CN110225766A - 嵌合抗原受体和组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了靶向人类LHR、B7‑H4、HLA‑G或HLA‑DR的新颖的嵌合抗原受体（CAR），以及其治疗性使用方法。LHR、B7‑H4、HLA‑G或HLA‑DR在许多人类癌症的范围中表达，该癌症包括甲状腺、前列腺、结肠、乳腺和肾的癌症，以及B‑细胞白血病和淋巴瘤。

Description

嵌合抗原受体和组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年09月23日提交的美国临时申请62/399,244的优先权，其内容通过引用方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及新颖的促黄体激素受体(LHR)、B7-H4、HLA-G或HLA-DR嵌合抗原受体(CAR)，包含其的细胞或组合物，以及将其用于包括实体肿瘤的治疗的方法。本发明还在此提供了分离的肽和融合蛋白，其含有用于促黄体激素受体、B7-H4、HLA-G或HLA-DR嵌合抗原受体的免疫原性决定簇。
背景技术
本发明背景的以下讨论仅仅被提供来帮助读者理解本发明，而不是承认示出或构成了本发明的现有技术。
卵巢癌是妇科肿瘤导致癌症死亡的最常见原因(Siegel,R.et al.(2012)CACancer J.Clin.62:10-29)。预计每年在美国大约出现25,000例新病例和14,000例死亡(Siegel,R.et al.(2012)CA Cancer J.Clin.62:10-29)。卵巢癌的整体存活期在过去30年中似乎有所改善，因为与当前的38个月相比，在20世纪60年代期间的中位生存期约为12个月。然而，III期卵巢癌的5年生存率并没有显著变化，并且仍然保持在25％。中位生存期中的改善可以被部分地解释为由于前线化疗中的改善。用于患有卵巢癌的患者的标准初始化疗涉及基于铂-紫杉醇的方案(Marcus,C.S.et al.(2014)J.Cancer 5:25-30)。大约70％的患者将取得对该疗法的临床反应。尽管如此，大多数女性将复发并最终死于其疾病。因此，在减少远处转移、延长复发时间并提高总体存活率的尝试中，至关重要的是识别新的治疗靶点并开发新的药物。
在2014年，估计232,670例浸润性乳腺癌新病例将在美国女性中被诊断，并且估计40,000名美国女性将死于转移性疾病。感染乳腺癌的风险随着年龄而增加，从而77％的病例在诊断时超过了50岁。通常，由于更早的检出、改善的治疗以及可能降低的发病率(由于绝经后的激素疗法的应用减少)，自1989年以来患有乳腺癌的患者的死亡率已经降低了。当早期发现时，局部乳腺癌的5年生存率为99％。相比之下，区域性疾病的5年生存率为84％，并且重要的是对于转移性疾病其急剧下降至24％。
今年在美国估计63,920名成年人(39,140名男性和24,780名女性)将被诊断为肾癌。据估计，今年将出现13,860例(8,900名男性和4,960名女性)死亡病例来自这种疾病。肾癌是男性第六大常见癌症，并且也是癌症死亡的第十大常见原因，而且它也是女性癌症的第八大常见原因。肾癌患者的五年存活率为72％。大约63％的病例在诊断时没有转移性疾病。对于这一群体，五年生存率改善至92％。相反，对于在肾盂中的肾癌(转移性疾病)的五年存活率为51％。
因此，有需要研发卵巢癌和其他实体肿瘤(例如前列腺癌)的安全和有效的治疗。本发明满足该需要并提供了相关的优点。
发明内容
由于最近使用利用基因工程化嵌合抗原受体(CAR)T-细胞的自体治疗在B细胞淋巴瘤和白血病中获得了空前的效果，许多实验室已经开始将这种方法应用至包括卵巢癌的实体肿瘤。CAR修饰的T-细胞将单克隆抗体的HLA-非依赖的靶向特异性与被激活的T细胞的细胞溶解活性、增殖和归巢特性结合，但不响应于检查点抑制。由于它们直接杀死表达靶标的抗原的能力，CAR T-细胞对任何抗原阳性细胞或组织都是高度毒性的，使得有需要构建具有高度肿瘤特异性抗体的CAR。至今，已经针对α-叶酸受体、间皮素和MUC-CD构建了针对卵巢癌的CAR修饰的T细胞，但是这些全部都具有一些抗原的脱靶表达。
例如，在一个方面，本发明在此公开了新的抗B7-H4抗体及其在诊断和治疗上的应用方法。在一个方面，就此而言，本发明在此提供了分离的抗体，其包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中该抗体结合至人B7-H4的表位，其包含氨基酸序列：
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKA或其等效物。
HLA-G是非经典的MHC I类分子，其主要作用来抑制细胞毒性免疫细胞的功能，尤其是作为NK细胞抑制性受体的配体。
例如，在一个方面，本发明在此公开了新的抗HLA-G抗体及其在诊断和治疗上的应用方法。在一个方面，就此而言，本发明在此提供了分离的抗体，其包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中所述抗体结合至人HLA-G的表位，其包含氨基酸序列：
或其等效物。
Lym-1和Lym-2是针对MHC II类HLA-DR分子的，其主要被表达在人B细胞、树突细胞以及B细胞源性淋巴瘤和白血病的表面上。本发明的方面涉及编码Lym1或Lym-2CAR的分离的核酸序列、抗体和包含该分离的核酸序列的载体。
本发明提供了用于治疗实体肿瘤的新靶标，所述实体肿瘤包括但不限于：卵巢、乳腺、肾和前列腺的癌症，以及B细胞淋巴瘤或白血病。该靶标包括LHR、B7-H4、HLA-G和HLA-DR，其通常被表达在这些肿瘤中的大多数上，但具有受限制的脱靶阳性(off-targetpositivity)，并因此具可期望的安全特性。因此，在一个方面，该组合物在治疗表达或过表达LHR、B7-H4、HLA-G、HLA-DR的肿瘤或癌症细胞中尤其有用。
在一个方面，该抗体具有至少10-6M的特异性结合亲和力。在某些方面，抗体以至少约10-7M，优选10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力来结合。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变域序列，其中该抗体结合至促黄体激素受体(LHR)、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的表位。在进一步的方面，本发明提供了单独的如本文所公开的分离的抗LHR、抗B7-H4、抗HLA-g、或抗HLA-DR抗体或其片段以及可检测或纯化的标签，或其与LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗原或其片段的组合。本发明进一步提供了包含该抗原/抗体复合物的离体细胞。
本发明的方面涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)细胞内结构域。本发明的进一步的方面涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)CD28跨膜结构域；(d)一个或多个共刺激区域，其选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域和OX40共刺激区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在进一步的方面，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)抗-促黄体激素受体(“LHR”)、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域，(e)CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一方面，本发明提供了编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的分离的核酸序列，或编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了载体，其包含编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的分离的核酸序列，或编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了载体，其包含编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的分离的核酸序列，或编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离的核酸序列。
在另一方面，本发明提供了组合物，其包含载体和以下中的一个或多个：抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体；和/或抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DRCAR；和/或编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的分离的核酸序列，或编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离的核酸序列；和/或包含编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体的载体，或包含编码抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的载体；和/或包含抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离细胞。
本发明的其他方面涉及包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的分离的细胞，以及生产这样的细胞的方法。本发明的其他方法方面涉及用于抑制肿瘤(例如实体肿瘤)的生长和治疗癌症患者的方法，其包含施用有效量的该分离的细胞。
在一方面，本发明提供了组合物，该组合物包含载体和以下中的一种或多种、或基本上由载体和以下中的一种或多种组成、或由载体和以下中的一种或多种组成：抗体或其片段，编码该抗体或其片段的核酸，包含抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR CAR的分离的细胞；和/或编码该CAR的分离的核酸；和/或包含编码该CAR的核酸的载体；和/或表达抗-LHR CAR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR的分离的细胞；和/或抗-LHR、抗-B7-H4、抗-HLA-G或抗-HLA-DR抗体。
附图说明
图1A-1C示出了LHR在TOV21G细胞系上的流式细胞术图(图1A)、间皮素在SKOV3细胞系上的流式细胞术图(图1B)、以及MUC16在CAOV3细胞系上的的流式细胞术图(图1C)。
图2A-2C示出了LHR抗体在第2期浆液性乳头状腺癌上的阳性免疫组化染色图案(图2A)；MUC16抗体在第IIIC期子宫内膜样腺癌上的阳性免疫组化染色图案(图2B)；以及间皮素抗体在第1C期浆液性乳头状腺癌上的阳性免疫组化染色图案(图2C)。
图3示出了用于生成LHR-Fc的序列。LHR G-蛋白的氨基酸结构示出了用于生成LHR-Fc的序列(框出的区域)，该LHR-Fc被用于免疫和筛选方法中以鉴定对LHR CAR的生成有用的可能的LHR结合抗体。
图4示出了LHR-Fc ELISA阳性抗体在ES-2卵巢癌细胞系上的典型流式细胞术筛选，其证明仅杂交瘤8B7有强反应性。
图5示出了5个候选LHR抗体亚克隆的流式细胞术图，其具有对ES-2人卵巢癌细胞的最高MFI值。
图6示出了抗-LHR CAR的DNA序列，以及抗-LHR CAR在质膜中的理论结构的示意图。
图7示出了LHR抗体亚克隆的重链和轻链序列的比对。
图8A-D示出了LHR阳性癌症的分布(图8A)；多个肿瘤组织学群组的LHR强度分布(图8B)；在患有卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌的患者中的LHR染色强度(图8C)；以及通过肿瘤病理分期群组进行的LHR染色强度(图8D)。
图9A-D示出了在前列腺癌中的LHR表达，在组织学(图9A)中的LHR表达，在前列腺癌(AD)和去势抗性(CR)前列腺癌中的相对mRNA水平(图9B)和蛋白质免疫印迹(图9C-D)。
图10示出了基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其含有HIV-1 5'和3'长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白ZsGreen、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和猿猴病毒40(SV40)起始位点。通过EF-1α启动子的存在确保转基因的组成型表达，该转基因包含对LHR特异性的scFV、CD8铰链和跨膜区域、以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。通过IRES区域执行检测蛋白质ZsGreen的表达。通过荧光显微镜，由细胞中ZsGreen的存在测定该载体的整合。
图11示出了LHR CAR T-细胞的细胞毒性测定的结果。如“方法”部分中所述地使用LDH细胞毒性试剂盒，确定表达LHR CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8磁珠(Stem Cell Technologies，30μl至2ml的介质)激活T细胞。用LHR慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，然后使用该αCD3/CD8磁珠激活该T细胞。将未转导的、被激活的T细胞用作对照。每孔3,000个SKOV3细胞进行铺板。将LHR转导的T细胞以20:1、10:1、5:1和1:1(60,000–3000)的比例加入孔中。每个数据点均代表三次重复测量的平均值。
图12示出了原代T-细胞中的LHR CAR的mRNA表达。用LHR CAR转导的原代T-细胞示出了LHR mRNA的表达。所使用的引物跨越在CD8铰链和4-1BB信号传导结构域(300bp)之间的区域。
图13A-13C示出了被用作抗原的人类B7-H4-Fc融合蛋白的示意图和HPLC分析。(图1A)被用于构建基因的载体；(图1B)完整的B7-H4-Fc融合蛋白，其中该B7-H4被融合至人类IgG1的免疫球蛋白Fc区的N-末端，产生用作抗原的二聚体蛋白。(图1C)被纯化的B7-H4-Fc的HPLC分析示出了表明其分子量的预期保留时间。
图14示出了在分别来源于乳腺癌、结直肠腺癌、绒毛膜癌和乳腺导管癌的SKBR-3、HT-29、JAR和T47D细胞系上的小鼠单克隆抗人类B7-H4的代表性流式细胞术的数据。较暗的线代表对B7-H4染色的细胞，而较浅的线代表用同型对照染色的细胞。将与FITC结合的绵羊抗小鼠IgG用作第二抗体。在这些细胞系中，B7-H4的细胞表面表达与b7-h4表达的q-PCR数据匹配(数据未显示)。
图15示出了新生成的并且纯化的人B7-H4的单克隆抗体的流式细胞术的筛选数据。基于这些结果，选择阳性杂交瘤的亚克隆(35-8和5F6-6)用于生成CAR T-细胞。然后对克隆35-8测序，并且用于生产用于免疫治疗的B7-H4CAR T-细胞。
图16A-B示出了B7-H4抗体(克隆#35-8)在16个正常和癌症组织微阵列上染色的代表性图像。(图16A)B7-H4在正常组织上的染色。(图16B)B7-H4在乳腺的正常组织和癌症组织上的染色。发现对B7-H4阳性呈阴性的其他正常组织(未示出)包括如下：肾上腺、骨髓、小脑、食道、垂体、肠、淋巴结、卵巢、前列腺、胃、睾丸、甲状腺、胸腺、舌、子宫、皮肤和神经组织。
图17示出了第三代抗-B7-H4CAR的DNA序列，以及第三代抗-B7-H4CAR在质膜中的理论结构的示意图。
18A-B示出了B7-H4在(图18A)人乳腺癌活检切片上和(图18B)SKBR3人乳腺癌细胞系团块的切片上的免疫组化染色，示出了细胞表面抗原阳性(棕色染色)。
图19示出了基因转移载体和该转基因的示意图。该基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其含有HIV-1 5'和3'长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白ZsGreen、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和猿猴病毒40(SV40)起始位点。通过EF-1α启动子的存在确保该转基因的组成型表达，该转基因包含对B7-H4特异性的scFV、CD8铰链和跨膜区域以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。通过IRES区域执行检测蛋白质ZsGreen的表达。通过荧光显微镜，可以由细胞中ZsGreen的存在测定该载体的整合。
图20示出了B7-H4CAR T-细胞的细胞毒性。如“方法”部分中所述地使用LDH细胞毒性试剂盒，确定表达B7-H4CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8磁珠(StemCell Technologies，30μl至2ml介质)激活T-细胞。用B7-H4慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，然后用该αCD3/CD8磁珠激活该T细胞。将未转导的、被激活的T-细胞用作对照。每孔3000个SKBR3细胞进行铺板。将B7-H4转导的T细胞以20:1、10:1、5:1和1:1(60,000-3000个细胞)的比例加入孔中。每个数据点均代表三次重复测量的平均值。
图21示出了新生成的人HLA-G的单克隆抗体的流式细胞术的筛选数据。基于这些结果，选择阳性杂交瘤的亚克隆(3H11-12和4E3-1)用于CAR T-细胞的生成。
图22A-22D示出了HLA-G在乳头状甲状腺癌和正常甲状腺组织中反应性的免疫组化(用HLA-ABC对照染色)。图22A示出了低倍率(100x)的使用抗体4E3-1的HLA-G阳性乳头状甲状腺癌切片。图22B示出了更高倍率(250X)的HLA-G阳性的乳头状甲状腺癌切片。图22C示出了正常甲状腺组织对HLA-G的阴性反应(250X)，以及图22D示出了正常甲状腺组织对HLA-ABC的阳性反应(100X)。
图23示出了第三代抗-HLA-G CAR的DNA序列，以及第三代抗HLA-G CAR在质膜中的理论结构的示意图。
图24示出了如图1所示的另外的抗体筛选。
图25示出了基因转移载体和该转基因的示意图。该基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其含有HIV-1 5'和3'长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白ZsGreen、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和猿猴病毒40(SV40)起始位点。通过EF-1α启动子的存在确保该转基因的组成型表达，该转基因包含对HLA-G特异性的scFV、CD8铰链和跨膜区域、以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。通过IRES区域执行检测蛋白质ZsGreen的表达。通过荧光显微镜，可以由细胞中ZsGreen的存在测定该载体的整合。
图26示出了HLA-G CAR T-细胞的细胞毒性。如“方法”部分中所述使用LDH细胞毒性试剂盒，确定表达该HLA-G CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8磁珠(Stem Cell Technologies，30μl至2ml介质)激活T-细胞。用HLA-G慢病毒颗粒转导被激活的T-细胞，然后用于该αCD3/CD8磁珠激活该T细胞。将未转导的、被激活的T-细胞和TLBR-2T淋巴瘤细胞系用作对照。每孔3,000个SKOV3或TLBR-2细胞进行铺板。将HLA-G转导的T细胞以20:1、10:1、5:1和1:1的比例(60,000-3000个细胞)加入孔中。每个数据点均代表三次重复测量的平均值。
图27示出了HLA-G CAR的蛋白表达。用HLA-G CAR慢病毒颗粒转导的T-细胞表达HLA-G CAR的蛋白。该CAR蛋白的大小估计为60kDa。使用CD3ζ抗体检测该蛋白。将50μg的蛋白用于蛋白质免疫印迹。将β-肌动蛋白用作上样对照。
图28A-28F示出了(图28A)阴性对照、(图28B)Lym-1、(图28C)Lym-1和B1、(图28D)仅B1、(图28E)Lym-2、以及(图28F)Lym-2和B1与患者的正常外周血淋巴细胞的染色反应性的流式细胞术分析。Lym-1和Lym-2都具有与正常人外周B细胞结合的不同特性。
图29A-29B示出了正常人扁桃体的Lym-1和Lym-2染色，证明了在B-细胞生发中心中的膜阳性。染色图案中的差异在Lym-1(图29A)和Lym-2(图29B)之间是明显的。只有分散的滤泡间树突细胞对T-细胞区中的两种抗体均呈阳性(IHC，冷冻切片，x325)。
图30A和30B示出了中级恶性B细胞淋巴瘤的Lym-1和Lym-2单克隆抗体的免疫过氧化物酶染色。中级恶性B细胞淋巴瘤的Lym-1(图30A)和Lym-2(图30B)单克隆抗体的免疫过氧化物酶染色(冷冻切片，x720)。注意切片中大多数细胞的明显的膜染色图案。
图31A-31C示出了结合曲线和Scatchard图，(图31A)Raji细胞的Lym-1单克隆抗体和ARH-77细胞的Lym-2单克隆抗体的结合曲线；(图31B)Raji细胞的Lym-1单克隆抗体的Scatchard图分析；(图31C)ARH-77细胞的Lym-2单克隆抗体的Scatchard图分析。
图32A和32B示出了通过Lym-1(图32A)和SC-2抗-HLA-DR抗体(图32B)的35S-甲硫氨酸和14C-亮氨酸标记的Raji蛋白的免疫沉淀反应。
图33A和33B示出了用于免疫疗法的(图33A)Lym-1和(图33B)Lym-2CAR T-细胞的构建示意图。图6A和6B公开了柔性接头序列。
图34示出了非限制性示例性的Lym-1基因转移载体和转基因的示意图。该基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其含有HIV-1 5'和3'长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白ZsGreen、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和猿猴病毒40(SV40)起始位点。通过EF-1α启动子的存在确保该转基因的组成型表达，该转基因包含：aCD8前导序列、对Lym-1特异性的scFV、CD8铰链和跨膜区域、以及4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。通过IRES区域执行检测蛋白质ZsGreen的表达。通过荧光显微镜，可以由细胞中ZsGreen的存在测定该载体的整合。
图35示出了Lym-1CAR在原代人T-细胞上的表达。用Lym-1CAR转导T-细胞，并用生物素-蛋白L染色，然后与链霉亲和素-PE一起孵育。通过流式细胞术分析细胞。
图36示出了Lym-1-CAR T-细胞的细胞毒性。如“方法”部分中所述地使用LDH细胞毒性试剂盒，确定表达Lym-1CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8磁珠(Stem Cell Technologies，30μl至2ml介质)激活T细胞。用Lym-1CAR慢病毒颗粒转导该被激活的T-细胞，然后使用该αCD3/CD8磁珠激活该T细胞。将未转导的、被激活的T-细胞用作对照。每孔15,000个Raji细胞进行铺板。将Lym-1CAR转导的T细胞以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入孔中。每个数据点代表三次重复测量的平均值。
图37示出了非限制性示例性的Lym-2基因转移载体和转基因的示意图。该基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其含有HIV-1 5'和3'长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、绿色荧光蛋白ZsGreen、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和猿猴病毒40(SV40)起始位点。通过该EF-1α启动子的存在确保该转基因的组成型表达，该转基因包含CD8前导序列、对Lym-2特异性的scFV、CD8铰链和跨膜区域、以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。通过IRES区域执行检测蛋白ZsGreen的表达。通过荧光显微镜，可以由细胞中ZsGreen的存在测定该载体的整合。
图38示出了Lym-2CAR在原代人T-细胞上的表达。用Lym-2CAR转导T-细胞并用生物素-蛋白L染色，然后与链霉亲和素-PE一起孵育。通过流式细胞术分析细胞。
图39示出了Lym-2-CAR T-细胞的细胞毒性。如“方法”部分中所述地，使用LDH细胞毒性试剂盒确定表达Lym-2CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8磁珠(StemCell Technologies，30μl至2ml介质)激活T-细胞。用Lym-2CAR慢病毒颗粒转导被激活的T-细胞，然后使用该αCD3/CD8磁珠激活该T细胞。将未转导的、被激活的T细胞用作对照。每孔15,000个Raji细胞进行铺板。将Lym-2CAR转导的T细胞以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入孔中。每个数据点均代表三次重复测量的平均值。
图40证明了Lym-1、Lym-2和CD19CAR T-细胞对人淋巴瘤Raji细胞有高度细胞毒性。Raji Burkitt的淋巴瘤细胞对由Lym-1和Lym-2靶向的HLA-Dr以及作为CD19CAR T-细胞的阳性对照的CD19均呈阳性。阴性对照由CD3+T细胞和Zsgreen细胞组成。
图41证明了Lym-1、Lym-2CAR在体外对HLA-Dr阳性而CD19阴性的TLBR-2人T淋巴瘤细胞是高度溶细胞性，而CD19CAR不是。衍生于乳腺植入物相关的淋巴瘤的TLBR-2人T淋巴瘤细胞对HLA-Dr呈阳性，而非CD19(Lechner et al.(2012)Clin.Cancer Res.18(17):4549-4559)。这些结果证明了，在杀死HLA-Dr阳性肿瘤中的Lym-1和Lym-2CAR T-细胞的特异性及其效力。使用常规未转导的原代T细胞，将Lym-1CAR-T和CD19CAR-T阳性细胞的百分比调节至50％。Lym-2CAR-T细胞的百分比为24％。
图42示出了被转染的NK细胞的FAC分析的结果。
发明详述
应当理解的是，本发明不限于所述的特定方面，因此该特定方面当然可以改变。还应当理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定方面，并不旨在限制，因为本发明的范围将仅受所附的权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有与属于本发明的技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本技术的实践或测试，但现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文所引用的所有技术和专利出版物其全文均通过引用方式并入本文。本文的任何内容均不应被解释为承认通过在先发明本发明无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术范围内。参见例如,Sambrookand Russell eds.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition；theseries Ausubel et al.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology；theseries Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson et al.(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow and Lane eds.(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,5th edition；Gait ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利号4,683,195；Hames and Higgins eds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds.(1984)Transcriptionand Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)APractical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987)Gene TransferVectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；和Herzenberg et al.eds(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology。
所有数字值(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度、以及分子质量，都是在适当时变化(+)或(-)0.1或1.0、或变化+/-15％、或10％、或5％、或2％的增值的近似值。应当理解的是，尽管并非总是明确地说明，但所有数字值前面都有术语“约”。还应理解的是，尽管并非总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。
除非另有说明，否则在没有明确叙述的情况下，应推断当本技术涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等效物或生物学等效物旨在本技术的范围内。
定义
除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“动物”是指活的多细胞脊椎动物生物，其包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。
术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换地使用，指人类和兽医对象，例如人、动物、非人类灵长类动物、狗、猫、绵羊、老鼠、马和牛。在一些实施方式中，对象是人类。
如本文所用，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间生产的类似分子，例如在哺乳动物(例如人类、山羊、兔和小鼠)以及非哺乳动物种类(例如鲨鱼免疫球蛋白)中。除非另有具体地说明，否则术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，其特异性结合至目标分子(或一组高度相似的目标分子)，以基本上排除了结合至其他分子(例如，在生物样品中，与对其他分子的结合常数相比，对目标分子的结合常数大至少103M-1、至少104M-1或至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。还请参见，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。抗体的“抗原结合片段”是抗体的一部分，其保留特异性结合至该抗体的靶抗原的能力。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由B淋巴细胞的单一克隆生产的抗体，或由单一抗体的轻链和重链基因已经被转染到其中的细胞生产的抗体。通过本领域技术人员已知的方法生产单克隆抗体，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合中制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体和人类抗体。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在确定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链含有恒定区域和可变区域(这些区域也称为“结构域”)。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。轻链和重链可变区域含有被三个高变区域中断的“框架”区域，高变区域也被称为“互补决定区”或“CDR”。框架区域和CDR的范围已经被确定(参见,Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,1991,其通过引用方式并入本文)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区域的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成轻链和重链的结合框架区域，主要采用β-折叠构象以及CDR形成环，该环连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，该支架通过链间的、非共价的相互作用将CDR定位在正确的方向中。
CDR主要负责结合至抗原的表位。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，其从N-端开始按顺序编号，并且也通常通过特定CDR所位于的链而被识别。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的抗体将具有特异性的VH区域和VL区域序列，并因此具有特异性的CDR序列。具有不同特异性(即，对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管抗体与抗体之间不同的是CDR，但CDR内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性的体液免疫或细胞免疫的产物(例如抗体分子或T细胞受体)特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(例如，复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质)。常见类别的抗原包括但不限于：病毒抗原，细菌抗原，真菌抗原，原生动物和其他寄生虫抗原，肿瘤抗原，涉及自身免疫疾病、过敏和移植物排斥的抗原，毒素和其他各种抗原。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指可以特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽的结构域。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指融合蛋白，其包含能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T-体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指可以结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指任何已知作为结构域起作用的寡肽或多肽，该结构域传递信号以在细胞中引起生物过程的激活或抑制。在某些实施方式中，除了主要信号传导结构域之外，细胞内结构域可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，或者基本上由其组成，或者进一步包含一个或多个共刺激信号传导结构域。“跨膜结构域”意为已知跨越细胞膜的任何寡肽或多肽，并且其可以起到连接细胞外结构域和信号传导结构域的作用。嵌合抗原受体可任选地包含“铰链结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。本文公开了编码每个结构域的组分的非限制性示例性多核苷酸序列，例如：
铰链结构域：IgG1重链铰链序列：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
跨膜结构域：CD28跨膜蛋白区域：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
每个示例性结构域组分的进一步的实施方式包括：具有类似生物学功能的其他蛋白质，其与由上文所公开的核酸序列编码的蛋白具有至少70％、或者至少80％的氨基酸序列同一性，优选90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性。进一步，本文提供了这样的结构域的非限制性例子。
如本文所用，术语“HLA-DR”指与这个名称相关的MHC II类细胞表面受体和具有类似生物学功能的任何其他分子，该分子与任何HLA-DR变体具有至少80％氨基酸序列同一性，优选90％序列同一性、或者至少95％的序列同一性，该HLA-DR变体包括但不限于其几种变体中的任何一种，包括但不限于包含HLA-DRA和HLA-DRB单体型的组合的HLA-DR DR1至DR75血清型。HLA-DR序列的例子是本领域已知的，并且Rose,L.M.et al.(1996)CancerImmunol.Immunother.43:26-30公开了这样的非限制性例子：
HLA-DRB1*1001[DR10]
GDTRPRFLEEVKFECHFFNGTERVRLLERRVHNQEEYARYDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLERRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPQSGEVYTCQVEHPSVMSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLPPTGFLS；
HLA-DRB3*0201[DR52]
GDTRPRFLELLKSECHFFNGTERVRFLERHFHNQEEYARFDSDVGEYRAVFELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGQVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPQVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETFPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWSARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGFLS；
HLA-DRB1*0301[DR17(3)]
GDTRPRFLEYSTSECHFFNGTERVRYLDRYFHNQEENVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGRVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPRGFLS,以及其每一个的等效物。
Rose等人还公开了HLA-DR特异性抗体可结合至其的示例性表位，并且因此可用作免疫原用于生成额外的抗体、单克隆抗体和其每一个的抗原结合片段。与对应于名称HLA-DR或包括但不限于指定的HLA-DR亚型的其等同物的所列出的编号和GenBank登记号中的每一个相关的序列通过引用方式并入本文，作为额外的非限制性列子。
“组合物”通常意指活性剂(例如，CAR T细胞或CAR NK细胞、抗体、化合物或组合物)和天然存在的或非天然存在的载体的组合，该载体是惰性的，例如可检测的试剂或标记，或是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生糖，例如醛醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地1-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白等。还以缓冲能力起作用的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于在本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。
如本文使用的，术语“共有序列(consensus sequence)”是指氨基酸或核苷酸序列，其通过比对一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在该多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该序列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。
如本文使用的，术语“促黄体激素受体(LHR)”是指与该名称相关的特定的分子，以及与本文所示的LHR序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登记号AAB19917.2(Homo sapiens)、或AAA39432.1(Mus musculus)、或AAA41529.1(Rattusnorvegicus)相关的蛋白序列提供了LHR的额外的示例性序列。其非限制性的例子包括：
促黄体激素受体[Homo sapiens]:
MKQRFSALQLLKLLLLLQPPLPRALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPSHCCAFRNLPTKEQNFSHSISENFSKQCESTVRKVNNKTLYSSMLAESELSGWDYEYGFCLPKTPRCAPEPDAFNPCEDIMGYDFLRVLIWLINILAIMGNMTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSTAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAIHLDQKLRLRHAILIMLGGWLFSSLIAMLPLVGVSNYMKVSICFPMDVETTLSQVYILTILILNVVAFFIICACYIKIYFAVRNPELMATNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPINSCANPFLYAIFTKTFQRDFFLLLSKFGCCKRRAELYRRKDFSAYTSNCKNGFTGSNKPSQSTLKLSTLHCQGTALLDKTRYTEC
促黄体激素受体[Mus musculus]:
MGRRVPALRQLLVLAMLVLKQSQLHSPELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVSKISSSEFNFILEICDNLYITTIPGNAFQGMNNESITLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGTFQGATGPSILDVSSTKLQALPSHGLESIQTLIATSSYSLKTLPSREKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVREANNETLYSAIFEENELSGWDYDYDFCSPKTLQCTPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWIFSTLMATLPLVGVSSYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILLLNAVAFVVICACYVRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPVNSCANPFLYAVFTKAFQRDFFLLLSRFGCCKHRAELYRRKEFSACTFNSKNGFPRSSKPSQAALKLSIVHCQQPTPPRVLIQ
促黄体激素受体[Rattus norvegicus]:
