WO2008113916A2 - Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w - Google Patents
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- HERV-W human endogenous retroviruses W
- HERV-W envelope protein also called syncytin
- syncytin is a fusogenic glycoprotein involved in the formation of the syncytiotrophoblastic layer of the placenta. It is encoded by the env gene of the ERVW1 proviral locus and synthesized as a gPr73 precursor that is specifically cleaved into two mature proteins, a gp50 (TM) subunit gp50 (SU) and a transmembrane subunit.
- TM gp50
- SU transmembrane subunit
- syncytin In vitro, the syncytin of the HERV-W family induces a cell-to-cell fusion dependent on its interaction with an amino acid receptor-transporter of the ASCT family (h-ASCT2, hASCT1). Phylogenic studies have shown that syncytin is related to a group of retroviruses, including the endogenous RDI 14 cat virus, the endogenous BaEV monkey virus, simian retroviruses and avian retroviruses: avian reticuloendotheliosis virus REV-A and SNV spleen necrosis virus, all having in common the sodium-dependent neutral amino acid receptor-transporter type 2 or hASCT2 (Rasko et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA Vol 96 , pp.
- hASCT receptors are involved in the specific transport of neutral amino acids and that the neuronal cells, for the transmission of information, predominantly use neuromediators of a polypeptide nature.
- the binding of the Env-HERV-W protein to receptors normally expected to carry the amino acids required for the synthesis of neuromediators may affect the ability of neurons to synthesize neuromediators by reducing the entry of physiological agonists such as amino acids. via the ASCT receivers.
- neurons, whose inter-cellular networks form indispensable connections for the transmission of information circulating in the brain and the spinal cord, they form syncytia following a fusion of several neurons induced by the Env-HERV-W protein.
- antibodies which are not directed specifically at the binding site between the HERV-W envelope protein and a hASCT-type receptor are capable of block the interaction of the HERV-W envelope protein and a hASCT-type receptor, in particular the hASCT1 or hASCT2 receptor, and / or to inhibit the cell fusion induced by said protein.
- the subject of the present invention is a therapeutic composition
- a therapeutic composition comprising, as active substance or active principle, at least one antibody directed against the HERV-W envelope protein, to the exclusion of any antibody directed specifically against the binding site between said env protein and the hASCT1 or hASCT2 receptor, and a pharmaceutically acceptable carrier.
- composition is meant a diagnostic, prophylactic or therapeutic composition.
- Said at least one composition or antibody is capable of inhibiting the interaction of the envelope protein with a hASCT-type receptor and / or the fusogenic properties of said protein.
- said antibody is chosen from the antibodies directed against the C-terminal end, glycosylated or otherwise, of the SU region of said envelope protein and the antibodies directed against the transmembrane region (TM) of said envelope protein.
- TM transmembrane region
- One of the suitable antibodies that are directed against the C-terminus, glycosylated or otherwise, of the SU region of the HERV-W envelope protein is monoclonal antibody MoAb2 (also named IF1 IB10).
- one of the suitable antibodies that are directed against the transmembrane region of the HERV-W envelope protein is the polyclonal antibody
- a hASCT receptor such as the hASCT1 or hASCT2 receptor on the surface of cells which expresses said receiver.
- the aforementioned pathologies are pathologies of the nervous system or neuropsychiatric pathologies.
- the invention relates to the uses of at least one antibody in the treatment of said pathologies.
- the antibody when the antibody is directed against the C-terminus of the SU region of the HERV-W envelope protein, it is preferably the monoclonal antibody MoAb2; when the antibody is directed against the transmembrane region of the HERV-W envelope protein, it is preferably the PolAb2 polyclonal antibody.
- Another subject of the invention is an antibody directed against the HERV-W envelope protein, to the exclusion of any antibody specifically directed against the binding site between said env protein and a hASCT-type receptor, such as the hASCT1 or hASCT2 receptor, capable of inhibiting HERV-W env-induced cell fusion and / or inhibiting binding between the envelope protein
- HERV -W and a hASCT-type receptor such as the hASCT1 or hASCT2 receptor.
- a preferred antibody is directed against the C-terminus, glycosylated or otherwise, of the SU region of the HERV-W envelope protein. It is obtainable from a hybridoma derived from mouse splenocytes immunized with the HERV-W envelope gene, according to techniques which belong to the general knowledge of those skilled in the art. Such an antibody may consist of the monoclonal antibody MoAb2. Advantageously, said antibody is humanized. Still a preferred antibody is directed against the transmembrane region of the HERV-W envelope protein. Such an antibody may consist of the polyclonal antibody PolAb2.
- Example 1 Molecular and Phenotypic Characterization of Recombinant Envelopes; Construction and production of the HERV-W Envelope SU subunit.
- HERV-W envelope gene 538 amino acids
- a vector phCMVEnv-Gp60 allowing the expression of a soluble recombinant envelope protein has been designed.
- the soluble envelope (Gp60, 1-435) was constructed as described below:
- transmembrane (tm) and intracytoplasmic (CYT) regions corresponding to amino acids 436 to 538 have been deleted in order to obtain a soluble protein.
- composition spacer arm (GGGS) 3 followed by a polyhistidine tail (RGS-HHHHHH) was added at the C-terminal position to allow purification of this protein by IMAC and detection by an anti-monoclonal antibody.
- GGGS composition spacer arm
- RGS-HHHHHH polyhistidine tail
- Soluble SU is a C-terminal polyhistidine tail fusion protein of sequence RGS-HHHHHH immediately downstream of the AAAR sequence, to allow purification of this protein by IMAC and detection by an anti-histidine monoclonal antibody (Qiagen , RGS H6).
- FIG. 1 The schematic structure of the different proteins produced from the vectors phCMV-Env-W, phCMV-EnvGp60 and phCMV-EnvSU is illustrated in FIG.
