечены в локальные повреждения головного мозга и воспаление, авторы изобретения показали системные иммунные ответы как ΜδКV-ΕNV, так и синцитина, которые стимулируют продуцирование провоспалительных цитокинов в культурах мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК, то есть лимфоцитов и моноцитов).
На фиг. 25 пример этого аналогичного биологического эффекта на МКПК подтвержден обнаружением ББ-12 Р40 (характерного для врожденного иммунного ответа), а также подтвержден высвобождением одинаковой дозы ББ-6 в надосадочной жидкости культуры для обоих белков, родственных ΗΕΒν-\ν ΕΝν. Кроме того, как для эксперимента с астроцитами, это высвобождение [И-6 также специфично ингибируется лигандом СИЬАС1 в форме мышиного или ЦС4 химерного антитела.
Пример 16: Лиганд СШАСБ рекомбинантное химерное антитело ЦС4 человека - СШАС1 и гуманизированное антитело ЦС4, содержащее лиганд, связываются с белками ΜδКV-ΕNV и ΗΕΒν-\ν ΕΝν 7с|/синцитин с гликозилированием клеток человека
1. Материалы и методы
a. Бактериальный рекомбинантный белок ΕΝν был получен, как описано в примере 2.
b. Гликозилированный белок ΜδКV ΕΝν человека был продуцирован фирмой Се№иго, Р'Х Легареийск, Гренобль, Франция, в соответствии с приведенной ниже методикой: белок, аналогичный ΗΕΒνν-ΕΝν, называемый синцитин, продуцировали в соответствии с тем же протоколом.
Способ получения гликозилированного очищенного белка ΕΝν экспрессией в клетках человека
Трансфекция
Клетки ΗΕΚ-Ρι^^Κ высевали при 106 клеток/мл и трансфицировали Εην-ΜδКV_рΜСΜVΗΕ/1, используя реагент трансфекции 293Ресйп.
Сбор и лизис
Через трое суток после трансфекции клетки собирали и центрифугировали. Осадок клеток ресуспендировали в буфере лизиса (ФСБ с добавлением ингибиторов протеаз), и разрушение клеток осуществляли путем обработки ультразвуком.
Солюбилизация
После центрифугирования осадок ресуспендировали в буфере солюбилизации (50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 2 М мочевина, 2% ΡΟδ-холин 10) и солюбилизировали в течение ночи при +4°С при перемешивании.
Разведение перед очисткой
На следующие сутки солюбилизированный белок разводили в 4 раза в буфере разведения (50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1) и гомогенизировали перед очисткой.
Пул 1 ΕηνΜδКV Шк-метка Способ очистки: Аффинная хроматография на Νί-сефарозе
- 41 024655
Аффинную хроматографию на Νί-сефарозе (СЕ НеаШсаге, 4 мл) проводят для очистки Ηίδ-меченого Епу-М§КУ.
Буфер уравновешивания: 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ ΝαΟ. 0,5% ΡΟδ-холин 10, 0,5 М мочевина.
Буфер элюирования: 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 0,5% ΡΘδ-холин 10, 0,5 М мочевина, 1 М имидазол.
Стадия элюирования: градиент на 30 СУ (объемов колонки) от 0% до 100% буфера элюирования.
Концентрирование пула: 7-кратная с использованием Ашюоп с отсечением 30 кДа
Пул 2 ΕηνΜδΚν Ηίδ-метка Способ очистки: Аффинная хроматография на Νί-сефарозе
Эту вторую аффинную хроматографию проводили, используя проточную фракцию первой в качестве исходного материала = нанесение, разведение до 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 0,2% ΡΟδ-холин 10, 0,5 М мочевина
Буфер уравновешивания: 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 0,2% ΡΟδ-холин 10, 0,5 М мочевина.
Буфер элюирования: 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 0,2% ΡΟδ-холин 10, 0,5 М мочевина, 1 М имидазол.
Стадия элюирования: градиент на 30 СУ от 0% до 100% буфера элюирования.
Контроль качества:
Для анализа на контроль качества проводили электрофорез в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси синим и Вестерн-блот-анализом, используя мышиное антитело СИЬАС1. Ν-концевое секвенирование подтвердило идентичность очищенного белка.
Диализ и замораживание партий
Две партии Εην-ΜδΚν подвергали диализу против 50 мМ Трис рН 8, 100 мМ №С1, 0,5% или 0,2% ΡΟδ-холин 10, после чего добавляли 10% глицерина и замораживали в жидком азоте.
с. Определение специфичного связывания тестом ΕΡΙδΑ
Все препараты ΕΝν разводили в буфере СаСО2 50 мМ рН 9,6; препараты инкубировали в лунках микропланшетов Ейка в течение 2 ч 37°С для покрытия белком микропланшетов ΕΕδΑ. Тем не менее, вследствие более низкого выхода продуцирования, концентрация иммобилизованного синцитина была ниже таковой для ΜδΚν-ΕΝν.
Идентифицирующие антитела разводили в ФСБ БСА 1% и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в трех повторах лунок микропланшета. Меченое пероксидазой второе антитело против мыши для мышиного моноклонального (ссылка 115-035-14) и второе антитело против человека для гуманизированных и человеческих - химерных рекомбинантов (ссылка 115-035-088) разводили 1/1000 в буфере ФСБ БСА 1% и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Проявление ΟΡΌ для пероксидазы проводили в течение 30 мин с последующим считыванием оптической плотности при 490 нм. Отмывки перед каждой стадией инкубации проводили при 4, 4 и 6 циклах отмывки соответственно.
2. Результаты
Как видно из фиг. 26 ниже, очищенные белковые препараты ΜδΚν-ΕΝν, как бактериальные, так и с человеческим типом гликозилирования, легко определялись всеми типами антител с лигандом (мышиным, химерным и гуманизированным), давая хороший сигнал при люминометрических измерениях оптической плотности. Интересно, что в настоящих условиях ΕΡΙδΑ только гуманизированное антитело СИЬАС1 с лигандом обеспечивало хорошее распознавание человеческого гликозилированного синцитина, тогда как при данной концентрации покрытия мышиное и химерное антитела давали низкие сигналы с синцитином.
Эти результаты четко показывают, что для лиганда по настоящему изобретению, независимо от его используемого молекулярного вектора для связывания с эпитопом-мишенью (мышиного, химерного 1дС4 или гуманизированного 1дС4 антитела), обнаружено эффективное связывание со всеми формами белков-мишеней, содержащих эпитоп, то есть с белками ΕΝν как бактериального, так и человеческого типа гликозилирования, и в особенности с гуманизированным антителом, как ΗΕΚν-ν-родственных белков, так и белка ΜδΚν-ΕΝν и ΗΕΚν-ν 7ς ΕΝν, также называемого синцитином.
Таким образом, терапевтический лиганд связывается с человеческими гликозилированными формами белка-мишени ΕΝν.
Пример 17: Анализ ίη νίνο химерного антитела СИЬАС1 изотипа 1дС4 на терапевтический эффект в животной модели шизофренических аномалий поведения, индуцированных ΜδΚν ΕΝν
Ι. Введение
В примере 8 авторы изобретения продемонстрировали присутствие белка ΜδΚν-ΕΝν в сыворотке пациентов с шизофренией. Этот результат подчеркивает необходимость в исследовании взаимоотношений между присутствием белка ΕΝν и возникновением изменений в головном мозге и нарушений поведения в адекватных животных моделях. Теории шизофрении, связанные с развитием нервной системы, постулируют, что это заболевание является поведенческим проявлением первичного инсульта задолго до клинического проявления этого заболевания ^ешЬегдег апб Ыркка, 1995; Ьеук апб Θονί!!, 2002).
Таким образом, данный патофизиологический признак следует принимать во внимание при разработке соответствующих животных моделей, имитирующих расстройства, связанные с шизофренией.
II. Эксперимент 1: Эффект химерного антитела 1дС4 на поведенческие и анатомические изменения
- 42 024655 после повторной односторонней интрацеребровентрикулярной инъекции белка ΕΝν крысам, которые получили ΕΝν-индуцированное иммунное примирование в раннем взрослом состоянии
А. Материалы и методы
1. Животные
Самцов крыс линии Спраг-Доули (6-8-недельного возраста) (п=8) покупали в СЫаг1е8 Ркег, Франция. Животных содержали по 3 на клетку при стандартном цикле света и темноты со свободным доступом к пище и воде и не беспокоили в течение 8-суточного периода акклиматизации. Все процедуры согласованы с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС) и Директивой Национального Совета от 19 октября 1987 (87848, ΜίηίδίΌΐΐ Де ГАдпсиИиге е1 Де 1а Роге!, Франция). Прилагали все усилия к минимизации числа используемых животных и их страданий.
2. ΕΝν-индуцированное иммунное примирование
На первые сутки, названные моментом 0 (Р0), крыс случайным образом определяли в ложноинъецированную группу (п=2) с инъекцией фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) (Ьоп/а, Франция) и ΕΝν-инъецированную группу (п=6) с инъекцией 250 нг рекомбинантного белка ΕΝν (Ηίδ-ΕΝνΤ081206-1, ΡXΤЬе^ареиΐ^С8, Франция), растворенного в ФСБ.
Каждую крысу анестезировали 1.р. введением смешанного раствора ксилазина 10 мг/кг (Дотрин®, А1суоп, Франция) и кетамина 80 мг/кг (1та1депе®, А1суоп, Франция). Шерсть обрезали в области, распространяющейся от промежутка между ушами до области непосредственно перед глазами. Вставляли ушные пробки, и животное фиксировали в стереотаксическом инструменте с пластинкой верхних резцов на 5 мм выше внутриушной линии. Выстриженную область скальпа промокали антисептическим раствором на основе хлоргексидина (А1суоп, Франция) и делали разрез от промежутка между ушами до точки между глазами. Кожу отводили ножницами, и нижележащую ткань, включая периост, удаляли, чтобы обнажить чистую, сухую область черепа (примерно 15х18 мм).
Пластмассовая канюля (о.Д. = 0,457 мм и ί.ά. = 0,267 мм) (Р1а8рс Опе, υδ^ была предназначена для имплантации в правый боковой желудочек. Канюлю монтировали в стереотаксическом инструменте, нулевое положение наконечника устанавливали на брегме. Просверливали отверстие в черепе над боковым желудочком (переднее-заднее, 0,92 мм; медиально-латеральное, ±1,7 мм относительно брегмы). Точку канюли помещали над центральным отверстием, так чтобы наконечник находился на одном уровне с поверхностью черепа. Канюлю опускали на 3,5 мм через кору головного мозга в боковой желудочек.
Для каждой крысы инъекцию одного ФСБ или белка ΕΝν осуществляли посредством инъектора из нержавеющей стали, помещенного в канюлю и продвинутого на 0,5 мм ниже наконечника канюли. Инъектор был соединен полиэтиленовой трубкой со шприцом Гамильтона (ννΚ, Франция) для ручной подачи растворов за 3-минутный период. Инъектор извлекали через 3 мин после завершения впрыска, чтобы предотвратить ток ФСБ или белка ΕΝν вслед за инъектором.
Рану закрывали, используя хирургическую нить на иглодержателе. Животным давали возможность восстановиться в индивидуальной клетке в течение 2-суточного периода. Затем животных случайным образом помещали по трое на клетку и не беспокоили в течение дальнейших экспериментов.
3. Повторная односторонняя интрацеребровентрикулярная инъекция белка ΕΝν после латентного периода
Восемь месяцев спустя всем крысам имплантировали краниальные канюли, дающие возможность повторных интрацеребровентрикулярных (юг) инъекций.
На сутки операции (Р0) каждую крысу анестезировали 1.р. введением смешанного раствора ксилазина 10 мг/кг (^трип®, А1суоп, Франция) и кетамина 80 мг/кг (1та1депе®, А1суоп, Франция). Шерсть обрезали в области, распространяющейся от промежутка между ушами до области непосредственно перед глазами. Вставляли ушные пробки, и животное фиксировали в стереотаксическом инструменте с пластинкой верхних резцов на 5 мм выше внутриушной линии. Выстриженную область скальпа промокали антисептическим раствором на основе хлоргексидина (А1суоп, Франция) и делали разрез от промежутка между ушами до точки между глазами. Кожу отводили ножницами, и нижележащую ткань, включая периост, удаляли, чтобы обнажить чистую, сухую область черепа (примерно 15х18 мм). Просверливали три отверстия, два примерно на 7 мм кпереди от брегмы на обеих сторонах черепа, правой и левой, а третье на 7 мм кзади от брегмы. Нейлоновые винты (диаметр = 0,50 мМ) (Р1а811с Опе, США) ввинчивали, чтобы они точно входили в отверстия, и они служили в качестве якорей для зубного цемента. При этих процедурах уделяли внимание сохранению твердой мозговой оболочки. Пластмассовая канюля (о.Д. = 0,457 мм и ί.ά. = 0,267 мм) (Р1а8Ис Опе, υδ^ была предназначена для имплантации в правый боковой желудочек. Канюлю монтировали в стереотаксическом инструменте, нулевое положение наконечника устанавливали на брегме и отмечали точку на 0,92 мм кзади и на 1,7 мм вбок от нулевой отметки. В этом отмеченном месте делали отверстие с помощью бора. Точку канюли располагали над центральным отверстием, так чтобы наконечник находился на одном уровне с поверхностью черепа. Канюлю опускали на 3,5 мм через кору головного мозга в боковой желудочек. При удерживании канюли в зажимном приспособлении стереотаксического инструмента небольшое количество зубного уплотнителя (Ра1аДиг®, Шще^ Ки1/ег, Франция) вводили вокруг канюли и якорных винтов. Рану закрывали, используя хирур- 43 024655 гическую нить на иглодержателе. Закрепляющую иглу вытаскивали, когда зубной материал затвердевал, и животное можно было извлечь из стереотаксического аппарата.
Инъекции ФСБ или белка ΕNΥ осуществляли на те же сутки (Р0) и на 25 сутки (Р25) после имплантации краниальных канюль.
Для каждого момента времени один ФСБ или 250 нг рекомбинантного белка ΕNΥ (Н|к-ЕНУТ081206-1, РХТйегареийск, Франция) посредством инъектора из нержавеющей стали, помещенного в канюлю и продвинутого на 0,5 мм ниже наконечника канюли. Инъектор был соединен полиэтиленовой трубкой со шприцом Гамильтона (У^К, Франция) для ручной подачи растворов за 3-минутный период. Инъектор извлекали через 3 мин после завершения впрыска, чтобы предотвратить ток ФСБ или белка ΕNΥ вслед за инъектором.
4. Системное введение химерного антитела 1дО4
На сутки после второй бустер-инъекции белка ΕNΥ (Р26) ΕNΥ-инъецированных крыс случайным образом отбирали для получения однократной внутрибрюшинной инъекции (1.р.) ФСБ (п=3) или 100 мкг химерного антитела 1дО4, разведенного в ФСБ (п=3).
5. Магнитно-резонансная визуализация ш νί\Ό (ΜРВ)
Морфологию головного мозга крыс исследовали на Р12 и Р37 путем МРВ ш νί\Ό. Сначала крыс анестезировали одобренной системой (ТЕМ 8еда, Франция), используя ингаляцию 3% изофлурана при токе 0,6 л/мин воздухом с 30% кислорода. После индукции анестезию поддерживали газом изофлураном при 1,5-2% и токе 0,6 л/мин. Температуру тела контролировали и поддерживали на уровне 37±1°С путем использования электрогрелки с циркулирующей водой. Мониторинг частоты дыхания проводили на протяжении всего эксперимента. Крыс помещали в наклонном положении на пластмассовую подложку (Вгикег Вюкрес Ашта1 НаибНпд ЗукГетк, Германия), оборудованную стереотаксической фиксацией (зубная пластинка и ушные булавки). Затем помещали внутривенный катетер калибра 22 в хвостовую вену крыс для последующих инъекций.
Сканирование проводили на системе Вгикег 7Т Вюкрес (Вгикег, Германия), оборудованной установкой градиента 400 мТ/м, используя трансмиссионную катушку корпуса (о.б. = 112 мм и 1.б. = 72 мм), и поверхностную катушку диаметром 25 мМ используют для приема сигнала. Эхолокатор быстрого градиента с тремя ортогональными ориентациями и 5 см полем зрения сначала использовали для идентификации областей головного мозга, что давало возможность вычисления фиксированных пространственных координат для последующих сканирований. Проводят две последовательности быстрого сканирования с релаксационным усилением (КАКЕ) в осевой плоскости. Первые Т2-взвешенные изображения снимают с последовательностью спин-эхо импульсов, используя время повторения импульса (ТК) 4200 мс, однократный эхо-сигнал при времени появления эхо-сигнала (ТЕ) 36 мс, диапазон приема 35714 Гц и время сканирования 4 мин.
Вторые Т2-взвешенные изображения снимают с последовательностью спин-эхо импульсов, используя ТК 3000 мс, два эхо-сигнала с ТЕ 17 мс и 51 мс, диапазон приема 55555 Гц и время сканирования 5 мин. Для обеих последовательностей было снято всего 30 срезов (толщиной 800 мкм) с полем зрения 2,56 см и размером матрицы снятия данных 256 х 256, приводящими в результате к разрешению в одной плоскости 100 х 100 мкм.
Для оценки динамики цереброменингеального и церебровентрикулярного барьеров у крыс, инъецированных белком ΕNΥ, использовали метод МРВ, усиленной гадолинием. Фронтальные преконтрастные Т1-взвешенные изображения снимали при последовательностях быстрой экспозиции с малым углом отклонения (РЬАЗН) и времени повторения/времени эхо-сигнала = 2,2/1,4 мс. Было снято всего 30 срезов (толщиной 800 мкм) с полем зрения 2,56 см и размером матрицы снятия данных 256 х 192, приводящими в результате к разрешению в одной плоскости 100 х 133 мкм. Затем животные получали болюсную инъекцию гадолиния 0,5 М (ОоГагет®, ОиегЬеГ, Франция) (1 мл/кг массы тела). Постконтрастное Т1 сканирование проводили через 10 мин после введения гадолиния в таких же условиях, как описано выше.
6. Поведенческий анализ
На Р15 и Р40 крыс тестировали на локомоторную активность, используя автоматизированный цифровой аппарат, соединенный с РС компьютером (1теГгошс, Реккас, Франция). Мониторинг локомоторной активности проводили в испытательной клетке с фотоэлементом, оборудованной устройством из четырех параллельных горизонтальных инфракрасных датчиков обнаружения по прерыванию луча (два спереди и два сзади), расположенных на 0,7 см выше пола, для измерения горизонтальной активности.
Число прерываний луча регистрировали автоматически. Горизонтальную активность выражали в числе пересечений клетки (то есть последовательных прерываний луча на любой стороне клетки). Число пересечений клетки непрерывно регистрировали и кумулировали за 10-минутные интервалы.
Для всех крыс локомоторную активность оценивали в условиях слабого стресса (то есть после воздействия новой окружающей среды или после 1.р. инъекции физиологического раствора) и при стимуляции амфетамином. Все эти тесты проводили во время неактивной фазы (световой период). Для теста новизны крыс извлекали из их домашней клетки и помещали в индивидуальную клетку с фотоэлементом, и локомоторную активность измеряли в течение 1 ч. Затем крысы получали инъекции физиологического
- 44 024655 раствора (1 мл/кг, 1.р.), и мониторинг их локомоторной активности проводили в течение одного дополнительного часа. Наконец, животным инъецировали Ό-амфетамин (сульфат, 1,5 мг/кг, 1.р., 81дта А1БпсН, А5880, партия 90К3354), и их активность регистрировали в течение двух дополнительных ч.
В. Результаты
1. Магнитно-резонансная визуализация ш νί\Ό
a) После первой бустер-инъекции белка ЕЫУ
На Р12 количественный анализ Т2-взвешенных изображений большинства животных выявил большие гиперсигналы, соответствующие боковым желудочкам. По сравнению с классическими МРВ изображениями головного мозга крыс, не подвергнутых воздействию, расширение этих гиперсигналов, наблюдаемое в настоящем исследовании, позволяет предположить отек боковых желудочков у соответствующих животных. Кроме того, более сильную экспансию правого бокового желудочка (то есть инъецированного) наблюдали как у ложно, инъецированных, так и у ЕЫУ-инъецированных животных. Степень гиперсигналов, соответствующих боковым желудочкам, наблюдаемых у животных, инъецированных белком ЕЫУ, отличалась по сравнению с животными, инъецированными ФСБ, что позволяет предположить, что белок ЕЫУ запускает нейровоспалительные процессы.
Сравнения Т1-взвешенных изображений, снятых до и после инъекции гадолиния, выявили различия у животных, инъецированных ФСБ или белком ЕЫУ. Эти результаты позволяют предположить, что цереброменингеальный и церебровентрикулярный барьеры могут быть изменены через 12 суток после интрацеребровентрикулярной (юу) инъекции белка ЕЫУ.
b) После второй бустер-инъекции белка ЕЫУ
Как описано после бустер-инъекции белка ЕЫУ, количественный анализ Т2-взвешенных изображений, полученных после второй бустер-инъекции (Р37), выявил большие гиперсигналы, соответствующие боковым желудочкам, у большинства животных. У ложно-инъецированных крыс авторы изобретения не обнаружили какого-либо значимого гиперсигнала (с учетом повышения сигнала выше нормального фонового сигнала цереброспинальной жидкости, который обычно визуализируется на МРВ внутри желудочков головного мозга), который соответствовал боковым желудочкам, между двумя временными точками. Удивительно, что ЕЫУ-инъецированные крысы проявляли сильное расширение этих гиперсигналов после второй инъекции. Даже более значимо, что гиперсигналы могли распространяться в окружающие структуры, в частности, в гиппокамп. МР изображения, полученные у ЕЫУ-инъецированных крыс, обработанных химерным антителом 1дС4, выявили сильное расширение гиперсигналов, соответствующих боковым желудочкам.
Интересно, что распространение этих Т2-взвешенных гиперсигналов в окружающие структуры, такие как гиппокамп, было ограниченным у ЕЫУ-инъецированных крыс, обработанных химерным антителом 1дС4. Поскольку антитело инъецировали на периферии центральной нервной системы - ЦНС (внутрибрюшинно), этот последний момент подчеркивает те факты, что немедленные провоспалительные ответы в желудочках головного мозга, относящиеся исключительно к конкретному протоколу, используемому для настоящей животной модели, в которой используют прямую ίσν инъекцию белка М8КУ ЕЫУ, не ингибируются немедленно лигандом химерного антитела 1дС4, инъецированным более чем через 24 ч после ίσν инъекции ЕЫУ и, следовательно, после инициации локального воспаления желудочков. Необходимо уточнить, что локальное воспаление желудочков не является основным признаком патогенеза при психозе, и, наиболее вероятно, не вовлечено в нейроповеденческие проблемы в настоящей модели. Это немедленное локальное воспаление после ίσν можно, следовательно, рассматривать как побочный эффект настоящей модели;
релевантные признаки, известные как ассоциированные с экспрессией психоза, такие как патогенная вовлеченность гиппокампа, в данном случае ингибируются у крыс, инъецированных терапевтическим лигандом по настоящему изобретению в форме химерного антитела с 1дС4 человека, инъецированного после юу инъекции ЕЫУ в отдалении от ЦНС и на периферии ЦНС. В данном случае об этом свидетельствует ингибирование распространения гиперсигналов, наблюдаемых на МРВ, из желудочков на критическую область гиппокампа головного мозга.