MGRRVPALRQLLVLAVLLLKPSQLQSRELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSELLIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVTKISSSEFNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGAFQGATGPSILDISSTKLQALPSHGLESIQTLIALSSYSLKTLPSKEKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVRKADNETLYSAIFEENELSGWDYDYGFCSPKTLQCAPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCGAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWLFSTLIATMPLVGISNYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILILNVVAFVVICACYIRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKILLVLFYPVNSCANPFLYAIFTKAFQRDFLLLLSRFGCCKRRAELYRRKEFSAYTSNCKNGFPGASKPSQATLKLSTVHCQQPIPPRALTH
如本文使用的，术语“B7-H4”(也称为VTCN1、H4、B7h.5、B7S1、B7X或PRO129)指与这个名称相关的特定的分子以及与B7-H4具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文在此提供了B7-H4序列的例子。此外，与GenBank登记号：AY280973.1(Mus musculus)和NP_078902(Homo sapiens)相关的蛋白序列提供了在各种动物中的B7-H4示例性序列；该参照基因具有87％的同源性。与所列举的GenBank登记号中每一个相关的序列通过引用方式并入本文。如本文所使用的，关于抗体或受体的术语“抗-B7-H4”是指特异性地结合至B7-H4的抗体或受体，并且包括任何针对B7-H4生成的抗体。
本发明提供了新的抗-B7-H4抗体及其在诊断和治疗上的使用方法。在一个方面，就此而言，本发明提供了分离的抗体，其包含重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该抗体结合至人类B7-H4的表位，其包含氨基酸序列：
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKA或其等效物。
在发明的某些实施方式中，抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该抗体结合至人类B7-H4的表位，其包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，其中HC包含下列中任何一个：包含氨基酸序列GFTFSSFG、GFTFSSYG或GYTFTDY的HC CDRH1；和/或包含氨基酸序列ISSGSSTL、ISSSNSTI或INPNNGGT的HC CDRH2；和/或包含氨基酸序列ARPLYYYGSVMDY或RPYYYGSSYDY的HC CDRH3。
在本发明的某些实施方式中，抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该抗体结合至人类B7-H4的表位，其包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，其中LC包含：LC CDRL1，其包含氨基酸序列QSIVHRNGNTY、QSIVHSNGNTY或ENIGSY；和/或LC CDRL2，其包含氨基酸序列KVS或AAT；和/或LC CDRL3，其包含氨基酸序列FQGSYVPPT、FQGSHVPLT、QHYYSTLVT。
如本文所使用的，术语“HLA-G”(也称为B2微球蛋白或MHC-G)是指与此名称相关的特定分子，以及与HLA-G具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似生物学功能的任何其他分子，包括但不限于其几个同种型中的任何一个，包括但不限于膜结合同种型(例如HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4)、可溶性同种型(例如HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7)和由膜结合同种型的蛋白水解裂解生成的可溶性形式(例如sHLA-G1)。本发明提供了HLA-G序列的例子。此外，与以下GenBan登记号有关的蛋白序列是示例性的：
NM_002127.5XM_006715080.1XM_006725041.1XM_006725700.1XM_006725909.1.一个例子是NM_002127.5序列：
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD
与以上所列出的GenBank登记号有关的序列通过引用方式并入本文中。
如本文所使用的，术语“CD8α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的CD8α铰链结构域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在Pinto,R.D.et al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的CD8α铰链结构域的示例性序列。其非限制性的例子包括：
人类CD8α铰链结构域：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
小鼠CD8α铰链结构域：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
猫CD8α铰链结构域：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
如本文使用的，术语“CD8α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的CD8α跨膜结构域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。与人类T-细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸(NCBI参考序列：NP_001759.3)、或者小鼠T-细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸(NCBI参考序列：NP_001074579.1)、以及大鼠T-细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸(NCBI参考序列：NP_113726.1)相关的片段序列，提供了CD8α跨膜结构域的额外的示例性序列。与所列出的NCBI的每一个相关的序列提供如下：
人类CD8α跨膜结构域：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
小鼠CD8α跨膜结构域：
IWAPLAGICVALLLSLIITLI
大鼠CD8α跨膜结构域：
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。与GenBank登记号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的额外的、非限制性的示例性序列。将与所列出的登记号中的每一个相关的序列并入本文。
如本文所用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域(signaling region)”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。在美国申请号US 13/826,258中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的示例性序列。与美国申请号US 13/826,258公开的相关4-1BB共刺激信号传导区域的序列提供如下：
4-1BB共刺激信号传导区域：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
如本文所使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger,T.L.et al.,Blood 98:2364-2371(2001)；Hombach,A.et al.,J Immunol 167:6123-6131(2001)；Maher,J.et al.NatBiotechnol 20:70-75(2002)；Haynes,N.M.et al.,J Immunol 169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.et al.,Blood 100:3155-3163(2002)中提供了示例性的CD28共刺激信号传导结构域。非限制性的例子包括以下CD28序列的114-220残基：MLRLLLALNL FPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSDYMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS,和其等效物。
如本文所使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：
ICOS共刺激信号传导区域：
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT
GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA
如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，并且其包括以下提供的示例性序列。
OX40共刺激信号传导区域：
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA
GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG
GCCAAGATC
如本文所使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与如本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物学功能的任何其他分子。在美国公开号US 2013/0266551A1中提供了CD3ζ信号传导结构域的示例性序列。与CD3ζ信号传导结构域相关的序列被列出如下：
CD3ζ信号传导结构域：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
如本文所使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在通过抗原相互作用的激活之后发育成记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞(例如T细胞)的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性例子包括：AHH-1(CRL-8146TM)、BC-1(CRL-2230TM)、BC-2(CRL-2231TM)、BC-3(CRL-2277TM)、CA46(CRL-1648TM)、DG-75[D.G.-75](CRL-2625TM)、DS-1(CRL-11102TM)、EB-3[EB3](CCL-85TM)、Z-138(ATCC#CRL-3001)、DB(ATCC CRL-2289)、Toledo(ATCC CRL-2631)、Pfiffer(ATCC CRL-2632)、SR(ATCC CRL-2262)、JM-1(ATCC CRL-10421)、NFS-5C-1(ATCC CRL-1693)、NFS-70C10(ATCC CRL-1694)、NFS-25C-3(ATCC CRL-1695)、和SUP-B15(ATCC CRL-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL,DL-40,FE-PD,JB6,Karpas 299,Ki-JK,Mac-2A Ply1,SR-786,SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16,DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda 519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L 540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)或ATCC(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)。
如本文所使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括辅助T细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T-细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T-细胞、调节T-细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括：BCL2(AAA)Jurkat(CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat(CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat(CRL-2901TM)、BCL2Jurkat(CRL-2899TM)、NeoJurkat(CRL-2898TM)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC#CRL-11386)细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟T-细胞系，例如ALL-SIL,Be13,CCRF-CEM,CML-T1,DND-41,DU.528,EU-9,HD-Mar,HPB-ALL,H-SB2,HT-1,JK-T1,Jurkat,Karpas 45,KE-37,KOPT-K1,K-T1,L-KAW,Loucy,MAT,MOLT-1,MOLT 3,MOLT-4,MOLT 13,MOLT-16,MT-1,MT-ALL,P12/Ichikawa,Peer,PER0117,PER-255,PF-382,PFI-285,RPMI-8402,ST-4,SUP-T1至T14,TALL-1,TALL-101,TALL-103/2,TALL-104,TALL-105,TALL-106,TALL-107,TALL-197,TK-6,TLBR-1、-2、-3和-4,CCRF-HSB-2(CCL-120.1),J.RT3-T3.5(ATCC TIB-153),J45.01(ATCC CRL-1990),J.CaM1.6(ATCC CRL-2063),RS4；11(ATCC CRL-1873),CCRF-CEM(ATCC CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78(ATCCCRM-TIB-161)、MJ[G11](ATCC CRL-8294)、HuT102(ATCC TIB-162)。无白血病(Nullleukemia)细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)或ATCC(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)。
如本文所使用的，术语“NK细胞”(也被称为自然杀伤细胞)是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供了针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫应答，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性例子包括NK-92(CRL-2407TM)、NK-92MI(CRL-2408TM)细胞系。进一步的例子包括但不限于HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT NK细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)或ATCC(www.atcc.org/)以及德国微生物和细胞培养物保藏所(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)。
如本文所使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、DNA基因组、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的补体，并且编码序列可以由此导出。
如本文所使用，术语“信号肽”或“信号多肽”意指通常存在于新合成的分泌性或膜多肽或蛋白质的N-末端的氨基酸序列。它起到将多肽引导穿过或进入细胞膜的作用，然后随后被移除。这样的例子在本领域中是已知的。美国专利号8,853,381和5,958,736中描述了那些非限制性例子。
如本文所使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等制造病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
如本文所使用的，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在该区域控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，其中调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。
如本文所使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)，以及致力于免疫谱系的其前体。T细胞的前体是谱系限制的干细胞和祖细胞，能够分化以生产成熟T细胞。T细胞的前体包括：HSC，长期HSC，短期HSC，多能祖细胞(MPP)，淋巴系多能祖细胞(LMPP)，早期淋巴祖细胞(ELP)，共同淋巴祖细胞(CLP)，Pro-T细胞(ProT)，早期T系祖细胞/双阴性细胞1(ETP/DN1)，双阴性(DN)2a、DN2b、DN3a、DN3b、DN4细胞和双阳性(DP)细胞。这些T细胞前体在人类中的标记物包括但不限于：HSC：CD34+和任选的CD38-；长期HSC：CD34+、CD38-以及谱系阴性，其中谱系阴性意为对一种或多种谱系特异性标记物为阴性，该标记物选自TER119、Mac1、Gr1、CD45R/B220、CD3、CD4和CD8；MPP：CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90-以及任选地谱系阴性；CLP：CD34+、CD38+、CD10+以及任选地谱系阴性；DN1：CD117-、CD34+、CD38-、CD1a-；DN2：CD117+、CD34+、CD38+、CD1a-；DN3：CD34+、CD38+、CD1a+；DN4：CD4+、CD3-；DP：CD4+、CD8+以及任选地CD3+。NK细胞的前体是谱系限制的干细胞和祖细胞，其能够分化以生产成熟的NK细胞。NK前体包括HSC、长期HSC、短期HSC、多能祖细胞(MPP)、共同骨髓祖细胞(CMP)、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)、pro-NK、pre-NK和未成熟NK(iNK)。这些NK前体的标记物包括但不限于：CMP：CD56-、CD36-、CD33+、CD34+、NKG2D-、NKp46-；GMP：CD56-、CD36-、CD33+、CD34+、NKG2D-、NKp46-；pro-NK：CD34+、CD45RA+、CD10+、CD117-、CD161-；pre-NK：CD34+、CD45RA+、CD10-、CD117+、CD161+/-；以及iNK：CD34-、CD117+、CD161+、NKp46-、CD94/NKG2A-。在一些方面，NK细胞前体的标记物包括但不限于CD117+、CD161+、CD244+、CD33+、CD56-、NCR-、CD94/NKG2A-和LFA-1-。检测前体表面标记物的表型试剂可从例如BD Biosciences(San Jose，CA)和BioLegend(San Diego，CA)获得。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括辅助T-细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T-细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T-细胞，调节T-细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。
如本文所使用，术语“CRISPR”是指依赖于规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)通路的序列特异性基因操作的技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及用于简单地将蛋白质靶向至特定的基因组位置。基因编辑是指一种基因工程的类型，其中通过向多核苷酸序列引入缺失、插入或碱基取代来改变该靶多核苷酸的核苷酸序列。在一些方面，CRISPR-介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的途径来执行该编辑。基因调控是指增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。
如本文所用的术语“向导RNA”或“gRNA”是指用于将CRISPR复合物靶向至特定的核苷酸序列(例如细胞基因组的特定区域)的向导RNA序列。将gRNA和供体治疗性多核苷酸设计用于靶特异性的技术是本领域公知的。例如，Doench,J.,et al.Nature biotechnology2014；32(12):1262-7,Mohr,S.et al.(2016)FEBS Journal 283:3232-38,和Graham,D.,etal.Genome Biol.2015；16:260。gRNA包含这样的融合多核苷酸或多核苷酸、或基本上由其组成，或由其组成，该融合多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活的CRIPSPR RNA(tracrRNA)，该多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活的CRIPSPR RNA(tracrRNA)。在一些方面，gRNA是合成的(Kelley,M.et al.(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。
术语“抑制性RNA”是指能够RNA干扰导致抑制基因表达和/或翻译的RNA分子，RNA干扰是抑制性RNA分子靶向信使RNA(mRNA)分子的机制。RNA干扰也称为转录后基因沉默。示例性的抑制性RNA包括但不限于：反义RNA、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、双链RNA(dsRNA)及其中间体。设计、克隆和表达抑制性RNA的方法是本领域已知的(例如McIntyre et al,BMC Biotechnol 2006；6:1；Moore et al.Methods MolBiol.2010；629:141-158)和定制RNAi试剂盒是商业上可获得的(例如GeneAssistTM CustomsiRNA Builder,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)。
如本文所使用，术语“自体同源的(autologous)”在涉及细胞时，是指被分离并且被灌注回相同的对象(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。
“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。
“实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。
术语“卵巢癌”是指一种类型的癌症，其在卵巢的组织中形成，并且经历了恶性转化，该恶性转化使得该癌症之内的细胞对宿主生物体有病态作用并且具有入侵或扩散至身体的其他部分的能力。本文的卵巢癌包括组织学分级低的I型癌症和组织学分级更高的II型癌症。特别地，卵巢癌包括但不限于上皮癌、浆液性癌、透明细胞癌、性索间质瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、混合肿瘤、继发性卵巢癌、低恶性潜在肿瘤。
术语“前列腺癌”是指在男性生殖系统中的腺体前列腺中发展出的一种类型的癌症。本文的前列腺癌包括但不限于腺癌、肉瘤、小细胞癌、神经内分泌肿瘤、移行细胞癌。
术语“B细胞淋巴瘤或白血病”是指一种类型的癌症，其在淋巴系统或骨髓的组织中形成，并且经历恶性转化，该恶性转化使得在该癌症内的细胞对宿主生物体有病态作用并且具有侵入或扩散至身体其他部位的能力。
术语“甲状腺癌”是指在甲状腺肿发展出的一种类型癌症。
如本文使用的，术语“包括”旨在意为组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该意为排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)中排除微量污染物。“由……组成”应当意为排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文所公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接产生可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的名单包括：例如通过比色、荧光、发光产生可检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团(例如荧光剂、发光染料)；具有通过电子显微镜或通过其电性质(例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗)检测的电子密度的基团；可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法(例如原子力谱、隧道效应)、或放射性分子(例如32P、35S或125I)。
如本发明所使用，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的名单包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃红、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
如本文所使用，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或该被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
如本文所使用，术语“开关”是指控制CAR或CAR组分的表达、激活或稳定性的机制(即，将“CAR”“打开”或“关闭”的机制)。开关机制包括但不限于CAR表达系统，其需要多于一种待激活构建体、自杀开关、安全开关和需要多聚化以激活的CAR的共表达。在一些实施例中，开关是可诱导的。
“Kozak共有序列”或“Kozak序列”是被核糖体识别为翻译起始位点的mRNA序列。Kozak序列包含用于翻译起始和额外的侧翼核苷酸的起始密码(也称为起始密码子)。起始密码指定在被翻译多肽的N-末端处的甲硫氨酸氨基酸。脊椎动物的Kozak共有序列是本领域中已知的(例如，Kozak,M.1987Nucleic Acids Res.15(20):8125-48)。在一些实施方式中，Kozak序列可以被修饰为“强的”，意为该核苷酸序列与共有序列紧密匹配，特别是在相对于第一核苷酸的+4和-3的核苷酸处。“适当的”Kozak序列仅具有这些匹配核苷酸中的一种，而“弱的”Kozak序列没有匹配的核苷酸。Kozak序列的强度与从被表达的mRNA翻译的多肽的量直接相关。通常，强的Kozak序列导致被表达mRNA的翻译效率更高，而从具有弱的Kozak序列的mRNA中转录的多肽更少。
如本文所使用，当被用于两个或更多个核酸或多肽序列的情况下时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域(例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60％同一性、优选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以通过比较可以为了进行比较而被比对的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别是，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的补体。这些术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有替换的序列。如本文所述，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文所公开的序列中的一个享有少于40％的同一性、或者少于25％的同一性。
短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。
在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过ELISA或其他合适的方法测量地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在本技术的范围之内。如本文使用，在指参照蛋白、抗体、多肽或核酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性和、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或98％百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其补体(complement)杂交的多核苷酸。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当被比对时，该百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR反应的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。
严格杂交条件的例子包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的例子包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。
“与肿瘤组织类型对应的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同的组织类型的正常细胞。非限制性例子是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或者来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。
如本文所使用，术语“分离的”是指，分子或生物制剂或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸(例如DNA或RNA)或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)或细胞或细胞器、或组织或器官分别与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组DNA技术生产时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指，通过B淋巴细胞的单一克隆生产的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞生产的抗体。克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法生产的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物亚单位的化合物。该亚单位可以通过肽键而被连接。在另一个方面，该亚单位可以通过其他键(例如酯键、醚键等)而被连接。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文所使用，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸及其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以执行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之后。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分结合。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。
如本文所使用，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80％的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90％、通常大于95％的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。
如本文所使用，术语“特异性结合”意为抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10-6M。在某些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10-7M，并且优选10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。
如本文所使用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术生产的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以生产异源蛋白。
如本文所使用，“治疗”在对象中的疾病是指(1)预防症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症(包括疾病)的程度的降低，病症(包括疾病)的稳定化(即不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或减缓，病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。当疾病是癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性例子：肿瘤负荷减少、肿瘤生长减慢、总生存期延长、肿瘤进展时间延长、抑制转移或减少肿瘤转移。
如本文所使用，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中生产的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。如本文所使用，“内源性的”是指天然存在于细胞内并且不是通过基因工程(例如基因材料的转染或转导)引入的基因或基因产物。
如本文所使用，术语“接头序列”是指任何氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或至约8、或至约6、或约5、或4或3、或2次的1至10个、或8个氨基酸、或6个氨基酸、或5个氨基酸。例如，接头可以包括由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一个方面，接头序列是包括gly-gly-gly-gly-ser的三个拷贝的(甘氨酸4丝氨酸)或其等效物的3柔性多肽接头。接头序列的非限制性例子是本领域已知的，例如GGGGSGGGGSGGGG(及其等同物)、三肽EFM、或Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met、以及其每个的等效物。
如本文所使用，术语“基质”是指，例如通常用于蛋白质免疫印迹的凝胶电泳凝胶或基质的组合物(例如由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯制成的膜)，该组合物可用于电泳和/或免疫印迹技术，例如蛋白质免疫印迹。如本文所使用，“固相支持物”是指能够支持肽和/或肽合成的材料、复合材料、表面或功能化表面。示例性固相支持物包括但不限于稳定的珠状凝胶树脂、端基丙烯酰化长链聚乙二醇、聚苯乙烯树脂和无酰胺键的PEG基树脂。如本文所使用，术语“溶液”是指液相混合物或组合物。
如本文所使用，术语“增强子”表示不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和方向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能(例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，即全长序列的活性)，则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。
如本文所使用，术语“WPRE”或“土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件”是指与该名称相关的特定的核苷酸片段，以及与本文所示的WPRE序列具有至少70％、或至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。例如，WPRE是指在土拨鼠肝炎病毒基因组序列(GenBank登记号J04514)中出现的类似于人类乙型肝炎病毒转录后调控元件(HBVPRE)的区域，并且该基因组序列的1093位至1684位的592个核苷酸对应于转录后调控区域(Journal of Virology,Vol.72,p.5085-5092,1998)。使用逆转录病毒载体的分析显示，被插入至目的基因的3'-末端未翻译区域的WPRE提高了产生的蛋白的量5至8倍。还被报道的是，WPRE的引入抑制了mRNA降解(Journal of Virology,Vol.73,p.2886-2892,1999)。在广义上，例如WPRE的通过使mRNA稳定而提高氨基酸翻译的效率的元件也被认为是增强子。
缩写列表
CAR：嵌合抗原受体
HLA：组织相容性淋巴细胞抗原
Ip：腹膜内
IRES：内部核糖体进入位点
LHR：促黄体激素受体
MFI：平均荧光强度
MOI：感染复数
PBMC：外周血单核细胞
PBS：磷酸盐缓冲盐水
scFv：单链可变片段
WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件
与以上列出的GenBank登记号、UniProt参照号、和参考文件中的每一个相关的序列都通过引用的方式并入本文中。
用于实施本发明的方式
由于最近在B细胞淋巴瘤和白血病中利用基因工程化嵌合抗原受体(CAR)T细胞进行自体治疗而获得了前所未有的结果(Maude,S.L.et al.(2014)New Engl.J.Med。
CAR T-细胞是基因工程化自体T-细胞，其中单链抗体片段(scFv)或配体被连接至能够促进T细胞激活的T细胞信号传导结构域(Maher,J.(2012)ISRN Oncol.2012:278093；Curran,K.J.et al.(2012)J.Gene Med.14:405-415；Fedorov,V.D.et al.(2014)CancerJ.20:160-165；Barrett,D.M.et al.(2014)Annu.Rev.Med.65:333-347)。CAR将单克隆抗体的HLA非依赖性靶向特异性与被激活T-细胞的细胞溶解活性和归巢特性结合。这些特性使得靶细胞与降低的HLA表达通路或下调的抗原加工通路(肿瘤用于逃避宿主免疫应答的两种常用方法)的识别成为可能(Jakobsen,M.K.et al.(1995)J.Immunother.EmphasisTumor Immunol.17:222-228；Lou,Y.et al.(2008)Clin.Cancer Res.14:1494–1501；Singh,R.et al.(2007)Cancer Res.67:1887–1892)。CAR修饰的T细胞已经在临床前和临床环境中示出了作为包括卵巢癌的各种疾病中的新疗法的巨大前景(Chu,C.S.et al.(2008)Expert Rev.Anticancer Ther.8:243–257；Chekmasova,A.A.et al.(2010)Discov.Med.9:62–70；Porter,D.L.et al.(2011)NEJM 365:725-733)。到目前为止，针对间皮素生成的CART细胞(Kelly,R.J.et al.(2012)Mol.Cancer Ther.11:517-525；Beatty,G.L.et al.(2014)Cancer Immunol.Res.2:112-120)目前正在国家癌症研究所(方案ID：120111；NCT01583686)，宾夕法尼亚大学(刚刚招募患者)和中国(4名患者已完成)进行临床试验。这些研究是非常初步的，并且除了α-叶酸受体(Kandalaft,L.E.et al.(2012)J.Transl.Med.10:157-167)和MUC16(Chekmasova,A.A.et al.(2010)Clin.CancerRes.16:3594–606；Rao,T.D.et al.(2010)Appl.Immunohistochem.Mol.Morphology 18:462-472)之外，目前我们所知的其他靶标尚未开发用于治疗卵巢癌。
到目前为止，对于人类实体肿瘤的CAR修饰的T细胞已被构建来针对α-叶酸受体、间皮素和MUC-CD、PSMA及其他靶标，但大多数在正常组织中具有偏离靶标的抗原表达。这些构建体在患者中没有示出同样的超常结果，突出了需要进行更多的研究，以识别可用于抗实体肿瘤的CAR T细胞构建体的新靶点和方法。
此外，本发明提供了对LHR、B7-H4、HLA-G、HLA-DR特异性的抗体以及与其应用和产生有关的方法和组合物。另外，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含对LHR、B7-H4、HLA-G、HLA-DR特异性的抗原结合结构域，其在一些方面中是抗LHR、B7-H4、HLA-G、HLA-DR抗体的抗原结合结构域，以及与其应用和生产有关的方法和组合物
与这些原理和发现一致，本发明提供以下实施方式。
本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD 8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在一些实施方式中，CAR的抗LHR抗体的抗原结合结构域，包含抗LHR重链(HC)可变区域和抗LHR轻链(LC)可变区域，由该抗LHR重链(HC)可变区域和该抗LHR轻链(LC)可变区域组成，或基本上由该抗LHR重链(HC)可变区域和该抗LHR轻链(LC)可变区域组成。在一些实施方式中，该CAR进一步包含位于抗LHR HC可变区域和抗LHR LC可变区域之间的接头多肽，由该接头多肽组成，或基本上由该接头多肽组成。