- Example 2 Obtaining Monoclonal Antibodies Directed Against HERV-W Envelope Protein Immunization of the mice by DNA.
- mice Three six week old female BALB / c mice (IFF A-Credo) were immunized by direct injection of naked plasmid DNA (phCMV-env-W) containing the HERV-W envelope gene. The injections were made intradermally using a gun ("gene gun"). Five injections of 2 ⁇ g of DNA were first made for each mouse, followed by a booster with two injections of 4 ⁇ g of DNA. The sera were taken and the antibody titre for each serum was determined. The antibody titre being too weak, a cell lysate was prepared. Preparation of the cell lysate
- TeICeBo rhabdomyosarcoma cells (ATCC CRL8805) were transfected with plasmid phCMV-env-W. After twenty hours and presence of syncytia, a cell extract was made in PBS 0.5% Triton buffer. The extracts Proteins were dosed by Bradford. The concentration of anti-W-antigen corresponded to 9.5 ⁇ g / ⁇ l of total protein.
- mice were first injected with 10 ⁇ g of cell lysate intraperitoneally followed by a booster injection of 2 ⁇ 100 ⁇ g of cell lysate intraperitoneally.
- a new intravenous injection was carried out of 22 ⁇ g of the soluble envelope protein Gp60 obtained from the plasmid phCMV-Env-Gp60 as described in the example 1 previously purified, before injection, on Ni-NTA resin (Qiagen) according to the following conditions: fixation in phosphate buffer pH 8, washing in phosphate buffer pH 8 and in ammonium acetate pH 6, elution in acetate buffer ammonium pH 3.5 and concentration by speed vac.
- the eukaryotic Gp60 protein thus obtained were reserved for the intravenous injection described above.
- the supernatants of the hybridomas were tested by immunofluorescence on the transfected and fixed cells (TelCeb ⁇ ), the antibodies were screened by an ELISA functional test using the Env-W protein at a concentration of 9.2 ⁇ g / ⁇ l of total protein and an Env AS protein as a negative control at a concentration of 13.3 ⁇ g / ⁇ l of total proteins and the best performing antibodies were selected.
- the monoclonal antibody MoAb2 was thus obtained. It is a monoclonal antibody directed against the C-terminal portion of the SU region of the Env-HERV-W protein.
- Example 3 Study in an Animal Al Model of the In Vivo Formation of Syncytia During Potential Cell Transfections, by Plasmids Encoding Various EPS Proteins of the MSRV / HERV-W Family and the Inhibition of the Formation of Such Syncytia when injecting antibodies against these MSRV / HERV-W ENV proteins.
- DMEM medium Gibco Invitrogen 41966-029
- ATCC CRL8805- rhabdomyosarcoma cells South American serum - TelCeB6 cells
- IP Intraperitoneal injection
- the reading is immediate. It is performed after plating on grid chamber slides in the presence of trypan blue (exclusion of dead cells).
- the number of cells fused together by a grid field with a "large field” objective (40) allows the counting of more than one hundred cells in order to have statistically representative counting series.
- mice 3.3 Number of mice:
- Table 1 results on the animal model Al READ ECP CBleu Trvpan *): Direct reading fsvncvtia)
- Each number represents the number of cells viewed as merged by field of interest. Since some cells can be superimposed in the optical path, the count of cells appearing fused under the control conditions is therefore greater than zero.
- the reality of syncytia and discrimination with cell stacks was subsequently verified by staining the cells on the slide, with visualization of multiple cell nuclei included in a space delimited by the continuity of a single cell membrane. Moreover, photos showing cells in the course of fusion make it possible to objectify the reality of the fusion right from the phase contrast microscopy analysis and the total absence of an equivalent phenomenon in the controls.
- ENV expressed (409): 22 positives counted on average on 100 antisense ENV cells (410 not expressed): 9.5 positive counted on average on 100 cells
- the controls are therefore statistically equivalent and there is no "real" difference related to the type of control.
- Example 4 In Vivo Study, in an Animal Model A2, of the Binding of MSRV / HERV-W ENV Proteins to Cells with ASCT Type 1 or Type 2 Receptors and None, and the Inhibition of this Link to level of the plasma membrane by injection of antibodies directed against ENV proteins
- Soluble Protein 0.45 ⁇ m filtered supernatant containing the protein solubility (293T tranfected with plasmid 460 (envelope-spacer-His6) Expression verified by Western blotting with anti-RGS-His antibody
- Anti-SU rabbit polyclonal antibody (anti-peptide) (69) - Anti-TM rabbit polyclonal antibody (anti-peptide) (71) - Cells: XChASCT2 XC cell clone (ATCC CCL-165, rat cells) expressing the hASCT2 receiver
- Pellet taken up with 100 ⁇ l of anti-mouse-FITC antibody (dilution at 20 ° -DAKO, reference: F0479) in a PBA buffer), maintained at + 4 ° C.
- mice 4.3 Number of mice:
- the reality of cells having fixed the ENV protein on their ASCT 1 or 2 receptor was subsequently verified by cytofluorometric analysis.
- the ENV protein can bind to an ASCT1 receptor (ASCT1 cont) or
- ASCT2 ASCT2cont
- ASCT2cont present on the surface of the cells grafted on SCID mice versus the grafted control cells which have no receptor (Xcont) and, in fact, on which the ENV protein injected into the corresponding animals can not bind and does not give of membrane fluorescence in the presence of an anti-ENV antibody.
- ASCT1 AS CT1 cont
- ASCT2 ASCT2cont
- results obtained with the animals grafted with the cells expressing the ASCT1 or ASCT2 membrane receptors are statistically very significant compared to the results obtained with the control animals grafted with the cells that do not express any of these receptors on their surface.