Сравнения Т1-взвешенных изображений, снятых до и после инъекции гадолиния, не выявили каких-либо видимых различий во всех группах. Эти результаты позволяют предположить, что цереброменингеальный и церебровентрикулярный барьеры, по-видимому, дополнительно не изменяются после второй бустер-инъекции белка ЕЫУ.
В этой первой серии экспериментов авторы изобретения впервые показали, что две ίσν бустеринъекции белка ЕЫУ могут привести к нейровоспалительным процессам в областях желудочков и гиппокампа у крыс, которые получили ЕЫУ-индуцированное иммунное примирование в раннем взрослом состоянии. Удивительно, что анатомические и функциональные нарушения гиппокампа согласуются с исследованиями МРВ, описанными у пациентов с шизофренией с долгосрочным ухудшением познавательной способности, связанным с потерей нейронов и расширением желудочков (Воги51ет е( а1., 1992). Интересно, что повреждение гиппокампа, индуцированное повторными бустер-инъекциями белка ЕЫУ, было ингибировано в результате введения человеческого химерного антитела 1дС4 после индукции ЕЫУ-индуцированного патогенеза, что согласуется с терапевтическим эффектом лиганда при введении в
- 45 024655 препарате этого химерного антитела в доклинической модели шизофрении.
Ш.Эксперимент 2: Оценка нейроповеденческих нарушений после однократной двусторонней инъекции белка ΕΝν в гиппокамп или боковые желудочки крыс
А. Материалы и методы
1. Животные
Самцов крыс линии Спраг-Доули (6-8-недельного возраста) (п=6) покупали в СЬаг1е8 Ктует, Франция. Животных содержали по 3 на клетку при стандартном цикле света и темноты со свободным доступом к пище и воде и не беспокоили в течение 8-суточного периода акклиматизации. Все процедуры согласованы с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС) и Директивой Национального Совета от 19 октября 1987 (87848, Μ^и^8!е^е бе ГАдпсиНиге е! бе 1а Роге!, Франция). Прилагали все усилия к минимизации числа используемых животных и их страданий.
2. Двусторонняя инъекция белка ΕΝν в гиппокамп или в боковые желудочки
На сутки операции (РО) крыс случайным образом определяли в ложно-инъецированную группу (п=2) с инъекцией фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) (Ьота, Франция) и две испытуемые группы с инъекцией 1су (крысы ΕΝν-ίον, п=2) или в гиппокамп (крысы ΕΝν-Ырр, п=2) 250 нг рекомбинантного белка ΕΝν (ΕΝν-Т, партия 081206-1, РХТЬетареиЬс8, Гренобль, Франция), растворенного в ФСБ.
Каждую крысу анестезировали 1.р. введением смешанного раствора ксилазина 10 мг/кг (Котрип®, А1суоп, Франция) и кетамина 80 мг/кг (1та1депе®, А1суоп, Франция).
Шерсть обрезали в области, распространяющейся от промежутка между ушами до области непосредственно перед глазами. Вставляли ушные пробки, и животное фиксировали в стереотаксическом инструменте с пластинкой верхних резцов на 5 мм выше внутриушной линии. Выстриженную область скальпа промокали антисептическим раствором на основе хлоргексидина (А1суоп, Франция) и делали разрез от промежутка между ушами до точки между глазами. Кожу отводили ножницами, и нижележащую ткань, включая периост, удаляли, чтобы обнажить чистую, сухую область черепа (примерно 15х18 мм).
Пластмассовая канюля (о.б. = 0,457 мм и ΐ.ά. = 0,267 мм) (Р1а8Йс Опе, США) была предназначена для двухсторонней имплантации в боковой желудочек или в гиппокамп. Канюлю монтировали в стереотаксическом инструменте, нулевое положение наконечника устанавливали на брегме. Просверливали отверстие в черепе над боковым желудочком (переднее-заднее, 0,92 мм; медиально-латеральное, ±1,7 мм относительно брегмы) или над гиппокампом (переднее-заднее, 4,8 мм; медально-латеральное, ±5,0 мМ относительно брегмы). Точку канюли помещали над центральными отверстиями, так чтобы наконечник находился на одном уровне с поверхностью черепа. Канюлю опускали на 3,5 мм через кору головного мозга в боковой желудочек или на 7,5 мм в гиппокамп.
Для каждой крысы инъекцию одного ФСБ или с белком ΕΝν осуществляли посредством инъектора из нержавеющей стали, помещенного в канюлю и продвинутого на 0,5 мм ниже наконечника канюли. Инъектор был соединен полиэтиленовой трубкой со шприцом Гамильтона (У^К, Франция) для ручной подачи растворов за 3-минутный период. Инъектор извлекали через 3 мин после завершения впрыска, чтобы предотвратить ток ФСБ или белка ΕΝν вслед за инъектором.
Рану закрывали, используя хирургическую нить на иглодержателе. Животным давали возможность восстановиться в индивидуальной клетке в течение 2-суточного периода. Затем животных случайным образом помещали по трое на клетку и не беспокоили в течение дальнейших экспериментов.
3. Поведенческий анализ
Локомоторный ответ крыс исследовали в условиях слабого стресса в открытом поле, используя три парадигмы: новизну, инъекцию физиологического раствора и стресс ограничения. Локомоторный ответ на новизну тестировали на Р5, Р6, Р7, Р11 и Р12, тогда как локомоторную активность после инъекции физиологического раствора и стресса ограничения тестировали однократно на Р11 и Р13 соответственно.
Аппарат открытого поля состоял из квадратного ящика (80 х 75 х 40 см), изготовленного из дерева, который был слабо освещен. Пол открытого поля был разделен на девять квадратных зон одинакового размера. Для теста на новизну крыс индивидуально помещали в центр открытого поля и давали возможность исследовать поле в течение 5 мин. Затем крысам давали возможность вернуться в их домашнюю клетку. Поле очищали физиологическим раствором между животными. Для теста на инъекцию физиологического раствора на Р11 крысы получали инъекцию физиологического раствора (1 мл/кг, 1.р.), и их немедленно помещали в центр открытого поля и давали возможность исследовать поле в течение 5 мин. Для теста на стресс ограничения животных ограничивали посредством иммобилизации на 15 мин в плексигласовой трубке (5,5 х 21 см) и немедленно помещали в центр открытого поля и давали возможность исследовать поле в течение 5 мин.
Для всех тестов поведение каждого животного наблюдал экспериментатор. Общую горизонтальную двигательную активность количественно определяли как число линий, пересеченных за 5-минутный период. Кроме того, число вертикальных стоек (подъемов на задние лапы, когда передние лапы находятся в воздухе или напротив стенки) оценивали следующим образом: 0 = отсутствуют, 1 = малое, 2 = среднее, 3
- 46 024655 = высокое, 4 = очень высокое.
В. Результаты
1. Локомоторный ответ на новизну
Для всех моментов времени после воздействия новизны все крысы проявляли высокую степень горизонтальной и вертикальной локомоторной активности в открытом поле в течение 5-минутного периода.
Общие результаты теста на новизну в различные экспериментальные моменты времени представлены на фиг. 27. У всех ЕИУ-инъецированных животных увеличение горизонтальной локомоторной активности отсутствовало в ранний период после инъекции (Р5), но постепенно появлялось со временем, в частности, у крыс, инъецированных в гиппокамп (крыс ЕИУ-Ырр) (фиг. 27А). Интересно, что только крысы ЕИУ-Ырр проявляли постоянную обостренную горизонтальную активность на Р12. Кроме того, повышенная вертикальная локомоторная активность была обнаружена уже на Р5 и Р6 у крыс ЕИУ-Ырр, тогда как никакого отличия от ложно-инъецированного животного не зарегистрировано у крыс ЕИУ-Ч в те же моменты времени.
2. Локомоторная активность после инъекции физиологического раствора После воздействия инъекции физиологического раствора все крысы проявляли высокую степень горизонтальной и вертикальной локомоторной активности в открытом поле в течение 5-минутного периода.
Только крысы ЕИУ-Ырр проявляли явное увеличение горизонтальной локомоторной активности по сравнению с ложно-инъецированным животным (фиг. 28А), тогда как вертикальная локомоторная активность всех групп была сходной (фиг. 28В).
3. Локомоторная активность после стресса ограничения
После воздействия стресса ограничения все крысы проявляли высокую степень горизонтальной и вертикальной локомоторной активности в открытом поле в течение 5-минутного периода. Как для горизонтальной, так и для вертикальной активности крысы ЕИУ-Ырр проявляли более высокую локомоторную активность по сравнению с ложно-инъецированными животными, тогда как явного отличия невозможно было обнаружить между ложно-инъецированными и ЕИУ-Ч крысами (фиг. 29).
В этой второй серии экспериментов авторы изобретения показали, что однократная двухсторонняя инъекция белка ЕИУ в боковые желудочки или в гиппокамп может приводить к обострению чувствительности к условиям слабого стресса. Кроме того, было показано, что изменения поведения являются значительно более тяжелыми и постоянными у крыс ЕИУ-Шрр. Кроме того, аберрантный локомоторный ответ на провокацию стрессом ограничения наблюдали только у крыс ЕИУ-Шрр. Крысы с двухсторонней инъекцией в гиппокамп белка ЕИУ обеспечивают релевантную модель в большей степени, чем ίσνинъецированная модель, в целях исследования терапий для шизофрении в доклинической модели.
Таким образом, авторы изобретения дополнительно оценили терапевтический эффект химерного IдС4 человека - лиганда в данной оптимизированной модели.
Ιν. Оценка химерного лиганда ^С4 не нейроповеденческие психотические симптомы после однократной двухсторонней инъекции белка ЕИУ в гиппокамп крыс
А. Материалы и методы
1. Животные
То же, что в части ΙΙΙ настоящего примера.
2. Двухсторонняя инъекция белка ЕИУ в гиппокамп или в боковые желудочки
То же, что в части ΙΙΙ настоящего примера, с дополнительной инъекцией антитела некоторым животным, как описано ниже.
Для каждой крысы инъекцию каждого раствора (ФСБ, ЕИУ и ^С4) осуществляли посредством инъектора из нержавеющей стали, помещенного в канюлю и продвинутого на 0,5 мм ниже наконечника канюли. Инъектор был соединен полиэтиленовой трубкой со шприцом Г амильтона (УУК, Франция) для ручной подачи растворов за 3-минутный период. Инъектор извлекали через 3 мин после завершения впрыска, чтобы предотвратить ток ФСБ или белка ЕИУ вслед за инъектором. Для IдС4-обработанных крыс ЕИУ 2 мкг антитела инфузировали через 10 мин после инъекции белка ЕИУ в обе полусферы при тех же координатах. Рану закрывали, используя хирургическую нить на иглодержателе. Животным давали возможность восстановиться в индивидуальной клетке в течение 2-суточного периода. Затем животных случайным образом помещали по трое на клетку и не беспокоили в течение дальнейших экспериментов.
3. Результаты
Эти результаты впервые обеспечили воспроизведение предшествующего эксперимента по стереотаксической инъекции в гиппокамп белка ЕИУ с обострением чувствительности к условиям слабого стресса, как в примере, проиллюстрированном ниже для Р12 на фиг. 31А.
Удивительно, что не наблюдалось в предыдущем эксперименте, в котором прекращали наблюдение за животными после 12 суток (Р12), было показано, что изменения поведения (необработанных) ЕИУ+ крыс претерпевают значительное развитие от гиперреактивности на слабый стресс, еще наблюдаемой на Р12, до гипореактивности (заторможенности), которую наблюдают в этой группе на Р32 (представленной средним столбиком на гистограммах фиг. 30А). Отдельно от нижеописанных результатов по терапевти- 47 024655 ческому эффекту лиганда 1дС4 на сутки 32 это наблюдение весьма интересно, поскольку воспроизводит ключевые признаки естественного клинического развития подтипа шизофрении человека, для которого идентифицирована корреляция с присутствием повышенной антигенемии ΕΝν и СКР в крови (как показано в примере 8): появление фазы негативной симптоматики (гипореактивности на стресс для настоящей животной модели), сопутствующей снижению познавательной способности и потере нейронов, после ранней фазы, характеризующейся позитивными симптомами (гиперреактивностью на стресс для настоящей животной модели).
Действительно, типично этот эффект является более поздним, связанным с потерей нейронов, о чем также может свидетельствовать расширение желудочков головного мозга, как в наблюдениях МРВ, осуществленных во время настоящего исследования головного мозга крыс, проведенного через 9 месяцев после первичной ίεν инъекции ΕΝν. Опять же, интересно, что объективно не определено количественно соответствующими поведенческими тестами, как в настоящем эксперименте, эти крысы претерпевали прогрессирующее развитие в направлении примечательной гипореактивности в течение этого долгого периода; это можно было наблюдать субъективно, но постоянно.
В данном случае, при количественных и соответствующих тестах, этот сдвиг от позитивных симптомов к негативным симптомам подтвержден вторым тестом на стресс ограничения на Р32 (фиг. 30В) животных, инъецированных белком ΕΝν в гиппокамп, против контролей (δΗΆΜ). Это, следовательно, усиливает значимость и важность терапевтического эффекта, настоящим описанного у подобных животных, обработанных лигандом 1дС4, после параллельной инъекции белка ΜδΚν ΕΝν.
Как видно на фиг. 31А, у животных ΕΝν+, обработанных 1дС4, не развивалось это снижение познавательной способности с появлением данной поведенческой гипореактивности (заторможенности) на Р32, и их невозможно было дифференцировать от контроля δΗΆΜ в данный момент времени (как проиллюстрировано перекрывающимися столбиками ошибки на гистограммах), тогда как данное различие было значимым для необработанных животных (отсутствие перекрывания столбиков ошибок на гистограммах). Опять же, второй поведенческий тест после стресса ограничения воспроизвел данное различие между крысами ΕΝν+, обработанными лигандом 1дС4, и необработанными животными даже с более высоким различием в результатах между двумя группами: если необработанные животные ΕΝν+ обладали активностью, значимо сниженной почти наполовину по сравнению с обработанными животными, последние имели результаты, неотличимые от контролей δΗΆΜ (фиг. 31В).
Таким образом, поскольку идентифицировано, что подтип шизофрении с повышенными сывороточными уровнями СКР ассоциирован с ΜδΚν в примере 8 и характеризуется данной последней фазой негативной симптоматологии, сопутствующей снижению познавательной способности и потере нейронов, данные по полезному терапевтическому эффекту в доклинической модели лечения лигандом 1дС4 неожиданно свидетельствовали о такой резкой симптоматологии; это, после того как инъекция ΜδΚν ΕΝν инициирует релевантный патогенетический процесс в данной модели, подтверждает чистый терапевтический эффект лиганда по настоящему изобретению при таких формах шизофрении (П1скегкоп, Р.,
С. δΙ;·ι11ίπ£,κ„ е! а1. 2007).
Пример 18: Анализ ш νί\Ό химерного антитела С№АС1 изотипа 1дС1 на терапевтический эффект в животной модели рака, привитого клетками лимфомы человека
I. Эксперимент 1: Эффект химерного антитела 1дС1 С№АС1 на миграцию клеток В-лимфомы человека, инъецированных подкожно бестимусным мышам
А. Материалы и методы
1. Животные
Свободных от патогенов самок бестимусных мышей (6-8-недельного возраста) (п=4) покупали в СЬаг1ек КТОет, Франция. Животных содержали в одной клетке при стандартном цикле света и темноты со свободным доступом к пище и воде и не беспокоили в течение 8-суточного периода акклиматизации. Все процедуры согласованы с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС) и Директивой Национального Совета от 19 октября 1987 (87848, Μιμ^κ бе ГАдпси1!иге е! бе 1а Роге!, Франция). Прилагали все усилия к минимизации числа используемых животных и их страданий.
2. Культура клеток
Клеточная линия Ака!а представляет собой клеточную линию, положительную по вирусу Эпштейна-Барр, выделенную от пациента, который страдал лимфомой Беркитта. Эту клеточную линию поддерживали в среде ΚΓΜΙ 1640 (δίβΗκι, Франция) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (СЬсо®, фуйгодеп, Франция), 40 ед. пенициллина на мл и 50 мкг стрептомицина на мл при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО2.
3. Инъекция клеток и введение антитела
На Р0 (первые сутки) 15 χ 107 клеток лимфомы подкожно инъецировали бестимусным мышам. После 6-часовой задержки две контрольные мыши получали 1.р. инъекцию фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (Боп/а, Франция), и одна мышь получала 1.р. инъекцию химерного антитела 1дС1 (100 мкг/животное). Последнюю мышь обрабатывали подобным образом тем же антителом через 72 ч после инъекции клеток лимфомы.
- 48 024655
4. Гистологическое исследование
На Р19 всех мышей умерщвляли передозировкой пентобарбитала и подвергали аутопсии для оценки присутствия патоанатомических аномалий. Фотографии снимали цифровой камерой [модель Соо1р1х δ500 (то есть 7 млн пикселов), №коп, Франция] и переносили с камеры на РС компьютер.
B. Результаты
Неожиданно никакой подкожной тканевой массы (опухоли) невозможно было обнаружить у необработанных мышей, тогда как у обеих ЦСВобработанных мышей выявлена локально ограниченная масса в сайте инъекции.
На аутопсии авторы изобретения наблюдали сильную спленомегалию у обеих контрольных мышей, тогда как обе ^61-обработанные мыши не проявляли макроскопическое изменение селезенки. Для лучшей оценки увеличения селезенки селезеночный индекс вычисляли следующим образом: [(масса селезенки/масса тела) х 100]. Интересно, что у необработанных бестимусных мышей проявлялось 2-кратное увеличение массы селезенки/тела по сравнению с таковой у ЦСВобработанных бестимусных мышей, как показано на фиг. 32. Кроме того, небольшое увеличение печени можно было также видеть у контрольных мышей по сравнению с ЦСВобработанными мышами. Макроскопическое обследование других органов (сердца, легких, почек, головного мозга, кишечника и желудка) не выявило никаких значительных аномалий.
C. Обсуждение
В данном первом эксперименте авторы изобретения показали, что подкожная инъекция лимфобластоидных клеток у бестимусных мышей может привести к диссеминации лимфоидных клеток в лимфоидных органах, о чем свидетельствует сильная спленомегалия, тогда как клетки, инъецированные ίη δίΐιι, по-видимому, почти все мигрировали. У мышей, обработанных химерным ЦСР авторы изобретения описали отсутствие увеличения селезенки, связанное с сохранением локально инъецированной массы клеток лимфомы, ограниченной ίη δίΐιι.
В соответствии с настоящими данными химерное антитело ЦС1 О№АС1 должно предотвратить миграцию клеток лимфомы посредством его эффекта в качестве лиганда. Эти результаты, следовательно, являются убедительным аргументом, что химерное антитело ЦСР содержащее лиганд по настоящему изобретению, может быть полезным терапевтическим инструментом при лечении ΕΝν-положительных опухолей человека.
II. Эксперимент 2: Данные клеточной цитотоксичности ίη νί\Ό против В-клеточной лимфомы человека после инъекции лиганда, связывающего ΜδΚν-ΕΝν, в форме химерного антитела IдО1 в мышиной модели δί'ΊΩ
А. Материалы и методы
1. Животные
Свободных от патогенов самок мышей δί'ΊΩ (тяжелый комбинированный иммунодефицит; отсутствие функциональных Т и В лимфоцитов, с уменьшенной популяцией ΝΚ) (6-8-недельного возраста; η=5) покупали в СЬат1е8 К|уег, Франция. Животных содержали в одной клетке при стандартном цикле света и темноты со свободным доступом к пище и воде и не беспокоили в течение 8-суточного периода акклиматизации. Все процедуры согласованы с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 (86/609/ЕЕС) и Директивой Национального Совета от 19 октября 1987 (87848, Миийеге йе 1'Λд^^сийиге еΐ йе 1а Гоге!, Франция). Прилагали все усилия к минимизации числа используемых животных и их страданий.
2. Культура клеток
Линия клеток представляет собой клеточную линию, положительную по вирусу Эпштейна-Барр, выделенную от пациента, который страдал лимфомой Беркитта. Клеточную линию Ака!а поддерживали в среде КΡΜI 1640 ^1дта, Франция) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (О1Ьсо®, ПкПгодец Франция), 40 ед. пенициллина на мл и 50 мкг стрептомицина на мл при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО2.
3. Инъекция клеток и введение антитела
На первые сутки Р0 15х107 лимфобластоидных клеток Ака!а (ЬС) внутрибрюшинно инъецировали всем мышам δίΊΩ. После 24-часовой задержки три контрольные мыши получали ί.ρ. инъекцию фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (Ьо^а, Франция), и две мыши получали ί.ρ. инъекцию 100 мкг химерного антитела Т§О1.
4. Гистологическое исследование и счет клеток
На Р7 всех мышей умерщвляли передозировкой пентобарбитала. После этого клетки перитонеальной промывки собирали в 5 мл ФСБ. Определение жизнеспособности ЬС было основано на окрашивании перитонеальной жидкости трипановым синим. ЬС и другие лейкоциты наблюдали и считали с помощью микроскопии низкого разрешения. Клетки лимфомы Беркитта человека можно было легко идентифицировать по их морфологии, и подтверждение их специфичности было получено с помощью иммуногистохимии, проведенной с моноклональными антителами против вируса Эпштейна-Барр, специфичным к экспрессируемым латентным белкам, а также с моноклональными антителами, специфичными к марке- 49 024655 рам В-клеток человека (не показано).
Мышей также подвергали аутопсии для оценки присутствия патоанатомических аномалий. В частности, потенциальное изменение селезенки оценивали на основании отношения массы селезенки/тела, вычисленного следующим образом: [(масса селезенки/масса тела) х 100].
B. Результаты
Макроскопическое обследование всех мышей не выявило присутствия пальпируемой опухоли, что было согласовано с очень короткой продолжительностью исследования, оправданной необходимостью в направлении антителозависимой клеточной цитотоксичности с короткой задержкой после инъекции клеток лимфомы, а затем антитела или ложной инъекции. Однако спленомегалию можно было легко обнаружить у обеих контрольных мышей, тогда как у обеих 1дО1-обработанных мышей не проявлялась макроскопическая модификация селезенки. Как в предыдущем эксперименте с подкожной инъекцией тех же клеток бестимусным мышам, у необработанных мышей §СГО проявлялось 2-кратное увеличение отношения массы селезенки/тела по сравнению с 1дО1-обработанными мышами §СГО (фиг. 32). Макроскопическое обследование других органов (сердца, легких, почек, головного мозга, кишечника и желудка) не выявило никаких значительных аномалий.
Анализ перитонеальной жидкости 1дО1-обработанных мышей выявил снижение числа как живых, так и мертвых клеток лимфомы по сравнению с контрольными мышами (фиг. 33А). Наиболее интересно, что примерно 50% клеток лимфомы, собранных из перитонеальной полости мышей, обработанных химерным О№АС1 1дО1, представляли собой мертвые клетки через шесть суток после инъекции антитела. Параллельно увеличение числа других мононуклеарных лейкоцитов (в основном, макрофагов моноцитарного происхождения и нескольких клеток ΝΚ у мышей §СГО) наблюдали у 1дО1-обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами (фиг. 33В).