在一些实施方式中，CAR的抗LHR抗体的HC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含GYSITSGYG或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含IHYSGST或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含ARSLRY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含SSVNY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含DTS或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含HQWSSYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，CAR的抗LHR抗体的HC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含GFSLTTYG或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含IWGDGST或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含AEGSSLFAY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含QSLLNSGNQKNY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含WAS或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含QNDYSYPLT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，CAR的抗LHR抗体的HC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含GYSFTGYY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含IYPYNGVS或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含ARERGLYQLRAMDY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含QSISNN的或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含NAS或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含QQSNSWPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本上由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，CAR的抗LHR抗体的HC可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，抗LHR轻链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，抗LHR重链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，抗LHR轻链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。
在一些实施方式中，多肽的等效物包含与该多肽具有至少80％氨基酸同一性的多肽或由在高严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，CAR进一步包含可检测标记物或纯化标记物，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，其进一步包含衍生自抗MUC-16的抗体或抗间皮素的抗体的抗原结合结构域，由该抗原结合结构域组成，或基本上由该抗原结合结构域组成。
本发明还提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，所述嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该分离的核酸序列包含选自本发明所公开的序列中任一个或其每一个的等效物，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，分离的核酸序列进一步包含位于抗LHR抗体的抗原结合结构域上游的Kozak共有序列或增强子，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，分离的核酸序列进一步包含抗生素抗性多核苷酸，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，分离的核酸序列进一步包含用于控制CAR的表达和/或激活的开关机制，由其组成，或基本上由其组成。
本发明还提供了载体，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，由其组成，或基本上由其组成；所述嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，载体是质粒。在一些实施方式中，该载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方式中，该载体是CRISPR载体或包含CRISPR的载体。
本发明还提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的分离的细胞，所述嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，本发明提供了分离的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列、由其组成、或基本上由其组成；该嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域(c)CD8α跨膜结构域；(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，本发明提供了分离的细胞，其包含载体、由该载体组成、或基本上由该载体组成；该载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列、由该分离的核酸序列组成、或基本上由该分离的核酸序列组成；所述嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该分离的细胞包含CAR、分离的核酸或载体中的一个或多个，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，分离的细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，该免疫细胞是T-细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，该分离的细胞是T-细胞的前体或NK细胞的前体。
本发明提供了一种组合物，其包含载体和以下中的一个或多个、由该载体和以下中的一个或多个组成、或基本上由该载体和以下中的一个或多个组成：CAR，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域、(b)CD8α铰链结构域、(c)CD8α跨膜结构域、(d)两个或更多个共刺激信号信号传导区域、以及(e)CD3ζ信号传导结构域；编码该CAR的分离的核酸；载体，其包含该分离的核酸、由该分离的核酸组成、或基本上由该分离的核酸组成；或分离的细胞，其包含该CAR、分离的核酸、和/或载体。
在一些实施方式中，该组合物进一步包含能够结合肽的抗原结合片段、由该抗原结合片段组成、或基本上由该抗原结合片段组成，其中该肽包含LHR蛋白或其片段。在一些实施方式中，该肽与细胞相连。在一些实施方式中，该肽被结合至固相支持物。在一些实施方式中，该肽被置于溶液中。在一些实施方式中，该肽与基质相连。
本发明还提供了生产表达抗-LHR CAR的细胞的方法，其包含以下步骤、由以下步骤组成、或基本上由以下步骤组成：(i)用编码CAR的核酸序列引入免疫细胞群体，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗促黄体激素受体(“LHR”)抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导结构域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；(ii)选择已用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-LHR CAR的细胞。
在该方法的一些实施方式中，该免疫细胞是T细胞。在该方法的一些实施方式中，已经将T-细胞的群体修饰以减少或消除内源性T-细胞受体的表达。
在该方法的一些实施方式中，使用采用RNA干扰或CRISPR的方法来修饰T-细胞的群体。
本发明还提供了在有需要的对象中抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤、由以下步骤组成、或基本上由以下步骤组成：向该对象施用有效量的根据本发明所提供的任一种实施方式的分离的表达抗-LHR CAR的细胞。
在该方法的一些实施方式中，表达抗-LHR CAR的细胞对于正被治疗的对象是自体同源的或同种异体的。
在该方法的一些实施方式中，该肿瘤或癌症表达或过表达LHR。在一些实施方式中，该肿瘤是实体肿瘤，任选地是卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤；和/或该癌症是卵巢癌或前列腺癌。
在该方法的一些实施方式中，所述有需要的对象是人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在一些实施方式中，CAR的抗B7-H4抗体的抗原结合结构域包含抗-B7-H4重链(HC)可变区域和抗-B7-H4轻链(LC)可变区域、或由其组成、或基本上由其组成。在一些实施方式中，该CAR进一步包含位于抗-B7-H4HC可变区域和抗-B7-H4LC可变区域之间的接头多肽。
一些实施方式中，抗-B7-H4抗体的HC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含GXTF或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)ISSXXXT、(ii)INPNNGGT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含ARPXYY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)QSIVHXNGTY、(ii)ENIGSY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)KVS、(ii)AAT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)FQGSXVPXT、(ii)QHYYSTLVT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，抗-B7-H4抗体的HC包含包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)GFTFSSFG、(ii)GFTFSSYG、(iii)GYTFTDY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)ISSGSSTL、(ii)ISSSNSTI或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)ARPLYYYGSVMDY、(ii)ARPYYYGSSYDY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)QSIVHRNGNTY、(ii)QSIVHSNGNTY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)FQGSYVPPT、(ii)FQGSHVPLT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，CAR的抗-B7-H4重链可变区域包含选自本发明所公开的序列、或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，该CAR的抗-B7-H4轻链可变区域包含选自本发明所公开的序列、或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，该CAR的抗-B7-H4重链可变区域包含具有共有序列的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成；该共有序列选自本发明所公开的序列、或其每一个的等效物。在一些实施方式中，抗-B7-H4轻链可变区域包含具有共有序列的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成；该共有序列选自本发明所公开的序列、或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该CAR进一步包含可检测的标记物或纯化标记物，由其组成，或基本上由其组成。
本发明还提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，所述嵌合抗原受体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该分离的核酸序列包含选自本发明所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
在一些实施方式中，该分离的核酸序列进一步包含位于抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域上游的Kozak共有序列或增强子，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，该分离的核酸序列进一步包含抗生素抗性多核苷酸，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，该分离的核酸序列进一步包含用于控制CAR的表达和/或激活的开关机制，由其组成，或基本上由组成。
本发明提供了载体，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，由该分离的核酸序列组成，或基本上由该分离的核酸序列组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该载体是质粒。在一些实施方式中，该载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方式中，该载体是CRISPR载体。
本发明还提供了分离的细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸、和/或载体，由该CAR、和/或该分离的核酸、和/或该载体组成，或基本上由该CAR、和/或该分离的核酸、和/或该载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸编码该CAR；该载体包含该分离的核酸、由该分离的核酸组成、或基本上由该分离的核酸组成。在一些实施方式中，该分离的细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，该免疫细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，该分离的细胞是T细胞的前体或NK细胞的前体。
本发明提供了组合物，其包含载体和以下中的一个或多个，由载体和以下中的一个或多个组成，或基本上由载体和以下中的一个或多个组成：嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；分离的核酸序列，其编码该CAR；载体，其包含该分离的核酸序列；和/或分离的细胞，其包含该CAR、载体或分离的核酸序列。
在一些实施方式中，该组合物进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，其中该肽包含B7-H4蛋白或其片段。在一些实施方式中，该肽与细胞相连。在一些实施方式中，该肽被结合至固相支持物。在一些实施反式中，该肽被置于溶液中。在一些实施方式中，该肽与基质相连。
本发明提供了生产表达抗-B7-H4CAR的细胞的方法，其包括：(i)用编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列引入免疫细胞的群体，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；以及(ii)选择已经用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-B7-H4CAR的细胞。在一些实施方式中，该免疫细胞是T-细胞。在一些实施方式中，已经将T-细胞的群体修饰来减少或消除内源性T-细胞受体的表达。在一些实施方案中，使用采用RNA干扰或CRISPR的方法来修饰T细胞的群体。
本发明还提供了在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，该方法包括向该对象施用有效量的表达抗-B7-H4CAR的细胞，该细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸、和/或载体，由该CAR、和/或该分离的核酸、和/或该载体组成，基本上由该CAR、和/或该分离的核酸、和/或该载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸编码CAR；该载体包含该分离的核酸，由该分离的核酸组成、或基本上由该分离的核酸组成。在一些实施方式中，表达该抗-B7-H4CAR的细胞对于正被治疗的对象是自体同源的、或同种异体的。在一些实施方式中，该肿瘤或癌症表达或过表达B7-H4。在一些实施方式中，该肿瘤是实体肿瘤，任选地是乳腺肿瘤、结肠肿瘤、或绒毛膜癌肿瘤，和/或该癌症是乳腺癌、结肠癌或绒毛膜癌。在一些实施方式中，该对象是人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在一些实施方式中，抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域包含抗-HLA-G重链(HC)可变区域和抗-HLA-G轻链(LC)可变区域，由该HC和LC组成，或基本上由该HC和LC组成。在一些实施方式中，该CAR进一步包含位于抗-HLA-G HC可变区域和抗-HLA-G LC可变区域之间的接头多肽，由该接头多肽组成、或基本上由该接头多肽组成。
在一些实施方式中，该抗-HLA-G抗体的HC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)GFNIKDTY、(ii)GFTFNTYA或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)IDPANGNT、(ii)IRSKSNNYAT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)ARSYYGGFAY、(ii)VRGGYWSFDV或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)KSVSTSGYSY、(ii)KSLLHSNGNTY或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)LVS、(ii)RMS或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)QHSRELPRT、(ii)MQHLEYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成、或基本由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，该CAR的抗-HLA-G重链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成。在一些实施方式中，抗-HLA-G轻链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽，由其组成，或基本上由其组成。在一些实施方式中，抗-HLA-G重链可变区域包含具有共有序列的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成，该共有序列选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物。在一些实施方式中，抗-HLA-G轻链可变区域包含具有共有序列的多肽，由该多肽组成，或基本上由该多肽组成；该共有序列选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该CAR进一步包含可检测的标记物或纯化标记物。
本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该核酸序列包含选自本发明所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
在一些实施方式中，该分离的核酸进一步包含位于抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列或增强子，由Kozak共有序列或增强子组成，或基本上由Kozak共有序列或增强子组成。在一些实施方式中，该分离的核酸进一步包含抗生素抗性多核苷酸，由抗生素抗性多核苷酸组成，或基本上由抗生素抗性多核苷酸组成。在一些实施方案中，该分离的核酸进一步包含用于控制CAR的表达和/或激活的开关机制，由该开关机制组成，或基本上由该开关机制组成。
本发明还提供了载体，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，由该分离的核酸序列组成，或基本上由该分离的核酸序列组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该载体是质粒。在一些实施方式中，载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方式中，该载体是CRISPR载体或包含CRISPR的载体。
本发明提供了分离的细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸序列、和/或载体，由该CAR、和/或该分离的核酸序列、和/或该载体组成或，基本上由该CAR、和/或该分离的核酸序列、和/或该载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸序列编码CAR；该载体包含该分离的核酸序列，由该分离的核酸序列组成，或基本上由该分离的核酸序列组成的载体。在一些实施方式中，该分离的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，该分离的细胞是T-细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，该分离的细胞是T-细胞的前体或NK细胞的前体。
本发明还提供了组合物，其包含载体和以下中的一个或多个,由载体和以下中的一个或多个组成，或基本上由载体和以下中的一个或多个组成：嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；和/或分离的核酸序列，其编码该CAR；和/或载体，其包含该分离的核酸序列，由该分离的核酸序列组成，或基本上由该分离的核酸序列组成；和/或分离的细胞，其包含该CAR、分离的核酸序列或载体，由该CAR、分离的核酸序列或载体组成，或基本上由该CAR、分离的核酸序列或载体组成。
在一些实施方式中，该组合物进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，由该抗原结合片段组成，或基本上由抗原结合片段组成，其中该肽包含HLA-G蛋白或其片段。在一些实施方式中，该肽与细胞相连。在一些实施方式中，该肽被结合至固相支持物。在一些实施方式中，该肽被置于溶液中。在一些实施方案中，该肽与基质结合。
本发明提供了生产表达抗-HLA-G CAR的细胞的方法，其包含以下步骤、由以下步骤组成、或基本上由以下步骤组成：(i)用编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列引入免疫细胞的群体，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；(ii)选择已用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗HLA-G CAR的细胞。在一些实施方式中，该免疫细胞是T-细胞。在一些实施方式中，已将T细胞的群体修饰来减少或消除内源性T细胞受体的表达。在一些实施方式中，使用采用RNA干扰或CRISPR的方法来修饰T细胞的群体。
本发明还提供了在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，该方法包括向该对象施用有效量的表达抗-HLA-G CAR的细胞，由该步骤组成，或基本上由该步骤组成；该细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸序列、和/或载体，由该CAR、和/或分离的核酸序列、和/或载体组成，或基本上由该CAR、和/或分离的核酸序列、和/或载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸序列编码该CAR；该载体包含该分离的核酸序列，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方式中，表达抗-HLA-G CAR的细胞对于正被治疗的对象是自体同源的或同种异体的。
在该方法的一些实施方式中，肿瘤或癌症表达或过表达HLA-G。在一些实施方式中，该肿瘤是实体肿瘤，任选地为甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤，和/或该癌症是甲状腺癌、卵巢癌或前列腺癌。
在该方法的一些实施方式中，该对象是人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域,(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
在一些实施方式中，抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域包含抗HLA-DR重链(HC)可变区域和抗HLA-DR轻链(LC)可变区域，由该HC可变区域和LC可变区域组成，或基本上由该HC可变区域和LC可变区域组成。在一些实施方式中，CAR进一步包含位于抗-HLA-DR HC可变区域和抗-HLA-DR LC可变区域之间的接头多肽，由该接头多肽组成，或基本上由该接头多肽组成。
在一些实施方式中，抗-HLA-DR抗体的CAR的HC以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)Lym-1抗体的CDRH1、(ii)Lym-2抗体的CDRH1、或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)Lym-1抗体的CDRH2、(ii)Lym-2抗体的CDRH2、或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i(i)Lym-1抗体的CDRH3、(ii)Lym-2抗体的CDRH1或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成；和/或LC包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：CDR1，其包含(i)Lym-1抗体的CDRL1、(ii)Lym-2抗体的CDRL1或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR2，其包含(i)Lym-1抗体的CDRL2、(ii)Lym-2抗体的CDRL2、或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成；和/或CDR3，其包含(i)Lym-1抗体的CDRL3、(ii)Lym-2抗体的CDRL3、或其每一个的等效物的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成，或基本由该氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，抗-HLA-DR重链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。在一些实施方式中，该抗-HLA-DR轻链可变区域包含选自本发明所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。在一些实施方式中，该抗-HLA-DR重链可变区域包含具有共有序列的多肽，该共有序列选自发明所公开的序列或其每一个等效物。在一些实施方式中，抗-HLA-DR轻链可变区域包含具有共有序列的多肽，该共有序列选自发明所公开的序列或其每一个等效物。
在一些实施方式中，该CAR进一步包含可检测的标记物或纯化标记物，由其组成，或基本上由其组成。
本发明提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该核酸序列包含选自发明所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
在一些实施方式中，该分离的核酸进一步包含位于抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域上游的Kozak共有序列或增强子，由其组成，或基本上由组成。
在一些实施方式中，该分离的核酸进一步包含抗生素抗性多核苷酸，由其组成，或基本上由其组成。
在一些实施方式中，该分离的核酸进一步包含用于控制CAR的表达和/或激活的开关机制，由其组成，或基本上由组成。
本发明提供了载体，该载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，由该核酸序列组成，或基本上由该核酸序列组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，该载体是质粒。在一些实施方式中，该载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方式中，该载体是CRISPR载体或包含CRISPR的载体。
本发明提供了分离的细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸、和/或载体，该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸编码该CAR；该载体包含编码该CAR的分离的核酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方式中，该分离的细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，该免疫细胞是T-细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，该分离的细胞是T-细胞或NK-细胞的前体。
本发明提供了组合物，该组合物包含载体和以下中的一个或多个：嵌合抗原受体(CAR)，其包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；和/或分离的核酸，其编码该CAR；和/或载体，其包含编码该CAR的分离的核酸序列，由其组成或基本上由其组成；和/或分离的细胞，其包含该CAR、分离的核酸序列和载体中的至少一个。
在一些实施方式中，该组合物进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，由该抗原结合片段组成，或基本上由该抗原结合片段组成，其中该肽包含HLA-DR蛋白或其片段。在一些实施方式中，该肽与细胞相连。在一些实施方式中，该肽被结合至固相支持物。在一些实施方式中，该肽被置于溶液中。在一些实施方案中，该肽与基质结合。
本发明提供了生产表达抗-HLA-DR CAR的细胞的方法，该细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸、和/或载体，由该CAR、和/或分离的核酸、和/或载体组成，或基本上由该CAR、和/或分离的核酸、和/或载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸编码该CAR；该载体包含编码该CAR的分离的核酸，由其组成或基本上由其组成；该方法包括：(i)用编码权利要求119至129中任一项所述的CAR的核酸序列引入免疫细胞的群体；(ii)选择已用步骤(i)所述的核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗HLA-DR CAR的细胞。在一些实施方式中，该免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，已将T细胞的群体修饰以减少或消除内源性T细胞受体的表达。在一些实施方式中，使用采用RNA干扰或CRISPR的方法来修饰T细胞的群体。
本发明还提供了在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，该方法包括向该对象施用有效量的表达抗-HLA-DR CAR的细胞，该细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、和/或分离的核酸、和/或载体，由该CAR、和/或分离的核酸、和/或载体组成，或基本上由CAR、和/或分离的核酸、和/或载体组成；该CAR包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：(a)抗HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8α铰链结构域，(c)CD8α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号区，(e)CD3ζ信号传导结构域；该分离的核酸编码该CAR；该载体包含编码该CAR的分离的核酸，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方式中，该表达抗-HLA-DR CAR的细胞对于正被治疗的对象是自体同源的或同种异体的。
在该方法的一些实施方式中，与正常的、非癌性的对应细胞相比，肿瘤或癌症表达或过表达HLA-DR。在一些实施方式中，该肿瘤是B细胞淋巴瘤肿瘤或白血病肿瘤，和/或该癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
在该方法的一些实施方式中，对象是人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
本文提供了试剂盒，其包含本发明所公开的CAR、分离的核酸序列、载体、分离的细胞和组合物中的一种或多种，以及根据本发明所公开的一种或多种方法的使用说明书。
抗体及其应用
组合物
抗体的大体结构在本领域中是已知的，在此将仅进行简要的概述。免疫球蛋白单体包括通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。每条重链都和轻链中的一个配对，它们通过二硫键被直接结合。每条重链包含恒定区域(其根据抗体的同种型而变化)和可变区域。可变区域包含三个高度可变区域(或互补决定区域)，其被命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3并且被支撑在框架区域之内。每条轻链包括恒定区域和可变区域，可变区域包含三个高度可变区域(命名为CDRL1、CDRL2和CDRL3)，其以与重链的可变区域类似的方式被支撑在框架区域中。
每对重链和轻链的高度可变区域相互配合来提供能够结合靶标抗原的抗原结合位点。每对重链和轻链的结合特异性由重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列来界定。因此，一旦确定了引起特定的结合特异性的一组CDR序列(即重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列)，则原则上该组CDR序列能够被插入进通过任何抗体恒定区域来连接的任何其他抗体的框架之内的适当位置，从而提供具有相同的抗原结合特异性的不同的抗体。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，其包括重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该抗体结合至促黄体激素受体(LHR)、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的表位。
抗-LHR抗体
如下文更详细所述，发明人已经证明了LHR是CAR T-细胞疗法的有效靶标。如下表1和图1所示，利用9种已经良好确立的人类卵巢细胞系的流式细胞术研究示出了，与间皮素和MUC16相比LHR是优异的靶标，该间皮素和MUC16仅在一半或更少的被测试的细胞系上是阳性的。如表2所示，还通过免疫组化在人卵巢癌的多区块载玻片上测试了这些靶标。与流式细胞术的结果一致，不管被测试的肿瘤的阶段或等级如何，与间皮素和MUC16阳性相比，通过这些方法更一致地看到LHR阳性。如在图2中所示，每种抗体的免疫组织化学染色图案有些不同。MUC16和间皮素抗体都倾向于染色肿瘤结节的腔表面而不染色所有细胞(特别是在肿瘤结节的周围上更多的细胞)的细胞表面。相反，LHR抗体对细胞质和细胞表面都进行染色，并且倾向于对肿瘤结节的所有细胞都染色。最终，在正常组织的多组织阵列上测试了每种抗体的脱靶染色。这些研究的结果在以下表3中示出，并且示出了所有三种靶标都在正常组织上具有受限的反应性。
在一个方面，该抗体的所HC包括以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或该抗体的LC包括以下部分、或基本上由以下部分组成、或进一步地由以下部分组成：CDR1，其包括SSVNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，该抗体包含该HC，该HC包括以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GFSLTTYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或该抗体的LC包括以下部分、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，该抗体的HC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或该抗体的LC包括以下部分、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSISNN或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括NAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QQSNSWPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了分离的抗-LHR抗体，其是针对LHR片段而生成的。
在一个实施方式中，该LHR片段是LHR G蛋白的一部分，其具有以下的氨基酸序列：REALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTK.
在另一个实施方式中，该LHR片段是LHR蛋白的N末端，其具有以下的氨基酸序列：RALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPS.
在另一个实施方式中，该抗体是单克隆抗体，该单克隆抗体包含：抗LHR重链可变区域，其包含选自本发明所公开的那些多肽或其每一个的等效物的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成；以及抗LHR轻链可变区域，其包含选自本发明所公开的那些多肽或其每一个的等效物的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成。
在另一个方面，该抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，本发明所公开的抗体具有至少10-6M结合亲和力。在某些方面中，抗体的结合亲和力为至少约10-7M，并且优选为10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。
在另一个方面，该重链可变区域包含具有选自本发明所公开的共有序列的多肽，或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成；以及抗LHR轻链可变区域包含具有选自本发明所公开的共有序列的多肽，或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成。
在另一个方面，本发明提供了分离的核酸，其编码该分离的抗-LHR抗体。在进一步的实施方式中，该分离的核酸包含选自本发明所公开的那些核酸序列或其每一个的等效物的核酸序列、或基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，该抗体的HC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY或其每一个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该抗体的轻链可变区域包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括SSVNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一个方面，该抗体的HC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包含GFSLTTYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或该抗体的LC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT或其每一个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在另一方面，该抗体的HC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或该抗体的LC包含以下中的一个或多个、或基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包含QSISNN或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包含NAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包含QQSNSWPYT或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了分离的抗-LHR抗体，其是针对LHR片段而生成的。
在一个实施方式中，针对其而产生了该抗体的该LHR片段是LHR蛋白的一部分，其具有以下氨基酸序列：
REALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTK.
在另一个实施方式中，该LHR片段是LHR蛋白的N-末端，其具有以下氨基酸序列：
RALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPS.