- ASCT1 + and ASCT2 + models the difference in the number of positive cells between the ASCT2 model and the control is greater for ASCT2 + (p ⁇ 0.001).
- results obtained show a statistically very significant effect for the monoclonal antibody (probability of random result (p) overall less than 0.01).
- Those obtained with the polyclonal antibody are different from the results obtained previously with the animal model grafted with the ASCT1 + cells: these have a clearly significant effect (p ⁇ 0.001) on the binding to the ASCT2 receptor.
- the effect obtained in vivo in the presence of the protein ENV and antibodies, also validates the therapeutic effect on the animal model A2 / ASCT2 +.
Abstract
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV- W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2.
Description
COMPOSITION PHARMACEUTIQUE COMPRENANT DES ANTICORPS DIRIGES CONTRE L'ENVELOPPE DE HERV-W
Les rétrovirus endogènes humains (HERVs) constituent 8% du génome humain et sont impliqués à la fois dans des pathologies et dans des phénomènes non pathologiques.
La famille des rétrovirus endogènes humains W (HERV-W) est dérivée d'un élément rétroviral infectieux intégré dans la lignée germinale, il y a 25 à 40 millions d'années. La protéine d'enveloppe de HERV-W, appelée également syncytine, est une glycoprotéine fusogène impliquée dans la formation de la couche syncytiotrophoblastique du placenta. Elle est codée par le gène env du locus proviral ERVWl et synthétisée sous la forme d'un précurseur gPr73 qui est spécifiquement clivé en deux protéines matures, une sous unité de surface gp50 (SU) et une sous unité transmembranaires gp24 (TM). In vitro, la syncytine de la famille HERV-W induit une fusion cellule à cellule dépendante de son interaction avec un récepteur-transporteur d'acides aminés de la famille ASCT (h-ASCT2, hASCTl). Des études phylogéniques ont alors montré que la syncytine est apparentée à un groupe de rétrovirus, comprenant notamment le virus endogène du chat RDI 14, le virus endogène du singe BaEV, des rétrovirus simiens et des rétrovirus aviaires : virus de la réticuloendothéliose aviaire REV-A et virus de la nécrose de la rate SNV, ayant tous en commun le récepteur-transporteur d'acides aminés neutres sodium-dépendants de type 2 ou hASCT2 (Rasko et al, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. 2129-2134; Tailor et al, 1999 JOURNAL OF VIROLOGY, VOL 73(5) May 1999, p. 4470-4474). Ainsi, l'infection de cellules par des virus de ce groupe de rétrovirus conduit à une réduction spécifique du transport des acides aminés (Rasko et al, 1999). L'infection d'une cellule par un de ces rétrovirus (ou l'expression dans la cellule de l'une de ces enveloppes) empêche, par interférence (interaction) vis à vis d'un récepteur de la famille ASCT, l'infection de cette même cellule par un autre de ces rétrovirus ou la fusion avec une autre cellule exprimant une autre enveloppe. Par interférence vis-à-vis d'un récepteur de la famille ASCT, l'infection d'une cellule par un de ces rétrovirus empêche l'infection par un autre de ces rétrovirus. Tous ces rétrovirus appartiennent au même groupe d'interférence du virus HERV-W.
Les mécanismes de liaisons entre l'enveloppe et le récepteur ASCT restent obscurs. Cette thématique est pourtant essentielle puisque l'inhibition de l'interaction enveloppe / récepteur ASCT permettrait en outre d'empêcher l'entrée d'un rétrovirus
dans la cellule, et donc de bloquer son cycle de réplication, de bloquer le phénomène d'interaction enveloppe / récepteur ASCT et/ou de fusion cellulaire pouvant être impliqué dans la formation de tumeurs, dans la prolifération de cellules métastasiques ou dans des phénomènes de résistance à des médicaments (voir à titre d'illustration la publication « CeIl fusion : A hidden enemy ?, Cancer CeIl : May 2003 Vol.3), de bloquer le phénomène d'interaction enveloppe / récepteur ASCT et/ou de fusion cellulaire pouvant intervenir dans des maladies du système nerveux voire d'inhiber la fusion cellule-cellule impliquée dans la différenciation trophoblastique. De plus, l'inhibition de l'interaction enveloppe / récepteur hASCT pourrait empêcher la propagation de tumeur en s'opposant à une immunosuppression locale pouvant découler de l'interaction enveloppe / récepteur hASCT. En effet, il a été montré d'une part que l'infection de cellules par des virus de ce groupe de rétrovirus (notamment ceux induisant des immunodéficiences) conduit à une réduction spécifique du transport des acides aminés (Rasko et al, 1999), et d'autre part il est proposé un lien direct entre l'altération du transport des acides aminés et l' immunosuppression (Espinosa et al., 2000; Rasko et al, 1999). Ainsi, concernant les maladies du système nerveux, il est connu que les récepteurs hASCT sont impliqués dans le transport spécifique d'acides aminés neutres et que les cellules neuronales, pour la transmission des informations, utilisent de manière prépondérante des neuromédiateurs de nature polypeptidique. Ainsi, la liaison de la protéine Env-HERV-W à des récepteurs devant normalement transporter les acides aminés requis pour la synthèse des neuromédiateurs peut affecter la capacité des neurones à synthétiser les neuromédiateurs en réduisant l'entrée des agonistes physiologiques que sont les acides aminés via les récepteurs ASCT. Par ailleurs, si des neurones, dont les réseaux inter-cellulaires forment des connexions indispensables à la transmission des informations circulant dans le cerveau et la moelle épinière, forment des syncytia suite à une fusion de plusieurs neurones induite par la protéine Env-HERV-W, tous les réseaux de transmission des informations se trouvent perturbés et connectés au même « paquet cellulaire » fusionné et de plus l'activité de production des neuromédiateurs de chaque cellule n'est plus individualisée, ni connectée aux voies de conduction amont et aval (dendrites et axones) qui lui sont propres.