C. Обсуждение
В этом втором эксперименте авторы изобретения наблюдали, что внутрибрюшинная инъекция клеток лимфомы Беркитта мышам §СГО может индуцировать спленомегалию через 7 суток, что согласовано с предыдущим исследованием авторов изобретения на бестимусных мышах, тоже проявляющих ее через 19 суток. Интересно, что у 1дО1-обработанных мышей не выявлено такого увеличения селезенки.
Кроме того, сочетание (ί) снижения числа живых клеток лимфомы, собранных из перитонеальной полости, по сравнению с необработанными животными, (ίί) значительной доли мертвых злокачественных клеток и (ίίί) увеличения числа других мононуклеарных лейкоцитов в высокой степени показательно для антителозависимого прямого и/или клеточно-опосредованного цитотоксического эффекта на опухолевые клетки. Этот эффект, таким образом, отражает (ί) специфичность лиганда, то есть связывание с опухолевыми клетками, экспрессирующими эпитоп-мишень в белках М§КУ-ЕКУ, экспонированных на опухолевых клетках человека, о чем свидетельствует пример 8, и (ίί) дополнительные, опосредованные изотипом 1дО1, гуморальные иммунные эффекты, в которые вовлечено разрушение опухолевых клеток. Последний эффект может быть опосредован, например, активацией комплемента 1дО1-активными сайтами и, например, уничтожающей опухолевые клетки активностью макрофагов, индуцированной посредством взаимодействия РС рецептора с О№АС1 1дО1, связанным с опухолевым антигеном М8КУН\У.
Независимо от механизмов, вовлеченных в эффекты этого химерного антитела 1дО1, результаты авторов изобретения демонстрируют ингибирование пролиферации клеток лимфомы в доклинической животной модели с опухолевыми клетками человека, что, таким образом, свидетельствует о терапевтическом потенциале антитела, являющегося лигандом анти-ЕКУ, при лечении таких ЕКУ-положительных раков.
- 50 024655
Ссылки боЬпзоп Θ, Ми ТТ. КаЬа( Оа(аЬазе апб Нз аррНсабопз: Ти(иге бкесйопз. ΝυσΙβίο Аабз Рез 2001; 29: 205-6.
СЬо(Ь'1а С, СеИапб I, ΚίβίβΓ А. 3(гис(ига1 бе(егт'шап(з т (Ье зециепсез οί 1ттипод1оЬиНп уапаЫе дотаю, ϋ ΜοΙ Βίο11998; 278:457-79.
ВесЬ Р, РаТае1зеп Об, Кгатр Ρ, ΒοΙννΐρ ΤΘ (1978) ТЬе тэта гайпд зса!е: зса1е сопз(гис(!оп апб 1п(ег-оЬзеп/ег адгеетеШ. №игорЬагтасо1оду 17:430-431.
Ебдаг РР, 5сЬи/аг(г РО (1992) РипсИопаИу ге!еуап( датта-ат!поЬи(упс аабА гесер(огз: еяип/а1епсе ЬеЬл/ееп гесер(ог аГСпКу (Кб) апб ро(епсу (ЕС50)? ΜοΙ РЬагтасо! 41:1124-1129.
ΡίΓΟίιζί Р, А. Р, М|сЬе( Μ, Е. б-М, Наи\лг бб, Ма1сиз-уосапзоп С, Ьагапп! Р, СеЬЬигег 1_, Зе1дпеипп 6М, Тоигате б, ЗапЬабр К, МагсЬе Р, Реггоп Н (2003) ΜυΙΐίρΙβ Зс1егоз!з Аззоаа(еб Ре(гомгиз Рагйс1ез Саизе Т-1_утрЬосу1е ОерепбеШ Оеа(Ь ννίίή Вга1п НетоггЬаде, ίη Нитатгеб ЗСЮ Мюе Мобе1. боигпа! οί Меигоу'|го1оду 9:79-93.
Ноиепои б, Згоке А, Меагу Α, Ι_οζβ б-Υ, Ма(Ыеи М, ЬеЬоуег М, ЗсЬигЬоЯ Р (2007) РзусЬоте(пс ргорегйез οί 1Ье РгепсЬ уегзюп οί (Ье З1дпз апб зутр(отз οί рзусЬойс Шпезз (33ΡΙ) зса1е. ЕпсерЬа1е 33:744-750.
Ниапд \Л/М (1986) ТЬе 52-рго(е»п зиЬипИ οί Т4 ϋΝΑ (оро)зотегазе ΐβ Ьото1одоиз 1о 1Ье дугА-рго(е1П οί дугазе. ΝυοΙβΐο Ас1бз Рез 14:7379-7390.
бапке С, Магбп ϋ, О|гаиб-Рап1з Мб, ΟβοονΐΙΙβ М, 1_оскег ϋ (2003) ОгозорЬНа ϋ3Ρ1 апб га( ΗΜΘΒ1 Ьауе βρυίνβίβηΐ ϋΝΑ ЫпсБпд ргорегйез апб зЬаге а знпНаг зесопбагу ίοΙ6. б ВюсЬет 133:533-539.
Капе 6М (1996) Тгеа(теп(-гез18(ап( зсЫгорЬгепю райеп(з. б СНп РзусЫа(гу 57 Зирр1 9:35-40.
Ьатапбе ЗР, Ва(етап 6Р (1993) А (уре I соПадеп геробег депе сопз(гис1 Тог ΡΓοΐθΐη епдтееппд з(иб1ез. Рипсбопа! еяиь/а[епсе οί 1гапзТес1еб геробег СОИА1 апб епбодепоиз депе ргобис1з биппд Ьюзуп1Ьез15 апб ίη νίίΓο ех!гасе11и1аг та(пх ассити1а(юп. ВюсЬет б 293 ( Р(2):387-394.
МсОопа1б ννΐ, Сотрз(оп А, Ебап Θ, Сообкт О, Набипд НР, 1_иЫ1п РО, МсРабапб НР, Ра1у ОМ, Ро1тап СН, Ре1пдо1б ЗС, ЗапбЬегд-Мо11Ье1т М, 3|Ыеу М, ТЬотрзоп Α, νβη беп Νοοιί 3, МеюзЬепкег ΒΥ, МоНпзку 63 (2001)
Ресоттепбеб д1адпоз1ю сгИепа Тог ти!бр1е зс!егоз1з: ди!беНпез <гот (Ье 1п(егпа(1опа1 Рапе! оп (Ье б1адпоз!з οί ти1бр1е зс1егоз!з. Апп Ыеиго! 50:121-127.
М1пи1Ь Т, Кгатег В, 1_еЫе К, баепюке Р, КоЬпеб и (1998) ТЬе зрес(гозсорю апа1уз(з, юЫЬМоп апб Ыпбюд з(иб1ез бетопз(га(е (Ье еяиг/а1епсе οί Егу(Ьппа саЯга Ιιγρβίη ίηΜΝίοτ апб (Ье гесотЬтап! зиЬзШийоп уапап( гесЗегЕТ!. б Вю(есЬпо162:231-239.
МоШдотегу ЗА, АзЬегд М (1979) Α ηβνν бергеззюп зса!е без1дпеб (о Ье 3βη3ί(ίνβ(ο сЬапде. Вг б РзусЫа(гу 134:382-389.
Реггоп Η, ΡίΓουζί Р, Тике Р, Оагзоп 6А, МюЬе! М, Везете Ρ, Веб!п Р, МаНе( Р, Магсе! Е, Зе!дпеипп 6М, Мапбгапб В (1997а) СеН сиКигез апб аззос!а(еб ге(гоу|гизез ίη ти№р1е зс1егоз15. СоПаЬога(Н/е РезеагсЬ Огоир оп МЗ. Ас(а Ыеиго! Зсапб Зирр1169:22-31.
Реггоп Н, Оагзоп 6А, Ββ6ίη Р, Везете Р, РагапЬоз-Васса1а С, КотипапРгабе! Р, Ма11е( Р, Тике РМ, νοί33βΙ С, В1опб б!_, 1_а1апбе В, Зе1дпеипп 6М, Мапбгапб В (1997Ь) Мо!еси1аг 1беп(й1са(юп οί а ηονβΙ ге(гсмгиз гереа(еб!у 1зо1а(еб Яот ра(!еп(з \л/ИЬ ти1йр1е зс1егоз!з. ТЬе СоПаЬогабуе РезеагсЬ Огоир оп ΜυΚίρΙβ Зс!егоз13. Ргос ΝβίΙ Асаб 3ά 163А 94:7583-7588.
Реггоп Н, боиу1П-МагсЬе Е, МюЬе1 М, Оипатап-Рагаг А, Сате1о 3, Оитоп А, боНуе(-Реупаиб С, Магсе! Р, ЗоиН1е( Υ, Боге! Е, ОеЬиЬгег Ц Зап(ого ί, Магсе! 3, Зе1дпеипп 6М, МагсЬе ΡΝ, 1_аТоп М (2001) Ми№р1е зс1егоз18 ге(гоу|гиз рабю1ез апб гесотЫпап( ет/е!оре (пддег ап аЬпогта! 1ттипе гезропзе ίη νίίΓο, Ьу тбиапд ро1ус!опа1 \/Ье(а16 Т-!утрЬосу(е ас(Ь/а(юп. \Лго!оду 287:321-332.
РоНапб А, боиУ!П-МагсЬе Ε, νίΓβί С, Раиге М, Реггоп Н, МагсЬе ΡΝ (2006) ТЬе βηνβίορβ ρΓΟίβίη οί а Ьитап епбодепоиз ге1гсмгиз-М (атНу ас1Ь/а(ез гппа(е йптипИу (ЬгоидЬ С014ЛХР4 апб ргото(ез ТМ-Нке гезропзез. б 1ттипо1 176:7636-7644.
Загбапа \Л/, ΕΓηίηί ЕА, СоШЬ Ь, СгаЬат йб, ЫпеЬегдег &\Ν, 1_опд \Л/б, ЗсЫаЬасЬ Аб, МоЯдапд 6А, Сопбга 6Н (1992) РипсИопа! апа1уз!з οί Ηΐν-1 геуегзе (гапзспр(азе атто аабз ίηνοίνβό ίη гез13(апсе (о ти1Ър1е поппис!еозЁбе т^ЬНогз. б ΒίοΙ СЬет 267:17526-17530.
3(е1аз Е, РисЬе(оп М, ОгааТ1апб Н, Моугмег М, Зотреугас С, ВаЬгаои! ЕМ, Уеаз Р (1997) Нитап р!азта(ю ароПрорго(е!п Н Ыпб$ Ьитап 1ттипобеЛаепсу νίτυβ (уре 1 апб (уре 2 рго(е!пз. АЮЗ Рез Нит РеЯомгизез 13:97-104.
- 51 024655
31еТаз I, РисЬеЮп М, й’Апдеас Αϋ, МогеРВассагб С, Зе1дпеипп 6М, ΖβΓδΜ 6Р, Майю М, Сеги№ М, Воззу 6Р, М|ззе ϋ, ОгааЯапб Н, Уеаз Ρ (2001) Нера1Шз В νίηΐ3 Оапе раг1ю1ез Ьюб1о Ьитап р!азта βροΙίροριΌΐβΐη К. Нера1о1оду 33:207-217.
иНтапп ОМ, НаизмаМ Μ, бепзеп А, Кпарр Е\Л/ (2000) 31гис1ига1 аИдптеп! οί ίβΓΓβοΙοχίη апб ίΐβνοάοχίη Ьазеб оп е!ес1гоз1а1ю ро1епйа1з: «трНсайопз (ог ίΚβΐΓ 1п1егас1юпз мЙЬ рЬо1озуз1ет I апб ίβΓΓβ6οχΐη-ΝΑΟΡ гебисЛазе. Рго1ет$ 38:301309.
иНтапп ОМ, Наизма1б М, бепзеп А, Козйс ΝΜ, Кпарр Е\Л/ (1997) Сотрапзоп οί 1Ье рЬузю!од1са11у еяи|уа1еп1 рго^етз су1осЬготе сб апб р!аз1осуап1П оп 1Ье Ьаз1з οί 1Ьек е1ес1гоз1аИс ро1епйа1з. ТгурЮрЬап 63 ΐη су1осЬготе сб тау Ье ΐδοίυηοίΐοηβΙ мИЬ {угозюе 83 ΐη р!аз1осуап1п. ВюсЬет1з1гу 36:16187-16196.
УегбоНуа А, Риуо М, Саззат О, Разз1па О (1995) Торо1од1са1 тнтнсгу οί сгозз-геасйпд епапйотепс рерйбе апЙдепз. ΰ ΒίοΙ СЬет 270:30422-30427.
\Л/еЬгтапп А, Уап νΐΐβΐ А, Орзотег С, ВоНегтап б, 5сЬи1г А (1996) ТЬе 31тНапйез οί Ьаг апб ра1 депе ргобис1з таке 1Ьет едиаНу аррНсаЫе ίοΓ р1ап1 епдтеегз. №1 ВИесЬпо! 14:1274-1278.
Хи Οί, КарТег\Л/, МаИег б, ТгаиШегТА (1992) ВзиВкап 1зозреайс гезШсйоп апб тобИюа1юп зуз1ет οί Рз11: сЬагас1епга1юп οί (Ье ВзиВ1 депез апб епгутез. ΝυοΙβίο Ас'|бз Рез 20:6517-6523.
Уи К, ЗсЬигг Мб, Оегейс V (1995) Рипс(юпа1 βςιιΐνθίβηοβ οί ЕзсЬепсЬ1а сой 51'дта Е апб Рзеиботопаз аегидтоза А1д1б: Е. соП гроЕ гез1огез тисо>бу апб гебисез зепзМуЙу ίο геасйуе охудеп 1п1егтеб(а(ез ίη а1д11 ти!ап1з οί Р. аегидтоза. б Вас1епо1 177:3259-3268.
2аЫп НВ, Ноп/а1Ь МР, ТепмШдег ТС (1991) АрргоасЬез 1о ргеб1сйпд еЯес(з οί 31пд1е аткю ааб зиЬзШюпз оп 1Ье ίυηοίΐοη οί а рго1еШ. ВюсЬет13(гу 30:62306240.
Ап1опу 6М, Е11ез1аб КК, Наттопб Р, 1та1гит1 К, Ма11е1 Р, Маггеп КС, Ромег С (2007). ТЬе Ьитап епбодепоиз ге1гоу1гиз епуе1оре д1усорго1е(п, зупсуйп1, геди!а1ез пеигоН1аттайоп апб Из гесер1ог ехргеззюп ΐη ти№р1е зс1егоз1з: а го!е ίοΓ епбор1азт'ю гейсШит сЬарегопез ίη азйосу1ез. б 1ттипо1179:1210-24.
АШопу 6М, уап Мапе О, Ορΐί \Л/, Ви«егПе1б ϋΑ, МаНе! Р, Уопд УУУ, \Л/а11асе 61-, Оеасоп РМ, \Л/аггеп К, Ромег С (2004). Нитап епбодепоиз ге1гоу|гиз д1усорго1е1п-теб1а1еб тбис(юп οί гебох геас(ап1з саизез оНдобепбгосу(е беа1Ь апб бетуеКпайоп. Νθί Ыеигоза 7: 1088-95.
В1опб б1_. Везете Р, Оиге( ί, Βουίοη О, ВебШ Р, Реггоп Н, Мапбгапб В, Ма11е1 Р (1999). Мо1еси1аг сЬагас(епга1юп апб р1асеп1а1 ехргеззюп οί НЕРУ-М, а ηβνν Ьитап епбодепоиз ге(гоу|гиз 1атНу. б У1го173: 1175-85.
СЬеупе! V, Οποί О, Ма11е1 Р (2006). 1беп(№саМоп οί (Ье ЬА5СТ2-Ь'тбШд ботат οί (Ье Εην ЕРУ\Л/Е1/зупсу1т-1 (изодепю д1усорго!е»п. Ре(гоу|го1оду 3: 41.
СЬпз1епзеп Т, Οΐδδΐηρ Зогепзеп Ρ, Ρΐβιτιβηη Н, Напзеп Нб, Мо11ег-1агзеп А (1998). Ехргеззюп οί зедиепсе уапап(е οί епбодепоиз гейоукиз ΡΟΗ ΐη рагИс1е ίοπτι ίη ти№р1е зс1егоз!3. Еапсе( 352: 1033.
ОеЬ-Рткег Р, К1етрап ТА, О'РеШу Ρί, Тоггеу ЕР, ЗШдЬ ЗМ (1999). Мо!еси1аг сЬагас(епга(юп οί а МЗРУ-Пке зедиепсе ί6βη(ΐίΐβ6 Ьу РОА йот топогудойс Ъл/ΐη ра'|гз б'1зсогбап( Тог зсЬ|горЬгета. Оепотюз 61:133-44.
ΟοΙβί А, Зегга С, МатеН С, РидКаМ М, ЗесЬ| О, С»го11о МС, Розай О, Зо1дю 3 (2002). ΜϋΙίίρΙβ зс1егоз15-аззос1а(еб гейоукиз (МЗРУ) ΐη Загбоап МЗ раУеШз. Ыеиго1оду 58: 471-3.
ΡίΓουζΐ Р, РоНапб А, МюЬе! М, боиут-МагсЬе Е, Наим бб, Ма1сиз-Уосапзоп С, кагапп! Р, ОеЬиКгег ί, Зе!дпеипп 6М, Тоигате бк, ЗапЬаб)! К, МагсЬе ΡΝ, Реггоп Н (2003). Ми№р1е зс1его513-аззос1а(еб ге(гоу|гиз райю1ез саизе Т 1утрЬосу1е-берепбеп1 беа1Ь мИЬ Ьгат ЬетоггЬаде ΐη ЬитаШгеб ЗСГО тюе тобе!. б ΝβυΓονΐΓΟΙ 9: 79-93.
Поскега А, Ридд^ей А, Ргапк О, 5аи1ег М, Ма1бепег Е, Коррег В, \Л/и1Нсп В, ЗеИайЬ \Ν, МиПег-ЬапЬзсЬ Ν, ке|Ь-МозсЬ С, Меезе Е, Мауег б (2008). Ехргеззюп раКетз οί (гапзспЬеб Ьитап епбодепоиз гейоукиз НЕРУ-К(НМк-2) Ιοοί ΐη Ьитап йззиез апб (Ье пееб ίοΓ а НЕРУТгапзспр(оте Рго)ес1. ВМС Оепотюз 9: 354.
Оагзоп 6А, Тике РУ/, Окаиб Р, РагапЬоз-Васса1а О, Реггоп Н (1998). ϋβίβοίΐοη οί укюп-аззоааГеб МЗРУ-ΡΝΑ ΐη зегит οί райеШб мИЬ тиШр1е зс1егоз)з. капсе(351: 33.
Кайззоп Н, ВасЬтапп 3, ЗсЬгобег б, МсАгШиг б, Тоггеу ЕР, Уо1кеп РН (2001). Рейоука! ΡΝΑ ΐ6βηίίίΐβ6 ΐη 1Ье сегеЬгозр1па1 ίΙυί6δ апб ЬгаШз οί 1пб(У1биа1з мИЬ зсШгорЬгеШа. Ргос №11 Асаб Зср и 3 А 98:4634-9.
Кайззоп Н, ЗсЬгобег б, ВасЬтапп 3, ВоНтег С, Уо1кеп РН (2004). НЕРУУ/-ге1а(еб ΡΝΑ бе!ес1еб ΐη р1азта йот 1Пб1У1биа1з мкЬ гесеп1-опзе1 зсЫгорЬгета
- 52 024655 ог зсЫгоайесЙуе сЛзог0ег. Мо1 РзусЬ»а(гу 9:12-3.
Κίιτι Κδ (2001). Зедиепсе апб рЬу1одепу οί НЕК\/-\Л/ ро! йадтеп(з. ΑΙ03 Рез Нит Ре(гоу|гизез 17: 1665-71.
Кпегг I, Ниррейг В, \Л/в1де! С, 0о(зсЬ 3, ХЛ/юЬ С, ЗсЬНс! Р1_, Весктапп М\Л/, РазсЬег νν (2004). Епбодепоиз гейхмга! зупсуЙп: сотрНайоп οί ехрептеп(а1 гезеагсЬ оп зупсуЙп апс! Из розз)Ые го1е ίη погта! апс! сИз(игЬес! Ьитап р1асеп(одепез!з. Мо! Нит Рергос! 10: 581-8.
Котипап-Ргабе! Р, РагапЬоз-Васса!а О, ВесПп Р, Оипатап-Рагаг А, ЗоЬоуег М, Ой С, РарЬапзоп А, Оагаа Е, МаИе( Р, Мапбгапс! В, Реггоп Н (1999). Мо1еси1аг с!отпд апс! сЬагас(епга(юп οί МЗР\/-ге1а1ес! зециепсез аззоаа(ес! м(Ь гейоуииз-Нке райю1ез. \Лго1оду 260:1-9.
1_апдЬе1п М, 8(пск Р, 31пззе1 РЬ, \/од! Ν, РагзсЬ Н, Весктапп М\Л/, ЗсЬНс! Р1_ (2008). 1трайес! су(о(горЬоЫаз( се11-се11 ίυβίοη 1з аззос1а(ес! ννιΐίτ гейисес! ЗупсуЙп апс! юсгеазес! βρορίοείβ ίη райеЫз ννίίή р1асеп(а! с!узйтс(юп. Мо1 Рергос! ϋθν 75: 175-83.
ЬаиГег С, Мауег 3, МиеНег ВР, Мие11ег-1_ап(гзсЬ Ν, РиргесЫ К (2009). Апа1уз1з οί (гапзспЬес! Ьитап епСодепоиз гейомгиз νν ет/ Ιοοί с1апЛез {Ье опдю οί ти№р1е зс1егоз18-аззос1а(ес! ге(гсмгиз βην зециепсез. Ре(гсмго1оду 6: 37.
1_ауН1ейе ϋ, Мапп М, Ридд1еп А, Ма11е( Р, Соззе1 РЬ, КаЬа( ϋ (2002). ТЬе βηνβίορβ д!усорго1е1п οί Ьитап епСодепоиз гейомгиз (уре νν изез а сПуегдеЫ ТатНу οί агтпо аск! (гапзройегз/сеН зийасе гесер(огз. 3 \ΖιγοΙ 76: 6442-52.
Ι,ίηίβΙ ΜΙ_, МШег Αϋ (1990). Рейоуйа! ΡΝΑ раскад!пд: зедиепсе геди1гетеп(з апб 1трНса(юпз. Ιη: Рейоукизез- з(га(ед1ез οί герНса(юп. Змапзйот Р, Уод( РК, (ес!з). Зрппдег-Уег!ад: ВегНп, рр 125-152.