在另一个实施方式中，该抗体是单克隆抗体，该单克隆抗体包含抗LHR重链可变区域，其包含选自本发明所公开的那些多肽或其每一个的等效物的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成。
在另一个实施方式中，该抗体是单克隆抗体，该单克隆抗体包含抗LHR轻链可变区域，其包含选自本发明所公开的那些多肽或其每一个的等效物的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成。
在另一个方面，该抗LHR抗体是嵌合抗体、人类或人源化抗体。
在另一个方面，该重链可变区域包含具有选自本发明所公开的那些共有序列的共有序列的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成；以及抗LHR轻链可变区域包含具有选自本发明所公开的那些共有序列或其每一个的等效物的的共有序列的多肽、或基本上由该多肽组成、或进一步地由该多肽组成。
在本技术的另一个方面，该分离的抗体包括以下特征中的一个或多个：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85％相同；
(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85％相同；以及
(e)该抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，其与本发明所公开的抗LHR抗体(例如5F4-21、4A7-4、8B7-3或138-2)至少85％相同。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体结合人类LHR的解离常数(KD)为小于10- 4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在本文提供的抗体的一些方面，该抗原结合位点特异性地结合至人类LHR。
抗-B7-H4抗体
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该抗体包含重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列形成结合至人类B7-H4的表位的抗原结合位点。在一个方面，该抗体具有至少10-6M的结合亲和力。在某些方面，该抗体的结合亲和力为至少约10-7M，以及优选地为10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。
在一些实施方式中，该重链可变结构域包含CDRH1序列，该CDRH1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成：该氨基酸序列以GXTF开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸或约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，该CDRH1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以下列序列中的任意一个开始：(i)GFTFSSFG、(ii)GFTFSSYG、(iii)GYTFTDY或其等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH2序列，该CDRH2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以ISSXXXT开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，该CDRH2序列包含这样氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸以下列序列中的任意一个开始：(i)ISSGSSTL、(ii)ISSSNSTI或其等效物，随后是在羧基末端另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在其他的实施方式中，该重链可变区域包含CDRH2序列，该CDRH2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以INPNNGGT或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH3序列，该CDRH3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以ARPXYY开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或接着约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，该CDRH3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸以下列序列中的任意一个开始：(i)ARPLYYYGSVMDY、(ii)ARPYYYGSSYDY、或其等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或由其组成：GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTC或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或由其组成：
EVQLEESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMKLPSLCYGLLGSRNLSHRLL(B7-H4 5F6重可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或由其组成：
GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGAATTCACTGGGTTCGTCAGGTTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTTATTAGTAGTAGCAATTCTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCGAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACCCCTTTACTACTATGGTAGCGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或由其组成：
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSYGIHWVRQVPEKGLEWVAFISSSNSTIYYADTVKGRFTISRDNAENTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARPLYYYGSVMDYWGQGTSVTVSS(B7-H4#33-14重可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或者基本上由其组成、或由其组成：
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGATGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGTCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCTTATTACTACGGTAGTAGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或由其组成：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYYGSSYDYWGQGTTLTVS(B7-H4#36-1重可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL1序列，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以QSIVHXNGTY开始，随后是在羧基末端的另外的50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步地的实施方式中，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以下述序列中的任一个开始：(i)QSIVHRNGNTY、(ii)QSIVHSNGNTY、或其等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL1序列，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，该氨基酸序列以ENIGSY或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸，或约40个氨基酸，或约30个氨基酸，或约20个氨基酸，或约10个氨基酸，或约5个氨基酸，或约4，或3，或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL2序列，该CDRL2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以KVS开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL2序列，该CDRL2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以AAT或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL3序列，该CDRL3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以FQGSXVPXT开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以下述序列中的任一个开始：(i)FQGSYVPPT、(ii)FQGSHVPLT或其等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL3序列，该CDRL3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成，该氨基酸序列以QHYYSTLVT或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或由其组成：
GACATTGTGATCACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGGAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACTTGCAGCAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA或其抗原结合片段或每一个的其等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成：
DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQQPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSYVPPTFGGGTKLEIK(B7-H4 5F6轻可变)或其抗原结合片段或每一个的其等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或由其组成：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATAAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAA或其抗原结合片段或每一个的其等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK(B7-H4#33-14轻可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或由其组成：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTGGCAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACACTCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCGAGATATTACTGTCAACATTATTATAGTACTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIGSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATLLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTLVTFGAGTKLELK(B7-H4#36-1轻可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在本技术的另一方面，该分离的抗体包含以下特征中的一个或多个：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85％相同；
(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85％相同；以及
(e)该抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体与选自B7H4 5F6、B7H4#33-14和B7H4#36-1的抗体至少85％是相同的。
在进一步的方面，上述指出的抗体具有至少10-6M的结合亲和力。在某些方面，抗体的结合亲和力为至少约10-7M、并且优选地为10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体包含B7H4 5F6的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体与B7H4 5F6至少85％是相同的。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体包含B7H4#33-14的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体与B7H4#33-14至少85％是相同的。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体包含B7H4#36-1的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，该分离的抗体与B7H4#36-1至少85％是相同的。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4 5F6的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4 5F6的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4#33-14的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4#33-14的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4#36-1的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4#36-1的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，该抗体结合人类B7-H4的解离常数(KD)小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的。在本发明在此提供的抗体的一些方面，该抗原结合位点特异性地结合至人类B7-H4。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，该抗体结合至表位，该表位结合B7H4 5F6、B7H4#33-14和B7H4#36-1抗体。
在本发明提供的抗体的一些方面，B7-H4-特异性抗体与B7H4 5F6、B7H4#33-14和B7H4#36-1竞争结合人类B7-H4。
抗-HLA-G抗体
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，其包含重链(HC)免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中该重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列形成结合至人类HLA-G的表位的抗原结合位点。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH1序列，该CDRH1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由该氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)GFNIKDTY、(ii)GFTFNTYA或其每一个的等效物，并且随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH2序列，该CDRH2序列包含这样的氨基酸序列、或者基本上由该氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)IDPANGNT、(ii)IRSKSNNYAT或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH3序列，该CDRH3序列包含这样的氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)ARSYYGGFAY、(ii)VRGGYWSFDV或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽，或基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGAGTTACTACGGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含以下氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
QVQLQESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARSYYGGFAYWGQGTLVTVSA
(3H11重可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTTTGGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTCTCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGTGAGAGGGGGTTACTGGAGCTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
EVQLQESGGGLVQPKGSLKLSCAAFGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLSLQMNNLKTEDTAIYYCVRGGYWSFDVWGAGTTVTVSS(HLA-G 4E3重链可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL1序列，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或者基本上由该氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)KSVSTSGYSY、(ii)KSLLHSNGNTY或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL2序列，该CDRL2序列包含这样的氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以LVS或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL2序列，该CDRL2序列包含这样的氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，所述氨基酸序列以RMS或其等效物开始，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL3序列，该CDRL3序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)QHSRELPRT、(ii)MQHLEYPYT或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GATATTGTGCTCACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPRTFGGGTKLEIK(3H11轻链可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由下述多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GATATTGTGATCACACAGACTACACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGTAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATCTCGGATGTCCAGCCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含以下氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
DIVITQTTPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLISRMSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(HLA-G 4E3轻链可变)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在本技术的另一方面，分离的抗体包括一个或多个以下特征：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85％相同；
(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85％相同；以及
(e)该抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
包含所公开的CDR序列以及重链和轻链可变序列的示例性抗体分别在表1和表2中公开。
在一个方面，本发明提供分离的抗体，其与选自3H11和HLA-G 4E3的抗体至少85％相同。
在一个方面，本发明提供分离的抗体，其包含3H11的CDR。在一个方面，本发明提供分离的抗体，其与3H11至少85％相同。
在一个方面，本发明提供分离的抗体，其包含HLA-G 4E3的CDR。在一个方面，本发明提供分离的抗体，其与HLA-G 4E3至少85％相同。
在本发明提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含3H11的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含3H11的可变结构域序列。
在本发明提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含HLA-G 4E3的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含HLA-G 4E3的可变结构域序列。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体结合人HLA-G的解离常数(KD)小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在本发明提供的抗体的一些方面，抗原结合位点特异性地结合至人类HLA-G。
抗-HLA-DR抗体
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH1序列，该CDRH1序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)GFSLTSYG、(ii)GFTFSNYW或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH2序列，该CDRH2序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)IWSDGST、(ii)IRFKSHNYAT或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRH3序列，该CDRH3序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)ASHYGSTLAFAS、(ii)TRRIGNSDYDWWYFDV或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCATCTCAGGGTTCTCATTAACCAGCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTAGTGATATGGAGTGATGGAAGCACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGTCACTACGGTAGTACCCTTGCCTTTGCTTCCTGGGGCCACGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(Lym-1重链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
QLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASHYGSTLAFASWGHGTLVTVSA(Lym-1重链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含由下示多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GAAGTGCAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGCTCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTTAAATCTCATAATTATGCAACACATTTTGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGGATAGGAAACTCTGATTACGACTGGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC(Lym-2重链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
EVQLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRFKSHNYATHFAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRIGNSDYDWWYFDVWGAGTSVTVSSAS(Lym-2重链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该重链可变区域包含CDRL1序列，该CDRL1序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)VNIYSY、(ii)QNVGNN或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL2序列，该CDRL2序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)NAK、(ii)SAS或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含CDRL3序列，该CDRL3序列包含这样的氨基酸序列，或基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成，该氨基酸序列以以下序列中的任一个开始：(i)QHHYGTFT、(ii)QQYNTYPFT或其每一个的等效物，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCATATGTCGAGCAAGTGTGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCCAAAATCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(Lym-1轻链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
DIQMTQSPASLSASVGETVTIICRASVNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTFTFGSGTKLEIK(Lym-1轻链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或者基本上由该多肽组成，或由该多肽组成：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTAATAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(Lym-2轻链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，该轻链可变区域包含下述氨基酸序列，或者基本上由该氨基酸序列组成，或由该氨基酸序列组成：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGNNVAWYQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNTYPFTFGSGTKLEIK(Lym-2轻链可变)，或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在本技术的另一方面，分离的抗体包括一个或多个以下特征：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85％相同的一个或多个CDR；
(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85％相同；
(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85％相同；以及
(e)该抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，其与选自Lym-1和Lym-2的抗体至少85％相同。
在一个方面，本发明提供了包含Lym-1的CDR的分离的抗体。在一个方面，本发明提供了与Lym-1至少85％相同的分离的抗体
在一个方面，本发明提供了包含Lym-2的CDR的分离的抗体。在一个方面，本发明提供了与Lym-2至少85％相同的分离的抗体。
在本发明提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含Lym-1的可变结构域序列，或基本上由该可变结构域序列组成，或由该可变结构域序列组成；以及LC可变结构域序列包含Lym-1的可变结构域序列，或基本上由该可变结构域序列组成，或由该可变结构域序列组成。
在本发明提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含Lym-2的可变结构域序列，或基本上由该可变结构域序列组成，或由该可变结构域序列组成；以及LC可变结构域序列包含Lym-2的可变结构域序列，或基本上该可变结构域序列组成，或由该可变结构域序列组成。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体结合人类HLA-DR的解离常数(KD)小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在本发明提供的抗体的一些方面，抗原结合位点特异性地结合至人类HLA-DR。
抗体特性和功能
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是可溶性Fab。
在本发明提供的抗体的一些方面，HC和LC可变结构域序列是相同多肽链的组分。在本发明提供的抗体的一些方面，HC和LC可变结构域序列是不同多肽链的组分。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是全长抗体。在其他方面，提供抗体的抗原结合片段。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是单克隆抗体。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是嵌合的或人源化的。
在本发明提供的抗体的一些方面，抗体片段选自Fab、F(ab)'2、Fab’、scFv和Fv。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体包含Fc结构域。在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是兔抗体。在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体是人类抗体或人源化抗体，或在人体内是非免疫原性的。在本发明提供的抗体的一些方面，包含人类抗体框架区域。
在其他方面，在本发明提供的抗体的CDR中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。该取代可以是“保守性的”，意思是在相同家族的氨基酸之内的取代。天然存在的氨基酸可以被分为以下四个家族并且保守性取代将在这些家族之内发生：
1)具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
2)具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；
3)具有不带电极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；
4)具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
在另一方面，一个或多个氨基酸残基被添加至抗体的一个或多个CDR或者被从中删除。这样的添加或删除发生在CDR的N或C末端或者在CDR之内的位置处。
通过氨基酸的添加、缺失或取代而改变抗体的CDR的氨基酸序列，可以得到各种效果，例如提高对靶标抗原的结合亲和力。
应该理解的是，包含这样的被改变的CDR序列的本发明的抗体仍然通过与公开的抗体相似的特异性和灵敏度而结合LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR。这可以通过结合测定来进行测试。
抗体的恒定区域也可以被改变。例如，抗体可以设有任何同种型的Fc区域：IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM。恒定区域序列的非限制性例子包括：
人类IgD恒定区域，Uniprot:P01880
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人类IgG1恒定区域，Uniprot:P01857
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG2恒定区域，Uniprot:P01859
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG3恒定区域，Uniprot:P01860
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人类IgM恒定区域，Uniprot:P01871
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人类IgG4恒定区域，Uniprot:P01861
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人类IgA1恒定区域，Uniprot:P01876
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类IgA2恒定区域，Uniprot:P01877
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类Igκ恒定区域，Uniprot:P01834
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些方面，该抗体包含与本发明公开的那些抗体中任一个至少80％相同的重链恒定区域。
在一些方面，该抗体包含与本发明公开的抗体中任一个至少80％相同的轻链恒定区域。
在本发明提供的抗体的一些方面，该抗体含有结构性修饰来促进快速结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体含有在抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，Fab片段被用于促进快速结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，F(ab)'2片段被用于促进快速结合和细胞摄取、和/或降低释放。
该抗体、片段及其等效物可以与载体结合(例如药学上可接受的载体或其他试剂)，以提供用于使用和/或储藏的制剂。
进一步提供的是分离的多肽，其包括可用来生成结合至LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR或其片段的氨基酸序列，或替代地基本上由其组成，或进一步地由其组成；并且提供的是编码它们的分离的多核苷酸。在一方面，所述分离的多肽或多核苷酸进一步包括标签或选择性标记物和/或连续的多肽序列(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)载体蛋白)，或者在多核苷酸的情况下，包括编码可操作地结合至多肽或多核苷酸的该序列的多核苷酸。该多肽或多核苷酸可以与各种载体(例如磷酸盐缓冲盐水)结合。进一步提供了宿主细胞，例如原核或真核细胞，例如细菌、酵母、哺乳动物(大鼠、类人猿、仓鼠、或人类)，其包括该分离的多肽或多核苷酸。该宿主细胞可以与载体结合。
进一步提供了编码如本发明公开的抗体及其片段的分离的核酸。它们可以与载体或合适的宿主细胞、和/或适当的载体结合以用于诊断或治疗用途。在一个方面，该核酸与宿主细胞容纳在一起，用于多肽和蛋白的重组生产。该宿主细胞可以是原核或真核的。
用于制备组合物的方法
抗体、它们的制造和用途是公知的并且被公开于例如Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1999。该抗体可以使用本领域已知的标准方法来生成。抗体的例子包括(但不限于)抗体的单克隆、单链、和功能性片段。用于生成这样抗体的方法是本领域中已知的，参见例如Collarini et al.(2009)J.Immunol.183(10):6338-6345。
可以在一定范围的宿主(例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类以及其他)内生产抗体。可以通过使用具有免疫原性特性的靶标抗原或其片段或寡肽(例如，LHR或B-7-H4、HLA-G或HLA-DR的C末端片段或其分离的多肽)进行注射来使它们免疫。根据宿主种类，可以加入和使用各种佐剂，以提高免疫反应。这样的佐剂包括但不限于弗氏(Freund's)试剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、以及二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)是特别有用的。本发明还提供了分离的多肽和佐剂。
在一些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的混合物。在一个方面，该多克隆抗体包含具有不同的CDR的多个类型的抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的混合物。因此，培养生产不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从得到的培养物纯化的抗体(参见WO 2004/061104)。
单克隆抗体生产。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来制备对于LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的单克隆抗体。这样的技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975))；三肿瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor,et al.,Immunol.Today 4:72(1983))以及EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如Cole,et al.,in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以通过使用人类杂交瘤(参见例如Cote,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030(1983))或者通过用Epstein Barr病毒体外转染人类B细胞(参见例如Cole,et al.,in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))来生产。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的PCR，来扩增编码抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段(例如可变结构域)的DNA。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白)的DNA，用于表达和展示噬菌体或细菌上的融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代地，可以通过例如使用包括LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR或其片段的氨基酸序列、或基本上由其组成、或由其组成的分离的多肽，使对象免疫，然后使用常规方法来从该对象的脾分离杂交瘤，来制备表达杂交瘤的抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR单克隆抗体。参见例如Milstein et al.,(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73:3-46(1981))。使用标准方法来筛选杂交瘤将生产不同特异性(即对不同表位的特异性)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性(例如LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR结合)的选择的单克隆抗体可以(i)被用作通过杂交瘤来表达，(ii)被结合至例如聚乙二醇(PEG)的分子以改变其特性，或(iii)可以通过各种方法来分离、测序和操纵编码该单克隆抗体的cDNA。在一个方面，通过杂交瘤来生产抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其中该转基因非人动物具有包含被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.,349(1988)；Hammerling et al.,Monoclonal Antibodies And T-CellHybridomas,563-681(1981)中教导的技术。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来生产本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固相表面或磁珠的抗原，从全部的或组合的抗体文库(例如人类或鼠类)中选择具有期望的结合特性的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括具有Fab、Fv的fd和M13，或者二硫化稳定化的Fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。此外，方法可以适用于构建Fab表达文库(参见例如Huse,et al.,Science 246:1275-1281,1989)，以允许具有LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物)的所需的特异性的单克隆Fab片段的快速和有效的识别。可以被用来制造本发明的分离的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括在以下文献中公开的方法：Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:1066-1070(1990)；Brinkman et al.,J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Ames et al.,J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)；Kettleborough et al.,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic et al.,Gene187:9-18(1997)；Burton et al.,Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(Medical Research Council et al.)；WO97/08320(Morphosys)；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)；以及美国专利号5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743。