Il est montré maintenant et de manière surprenante que des anticorps qui ne sont pas dirigés spécifiquement contre le site de liaison entre la protéine d'enveloppe de HERV-W et un récepteur de type hASCT, notamment le récepteur hASCT 1 ou hASCT2, sont capables de bloquer l'interaction de la protéine d'enveloppe HERV-W et
un récepteur de type hASCT, notamment le récepteur hASCTl ou hASCT2, et/ou d'inhiber la fusion cellulaire induite par ladite protéine.
Aussi, la présente invention a pour objet une composition thérapeutique comprenant, à titre de substance active ou de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par composition pharmaceutique, on entend une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique. Ladite composition ou ledit anticorps au moins est capable d'inhiber l'interaction de la protéine d'enveloppe avec un récepteur de type hASCT et/ou les propriétés fusogènes de ladite protéine.
Selon une variante de l'invention, ledit anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe. Un des anticorps adaptés qui sont dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W est l'anticorps monoclonal MoAb2 (aussi nommé IFl IBlO). En combinaison ou en variante, un des anticorps adaptés qui sont dirigés contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W est l'anticorps polyclonal
PolAb2 (aussi référencé 71).
Compte tenu de leurs propriétés, les anticorps ci-dessus trouvent, selon l'invention, les applications suivantes.
Ainsi, font partie de l'invention, les utilisations suivantes : une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies associées à une interaction de l'enveloppe de HERV-W et d'un récepteur hASCT; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée à traiter des pathologies associées à la cascade proinflammatoire induite par l'expression de MSRV/HERV-W; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée à inhiber la fusion cellulaire induite par la protéine env de HERV-W; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée à inhiber la liaison entre ladite protéine env et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCTl ou hASCT2 à la surface des cellules qui
exprime ledit récepteur.
Les pathologies précitées sont des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques. A titre d'illustration, on peut citer l'article de S. Weis et al., J Neural Transm. 2007 Feb;114(2):261-71, associant une altération de l'expression des récepteurs précités dans la schizophrénie, la psychose maniacodépressive et des dépressions majeures. Ainsi, l'invention concerne les utilisations d'au moins un anticorps dans le traitement desdites pathologies.
Selon des variantes d'utilisation selon l'invention, lorsque l'anticorps est dirigé contre l'extrémité C-terminale de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV- W, il est de préférence l'anticorps monoclonal MoAb2; lorsque l'anticorps est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W, il est de préférence l'anticorps polyclonal PolAb2.
Un autre objet de l'invention est un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCTl ou hASCT2, capable d'inhiber la fusion cellulaire induite par la protéine env de HERV-W et/ou d'inhiber la liaison entre la protéine d'enveloppe de
HERV -W et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCTl ou hASCT2.
Un anticorps préférentiel est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W. Il est, susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W, selon des techniques qui appartiennent aux connaissances générales de l'homme du métier. Un tel anticorps peut consister en l'anticorps monoclonal MoAb2. Avantageusement, ledit anticorps est humanisé. Encore un anticorps préférentiel est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W. Un tel anticorps peut consister en l'anticorps polyclonal PolAb2.
Exemple 1: caractérisation moléculaire et phénotypique d'enveloppes recombinantes ; Construction et production de la sous-unité SU d'enveloppe HERV-W.
A partir du vecteur d'expression phCMV-Env-W (Blond J Virol, Vol
74(7) :3321-3329, 2000) contenant le gène de l'enveloppe HERV-W (538 acides aminés) (clone PH74, Blond et al J Virol Vol 73(2) : 1175-1185, 1999), un vecteur phCMVEnv-Gp60 permettant l'expression d'une protéine d'enveloppe recombinante soluble a été conçu.
L'enveloppe soluble (Gp60, 1-435) a été construite comme décrit ci dessous:
(1) le site de clivage natif RNKR (AA 314 à 317) entre les sous-unités SU et TM a été muté en AAAR, afin de permettre la production d'une protéine de fusion stable et non de deux sous-unités SU-TM clivées puis ré-associées par un pont disulfure.
(2) Les régions transmembranaire (tm) et intracytoplasmique (CYT) correspondant aux acides aminés 436 à 538 on été supprimées afin d'obtenir une protéine soluble.
(3) Un bras espaceur de composition (GGGS)3 suivi d'une queue polyhistidine (RGS-HHHHHH) ont été ajoutés en position C-terminale, afin de permettre la purification de cette protéine par IMAC et la détection par un anticorps monoclonal anti-histidine (Qiagen, RGS H6).
A partir du vecteur phCMVEnv-Gp60 exprimant l'enveloppe soluble, le vecteur phCMV-EnvSU a été construit, permettant la production d'une protéine SU. La SU soluble est une protéine de fusion contenant une queue polyhistidine C-terminale de séquence RGS-HHHHHH immédiatement en aval de la séquence AAAR, afin de permettre la purification de cette protéine par IMAC et la détection par un anticorps monoclonal anti-histidine (Qiagen, RGS H6).
La structure schématique des différentes protéines produites à partir des vecteurs phCMV-Env-W, phCMV-EnvGp60 et phCMV-EnvSU est illustrée en figure 1.
Exemple 2 : Obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine d'enveloppe de HERV-W. Immunisation des souris par ADN.