Ма!азз1пе А, Напс15сЬиЬ К, Тза(запз V, ОегЬаис! Р, СЬеупе( V, Οποί О, МаНе( Ρ, Ενθϊη-Βποη ϋ (2005). Ехргеззюп οί НЕРХЛЛЛ/ Εην д1усорго(е!п (зупсуйп) ίη (Ье ехйауМоиз йорЬоЫаз( οί йгз( (птез(ег Ьитап р!асеп(а. Р1асеп(а 26: 556-62.
МаНе( Р, Вои(оп О, РгийЬотте 3, СЬеупе( V, Οποί О, Воппаис! В, Ьисойе
O, Оиге( Ц Мапсйапс! В (2004). ТЬе епс!одепоиз гейомга! !осиз ЕР\ЛЛ/Е1 Ϊ3 а Ьопа Обе депе ίηνοίνβά ίη Μοηιίηοίά р1асеп(а1 рЬузю!оду. Ргос №(1 Асас! За ЫЗА 101: 1731-6.
МатеИ О, Аз(опе V, Агт О, Магсот 3, ίονβίο Ь, Зегга С, Зо(дю 3, Βοηβίίί В, ϋοίβί А (2007). Вгаюз апс! репрЬега! ЫооЗ топопис!еаг сеПз οί ΓηυΙίίρΙβ зс1егоз!з (МЗ) ра(1еп(з Ьурегехргезз М3-аззоаа(ес! гейоукиз/НЕРХЛЛЛ/ епс!одепоиз гейомгиз, Ьи( по( Нитап Ьегрезмгиз 6. 3 Оеп ΧΖ'ιγοΙ 88: 264-74.
ЫоогаК 3, Ро(аг 1С, 1_е\Мз С, Рез(апег ϋΡ, Расе ϋθ, δίβοη А, Вадазга О (2009). Ро!е οί ΗΕΡν-νν Зупсу(1п-1 ίη Р1асеп(а(юп апс! Мат(епапсе οί Нитап Ргедпапсу. Арр! 1ттипоЬ|з(осЬет Мо! МогрЬо!.
Реггоп Н, Вегпагс! С, Вегйапс! ΰΒ, Ьапд АВ, Рора I, ЗапЬаф| К, РойоикаНап 3 (2009). Епбодепоиз гейомга! депез, Негрезукизез апс! депбег ίη ΜυΙίίρΙβ Зс1егоз15. ϋ Ыеиго! 3οί.
Реггоп Η, ΡίΓουζί Р, Тике Р, Оагзоп ЗА, МюЬе! М, Везете Р, ВесПп Р, МаНе(
P, Магсе! Е, Зе1дпеипп ЗМ, Мапсйапс! В (1997а). СеП сиКигез апс! аззоаа(ес! гейоуйизез ίη ти!(1р1е зс1егоз13. Со11аЬога(Ь/е РезеагсЬ Огоир оп МЗ. Ас(а №иго! Зсапб Зирр! 169: 22-31.
Реггоп Н, Оагзоп ЗА, ВесПп Р, Везете Р, РагапЬоз-Васса!а О, КотипапРгас!е1 Р, Ма!1е( Р, Тике РМ, νοίβββΐ С, ΒΙοηά Л_, 1а1апс!е В, Зе1дпеипп ЗМ, Мапсйапс! В (1997Ь). Мо1еси1аг ίάβηύίίοβίίοη οί а ηονβΙ гейоуйиз гереа(ес!1у 1зо1а(ес! йот райеЫз м(Ь тиШрЕе зс1егоз1з. ТЬе СоНаЬогайуе РезеагсЬ Огоир оп Ми1(1р1е Зс1егоз13. Ргос №11 Асас! За иЗА 94: 7583-8.
Реггоп Н, Зоимп-МагсЬе Е, МюЬе! М, Оипатап-Рагаг А, Сате1о 3, Оитоп А, Зо1|уе(-Реупаис1 С, Магсе! Ρ, 8оиН1е( Υ, Воге! Е, СеЬиЬгег 1_, Зап(ого Ь, Магсе! 3, Зе1дпеипп ЗМ, МагсЬе ΡΝ, 1_а(оп М (2001). Ми№р1е зс!егоз13 гейоуйиз раг1ю1ез апс! гесотЫпаЫ βηνβίορβ (пддег ап аЬпогта! 1ттипе гезропзе ίη νίίΓο, Ьу 1пс!ис1пд ро1ус!опа! \/Ье(а16 Т-!утрЬосу(е ас(№(юп. \/1го1оду 287: 321-32.
Реггоп Н, 1_а1апс!е В, Ога(асар В, Ьаигеп( А, Оепои!аг О, Оепу С, МаПаге( М, ЗсЬиПег Е, 3(оеЬпег Р, Зе'|дпеипп ЗМ (1991). 1зо!а('юп οί гейомгиз йот раПеЫз и«(Ь ти1(1р1е зс1егоз1з.1_апсе( 337: 862-3.
Реггоп Η, 1_агапт Р, РиргесЫ К, РесЬоих-1_опд1п С, ЗеНЬеап Э, ЗагйоуПсЬ V, Сгеапде А, ВаПаН-Ройо( Ν, 31Ьа1 О, Зап(ого ί, 3οΙίνβί М, ОагНх Л, Р|есктапп Р, АгеЬегдег Т, Наи\л/ 33, Ьаззтапп Н (2005). Нитап епСодепоиз гейоукиз (НЕР\/)νν ΕΝν апб ОАО рго(е1пз: рЬузю1одюа1 ехргеззюп ίη Ьитап Ьга1п апс! ра(ЬорЬузю!одюа! тосМайоп ίη ти№р1е зс1егоз131езюпз. ϋ №игоуйо! 11: 23-33.
Реггоп Н, Мекаош 1_, Вегпагс! С, Уеаз Ρ, 3(е(аз I, ЬеЬоуег М (2008). Епс!одепоиз гейоукиз (уре ОАО апс! βηνβίορβ ρΓοίβίη апИдепегт'а ίη зегит οί зсЫгорЬгетс райеЫз. Βίο! РзусЫайу 64: 1019-23.
- 53 024655
Реггоп Н, Репп ϋΡ, Р1едег Ρ, ΑΙΙίθΙ РМ (2000). Рагйс1е-аззоаа1ей гейоуйа! ΡΝΑ апб 1апйет ΡΘΗ/ΗΕΡ\/-νν οορϊβδ оп Ьитап сЬготозоте 7ς: розз1Ые сотропепи οί а 'сЬа1П-геасйоп' 1пддегей Ьу ίηίβοΐίουδ адеп1з ίη ти1йр1е зс1егоз!3? ΰ Ыеигоу|го1 6 5ирр1 2: 567-75.
Разтиззеп НВ, Реггоп Н, С1аизеп 0 (1993). Ро епйодепоиз гейоукизез Ьауе еЙо1одюа1 1трПсаЙопз ιη 1ПЙатта1огу апй йедепегайуе пеп/оиз зуз1ет сИзеазез? Ас1а Иеиго! 5сапс1 88: 190-8.
РоНапй А, ϋουνίη-МагсЬе Е, ЗагезеНа М, Реггап1е Р, Сауагейа Р, Сгеапде А, МагсЬе Р, Реггоп Н (2005). Согге1айоп ЬеЫееп сЛзеазе зеуегйу апй ίη уйго су1ок1пе ргойисйоп тесЛа^ед Ьу ΜδΡν (ти№р!е зс1егоз13 аззоаа1ес1 гейоуйа! е1етеп1) βηνβίορβ ρΓΟίβίη ίη райеп1з ууЙЬ ти№р!е зс1егоз13. ϋ Ыеиго1ттипо1 160: 195-203.
РоНапй А, ΰουνίη-МагсЬе Ε, νίωΐ С, Раиге М, Реггоп Н, МагсЬе ΡΝ (2006). ТЬе βηνβίορβ рго1ет οί а Ьитап епйодепоиз гейоу|гиз-\Л/ ТатМу асйуа(ез тпа<е |'ттипЙу 1ЬгоидЬ С014ЛХР4 апс! ргото1ез ТМ-Нке гезропзез. ϋ 1ттипо1176: 7636-44.
ЗагезеНа М, РоНапй А, Магуеп1апо I, Сауаггейа Р, СарШо ϋ, МагсЬе Р, Реггоп Н, С1епа М (2009). Ми1Йр1е зс1егоз13-аззос1а(ей гейоу|'га1 адеп1 (МЗРУ)зйти1а1ей су1ок1пе ргойисйоп ίη райеп1з ννίίή ге!арз1пд-гетййпд ти1Йр1е зс1егоз13. МиЙ Зс1ег 15: 443-7.
8егга С, 5о1д|'и 5, МатеК О, РидКаШ М, Розай Θ, ϋοίβί А (2001). Ми1йр1е зс!егоз13 апс! ти1йр!е зс1егоз15-аззос1а1ей гейоукиз ίη ЗагеКта. Ыеиго! 3οί 22: 1713.
5о1д1и 5, Агт С, МатеК С, Зегга С, РидКаШ М, РозаЙ Θ, ϋοίβί А (2006). Ми1йр1е зс1его513-аззоаа1ей гейоуйиз ίη еаг1у ти1йр1е зс!егоз1з: а δίχ-уеаг ίοΙΙονν-ир о(а 5агсйп1ап соЬой. МиЙ Зс1ег 12; 698-703.
$о1дш 5, Зегга С, МатеК С, РидКаМ М, Розай С, Агт Θ, ϋοίβί А (2002). Ми1Йр1е зс1егоз(з-аззос1а1ей гейоуйиз апй МЗ ргодпоз^з: ап оЬзегуайопа! з1ийу. 1Чеиго1оду59: 1071-3.
νοίδδβί С, В1апсЬег А, Реггоп Н, Мапйгапй В, МаПе! Р, РагапЬоз-Васса1а Θ (1999). РЬу!одепу οί а ηονβΙ Тат'Ну οί Ьитап епйодепоиз гейоу'|гиз зедиепсез, ΗΕΡν-νν, ίη Ьитапз апй о1Ьег рпта1ез. АЮЗ Рез Нит Рейоуйизез 15: 1529-33.
νοίβδθί С, Вои1оп О, Ββάίη Р, Оиге( Ь, Мапйгапй В, МаНе1 Р, РагапЬозВасса1а О (2000). СЬготозота! <Лз1пЬиЙоп апй сойтд сарасйу οί 1Ье Ьитап епйодепоиз гейомгиз НЕКУАЛМатНу. АЮЗ Рез Нит Рейоуйизез 16:731-40.
ννβίδ 5, Непоз !С, Ои1ау ЙР, Уегта Ν, ЗаЬипауап 3, Уо1кеп РН (2007). СЬапдез ίη гедюп- апй сеН 1уре-зрес1Йс ехргеззюп райетз οί пеийа! аггнпо ас1Й йапзроЯег 1 (АЗСТ-1) ίη 1Ье ап1епог С1пди1а1е соПех апй Ь|рросатриз ίη δοΜίζορΙίΓβηίβ, Ыро1аг сйзогйег апй таргйергеззюп. ϋ Иеига! Тгапзт 114: 261-71.
Уо1кеп РН, Каг!ззоп Н, Уее Г, ЛоЬпз1оп-\М1зоп ΝΙ_, Тоггеу ЕР (2000). Епйодепоиз гейомгизез апй зсЬ12орЬгеп!а. Вга1п Рез Вгат Рез Реу 31: 193-9.
Вогпз1е1п, Р. А., 3. В. ЗсЬи/аггкорТ, е1а1. (1992). ТЫгй-уепйю1е еШагдетеШ апй пеигор$усЬо1одюа1 йейсй ίη $сЬ|горЬгеп1а, ΒίοΙ РзусМайу 31(9): 954-61.
Оюкегзоп, Р., С. 31а1Кпдз, е1 а1. (2007). ’’С-геасйуе рго1ет Ϊ3 аззоаа1ей ν/йЬ 1Ье зеуегйу οί содпйме трактет Ьи1 ηοί οί рзусЫайю зутрйэтз ίη ίηύίνίόιιβΙβ ууйЬ зсЬ|горЬгеп1а. ЗсМгорЬг Рез 93(1-3): 261-5.
Аа!Ьегзе апй ЗсЬиигтап 2002, 1дС4 Ьгеактд 1Ье ги!ез, 1ттипо1оду. 2002, 105:9-19.
- 54 024655
Перечень последовательностей
- 55 024655
РНе С1у Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз 100 105 <210> 8 <211> 116 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 8
С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1п Зег О1у А1а С1и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у А1а
Рго Уа1 ТЬг Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг 20 25
РЬе ТЬг Азр Туг 30
С1и Мес Нгз Тгр Уа1 Ьуэ С1п ТЬг Гго Уа1 Шз С1у 35 40
Ьеи С1и Тгр 11с 45
СЬу А1а Уа1 АЬа Рго СЬи ТЬг С1у С1у ТЬг А1а Туг Азп С1п Ьуз РЬе
Ьуз 61у Ьуз АЬа ТЬг Ьеи ТЬг АЬа А1а Ьуз Зег Зег 65 70 75
Зег ТЬг А1а Туг 80
Мес СЬи Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег СЬи Азр Зег АЬа Уа1 Туг Туг Суз
ТЬг Зег ТЬг УаЬ УаЬ Рго РЬе АЬа Туг Тгр С1у СЬп 100 105
СЬу ТЬг Ьеи Уа1 но
ТЬг Уа1 Зег АЬа 115 <210> 9 <211> 318 <212> ДНК <213> Миэ тизси1из <220>
<221> т13С_Геасиге <222> <9)..(9) <223> п представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221>
низе ГеаСиге <222> (12)..(12) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220 <2 21> гп1зс_£еасиге <222> (15) . . (15) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> гпЬзс £еаСиге <222> (21)7.(21) <223> п представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> гп1зс_£еаСиге <222> (24) . . (24) <223> η представляет собой а, д, ог С <220>
<221> тЬзс_£еаСиге <222> (27) . . (27) <223> η представляет собой а, с, ог С <220>
<221> тЬзс_£еаСиге <222> (36)..(36) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> шЬзс_£еаСиге <222> (39)..(39) <223> η представляет собой а, с, д, ог Ь <220>
<221> ш15С_£еаРиге <222> (42)..(42) <223> η представляет собой а, с, д, ог ΐ.
<220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (45). . (45) <223> η представляет собой а, ζ, д, ог 1:
<220>
<221> т1зс_£еаЬисе <222> (48) . . (48) <223> η представляет собой а, с, д, ог Ь <220>
<221> га1зс_£еаЬиге <222> (57)..(57) <223> η представляет собой а, с, д, ог Ь <220>
<221> тЬзс £еаЬиге <222> (60)7.(60) <223> η представляет собой а, с, д, ог Ь
- 56 024655 <221> га1зс_£еабиге <222> (66)..(66) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> гп1зс_£еабиге <222> (72)..(72) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гшзс_£еабиге <222> (75). . (75) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т15с_£еабиге <222> (78)..(78) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гп1зс_£еабиге <222> (81)..(81) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (84)..(84} <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (87)..(87} <223> п представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабоге <222> (90)..(90} <223> п представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т2.5с_£еабиге <222> (117)..(117) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (120}..(120) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (123}..(123) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> т±зс_£еабиге <222> (126)..(126) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гадзс__£еабиге <222> (129)..(129) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тбзс_£еабиге <222> (135)..(135) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т!зс_£еабиге <222> (147)..(147) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тдзс_£еабиге <222> (150)..(150) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тдзс_£еабиге <222> (153)..(153) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тдзс_£еабиге <222> (159)..(159) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <22О>
<221> тдзс_£еабиге <222> (162)..(162) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (165) . . (165) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тгзс_£еабиге <222> (16Θ)..(168) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> ттзс_£еабиге <222> (171)..(171) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тдзс_£еабиге <222> (174)..(174) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тгзс_Геабиге <222> (177)..(177) <223> η представляет собой а, с, д, ог б
<220 <221> <222> <223> низе ГеаРиге (180)..(180) η представляет собой а, с, д, ог Р
<220> <221> Пизе £еаРиге
<222> (186)..(186)
<223> η представляет собой а, с, д. ог Р
<220> <221> низе £еаРиге
<222> (189)..(189)
<223> η представляет собой а, с, д, ог Р
<220> <221> низе ГеаРиге
<222> (192) . . (192)
<223> η представляет собой а, с, д- ог Р
<220> <221> Пизе £еаРиге
<222> (195)..(195)
<223> η представляет собой а, с, д» ог Р
<220> <221> пиве £еаРиге
<222> (198) . . (198)
<223> η представляет собой а, С, <з> ог Р
<220> <221> пиве ЕеаРиге
<222> (201) .. (201)
<223> η представляет собой а, С, д- ог Р
<220> <221> инее £еаРиге
<222> (204) . . (204)
<223> η представляет собой а, С, <з> ог Р
<220> <221> Пизе £еариге
<222> (207)..(207)
<223> η представляет собой а, с, д. ог Р
<220> <221> гп13С £еариге
<222> (213) .. (213)
<223> η представляет собой а, с, 9/ ог Р
<220> <221> гп15с £еаРиге
<222> (216)..(216)
<223> η представляет собой а, С, д. ог Р
<220> <221> Пизе ГеаРиге
<222> (219)..(219)
<223> η представляет собой а, с, д. ог Р
<220> <221> Ш15с £еаРиге
<222> (225)..(225)
<223> η представляет собой а, с, д, ог Р
<220> <221> лиге £еаРиге
<222> (228)..(228)
<223> η представляет собой а, с, д» ог Р
<220> <221> ГП15С £еаРиге
<222> (237) . . (237)
<223> η представляет собой а, С, д» ог Р
<220> <221> гпБзс £еаРиге
<222> (246)..(246)
<223> η представляет собой а, С, д, ог Р
<220> <221> гпБзс £еаРиге
<222> (249)..(249)
<223> η представляет собой а, С; д. ог Р
<220> <2 21> ппзс ГеаРиге
<222> (252) . . (252)
<223> η представляет собой а, С, 9/ ог Р
<220> <221> гп1зс £еаРиге
<222> (276) . . (276)
<223> η представляет собой а, с, 9/ ог Р
<220> <221> ттзс £еаРиге
<222> (279) . . (279)
<223> л представляет собой а, С, 9/ ог Р
<220> <221> ггизс £еаРиге
<222> (282)..(282)
<223> η представляет собой а, с, 9г ог Р
<220> <221> ттзс £еаРиге
<222> (285) . . (285)
<223> η представляет собой а, С, 9- ог Р
<220> <221> ттзс £еаРиге
<222> (288).,(288)
<223> η представляет собой а, С, 9г ог Р
<220> <221> т1зс__£еариге
<222> (294)..(294) <223> η представляет собой а, с, д, ог к <220>
<221> т1зс_£еариге <222> (297)..(297) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> 1шзс_£еаРиге <222> (300)..(300) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> 1Ш5С_£еаРиге <222> (303)..(303) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (309).. (309) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р
<400> 9 сагаСЬдРпу 60 Рпаспсагмз псспдспаРЬ аРдизпдспы зпсспддпда гаагдРпасп
аРРмзпРдум 120 зпдспмзпиз гшзпдрпмзп РауаРдРаур ддраусагса гаагсспддп
мзгмзпсспа 180 агдспРддаР НРаушдпасп адзпаауурпд спизпддпдр псспддптдп
ррумзпддгш 240 зпддпмзпдд паспмзпРау игзпуРпаспа РкмзпмзпаР ддагдспдаг
даудспдсла спРауРауРд усагсагРау сагмзпурпс спуРпаспРР уддпмзпддп
300 аспаагуРпд агаРЬааг 318 <210> 10 <211> 348 <212> ДНК <213> Миг тизси1из <220>
<221> т15с_£еаРиге <222> (б)..(б) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> тгзс_£еаРиге <222> (12)..(12) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> ш15с_£еаРиге <222> (21)..(21) <223> η представляет собой а, с, д, ог р <220>
<2 21> тдзс_£еаРиге <222> (24)..(24) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> га15с_£еаРиге <222> (27)..(27) <223> п представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т1зс_£еаРиге <2 22> (33) .. (33) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <2 20>
<221> т15С_£еаРиге <2 22> (36) .. (36) <223> п представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> гг1дзс_£еариге <2 22> (39) .. (39) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <2 20>
<221> пи.зс_£еариге <222> (42) . . (42) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<2 21> гп1зс_£еаРиге <222> (45)..(45) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т£зс_£еаРиге <222> (48) .. (48) <223> л представляет собой аг с, д, ог Р <2 20>
<221> 1П15С_£еаРиге <222> (51) .. (51) <223> п представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> тдзс_£еаРиге <222> (54)..(54) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220 <2 21> т1зс_£еаРиге <222> (57).. (57) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р
- 59 024655 <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (60)..(60) <223> η представляет собой а, с, д, ог р <220>
<221> пи5С_£еаРиге <222> (63)..(63) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (72)..(72) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (75)..(75) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> Го1зс_£еариге <222> (78). . (78) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пчзс_£еаРиге <222> (84) . .(84) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пнзс_£еаРиге <222> (90)..(90) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пн5С_£еариге <222> (111)..(111) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> гтзс_£еаРиге <222> (120)..(120) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (123)..(123) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т15с_£еариге <222> (126)..(126) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пизс_£еаРиге <222> (132)..(132) <223> η представляет собой а, о, д, ог Р <220>
<221> ιηί зс_£еаРиге <222> (135)..(135) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т15С_£еаРиге <222> (147) . . (147) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т±зс_£еаРиге <222> (150)..(150) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <2 2 0>
<221> т15с_Геагиге <222> (153)..(153) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> га15С_£еаРиге <222> (156)..(156) <223> η представляет собой а, су д, ог Р <220>
<221> т15с_£еаГиге <222> (159)..(159) <223> η представляет собой а, с, дх ог р <220>
<221> тгзс_£еаРиге <222> (165)..(165) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т1зс_£еаРиге <222> (168)..(168) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т!зс_£еаРиге <222> (171)..(171) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т15С_£еаРиге <222> (174)..(174) <223> η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> пи зс_£еаРиге <22 2> (177)..(177) <223> п представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> ггизс_£еаРиге <222> (198)..(198) <223> η представляет собой а, с, д, ог ί <220>
<221> гтзс_£еабиге <222> (204) . . (204) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гшзс__£еабиге <222> (207) . . (207) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_Геабиге <222> (210) . . (210) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> пизс_£еабиге <222> (213)..(213) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гтзс_£еабиге <222> (216).. (216) <223> η представляет собой а, с, д, ог 1:
<220>
<221> 1шзс_£еабиге <222> (219)..(219) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> Ш1зс_£еабиге <222> (225)..(225) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> Ш1зс_£еабиге <222> (228)..(228) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гп1зс_£еабиге <222> (231)..(231) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (234)..(234) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тд-зс_£еабиге <222> (237)..(237) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гп1зс_£еабиге <222> (249)..(249) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тгзс_£еабиге <222> (252)..(252) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> Ш1зс_£еабиге <222> (255)..(255) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (258)..(258) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (261)..(261) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабиге <222> (264)..(264) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т1зс_£еабыге <222> (273)..(273) <223> п представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> тзс_£еабиге <222> (276)..(276) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т!зс_£еабиге <222> (279).. (279) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т15с_£еабиге <222> (291)..(291) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> гп1зс_£еабиге <222> (294)..(294) <223> η представляет собой а, с, д, ог б <220>
<221> т£зс_£еабиге <222> (297).,(297) <223> п представляет собой &, с, д, ог б <220 <221 > лй5с_£еа£иге <222> (300)..(300)
<223> η представляет собой а, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (303)..(303)
<223> η представляет собой &, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (306) . . (306)
<223> η представляет собой а, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (312?..(312)
<223> η представляет собой ά, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еасиге
<222> (321)..(321)
<223> η представляет собой а, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (327),,(327)
<223> п представляет собой &, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (330) .. (330)
<223> η представляет собой а, с, д, ог £
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (333).. (333)
<223> η представляет собой а, Сг д, ог £
<220
<221> тхзс Оеасиге
<222> (336)..(336)
<223> η представляет собой а. сг дг ог £
<220>
<221> тхзс £еа£иге
<222> (339)..(339)
<223> η представляет собой а, сг д. ог £
<220
<220 тхзс £еа£иге
<222> (342).,(342)
<223> η представляет собой а, с, д, ог ΐ
<220
<221> тхзс £еа£иге
<222> (345)..(345)
<223> л представляет собой а, с„ д, ог £
<220>
<221> тхзс_£еа£иге <222> (348)..(348) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <400> 10
сагдгпсагу 60 Епсагсагмз пддпдспдаг у£пд£птдпс спддпдспсс пд£паспу£п
мзпЕдуаагд 120 спузпддпЕа уасп££уасп дау£аудага £дсау£ддд£ паагсагасп
сспдЕпсауд 180 длу£лдаг£д даЕКддлдсп д£пдспсспд агаспддпдд паспдсп£ау
ааусагааг£ 240 Еуаагддпаа гдспаспуЕп аспдслдспа агмзпизпуз паспдспЕау
а£ддагу£пт 300 длмзлуЕпас пмзпдагдау узпдспдЕпЕ ауЕауЕдуас пмзпаспдЕп
д£пссп££уд сп£ау£дддд псагддпасп у£пд£паспд Епмзпдсп
348 <210> 11 <211> 318 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 11
сааа££д££с 60 £сасссад£с £ссадсаа£с а£д£с£дса£ сЕссадддда дааддЕсасс
а£а£сс£дса 120 д£дссадс£с аад£д£аад£ £аса£д£ас£ ддЕассадса даадссадда
£сс£ссссса 180 аадсс£дда£ ££а£сдсаса ЕссаассЕдд сЕЕсЬддадЕ сссЕддЕсдс
££сад£ддса 240 дЕдддЕсЕдд дасс£с££а£ ЕсЕсЕсасаа ЕсадсадсаЕ ддаддсЕдаа
да£дс£дсса 300 с££а££ас£д ссадсад£а£ сааадЕсЕсс сасЕсасдЕЕ сддсЕсдддд
асааад££дд ааа£аааа
318 <210> 12 <211> 348 <212> ДНК <213> Миз тизси1из
- 62 024655
£сс£дсаадд 120 с££сдддс£а сасаЕЕЕасЕ дас£а£дааа £дсас£ддд£ даадсадаса
сс£д£дса£д 180 дсс£ддаа£д да££ддадс£ д££дс£сс£д ааас£дд£дд £ас£дсс£ас
аа£садаад£ 240 £саадддсаа ддссасас£д ас£дсадсса аа£сс£ссад сасадсс£ас
а£ддадс£сс 300 дсадсс£дас а£с£даддас £с£дссд£с£ а££ас£д£ас ££с£асдд£д
д£ссс££££д с££ас£дддд ссаадддас£ с£дд£сас£д £с£с£дса
348 <210> 13 <211> 30 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>
<221> гтзс_£еа£иге <222> (3)..(3) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> гтзс_£еа£иге <222> (6)..(б) <223> η представляет собой а, с, д, ог С <220>
<221> гп1зс_£еа£иге <222> (9) . .(9) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> 1тзс_£еа£иге <222> (12}. . (12) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> лизс__£еа£иге <222> (15)..(15) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> ггчзс_£еа£иге <222> (18)..(18) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> ггчзс_£еа£иге <222> (21)..(21) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <400> 13 изпдспызпч зпмзпд£пмз п£ауа£д£ау 30 <210> 14 <211> 21 <212> ДНК <213> Миз гаизсиДиз <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (3)..(3) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> т15с_£еа£иге <222> (б)..(6) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (9)..(9) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> штзс_£еа£иге <222> (15)..(15) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> т1зс_£еа£иге <222> (18) . . (18) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> Ш1зс_£еа£иге <222> (21) . . (21) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <400> 14 гадпаспивпа ауу£пдся«5 η <210> 15 <211> 27 <212> ДНК <213> Миз тоизси1из <220>
<221> т!зс_£еа£иге <222> (15)..(15) <223> η представляет собой а, с, д, ог £ <220>
<221> сп!зс_£еа£иге <222> (18).. (18) <223> η представляет собой а, с, д, ог с <220?