洛宁的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上显示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，编码来自噬菌体的区域的抗体可以被分离并且被用来生成整个抗体(包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段)，并且被表达在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，例如在WO 92/22324；Mullinax et al.,BioTechniques 12:864-869(1992)；Sawai et al.,AJRI 34:26-34(1995)；以及Better et al.,Science 240:1041-1043(1988)中公开的。
通常，可以针对合适的抗体来选择被克隆到显示载体中的杂交抗体或杂交抗体片段，从而识别维持了良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如Barbas III et al.,Phage Display,A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。但是，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体(被修饰的T7或Lambda Zap系统)以用于选择和/或筛选。
抗体生产的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或面板，来产生抗体(Orlandi et al.,PNAS 86:3833-3837(1989)；Winter,G.et al.,Nature,349:293-299(1991))。
替代地，可以使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体(scFv)包含通过接头肽(通常长度为5至25个氨基酸)连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scFv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scFv，例如通过编码该scFv的载体在宿主生物(例如E.coli)中的表达。可以通过以下方法获得编码scFv的DNA：使用部分DNA作为模板进行扩增，其中该部分DNA编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的DNA和编码其轻链或轻链的可变区域的DNA的DNA的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的PCR，并且进一步结合编码多肽接头部分的DNA和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将该接头的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scFv的DNA的表达载体和由该表达载体转化的宿主。
还可以生成抗原结合片段，例如F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来生产，而Fab片段可以通过减少F(ab′)2片段的二硫键而生成。替代地，可以构建Fab表达文库来使具有期望的特异性的单克隆Fab片段的快速和简单的识别可以进行(Huse etal.,Science,256:1275-1281(1989))。
抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。将被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将IgG CH3结构域结合至两个scFv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本发明公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂(免疫偶联物)之间形成的偶联物的形式。在一方面，本发明公开的抗体被偶联至放射性物质。在另一方面，本文公开的抗体可以被结合至各种类型的分子，例如聚乙二醇(PEG)。
抗体筛选。可以使用多种免疫测定来进行筛选，以识别具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测定的许多方案在本领域中是已知的。这样免疫测定通常涉及测量在LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用利用对两个非干扰的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测定，但是也可以采用竞争性结合测试(Maddox et al.,J.Exp.Med.,158:1211-1216(1983))。
可以使用Ventana Medical Systems,Inc(VMSI)Discovery XT和在玻璃载玻片上的福尔马林固定的、石蜡包埋的人体组织，进行可能的抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的自动的免疫组织化学(IHC)筛选。组织样品首先进行去石蜡化、抗原修复，然后加入可能的抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体和检测抗体。使用来自VMSI的色原检测试剂使该检测抗体可视化。在显微镜下手工筛选被染色的载玻片。具有正确的初级抗体染色图案的样品被选择为可能的抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR候选。
抗体纯化。可以将本发明公开的抗体纯化至同质化。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。
仅仅作为例子，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用，分离和纯化抗体。Strategies forProtein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,DanielR.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies:ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。
色谱法的例子包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液体色谱(例如HPLC或FPLC)进行色谱。
在一个方面，在亲和色谱中可以使用Protein A柱或Protein G柱。其他示例性的柱包括Protein A柱、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。
使用方法
概述。本发明公开的抗体可用于本领域中涉及LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的定位和/或定量的方法(例如用于测量在适当的生理样品之内的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的水平、用于诊断方法、用于使多肽成像等)。本发明公开的抗体可用于通过标准技术(例如亲和色谱或免疫沉淀)分离LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽。本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可以促进来自生物样品(例如哺乳动物血清或细胞)的天然LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽以及在宿主系统中表达的重组地生产的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的纯化。再者，可以使用LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体来检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽(例如在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中)，从而评估多肽的表达的丰度和模式。可以诊断性地使用本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽，以作为临床测试过程的一部分来监控组织中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR水平，例如从而确定给定的治疗方案的功效。可以通过将本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体结合(即物理地连接)至可检测的物质，以促进检测。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包括结合至肽的本发明公开的抗体或抗原结合片段，所述肽包含例如人类LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR蛋白或其片段。在一方面，所述肽与细胞相连。例如，所述组合物可以包含采用本发明公开的抗体或抗体片段进行标记的被分解的细胞样品，该组合物可用于例如用于分离细胞的亲和色谱方法或基于流式细胞术的细胞分析或细胞分选。作为另一例子，所述组合物可以包含用本发明公开的抗体或抗体片段进行标记的被固定的组织样品或细胞涂片，该组合物可用于例如免疫组化或细胞学分析。在另一方面，所述抗体或抗体片段被结合至固相支持物，其可用于例如：ELISA；亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR蛋白或其片段，LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR阳性细胞、或含有LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR和其他细胞组分的复合物。在另一方面，所述肽被结合至固相支持物。例如，所述肽可以通过对该肽具有特异性的二级抗体而被结合至固相支持物，其可用于例如夹心ELISA。作为另一个例子，所述肽可以被结合至色谱柱，其可用于例如根据本技术的抗体的分离或纯化。在另一方面，所述肽被置于溶液中，例如裂解溶液或含有被分离的细胞的亚细胞组分的溶液，其可用于例如ELISA和亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR蛋白或其片段、或含有LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR和其他细胞组分的复合物。在另一方面，所述肽与基质相连，例如凝胶电泳凝胶或通常被用于蛋白免疫印迹的基质(例如由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯制成的膜)，该组合物可用于电泳和/或免疫印迹技术，例如蛋白免疫印迹。
LHR、B7-H4、HLA-G、或HLA-DR多肽的检测。用于检测生物样品中的LHR、B7-H4、HLA-G、或HLA-DR多肽的水平的示例性方法涉及从对象获得生物样品，并且将所述生物样品与能够检测LHR、B7-H4、HLA-G、或HLA-DR多肽的本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G、或HLA-DR抗体相接触。
在一方面，本发明所公开抗体(例如，5F4-21、4A7-4、8B7-3、138-2、B7-H4 5F6、B7-H4#33-14、B7-H4#36-1、HLA-G 4E3、3H11、Lym-1或Lym-2)或其片段被可检测地标记。关于抗体的术语“标记”旨在包括抗体的直接标记以及抗体的间接标记，该直接标记通过将可检测的物质连接(即物理地连接)至抗体，而所述间接标记通过与被直接地标记的另一种化合物的反应性。间接标记的非限制性例子包括使用荧光标记的二级抗体进行的初级抗体的检测，以及使用生物素进行的DNA探针的末端标记，使得它能够通过荧光标记的链霉亲和素而被检测。
本发明的检测方法可以被用来体外及体内检测生物样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达水平。用于LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光(例如IHC)。进一步地，用于LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的体内检测技术包括将被标记的抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体引入对象中。仅仅作为例子，可以使用放射性标记物来标记所述抗体，可以通过标准的成像技术来检测该标记物在对象中的存在和位置。在一方面，所述生物样品包括来自测试对象的多肽分子。
免疫测定和成像。本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可以被用来使用基于抗体的技术测定生物样品(例如人类血浆)中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽水平。例如，可以使用经典的免疫组化(IHC)染色方法来研究组织中的蛋白表达。Jalkanen,M.etal.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen,M.et al.,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)。用于检测蛋白基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测试标签在本领域中是已知的并且包括：酶标签，例如葡萄糖氧化酶；以及放射性同位素或其他放射剂，例如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)、和锝(99mTc)；以及荧光标签，例如荧光素和罗丹明、以及生物素。
除了在生物样品中测定LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽水平之外，还可以通过成像而在体内检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽水平。可以与抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体结合以用于LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽水平的体内成像的标签包括能够通过X射线照相、NMR或ESR检测的标签。对于X射线照相，适当的标签包括放射性同位素(例如钡或铯)，其发射可检测的辐射但不对对象显著有害。用于NMR和ESR的适当的标记物包括具有可检测的特性螺旋的标记物(例如氘)，其可以通过对于相关的scFv克隆的营养素的标记而被结合进LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体。
具有已经标记有合适的可检测的成像部分(例如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的材料)的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体，被引入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)进所述对象。在本领域中将理解的是，对象的大小和使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况中，对于人类对象，注射的放射性的量将通常为约5至20毫居里99mTc。被标记的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体然后将会优先地积累在含有特异性靶标多肽的细胞的位置。例如，在S.W.Burchiel et al.,Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer 13(1982)中描述了体内肿瘤成像。
在一些方面，含有促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的结构性修饰的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可用于体内成像检测方法。在一些方面，LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体含有在该抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的诊断性使用。本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体组合物可用于诊断和预后方法。因此，本发明提供了用于在对象中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR相关的医疗状况的诊断中使用本发明公开的抗体的方法。可以选择本发明公开的抗体，使得它们具有对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的高水平的表位结合特异性和高的结合亲和力。一般来说，抗体的结合亲和力越高，则在免疫测定中可以进行的洗涤条件越严格，以在不移除靶标多肽的情况下移除非特异性结合的材料。相应地，可用于诊断性测定的本技术的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体通常的结合亲和力为至少10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M。在一些方面，被用作诊断试剂的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体具有足够的动力学上的速率(kinetic on-rate)，以在至少12小时、至少5小时、至少1小时、或至少30分钟在标准条件下达到平衡。
本技术的一些方法采用抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的多克隆制剂和多克隆的抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体组合物作为诊断试剂，而其他方法采用单克隆分离物。在采用根据上述方法而制备的多克隆人类抗-LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的方法中，制剂通常含有LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的混合物，例如具有对靶标多肽的不同的表位特异性的抗体。本发明的单克隆抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可用于在存在或可能存在紧密相关的抗原的情况下检测单一的抗原。
本发明的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可以被用作对于任何类型的生物样品的诊断试剂。在一个方面，本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可用作对于人类生物样品的诊断试剂。LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体可以被用来在各种标准测定方式中检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽。这样的方式包括免疫沉淀、蛋白免疫印迹、ELISA、放射免疫测定、流式细胞术、IHC和免疫测定。参见Harlow&Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Publications,New York,1988)，美国专利申请号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,879,262、4,034,074、3,791,932、3,817,837、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、和4,098,876。可以从对象的任何组织(包括活组织检查)、细胞或体液中获得生物样品。
LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的预后使用。本发明还提供了预后(或预测)测定，用于确定对象是否有风险发展与增加的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达或活性(例如癌前细胞的检测)相关的医学疾病或病症。这样的测定可以被用于预后或预测目的，从而因此在以LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达为特征或与其相关的医学疾病或病症的发作之前，预防性地治疗个体。
本发明的另一方面提供了用于确定对象中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR表达的方法，从而为该对象选择合适的治疗或预防化合物。
替代地，所述预后测定可以被用来识别患有或者有风险发展癌症和/或实体肿瘤的对象。在某些实施方式中，该癌症和/或肿瘤是甲状腺、乳腺、结肠、前列腺、卵巢的癌症和/或肿瘤，或更具体地是绒毛膜癌；或癌症和/或肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。因此，本发明提供了一种用于识别与增高的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达水平相关的疾病或病症的方法，其中从对象获得测试样品并且检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽，其中与对照样品相比LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的增高的水平的存在，是对象患有或者有风险发展与增高的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达水平相关的疾病或病症的预示。在一些方面，与增高的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达水平相关的疾病或病症选自癌症和/实体肿瘤。在某些实施方式中，该癌症和/或肿瘤是甲状腺、乳腺、结肠、前列腺、卵巢的癌症和/或肿瘤，或绒毛膜癌；或B细胞淋巴瘤或白血病。
另一方面，本发明提供了用于确定对象是否可以用与LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽表达增加相关的病症或病症的化合物有效治疗的方法，其中从该对象获得生物样品，并使用LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽。在从该对象中获得的生物样品中确定LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达水平，并与在从对象中获得或从没有患有该疾病的患者群体分离的生物样品中发现LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR表达水平进行比较。与从健康对象中获得的样品相比，在从怀疑患有疾病或病症的对象中获得的样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的升高水平，表明在被测试的对象中与LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR相关疾病或病症。与来自没有患有疾病的患者的患者样品中的多肽或蛋白质的表达水平相比，LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达增加表明患者可能对本发明的CAR T细胞或CAR NK细胞疗法有反应，以及缺乏升高的表达表明患者不太可能对该CAR T细胞或CAR NK细胞疗法有反应。样品的非限制性例子包括例如任何体液(包括但不限于例如痰、血清、血浆、淋巴液、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液)，并且包括身体组织的活检样品。该样品也是肿瘤细胞。用于上述方法的测试样品将根据测定形式，检测方法的性质以及用作待测样品的组织、细胞或提取物而变化。
在特定的方面，本发明涉及用于确定患者是否对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DRCAR疗法可能有反应或不可能有反应的方法。在具体的实施方式中，该方法包含使分离自患者的肿瘤样品与有效量的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR结合剂(例如LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体)接触，并检测与肿瘤样品结合的任何试剂或抗体的存在。在进一步的实施方式中，试剂或抗体与肿瘤样品结合的的存在表明患者可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法有反应，并且抗体与肿瘤样品结合的不存在表明患者不太可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR疗法有反应。样品的非限制性例子包括例如任何体液(包括但不限于例如痰、血清、血浆、淋巴液、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液)，并且包括身体组织的活检样品。该样品也是肿瘤细胞。用于上述方法的测试样品将根据试验形式，检测方法的性质以及用作待测样品的组织、细胞或提取物而变化。在一些实施方式中，该方法包括向被确定可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法有反应的患者施用有效量的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法的额外的步骤。在一些实施方式中，患者患有表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的肿瘤和/或癌症。
存在许多疾病状态，其中已知LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达水平升高表明患有该疾病的对象是否可能对特定类型的疗法或治疗有反应。此类疾病状态的非限制性例子包括癌症，例如癌、肉瘤或白血病。因此，检测生物样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的方法可用作预后方法，例如，评估对象将对疗法或治疗的有反应的可能性。确定来自对象的合适组织或体液样品中LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的水平，并与合适的对照(例如，患有相同疾病的但对治疗反应良好的对象中的水平)进行比较。样品的非限制性例子包括例如任何体液(包括但不限于例如痰、血清、血浆、淋巴液、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液)，并且包括身体组织的活检样品。该样品也是肿瘤细胞。用于上述方法的测试样品将根据测定形式，检测方法的性质以及用作待测样品的组织、细胞或提取物而变化。用于制备细胞的蛋白质提取物或膜提取物的方法是本领域已知的，并且可以容易地进行调整，从而获得能够与采用的系统兼容的样品。
在一方面，本发明提供了监测试剂(例如，药物、化合物或小分子)对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达的影响的方法。这样的测定可用于基础药物筛选和临床试验。例如，可以在表现出LHR、B7-H4、HLA-G或HLA表达升高的对象的临床试验中监测试剂降低LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽水平的效力。-DR，例如，被诊断患有癌症的患者。可以通过施用该试剂并观察反应来鉴定影响LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达的试剂。以这种方式，LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的表达模式可以用作标记物，指示对象对该试剂的生理反应。因此，可以在用该试剂治疗对象之前和在期间的各个时间点，确定该反应状态。在一些实施方式中，该方法进一步包含向确定需要额外的治疗的患者施用有效量的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法的额外步骤。
本发明的进一步的方面涉及用于确定患者是否可能响应或不可能响应LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法的方法。在具体的实施方式中，该方法包含使分离自该患者的肿瘤样品与有效量的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体接触，并检测任何抗体与肿瘤样品结合的存在。在进一步的实施方式中，抗体与肿瘤样品结合的存在表明该患者可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法有反应，并且抗体与肿瘤样品结合的不存在表明患者不可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR疗法有反应。在一些实施方式中，该方法包含向确定可能对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR疗法有反应的患者施用有效量的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DRCAR疗法的额外步骤。在一些实施方式中，该患者是表达B7-H4的肿瘤和/或癌症。在一些实施方式中，该肿瘤和/或癌症是实体肿瘤，例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌或绒毛膜癌。在一些实施方式中，该癌症/肿瘤是B细胞淋巴瘤或白血病。
自动的实施方式。本领域技术人员将会理解，用于使用本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的方法的方面可以是自动的。可以使用各种自动的方法，来进行LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR染色方法的特定的方面。
试剂盒
如本文所述，本发明提供了用于确定LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒，以及用于进行本发明的方法的说明，例如收集组织和/或进行筛选、和/或分析结果。
所述试剂盒包括本发明公开的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体组合物(例如单克隆抗体)以及使用说明、或基本上由其组成、或由其组成。所述试剂盒可用于检测生物样品中LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的存在，所述生物样品例如是任何体液(包括但不限于例如痰液、血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液)并且包括身体组织的活检样品。测试样品也可以是肿瘤细胞、肿瘤附近的正常细胞、对应于肿瘤组织类型的正常细胞、血细胞、外周血淋巴细胞、或其组合。在上述方法中使用的测试样品将会根据测定形式、测试方法的特性和被用作被测试的样品的组织、细胞或提取物而改变。用于制备细胞的蛋白提取物或膜提取物的方法在本领域中是已知的，并且可以容易地进行调整，从而获得能够与采用的系统兼容的样品。
在一些方面，所述试剂盒可以包含：能够结合生物样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的一种或多种LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体(例如具有与LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体B7H4 5F6、B7H4#33-14或B7H4#36-1相同的抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段)；用于确定该样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的量的装置；以及用于将该样品中的LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的量与标准进行比较的装置。所述LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体中的一种或多种可以被标记。所述试剂盒组件(例如试剂)可以被包装在合适的容器中。所述试剂盒可以进一步包含使用该试剂盒来检测LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽的说明。在一些方面，所述试剂盒包含：第一抗体，例如被连接至固相支持物，其结合至LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽；以及任选地2)第二、不同的抗体，其结合至所述LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR多肽或所述第一抗体，并且被偶联至可检测的标签。
所述试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒可以进一步包含用于检测所述可检测的标签(例如酶或底物)必要的组件。所述试剂盒还可以含有对照样品或一系列的对照样品，其可以被测定并且与测试样品相比较。所述试剂盒的每个组件都可以被包裹在单个容器之内，并且所有的各种容器可以与用于解读使用该试剂盒进行的测定的结果的说明一起，处于单一的包装之内。本发明的试剂盒可以含有在所述试剂盒容器之上或之内的书面产品。所述书面产品描述了如何使用被包含在试剂盒之内的试剂。
经得起考验的是，可以以本领域技术人员习惯使用的方式来包装这些建议的试剂盒组件。例如，这些建议的试剂盒组件可以被提供于溶液中或者作为液体分散体等。
载体
本发明的抗体还可以被结合至许多不同的载体。因此，本发明还提供了含有所述抗体和活性或惰性的另一种物质的组合物。熟知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂和磁铁矿。所述载体的性质可以是可溶的或不可溶的以用于本发明。本领域技术人员将会知晓用于结合抗体的其他合适的载体、或者将会能够使用常规实验来确定这些载体。
嵌合抗原受体及其使用
组合物
本发明提供了结合至LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的嵌合抗原受体(CAR)，其包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，由其组成，或基本上由其组成。所述细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，或者被称为抗原结合结构域。所述细胞内结构域或细胞质结构域包含至少一个共刺激信号传导区域和ζ链部分。
间隔结构域。CAR可任选地进一步包含最多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，更优选25至50个氨基酸的间隔结构域。例如，间隔区可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。间隔结构域可包含例如人类Fc结构域、CH3结构域、或任何免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其变体)的铰链区域的一部分。例如，一些实施方式可包含具有或不具有S228P、L235E和/或N297Q突变(根据Kabat编号)的IgG4铰链。另外的间隔区包括但不限于CD4、CD8和CD28铰链区域。
抗原结合结构域。在一些方面，本发明提供了一种CAR，其包含对LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR特异的抗原结合结构域、或基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包含抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域、或基本上由其组成、或由其组成。在进一步的实施方式中，抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的重链可变区域和轻链可变区域包含抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域、或基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，该抗原结合结构域包含靶特异性抗体(即抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体)的片段(例如scFv)，由该片段组成，或基本上由该片段组成。
scFv区域可包含与短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区域。接头肽可以是1至50个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方式中，该接头富含甘氨酸，但其也可含有丝氨酸或苏氨酸。
在一些实施方式中，该抗体的重链可变区域包含本发明所公开的那些重链可变区域或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成；和/或包含一个或多个CDR区域，该CDR区域包含本发明所公开的那些CDR或其每一个的等效物。在一些实施方式中，该抗体的轻链可变区域包含本发明公开的那些轻链可变区域，或基本上由其组成，由其组成；和/或包含一个或多个CDR区域，该CDR区域包含本发明公开的那些CDR或其每一个的等效物。
跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154、TCR。替代地所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
细胞质结构域。CAR的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。在一些实施方式中，该CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域。
因为单独通过TCR生成的信号不足以完全激活T细胞，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，至少一个共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于CD27、CD28、4-IBB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、或特异性地与CD83结合的配体也可以被包括在CAR的细胞质结构域中。本发明的CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。例如，除了信号传导结构域(例如CD3ζ信号传导结构域)之外，CAR可包含一个、两个、或多个共刺激结构域。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或基本上由其组成、或由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C、B7-H3和CD3ζ蛋白。
在具体的实施方式中，所述CAR包括以下部分、或基本上由其组成、或由其组成：抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体或其片段(例如scFv)的抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、至少一个共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，所述共刺激信号传导区域包括CD28共刺激信号传导区域和4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。
在一些实施方式中，该CAR可以进一步包含可检测的标记物或纯化标记物。
开关机制。在一些实施方式中，该CAR还可以包含用于控制该CAR的表达和/或激活的开关机制。例如，CAR可以包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，由其组成，或基本上由其组成，其中该细胞外结构域包含靶特异性结合元件，该靶特异性结合元件包含特异于在靶细胞上表达或由靶细胞表达的分子而非靶抗原的标记、结合结构域或标签。在这样的实施方式中，该CAR的特异性由第二构建体提供，所述第二构建体包含以下部分、由以下部分组成、或基本上由以下部分组成：靶抗原结合结构域(例如，抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体或其片段，或结合LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR以及该CAR上的标记或标签的双特异性抗体)以及通过在该CAR上的标记、结合结构域或标签被识别的或结合至其的结构域。参见例如WO 2013/044225,WO 2016/000304,WO 2015/057834,WO 2015/057852,WO 2016/070061,US 9,233,125,US 2016/0129109。以这种方式，表达该CAR的T细胞可以施用至对象，但是其不能结合其靶抗原(即LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR)直至施用包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR特异性结合结构域的第二组合物。
本发明的CAR同样可能需要多聚化，从而激活它们的信号传导功能(参见，例如US2015/0368342、US 2016/0175359、US 2015/0368360)和/或外源性信号，例如小分子药物(US 2016/0166613,Yung et al.,Science,2015)以引发T细胞反应。