Trois souris BALB/c femelles de six semaines (IFF A-Credo) ont été immunisées par injection directe d'ADN plasmidique nu (phCMV-env-W) contenant le gène de l'enveloppe HERV-W. Les injections ont été réalisées par voie intra-dermique à l'aide d'un pistolet (« gène gun »). Cinq injections de 2 μg d'ADN ont d'abord été effectuées pour chaque souris, suivies d'un rappel avec deux injections de 4 μg d'ADN. Les sérums ont été prélevés et le titre en anticorps pour chaque sérum a été déterminé. Le titre en anticorps étant trop faible, un lysat cellulaire a été préparé. Préparation du lysat cellulaire.
Les cellules de rhabdomyosarcome TeICeBo (ATCC CRL8805) ont été transfectées par le plasmide phCMV-env-W. Après une vingtaine d'heures et présence de syncytia, un extrait cellulaire a été réalisé en tampon PBS 0,5% Triton. Les extraits
protéiques ont été dosés par Bradford. La concentration en antigène env-W correspondait à 9,5 μg/μl de protéines totales.
Immunisation des souris par extrait de lysat cellulaire.
Les mêmes souris ont tout d'abord reçu une injection de 10 μg de lysat cellulaire par voie intrapéritonéale suivie d'une injection de rappel de 2 x 100 μg de lysat cellulaire par voie intrapéritonéale. Trois jours avant la fusion avec les cellules de myélome une nouvelle injection a été effectuée, par voie intra-veineuse, de 22 μg de la protéine d'enveloppe soluble Gp60 obtenue à partir du plasmide phCMV-Env-Gp60 comme décrit à l'exemple 1 préalablement purifiée, avant injection, sur résine Ni-NTA (Qiagen) selon les conditions suivantes : fixation en tampon phosphate pH 8, lavages en tampon phosphate pH 8 et en acétate d'ammonium pH 6, élution en tampon d'acétate d'ammonium pH 3,5 et concentration par speed vac. 47 μg de la protéine Gp60 eucaryote ainsi obtenue ont été réservés pour l'injection par voie intra-veineuse décrite ci-dessus. Après fusion, les surnageants des hybridomes ont été testés par immuno fluorescence sur les cellules transfectées et fixées (TelCebό), les anticorps ont été criblés par un test fonctionnel en ELISA en utilisant la protéine Env-W à une concentration de 9,2 μg/μl de protéines totales et une protéine Env AS comme contrôle négatif à une concentration de 13,3 μg/μl de protéines totales et les anticorps les plus performants ont été sélectionnés. L'anticorps monoclonal MoAb2 a ainsi été obtenu. C'est un anticorps monoclonal dirigé contre la partie C-terminale de la région SU de la protéine Env- HERV-W.
Exemple 3: étude dans un modèle Animal Al de la formation in vivo de syncytia lors de transfections de cellules susceptibles, par des plasmides codant pour différentes protéines ENV de la famille MSRV/HERV-W et de l'inhibition de la formation de tels syncytia lors d'injection d'anticorps dirigés contre ces protéines ENV MSRV/HERV-W.
3.1 Matériel :
Cellules en boite 100 mm de diamètre à confluence
- Kit LipofectAMINE PLUS™ (Gibco Invitrogen)
Milieu DMEM (Gibco Invitrogen 41966-029) avec du sérum Amérique du Sud - Cellules TelCeB6 (ATCC CRL8805- cellules rhabdomyosarcome )
- ADNs : 409 (enveloppe W clonée en sens) 2μg/μl
410 (enveloppe W clonée en antisens ) l,5μgμl LQMV (enveloppe mutée non fusogène) l,3μg/μl
3.2 Protocole : 1er Jour : Mise en culture des Cellules
Inoculation des boites de diamètre de 100 mm -» 50-70% de confluence pour les TeICeBo
Incubation en milieu complémenté (6 ml par boite) 24h à 37°C sous 5% CO2 2ème Jour : Transfection - Kit LipofectAMINE PLUS™ a) Précomplexation de l'ADN
Mélange de 750μl de milieu non-complémenté avec les ADNs dans un tube falcon 15ml (référence 2096)
- Soit 2μl de 409 ou 3 μl de 410 ou 3 μl LQMV - Agitation sous Vortex du PLUS Reagent et en ajouter 20μl à la solution d'ADN
Agitation sous Vortex immédiatement 10 sec à 1400 tours/minutes Incubation 15 min à température ambiante b) Préparation des cellules - Remplacement par 5ml de milieu non-complémenté c) Dilution de la Lipofectamine
Dans un tube et pour une boite, mélange de 30 μl de LipofectAMINE Reagent avec 750 μl de milieu non-complémenté d) Complexation de l'ADN - Mélange des 780 μl de Lipofectamine diluée et des 772 μl de solution d'ADN pré-complexé
Agitation sous Vortex immédiatement 10 sec à 1400 tours/minutes
- Incubation 15 min à température ambiante e) Transfection et obtention d'animaux receveurs greffés avec les cellules cibles, traités ou non par injection d'anticorps anti-ENV.
- Dépose des 1552 μl dans une boite Incubation 2-3 heures à 37°C sous 5% CO2
Remplacement du milieu de transfection par 6ml de milieu complémenté - Incubation Ih à 37°C sous 5% CO2
Injection par voie intrapéritonéale (IP) aux souris SCID (sous un
volume de 1 ml), l/5eme de chaque boite à 70% de confluence, avec ou sans injection supplémentaire d'anticorps anti-protéines ENV MSRV/HERV-W (anticorps : MoAb2, PoI Ab2, 69 et 71 au 1/100)
Obtention d'animaux tolérant la greffe et permettant la dissémination des cellules greffées dans l'organisme, parallèlement à l'établissement dune pseudo-ascite dans la cavité péritonéale. 3éme Jour :
Prélèvement des cellules de chaque animal par lavage péritonéal: °injection d'abord de 2 ml d'air suivie de 2ml de sérum physiologique puis massage et récupération des 2ml de liquide péritonéal (protocole original mis au point pour la récupération chez l'animal greffé des cellules implantées dans la cavité péritonéale)
Observation au microscope « phase inverse » avec comptage des syncytia et/ou après coloration sur lame.