<221? т13с_£еаРиге <222> (21)..(21) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? га1зс_£еаРиге <222? (24)..(24) <223? η представляет собой а, с, д, ог с <220?
<221? гтзс_£еаРиге <222? (27) , . (27) <223> η представляет собой а, с, д, ог р <400? 15 сагсагРаус агмзпуРпсс пурпасп <210? 16 <211? 15 <212? ДНК <213? Миз тизси1из <400? 16 дауРаудага Рдсау 15 <210? 17 <211? 51 <212? ДНК <213? Миз гаизси1из <220?
<221? гп1зс_£еариге <222? (3).. (3) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? гп13С_ГеаРиге <222? (6)..(6) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? пизс_£еаРиге <222? (9) . .(9) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? пизс_£еаРиге <222? (12). . (12) <223? п представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? пызс_£еаРиге <222? (18) , . (18) <223? η представляет собой а, с, д, ог р <220?
<221? тазс_£еаРиге <222? (21). . (21) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? пи.зс_£еаРиге <222? (24)..(24) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? ш1зс_£еаРиге <222? (27)..(27) <223? п представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? гшзс_£еаРиге <222? (30)..(30) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? ггчзс_£еаРиге <222> (51) . . (51) <223? η представляет собой а, с, д, ог р <400> 17 дспдрпдспс спдагаспдд пддпаспдсп Рауааусага агРЬуаагдд η 51 <210? 18 <211? 21 <212? ДНК <213? Миз гаизси1из <220?
<221? тсзс_£еаРиге <222? (3). . (3) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221? штЗС_£еаРиге <222? (6)..(6) <223? п представляет собой а, с, д, ог р <220?
<221? тсзс_£еаРиге <222? (9) . .(9) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220?
<221> трзс_£еаРиге <222? (12)..(12) <223? η представляет собой а, с, д, ог Р <220>
<221> т15с_£еаЬиге <222> (10)..(18) <223> η представляет собой а, с, д, ог С.
<400> 18 аспдЬпдЬпс спНудсп^а у <210> 19 <211> 540 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 19
МеГ А1а Ьеи Рго Туг НЬз ТЬг РЬе Ьеи РЬе ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Рго Рго 15 10 15
РЬе А1а Ьеи ТЬг А1а Рго Рго Рго Суз Суз Суз ТЬг ТЬг Зег Зег Зег 20 25 30
Рго Туг С1п С1и РЬе Ьеи Тгр Агд тЬг Агд Ьеи Рго СЬу Азп Не Азр 35 40 45
А1а Рго Зег Туг Агд Зег Ьеи Зег Ьуз СЬу Азп Зег ТЬг РЬе ТЬг А1а 50 55 60
НЬз ТЬг НЬз Мес Рго Агд Азп Суз Туг Азп Зег А1а ТЬг Ьеи Суз МеС 65 70 75 80
НЬз А1а Азп ТЬг НЬз Туг Тгр ТЬг СЬу Ьуз Мес 11е Азп Рго Зег Суз 85 90 95
Рго СЬу С1у Ьеи СЬу А1а ТЬг Уа1 Суз Тгр ТЬг Туг РЬе ТЬг НЬз ТЬг 100 105 110
Зег МеС Зег Азр СЬу С1у С1у Не СЬп С1у С1п А1а Агд С1и Ьуз СЬп 115 120 125
УаЬ Ьуз СЬи АЬа Не Зег СЬп Ьеи ТЬг Агд СЬу НЬз Зег ТЬг Рго Зег 130 135 140
Рго Туг Ьуз С1у Ьеи УаЬ Ьеи Зег Ьуз Ьеи НЬз СЬи ТЬг Ьеи Агд ТЬг 145 150 155 160
НЬз ТЬг Агд Ьеи Уа1 Зег Ьеи РЬе Азп ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Агд Ьеи НЬз
165 170 175
СЬи УаЬ Зег А1а СЬп Азп Рго ТЬг Азп Суз Тгр МеС Суэ Ьеи Рго Ьеи 100 185 190
НЬз РЬе Агд Рго Туг Не 5ег Не Рго УаЬ Рго СЬи СЬп Тгр Азп Азп 195 200 205
РЬе Зег ТЬг СЬи 11е Азп ТЬг ТЬг Зег УаЬ Ьеи УаЬ СЬу Рго Ьеи УаЬ 210 215 220
5ег Азп Ьеи СЬи Не ТЬг НЬз ТЬг Зег Азп Ьеи ТЬг Суз УаЬ Ьуз РЬе 225 230 235 240
Зег Азп ТЬг Не Азр ТЬг ТЬг Зег Зег СЬп Суз Не Агд Тгр \7а1 ТЬг 245 250 255
Рго Рго ТЬг Агд Не УаЬ Суз Ьеи Рго Зег С1у Не РЬе РЬе УаЬ Суз 260 265 270
СЬу ТЬг Зег АЬа Туг НЬз СуЗ Ьеи Азп СЬу Зег Зег СЬи Зег МеС Суз 275 280 285
РЬе Ьеи Зег РЬе Ьеи УаЬ Рго Рго МеС ТЬг Пе Туг ТЬг СЬи СЬп Азр 290 295 300
Ьеи Туг Азп НЬз УаЬ УаЬ Рго Ьуз Рго НЬз Азп Ьуз Агд УаЬ Рго Пе 305 ЗЬО 315 320
Ьеи Рго РЬе УаЬ Не Агд АЬа СЬу УаЬ Ьеи СЬу Агд Ьеи СЬу ТЬг СЬу 325 330 335
Не СЬу Зег 11е ТНг ТЬг Зег ТЬг СЬп РЬе Туг Туг Ьуз Ьеи Зег СЬп 340 345 350
СЬи Пе Азп СЬу Агр Меи СЬи СЬп УаЬ ТЬг Азр Зег Ьеи УаЬ ТЬг Ьеи 355 360 365
СЬп Азр СЬп Ьеи Азп Зег Ьеи А1а АЬа УаЬ УаЬ Ьеи СЬп Азп Агд Агд 370 375 ЗВО
АЬа Ьеи Азр Ьеи Ьеи ТЬг АЬа Ьуз Агд СЬу СЬу ТЬг Суз Ьеи РЬе Ьеи 385 390 395 400
- 65 024655
С1у С1и С1и Агд Суз Туг Туг У$1 Азп СЬп 5ег Агд Не УаЬ ТЬг СЬи 405 410 415
Ьуз Уа1 Ьуз СЬи 11е Агд Азр Агд 11е С1п Суз Агд АЬа СЬи С1и Ьеи 420 425 430
СЬп Азп ТЬг СЬи Агд Тгр СЬу Ьеи Ьеи Зег СЬп Тгр Меи Рго Ггр ТЬг 435 440 445
Ьеи Рго РЬе Ьеи СЬу Рго Ьеи АЬа АЬа 11е 11е РЬе Ьеи Ьеи Ьеи РЬе 450 455 460
СЬу Рго Суз 1Ье РЬе Азп РЬе Ьеи УаЬ Ьуз РЬе УаЬ 5ег Зег Агд ЬЬе 465 470 475 480
СЬи АЬа УаЬ Ьуз Ьеи СЬп Ые УаЬ Ьеи СЬп МеЬ СЬи Рго СЬп МеС СЬп 455 490 495
Зег МеС ТЬг Ьуз Ые Туг Агд СЬу Рго Ьеи Аэр Агд Рго АЬа Агд Ьеи 500 505 510
Суз Зег Азр Уа1 Азп Азр Ые С1и Уа1 ТЬг Рго Рго СЬи СЬи Ые Зег 515 520 525
ТЬг АЬа СЬп Рго Ьеи Ьеи КЬз Зег Азп Зег УаЬ СЬу Зег Зег Ηΐ5 Ηΐδ 530 535 540
Ηΐ5 Ηΐ5 Ηΐ5 ΗΣ5 545 <210> 20 <2ЬЬ> 25 <212> ΠΡΤ <213> Ното зартепз <400> 20
Рго Рго МеС ТЬг 11е Туг ТЬг СЬи СЬп Азр Ьеи Туг Азл НЬз УаЬ УаЬ
Рго Ьуз Рго НЬз Азп Ьуз Агд УаЬ Рго <210 21 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Праймер для КАСЕ РСК (ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК) <400 21 сддддсддда дСсдасСССС СССССССССС ССС <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер для КАСЕ РСК (ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК) <400> 22 дссСсадСсд ЪдЪдсиЪсоЪ д <210> 23 <211> 1Θ <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер для КАСЕ РСК (ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК) <400> 23 ссассбдрус аСсстуСд <210> 24 <211> 29 <212> ПРТ <213> Ното зарЪепз <400> 24
Меб АЬа Ъеи Рго Туг НЬз ТЬг РЬе Ьеи РЬе ТЬг Уа1 Ъеи Ъеи Рго Рго
РЬе АЬа Ъеи ТЬг АЬа Рго Рго Рго Суз Суз Суз ТЬг ТЬг <210> 25 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СЪ_А1а130_обратный - Праймер для амплификации саадаадсас асдасрдадд <210> 26 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СН1_Рго119_обратный Праймер для амплификации УН с К=А/С; К«6/Т; Н=А/Т/С <400> 26 сддддсддда дрсдассагк ддаРагасЬд аРдд <210> 27 <211> 373 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 27
ддРасссРдд 60 аРаРссддад ссРасддсса даРсдРдсРд асссадРссс сРдссаРсаР
дРссдссадс ссРддсдада аддРдассаР сРссРдсРсс дссРссРссР ссдРдРссРа
120
сардрасрдд РаРсадсада адссРддсРс сРссссРаад дссРддаРсР ассддассРс
180
саассРддсс РссддсдРдс сРддссддРР сРссддсРсс ддсадсддса ссРссРасРс
240
ссРдассаРс адсРссаРдд аддссдадда сдссдссасс РасРасРдсс адсадРасса
300
дРсссРдссР сРдассРРсд дсРсРддсас саадсРддад аРсаадсдРа сддрддсддс
360
дссаРссдад сРс
<210> 28 <211> 6165 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 1дС1Ь+УЬ оптимизированная последовательность <400> 28
РсааРаРРдд ссаРРадсса РаРРаРРсаР рддррарара дсаРаааРса араррддсра ррддссаррд саРасдррдр аРсРаРаРса РааРаРдРас аРРРаРаРРд дсРсаРдрсс 120 ааРаРдассд ссардррддс аррдаррарр дасРадРРаР РааРадРааР сааРРасддд 180 дДсаРРадрР саРадсссаР арарддадрр ссдсдРРаса РаасРРасдд РаааРддссс 240 дссРддсРда ссдсссаасд асссссдссс аРРдасдРса аРааРдасдР ардррсссар 300 адРаасдсса аРадддасРР РссаРРдасд РсааРдддРд дадЬаРРРас ддРааасРдс 360 ссасРРддса драсаРсаад рдраРсаъаР дссаадРссд сссссРаРРд асдРсаарда 420 сддрааардд сссдссРддс аРРаРдссса драсаРдасс РРасдддасР РРссРасРРд 480 дсадРасаРс РасдРаРРад РсаРсдсрар рассаРддРд аРдсддРРРР ддсадРасас 540 сааРдддсдР ддаРадсддР РРдасРсасд дддаРРРсса адРсРссасс ссаРРдасдР 600 сааРдддадР РРдРРРРддс ассааааРса асдддасРРС ссааааРдРс дРаасаасРд 660 сдаРсдсссд ссссдРРдас дсаааРдддс ддраддсдрд расддрддда ддРсРаРаРа 720 адсададсрс дРРРадРдаа ссдРсадаРс асРадаадсР РРаРРдсддР адРРРаРсас 780 адрраааррд сРаасдсадР садРдсРРсР дасасаасад РсРсдаасРР аадсрдсадр дасРсРсРРа аддрадссрр дсадаадРРд дрсдРдаддс асРдддсадд РаадРаРсаа 900 ддРРасаада саддРРРаад дадассааРа дааасРдддс РРдРсдадас ададаадасР 960 сРРдсдРРРс РдаРаддсас сРаРРддРсР РасРдасаРс сасРРРдссР ррсРсРссас 1020 аддРдРссас РсссадРРса аРРасадсРс РРааддсРад адРасРРааР асдасРсасР 1080 аРаддсРадс сРсдадааРР сассаРддсс срдсадассс аддРдРСсаР садссРдсРд 1140 сРдРддаРаР ссддадссРа сддссадаРс дРдсРдассс адРссссРдс саРсаРдРсс 1200 дссадсссРд дсдадааддр дассаРсРсс РдсРссдссР ссрссрссдр дРССРасаРд 1260
- 67 024655
басбддбабс 1320 адсадаадсс бддсбссбсс
сбддссбссд 1380 дсдбдссбдд ссддббсбсс
ассабсадсб 1440 ссабддаддс сдаддасдсс
сбдссбсбда 1500 ссббсддсбс бддсассаад
адсдбдббса 1560 бсббсссссс садсдасдад
бдссбдсбда 1620 асаасббсба сссссдддад
сбдсададсд 1680 дсаасадсса ддададсдбс
адссбдадса 1740 дсасссбдас ссбдадсаад
бдсдаддбда 1800 сссассаддд ссбдбссадс
бдсбдасбсд 1860 адбсбадасс дсддссдсбб
асабдабаад 1920 абасаббдаб дадбббддас
дсбббабббд 1980 бдааабббдб дабдсбаббд
аасаадббаа 2040 саасаасааб бдсаббсабб
аддбббббба 2100 аадсаадбаа аассбсбаса
дддсбддсдб 2160 аабадсдаад аддсссдсас
даабддсдаа 2220 бддасдсдсс сбдбадсддс
сдсадсдбда 2280 ссдсбасасб бдссадсдсс
бссбббсбсд 2340 ссасдббсдс сддсбббссс
дддббссдаб 2400 ббададсббб асддсассбс
бсасдбадбд 2460 ддссабсдсс сбдабадасд
ббсбббааба 2520 дбддасбсбб дббссааасб
бсббббдабб 2580 бабаадддаб бббдссдабб
баасааабаб 2640 ббаасдсдаа ббббаасааа
дбаббббсбс 2700 сббасдсабс бдбдсддбаб
ссабддссбд 2760 ааабаассбс бдааададда
аассадсбдб 2820 ддаабдбдбд бсадббаддд
адаадбабдс 2880 ааадсабдса бсбсааббад
бссссадсад 2940 дсадаадбаб дсааадсабд
ссссбаасбс 3000 сдсссабссс дссссбаасб
ддсбдасбаа 3060 ббббббббаб ббабдсадад
садаадбадб 3120 даддаддсбб ббббддаддс
дасасаасад 3180 бсбсдаасбб ааддсбадад
саддббсбсс 3240 ддссдсббдд дбддададдс
бсддсбдсбс 3300 бдабдссдсс дбдббссддс
бсаадассда 3360 ссбдбссддб дсссбдаабд
ддсбддссас 3420 дасдддсдбб ссббдсдсад
дддасбддсб 3480 дсбаббдддс даадбдссдд
сбдссдадаа 3540 адбабссабс абддсбдабд
сбассбдссс 3600 аббсдассас саадсдааас
ссбааддссб ддабсбассд дассбссаас
ддсбссддса дсддсассбс сбасбсссбд
дссассбасб асбдссадса дбассадбсс
сбддадабса адсдбасддб ддсддсдсса
садсбдаада дсддсассдс садсдбддбд
дссааддбдс адбддааддб ддасаасдсс
ассдадсадд асадсаадда сбссассбас
дссдасбасд адаадсасаа ддбдбасдсс
сссдбдасса ададсббсаа саддддсдад
сссбббадбд адддббаабд сббсдадсад
ааассасаас бадаабдсад бдаааааааб
сбббабббдб аассаббаба адсбдсааба
ббабдбббса ддббсадддд дадабдбддд
аабдбддбаа аабссдабаа ддабсдабсс
сдабсдсссб бсссаасадб бдсдсадссб
дсаббаадсд сддсдддбдб ддбддббасд
сбадсдсссд сбссбббсдс бббсббсссб
сдбсаадсбс бааабсдддд дсбсссббба
дассдсаааа аасббдаббб дддбдабддб
дбббббсдсс сбббдасдбб ддадбссасд
ддаасаасас бсаасссбаб сбсддбсбаб
бсддссбабб ддббаааааа бдадсбдабб
абаббаасдб ббасаабббс дссбдабдсд
ббсасассдс абасдсддаб сбдсдсадса
асббддббад дбассббсбд аддсддааад
бдбддааадб ссссаддсбс сссадсаддс
бсадсаасса ддбдбддааа дбссссаддс
сабсбсаабб адбсадсаас сабадбсссд
ссдсссадбб ссдсссаббс бссдссссаб
дссдаддссд ссбсддссбс бдадсбаббс
сбаддсбббб дсааааадсб бдаббсббсб
ссассабдаб бдаасаадаб ддаббдсасд
баббсддсба бдасбдддса саасадасаа
бдбсадсдса ддддсдсссд дббсбббббд
аасбдсадда сдаддсадсд сддсбабсдб
сбдбдсбсда сдббдбсасб даадсдддаа
ддсаддабсб ссбдбсабсб сассббдсбс
саабдсддсд дсбдсабасд сббдабссдд
абсдсабсда дсдадсасдб асбсддабдд
- 68 024655
аадссддкс! 3660 Рдссда1сад даЬдаксбдд асдаададса Ъсаддддсбс дсдссадссд
аасбдСЛсдс 3720 саддсбсаад дсдсдсасдс ссдасддсда ддаъсбсдРс дСдасссаСд
дсдаРдссбд 3780 сИздссдааР аСсабддбдд ааааСддссд ссьЪРсбдда ССсаСсдасС
дрддссддсЪ 3840 дддбдбддсд дассдсбакс аддасагадс дсиддссасс сдСдаСаССд
скдаададсР 3900 Ьддсддсдаа Рдддс£дасс дсСЪссксдд дсЬС.ЬасддЬ аСсдссдсСс
ссдаЬЪсдса 3960 дсдсарсдсс ЪЪсЬаЪсдсс ЪСскЪдасда дсксббсрда дсдддасСсС
ддддЬСсдаа 4020 аРдассдасс аадсдасдсс саасскдсса РсасдаРддс сдсааСаааа
ъас.с£ХЪа56 4080 ЪЪсаЪРасаЪ сС.дС.дрдР6д дЪРРЪкРдЪд РдаабсдаСа дсдаСаадда
ЬссдсдСабд 4140 дкдсасРскс адРасаабск дсРсЪдакдс сдсаРадМьа адссадсссс
дасасссдсс 4200 аасасссдсС дасдсдссск дасдддсббд дсбдсСсссд дсаСссдсСС
асадасаадс 4260 бдбдассдЬс Ъссдддадсб дсаСдгдкса даддРС-ЬЬса ссдСсаСсас
сдааасдсдс 4320 дадасдааад ддссксдкда ЪасдсссаИ; ГбРакаддЫ ааСдссасда
каасаакддс. 4380 СЛсРСадасд Рсаддкддса сбкЛбсдддд аааРдСдсдс ддаассссСа
ъ-еедррсаср 4440 0ЪС.с6аааЕа саЪСсааака СдЬаСссдсб саСдадасаа СаасссСдаС
аааОдсЪЪса 4500 аРаабаРЬда ааааддаада дРаЬдадСар СсаасаСССс сдСдСсдссс
РбаСбсссбЪ 4 5 60 гбРРдсддса Ьсссдсс-Сбс сЁдЪЪРЪддс Ссасссадаа асдсСддСда
аадРаааада 4620 РдсСдаадаС. садЪЪдддгд сасдадбддд ССасаСсдаа сСддаСсСса
асадсддЪаа 4680 даЪссЪЪдад адбсльсдсс ссдаадаасд ССССссааСд аСдадсасСС
ъЪааадкбсР 4740 дскаЬдбддс дсддРаРбаг сссдСакЬда сдссдддсаа дадсаасСсд
дбсдссдса! 4800 асаскаССск садааРдасс сддЬРдадЬа сСсассадСс асадаааадс
аСскбасдда 4860 Рддсабдаса дСаададааС РаРдсад^дс СдссаСаасс аСдадСдаСа
асасддсддс 4920 саасСбасЫ: сбдасаасда Рсддаддасс дааддадсСа ассдсССССС
ЬдсасаасаЪ 4980 дддддаЪсаб дЪаасбсдсс кбдаЪсдРС.д ддаассддад сСдааСдаад
ссаЪассааа 5040 сдасдадсдк дасассасда рдссСдбадс аасддсааса асдССдсдса
аасЪаббаас 5100 6ддсдаасЪ.а сСЪасксЬад сбРсссддса асааССааСа дасСддаСдд
аддсддаъаа 5160 адЫдсадда ссасШсбдс дсЪсддсссТ СссддсСддс сддсссассд
сЪдаРаааЪс 5220 РддадссддР дадсдрдддк сбсдсддЬа! саСРдсадса сСддддссад
абддРаадсс 5280 сРсссдсакс дЪадРРаС.сЪ асасдасддд дадСсаддса асСаСддаСд
аасдаааЬад 5340 асадаксдсъ дада'Е.аддгд ссЪсасСдаЪ саадсаССдд СаасСдСсад
ассаадЪЪЬа 5400 сьсабакака скСЪададдд аррдаааасд СсаЪССССаа СССаааадда
РсСаддЬдаа 5460 даСссбъъъъ даРаабсЪса Ъдассаааак сссЬСаасдС дадССССсдс
кссасбдадс 5520 дксадасссс дкадаааада Ъсаааддакс ССсССдадаС ссССЪССССс
£дсдсд£аа£ 5580 сгдсЬдсЫд сааасааааа аассассдсъ ассадсддСд дсссдсссдс
сддаЪсаада 5640 дсСассааск сРРЪРРссда аддкааскдд сССсадсада дсдсадасас
саааС.асбдР 5700 ссЪРскадбд Ъадссдрадк Саддссасса сССсаадаас СсСдСадсас
сдсскасаЪа 57 60 ссксдсрсбд скааРссРдк ЪассадЪддс сдсСдссадС ддсдасаадс
сдбдЪсЪЬас 5820 сдддбЪддас Ссаадасдаб адбрассдда Сааддсдсад сддСсдддсС
даасдддддд 5880 РРсдЪдсаса садсссадск Сддадсдаас дасссасасс даасСдадаС
ассбасадсд РдадсРабда дааадсдсса сдссссссда адддадааад дсддасаддС
5940
- 69 024655 акссддСаад
6000 ссЪддЕаЕсЪ
6060 дардсксд^с
6120
Гсскддссчс.