此外，本发明公开的CAR可包含“自杀开关”或“安全开关”，以在治疗后诱导CART细胞的细胞死亡(Buddee et al.,PLoS One,2013)或在与靶抗原结合后下调CAR的表达(WO2016/011210)。例如，可以用自杀基因修饰CAR，所述自杀基因赋予对抗体或前药的敏感性，其可以被施用以停止CAR活性。在一些实施方式中，将抗体或前药施用至在发生不良事件时接受CAR疗法的对象。示例性自杀基因包括但不限于：单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)，其使细胞对更昔洛韦敏感(Bonini et al.Science 276:1719-1724(1997))；可诱导的半胱天冬酶9，当由二聚化药物激活时其允许二聚化和细胞凋亡的激活(Gargett et al.,FrontPharmacol,2014 5:235)；以及使细胞对西妥昔单抗(cetuximab)敏感的截短的EGFR(Wanget al.Blood 118:1255-63(2011))。
在另一方面，本发明提供了包含与其靶细胞结合的HLA-DR CAR细胞的复合物。在另一方面，该复合物被可检测地标记。可检测标记在本领域中是已知的并且在本文中简要描述。
用于制备CAR的方法
本发明还提供了生产表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR细胞的方法，所述方法包含以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者由以下步骤组成：(i)用编码本发明所述CAR的核酸序列转导分离的细胞的群体，(ii)选择已用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的所述分离的细胞的亚群体，从而生产表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的细胞。在一方面，该分离的细胞选自T细胞和NK细胞。
本发明的一些方面涉及包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR特异性的CAR的分离的细胞，以及生产这样细胞的方法。该细胞是原核细胞或真核细胞。在一个方面，该细胞是T细胞或NK细胞。真核细胞可以来自任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人类、猫或犬细胞。
在本发明的一些方面，用编码如本发明所述的CAR的核酸序列转导的分离的细胞的群体是NK前体细胞群体和/或T细胞前体细胞群体。前体细胞的转导导致能够分化成CART细胞和/或CAR NK细胞的长寿命细胞群体。T细胞前体包括但不限于HSC、长期HSC、MPP、CLP、LMPP/ELP；DN1、DN2、DN3、DN4、DP。NK前体包括但不限于HSC、长期HSC、MPP、CMP、GMP、pro-NK、pre-NK和iNK细胞。在一个具体方面，分离的细胞的群体包括成熟T细胞和T细胞前体，以提供短寿命效应器CAR T细胞和长寿CAR T细胞前体，用于移植入对象。另一方面，分离的细胞的群体包括成熟NK细胞和NK前体，以提供短寿命效应器CAR NK细胞和长寿命CARNK前体，用于移植入对象。
在具体的实施方式中，所述分离的细胞包含外源性CAR、或基本上由其组成、或由其组成，所述CAR包含以下部分、或基本上由其组成、或由其组成：抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域，CD8α铰链结构域，CD8α跨膜结构域，CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域，以及CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。
在某些实施方式中，本发明公开了生产表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的细胞的方法，所述方法包含以下步骤、或基本上由以下步骤组成：(i)使用编码LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的核酸序列转导分离的细胞的群体，和(ii)选择已经使用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的细胞的亚群体。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人类T细胞，从而生产LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人类NK细胞，从而生产LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CARNK细胞。
在一些实施方式中，可以进一步修饰表达所公开的CAR的T细胞以减少或消除内源性TCR的表达。内源性TCR的减少或消除可降低脱靶效应并增加T细胞的有效性。可以使用各种方法产生稳定缺乏功能性TCR表达的T细胞。T细胞将整个T细胞受体内化、分类和降解为复合物，静息T细胞半衰期约为10小时，受刺激T细胞半衰期为3小时(von Essen,M.etal.2004.J.Immunol.173:384-393)。TCR复合物的适当功能需要构成该TCR复合物的蛋白质的适当化学计量比。TCR功能还需要具有ITAM基序的两种功能性TCRζ蛋白。与其MHC-肽配体结合后，TCR的激活需要在同一T细胞上接合几个TCR，所有TCR必须正确发出信号。因此，如果没有正确相连或不能最适宜传导信号的蛋白质使TCR复合物不稳定，则T细胞不会被充分激活以开始细胞反应。
因此，在一些实施方式中，在原代T细胞中可以使用RNA干扰(例如，shRNA、siRNA、miRNA等)、CRISPR、或靶向编码特定TCR(例如，TCR-α和TCR-β)和/或CD3链的核酸的其他方法来消除TCR的表达。通过阻断这些蛋白质中的一种或多种的表达，T细胞将不再生产TCR复合物的一种或多种关键组分，从而使TCR复合物不稳定并阻止功能性TCR的细胞表面表达。尽管当使用RNA干扰时一些TCR复合物可以被再循环到细胞表面，但该RNA(例如，shRNA、siRNA、miRNA等)将阻止TCR蛋白的新生产，导致整个TCR复合物的降解和移除，导致生产在功能性TCR表达中具有稳定缺陷的T细胞。
可以使用任何常规的表达系统(例如慢病毒表达系统)在原代T细胞中获得抑制性RNA(例如，shRNA、siRNA、miRNA等)的表达。尽管慢病毒可用于靶向静息的原代T细胞，但并非所有T细胞都表达shRNA。这些T细胞中的一些可能不表达足够量的该RNA以允许足够的TCR表达的抑制，以改变该T细胞的功能活性。因此，可以例如通过细胞分选或分离技术移除在病毒转导后保留中度至高度的TCR表达的T细胞，从而剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，使缺乏功能性TCR或CD3表达的分离的T细胞群体的扩张成为可能。
可以使用常规CRISPR/Cas系统和对靶TCR特异性的向导RNA来实现CRISPR在原代T细胞中的表达。合适的表达系统，例如慢病毒或腺病毒表达系统，是本领域已知的。与抑制剂RNA的递送类似，CRISPR系统可用于特异性靶向用于CAR细胞疗法的静息的原代T细胞或其他合适的免疫细胞。进一步地，到CRISPR编辑不成功的程度，可以根据上述公开的方法选择细胞以获得成功。例如，如上所述，可以例如通过细胞分选或分离技术移除在病毒转导后保留中度至高度的TCR表达的T细胞，从而剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，使缺乏功能性TCR或CD3表达的分离的T细胞群体的扩张成为可能。进一步应理解的是，CRISPR编辑构建体可用于敲除(knocking out)内源性TCR及敲入(knocking in)本发明公开的CAR构建体。因此，应理解的是，可以设计CRISPR系统用于以实现这些目的中的一个或两个。
分离的细胞的来源。在本发明公开的细胞的扩增和基因修饰之前，可以从对象——例如在涉及自体疗法的实施方式中——或从例如可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的市售培养物中获得细胞。
细胞可以从对象中的许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。
分离相关细胞的方法在本领域中是公知的，并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的应用的分离方法包括但不限于LifeTechnologies 系统；STEMcell Technologies EasySepTM、RoboSepTM、RosetteSepTM、SepMateTM；Miltenyi Biotec MACSTM细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用荧光激活的细胞分选(FACS)(在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的磁珠或其他结合试剂)，分离免疫细胞的特定的亚群体和前体。例如，MACSTM CD4+和CD8+MicroBeads可以被用来分离CD4+和CD8+T细胞。
替代地，细胞可以通过商业上可获得的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对于T细胞，BCL2(AAA)Jurkat(CRL-2902TM)、BCL2(S70A)Jurkat(CRL-2900TM)、BCL2(S87A)Jurkat(CRL-2901TM)、BCL2Jurkat(CRL-2899TM)、Neo Jurkat(CRL-2898TM)细胞系；以及对于NK细胞，NK-92(CRL-2407TM)、NK-92MI(CRL-2408TM)细胞系。
在一些方面，可以向对象施用预处理方案，以在从该对象中获得细胞之前诱导前体细胞动员到外周血中。例如，在从该对象中分离的细胞最多两周前或同时，可以向对象施用有效量的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、非格司亭(Neupogen)、沙格司亭(Leukine)、培非格司亭(Neulasta)和普乐沙福(Plerixafor)中的至少一种。可以通过本领域已知的任何方法从对象中获得被动员的前体，包括例如白细胞去除术的第1-14天接着施用预处理方案。在一些实施方式中，进一步分离特异性前体细胞群体。
载体。可以使用载体制备CAR。本发明的方面涉及编码LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DRCAR的分离的核酸序列以及载体；该载体其包含编码该CAR和其补体的分离的核酸序列和其每一个的等效物，或基本上由该核酸序列和等效物组成、或由该核酸序列和等效物组成。
在下面的实施例中详细讨论了示例性载体的制备和使用所述载体来生成的表达CAR的细胞。总之，通常通过将编码CAR多肽的核酸或其部分可操作地连接至启动子，并将该构建体结合进表达载体中，来实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。该载体可适用于真核细胞的复制和整合。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码CAR，所述CAR包括以下部分、或基本上由其组成、或由其组成：抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括以下序列、或基本上由以下序列组成、或由以下序列组成，该序列编码(a)抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域、随后的(b)CD8α铰链结构域、(c)CD8α跨膜结构域、随后的(d)CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、随后的(e)CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包含位于编码抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的抗原结合结构域的序列的上游的Kozak共有序列、或基本上由该共有序列组成、或由该共有序列组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸包含赋予抗生素抗性的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列被包括在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在其他实施方式中，所述载体是病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。
以下例子中详细地讨论了示例性的载体的制备和使用所述载体来生成表达CAR的细胞。总之，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体中，来实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体可以适于真核细胞的复制和整合。用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。
在一方面，术语“载体”是指重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(MLV)。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包含衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包含合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组载体衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(VMV)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,07,993；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。
美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组中。该专利教导了每个逆转录病毒都包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因在两个末端处的两侧为被称为长末端重复(LTR)的区域。所述LTR负责前病毒的整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR其自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合(A)加成(终止)的位点是在LRT右手边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞(在某些情况下为病毒)转录激活蛋白。
关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶(IN)，它们介导基因组的复制。
对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的DNA构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个)，以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的组件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2“ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of HopeResearch Institute实验室生成和使用；“Lenti-X”慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由Virology(CBF),Berlin,Germany的CharitéMedical School,Institute实验室生成和使用。
不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行各种测定。这样的测定包括：例如本领域技术人员公知的“分子生物学”试验，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白免疫印迹)或者通过本文描述的试验来识别落入本发明的范围之内的试剂。
包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将CAR包装进慢病毒或逆转录病毒包装系统。该包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体含有促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是包装质粒，其包含至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高效价包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会生产复制完整型辅助病毒。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′LTR，但其编码外来的聚腺苷酸化位点(例如SV40聚腺苷酸化位点)以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、或长臂猿白血病病毒(GALV)。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(IE)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)的增强子和启动子(U3区域)、Rous肉瘤病毒(RSV)的U3区域、脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列含有编码嗜亲性MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的(貂病灶形成)或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(GALV env蛋白)、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白、人类T细胞白血病(HTLV)I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，包装质粒和表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR的逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够生产病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞(ATCC No.CRL1573,ATCC,Rockville,Md.)，以生产高效价的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，被瞬时转染该细胞的第一群体然后与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞)共培养，以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述被瞬时转染细胞的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞或造血干细胞)一起孵育，以高效率转导具有外来基因的靶细胞。
在另一方面，在能够生产病毒的哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞)的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地(episomally)维持的质粒中。生产了高效价的含有重组逆转录病毒的上清液。
T细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的T细胞的基因修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增T细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中描述的方法。使用LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗原离体刺激能够激活并扩增所选的表达CAR的细胞亚群体。替代地，可以通过与LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗原的相互作用，体内激活T细胞。
激活相关细胞的方法在本领域中是公知的，并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies系统激活和扩增试剂盒；BD Biosciences PhosflowTM激活试剂盒、Miltenyi Biotec MACSTM激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的磁珠或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-CD3/α-CD28可以被用来激活和扩增分离的T细胞的群体。
使用方法
治疗应用。本发明的CAR T-细胞可以用于治疗肿瘤和癌症。本发明的CAR T-细胞可以被单独地或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或例如是细胞因子或免疫刺激的其他细胞群体的其他组分联合施用。
因此，本发明的方法的方面涉及用于抑制在有需要的对象中的肿瘤的生长和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，该肿瘤是实体肿瘤或B细胞淋巴瘤或白血病。在一些实施方式中，该肿瘤/癌症是甲状腺、乳腺、结肠、绒毛膜、卵巢或前列腺肿瘤/癌症或B细胞淋巴瘤或白血病。在一些实施方式中，该肿瘤或癌症表达或过表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR。在某些实施方式中，这些方法包括向对象或患者施用有效量的分离的细胞，或者基本上由该步骤组成，或由该步骤组成。在进一步的实施方式中，该分离的细胞包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR。在更进一步的实施方式中，该分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，该分离的细胞对于正被治疗的对象或患者是自体同源的。在另一方面，该肿瘤表达LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗原，并且已通过诊断(例如本文所述的诊断)选择对象用于该疗法。
本发明公开的CAR细胞可以被单独地施用，或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂、和/或与其他组分(例如细胞因子或免疫刺激性的其他细胞群体)联合施用。它们可以以一线、二线、三线、四线、或进一步的疗法施用。因此，所公开的CAR可以与其他疗法(例如，化学疗法、放射等)一起组合。额外的疗法的非限制性的例子包括化学疗法或生物制剂。合适的治疗方案将由治疗医师或兽医确定。
在一些实施方式中，可以将公开的CAR递送或施用到通过肿瘤组织的切除形成的腔(即腔内递送)中，或在切除之前直接进入肿瘤(即瘤内递送)。在一些实施方式中，公开的CAR可以通过静脉内、鞘内、腹膜内、肌内、皮下或通过其他合适的给药方式施用。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
载体
本发明的其他方面涉及组合物，其包括载体和在本文公开的实施方式中描述的产物中的一种或多种——例如，包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的分离的细胞，分离的核酸，载体，任何抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体的分离的细胞或CAR细胞，抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。
在治疗过程中，细胞或组合物可以单个剂量形式连续或间断给药。本领域技术人员已知确定最有效的给药途径和给药剂量的方法，并且这会根据用于疗法、疗法目的和正被治疗的对象而改变。可以根据治疗医师选择的剂量水平和模式来进行单次或多次给药。合适的制剂和给药方法在本领域是已知的。在另一个方面，本发明的细胞和组合物可与其他治疗联合施用。
细胞和细胞群体通过本领域已知的方法给药至宿主，这些方法例如描述于PCT/US2011/064191。本发明的细胞或组合物的给药可用来生成用于实验或筛选测定的期望疾病、病症或适应症的动物模型。
本发明的其他方面涉及包含载体和本文公开的实施方式中描述的产物中的一种或多种的组合物——例如，包含LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR CAR的分离的细胞，分离的核酸，载体，任何抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR抗体或CAR细胞，抗LHR、B7-H4、HLA-G或HLA-DR。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被优选地配制用于静脉给药。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
以下例子说明了可以在实施本发明的各种情况下使用的方法。
实施例
实施例1-小鼠抗LHR单克隆抗体的生成
通过具有基因工程化的LHR-Fc的4周龄的BALB/c和NIH Swiss小鼠的反复免疫，生成针对LHR的富含赖氨酸的细胞外激素结合结构域的抗体。如在以下的图3所示，使用人类LHR G蛋白的前导序列和第一部分来生成在免疫和筛选方法中使用的LHR-Fc，以生成和识别高结合的抗体。因为先前已经显示了流式细胞术是用于CAR生成的功能性抗体的最好的预测方法，所以该方法被用来从在实验室进行的超过7种融合物中识别潜在的候选抗体。使用ES-2卵巢癌细胞系，在以下的图4中示出了杂交瘤阳性的典型流式细胞术筛选，其通过使用LHR-Fc包被的培养板的初始ELISA筛选进行。如在该图中的杂交瘤8B7所示，仅仅少量的LHR杂交瘤被显示出通过流式细胞术产生高MFI。然后这些少数的候选杂交瘤通过在96孔板中的稀释而被亚克隆，并且被扩增以在小瓶中进行冷冻。在通过流式细胞术进行的进一步筛选之后，选择特异性的亚克隆来使用2L容器(GRrex,100L,Wolfson)进行大规模生产。然后将被过滤的上清液进行抗体纯化，其中使用tandon蛋白A或G以及在实验室中常规进行的离子交换色谱法。一旦纯化之后，则将被命名为8B7-3、5F4-21、5B1-1、2H11-37和138-2的5种抗体亚克隆进行测序，以便于用于构建下述LHR CAR的单链基因的工程化。为了进行比较，通过流式细胞术在ES-2人类卵巢癌细胞系上测试了所选的5种杂交瘤亚克隆，以证明它们的相对平均荧光强度(MIF)(图5)。
实施例2-在卵巢癌中检测到LHR的表达的抗LHR单克隆抗体
总体假设是，可以使用LHR嵌合抗原受体修饰的T细胞有效且安全地治疗卵巢癌。作为靶标，由于其在卵巢癌上的常见表达以及其缺少在正常人类组织上的表达，LHR比其他靶标有显著的优势。在体外和体内生产LHR CAR T细胞，以识别潜在的临床候选，用于后续的临床试验或与双靶标CAR修饰的T细胞一起使用。
构建和合成单链LHR抗体基因
通过MCLAB(South San Francisco,CA)对所述5种高结合的抗LHR抗体(8B7-3、5F4-21、5B1-1、2H11-37和138-2)的DNA序列进行测序。对五种抗体全部都进行测试，以确定哪种抗体在下文描述的测定中产生最有效的CAR。如在以下的图6所示，构建了第三代CAR载体，其包括以下串联基因：kozak共有序列，CD8信号肽，抗LHR重链可变区域，(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头，各自的抗LHR轻链可变区域，CD8铰链和跨膜结构域，以及CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导区域。铰链、跨膜和信号传导结构域DNA序列在本领域中是已知的(参见美国专利申请号20130287748A1)。可以在含有β-内酰胺酶(“bla”)基因的pUC57载体骨架之内合成抗LHR CAR基因，该bla基因对载体宿主赋予氨苄青霉素抗性。参照GeneBank登记号Y14837本发明公开了pUC57载体序列，而β-内酰胺酶基因的序列被公开在列出的GeneBank登记号中。与列出的GeneBank登记号相关的序列通过引用的方式合并入本文中。
将CAR基因亚克隆到慢病毒质粒中
使用抗LHR质粒cDNA转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化CAR质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过T4DNA连接酶反应(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜被插入进基于HIV-1的慢病毒载体，该载体含有HIV-1长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。然后使用得到的含有抗LHR的慢病毒质粒，转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在10mL完全-Tet-DMEM中在4.0×106个细胞/100mm组织培养物处理过的板上接种HEK293T细胞，并且在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中过夜孵育。一旦80-90％融合，则使用CAR-基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃下孵育被转染的HEK293T细胞培养物4小时之后，将转染培养基替换为10mL新鲜的完全Tet DMEM。然后再孵育HEK293T细胞48小时，然后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。将含有慢病毒的上清液进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。可以使用MACSCD4+和CD8+MicroBeads(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)试剂盒来分离这些人类T细胞亚群，其中使用磁激活的LS柱来主动选择CD4+和CD8+T细胞。然后从磁性MACS分离器中移除磁结合的T细胞，从LS柱中冲刷，并在新鲜的完全培养基中洗涤。通过使用Life TechnologiesAcoustic细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞的纯度，并在有需要的情况下通过在USC的流式细胞术核心设施进行的荧光活化细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中在补充有100IU/mL IL-2的完全培养基中将CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞Dynabead(Life Technologies；Carlsbad,CA)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃ 5％CO2培养箱中孵育T细胞2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+和CD8+T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，以1.0×106个细胞/mL完全培养基的浓度将被激活的T细胞进行铺板。对于各个孔，以各种感染复数(MOI)(例如1、5、10和50)将含有LHR CAR的慢病毒颗粒加入至细胞混悬液。以4μg/mL的终浓度加入聚凝胺，其是一种阳离子聚合物，通过促进慢病毒颗粒和靶细胞表面之间的相互作用而辅助转导。在32℃以800×g将培养板离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并将细胞团块重悬于具有100IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于37℃ 5％CO2湿润的培养箱中过夜。在转导之后三天，细胞团块化并重悬于具有IL-2和400μg/mL遗传霉素(G418硫酸盐)(Life Technologies；Carlsbad,CA)的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析来评估LHR CAR修饰的T细胞，以证明转导过程成功。在体外和体内测定之前，通过FACS富集LHR CAR T细胞并1:1混合用于体内研究。
通过钙黄绿素释放细胞毒性测定进行CAR功效的体外评估
收集LHR抗原阳性和阴性靶细胞，洗涤，并以1.0x 106个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中。以15μM的浓度将钙黄绿素乙酰甲酯(AM)加入至靶细胞样品，然后在37℃5％CO2湿润的培养箱中孵育30分钟。将被染色的阳性和阴性靶细胞洗涤两次，并通过离心重悬于完全培养基中，并以1.0×104个细胞/孔的密度将其加入至96孔板。以50:1、5:1和1:1的效应与靶细胞的比例，将LHR CAR T细胞加入至完全培养基中的板。悬浮在完全培养基和具有2％triton X-100的完全培养基中的被染色的靶细胞分别作为自发对照和最大释放对照。在365x g和20℃下将培养板离心2分钟，然后放置回培养箱中3小时。然后将板离心10分钟，并将细胞上清液等分至黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别以485/20nm和528/20nm的激发和发射波长在SynergyTM HT酶标仪上评估荧光度。
通过Luminex生物测定进行的人类细胞因子的定量。
使用本领域中已知的标准程序，测量LHR CAR修饰的T细胞和LHR阳性和阴性肿瘤细胞系的上清液的细胞因子分泌，作为CAR T细胞激活的测量。将数据与单独的培养基进行比较，并且与使用未被激活的人类T细胞的培养物进行比较，以识别背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12和其他相关细胞因子的浓度。
在两个异种移植卵巢癌模型中体内评估CAR T细胞功效
使用两个不同的人类卵巢细胞异种移植肿瘤模型，进一步体内评估LHR CAR T细胞。在第一个模型中，通过注射5x 106个LHR阳性卵巢癌细胞系或LHR阴性卵巢癌细胞系，在裸小鼠中皮下地建立人类卵巢实体肿瘤。当该肿瘤的直径达到0.5cm时，使用1或3x 107个人类T细胞(作为阴性对照)，或者使用根据体外研究结果从最具活性的LHR抗体构建的LHRCAR，静脉注射各组小鼠(n＝5)。然后使用卡尺3X/周测量肿瘤体积，并生成体积增长曲线，以证明实验处理对对照的效果。在修改自Chekmasova et al.(Chekmasova,A.A.et al.(2010)Clin.Cancer Res.16:3594–606)的第二个肿瘤模型中，将各组的NOD/SCID/γ-链-/-6-8周龄的雌性小鼠(Jackson Laboratories,Inc.)(n＝5)腹腔内注射来自LHR阳性或阴性(对照)人类细胞系的3x 106个GFP转染的肿瘤细胞。与在植入之后7天处理小鼠的Chekmasova et al.(Chekmasova,A.A.et al.(2010)Clin.Cancer Res.16:3594–606)不同，直至植入后3周腹水形成才开始CAR T细胞疗法。在这时，腹腔内注射1或3X 107LHR CART细胞制剂，并且此后每周通过荧光成像监控肿瘤体积。在合适的时间处死示出肿瘤进展的小鼠，以减轻发病率。从数据中生成小鼠生存率的Kaplan Meier曲线，从而比较对照和实验处理组的生存率。在处死时，使用人类特异性抗体和流式细胞术分析血液和腹水中存在的CAR T细胞。此外，通过Luminex磁珠测定(Life Technologies,Inc.)量化1型和2型细胞因子的细胞因子分泌，作为CAR T细胞激活的测量。
双表达CAR修饰的T细胞的研究
为了提高LHR CAR修饰的T细胞的特异性，制备了具有MUC-CD或间皮素单链的双LHR CAR T细胞。已经在使用ERB/2和MUC1(Wilkie,S.et al.(2012)J.Clin.Immunol.32:1059–1070)、间皮素和α-叶酸受体(Lanitis,E.et al.(2013)Cancer Immunol.Res.1:45-53)治疗乳腺癌、以及PSMA和PSCA治疗前列腺癌(Kloss,C.C.et al.(2013)Nat.Biotechnol.31:71–75)中，成功地测试了双靶向CAR T细胞的原理。粘蛋白家族成员MUC16在大部分卵巢癌上过度表达，并且是卵巢癌的进展和检测的已确立的替代血清标记物(CA125)。MUC16由会裂开的大的结构域CA125以及保留的结构域(MUC-CD)组成，该MUC-CD含有细胞外片段、跨膜结构域和细胞质尾巴(Rao,T.D.et al.(2010)Appl.Immunohistochem.Mol.Morphology 18:462-472)。MUC16还在子宫、子宫内膜、输卵管、管、卵巢和腹部和胸腔的浆膜中以低水平表达。CAR修饰的MUC-CD靶向的T细胞在体外显示出针对人类卵巢癌细胞系的高效的MUC-CD特异性细胞溶解活性，并且成功根除在SCID-Beige小鼠中已确立的腹膜卵巢肿瘤(Chekmasova,A.A.et al.(2010)Clin.Cancer Res.16:3594–606)。因此，MUC-CD是CAR疗法的可行的靶标，并且是双靶向CAR修饰的T细胞的优秀的选择，以降低潜在的中靶但偏离肿瘤的效应。MUC-CD和间皮素CAR修饰的T细胞都显示出是有效的，并且如果需要最佳的临床使用，则与LHR联合可以提供更安全的替代方案。
数据和统计分析计划
对于体外钙黄绿素释放测定，使用单向ANOVA比较裂解的靶细胞的百分比，如果在单向ANOVA中发现显著性(p<0.05)则然后进行适当的多重比较测试。为了在腹水异种移植模型中比较在用于实验组的CAR T细胞和对照组之间的生存率，构建了Kaplan Meier曲线，并且使用log rank测试来测试显著性(p<0.05)。对于皮下肿瘤模型，使用ANOVA来比较肿瘤体积曲线，如果在ANOVA中发现显著性(p<0.05)则然后进行适当的多重比较测试。
表1.使用流式细胞术的在九种人类卵巢细胞系上的三个潜在的细胞表面靶标(LHR、间皮素、MUC16)的表达。
<u>卵巢细胞系</u> <u>LHR</u> 间皮素 <u>MUC16</u>
EFO-27 + - -
EFO-21 + + +
ES-2 + - -
HEY + + -
SKOV3 + + -
TOV21G + + -
NIHOVCAR3 + - +
CAOV3 + - +
SW626 + - -
表2.LHR、MUC16和间皮素在人类卵巢肿瘤和组织微阵列的面板上的免疫组化表达。
表3.通过免疫组化测定的LHR、间皮素和MUC-16的正常组织反应性。
表4
表5–在正常组织中的LHR染色
实施例3-抗LHR CAR T细胞
CAR慢病毒构建体的构建
CAR由结合LHR的细胞外抗原结合部分或scFV组成。该scFV通过CD8铰链区域被连接至细胞质信号传导区域，由CD8跨膜区域、以及来自CD28、4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域组成。通过Genewiz基因合成服务(Piscataway,NJ)合成地合成包括信号传导结构域的整个CAR序列(图10)。纯化质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜T4DNA连接酶反应(New England Biosciences；Ipswich,MA)被插入进基于HIV-1的双顺反子慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen,Clontech,Signal Hill,CA)，该载体含有HIV-1 5’和3’长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40(SV40)起始位点。然后使用得到的含有LHR-CAR的慢病毒质粒，转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在补充有10％透析过的FCS的20mL DMEM中在4.0×106个细胞/150cm2组织培养物处理过的培养瓶接种HEK 293T细胞，并且在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中过夜孵育。一旦80-90％融合，则在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中在补充有1-％透析过的FCS的且不含青霉素/链霉素的20mL DMEM中孵育HEK 293T细胞两小时。使用特异性的pLVX-CAR质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃孵育被转染的HEK 293T细胞培养物24小时之后，将转染培养基替换为20mL新鲜的完全DMEM。每24小时收集慢病毒上清液至三天，并且在4℃以1,250rpm将上清液快速离心(spun down)5分钟，然后过滤灭菌并在4℃以20,000g在超离心中离心2小时。将被浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中，用于长期储存。将慢病毒进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。24小时之后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。转染效率由蛋白标记物ZsGreen的表达确定，其通过在荧光显微镜下的可视化而被估算在20％-50％之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中使用来主动选择对于CD4+和CD8+T细胞。通过使用Life Technologies Acoustic 细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞群体的纯度，并且通过荧光激活细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中在补充有100IU/mL IL-2的完全50％Click's培养基/50％RPMI-1640培养基中将1:1混合的CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃5％CO2培养箱中孵育T细胞2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+和CD8+T细胞的慢病毒转导
收集活化的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，以1.0×106个细胞/mL完全培养基的浓度将被激活的T细胞进行铺板。使用补充有Lentiblast(细胞转染辅助试剂)(Oz Biosciences,San Diego,CA)的慢病毒颗粒转导细胞。在加湿的5％CO2培养器中37℃孵育被转导的细胞24小时。然后通过离心和更换培养基，使细胞团块化，然后加入T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)。
mRNA表达的RT-PCR
使用Nucleospin RNA试剂盒(Clontech,Signal Hill,CA)分离来自被转导的T细胞的mRNA。使用OneTaq One Step RNA试剂盒(New England Biolabs,Boston,MA)运行RT-PCR，其中使用以下引物：5'CGCCTGTGATATCTACATCTGGGC 3'和5'ATCGGCAGCTACAGCCATCT3'。在1％琼脂糖凝胶上运行样品。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific,Carlsbad,CA)，确定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并使用合适的上述的CAR慢病毒构建体来转导1x 106个细胞。使用T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)来激活细胞两天，然后进行细胞毒性测定。根据制造商的方案来确定靶细胞的最佳数目。为了测试，在96孔板中一式三份地将合适的靶细胞进行铺板，在37℃ 5％CO2培养箱中24小时，然后以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入被激活的CAR T细胞，并在37℃ 5％CO2培养箱中孵育24小时。然后在37℃裂解细胞45分钟，并以1,250rpm离心5分钟。将上清液转移至新的96孔板，然后加入反应混合物30分钟。使用停止溶液来停止反应，并在450nm对培养板进行读数，使用在650nm的吸光度来修正读数。