La lecture est immédiate. Elle est effectuée après étalement sur des lames à chambre quadrillée en présence de bleu Trypan (exclusion des cellules mortes). On dénombre le nombre de cellules ayant fusionné entre elles par champ quadrillé avec un objectif « grand champ » (40) permettant d'établir le comptage sur plus d'une centaine de cellules afin de disposer de séries de comptage statistiquement représentatives.
Un aliquot cellulaire de chaque prélèvement est fixé en présence méthanol/acétone (v/v) puis conservé à -20°C jusqu'à coloration au cristal violet (1%). Ces lames colorées ont fait l'objet de prises photographiques.
3.3 Nombre de souris :
Des lots de 2 souris seront inoculés avec : - Les cellules transfectées avec les trois types de plasmide (2 codants et un antisens pour contrôle) sans anticorps (3x2=6 souris)
- Les trois types de cellules transfectées et l'anticorps monoclonal MoAb2 (3x2=6 souris)
- Les trois types de cellules transfectées et un anticorps polyclonal anti TM PolAb2 (3x2=6 souris)
3.4 Résultats :
Les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1 des résultats sur le modèle animal Al LECTURE ECP CBleu Trvpan*) : Lecture directe fsvncvtia)
(nombre de cellules fusionnées, lecture sur chambre de numération quadrillée pour 100 cellules)
Lignées Numération Numération Moyenne
Sl * S2*
409cont. 19 22 22 409MoAb2 1 3 2
409PolAb2 9 9 9
410cont. 8 11 9.5
410MoAb2 3 5 4 410polAb2 9 14 11.5
LQMVcont. 8 5 6.5
LQMVMoAb2 4 2 3
LQMVPolAb2 8 4 6
*S1, S2 = Souris 1, Souris 2
Bleu Trypan: exclusion des cellules mortes
Chaque chiffre représente le nombre de cellules visualisées comme fusionnées par champ étudié. Certaines cellules pouvant être superposées dans le trajet optique, le compte des cellules apparaissant fusionnées dans les conditions témoins est donc supérieur à zéro. La réalité des syncytia et la discrimination avec des empilements de cellules a par la suite été vérifié par coloration des cellules sur lame, avec visualisation de multiples noyaux cellulaires inclus dans un espace délimité par la continuité d'une seule et unique membrane cellulaire. Par ailleurs des photos montrant des cellules en cours de fusion permettent d'objectiver la réalité de la fusion dès l'analyse en microscopie en contraste de phase et l'absence totale de phénomène équivalent dans les contrôles.
Cependant, pour objectiver statistiquement l'analyse primaire représentée par les chiffres indiqués dans le tableau des résultats du modèle animal Al, nous avons procédé à un test de Chi-2 pour comparer les données relevées dans les conditions où
(i) la protéine ENV est correctement exprimée (409) versus les contrôles où elle ne s'exprime pas (410) ou est mutée de façon à réduire son effet fusogène (LQMV)et (ii) où la protéine est correctement exprimée (409) sans injection d'anticorps anti-ENV versus injection de différents anticorps. Ainsi, les résultats de l'analyse statistique qui tient compte du « bruit de fond » de la lecture primaire, sans analyse secondaire après coloration sur lame ou recherche de cellules typiques en cours de fusion (n'étant jamais vues dans les contrôles, sont les suivants.
Validation statistique de la spécificité de l'effet pathogène in vivo :
ENV exprimée (409) : 22 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules ENV antisens (410 non exprimée) : 9,5 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules
- ENV mutée (LQMV activité supprimée) : 6,5 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules
- Moyenne des contrôles (410 et LQMV): 9,5+6,5/2= 8% 1 ) ENV versus contrôle 410 : Chi-2 = 5,89 (p< 0.02)
2) ENV versus contrôle LQMV : Chi-2 = 9,83(p< 0.002)
3) ENV versus tous contrôle (410 et LQMV) : Chi-2 = 7,69 (p< 0.01 ) 4) contrôle 410 versus contrôle LQMV : Chi-2 = 0,61 (Différence Non
Significative).
Les contrôles sont donc bien statistiquement équivalents et il n'y a pas de différence « réelle » liée au type de contrôle.
Les résultats obtenus dès ce stade de l'analyse (en n'excluant pas le bruit de fond lié aux images artéfactuelles et en comparant entre eux les deux types de contrôles qui s'avèrent équivalents) est statistiquement très significatif (globalement p<0,01). Les analyses ultérieures par coloration de la spécificité des effets ne font donc que confirmer la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV, validant ainsi le modèle animal Al pour la production et l'étude in vivo de syncytia dont la fusion a été induite par ENV HERV-W.
Validation statistique de l'activité thérapeutique des anticorps testés sur l'effet pathogène in vivo :
- ENV exprimée (409) + anticorps monoclonal MobAb2 (409MoAb2) : 2 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules
- ENV exprimée (409) + anticorps polyclonal 71 (409PolAb2) : 9 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules
1) ENV seul versus injection anticorps MoAb2 : Chi-2 = 18,94(p< 0.001)
2) ENV seul versus injection anticorps PolAb2 : Chi-2 = 6,45 (p< 0.05)
Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement très inférieur à 0,001). (Chi-2 =18,94). Les analyses ultérieures par coloration de la spécificité des effets confirment, ici aussi, la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV et d'anticorps, validant ainsi l'effet thérapeutique sur le modèle animal Al.
Exemple 4 : Etude in vivo, dans un modèle animal A2, de la liaison des protéines ENV MSRV/HERV-W aux cellules possédant des récepteurs ASCT de type 1 ou 2 ou n'en possédant pas et de l'inhibition de cette liaison au niveau de Ia membrane plasmique par injection d'anticorps dirigés contre les protéines ENV
MSRV/HERV-W.