6165 сддсадддкс бСаРадбссС аддддддсдд
ЬРдссддссс ддаасаддад д£сддд££Сс адсссакдда
СЛЕдсЬсаса адсдсасдэд дссассксгд аааасдссад
ГддсЬсдаса ддадсгъсса ас£Хдадсд£ саасдсддсс даксЬ дддддааасд сдасиьъсдб
СЕЁСГасддЬ <210> 29 <211> 400 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 29
ддСассадсс 60 ассддСдСсс асадссаддС дсадсСдсад садСсСддсд ссдадссддС
ссддссСддс 120 дсссссдСда сссСдСссСд сааддссСсс ддсСасассС СсассдасСа
сдадаСдсас 100 СдддСдаадс адассссСдС дсасддссСд дадСддаСсд дсдссдсддс
сссСдадасс 240 ддсддсассд сссасаасса даэдССсаад ддсааддсса сссСдассдс
сдссаадСсс 300 СссСсСассд ссСасасдда дссдсддссс сСдассСссд аддасСссдс
сдСдСассас 360 СдсассСсса ссдСддСдсс ссссдссСас Сддддссадд дсасссСддС
дассдСдСсс дссдсСадса ссаадддссс аСссдадсСс
400 <210> 30 <211> 6682 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 1д31Н+УН оптимизированная последовательность <400> 30
сССдэадасд 60 ааадддссСс дсдасасдсс СаСССССаСа ддССааСдСс аСдаСааСаа
СддСЬСсССа дасдСсаддС ддсасССССс ддддаааСдС дсдсддаасс ссСаСССдСС
баЬЪЁЕЕсиа ааиасаЧЧса ааЪабдЬаьс сдсСса^дад асаа^аассс сдагааасдс
180
С£саа£ааСа
240 ссСЬЕССРдс
300 аадаСдсЪда
360 дбаадабссб
420
ЬЛсЪдсбаЕд
480 дсаСасасЧа
540 сддасддсас
600 сддссаасЪИ
660 аса£.ддддда
720 сааасдасда
700
ЬаасЧддсда
840 аРааадРСдс
900 ааРсЪддадс
960 адсссЬсссд
1020 аСадасадаС
1080 ίίίθΟίΟβΊβ
1140
СдаадаГссГ
1200 дадсдЧсада
1260
РааСспдспд
1320
СЕдааааадд ддсаЧРСГдс адаЪсадССд
ЕдададЕЕЕЬ
СддсдсддСа
ЁСсЬсадааЧ дасадСаада асЧГсрдаса
РсасдРаасТ дсдСдасасс асЬасЬЬасЬ аддассасСС сддСдадсдР
Саксдсадпь сдсбдадаСа
РаЕасЪРЬад
ССССдаСааС ссссдрадаа сЧСдсаааса аададЕаСда с1ПссЧдСС1:
ддСдсасдад сдссссдаад
ЪЪаЕсссдид дасЧЧддЧЧд дааЧСаЬдса асдаЪсддад сдссГСдатс асдабдссСд сСадсЬЬссс сТдсдсбсдд дддЮСсдсд аСсСасасда ддЧдссСсас аЕЧдаЬССаа сЬсаРдасса аадаСсааад аааааассас дЕаЫсааса
ЧЧдсЧсассс
ЪдддССасаЪ аасдМьЫсс ьсдасдссдд адСасСсасс дрдсЬдссаи дассдаадда дЫдддаасс садсааЧддс ддсаасааЧЪ сссесссддс дсаЧсапЧдс сддддадЧса рда£С.аадса аасЕЕсаЬГЕ аааРсссЧСа даЧсЬПсПд сдссассадс
СССссдСдЧс адааасдсСд сдаасЧддаС ааЬдаС.дадс дсаададсаа адЪсасадаа аассаЧдадС дсЬаассдсС ддадскдааЬ аасаасдГЪд аагадасгдд
ЕддсСддЕС!
адсасЪдддд ддсаасРаЪд
ЧСдд1:аасСд
СЕааГСЕааа асдЧдадРЫ адакссЬССС ддЪддЬгидЕ дсссСЧаССс дкдааадраа сСсаасадсд асЬЬНЬааад сЧсддЁсдсс аадсаЧсЕЕа дакаасасСд
ЬСЫЕдсаса даадссаРас сдсааас£аС агддаддсдд а^СдспдаСа ссада£ддеа дардаасдаа
Ссадассаад аддаЬсСадд
ЕсдЫссасС
ЧРРсЪдсдсд
ССдссддаСс
- 70 024655 аададсРасс
1380 срдрссррср
1440 саРассРсдс
1500
РСассдддРР
1560 ддддррсдрд
1620 адсдРдадсР
1680
Раадсддсад
1740 аРсРРРаРад
1800 сдРсаддддд
1860 ссррррдсрд
1920 ассдРаРРас
1980 дсдадРсадР
2040 рдрдсддрар
2100 адРРаадсса
2160 сссдссааса
2220 асаадсРдРд
2280 асдсдсдадд
2340 адсаддсада
2400 сссаддсРсс
2460 адРсссдссс
2520 дссссаРддс
2580 дсРаРРссад
2640 ддРРсдасса
2700 адассРассс
2760 сРсРРсадРд
2820
РссРдадаад
2880 адаассасса
2940 рдаасаассд
3000
РРассаддаа
3060 ддааРРРдаа
3120 адааРассса
3180 адРсРасдад
3240 ааРрддасаа
3300
РаРааРдРдР
3360 сРдаРдааРд
3420 ааардссаРс
3480 адаададааа
3540 ардсрдрдрр
3600 сРдсасРдсР
3660 аасРсРРРРР адРдРадссд
РсРдсРааРс ддасРсаада сасасадссс аРдадааадс ддРсддааса
РссРдРсддд дсддадссРа дссРРРРдсР сдссРРРдад дадсдаддаа
РРсасассдс дРаРасасРс сссдсРдасд ассдРсРссд садсрдрдда адРаРдсааа ссадсаддса сРаасРссдс рдасрааррр аадРадРдад
РРдаасРдса
РддссРссдс дааддрааас ааРсдассРР сдаддадсРс дааррддсаа дссаРдааРс адРдасасдР ддсдРссРсР аадааадасР асРассРаса
РааасРасРд ддадсадрдд
РадРдаРдаР ддРадаадас
РадРааРада аРасаадааа ссдааддРаа
РадРРаддсс сРдРРассад сдаРадРРас адсРРддадс дссасдсРРс ддададсдса
РРРсдссасс
Рддааааасд сасаРдРРсР
РдадсРдаРа дсддаададс аРаРддРдса сдсРаРсдсР сдсссРдасд ддадсРдсаР аРдРдРдСса дсаРдсаРсР даадРаРдса ссаРсссдсс рррррагрра даддсРРРРР
РсдРсдссдР
Рсаддаасда адаагсрддр раааддасад аРРРРсррдс драаадРада аассаддсса
РРРРсссада сРдаддРсса аасрадрррд дадаРРРааа аРРсРааРРд
РддааРдссР даддсРасРд сссааддасР асРсРРдсРР аРРаРддааа сРддсРРсад ассасРРсаа
РддсРдсРдс сддаРааддс даасдассРа ссдаадддад сдадддадсР
РсРдасРРда ссадсаасдс ррссрдсдрр ссдсРсдссд дссРдаРдсд сРсРсадРас асдрдасрдд ддсРРдРсрд дрдрсададд дррадддрдр сааРРадРса аадсаРдсаР ссРаасРссд
Рдсададдсс
РддаддссРа дРсссааааР дРРсаадРас даРРаРдддР ааРРааРаРа саааадРРРд саРддРРРдд ссРРадасРс ааРРдаРРРд ддаддааааа
Рдааддаасс дсРсРааддР
РРРдРдРаРР рраардадда сРдасРсРса
РРссРРсада дсРРРдсРаР ааРаРРсРдР сададсдсад даасРсРдРа садРддсдаР дсадсддРсд сассдаасРд аааддсддас
Рссаддддда дсдРсдаРРР ддссРРРРРа аРссссРдаР садссдаасд дРаРРРРсРс ааРсРдсРсР дрсаРддсРд сРсссддсаР ррррсассдР ддааадРссс дсаассаддР сРсааРРадР сссадРРссд даддссдссР ддсРРРРдса аРддддаРРд
РРссааадаа аддаааассР дРРсРсадРа даРдаРдссР аРадРсддад рррдрдасаа дддаааРаРа ддсаРсаадР
РРасРРсРдР аааРаРаааа
РРадаРРсса ааассрдРРР асаРРсРасР аРГдсРаадР
РРасассаса аассРРРаРа аРассаааРа дсассдссРа аадРсдРдРс ддсрдаасдд адаРассРас аддРаРссдд аасдссРддР
РРдРдаРдсР сддРРссРдд
РсРдРддаГа ассдадсдса сРРасдсаРс даРдссдсаР сдссссдаса ссдсРРасад саРсассдаа саддсРсссс дрддааадрс садсаассаР сссаРРсРсс сддссРсРда аааадсРРаР дсаадаасдд рдассасаас ддррсрссар дадаасРсаа
РаадасРРаР дсадРРсРдР ддаРсаРдса аасРРсрссс аРаадРРРда ддрдрдасар
РРРРРаадРд ассРаРддаа рдсрсадаад ссРссааааа
РРРРРдадРс ааддааааад адраддсара
- 71 024655
асадббабаа 3720 бсабаасаба сбдббббббс ббасбссаса саддсабада дбдбсбдсба
ббаабаасба 3780 бдсбсааааа ббдбдбассб ббадсббббб аабббдбааа ддддббааба
аддаабаббб 3840 дабдбабадб дссббдасба дадабсабаа бсадссабас сасабббдба
даддббббас 3900 ббдсбббааа ааассбссса сассбссссс бдаассбдаа асабаааабд
аабдсааббд 3960 ббдббдббаа сббдбббабб дсадсббаба абддббасаа абааадсааб
адсабсасаа 4020 абббсасааа бааадсаббб ббббсасбдс аббсбадббд бддбббдбсс
ааасбсабса 4080 абдбабсбба бсабдбсбдд абссбдбдда абдбдбдбса дббадддбдб
ддааадбссс 4140 саддсбсссс адсаддсада адбабдсааа дсабдсабсб сааббадбса
дсаассаддб 4200 дбддааадбс сссаддсбсс ссадсаддса даадбабдса аадсабдсаб
сбсааббадб 4260 садсаассаб адбсссдссс сбаасбссдс ссабсссдсс ссбаасбссд
сссадббссд 4320 сссаббсбсс дссссабддс бдасбааббб бббббаббба бдсададдсс
даддссдссб 4380 сддссбсбда дсбаббссад аадбадбдад даддсббббб бддаддссба
ддсббббдса 4440 аааадсбдсд дссдсдаабб сассабддас бддассбддс ддабссбдбб
ссбддбддсс 4500 дсбдссассд дбдбссасад ссаддбдсад сбдсадсадб сбддсдссда
дсбддбссдд 4560 ссбддсдссб ссдбдасссб дбссбдсаад дссбссддсб асассббсас
сдасбасдад 4620 абдсасбддд бдаадсадас сссбдбдсас ддссбддадб ддабсддсдс
сдбддссссб 4680 дадассддсд дсассдссба саассадаад ббсаадддса аддссасссб
дассдссдсс 4740 аадбссбссб сбассдссба сабддадсбд сддбсссбда ссбссдадда
сбссчссдбд 4800 басбасбдса ссбссассдб ддбдссбббс дссбасбддч дссадддсас
ссбддбдасс 4860 дбдбссдссд сбадсассаа дддссссадс дбдббссссс бддсдсссад
садсаададс 4920 ассадсддсд дсасадссдс ссбдддсбдс сбддбдаадд асбасббссс
сдадсссдбд 4980 ассдбдадсб ддаасадсдд адсссбдасс бссддсдбдс асассббссс
сдссдбдсбд 5040 сададсадсд дссбдбасад ссбдадсадс дбддбдассд бдсссадсад
садссбдддс 5100 асссадассб асабсбдсаа сдбдаассас аадсссадса асассааддб
ддасаадаад 5160 дбддадссса ададсбдсда саадасссас ассбдссссс ссбдсссадс
сссададсбд 5220 сбдддсддас ссбссдбдбб ссбдббсссс сссаадссса аддасасссб
дабдабсадс 5280 аддасссссд аддбдассбд сдбддбддбд дасдбдадсс асдаддассс
ададдбдаад 5340 ббсаасбддб асдбддасдд сдбддаддбд сасаасдсса адассаадсс
садададдад 5400 садбасааса дсассбасад ддбддбдбсс дбдсбдассд бдсбдсасса
ддасбддсбд 5460 аасддсаадд аабасаадбд сааддбсбсс аасааддссс бдссадсссс
сабсдаааад 5520 ассабсадса аддссааддд ссадссасдд дадссссадд бдбасасссб
дссссссбсс 5580 сдддасдадс бдассаадаа ссаддбдбсс сбдассбдбс бддбдааддд
сббсбасссс 5640 адсдасабсд ССдбддадбд ддададсаас ддссадсссд адаасаасба
саадассасс 5700 сссссадбдс бддасадсда сддсадсббс ббссбдбаса дсаадсбдас
едбддасаад 5760 адсаддбддс адсадддсаа сдбдббсадс бдсадсдбда бдсасдаддс
ссбдсасаас 5820 сасбасассс адаададссб дадссбдбсс сссддсаадб дасбсдадбс
бадассдсдд 5880 бббдбдаадд аассббасбб сбдбддбдбд асабааббдд асааасбасс
басададабб 5940 бааадсбсба аддбааабаб ааааббббба адбдбабааб дбдббааасб
асбдаббсба аббдбббдбд баббббадаб бссаассбаб ддаасбдабд аабдддадса
6000
- 72 024655 дЕддЕддааЕ 60 60
ЕдаЕдаддсЕ
6120 адассссаад
6190
ЕадаасЕсЕЕ
6240 дааааЕЕаЕд
6300 саЕасЕдЕЕЕ
6360 ааааЕСдЕдЕ
6420
ЕадЕдссЕЕд
6480
ЕаааааассЕ
6540
ЕЕаасЕЕдЕЕ
6600 саааЕааадс
6660 сЕЕаЕсаЕдЕ
6682 дссЕЕЕааЕд асЕдсЕдасЕ дасЕЕЕссЕЕ дсЕЕдсЕЕЕд даааааЕаЕЕ
ЕЕЕсЕЕасЕС ассЕЕЕадсЕ асЕададаЕс сссасассЕс
ЕаЕЕдсадсЕ аЕЕЕЕЕЕЕСЭ сЕддаЕсдаа аддаааассЕ сЕсаасаЕЕс садааЕЕдсЕ сЕаЕЕЕасас сЕдЕаассЕЕ сасасаддса
ЕЕЕЕааЕЕЕд аЕааЕсадсс ссссЕдаасс
ЕаЕааЕддЕЕ сЕдсаЕЕсЕа
ЕЕ дЕЕЕЕдсЕса
ЕасЕссЕсса аадЕЕЕЕЕЕд сасаааддаа
ЕаЕаадЕадд
ЕададЕдЕсЕ
ЕаааддддЕЕ аЕассасаЕЕ
ЕдааасаЕаа асаааЕааад дЕЕдЕддЕЕЕ даадаааЕдс ааааадаада адЕсаЕдсЕд ааадсЕдсас саЕаасадЕЕ дсЕаЕЕааЕа ааЕааддааЕ
ЕдЕададдЕЕ ааЕдааЕдса сааЕадсаЕс дЕссааасЕс саЕсЕадЕда даааддЕада
ЕдЕЕЕадЕаа
ЕдсЕаЕасаа аЕааЕсаЕаа асЕаЕдсЕса аЕЕЕдаЕдЕа
ЕЕасЕЕдсЕЕ аЕЕдЕЕдЕЕд асаааЕЕЕса аЕсааЕдЕаЕ <210> 31 <211> 1441 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 1д54Н+УН оптимизированная последовательность <400> 31 ддЕассЕддс
ЕдсЕдссасс
120 дссЕддсдсс
180 даЕдсасЕдд
240
Едадассддс
300 саадЕссЕсс
360 дЕасЕасЕдс
420 сдЕдЕссдсс
480 сассЕссдад
540 дассдЕдадс
600 дсадЕссЕсс
660 сассаадасс
720 ддЕддадЕсс
780 ассЕЕссдЕд
840
ЕдаддЕдасс
900 дЕасдЕддас
960 сЕссассЕас
1020 ддааЕасаад
1080 сааддссаад
1140 даЕдассаад
1200 сдссдЕддад
1260 дсЕддасЕсс
1320 дсаддааддс
1380 ссадаадЕсс
1440 ддссдсдааЕ ддЕдЕссаса
ЕссдЕдассс дЕдаадсада ддсассдссЕ
ЕсЕассдссЕ ассЕссассд дсЕадсасса
Ессассдссд
ЕддаасЕссд ддссЕдЕасЕ
ЕасассЕдса аадЕасддсс
ЕЕссЕдЕЕсс
ЕдсдЕддЕдд ддсдЕддаад сдддЕддЕдЕ
ЕдсааддЕсЕ ддссадссЕс аассаддЕдЕ
ЕдддадЕсса дасддсЕссЕ аасдЕсЕЕЕЕ сЕдЕсссЕда
ЕсассаЕдда дссаддЕдса
ЕдЕссЕдсаа ссссЕдЕдса асаассадаа асаЕддадсЕ
ЕддЕдссЕЕЕ адддсссаЕс сЕсЕдддсЕд дсдсссЕдас сссЕдЕссЕс асдЕддасса сЕссСЕдссс сЕссЕаадсс
ЕддасдЕдЕс
Ессасаасдс ссдЕдсЕдас ссаасааддд дсдадссЕса сссЕдасаЕд асддссадсс
ЕсЕЕссЕдЕа ссЕдсЕссдЕ дссЕдддсаа
ЕЕддассЕдд дсЕдсадсад ддссЕссддс сддссЕддад дЕЕсаадддс дсддЕсссЕд сдссЕасЕдд сдЕдЕЕсссЕ ссЕддЕдаад садсддсдЕд сдЕддЕдаса саадссЕЕсс
ЕЕссЕдсссЕ
Еааддасасс ссаддаадаЕ саадассаад сдЕдсЕдсас ссЕдсссЕсе ддЕдЕасасс
ЕсЕддЕдаад
Едадаасаас сЕссаддсЕд даЕдсасдад дЕдасЕсдад сддаЕссЕдЕ
ЕсЕддсдссд
ЕасассЕЕса
ЕддаЕсддсд ааддссассс ассЕссдадд ддссадддса сЕддссссЕЕ дасЕасЕЕСО сасассЕЕсс дЕдссЕЕссЕ аасассаадд дссссЕдадЕ сЕдаЕдаЕсЕ ссЕдаддЕсс ссЕсдддадд саддасЕддс
ЕссаЕсдада сЕдссЕссЕа ддсЕЕсЕасс
Еасаадасса ассдЕддаса дсссЕдсаса
ЕсЕадассдс
ЕссЕддЕддс адсЕддЕссд ссдасЕасда ссдЕддсссс
Едассдссдс асЕссдссдЕ сссЕддЕдас дсЕсссддЕс
СЕдадссЕдЕ сЕдссдЕдсЕ ссЕсссЕддд
Еддасаадсд
ЕссЕдддсдд сссддасссс адЕЕсааЕЕд аасадЕЕсаа
Едаасддсаа ааассаЕсЕс дссаадаада сЕЕссдасаЕ ссссЕссЕдЕ адЕсссддЕд ассасЕасас ддссддадсЕ
- 73 024655
- 74 024655
90 95
ТНг Зег ТНх УаЬ УаЬ Рго РЬе АЬа Туг Тгр СЬу С1п СЬу ТНг Ней УаЬ 100 105 110
ТНг УаЬ Зег Зег 115 <210> 40 <211> 116 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 40
С1п Уа1 СЬп Ней Уа1 СЬп Зег СЬу АЬа С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у Зег 15 10 15
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег С1у Туг ТНх РНе ТНг Азр Туг 20 25 30
СЬи Мер Н15 Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп С1у Ьеи СЬи Тгр Не 35 40 45
СЬу АЬа УаЬ А1а Рго СЬи ТНг СЬу СЬу ТНг АЬа Туг Азп СЬп Ьуз РНе 50 55 60
Ьуз СЬу Агд АЬа ТНг 11е ТНг АЬа Аэр Ьуз Зег ТНг Зег ТНг А1а Туг 65 70 75 80
Мер С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТНг АЬа Уа1 Тух Туг Суз 85 90 95
ТНг Зег ТНг УаЬ Уа1 Рго РНе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп С1у ТНг Ьеи УаЬ 100 105 110
ТНг УаЬ Зег Зег 115 <210> 41 <211> 116 <212> ПРТ <213> Ното зарьепз <400> 41
С1п УаЬ С1п Ьеи УаЬ С1п Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу Зег 15 10 15
Зег Уа1 Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азр Туг 20 25 30
СЬи Мер Ηΐ5 Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр 11е 35 40 45
СЬу АЬа УаЬ АЬа Рго СЬи ТНг СЬу СЬу ТНг АЬа Туг Азп СЬп Ьуз РНе 50 55 60
Ьуз СЬу Агд АЬа ТНг Ьеи ТНг АЬа АЬа Ьуз Зег ТНг Зег ТНг АЬа Туг 65 70 75 80
Мер СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТНг А1а УаЬ Туг Туг Суз 85 90 95
ТНг Зег ТНг УаЬ УаЬ Рго РНе АЬа Туг Тгр с1у СЬп СЬу ТНг Ьеи УаЬ 100 105 НО
ТНг Уа1 Зег Зех 115 <210> 42 <211> Ыб <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 42
СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зех СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу Зег 15 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег СЬу Туг ТНг РНе ТНх Азр Туг 20 25 30
СЬи Мер НЬз Тхр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр Пе 35 40 45
СЬу А1а Уа1 АЬа Рхо СЬи ТНх СЬу СЬу ТНг АЬа Туг Азп СЬп Ьуз РНе 50 55 60
Ьуз С1у Агд АЬа ТНг Пе ТНг АЬа Азр Ьуз Зег ТНх Зег ТНх АЬа Туг 65 70 75 80
Мер СЬи Ьеи Зег Зех Ьеи Ахд Зег СЬи Азр ТНг АЬа УаЬ Тух Туг Суз 85 90 95
- 75 024655
- 76 024655
АЬа Зег ТЬг УаЬ УаЬ Рго РЬе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЫ Ьеи УаЬ
100 105 НО
ТЬг УаЬ Зег Зег
115
<210> 46
<211> 106
<2Ь2> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 46
Азр 11е СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Зег АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг МеЬ
20 25 30
Туг Тгр Туг С1п СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг
35 40 45
Агд ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг СЬп Зег Ьеи Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе СЬу С1у СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз
100 105
<210> 47
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 47
СЬп Не СЬп Меь ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи зег АЬа зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЫ Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег зег УаЬ Зег Туг Мет:
20 25 30
Туг Тгр Туг 61л СЬп Ьуь Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Тгр Пе Туг 35 40 45
Агд ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег 50 55 60 еЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи 65 70 75 $0
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суэ СЬп СЬп Туг СЬп Зег Ьеи Рго Ьеи ТЬг 85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Уа1 СЬи 11е Ьуа 100 105 <210> 48 <2Н> ЬОб <212> ПРТ <213> Ното зарьепз <400> 48
СЬп Не СЬп Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу 15 10 15
Азр Агд Уа! ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг Меь 20 25 30
Туг Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз АЬа Тгр Не Туг 35 40 45
Агд ТЫ Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег 50 55 60
СЬу Зег СЬу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи 65 70 75 80
Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг СЬп Зег Ьеи Рго Ьеи ТЬг 85 90 95
РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз 100 105 <210> 49 <211> 5 <212> ПРТ <213> Ното заргепз <400> 49
А$р Туг С1и МеЕ Нхз 1 5 <210 50 <211> 17 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 50
А1а \Га1 А1а Рго С1и ТНг С1у С1у ТНг А1а Туг Азп С1п Ьуз РНе Ьуз 15 10 15 (31 у <210> 51 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ното эархепз