体内肿瘤消退测定
使用表达LHR的卵巢癌细胞系SKOV3注射Foxn1缺陷小鼠。使用0.2mL接种器将在200ul的磷酸盐缓冲盐水中的2x 106个细胞注射进小鼠的左侧腹部。使用αCD3/CD28激活复合物(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)激活初始T细胞2天。然后使用上述的pLVX-LHR-CAR慢病毒颗粒，转染被激活的T细胞，并激活2天。在肿瘤接种之后第7天，将2.5x 106个被激活的表达LHR CAR的T细胞静脉内注射入小鼠。使用游标卡尺每周两次评估肿瘤尺寸，并计算体积。
LHR CAR T细胞的细胞毒性
使用卵巢癌细胞系SKOV3作为靶细胞，检验LHR CAR-T细胞的细胞溶解活性。FACS分析示出了SKOV3表达LHR。以20:1、10:1、5:1和1:1的效应细胞与靶细胞的比例，加入CAR T细胞。孵育24小时之后，在10:1的比例时，LHR CAR T细胞有效地裂解SKOV3，裂解率为30％(图11)。相比之下，在所使用的效应细胞与靶细胞的任何比例下，未诱导的T细胞都没有显示出任何细胞毒活性。
LHR CAR的RNA表达
使用分离自转导有LHR CAR的T细胞的mRNA的RT-PCR显示了嵌合CAR的mRNA表达(图12)。进行RT-PCR所使用的引物跨过CD8铰链和4-1BB信号传导结构域之间的嵌合CAR，因此对于CAR的表达是高度特异的。
实施例4-小鼠抗人类B7-H4单克隆抗体的生成
B7H4-Fc融合蛋白的构建
编码人类B7-H4信号传导结构域和被融合至人类IgG1的Fc区域的细胞外结构域的表达载体被构建如下：通过来自购买于Open Biosystem(Lafayette,CO)的全长cDNA的PCR扩增，生成了编码人类的B7-H4的信号传导结构域和细胞外结构域的cDNA。该cDNA从在信号传导序列中的起始Met延伸穿过总蛋白序列的Gly236。分别使用5’和3’引物5’-TCG ATC AAGCTT GCC GCC ACC ATG GCT TCC CTG GGG CAG ATC-3’和5’-TGT GTG AGT TTT GTC AGCCTT TGA CAG CTG-3’进行B7-H4的初级PCR。用5’引物5’-CTA AAC TCA AAG GCT GAC AAAACT CAC ACA TGC CCA-3’和3’引物5’-TGA TTA ATG ATC AAT GAA TTC TCA TTT ACC CGGAGA CAG GGA-3’，PCR扩增人类IgG1的铰链-CH2-CH3部分。通过将B7-H4的5’引物和人类Fc3’引物各自装配，生产了编码huB7-H4-Fc的基因。被使用的B7-H4-Fc的全部序列如下(加粗:B7-H4，未加粗：人类Fc)：
随后用Hind3和EcoRI消化B7H4-Fc融合基因，然后将其插入pN24表达载体的Hind3和EcoRI位点，生成了表达载体pN24/B7-H4-Fc。
B7-H4-Fc抗原的表达、纯化和表征
根据制造商的方案(Lonza Biologics,Inc.)，B7-H4-Fc融合蛋白被表达在NS0小鼠骨髓瘤细胞中，用于长期稳定表达。最高生产的克隆被按比例放大以在充气的3L搅拌培养瓶生物反应器中孵育，使用3％热灭活的已透析的胎牛血清。然后通过序列蛋白A亲和色谱和离子交换方法从被过滤的已用的培养基中纯化融合蛋白。通过HPLC分析和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下分析该融合蛋白，并且用考马斯蓝染色来证明正确的组装和纯度。如图13A-13C所示完整的载体和分子的示意图，结合HPLC数据证明它的大小。
免疫方法
每周两周x4用10ug的用完整的弗氏佐剂(第一和第二次免疫)或非完整弗氏佐剂(第三和第四次免疫)乳化的KLH偶联的huB7-H4-Fc，使购买于哈伦(Harlan)实验室的四周龄的雌性BALB/c小鼠免疫。每次免疫用分成三份的共25ug的抗原/佐剂皮内注射到小鼠的背上的分离点。在最后的免疫之后第十天，获取血液样品，并且在抗原包被的板上通过ELISA方法滴定该血液样品。随后示出了最高效价的小鼠接受了不需要静脉注射佐剂或KLH偶联物的B7-H4-Fc的第五次免疫增强，其中通过横向尾静脉注射10ug在100ul无菌的磷酸盐缓冲生理盐水溶液。
杂交瘤生产
四天后，处死被增强免疫的小鼠，然后摘除脾脏用于杂交瘤方法。将在含有Pen/Strep抗生素的RPMI-1640培养基的溶液中的脾脏细胞分散后，使用PEG(Hybri MAX,molwt1450,Cat.No:p7181,Sigma)融合脾脏细胞与小鼠NSO细胞。然后用HAT的选择使仅融合细胞能够生长。然后首先通过针对B7-H4-Fc抗原包被的板的ELISA，其次通过在B7-H4阳性和阴性肿瘤细胞系(分别为SK-BR-3和HT-29)上的流式细胞术，来筛选来自具有正在生长的杂交瘤细胞的孔的上清液。为了消除对B7-H4-Fc的Fc区域阳性的杂交瘤，还针对IL-2-Fc包被的板筛选上清液，然后从进一步的研究中消除示出对于两种抗原阳性的这些克隆。通过有限稀释方法，选择示出阳性和高平均荧光指数(MFI)的杂交瘤用于亚克隆。然后通过流式细胞术再次测试亚克隆，将其冰冻在液氮中并且在2L容器中扩增，然后通过tandoriProteinA或G以及离子交换色谱法纯化抗体。然后将被纯化的抗体装瓶，并储存在-20℃直至使用。
流式细胞术数据
为了确定结合最好的抗体，使用等分的纯化抗体，在B7-H4阳性(SK-BR-3)和阴性(HT-29、JAR、和T47D)细胞系上进行流式细胞术。如图14所示，与阴性抗体同型对照相比，阳性细胞系已经增加了结合特性。阳性克隆的比较示出了杂交瘤35-8和5F6-6对表达B7-H4的SK-BR-3细胞系产生了最高的MFI(图15)，并且因此被选为如下述的CAR-T细胞构建的候选者。
免疫组化数据
使用这些单克隆抗体，筛选人类正常组织的组织微阵列(FDA808c,Biomax,Inc.)，以确定在24种器官(每个器官有3个捐赠者)中的抗体结合。虽然大多数组织对于染色是阴性的，但是在消化道的上皮细胞中和在肾脏的进曲小管和远曲小管中存在不一致的细胞质染色(图16A-16B)。仅仅在乳腺导管细胞的顶部和在某些肾小管中发现了强烈、一致的膜染色(图16A-16B)。然而与在如下所示的乳腺癌组织中的染色相比，在正常乳腺组织中的染色较苍白，其中在5个不同癌症病例中的5个标注了强烈的膜和细胞质染色。
从被生成的抗人类B7-H4-Fc的抗体中，已经通过针对B7-H4阳性而非阴性的肿瘤细胞系的流式细胞术，示出了两种单克隆抗体产生了高的结合力。为了预防针对B7-H4CART细胞的人类抗小鼠反应的可能性，在患者中使用之前，可以为了它们的构建而生成人源化的抗体。
实施例5-B7-H4CAR T细胞的生成
单链抗人类B7-H4抗体基因的构建和合成
从MCLAB(South San Francisco,CA)获得所生成的35-8和5F6-6高结合力的抗B7-H4抗体的DNA序列。测试两种抗体来确定在下述的测定中哪一个生产最有效的CAR T细胞。对于这些研究，构建由以下的串联基因组成的第二或第三(图17)代CAR载体，所述串联基因：kozak共有序列，CD8信号肽，抗B7-H4重链可变区域，(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头，各自的抗B7-H4轻链可变区域，CD8铰链和跨膜结构域，以及CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导结构域。从Carl June的专利(参见US 20130287748 A1)确定了铰链、跨膜和信号传导结构域DNA序列。通过Genewiz,Inc.(South Plainfield,NJ)，在含有bla基因的pUC57载体骨架内合成抗-B7-H4CAR基因，该bla基因对载体宿主赋予氨苄青霉素抗性。
CAR基因亚克隆进慢病毒质粒
用抗B7-H4质粒cDNA转化NovaBlue SinglesTM化学感受态大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化CAR质粒并且用适当的限制性酶消化，通过过夜T4DNA聚合酶(New England Biosciences；Ipswich,MA)反应插入基于HIV-1的慢病毒载体，该载体含有HIV-1长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。然后用生成的含有抗B7-H4的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将HEK293T细胞接种在10mL完全Tet-DMEM中的4.0×106细胞/100mm组织培养物处理的板，并且在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中孵育过夜。一旦80-90％融合，就用CAR基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，以及专用反应缓冲液和聚合物，共转染HEK293T，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在将被转染的HEK293T细胞培养物在37℃孵育4小时之后，用10mL新鲜的完全Tet DMEM替换转染培养基。然后孵育HEK293T细胞额外的48小时，在此后收获细胞上清液，并且通过针对主要的慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。将含有慢病毒的上清液等分，并且储存在–80℃，直至用于靶向CD4+和CD8+细胞的转导。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、激活和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用MACS CD4+和CD8+MicroBeads(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)试剂盒来分离这些人类T细胞亚群，使用磁性地激活的LS柱来主动选择CD4+和CD8+T细胞。然后将磁性地结合的T细胞从磁性的MACS分离器中移除，从该LS柱冲洗，并且在新鲜的完全培养基中洗涤。使用LifeTechnologies AcousticCytometer通过流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞群体的纯度，并且在有需要的情况下通过执行在USC流式细胞术核心设备的荧光激活细胞分选进行富集。在适当的细胞培养容器中的补充有100IU/mL IL-2的完全培养基中，将CD4+和CD8+T细胞保持在1.0×106细胞/mL的密度，将α-CD3/α-CD28人类T细胞Dynabeads(LifeTechnologies；Carlsbad,CA)加入至其中以激活培养的T细胞。在湿润的5％CO2的培养器37℃孵育T细胞2天，然后用CAR慢病毒颗粒转导。
CD4+CD8+T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并且通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)的使用，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0×106细胞/mL完全培养基的浓度进行铺板。对于各个孔，以不同的感染复数(MOI)(例如1、5、10和50)，将含有B7-H4CAR的慢病毒颗粒添加至细胞混悬液。以4μg/mL的终浓度添加聚凝胺，它是一种阳离子聚合物，通过促进在慢病毒颗粒核靶细胞表面之间的相互作用而协助转导。在800×g 32℃对板进行离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并且将细胞团块重悬在含有100IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于37℃5％CO2加湿的培养箱中过夜。在转导之后第三天，细胞被团块化并且被重悬在有IL-2和400μg/mL遗传霉素(G418硫酸盐)(Life Technologies；Carlsbad,CA)的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析评估B7-H4CAR修饰的T细胞，以证明成功的转导过程。在体外和体内测定之前，通过FACS将B7-H4CAR T细胞富集，并且1:1混合用于体内研究。
通过钙黄绿素释放细胞毒性测定进行CAR功效的体外评估
收集B7-H4抗原阳性和阴性细胞系、洗涤并且以1.0x 106细胞/mL的浓度重悬在完全培养基中。以15μM将钙黄绿素乙酰甲酯(AM)添加至靶向细胞样品，然后其在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中孵育30分钟。将被染色阳性和阴性的靶细胞洗涤两次，并且通过离心重悬在完全培养基中，并且将其以1.0×104细胞/孔的浓度添加至96孔板。以50:1、5:1和1:1的效应细胞与靶细胞的比例，将B7-H4CAR T细胞添加至在板中的完全培养基。被染色的靶向细胞悬浮在完全培养基和具有2％triton X-100的完全培养基中，分别地作为自发对照和最大释放对照。在365x g、20℃离心所述板2分钟，然后将所述板放回培养箱3小时。然后将所述板离心10分钟，将细胞上清液等分至在黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别在485/20nm和528/20nm的激发和发射波长在SynergyTM HT酶标仪上评估荧光度。
通过Luminex生物测定进行的人类细胞因子的定量
使用在实验室中常规执行的标准程序，测量B7-H4CAR修饰的T细胞以及B7-H4阳性和阴性的肿瘤细胞系的上清液的细胞因子的分泌，作为CAR T细胞激活的测量。与培养基单独进行比较，并且与使用未被激活的人类T细胞的培养物进行比较，以测定背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12的浓度和其他相关细胞因子的浓度。
在两个异种移植的B7-H4阳性癌症模型中的CAR T细胞效力的体内评估
使用两种不同的人类肿瘤细胞系异种移植肿瘤模型，进一步体内评估B7-H4CAR T细胞。对于两者，通过5x 106B7-H4阳性或阴性的实体肿瘤细胞系的注射，在6-8周龄雌性裸鼠皮下地建立实体肿瘤。当肿瘤达到0.5cm的直径时，用1或3x 107人类T细胞(做为阴性对照)或基于体外研究结果从候选的B7-H4抗体构建的B7-H4CAR T细胞处理各组小鼠(n＝5)。然后通过游标卡尺3X/周测量肿瘤体积，以及然后生成了体积生长曲线，证明了相比对照的实验治疗的有效性。
一般情况下，B7-H4被表达在肿瘤上来抑制免疫反应。在正常细胞组织上，它的表达是非常有限的，使得它对于CAR T细胞成为可行的靶标。
实施例6–抗-B7-H4CAR T-细胞
CAR慢病毒构建体的构建
该CAR由结合B7-H4的细胞外抗原结合部分或scFV组成。将该scFV通过CD8铰链区域连接至细胞质信号传导结构域，该结构域由CD8跨膜区域以及来自CD28、4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域(图19)组成。通过Genewiz Gene合成服务(Piscataway,NJ)合成方法来合成包括该信号传导结构域的scFV序列。用适当的限制酶纯化和消化质粒，以通过T4DNA聚合酶反应(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入基于HIV-1的双顺反子慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen,Clontech,Signal Hill,CA)，其含有HIV-1 5’和3’长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、ZsGreen(绿色荧光蛋白)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40(SV40)起始位点。然后用生成的含有CAR的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将4.0×106个HEK 293T细胞接种在150cm2组织培养物处理的培养瓶中的20mL补充了10％已透析的FCS的DMEM中，并且使其在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中孵育过夜。一旦80-90％融合，就在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中，使HEK 293T细胞在20mL补充了1-％已透析的FCS且不含青霉素/链霉素的DMEM中孵育两小时。用pLVX-B7-H4-CAR质粒，以及含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒封装质粒，共转染HEK293T细胞。加入专用的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在将被转染的HEK293T细胞培养物在37℃孵育24小时之后，用20mL新鲜的完全DMEM替换转染培养基。然后每24小时收集慢病毒上清液，收集三天，然后在1,250rpm 4℃将上清液离心5分钟，然后过滤灭菌，在超速离心机中以20,000g 4℃离心2小时。将浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中。然后等分所述慢病毒，并且储存于–80℃，直到用于靶向CD4+和CD8+T细胞的转导。在24小时后收取细胞上清液，通过针对主要的慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试其中的慢病毒颗粒。通过在荧光显微镜下显示，由蛋白标记物ZsGreen的表达确定的转染效力估计在20％-50％之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、激活和富集
回收通过Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)的密度梯度离心而被富集的外周血液单核细胞(PBMC)，通过离心进行洗涤，该洗涤程序用含有0.5％牛血清蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中使用对CD4+和CD8+T细胞的阴性选择。通过流式细胞术(使用Life Technologies Acoustic Cytometer)评估CD4+和CD8+T细胞群体的纯度，并且通过荧光-激活细胞分选术进行富集。在适当的细胞培养瓶中的补充有100IU/mL IL-2的50％的Click完全培养基/50％RPMI-1640培养基中，将1:1混合的CD4+和CD8+T细胞维持在1.0×106细胞/mL的密度，将αCD3/αCD28人类T细胞激活磁珠(StemCell Technologies)添加至其中来激活被培养的T细胞。然后T细胞在37℃ 5％CO2培养箱中孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+CD8+T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并且通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，在完全培养基中以1.0×106细胞/mL的浓度接种被激活的T细胞。随后用补充有转染助剂Lentiblast(OzBiosciences,San Diego,CA)的慢病毒颗粒转导该细胞。在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中将被转导的细胞孵育24小时。将该细胞快速离心，并更换培养基，接着加入T细胞激活剂磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific,Carlsbad,CA)确定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并且用如上述的B7-H4CAR慢病毒构建体转导1x106细胞。在细胞毒性测定之前，使用T细胞激活剂磁珠(Stem Cell Technologies,SanDiego,CA)激活细胞2天。根据制造商的方案确定靶向细胞的最佳数量。对于该测试，将适当的靶细胞一式三份地在96孔板中进行铺板，在37℃ 5％CO2培养箱中24小时，随后以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入被激活的CAR T细胞，然后在37℃ 5％CO2的培养箱中孵育24小时。然后在37℃将细胞裂解45分钟，然后在1250rpm离心5分钟。将上清液转移至新的96孔板，接着加入反应混合物30分钟。使用终止溶液将该反应终止，并且将该板在450nm处读数，使用在650nm的吸光度来校正读数。
体内肿瘤消退测定
使Foxn1裸鼠注射表达B7-H4的永生的乳腺癌细胞系MDA-MB-468。使用0.2mL的接种器，将在200ul的磷酸盐缓冲生理水(PBS)中的2x106肿瘤细胞注射入小鼠的左侧腹。用αCD3/CD28激活剂复合物(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)将T细胞激活2天。然后用B7-H4CAR慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，接着用αCD3/CD28激活剂复合物再激活2天。然后在肿瘤接种后的第7天将被激活的B7-H4CAR T细胞(2.5x 106)静脉注射入小鼠。使用游标卡尺每周两次评估肿瘤的大小并且计算体积。
B7-H4CAR T细胞的细胞毒性
使用乳腺癌细胞系SKBR3检查B7-H4CAR T细胞的细胞溶解活性。如通过FACS分析确定的，SKBR3表达B7-H4(图20)。以效应细胞比靶细胞20:1、10:1、5:1和1:1的比例，将B7-H4CAR T细胞加入至SKBR3中。在10:1的比例时，B7-H4CAR T细胞示出了靶向SKBR3细胞的裂解增加，裂解率为25％。相比之下，在任意的被测试的比例下，未被转导的T细胞都不裂解SKBR3细胞。
实施例7-鼠抗人类HLA-G单克隆抗体的生成
抗原
HLA I类组织相容性抗原(α链G抗原)购自MybioSource.com(货号MBS717410)。它是一种在细菌中制造的重组蛋白并具有HIS标签，分子量为50KD(90％纯度)，序列为：
免疫方法
四周龄雌性BALB/c小鼠购自Harlan Laboratories，每两周用10μg以完全弗氏佐剂(第一和第二次免疫)或不完全弗氏佐剂(第三和第四次免疫)乳化的抗原免疫四次。每次免疫，将总共25μg的抗原/佐剂分为三份，分别皮内注射到小鼠背部上的单独位点。最后一次免疫后第十天，采集血样，在抗原包被的板上用ELISA法滴定。表现出最高效价的小鼠通过尾静脉注射进行第五次增强免疫，不添加佐剂，只将10μg溶解于100μl的无菌磷酸缓冲盐溶液中。
杂交瘤的生成
四天后，处死这些小鼠，摘取脾脏用于杂交瘤程序。将脾细胞分散于含有Pen/Strep抗生素的RPMI-1640培养基中，使用PEG(Hybri MAX,分子量1450,货号：p7181,Sigma)将脾细胞与鼠NSO细胞融合。随后使用HAT筛选使得仅融合细胞能够生长。首先用针对抗原包被的板的ELISA，其次通过在HLA-G阳性和阴性人肿瘤细胞系(JAR TrophoblasticCarcinoma)上进行的流式细胞术，筛选具有生长的杂交瘤细胞的孔中的上清液。筛选表现出阳性和高平均荧光指数(MFI)的杂交瘤，用于通过有限稀释法进行亚克隆。随后通过流式细胞术对亚克隆进行重新测试，并冷冻于液氮中，并在2L容器中扩增，然后用Tandon蛋白A或G以及离子交换色谱法纯化抗体。纯化抗体随后被装入小瓶并存储于-20℃直至使用。
流式细胞术方法和数据
使用通过ELISA发现对抗原包被板呈阳性的杂交瘤的上清液，在HLA-G阳性(JEG-3滋养细胞癌)和阴性(K562,Jurkat)细胞系上进行使用流式细胞术的筛选方法。这些产生高平均荧光指数(MFI)的杂交瘤随后被亚克隆，并再次筛选出对HLA-G呈选择性阳性的细胞群。如图21所示，母杂交瘤3H11和4E3的亚克隆持续生产高MFI的表达HLA-G的JEG-3细胞系。根据这些数据，3H11-12和4E3-1被选择用来生成如下所述的CAR-T细胞。
用筛选的抗体进行免疫组化
使用标准免疫组化方法和抗原修复法，发现抗体4E3及其亚克隆能染色HLA-G阳性组织。如图22A-22D所示，在抗原阳性肿瘤(如甲状腺乳头状癌)的细胞质和细胞膜中均为HLA-G阳性(图22A、22B)，但在正常甲状腺组织中呈阴性(图22C)，正常甲状腺组织不表达HLA(图22D)。获得用于免疫组化的HLA-G的伴随诊断抗体使在将来的临床试验中能够识别出有可能受益于HLA-G CAR T细胞疗法的患者。
HLA-G CAR T细胞的生成
单链HLA-G抗体基因的构建和合成
用于2种高结合性抗HLA-G抗体(4E3-1和3H11-12，我们实验室生成)的DNA序列获得自MCLAB(South San Francisco,CA)。在下述测定中测试两种抗体以确定哪一种能够产生最有效的CAR。如下所示，构建第二或第三(图23)代CAR载体，其由以下串联基因组成：kozak共有序列；CD8信号肽；抗HLA-G重链可变区域；(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头；各抗HLA-G轻链可变区域；CD8铰链和跨膜结构域；以及CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导结构域。铰链、跨膜和信号传导结构域的DNA序列通过Carl June的专利确定(参见US20130287748A1)。抗HLA-G CAR基因由Genewiz,Inc.(South Plainfield,NJ)在含有bla基因的pUC57载体骨架内合成，该bla基因赋予载体宿主氨苄青霉素抗性。
CAR基因亚克隆进慢病毒质粒
使用抗HLA-G质粒cDNA转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化CAR质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜T4DNA连接酶反应(New England Biosciences；Ipswich,MA)被插入进基于HIV-1的慢病毒载体，该载体包括HIV-1长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。然后使用得到的含有抗HLA-G的慢病毒质粒，转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将HEK293T细胞接种在4.0×106个细胞/100mm组织培养物处理过的板的10mL完全-Tet-DMEM中，并且在37℃ 5％CO2加湿的培养器中孵育过夜。一旦80-90％融合，则使用CAR-基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。将被转染的HEK293T细胞培养物在37℃孵育4小时之后，将转染培养基替换为10mL新鲜的完全Tet DMEM。然后HEK293T细胞将再孵育48小时，然后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。将含有慢病毒的上清液进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。可以使用MACSCD4+和CD8+MicroBeads(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)试剂盒，来分离这些人类T细胞亚群，其中使用磁激活的LS柱来主动选择CD4+和CD8+T细胞。然后从磁性MACS分离器中移除磁结合的T细胞，从该LS柱中冲刷，并在新鲜的完全培养基中洗涤。通过使用LifeTechnologies Acoustic细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞的纯度，并在有需要的情况下通过在USC的流式细胞术核心设施进行的荧光活化细胞分选术而进行富集。在合适的细胞培养容器中的补充有100IU/mL IL-2的完全培养基中，将CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞戴诺磁珠(LifeTechnologies；Carlsbad,CA)被加入来激活被培养的T细胞。使T细胞在37℃ 5％CO2培养箱中孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+和CD8+T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0×106个细胞/mL浓度于完全培养基中进行铺板。对于各个孔，以各种感染复数(MOI)(例如1、5、10和50)将含有HLA-G CAR的慢病毒颗粒加入至细胞混悬液。以4μg/mL的终浓度加入阳离子聚合物聚凝胺，通过促进慢病毒颗粒和靶细胞表面之间的相互作用而辅助转导。在32℃以800×g将培养板离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并将细胞团块重悬在有100IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于37℃ 5％CO2加湿的培养箱中过夜。在转导之后第三天，将细胞团块化并重悬在有IL-2和400μg/mL遗传霉素(G418硫酸盐)(Life Technologies；Carlsbad,CA)的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析来评估HLA-G CAR修饰的T细胞，以证明转导过程成功。在体外和体内测定之前，使用FACS富集HLA-G CAR T细胞并1:1混合以进行体内研究。
通过钙黄绿素释放细胞毒性测定进行CAR功效的体外评估
收集HLA-G抗原阳性和阴性靶细胞，洗涤，并以1.0x 106个细胞/mL的浓度重悬在完全培养基中。以15μM的浓度将钙黄绿素乙酰甲酯(AM)加入至靶细胞样品，然后在37℃5％CO2加湿的培养箱中孵育30分钟。将被染色的阳性和阴性靶细胞洗涤两次，并通过离心重悬在完全培养基中，并以1.0×104个细胞/孔的密度将其加入至96孔板。以50:1、5:1和1:1的效应细胞与靶细胞的比例，将HLA-G CAR T细胞加入至完全培养基中的板。悬浮在完全培养基和具有2％triton X-100的完全培养基中的被染色的靶细胞分别作为自发对照和最大释放对照。在365x g和20℃下将板离心2分钟，然后放回培养箱中3小时。然后将板离心10分钟，并将细胞上清液等分至黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别以485/20nm和528/20nm的激发和发射波长在SynergyTM HT酶标仪上评估荧光度。
通过Luminex生物测定进行的人细胞因子的定量
使用本领域中已知的标准程序，测量HLA-G CAR修饰的T细胞和HLA-G阳性和阴性肿瘤细胞系的上清液的细胞因子分泌，作为CAR T细胞激活的测量。将数据与单独的培养基进行比较，并且与使用未被激活的人类T细胞的培养物进行比较，以识别背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12和其他相关细胞因子的浓度。
在两种异种移植HLA-G阳性癌症模型中体内评估CAR T细胞功效
利用两种不同的人类肿瘤细胞系异种移植肿瘤模型来进一步体内评价HLA-G CART细胞。通过注射5x 106HLA-G阳性或HLA-G阴性实体肿瘤细胞系，在6-8周龄雌性裸鼠皮下建立这两种实体肿瘤。当肿瘤直径达到0.5cm时，使用1或3x 107个人类T细胞(作为阴性对照)或者使用从根据体外研究结果的最具活性的HLA-G抗体构建的HLA-G CAR T细胞，静脉注射小鼠(n＝5)。然后使用卡尺3X/周测量肿瘤体积，并生成体积增长曲线，以证明与对照相比实验处理的效果。
HLA-G被发现是CAR T细胞发育的优异靶标，以用来治疗丧失HLA-A、B、C的表达以避免免疫识别的人类实体肿瘤。它在正常组织中具有最低的表达(孕期胎盘除外)，因此在患者中应当具有非常有限的脱靶阳性和毒性。
实施例9-抗HLA-G CAR T细胞
CAR慢病毒构建体的构建
CAR由特异性结合至HLA-G的细胞外抗原结合部分或scFV构成。ScFV经CD8铰链区连接至细胞质信号传导结构域，该信号传导结构域由CD8跨膜区域、以及来自CD28、4-1BB和CD3z的信号传导结构域组成(图25)。包括该信号传导结构域的scFV序列由Genewiz GeneSynthesis服务公司(Piscataway,NJ)通过合成方法来合成。纯化质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过T4DNA连接酶反应(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入进基于HIV-1的双顺反子慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen,Clontech,Signal Hill,CA)，该载体包括HIV-1 5’和3’长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40(SV40)起始序列。然后使用得到的含有CAR的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，HEK 293T细胞以4.0×106个细胞接种在150cm2经组织培养物处理过的培养瓶中的补充有10％透析过的FCS的20mL DMEM中，并且在加湿的37℃ 5％CO2培养器中孵育过夜。一旦80-90％融合，则在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中使HEK 293T细胞在补充有1-％透析过的FCS的且不含青霉素/链霉素的20mL DMEM中孵育两小时。使用pLVX-B7-H4-CAR质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃下孵育被转染的HEK 293T细胞培养物24小时之后，将转染培养基替换为20mL新鲜的完全DMEM。每24小时收集慢病毒上清液至第三天，并且在4℃以1,250rpm将上清液离心5分钟，然后过滤灭菌并在4℃以20,000g在超速离心机中离心2小时。将被浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中。将慢病毒进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。24小时之后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。通过在荧光显微镜下显示，由蛋白标记物ZsGreen的表达确定的转染效力估计在30％-60％之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中使用对CD4+和CD8+T细胞阴性选择。通过使用Life Technologies Acoustic 细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞的纯度，并且通过荧光激活细胞分选术而富集。在合适的细胞培养容器中，在补充有100IU/mL IL-2的完全50％Click's培养基/50％RPMI-1640培养基中将1:1混合的CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃ 5％CO2培养箱中，使T细胞孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+和CD8+T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0×106个细胞/mL密度在完全培养基中进行铺板。使用补充有细胞转染辅助试剂Lentiblast(Oz Biosciences,San Diego,CA)的慢病毒颗粒转导细胞。然后在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中，使被转导的细胞孵育24小时。然后快速离心细胞，更换介质，接着加入T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific,Carlsbad,CA)测定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并使用上述HLA-G CAR慢病毒构建体来转导1x106个细胞。使用T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)来激活细胞两天，然后进行细胞毒性测定。根据制造商的方案来确定靶细胞的最佳数目。为了测定，将合适的靶细胞一式三份在96孔板中进行铺板，37℃ 5％CO2培养箱中24小时，然后以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入被激活的CAR T细胞，并在37℃ 5％CO2培养箱中孵育24小时。然后在37℃下裂解细胞45分钟，并以1,250rpm离心5分钟。将上清液转移至新的96孔板，然后加入反应混合物30分钟。使用终止溶液来终止反应，并在450nm对培养板进行读数，使用在650nm的吸光度来修正读数。
蛋白质免疫印迹
使用RIPA缓冲液裂解表达HLA-CAR的T细胞。通过Bradford方法估算蛋白浓度。50微克的蛋白裂解液在12％的还原性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后转移至硝酸纤维素膜。该膜在补充有0.05％吐温的5％无脂肪牛奶的TBS中封闭1小时。该膜随后在4℃用CD3ζ特异性抗体(1:250)孵育过夜。洗涤三次后，该膜在二抗中孵育，使用化学发光法检测条带。将膜剪成条状，并再次检测β肌动蛋白。
体内肿瘤消退测定
使用表达HLA-G的卵巢癌细胞系SKOV3注射Foxn1缺陷小鼠。使用0.2mL接种器将200ul的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2x 106个细胞注射进小鼠的左侧腹部。使用αCD3/CD28激活复合物(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)激活T细胞2天。然后使用HLA-G CAR慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，接着用αCD3/CD28激活复合物再激活2天。在肿瘤接种之后第7天，将2.5x 106个被激活的表达HLA-G CAR的T细胞注射至小鼠。使用游标卡尺每周两次评估肿瘤尺寸，并计算体积。
HLA-G CAR T细胞的细胞毒性
使用卵巢癌细胞系SKOV3检验HLA-G CAR-T细胞的溶细胞活性(图26)。FACS分析显示SKOV3表达HLA-G。以20:1、10:1、5:1和1:1的效应细胞:靶细胞比例，将HLA-G CAR T细胞加入至SKOV3。在10:1的比例时，HLA-G CAR T细胞示出了靶细胞SKOV3裂解增高，裂解率为42％。相比之下，未被转导的T细胞在所测试的任何比例下都未裂解SKOV3细胞。
HLA-G CAR的蛋白表达
如蛋白免疫印迹所示(图27)，用HLA-G CAR转导的T细胞表达CAR蛋白。CAR的大小预估为60kDA。β肌动蛋白用作上样内参。靶向用于该CAR的信号传导结构域的CD3ζ抗体被用来检测该CAR蛋白。
实施例10-小鼠抗人类HLA-DR单克隆抗体的生成
抗原
Raji African Burkitt的淋巴瘤细胞核被用作生产Lym-1抗体的抗原。CLL活检细胞核用作产生Lym-2抗体的抗原。
免疫方法
每两周用以完全弗氏佐剂(第一和第二次免疫)或不完全弗氏佐剂(第三和第四次免疫)乳化的107细胞核将购买自Harlan Laboratories的雌性BALB/c小鼠免疫四次。每次免疫，将总共107的细胞核/佐剂分为三份，皮内注射到小鼠背部上的单独位点。最后一次免疫后第十天，采集血样，在抗原包被的板上用ELISA法滴定。然后表现出最高效价的小鼠通过尾静脉注射进行第五次增强免疫，不添加佐剂，只将106细胞核溶解于100μl的无菌磷酸缓冲盐溶液中。
杂交瘤的生成
四天后，将这些小鼠处死，摘取脾脏用于杂交瘤程序。在将脾细胞分散于含有Pen/Strep抗生素的RPMI-1640培养基溶液之后，使用PEG(Hybri MAX,分子量1450,货号：p7181,Sigma)将该脾细胞与鼠NSO细胞融合。随后使用HAT筛选使得仅融合细胞能够生长。然后筛选来自具有生长的杂交瘤细胞的孔的上清液，首先用针对抗原包被的板的ELISA，其次通过在HLA-G阳性(Raji)和阴性人类肿瘤细胞系(CEM T-细胞白血病)上进行的流式细胞术。选择表现出阳性和高平均荧光指数(MFI)的杂交瘤，用于通过有限稀释法进行亚克隆。随后通过流式细胞术对亚克隆进行重新测试，并冷冻于液氮中，并在2L容器中扩增，然后通过Tandon蛋白A或G以及离子交换色谱法纯化抗体。被纯化的抗体随后被装入小瓶并存储于-20℃直至使用。
流式细胞术方法和数据
使用通过ELISA发现对抗原包被板呈阳性的杂交瘤的上清液，在HLA-DR阳性(Raji)和阴性(CEM)细胞系上进行使用流式细胞术的筛选方法。这些产生高平均荧光指数(MFI)的杂交瘤随后被亚克隆，并再次筛选出对HLA-DR呈选择性阳性的细胞群。如下图28A-28F所示，Lym-1和Lym-2对表达HLA-DR的Raji细胞系产生了高MFI，具有与B1抗体不同的曲线。根据这些数据，Lym-1和Lym-2被选择用来生成如下所述的CAR-T细胞。
使用所选择抗体的免疫组化
如图29A-29B所示，发现使用标准免疫组化方法和抗原修复方法，抗体Lym-1和Lym-2能够将人类扁桃体组织的生发中心中的HLA-DR阳性细胞染色。胸腺、脾和骨髓中的染色仅限于表达HLA-DR抗原的B细胞或树突细胞(表6)。
表6：冷冻切片或细胞离心涂片中的Lym-1和Lym-2与人类正常淋巴和造血组织的反应性
a免疫过氧化物酶染色强度从–至+++。
如图30A-30B所示，在抗原阳性肿瘤(例如中级B细胞淋巴瘤)的细胞膜上观察到HLA-DR阳性。最后，来自正常组织和器官的组织切片，示出了对淋巴B细胞和皮肤巨噬细胞的受限的反应性(表7)。获得用于免疫组化的HLA-DR的伴随诊断抗体，使得在将来的临床试验中能够识别出可能受益于HLA-DR CAR T细胞疗法的患者。
表7：冷冻切片中的Lym-1和Lym-2与正常非淋巴组织的反应性
a免疫过氧化物酶染色强度从–至+++。
活细胞的放射免疫测定
使用活细胞放射免疫测定方法，使用Lym-1或Lym-2筛选一组人淋巴瘤和实体肿瘤细胞系的结合。对于该测定，将悬浮培养物和用EDTA-胰蛋白酶从其培养瓶中移出的实体肿瘤细胞系在由PBS，牛血清白蛋白(1mg/ml)和0.02％叠氮化钠组成的冷缓冲液中洗涤两次。将重悬于100μl洗涤缓冲液中的细胞(5×105)移液到用BSA(10mg/ml)的PBS溶液预处理过夜的微孔中，以防止抗体与孔结合。然后加入Lym-1或Lym-2上清液(100μl/孔)孵育30分钟，同时在室温下使用96孔板的微型振荡器对其持续振荡。洗涤4次后，然后以100μl加入100,000cpm的I-125山羊抗小鼠IgG，并与该细胞一起再孵育30分钟，同时持续振荡。在最后4次洗涤后，将孔在γ计数器中计数以确定抗体与每种细胞制剂的结合。这些研究的结果表明，对于多种人淋巴瘤和白血病活组织检查，Lym-1和Lym-2的反应性仅限于B细胞而非T细胞来源的肿瘤(表8)。
表8：Lym-1和Lym-2与人类恶性淋巴瘤和白血病活检标本的反应性
a阳性/总数.
b拉帕波特分类.
c免疫过氧化物酶技术.
d间接免疫荧光.
与这些结果一致，如表9所示，Lym-1和Lym-2被发现结合选定数量的人类淋巴瘤和白血病细胞系。
表9：通过活细胞放射免疫测定的Lym-1和Lym-2与人类恶性淋巴瘤细胞系的反应性
a–,<2,000cpm；+,2,000–6,000cpm；++,6,000–10,000cpm；+++,10,000–15,000cpm；
++++,>15,000cpm.
相反，使用上述活细胞放射免疫测定未发现Lym-1和Lym-2与35种人实体肿瘤细胞系结合(表10)。
表10：通过活细胞放射免疫测定的Lym-1和Lym-2与35种人类实体肿瘤细胞系的反应性
a–,<2,000cpm；+,2,000–6,000cpm；++,6,000–10,000cpm；+++,10,000–15,000cpm；++++,>15,000cpm.