4.1 Matériel :
- Protéine soluble : surnageant filtré sur 0,45 μm contenant la protéine so lubie (293T tranfectées avec le plasmide 460 (enveloppe-spacer-His6). Expression vérifiée par Western blot avec un anticorps anti- RGS-His Les anticorps :
Anticorps polyclonal de lapin (anti-peptide) anti-SU (69) - Anticorps polyclonal de lapin (anti-peptide) anti-TM (71) - Les cellules : XChASCT2 Clone cellulaire XC (ATCC CCL- 165, cellules de rat) exprimant le récepteur hASCT2
Milieu DMEM (Gibco Invitrogen 41966-029) avec du sérum Amérique du Sud
Pré-incubation, incubation, marquage en tube Eppendorf 1,5ml
4.2 Protocole : a) Inoculation IP des cellules XChASCTl, XChASCT2 et de cellules témoins XC (ASCT-) à des souris SCID
Injection aux souris de l/5eme de flacon à 70% de confluence sous un volume de 2ml. b) Pré-incubation
Incubation du surnageant protéine soluble (surnageant filtré de la lignée 293T) avec les anticorps (2H1H8, IFl IBlO, 69 et 71)
990μl de surnageant avec lOμl d'anticorps (dilution au 100 ème) 1 heure à 37°C dans l'incubateur des cellules avec une agitation de temps en temps (toutes les 15 minutes)
Inoculation des protéines seules ou avec des anticorps, en IP aux souris greffées avec les cellules (1 106 cellules par point soit 1/5 d'une boite 0100mm confluente).
Après injection des anticorps (200 microlitres) maintien en IP, pendant 6 heures, avec un massage péritonéal de temps en temps (toutes les 30-60 minutes) c) Récupération des cellules par lavage péritonéal des souris greffées
Centrifugation 3000 tours pendant 5 minutes à +4°C Récupération du culot cellulaire et dilution dans les milieux de • marquage (maintien à +4 °C jusqu'à fixation) d) Marquage Anticorps primaire :
- Culot repris par lOOμl d'anticorps anti-RGS His (dilution au 100ème- Qiagen) dans un tampon PBA (PBS avec 2% Sérum de veau fœtal et 0,1% azide de sodium), maintenu à +4°C.
1 heure dans la glace avec une agitation de temps en temps (toutes les 15minutes) lavage en tampon PBA (ImI par tube), maintenu à +4°C. Anticorps secondaire :
- Centrifugation 3000 tours pendant 5 minutes à +4°C
Culot repris par lOOμl d'anticorps anti-souris-FITC (dilution au 20έme-DAKO, référence : F0479) dans un tampon PBA), maintenu à +4°C.
1 heure dans la glace avec une agitation de temps en temps (toutes les 15 minutes)
2 lavages en tampon PBA (ImI par tube), maintenu à +4°C. culot repris par 500μl de PBA), maintenu à +4°C. et analyse par FACS. Alternativement analyse par IF après fixation sur lame en acétone/méthanol (50%/50%) à -20°C et contre-coloration au bleu EVANS.
4.3 Nombre de souris :
Des lots de 2 souris seront inoculés avec :
- Avec chaque type de cellules (exprimant les 2 types de récepteurs ASCTl et ASCT2 et une n'en exprimant pas pour contrôle) sans anticorps (3x2=6 souris)
-Les trois types de cellules avec la protéine ENV et l'anticorps monoclonal en (3x2=6 souris)
Les trois types de cellules avec la protéine ENV et un anticorps polyclonal anti TM (3x2=6 souris)
4.4 Résultats : Les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau 2 ci-dessous :
Tableau 2 des résultats du modèle Animal A2
LECTURE IF (microscope)
(nombre de cellules fluorescentes/total dans un même champ, nombre de cellules indiquées dans le tableau)
Lignée Nbre cell.fluo/total moyennes
Xcont. 1/18, 0/10 = 1/28 XXMMooAAbb22 00//1100,, 00//1122,, 11//1166 = 1/38
XPolAb2 3/25, 2/40 = 5/65
ASCTlcont. 12/40, 3/12, 9/25 = 24/77
ASCTl MoAb2 1/50, 0/30 = 1/80 AASSCCTTllPPoollAAbb22 66//3377 = 6/37
ASCT2cont. 8/22, 15/35 = 23/57
ASCT2MoAb2 3/28 = 3/28
ASCT2PolAb2 2/36 = 2/36
Chaque chiffre représente le nombre de cellules visualisées comme fluorescentes par champ étudié. Certaines cellules pouvant avoir fixé une fluorescence de manière non spécifique, le compte des cellules apparaissant fluorescentes dans les conditions témoins est donc supérieur à zéro dans un des deux champs compté (moyenne des deux champs = 1/28, soit 0,036%, ce qui est tout à fait correct pour le bruit de fond d'une telle technique de lecture). La réalité des cellules ayant fixé de la
protéine ENV sur leur récepteur ASCT 1 ou 2 a par la suite été vérifiée par analyse cytofluorométrique.
Pour objectiver statistiquement l'analyse présentée dans le tableau des résultats du modèle animal A2, un test de Chi-2 a été réalisé pour comparer les données relevées dans les conditions où :
(i) la protéine ENV peut se fixer sur un récepteur ASCTl (ASCTl cont) ou
ASCT2 (ASCT2cont) présent à la surface des cellules greffées sur souris SCID versus les cellules contrôles greffées qui n'ont aucun récepteur (Xcont) et, de fait, sur lesquelles la protéine ENV injectée aux animaux correspondants ne peut se fixer et ne donne pas de fluorescence membranaire en présence d'un anticorps anti-ENV. et (ii) où la protéine ENV peut se fixer sur un récepteur ASCTl (AS CTl cont) ou ASCT2 (ASCT2cont) présent à la surface des cellules greffées sur souris SCID versus injection d'anticorps.