<4 00> 51
ТНг ν$ι Рго РЬе А1а Туг
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 52
Зег А1а . Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС Туг
1 5 10
<210> 53 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ното зархепз
<400 53
Агд ТЬг Зес Азп Ьеи А1а Зег
1 5
<210> 54 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ното зархепз
<400> 54
С1п С1п Туг 1 С1п Зег Ьеи 5 Рго Ьеи ТЬг
<210> 55 <211> 1386 <212> ДНК <213> Ното зархепз
<400> 55 аЕддасЕЕсд 60 ддсЕсадсЕд ддЕЕЕЕссЕЕ дсссЕсаЕЕЕ ЕааааддЕдЕ ссадЕдЕсад
дЕдсадсЕдд 120 ЕдсадЕсЕдд ддсЕдаддЕд аадаадссЕд ддЕссЕсддЕ дааддЕсЕсс
ЕдсааддсЕЕ 180 сЕддаЕасас сЕЕсассдас ЕасдадаЕдс асЕдддЕдсд асаддссссЕ
ддасаадддс 240 ЕЕдадЕддаЕ ЕддадсЕдЕд дссссЕдааа сЕддЕддЕас ЕдссЕасааЕ
садаадЕЕса 300 адддсададс сасдаЕЕасс дсддасаааЕ ссасдадсас адссЕасаЕд
дадсЕдадса 360 дссЕдадаЕс Едаддасасд дссдЕдЕаЕЕ асЕдЕассЕс сассдЕддЕд
ссЕЕЕсдссЕ 420 асЕддддсса аддаасссЕд дЕсассдЕсЕ ссЕсадсЕЕс сассаадддс
ссаЕссдЕсЕ 480 ЕсссссЕддс дсссЕдсЕсс аддадсассЕ ссдададсас адссдсссЕд
ддсЕдссЕдд 540 ЕсааддасЕа сЕЕссссдаа ссддЕдасдд ЕдЕсдЕддаа сЕсаддсдсс
ссдассадсд 600 дсдЕдсасас сЕЕсссддсЕ дЕссЕасадЕ ссЕсаддасЕ сЕасЕсссЕс
адсадсдЕдд 660 ЕдассдЕдсс сЕссадсадс ЕЕдддсасда адассЕасас сЕдсаасдЕа
даЕсасаадс 720 ссадсаасас сааддЕддас аадададЕЕд адЕссаааЕа ЕддЕссссса
ЕдсссассаЕ 780 дсссадсасс ЕдадЕЕссЕд дддддассаЕ садЕсЕЕссЕ дЕЕсссссса
ааасссаадд 840 асасЕсЕсаЕ даЕсЕсссдд ассссЕдадд ЕсасдЕдсдЕ ддЕддЕддас
дЕдадссадд аадассссда ддЕооадЕЕс аасЕддЕасд ЕддаЕддсдЕ ддаддЕдсаЕ
900
- 78 024655
ааРдссаада 960 сааадссдсд ддаддадсад РРсаасадса сдРассдрдР ддРсадсдРс
сРсассдРсс 1020 Рдсассадда сРддсРдаас ддсааддадр асаадрдсаа ддрсрссаас
аааддссРсс 1080 сдРссРссаР сдадаааасс арсРссааад ссааадддса дссссдадад
ссасаддрдр 1140 асасссРдсс сссаРсссад даддадаРда ссаадаасса ддРсадссРд
ассРдссРдд 1200 РсаааддсРР сРассссадс дасаРсдссд РддадРддда дадсаарддд
садссддада 1260 асаасРасаа дассасдссР сссдРдсРдд асРссдасдд СРССРРСРРС
сРсРасадса 1320 ддсраассдр ддасаададс аддрддсадд аддддааРдР СРРсРсаРдс
РссдРдаРдс аРдаддсРсР дсасаассас Расасасада ададссРсРс ссРдРсрсРд
1380 ддРааа
1386 <210> 56 <211> 462 <212> ПРТ <213> Ното заргепз
<400> 56
МеР 1 Азр РЬе С1у Ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе 5 Ьеи 10 А1а Ьеи Ие Ьеи Ьуз С1у 15
Уа1 Θΐη Суз С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 СЬп 20 25 Зег С1у А1а СЬи Уа1 30 Ьуз Ьуз
Рго С1у Зег Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз 35 40 Ьуз АЬа Зег С1у 45 Туг ТЬг РЬе
ТЬг Азр Туг СЬи МеР Ηΐδ Тгр Уа1 Агд 50 55 С1п А1а Рго 60 С1у С1п С1у Ьеи
С1и 65 Тгр Не С1у АЬа Уа1 АЬа Рго СЬи 70 ТЬг С1у 75 С1у ТЬг АЬа Туг Азп 80
С1п Ьуз РЬе Ьуз С1у Агд А1а ТЬг Не 85 ТЬг 90 АЬа Азр Ьуз 5ег ТЬг Зег 95
ТЬг А1а Туг МеР 61и Ьеи Зег Зег 100 Ьеи 105 Агд Зег 61и Азр ТЬг А1а 110 Уа1
Туг Туг Суз ТЬг Зег ТЬг Уа1 УаЬ 115 120 Рго РЬе А1а Туг Тгр 125 СЬу С1п С1у
ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег А1а 130 135 Зег ТЬг Ьуз С1у 140 Рго Зег УаЬ РНе
Рго 145 Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег 150 ТЬг Зег С1и 155 Зег ТЬг А1а АЬа Ьеи 160
С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе 165 Рго С1и 170 Рго Уа1 ТЬг УаЬ Зег 175 Тгр
АвП Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у 180 Уа1 185 Ηίβ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 190 Ьеи
С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи 195 200 Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг 205 Уа1 Рго Зег
Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг 210 215 ТЬг Суз Азп УаЬ 220 Агр Ηΐ3 Ьуз Рго
Зег 225 Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд 230 Уа1 С1и Зег 235 Ьуэ Туг С1у Рго Рго 240
Су5 Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи 245 РЬе Ьеи 250 С1у С1у Рго Зег УаЬ 255 РЬе
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Аэр 260 ТЬг 265 Ьеи МеР Не Зег Агд ТЬг 270 Рго
СЬи УаЬ ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр 275 2Θ0 Уа1 Зег СЬп 61и Азр 285 Рго С1и УаЬ
С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Аэр 51у 290 295 УаЬ СЬи Уа1 НЬЗ 300 Азп А1а Ьуэ ТЬг
Ьуэ 305 Рго Агд С1и Е1и С1п РЬе Азп 310 Зег ТЬг Туг 315 Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 320
Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηΐδ 61η Азр Тгр 325 Ьеи Азп 330 51у Ьуз С1и Тух Ьуэ 335 Суэ
- 79 024655
Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег Не СЬи Ьуз ТЬг Ые Зег
340 345 350
Ьуз АЬа Ьуз 355 С1у СЬп Рго Агд СЬи Рго 360 С1п УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 365
Зег СЬп СЬи 370 СЬи Меб ТЬг Ьуз Азп СЬп 375 Уз1 Зег Ьеи 380 ТЬг Суз Ьеи Уа1
ЬуЗ СЬу РЬе 385 Туг Рго Зег 390 Азр 11е АЬа Уа1 СЬи Тгр 395 СЬи Зег Азп СЬу 400
СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг 405 Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 410 Ьеи Азр Зег Азр 415
СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг 420 Зег Агд Ьеи 425 ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 430
СЬп СЬи СЬу 435 Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег 440 УаЬ Меб Нхз СЬи А1а Ьеи Ηΐ3 445
АЗП Нхз Туг 450 ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег 455 Ьеи Зег Ьеи 460 С1у Ьуз
<210> 57 <211> 817 <212> ДНК <213> Ногтю зархепз
<400> 57 абддасббсд 60 ддсбсадсбд ддббббссбб дсссбсаббб бааааддбдб ссадбдбсаа
абссадсбса 120 сссадбсбсс абссбсссбд бсбдсабсбд баддадасад адбсассабс
асббдсбссд 180 ссбссбссбс сдбдбссбас абдбасбддб . абсадсадаа ассадддааа
дссссбаадд 240 ссбддабсба бсдсасабсс аасббддсба . дбддддбссс абсааддббс
адбддсадбд 300 дабсбдддас адаббасасб сбсассабса ι дсадбсбдса ассбдаадаб
бббдсаасбб 360 асбасбдбса асадбабсад адбсбдссбс бсасбббсдд сддадддасс
ааддбддада 420 бсааасдбаа дбсдасббсб адаббдбсда ι сбдбсссбаа сабдсссбдб
даббабссдс 480 ааасаасаса сссаадддса даасбббдбб асббааасас сабссбдббб
дсббсбббсс 540 бсаддаасбд бддсбдсасс абсбдбсббс абсббсссдс сабсбдабда
дсадббдааа 600 бсбддаасбд ссбсбдббдб дбдссбдсбд аабаасббсб абсссадада
ддссааадба 660 садбддаадд бддабаасдс ссбссаабсд ддбаасбссс аддададбдб
сасададсад 720 дасадсаадд асадсассба садссбсадс адсасссбда сдсбдадсаа
адсадасбас 780 дадааасаса аадбсбасдс сбдсдаадбс асссабсадд дссбдадсбс
дсссдбсаса 817 аададсббса асаддддада дбдббад
<210> 58 <211> 118 <212> ДНК <213> Ното зарлепз
<400> 58 дбаадбсдас 60 ббсбадаббд бсдасбдбсс сбаасабдсс сбдбдаббаб ссдсааасаа
сасасссаад 118 ддсадаасбб бдббасббаа асассабссб дбббдсббсб ббссбсад
<210> 59 <211> 696 <212> ДНК <213> Ното заргепз
<400> 59 абддасббсд 60 ддсбсадсбд ддббббссбб дсссбсаббб бааааддбдб ссадбдбсаа
абссадсбса 120 сссадбсбсс абссбсссбд бсбдсабсбд баддадасад адбсассабс
асббдсбссд 180 ссбссбссбс сдбдбссбас абдбасбддб абсадсадаа ассадддааа
дссссбаадд 240 ссбддабсба бсдсасабсс аасббддсба дбддддбссс абсааддббс
адбддсадбд 300 дабсбдддас адаббасасб сбсассабса дсадбсбдса ассбдаадаб
бббдсаасбб асбасбдбса асадбабсад адбсбдссбс бсасбббсдд сддадддасс
360
- 80 024655
ааддбддада 420 бсааасдаас бдбддсбдса ссабсбдбсб бсабсббссс дссабсбдаб
дадсадббда аабсбддаас бдссбсбдбб дбдбдссбдс бдаабаасбб сбабсссада
480
даддссааад басадбддаа ддбддабаас дсссбссааб сдддбаасбс ссаддададб
540
дбсасададс аддасадсаа ддасадсасс басадссбса дсадсасссб дасдсбдадс
600
ааадсадасб асдадаааса сааадбсбас дссбдсдаад бсасссабса дддссбдадс
660
бсдсссдбса сааададсбб саасадддда дадбдб
696
<210> 60
<211> 232
<212> ПРТ
<213> Нолю зархепз
<400> 60
Меб Азр РЬе 61у Ьеи Зег Тгр УаЬ РЬе Ьеи А1а Ьеи Не Ьеи Ьуз С1у
1 5 10 15
Уа1 С1п Суз С1п Не С1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а
20 25 30
Зег Уа1 С1у Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Зег АЬа Зег Зег Зег УаЬ
35 40 45
Зег Туг Меб Туг Тгр Туг СЬп 61п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз А1а
50 55 60
Тгр Не Туг Агд ТЬг Зег Азп Ьеи АЬа Зег С1у УаЬ Рго Зег Агд РЬе
65 70 75 80
Зег С1у Зег <31у Зег 51у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи
85 90 95
51п Рго С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг 51п Зег Ьеи
100 105 110
Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у СЬу ТЬг Ьуз УаЬ С1и Не Ьуз Агд ТЬг УаЬ
115 120 125
АЬа АЬа Рго Зег УаЬ РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр СЬи 140 С1п Ьеи Ьуз
130 135
Зег Е1у ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд
145 150 155 160
СЬи АЬа Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи С1п Зег СЬу Азп
165 170 Ь75
Зег С1п СЬи Зет УаЬ ТЬг СЬи СЬь Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег
180 185 190
Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи Ьуз Низ Ьуз
195 200 205
УаЬ Туг АЬа Сув СЬи УаЬ ТЬг ΗΪ3 СЬп Е1у Ьеи Зег Зег РХО УаЬ ТЬх
210 215 220
Ьуз Зег РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
225 230
<210> 61
<2Ы> 443
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химерное СЫЬАСЬ 1дС4
<400> 61
СЬп УаЬ СЬп Ьеи С1п СЬп Зег С1у АЬа СЬи Ьеи УаЬ Агд Рго СЬу АЬа
1 5 ЬО 15
Зег УаЬ ТЬг Ьеи Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
СЬи Меб Н15 Тгр УаЬ Ьуз 61п ТЬг Рго УаЬ Ньз СЬу Ьеи СЬи Тгр Не
35 40 45
С1у АЬа УаЬ АЬа Рго СЬи ТЬг СЬу С1у ТЬг АЬа Туг Азп С1п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз СЬу Ьуз АЬа ты Ьеи ТЬг АЬа АЬа Ьуз Зег Зег Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
Меб С1и Ьеи Агд 5ег Ьеи ТЬг 5ег СЬи Азр Зег АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
ТНг Зег ТНг Уа1 УаЬ Рго РНе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТНг Ьеи УаЬ
100 105 но
ТНг Уа1 Зег АЬа А1а Зег ТНг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РНе Рго Ьеи АЬа
115 120 125
Рго Суз Зег Агд Зег ТНг Зег СЬи Зег ТНг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи
130 135 140
УаЬ Ьуз Азр Туг РНе Рго СЬи Рго УаЬ ТНг Уа1 Зег Тгр Азп Зег СЬу
145 150 155 160
АЬа Ьеи ТНг Зег СЬу УаЬ НЬз ТНг РНе Рго А1а УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег
165 170 175
СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТНг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи
180 185 190
СЬу ТНг Ьуз ТНг Туг ТНг Суз Азп УаЬ Азр Н15 Ьуз Рго Зег Азп ТНг
195 200 205
Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 СЬи Зег Ьуз Туг СЬу Рго Рго Суз Рго Зег
210 215 220
Суз Рго АЬа Рго СЬи РНе Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго
225 230 235 240
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Мер Не Зег Агд ТНг Рго СЬи УаЬ ТНг
245 250 255
Суз УаЬ Уа1 Уа1 Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго СЬи Уа1 СЬп РНе Азп
260 265 270
Тгр Туг Уа1 Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ Ηΐ3 Азп АЬа Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд
275 230 285
С1и СЬи СЬп РНе Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1 УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТНг УаЬ
290 295 300
Леи Н15 СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег
305 310 315 320
Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз
325 330 335
С1у СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи
340 345 350
СЬи Мер ТНг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РНе
355 360 365
Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи
370 375 380
Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе
305 390 395 400
РНе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТНг УаЬ Азр Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬи СЬу
405 410 415
Азп УаЬ РНе Зег Суз Зег УаЬ Мер Ηίδ СЬи АЬа Ьеи Н15 Αεη Ηίδ Туг
420 425 430
ТНг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз
435 440 <210> 62 <211> 213 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Легкая цепь химерного ΰΝΗΑΟΙ <400> 62
СЬп 1 Не УаЬ Ьеи ТНг СЬп Зег Рго АЬа Не Мек Зег АЬа Зег Рго СЬу
5 10 15
СЬи Ьуз УаЬ ТНг Не Зег Суз Зег АЬа Зег Зег Зег УаЬ Зег Туг Мек
20 25 30
Туг Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Зег Зег Рго Ьуз АЬа Тгр Не Туг
35 40 45
Агд ТНг Зег Азп Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго СЬу Агд РНе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг Не Зег Зег Мек СЬи АЬа СЬи
- 83 024655
- 84 024655
ааддссссРа 240 аддссРддаР сРассддасс РссаассРдд ссРссддсдР дссРРссадд
РРсРссддсР 300 ссддсРсРдд сассдасРас асссРдасса РсРссадссР дсадссРдад
дасРРсдсса 360 ссРасРасРд ссадсадРас садРсссРдс сРсРдассРР сддсддаддс
ассааддрдд 420 адаРсаадсд РасддРддсд дсдссаРсРд РдРРсаРсРР ссссссРРсс
дасдадсадс 480 рдаадрссдд сассдссрср дрддрдрдсс рдсРдаасаа сРРсРасссР
сдддаддсса 540 аддРдсадРд дааддрддас аасдсссрдс адрссддсаа срсссаддаа
РссдРсассд 600 адсаддасРс сааддасРсР ассРасРссс РдРссРссас ссРдасссРд
Рссааддссд 660 асРасдадаа дсасааддрд РасдссРдсд аадрдассса ссадддссРд
адРРсРсссд 702 рдассаадрс сРРсаассдд ддсдадРдсР да
<210> 66 <211> 1389 <212> ДНК <213> Ното зархепз
<400> 66 аРддасРдда 60 ссРддсддаР ссРдРРРсРд дрддссдсрд ссассддрдр дсасРсссад
дрдсадсрдд 120 рдсадрсрдд сдссдаадрд аадааассРд дсРссРссдР дааддРдРсс
РдсааддссР 180 ссддсРасас сРРсассдас РасдадаРдс асРдддРдсд ссаддсРсса
ддасадддсс 240 рддаарддар сддсдссдрд дсРссРдааа ссддсддсас сдссРасаас
садаадррса 300 адддсадддс сассаРсасс дссдасаадР ссассРсРас сдссРасаРд
даасРдРссР 360 сссРдсддРс Рдаддасасс дссдРдРасР асРдсассРс сассдрддрд
ссРСРсдсРР 420 асРддддсса дддсасссрд дрдассдрдр ссРссдсРад сассаадддс
ссРРссдРдР 480 РсссРсРддс сссрРдсРсс сддРссассС сРдадРсРас сдссдсРсРд
ддсРдссРдд 540 РдааддасРа сРРсссРдад ссрдрдасад РдРсРРддаа сРсРддсдсс
сРдассРсРд 600 дсдрдсасас сРРсссРдсс дрдсрдсадр ссРссддссР дРасРсссРд
РссРссдРдд 660 РдасадРдсс РРссРссРсс срдддсасса адассРасас сРдРаасдРд
дассасаадс 720 сРРссаасас сааддРддас аадсдддрдд адРссаадРа сддсссРссР
РдсссРссаР 780 дсссРдсссс рдадррссрд ддаддссссР ссдРдрРссР дррсссРссР
аадссРаадд 840 асасссРдаР даРсРсссдд ассссРдаад РдассРдсдР ддрддрддас
дрдрсссадд 900 аадаРссРда ддРссадРРс ааРРддРасд рддасддсдр ддаддрдсас
аасдссаада 960 ссаадссРад ададдаасад РРсаасРсса ссРассдддР ддрдрссдрд
сРдассдРдс 1020 рдсассадда сГддсРдаас ддсааадааР асаадрдсаа ддрдрссаас
аадддссРдс 1080 ссрссрссар сдаааадасс аРсРссаадд ссаадддсса дссРсдддаа
ссРсаддРдР 1140 асасссРдсс РсссРсРсад даададаРда ссаадаасса ддРдРсссРд
ассРдРсРдд 1200 рдаадддсРР сРасссРРсс даРаРсдссд РддадРддда дРсРаасддс
садссрдада 1260 асаасрасаа дассасссср ссРдРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс
сРдРасРсса 1320 ддсРдассдР ддасаадРсс сддрддсадд ааддсаасдР сРРРРссРдс
РссдРдаРдс 1380 асдаддсссР дсасаассас Расасссада адРсссРдРс ссрдрсрсрд
ддсаадрда 1389
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Лиганд, связывающийся с ΜδΚν-ΕΝν, содержащий каждый из участков, определяющих ком-

Claims (27)

1. Лиганд, связывающийся с ΜδΚν-ΕΝν, содержащий каждый из участков, определяющих комплементарность (СОК): СЭК1 вариабельной области легкой цепи (УБ), представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 1, СЭК2 Уб, представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 2, СЭК3 УБ, представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 3, СЭК4 вариабельной области тяжелой цепи (УН), представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 4, СЭК5 УН, представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 5, и СЭК6 УН, представленный δΕΟ ΙΌ Ш. 6.