Lym-1和Lym-2抗体的结合曲线和Lym-1抗原的鉴定
图31A中示出了Lym-1与Raji细胞结合的结合曲线和Scatchard作图分析。同样地，图31B示出了Lym-2与ARH-77骨髓瘤细胞系结合的Scatchard作图分析。这些数据证明了，两种抗体对抗原阳性肿瘤细胞系的结合亲和力为108M-1。如表11所示，当与正常外周血B细胞相比时，结合亲和力与肿瘤细胞观察到亲和力相比降低了2至4倍。另外，用35S-甲硫氨酸和14C-亮氨酸代谢标记Raji细胞，示出了见于HLA-DR的特征条带图案(图32A-32B)。作为对照，平行使用SC-1抗HLA-DR抗体，并通过SDS-凝胶电泳给出具有相同蛋白质分子量的相同条图案。
表11：使用靶肿瘤细胞系(Raji，ARH-77)和扁桃体淋巴细胞的Lym-1和Lym-2的亲和力常数
实施例11-HLA-DR CAR T-细胞的生成
单链HLA-DR抗体基因的构建和合成
从MCLAB(South San Francisco,CA)中获得在实验室中生成的2种高结合力的抗-HLA-DR抗体的DNA序列。测试两种抗体以在下述的测定中确定哪一种生产最有效的CAR T细胞。如下所示，构建由以下的串联基因组成的第二或第三(图33)代CAR载体，所述串联基因：kozak共有序列，CD8信号肽，抗HLA-DR重链可变区域，(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头，各自的抗HLA-DR轻链可变区域，CD8铰链和跨膜结构域，以及CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导结构域。从Carl June的专利(参见美国专利申请公开号2013/0287748A1)确定了铰链、跨膜和信号传导结构域DNA序列。通过Genewiz,Inc.(South Plainfield,NJ)，在含有bla基因的pUC57载体骨架内合成抗-HLA-DR CAR基因，该bla基因对载体宿主赋予氨苄青霉素抗性。
CAR基因亚克隆进慢病毒质粒
用抗HLA-DR质粒cDNA转化NovaBlue SinglesTM化学感受态大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化CAR质粒并且用适当的限制性酶消化，通过T4DNA聚合酶(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜反应插入基于HIV-1的慢病毒载体，该载体含有HIV-1长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。然后用生成的含有抗HLA-DR的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将HEK293T细胞以4.0×106个细胞/100mm接种在组织培养物处理过的板的10mL完全-Tet-DMEM中，并且在37℃ 5％CO2加湿的培养器中孵育过夜。一旦80-90％融合，则使用CAR基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞，还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃下将被转染的HEK 293T细胞培养物孵育24小时之后，将转染培养基替换为20mL新鲜的完全DMEM。然后将HEK293T细胞再孵育48小时，其后收集上清液并且通过针对主要的慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。将含慢病毒的上清液进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用MACS CD4+和CD8+MicroBeads试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)来分离这些人类T细胞亚群，其中使用被磁性地激活的LS柱来阳性选择CD4+和CD8+T细胞。然后从该磁性的MACS分离器移除磁结合的T细胞，从LS柱中冲刷，并在新鲜的完全培养基中洗涤。通过使用LifeTechnologies Acoustic细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞群体的纯度，并在有需要的情况下通过在USC的流式细胞术核心设施进行的荧光活化细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中，将CD4+和CD8+T细胞以1.0×106个细胞/mL的密度维持在补充有100IU/mL IL-2的完全培养基中，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞Dynabead(LifeTechnologies；Carlsbad,CA)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃ 5％CO2培养箱中将T细胞孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+CD8+T-细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并且通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)的使用，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0×106细胞/mL完全培养基的浓度进行铺板。对于各个孔，以不同的感染复数(MOI)(例如1、5、10和50)，将含有HLA-DR CAR的慢病毒颗粒加入至细胞混悬液。以4μg/mL的终浓度加入阳离子聚合物聚凝胺，其通过促进在慢病毒颗粒核靶细胞表面之间的相互作用而协助转导。在32℃将板以800×g进行离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并且将细胞团块重悬在含有100IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于37℃ 5％CO2加湿的培养箱中过夜。在转导之后第三天，细胞被团块化并且被重悬在有IL-2和400μg/mL遗传霉素(G418硫酸盐)(Life Technologies；Carlsbad,CA)的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析评估HLA-DR CAR修饰的T细胞，以证明成功的转导过程。在体外和体内测定之前，通过FACS将HLA-DR CAR T细胞富集，并且1:1混合用于体内研究。
通过钙黄绿素释放细胞毒性测定体外评估CAR功效
收集HLA-DR抗原阳性和阴性人类细胞系，洗涤，并以1.0x 106个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中。以15μM的浓度将钙黄绿素乙酰甲酯(AM)加入至靶细胞样品，然后在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中孵育30分钟。将被染色的阳性和阴性靶细胞洗涤两次，并通过离心重悬于完全培养基中，并以1.0×104个细胞/孔的密度将其加入至96孔板。以50:1、5:1和1:1的效应细胞与靶细胞的比例，将HLA-DR CAR T细胞加入至完全培养基中的板。悬浮在完全培养基和具有2％triton X-100的完全培养基中的被染色的靶细胞分别作为自发对照和最大释放对照。在365x g和20℃下将培养板离心2分钟，然后放置回培养箱中3小时。然后将板离心10分钟，并将细胞上清液等分至黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别以485/20nm和528/20nm的激发和发射波长在SynergyTM HT酶标仪上评估荧光度。
通过Luminex生物测定进行的人类细胞因子的定量
使用本领域中已知的标准程序，测量HLA-DR CAR修饰的T细胞和HLA-DR阳性和阴性肿瘤细胞系的上清液的细胞因子分泌，作为CAR T细胞激活的测量。将数据与单独的培养基进行比较，并且与使用未被激活的人类T细胞的培养物进行比较，以识别背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12和其他相关细胞因子的浓度。
在两种异种移植HLA-DR阳性癌症模型中体内评估CAR T细胞功效
使用两种不同的人类肿瘤细胞系异种移植肿瘤模型来进一步体内评价HLA-DRCAR T细胞。通过注射5x 106HLA-DR阳性或HLA-DR阴性实体肿瘤细胞系，在6-8周龄雌性裸鼠皮下建立这两种实体肿瘤。当肿瘤直径达到0.5cm时，使用1或3x 107个人类T细胞(作为阴性对照)或者使用从根据体外研究结果的最具活性的HLA-DR抗体构建的HLA-G CAR T细胞，静脉注射各组小鼠(n＝5)。然后使用卡尺3X/周测量肿瘤体积，并生成体积增长曲线，以证明与对照相比实验处理的效果。
发现HLA-DR是CAR T细胞发育的突出靶标。
实施例12–Lym-1CAR细胞
CAR慢病毒构建体的构建
Lym-1CAR载体含有CD8前导序列，其后是细胞外抗原结合部分或scFV，其特异性结合Lym-1抗原。该ScFV经CD8铰链区连接至细胞质信号传导结构域，该信号传导结构域由CD8跨膜区域、以及来自4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域组成(图7)。包括该信号传导结构域的CAR序列由Genewiz Gene Synthesis服务公司(Piscataway,NJ)通过合成方法来合成。纯化质粒，并使用合适的限制酶进行消化从而通过T4DNA连接酶反应(New EnglandBiosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入进基于HIV-1的慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen,Clontech,Signal Hill,CA)，随后使用限制性酶消化并使用T4DNA连接酶的连接反应删除IRES-ZsGreen及(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入，该病毒载体含有HIV-15’和3’长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40(SV40)起始序列。然后使用得到的含有CAR的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在150cm2经组织培养物处理过的培养瓶中，HEK 293T细胞以4.0×106个细胞接种在补充有10％透析过的FCS的20mL DMEM中，并且在加湿的37℃ 5％CO2培养器中孵育过夜。一旦80-90％融合，则在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中使HEK 293T细胞在补充有1-％透析过的FCS的且不含青霉素/链霉素的20mL DMEM中孵育两小时。使用CAR质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃下将被转染的HEK 293T细胞培养物孵育24小时之后，将转染培养基替换为20mL新鲜的完全DMEM。每24小时收集慢病毒上清液至第三天，并且在4℃以1,250rpm将上清液离心5分钟，然后过滤灭菌并在4℃以20,000g在超速离心机中离心2小时。将被浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中。将慢病毒进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。24小时之后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。通过用生物素标记的蛋白L抗体(Genscript，Piscataway，NJ)染色，然后与偶联至PE的链霉亲和素一起孵育，并通过FACS分析检测，估计转染效力在20％-50％之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中使用对CD4+和CD8+T细胞的阴性选择。通过使用Life Technologies Acoustic 细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞的纯度，并且通过荧光激活细胞分选术而富集。在合适的细胞培养容器中，在补充有100IU/mL IL-2的完全50％Click's培养基/50％RPMI-1640培养基中将1:1混合的CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃ 5％CO2培养箱中，使T细胞孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+CD8+T-细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞在完全培养基中以1.0×106个细胞/mL密度进行铺板。使用补充有细胞转染辅助试剂Lentiblast(Oz Biosciences,San Diego,CA)的慢病毒颗粒转导细胞。在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中，使被转导的细胞孵育24小时。然后快速离心细胞，并且更换介质，接着加入T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)。
流式细胞术检测Lym-1CAR表达
在慢病毒转导后第7天，使用洗涤缓冲液(PBS中的4％BSA)洗涤原代T细胞3次。将细胞与生物素-蛋白L(2ug，Genscript，Piscataway，NJ)在4℃孵育45分钟。将细胞再次用洗涤缓冲液洗涤3次，然后与2ul链霉亲和素-PE(BD Sciences，La Jolla，CA)在4℃孵育45分钟。将细胞洗涤3次并使用流式细胞术(Attune Cytometer，Applied Biosciences，Carlsbad，CA)分析。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific,Carlsbad,CA)确定Lym-1CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并使用上述Lym-1CAR慢病毒构建体来转导1x 106个细胞。使用T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)来激活细胞两天，然后进行细胞毒性测定。根据制造商的方案来确定靶细胞的最佳数目。为了测定，将合适的靶细胞一式三份在96孔板中进行，37℃ 5％CO2培养箱中24小时，然后以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入被激活的CAR T细胞，并在37℃ 5％CO2培养箱中孵育24小时。然后在37℃下裂解细胞45分钟，并以1,250rpm快速离心5分钟。将上清液转移至新的96孔板，然后加入反应混合物30分钟。使用终止溶液来终止反应，并在450nm对培养板进行读数，使用在650nm的吸光度来修正读数。
体内肿瘤消退测定
使用表达Lym-1抗原的永生化B淋巴细胞系Raji注射Foxn1缺陷小鼠。将200ul的2x106个Raji细胞与1x106人类成纤维细胞的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液注射进预辐射小鼠(400rads)的左侧腹部，以减少循环NK细胞的数量，使异种移植物能够以高频率植入。使用αCD3/CD28激活复合物(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)激活T细胞2天。然后使用Lym-1CAR慢病毒颗粒，转染该被激活的T细胞，然后用αCD3/CD28激活复合物再激活2天。在肿瘤接种之后第7天，将2.5x 106个被激活的表达Lym-1CAR的T细胞通过尾静脉静脉注射入小鼠。使用游标卡尺每周三次评估肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积。
检测Lym-1CAR表达
用于表达Lym-1CAR的Lym-1CAR T细胞的分析显示62.5％的被转导的T细胞对Lym-1呈阳性(图35中图)。相反，仅1％的未被转导的用作对照的T细胞对CAR表达呈阳性(图35左图)。CD19转导的T细胞用作阳性对照，并示出了52％的CD19CAR的表达(图35右图)。
Lym-1CAR T细胞的细胞毒性
使用B细胞淋巴瘤细胞系Raji检查Lym-1CAR T细胞的溶细胞活性。通过FACS分析确定，Raji表达Lym-1抗原(HLA-Dr10)。以效应细胞与靶细胞的20：1、10：1、5：1和1：1的比例，将Lym-1CAR T细胞加入Raji细胞中。在5：1、10：1和20：1的比例，示出了Lym-1CAR T细胞增加靶Raji细胞的裂解，裂解率为22％。相比之下，未被转导的T细胞在任何测试比例下都不溶解Raji细胞。
实施例13–Lym-2 CAR细胞
CAR慢病毒构建体的构建
Lym-2CAR载体含有CD8前导序列，其后是细胞外抗原结合部分或scFV，其特异性结合Lym-2抗原(HLA-Dr)。该ScFV经CD8铰链区连接至细胞质信号传导结构域，该信号传导结构域由CD8跨膜区域、以及来自4-1BB和CD3ζ的信号传导结构域组成。包括该信号传导结构域的CAR序列由Genewiz Gene Synthesis服务公司(Piscataway,NJ)通过合成方法来合成。纯化质粒，并使用合适的限制酶进行消化从而通过T4DNA连接酶反应(New EnglandBiosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入进基于HIV-1的慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen,Clontech,Signal Hill,CA)，随后使用限制性酶消化并使用T4DNA连接酶的连接反应删除IRES-ZsGreen及(New England Biosciences；Ipswich,MA)过夜将其插入，该病毒载体含有HIV-1 5’和3’长末端重复序列(LTR)、包装信号(Ψ)、EF1α启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40(SV40)起始序列。然后使用得到的含有CAR的慢病毒质粒转化NovaBlue SinglesTM化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在150cm2经组织培养物处理过的培养瓶中HEK 293T细胞以4.0×106个细胞接种在补充有10％透析过的FCS的20mL DMEM中，并且在加湿的37℃ 5％CO2培养器中孵育过夜。一旦80-90％融合，则在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中使HEK 293T细胞在补充有1-％透析过的FCS的且不含青霉素/链霉素的20mL DMEM中孵育两小时。使用CAR质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37℃下孵育被转染的HEK 293T细胞培养物24小时之后，将转染培养基替换为20mL新鲜的完全DMEM。每24小时收集慢病毒上清液至第三天，并且在4℃以1,250rpm将该上清液离心5分钟，然后过滤灭菌并在4℃以20,000g在超速离心机中离心2小时。将被浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中。将慢病毒进行等分，并储存在–80℃，直至用于靶标CD4+和CD8+T细胞的转导。24小时之后收获细胞上清液，并通过针对主要慢病毒衣壳蛋白p24的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。通过用生物素标记的蛋白L抗体(Genscript，Piscataway，NJ)染色，然后与偶联至PE的链霉亲和素一起孵育，并通过FACS分析检测，估计转染效力在20％-50％之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare；Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞(PBMC)，并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中使用对CD4+和CD8+T细胞的阴性选择。通过使用Life Technologies Acoustic 细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞的纯度，并且将通过荧光激活细胞分选术而富集。在合适的细胞培养容器中，在补充有100IU/mL IL-2的完全50％Click's培养基/50％RPMI-1640培养基中将1:1混合的CD4+和CD8+T细胞维持1.0×106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies)被加入来激活被培养的T细胞。在37℃ 5％CO2培养箱中，使T细胞孵育2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+CD8+T-细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec；San Diego,CA)，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0×106个细胞/mL密度在完全培养基中进行铺板。使用补充有细胞转染辅助试剂Lentiblast(Oz Biosciences,San Diego,CA)的慢病毒颗粒转导细胞。然后在37℃ 5％CO2加湿的培养箱中，使被转导的细胞孵育24小时。然后将细胞快速离心，更换介质，接着加入T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific,Carlsbad,CA)测定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并使用上述Lym-2CAR慢病毒构建体来转导1x106个细胞。使用T细胞激活磁珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)来激活细胞两天，然后进行细胞毒性测定。根据制造商的方案来确定靶细胞的最佳数目。为了该测定，将合适的靶细胞一式三份在96孔板中进行铺板，37℃ 5％CO2培养箱中24小时，然后以20:1、10:1、5:1和1:1的比例加入被激活的CAR T细胞，并如上所述孵育24小时。然后在37℃下裂解细胞45分钟，并以1,250rpm离心5分钟。将上清液转移至新的96孔板，然后加入反应混合物30分钟。使用终止溶液来终止反应，并在450nm对培养板进行读数，使用在650nm的吸光度来修正读数。
体内肿瘤消退测定
使用表达Lym-2抗原的永生化B淋巴细胞系Raji注射Foxn1缺陷小鼠。将200ul的2x106个Raji细胞与1x106人类成纤维细胞的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液注射进预辐射(400rads)的BALB/c小鼠的左侧腹部，以确保高肿瘤的摄取率。使用αCD3/CD28激活复合物(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)激活T细胞2天。然后使用Lym-2CAR慢病毒颗粒，转染该被激活的T细胞，然后用该αCD3/CD28激活复合物再激活2天。在肿瘤接种之后第7天，将被激活的表达Lym-2CAR的T细胞(2.5x 106个)通过尾静脉静脉注射入小鼠。使用游标卡尺每周三次评估肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积。
Lym-2CAR表达的检测
用于表达Lym-2CAR的Lym-2CAR T细胞的分析显示28％的被转导的T细胞对Lym-2呈阳性(图38中图)。相反，仅1％的未被转导的用作对照的T细胞对CAR表达呈阳性(图38左图)。CD19转导的T细胞用作阳性对照，并示出了52％的CD19CAR的表达(图38右图)
Lym-2CAR T-细胞的细胞毒性
使用B细胞淋巴瘤细胞系Raji检查Lym-2CAR T细胞的溶细胞活性。通过FACS分析确定，Raji表达Lym-2抗原(HLA-Dr10)。以效应细胞与靶细胞的20：1、10：1、5：1和1：1的比例，将Lym-2CAR T细胞加入Raji细胞中。在5：1和10：1的比例，示出了Lym-2CAR T细胞增加靶Raji细胞的裂解，裂解率为22％。相比之下，未被转导的T细胞在任何测试比例下都不溶解Raji细胞。
实施例14-NK细胞的转导
NK-92MI的转导
NK-92Mi细胞系购自ATCC(CRL-2408)，并维持在含有10％FBS的RPMI-1640中。在转导之前，用10μg RetroNectin(Clontech T100A)的300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液将非组织处理的24孔板在室温下孵育2小时。将100万个NK-92Mi细胞和慢病毒(MOI＝5)混合并加入到RetroNectin包被的板中。然后将板在28℃800g离心90分钟。离心之后，将细胞维持在细胞培养箱中过夜。在孵育后，第二天早晨用PBS洗涤细胞三次，然后将被转导的NK-92Mi细胞转移到24孔G-Rex(Wilson Wolf)板中进行扩增。在慢病毒转导后第7天，将细胞在洗涤缓冲液(4％BSA的PBS溶液)中洗涤3次，用生物素-蛋白L(1ug/1百万细胞.Genscript)在4℃染色45分钟，并用洗涤缓冲液洗涤3次，然后在4℃加入2ul链霉亲和素-APC(BD science)45分钟。在洗涤缓冲液中最后洗涤3次后，通过FAC(Attune)分析细胞(图42)。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。
可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术要求保护的范围之内各种变化都是可能的。
因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和例子是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。
此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。
在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。
在以下权利要求中阐述了其他方面。

Claims (157)

1.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含：（a）抗-促黄体激素受体（“LHR”）抗体的抗原结合结构域，（b）CD8 α铰链结构域，（c）CD8 α跨膜结构域，（d）两个或更多个共刺激信号传导区域，以及（e）CD3 ζ信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
3.根据权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗-LHR抗体的抗原结合结构域包含抗-LHR重链（HC）可变区域和抗-LHR轻链（LC）可变区域。
4.根据权利要求3所述的CAR，其进一步包含位于所述抗-LHR HC可变区域和所述抗-LHR LC可变区域之间的接头多肽。
5.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述HC包含：
(a) CDR1，其包含GYSITSGYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含IHYSGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含ARSLRY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含：
(a) CDR1，其包含SSVNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含DTS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含HQWSSYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
6.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述HC包含：
(a) CDR1，其包含GFSLTTYG或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含IWGDGST或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含AEGSSLFAY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含
(a) CDR1，其包含QSLLNSGNQKNY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含WAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含QNDYSYPLT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
7.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述HC包含：
(a) CDR1，其包含GYSFTGYY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含IYPYNGVS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含ARERGLYQLRAMDY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含：
(a) CDR1，其包含QSISNN或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(b) CDR2，其包含NAS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(c) CDR3，其包含QQSNSWPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
8.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述抗-LHR重链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
9.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述抗-LHR轻链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
10.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述抗-LHR重链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
11.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述抗-LHR轻链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的CAR，其中等效物包含：与多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或由在高严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的CAR，其进一步包含可检测标记物或纯化标记物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的CAR，其进一步包含衍生自针对MUC-16的抗体或针对间皮素的抗体的抗原结合结构域。
15.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1至14中任一项所述的CAR。
16.根据权利要求15 所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自本文所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
17.根据权利要求15或16所述的分离的核酸序列，其进一步包含位于抗-LHR 抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列或增强子。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性多核苷酸。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含用于控制所述CAR的表达和/或激活的开关机制。
20.一种载体，其包含权利要求15至19中任一项所述的分离的核酸序列。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是质粒。
22.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、以及腺相关病毒载体。
23.根据权利要求20所述的载体，其中所述载体是CRISPR载体。
24.一种分离的细胞，其包含权利要求1至14中任一项所述的CAR，和/或权利要求15至19中任一项所述的分离的核酸，和/或权利要求20至23中任一项所述的载体。
25.根据权利要求24所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是免疫细胞。
26.根据权利要求25所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞是T-细胞或自然杀伤（NK）细胞。
27.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：权利要求1至14中任一项所述的CAR；和/或权利要求15至19中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求20至23中任一项所述的载体；和/或权利要求24至26中任一项所述的分离的细胞。
28.根据权利要求27所述的组合物，其进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，其中所述肽包含LHR蛋白或其片段。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肽与细胞相连。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肽被结合至固相支持物。
31.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
32.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肽与基质相连。
33.一种生产表达抗-LHR CAR的细胞的方法，其包含：
(i)用编码权利要求1至14中任一项所述的CAR的核酸序列引入免疫细胞的群体；以及
(ii)选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-LHR CAR的细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述T-细胞的群体已经被修饰以减少或消除内源性T-细胞受体的表达。
36.根据权利要求35所述的方法，其中使用采用RNA干扰或CRISPR的方法修饰所述T-细胞的群体。
37.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求33至36中任一项所述的表达抗-LHR CAR的细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述表达抗-LHR CAR的细胞对正被治疗的所述对象是自体同源的或同种异体的。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述肿瘤或癌症表达或过表达LHR。
40.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤，任选地为卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤；和/或所述癌症是卵巢癌症或前列腺癌症。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述对象是人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
42.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含：(a) 抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，(b) CD8α铰链结构域，(c) CD8 α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e) CD3ζ信号传导结构域。
43.根据权利要求42所述的CAR，其中所述两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
44.根据权利要求42或43所述的CAR，其中所述抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域包含抗-B7-H4重链(HC)可变区域和抗-B7-H4轻链(LC)可变区域。
45.根据权利要求44所述的CAR，其进一步包含位于所述抗-B7-H4 HC可变区域和所述抗-B7-H4 LC可变区域之间的接头多肽。
46.根据权利要求44或45所述的CAR，其中所述HC包含：
(d) CDR1，其包含GXTF或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(e) CDR2，其包含(i) ISSXXXT、(ii) INPNNGGT或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(f) CDR3，其包含ARPXYY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含
(d) CDR1，其包含(i) QSIVHXNGTY、(ii) ENIGSY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(e) CDR2，其包含(i) KVS、(ii) AAT或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(f) CDR3，其包含(i) FQGSXVPXT、(ii) QHYYSTLVT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的CAR，其中所述HC包含：
(d) CDR1，其包含(i) GFTFSSFG、(ii) GFTFSSYG、(iii) GYTFTDY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(e) CDR2，其包含(i) ISSGSSTL、(ii) ISSSNSTI或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(f) CDR3，其包含(i) ARPLYYYGSVMDY、(ii) ARPYYYGSSYDY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含
(d) CDR1，其包含(i) QSIVHRNGNTY、(ii) QSIVHSNGNTY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(e) CDR3，其包含(i) FQGSYVPPT、(ii) FQGSHVPLT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
48.根据权利要求44或45所述的CAR，其中所述抗-B7-H4重链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
49.根据权利要求44或45所述的CAR，其中所述抗-B7-H4轻链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
50.根据权利要求44或45所述的CAR，其中所述抗-B7-H4重链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
51.根据权利要求44或45所述的CAR，其中所述抗-B7-H4轻链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的CAR，其中等效物包含：与多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或由在高严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
53.根据权利要求42至52中任一项所述的CAR，其进一步包含可检测标记物或纯化标记物。
54.一种分离的核酸序列，其编码权利要求42至53中任一项所述的CAR。
55.根据权利要求54所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自本文所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
56.根据权利要求54或55所述的分离的核酸序列，其进一步包含位于所述抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列或增强子。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性多核苷酸。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含用于控制所述CAR的表达和/或激活的开关机制。
59.一种载体，其包含权利要求54至58中任一项所述的分离的核酸序列。
60.根据权利要求59所述的载体，其中所述载体是质粒。
61.根据权利要求59所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、以及腺相关病毒载体。
62.根据权利要求59所述的载体，其中所述载体是CRISPR载体。
63.一种分离的细胞，其包含权利要求42至53中任一项所述的CAR，和/或权利要求54至58中任一项所述的分离的核酸，和/或权利要求59至62中任一项所述的载体。
64.根据权利要求63所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是免疫细胞。
65.根据权利要求64所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞是T-细胞或自然杀伤（NK）细胞。
66.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：权利要求42至53中任一项所述的CAR；和/或权利要求54至58中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求59至62中任一项所述的载体；和/或权利要求63至65中任一项所述的分离的细胞。
67.根据权利要求66所述的组合物，其进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，其中所述肽包含B7-H4蛋白或其片段。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述肽与细胞相连。
69.根据权利要求67所述的组合物，其中所述肽被结合至固相支持物。
70.根据权利要求67所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
71.根据权利要求67所述的组合物，其中所述肽与基质相连。
72.一种生产表达抗-B7-H4 CAR的细胞的方法，其包含：
(i)用编码权利要求42至53中任一项所述的CAR的核酸序列引入免疫细胞的群体；以及
(ii)选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-B7-H4 CAR的细胞。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述T-细胞的群体已经被修饰以减少或消除内源性T-细胞受体的表达。
75.根据权利要求74所述的方法，其中使用采用RNA干扰或CRISPR的方法修饰所述T-细胞的群体。
76.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求72至75中任一项所述的表达抗-B7-H4 CAR的细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述表达抗-B7-H4 CAR的细胞对正被治疗的所述对象是自体同源的或同种异体的。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述肿瘤或癌症表达或过表达B7-H4。
79.根据权利要求76至78所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤，任选地为乳腺肿瘤、结肠肿瘤、或绒毛膜癌肿瘤；和/或所述癌症是乳腺癌、结肠癌或绒毛膜癌。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中所述对象包含人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
81.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含：(a) 抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域，(b) CD8α铰链结构域，(c) CD8 α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e) CD3ζ信号传导结构域。
82.根据权利要求81所述的CAR，其中所述两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD- 1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和 B7-H3。
83.根据权利要求81或82所述的CAR，其中所述抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域包含抗-HLA-G重链(HC)可变区域和抗-HLA-G轻链(LC)可变区域。
84.根据权利要求83所述的CAR，其进一步包含位于所述抗-HLA-G HC可变区域和所述抗-HLA-G LC可变区域之间的接头多肽。
85.根据权利要求83或84所述的CAR，其中所述HC包含：
(g) CDR1，其包含(i) GFNIKDTY、(ii) GFTFNTYA或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(h) CDR2，其包含(i) IDPANGNT、(ii) IRSKSNNYAT或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(i) CDR3，其包含(i) ARSYYGGFAY、(ii) VRGGYWSFDV或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含
(g) CDR1，其包含(i) KSVSTSGYSY、(ii) KSLLHSNGNTY或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(h) CDR2，其包含(i) LVS、(ii) RMS或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(i) CDR3，其包含(i) QHSRELPRT、(ii) MQHLEYPYT或其每一个的等效物的氨基酸序列。
86.根据权利要求83或84所述的CAR，其中所述抗-HLA-G重链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
87.根据权利要求83或84所述的CAR，其中所述抗-HLA-G轻链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
88.根据权利要求83或84所述的CAR，其中所述抗-HLA-G重链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
89.根据权利要求83或84所述的CAR，其中所述抗-HLA-G轻链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的CAR，其中等效物包含：与多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或由在高严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
91.根据权利要求81至90中任一项所述的CAR，其进一步包含可检测标记物或纯化标记物。
92.一种分离的核酸序列，其编码权利要求81至91中任一项所述的CAR。
93.根据权利要求92所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自本文所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
94.根据权利要求92或93所述的分离的核酸序列，其进一步包含位于抗-HLA-G抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列或增强子。
95.根据权利要求92至94中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性多核苷酸。
96.根据权利要求92至95中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含用于控制所述CAR的表达和/或激活的开关机制。
97.一种载体，其包含权利要求94至96中任一项所述的分离的核酸序列。
98.根据权利要求97所述的载体，其中所述载体是质粒。
99.根据权利要求97所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、以及腺相关病毒载体。
100.根据权利要求97所述的载体，其中所述载体是CRISPR载体。
101.一种分离的细胞，其包含权利要求81至91中任一项所述的CAR，和/或权利要求92至96中任一项所述的分离的核酸，和/或权利要求97至100中任一项所述的载体。
102.根据权利要求101所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是免疫细胞。
103.根据权利要求102所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞是T-细胞或自然杀伤（NK）细胞。
104.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：权利要求81至91中任一项所述的CAR；和/或权利要求92至96中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求97至100中任一项所述的载体；和/或权利要求101至103中任一项所述的分离的细胞。
105.根据权利要求104所述的组合物，其进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，其中所述肽包含HLA-G蛋白或其片段。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中所述肽与细胞相连。
107.根据权利要求105所述的组合物，其中所述肽被结合至固相支持物。
108.根据权利要求105所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
109.根据权利要求105所述的组合物，其中所述肽与基质相连。
110.一种生产表达抗-HLA-G CAR的细胞的方法，其包含：
(i)用编码权利要求81至91中任一项所述的CAR的核酸序列引入免疫细胞的群体；以及
(ii)选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-HLA-G CAR的细胞。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述T-细胞的群体已经被修饰以减少或消除内源性T-细胞受体的表达。
113.根据权利要求112所述的方法，其中使用采用RNA干扰或CRISPR的方法修饰所述T-细胞的群体。
114.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求110至113中任一项所述的表达抗-HLA-G CAR的细胞。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述表达抗-HLA-G CAR的细胞对正被治疗的所述对象是自体同源的或同种异体的。
116.根据权利要求114或115所述的方法，其中所述肿瘤或癌症表达或过表达HLA-G。
117.根据权利要求114至116所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤，任选地为甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤；和/或所述癌症是甲状腺癌、卵巢癌或前列腺癌。
118.根据权利要求114至117中任一项所述的方法，其中所述对象包含人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
119.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含： (a) 抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域，(b)CD8 α铰链结构域，(c) CD8 α跨膜结构域，(d)两个或更多个共刺激信号传导区域，以及(e)CD3 ζ信号传导结构域。
120.根据权利要求119所述的CAR，其中所述两个或更多个共刺激信号传导区域选自CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
121.根据权利要求119或120所述的CAR，其中所述抗- HLA-DR抗体的抗原结合结构域包含抗-HLA-DR重链(HC)可变区域和抗-HLA-DR轻链(LC)可变区域。
122.根据权利要求122所述的CAR，其进一步包含位于所述抗- HLA-DR HC可变区域和所述抗-HLA-DR LC可变区域之间的接头多肽。
123.根据权利要求121或122所述的CAR，其中所述HC包含：
(j) CDR1，其包含(i) Lym-1抗体的CDRH1、(ii) Lym-2抗体的CDRH1或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(k) CDR2，其包含(i) Lym-1抗体的CDRH2、(ii) Lym-2抗体的CDRH2或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(l) CDR3，其包含(i) Lym-1抗体的CDRH3、(ii) Lym-2抗体的CDRH1或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包含
(j) CDR1，其包含(i) Lym-1抗体的CDRL1、(ii) Lym-2抗体的CDRL1或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(k) CDR2，其包含(i) Lym-1抗体的CDRL2、(ii) Lym-2抗体的CDRL2或其每一个的等效物的氨基酸序列；和/或
(l) CDR3，其包含(i) Lym-1抗体的CDRL3、(ii) Lym-2抗体的CDRL3或其每一个的等效物的氨基酸序列。
124.根据权利要求121或122所述的CAR，其中所述抗-HLA-DR重链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
125.根据权利要求121或122所述的CAR，其中所述抗-HLA-DR轻链可变区域包含：选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的多肽。
126.根据权利要求121或122所述的CAR，其中所述抗-HLA-DR重链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
127.根据权利要求121或122所述的CAR，其中所述抗-HLA-DR轻链可变区域包含：具有选自本文所公开的序列或其每一个的等效物的共有序列的多肽。
128.根据权利要求119至127中任一项所述的CAR，其中等效物包含：与多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或由在高严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
129.根据权利要求119至128中任一项所述的CAR，其进一步包含可检测标记物或纯化标记物。
130.一种分离的核酸序列，其编码权利要求119至129中任一项所述的CAR。
131.根据权利要求130所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自本文所公开的序列中的任一个或其每一个的等效物的序列。
132.根据权利要求130或131所述的分离的核酸序列，其进一步包含位于抗-HLA-DR抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列或增强子。
133.根据权利要求130至132中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性多核苷酸。
134.根据权利要求130至133中任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包含用于控制所述CAR的表达和/或激活的开关机制。
135.一种载体，其包含权利要求130至134中任一项所述的分离的核酸序列。
136.根据权利要求135所述的载体，其中所述载体是质粒。
137.根据权利要求135所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、以及腺相关病毒载体。
138.根据权利要求135所述的载体，其中所述载体是CRISPR载体。
139.一种分离的细胞，其包含权利要求119至129中任一项所述的CAR，和/或权利要求130至134中任一项所述的分离的核酸，和/或权利要求135至138中任一项所述的载体。
140.根据权利要求139所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞是免疫细胞。
141.根据权利要求140所述的分离的细胞，其中所述免疫细胞是T-细胞或自然杀伤（NK）细胞。
142.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：权利要求119至129中任一项所述的CAR；和/或权利要求130至134中任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求135至138中任一项所述的载体；和/或权利要求139至141中任一项所述的分离的细胞。
143.根据权利要求142所述的组合物，其进一步包含能够结合肽的抗原结合片段，其中所述肽包含HLA-DR蛋白或其片段。
144.根据权利要求143所述的组合物，其中所述肽与细胞相连。
145.根据权利要求143所述的组合物，其中所述肽被结合至固相支持物。
146.根据权利要求143所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
147.根据权利要求143所述的组合物，其中所述肽与基质相连。
148.一种生产表达抗-HLA-DR CAR的细胞的方法，其包含：
(i)用编码权利要求119至129中任一项所述的CAR的核酸序列引入免疫细胞的群体；以及
(ii) 选择已经用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的免疫细胞的亚群体，从而生产表达抗-HLA-DR CAR的细胞。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述T-细胞的群体已经被修饰以减少或消除内源性T-细胞受体的表达。
151.根据权利要求150所述的方法，其中使用采用RNA干扰或CRISPR的方法修饰所述T-细胞的群体。
152.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长和/或治疗癌症的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求148至152中任一项所述的表达抗-HLA-DR CAR的细胞。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述表达抗-HLA-DR CAR的细胞对正被治疗的所述对象是自体同源的或同种异体的。
154.根据权利要求152或153所述的方法，其中与正常的、非癌性的对应细胞相比，所述肿瘤或癌症表达或过表达HLA-DR。
155.根据权利要求152至154所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞淋巴瘤肿瘤或白血病肿瘤；和/或所述癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
156.根据权利要求152至155中任一项所述的方法，其中所述对象包含人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马或牛。
157.一种试剂盒，其包含本文所公开的CAR、分离的核酸序列、载体、分离的细胞、以及组合物中的一种或多种及根据本文所公开一种或多种方法的使用说明。
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