Ainsi, les résultats de l'analyse statistique sont les suivants.
Validation statistique de Ia spécificité de l'effet pathogène in vivo :
- ASCTl cont : 24 positifs comptés en moyenne sur 77 cellules ASCT2cont : 23 positifs comptés en moyenne sur 57 cellules
- Cellules ASCT Négatives (Xcont): 1 positif compté en moyenne sur 28 cellules
1) ENV+greffes ASCTl versus contrôle ASCT NEGATIVES Xcont : Chi-2 = 8,62(p< 0.01)
2) ENV+greffes ASCT2 versus contrôle ASCT NEGATIVES Xcont : Chi-2 = 12,53(p< 0.001) 3) ENV+greffes ASCTl versus ENV+greffes ASCT2:
Chi-2 = 1,21 (Différence Non Significative). Les cellules exprimant les récepteurs ASCTl ou ASCT2 à leur surface sont donc bien statistiquement équivalentes et il n'y a pas de différence de liaison de ENV sur le récepteur liée au sous-type 1 ou 2, dans les conditions de ce modèle animal A2.
Les résultats obtenus avec les animaux greffés avec les cellules exprimant les récepteurs membranaires ASCTl ou ASCT2 sont statistiquement très significatif au regard des résultats obtenus avec les animaux contrôles greffés avec les cellules n'exprimant aucun de ces récepteurs à leur surface. Cependant, bien qu'il ne soit pas mis en évidence de différence statistique entre les modèles ASCT1+ et ASCT2+, la
différence du nombre de cellules positives entre le modèle ASCT2 et le contrôle est plus importante pour ASCT2+ (p<0,001).
Ces résultats confirment la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV dans les modèles A2/ASCT1+ et A2/ASCT2+.
Validation statistique de l'activité thérapeutique des anticorps testés sur l'effet pathogène in vivo :
Modèle A2/ASCT1+
- ENV+greffes ASCTl : 24 positifs comptés en moyenne sur 77 cellules - ENV+greffes ASCTl + anticorps monoclonal MobAb2 (MoAb2) : 1 positifs comptés en moyenne sur 80 cellules
- ENV+greffes ASCTl + anticorps polyclonal 71(PolAb2) : 6 positifs comptés en moyenne sur 37 cellules
1) ENV+greffes ASCTl seul versus injection anticorps MoAb2 : Chi-2 =
26,23(p< 0.001)
2) ENV+greffes ASCTl seul versus injection anticorps
3) ENV+greffes ASCTl seul versus injection anticorps PolAb2 : Chi-2 = 2,88 (Différence Non Significative).
Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement très inférieure à 0,001) (Chi-2 =26,23). Ceux obtenus avec l'anticorps polyclonal sont non- significatifs. Les analyses confirment, ici aussi, la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV et d'anticorps, validant ainsi l'effet thérapeutique sur le modèle animal A2/ASCT1+ avec des anticorps Monoclonaux. Cependant, à la grande différence du modèle animal Al et ce, ce manière inattendue, seuls des monoclonaux sont efficaces pour inhiber la liaison de la protéine ENV HERV-W injectée à l'animal sous forme de protéine extracellulaire.
Modèle A2/ASCT2+
- ENV+greffes ASCT2: 23 positifs comptés en moyenne sur 57 cellules
- ENV+greffes ASCT2 + anticorps monoclonal (409MoAb2) : 3 positifs comptés en moyenne sur 28 cellules - ENV+greffes ASCT2 + anticorps polyclonal (409PolAb2) : 2 positifs comptés en moyenne sur 36 cellules
1) ENV+greffes ASCT2 seul versus injection anticorps MoAb2 : Chi-2 = 7,77(p< 0.01)
2) ENV+greffes ASCT2 seul versus injection anticorps PoI Ab2 : Chi-2 = 13,59 (p< 0.001)
Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement inférieur à 0,01). Ceux obtenus avec l'anticorps polyclonal sont différents des résultats obtenus précédemment avec le modèle animal greffé avec les cellules ASCT1+: ceux-ci présentant un effet nettement significatif (p<0,001) sur la liaison au récepteur ASCT2. L'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV et d'anticorps, valide aussi l'effet thérapeutique sur le modèle animal A2/ASCT2+.
Ainsi, en ayant validé les modèles animaux Al et A2 (A2/ASCT1+ et A2/ASCT2+) contre les témoins appropriés, il a été trouvé que des anticorps monoclonaux testés sur ces modèles animaux ont une activité thérapeutique potentielle en inhibant très significativement les effets pathogéniques de la protéine ENV HERV-
W.
Claims
1. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit anticorps est susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W.
5. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit anticorps est humanisé.
7. Utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2, pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques, lesdites pathologies étant associées à une interaction de l'enveloppe de HERV-W et d'un récepteur hASCT.
8. Utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2, pour préparer une composition pharmaceutique destinée à traiter des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques, lesdites pathologies étant associées à la cascade proinflammatoire induite par l'expression de MSRV/HERV-W.
9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique est destinée à traiter une pathologie choisie parmi la schizophrénie, la psychose maniacodépressive et les dépressions majeures.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendication 7 à 9, caractérisée en ce que l'anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que l'anticorps est humanisé.
12. Anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCTl ou hASCT2, ledit anticorps étantt choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
13. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
14. Anticorps selon la revendication 13, susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de cellules de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W.
15. Anticorps selon la revendication 12 à 14, caractérisé en ce qu'il est humanisé.
16. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
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