2. Лиганд, связывающийся с ΜδΚν-ΕΝν, содержащий
- 85 024655 вариабельную область легкой цепи (УЬ), содержащую аминокислотные последовательности 8ЕО ГО Ыо. 1, представляющую собой СГОКЕ 8ЕО ГО Ыо. 2, представляющую собой СГОК2, и 8Е0 ГО Ыо. 3, представляющую собой СГОК3, и вариабельную область тяжелой цепи (УН), содержащую аминокислотные последовательности 8Е0 ГО Ыо. 4, представляющую собой СГОК4, 8Е0 ГО Ыо. 5, представляющую собой СГОК5, и 8Е0 ГО Ыо. 6, представляющую собой СГОК6.
3. Лиганд, связывающийся с М8КУ-ЕЫУ, содержащий вариабельную область легкой цепи (УЬ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО Ыо. 7, и вариабельную область тяжелой цепи (УН), имеющую аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО Ыо. 8.
4. 8сЕУ фрагмент, содержащий лиганд по любому из пп.1-3.
5. ЕаЬ фрагмент, содержащий лиганд по любому из пп.1-3.
6. Антитело, содержащее лиганд по любому из пп.1-3.
7. Антитело по п.6, отличающееся тем, что оно представляет собой химерное, сконструированное или гуманизированное антитело.
8. Антитело по п.6 или 7, которое представляет собой 1дС.
9. Антитело по п.8, которое представляет собой 1дС1 или 1дС4 человека.
10. Фармацевтическая композиция для лечения М8КУ-ассоциированных заболеваний, содержащая лиганд по любому из пп.1-3, 5сЕУ фрагмент по п.4, ЕаЬ фрагмент по п.5 или антитело по любому из пп.69 в качестве активного ингредиента.
11. Нуклеиновая кислота, кодирующая СОК по п.1, содержащая каждую из последовательностей, представленных 8ЕО ГО Ыо. 13, кодирующей СГОКЕ 8ЕО ГО Ыо. 14, кодирующей СГОК2, 8ЕО ГО Ыо. 15, кодирующей СГОК3, 8ЕО ГО Ыо. 16, кодирующей СГОК4, 8ЕО ГО Ыо. 17, кодирующей СГОК5, и 8ЕО ГО Ыо. 18, кодирующей СГОК6.
12. Нуклеиновая кислота, кодирующая УН цепь лиганда по п.2 или 3, содержащая по меньшей мере одну полноразмерную последовательность, представленную 8ЕО ГО Ыо. 10 или 12.
13. Нуклеиновая кислота, кодирующая УЬ цепь лиганда по п.2 или 3, содержащая по меньшей мере одну полноразмерную последовательность, представленную 8ЕО ГО Ыо. 9 или 11.
14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.11-13.
15. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.14.
16. Способ получения лиганда по любому из пп.1-3, 5сЕУ фрагмента по п.4, ЕаЬ фрагмента по п.5 или антитела по любому из пп.6-9, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п.15 в условиях, которые дают возможность синтеза лиганда, 5сЕУ антитела, ЕаЬ фрагмента или антитела.
17. Способ лечения М8КУ-ассоциированного заболевания, включающий введение лиганда по любому из пп.1-3, 5сЕУ фрагмента по п.4, ЕаЬ фрагмента по п.5 или антитела по любому из пп.6-9, либо фармацевтически приемлемой формы лиганда по любому из пп.1-3, 5сЕУ фрагмента по п.4, ЕаЬ фрагмента по п.5 или антитела по любому из пп.6-9, либо фармацевтической композиции по п.10.
18. Способ по п.17, где М8КУ-ассоциированное заболевание выбрано из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению, клинически изолированный синдром, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет.
19. Способ по п.18, где диабет представляет собой диабет типа 1.
20. Способ лечения М8КУ-ассоциированных заболеваний по любому из пп.17-19, включающий введение антитела 1дС4 или 1дС1 по п.9 в качестве длительного лечения регулярно повторяющимися инъекциями.
21. Антилиганд, предназначенный для получения антитела по любому из пп.6-9, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности, представленной 8ЕО ГО Ыо. 20 или 8ЕО ГО Ыо. 32.
22. Способ определения антилиганда в биологическом образце с применением лиганда по любому из пп.1-3, 8сЕу фрагмента по п.4, ЕаЬ фрагмента по п.5 или антитела по любому из пп.6-9, включающий стадии:
(а) приведения в контакт образца с лигандом по любому из пп.1-3, 8сЕу фрагментом по п.4, ЕаЬ фрагментом по п.5 или антителом по любому из пп. 6-9, (б) обнаружения специфического связывания антилиганда с указанным лигандом, 8сЕу фрагментом, ЕаЬ фрагментом или антителом в образце.
23. Способ определения антилиганда по п.22, дополнительно включающий стадию:
(в) приведения в контакт образца с лигандом, который специфично связывается с антигеном САС.
24. Набор для иммунологического анализа для определения антилиганда в биологическом образце, содержащий лиганд по любому из пп.1-3, 8сЕу фрагмент по п.4, ЕаЬ фрагмент по п.5 или антитело по любому из пп.6-9 и реагенты для определения специфичного связывания антилиганда с вышеуказанным лигандом, 5сЕу, ЕаЬ фрагментом или антителом.
25. Набор для иммунологического анализа для определения антилиганда в биологическом образце
- 86 024655 по п.24, дополнительно содержащий лиганд, который специфично связывается с антигеном ОАО.
26. Применение набора для иммунологического анализа по п.24 или 25 при определении М5КУассоциированного заболевания, выбранного из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению, клинически изолированный синдром, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет.
27. Применение по п.26, где диабет представляет собой диабет типа 1.
(A)
С1УЬТОЗРА1МЗА5Р5ЕКУТ13СЗАЗЗЗУЗУМУСТУООКР533РКА?ЛУНТ
5ЫЬА5СУРСКГ5С5С5СТ5У5ЬТ155МЕАЕОААТУ¥С00У05ЬРЬТГе5С
ТКЬЕ1К (B) (2У0Ь(ЭС5САЕЬУКРСАРУТЬ5СКА5СУТГТОУЕМНИУК(2ТРУНСЬЕИ1СА. УАРЕТССТАУЫОКЕКСКАТЪТААКЗ5ΞТАУМЕЬКЗЬТΞΕАУУУСТЗТУ УРЕАУЖЗСеТЬУТУЗА
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
- 87 024655
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
- 88 024655
АроН (080141 - 6ΑΖΒ 2 060414С51 10 мкг/мл + Заскзоп регох. 1/250 - Сыворотка 1/10
|| 91 > ΐτ—1- В ι ΕΙεΙΙ р ш ПШштттшкт ΙΙιΙίιΙΐΙ ΤίΤΠΓΠ ϊ 1 н 10 а И 1 11»яв«Ун... ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙIIΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΝΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΠΙΙΙΊΙΙΙΙΙΙΙ ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙίΙΙΙΙ
Пациенты с эпилепсией / Здоровые контроли
Фиг. 10
Фиг. 11
- 89 024655
Фиг. 12
Фиг. 13 'к' ζ
ш
Фиг. 14
15А: Определения по Кэбету и Чозиа:
αναίαοδΟΑΕί,νκροΑΰντί-δοκΑδΰΥтрт ρυεμη ул/катруне1.Е\ме
АУАРЕТССТАУТОКГК(ЗКАТ1-~ААК555ТАУМЕ1-Р5!_Т5ЕР5АУУУСТ5ТУУРГАУ ννΰΟΟΤΙ.ντν3Α
15В: Предпочтительное (комбинированное) определение:
ОУО1_СО5САЕ1_УРР5А5УТ1_ЗСКА5 ΟΥΤΡΤΡΥΕΜΗ УТУКОТРУНСЛБЛЛе АУАРЕТООТАУУУОКРКОКАТ1_ТААК555ТАУМЕ1-К51-Т5ЕР5АУУУСТ5 ТУУРРАУ 'лсаенутузА
Фиг. 15
ΟΐνίΤ03ΡΜΜ5Α5Ρ5ΕΚνΤΙ505Α555ν3ΥΜΥννΥΟΟΚΡ533ΡΚΑννΐΥΗΤ8ΝΙ
Α5θνΡΰΚΓ553<356Τ5Υ5ΠΊ55ΜΕΑΕΡΑΑΤΥΥΟΟΟΥ03Ι-ΡΙ-Τ
РО53ТК1.Е1КК
Фиг. 16
- 90 024655
Фиг. 18
Фиг. 19
Фиг. 20
- 91 024655
Фиг. 21
Фиг. 22
Н2 Тяжелая цепь:
ОУОЬУОЗеАЕУККРСЗБУКУЗСКАЗОУТЕТРУЕМНУУУНОАРОааЬЕУУ'бАУАРЕ
ΤΟ3ΤΑγΝαΚΓΚΘΡΑ~ΙΤΑΡΚ5Τ3ΤΑΥΥΕί351Ρ3ΕΡΤΑνΥΥ3Τ5ΡΑ/ΡΓΑΥννθα(3Τ
1_УТУ55
УКЗ Легкая цепь:
дЮ'-ТаЗР3313АЗУ<ЗРРУГ1ТСЗА533УЗУМУУУаОКРСКАРКАЦ1УКТЗЫ1-АЗ(ЗУ
Ρ5ΡΡ3Θ5Θ3ΘΤΡνΤΙΤΙ55ΐαΡΕΡΡΑΤΎΥ023Υ031=Ρ!=ΤΡΟΘΟΤΚνΕ!Κ
Фиг. 23
- 92 024655
А
Фиг. 26
- 93 024655
Фиг. 27
Фиг. 28
Фиг. 29
- 94 024655
А
Ложные ΕΝν без обработки ΕΝν обработка 1дО4
Фиг. 30
Фиг. 31
EA201100160A 2008-07-08 2009-07-08 ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ EA024655B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12961308P 2008-07-08 2008-07-08
US20258109P 2009-03-13 2009-03-13
US21318909P 2009-05-15 2009-05-15
PCT/EP2009/058663 WO2010003977A1 (en) 2008-07-08 2009-07-08 Therapeutic use of specific ligand in msrv associated diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100160A1 EA201100160A1 (ru) 2011-08-30
EA024655B1 true EA024655B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=41165692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100160A EA024655B1 (ru) 2008-07-08 2009-07-08 ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (24)

Country Link
US (4) US8715656B2 (ru)
EP (2) EP3211005B1 (ru)
JP (3) JP6058264B2 (ru)
KR (1) KR101682040B1 (ru)
CN (1) CN102143975B (ru)
AU (1) AU2009268025B2 (ru)
BR (1) BRPI0915667B8 (ru)
CA (1) CA2729869C (ru)
CY (2) CY1119185T1 (ru)
DK (1) DK3211005T3 (ru)
EA (1) EA024655B1 (ru)
ES (2) ES2633965T3 (ru)
HK (2) HK1158232A1 (ru)
HR (2) HRP20171067T1 (ru)
HU (2) HUE054712T2 (ru)
IL (1) IL210204A (ru)
LT (2) LT2315777T (ru)
MX (1) MX2010014319A (ru)
NZ (1) NZ590515A (ru)
PL (2) PL2315777T3 (ru)
PT (2) PT3211005T (ru)
SI (2) SI3211005T1 (ru)
WO (1) WO2010003977A1 (ru)
ZA (1) ZA201100446B (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5087625B2 (ja) 2006-09-01 2012-12-05 セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化
MX2010014319A (es) * 2008-07-08 2011-05-19 Geneuro Sa Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.
FR2945538B1 (fr) * 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
UA119032C2 (uk) 2012-10-02 2019-04-25 Женеро Са Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w
EP2949342A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-02 Geneuro SA Antiretroviral drug targeting human endogenous retrovirus
SG10202006332PA (en) * 2015-10-29 2020-08-28 Hoffmann La Roche Transgenic rabbit with common light chain
JP2018028538A (ja) * 2016-08-12 2018-02-22 公立大学法人名古屋市立大学 統合失調症とその関連疾患の診断用マーカー及びその使用
WO2019201908A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Geneuro Sa Method for the detection of the soluble hydrophilic oligomeric form of herv-w envelope protein
EP3916015A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Geneuro SA Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
CN113940993B (zh) * 2021-12-20 2022-02-22 深圳万可森生物科技有限公司 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001031021A1 (en) * 1999-10-28 2001-05-03 Universite De Geneve Multiple sclerosis-related superantigen
US20030185827A1 (en) * 1994-04-29 2003-10-02 Mayo Foundation Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
WO2005080437A1 (fr) * 2004-01-23 2005-09-01 Biomerieux Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
EP1829962A1 (en) * 2004-12-22 2007-09-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of preparing antibody by use of cell having its fucose transporter function inhibited
WO2008113916A2 (fr) * 2007-02-09 2008-09-25 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0814166A3 (en) 1989-08-09 1998-05-13 DeKalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
CA2522894C (en) * 2003-05-31 2013-06-25 Micromet Ag Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody specific for epcam
UA94019C2 (ru) 2004-07-09 2011-04-11 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело, которое специфически связывается с глипиканом 3 (gpc3)
KR100918746B1 (ko) 2004-09-06 2009-09-24 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항 ａ３３ 항체
WO2006138627A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 Inhibitex, Inc. Monoclonal antibodies recognizing a coagulase-negative staphylococcal protein
EP1921137A4 (en) 2005-06-21 2011-01-26 Med & Biological Lab Co Ltd ANTIBODIES WITH INHIBITOR EFFECT ON THE FORMATION OF AMYLOID FIBRILLES
MX2010014319A (es) * 2008-07-08 2011-05-19 Geneuro Sa Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030185827A1 (en) * 1994-04-29 2003-10-02 Mayo Foundation Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
WO2001031021A1 (en) * 1999-10-28 2001-05-03 Universite De Geneve Multiple sclerosis-related superantigen
WO2005080437A1 (fr) * 2004-01-23 2005-09-01 Biomerieux Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
EP1829962A1 (en) * 2004-12-22 2007-09-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of preparing antibody by use of cell having its fucose transporter function inhibited
WO2008113916A2 (fr) * 2007-02-09 2008-09-25 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOND J.-L., ET AL.: "ENVELOPE GLYCOPROTEIN OF THE HUMAN ENDOGENOUS RETROVIRUS HERV-W IS EXPRESSED IN THE HUMAN PLACENTA AND FUSES CELLS EXPRESSING THE TYPED MAMMALIAN RETROVIRUS RECEPTOR.", JOURNAL OF VIROLOGY., THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., US, vol. 74., no. 07., 1 April 2000 (2000-04-01), US, pages 3321 - 3329., XP000946327, ISSN: 0022-538X, DOI: 10.1128/JVI.74.7.3321-3329.2000 *
LANG ALOIS B; BERNARD CORINNE; PERRON HERVE: "The therapeutic potential of monoclonal anti-human endogenous retrovirus W (HERV-W) envelope protein antibody in multiple sclerosis: Results from a new EAE-animal model", HUMAN ANTIBODIES, IOS PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 17, no. 1-2, 12 November 2008 (2008-11-12), AMSTERDAM, NL, pages 21, XP009124418, ISSN: 1093-2607 *
PERRON HERVÉ, ET AL: "Endogenous retroviral genes, Herpesviruses and gender in Multiple Sclerosis.", JOURNAL OF NEUROLOGICAL SCIENCES., ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING CO, AMSTERDAM., NL, vol. 286, no. 1-2, 15 November 2009 (2009-11-15), NL, pages 65 - 72, XP002551232, ISSN: 0022-510X, DOI: 10.1016/j.jns.2009.04.034 *
PERRON HERVE; SANHADJI K; BERNARD CORINNE; TOURAINE JEAN-LOUIS; MARCHE PATRICE: "Monoclonal antibody against envelope protein from Human Endogenous Retrovirus "W" (MSRV-ENV or Syncytin) inhibits TLR4-initated immunotoxicity cascade in human peripheral blood mononuclear cells and displays therapeutic effects in novel pre-clinical models for Multiple Sclerosis", JOURNAL OF NEUROVIROLOGY, INFORMA HEALTHCARE, GB, vol. 13, no. Suppl. 1, 30 October 2007 (2007-10-30), GB, pages 112 - 113, XP009124416, ISSN: 1355-0284 *

Also Published As

Publication number Publication date
LT3211005T (lt) 2021-08-25
ES2633965T3 (es) 2017-09-26
ES2875762T3 (es) 2021-11-11
BRPI0915667A2 (pt) 2017-01-17
US20110243962A1 (en) 2011-10-06
IL210204A0 (en) 2011-03-31
HK1243436A1 (zh) 2018-07-13
IL210204A (en) 2015-03-31
JP6058264B2 (ja) 2017-01-11
EP3211005B1 (en) 2021-03-17
US10059758B2 (en) 2018-08-28
HRP20171067T1 (hr) 2017-10-06
HUE054712T2 (hu) 2021-09-28
PT3211005T (pt) 2021-06-15
DK3211005T3 (da) 2021-06-07
NZ590515A (en) 2013-01-25
US9550824B2 (en) 2017-01-24
PL2315777T3 (pl) 2017-10-31
HRP20210892T1 (hr) 2021-11-26
SI2315777T1 (sl) 2017-09-29
CY1124281T1 (el) 2022-07-22
CY1119185T1 (el) 2018-02-14
ZA201100446B (en) 2012-01-25
AU2009268025B2 (en) 2014-07-31
CN102143975A (zh) 2011-08-03
US20140220026A1 (en) 2014-08-07
JP2011527887A (ja) 2011-11-10
JP6109869B2 (ja) 2017-04-05
HUE033803T2 (en) 2018-01-29
WO2010003977A1 (en) 2010-01-14
CA2729869A1 (en) 2010-01-14
MX2010014319A (es) 2011-05-19
CN102143975B (zh) 2014-12-31
US20180057569A1 (en) 2018-03-01
BRPI0915667B1 (pt) 2020-10-13
EA201100160A1 (ru) 2011-08-30
JP2017158550A (ja) 2017-09-14
PT2315777T (pt) 2017-07-25
PL3211005T3 (pl) 2021-11-29
LT2315777T (lt) 2017-10-25
JP2015157812A (ja) 2015-09-03
AU2009268025A1 (en) 2010-01-14
US8715656B2 (en) 2014-05-06
EP3211005A1 (en) 2017-08-30
EP2315777A1 (en) 2011-05-04
KR20110031969A (ko) 2011-03-29
SI3211005T1 (sl) 2021-06-30
KR101682040B1 (ko) 2016-12-02
US20170107274A1 (en) 2017-04-20
HK1158232A1 (en) 2012-07-13
BRPI0915667B8 (pt) 2021-05-25
CA2729869C (en) 2018-02-13
US9815888B2 (en) 2017-11-14
JP6495361B2 (ja) 2019-04-03
EP2315777B1 (en) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230110249A1 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
EA024655B1 (ru) ЛИГАНД, СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С MSRV-ENV (ВАРИАНТЫ), ScFV И Fab ФРАГМЕНТЫ, АНТИТЕЛО, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, АНТИЛИГАНД И СПОСОБ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, НАБОР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US9951143B2 (en) Antibodies against immunogenic glycopeptides, compositions comprising the same and use thereof
AU2016201712B2 (en) ActRIIb antagonists and dosing and uses thereof
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;e&lt;/font&gt;
JP6277127B2 (ja) インスリン様成長因子１による細胞の活性化を阻害するための方法
US10851148B2 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
CN103282495B (zh) 新的抗dr5抗体
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв&#39;язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв&#39;язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв&#39;язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
CN106103481A (zh) 用于治疗人癌症的特异性抗cd38抗体
UA123390C2 (uk) Терапія і діагностика на основі білків тау-опосередковуваної патології при хворобі альцгеймера
CN107098970A (zh) 结合细胞内prl‑1多肽或prl‑3多肽的抗体
UA128330C2 (uk) Конструкція на основі біспецифічного антитіла, спрямована на muc17 і cd3
BR112020013475A2 (pt) Anticorpo de pd-l1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico do mesmo
CN107427550A (zh) 细胞穿透抗体
AU2017347822A1 (en) Use of beta-catenin as a biomarker for treating cancers using anti-Dkk-1 antibody
KR20220128332A (ko) Lilrb2에 대항하는 단일-도메인 항체
CN110494152A (zh) 短trail抗体及使用方法
US20220275075A1 (en) Methods and compositions for pdgf-cc inhibition
NZ751584A (en) Antibodies to mica and micb proteins
KR20160084177A (ko) 뮤턴트 루테리알에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 제조방법
NZ751584B2 (en) Antibodies to mica and micb proteins
NZ621515B2 (en) Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1

Legal Events

Date Code Title Description
PZ1A Registration of pledge of rights to a eurasian application
PZ1A Registration of pledge of rights to a eurasian application
HK9A Amendment to the eapo bulletin concerning published eurasian application