CN107531782A - 用于表达b7‑h4的实体肿瘤的治疗的car t‑细胞 - Google Patents

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Abstract

作为癌症治疗的新方法描述了靶定在许多人类癌症上表达的人类B7‑H4的CAR细胞和抗体，所述癌症包括但不限于乳腺、卵巢和肾脏癌症。应当指出的是，B7‑H4 CAR细胞在患者中是安全并且有效的，并且可以被用于治疗表达B7‑H4表面蛋白的人类肿瘤。

Description

用于表达B7-H4的实体肿瘤的治疗的CAR T-细胞
相关申请的交叉引用
本申请根据美国专利法119(e)节的规定要求2015年03月27日提交的美国临时申请号62/139,592的优先权，前述申请的内容以引用的方式合并入本文中。
技术领域
本发明涉及新颖的B7-H4嵌合抗原受体（CAR）、包含其的细胞或组合物、以及应用其用于包括实体肿瘤的治疗的方法。本发明也在此提供了分离的肽和融合蛋白，所述肽和融合蛋白含有用于B7-H4受体的免疫原性的抗原决定簇。
发明背景
本发明的背景的下述讨论仅仅是被提供来帮助读者理解本发明，而并非承认示出或构成了本发明的现有技术。
卵巢癌是妇科肿瘤造成的癌症死亡的最常见的原因，并且是美国每年接近2,5000个新病例和14,000例死亡的原因。尽管在过去的30年中卵巢癌的整体的生存已经改善至当前的38个月的生存率，但是对于III 期疾病它的5年生存率没有显著地改变并且保持在25%左右。由于这些患者的高复发率，试图降低远处转移、延长复发时间以及改善整体生存率是卵巢癌研究的前沿。
在2014年，预计232,670个浸润性乳腺癌的新病例将在美国女性中被确诊，并且预计40,000例美国女性将死于转移性的疾病。患有乳腺癌的风险随着年龄增加，从而77%的病例在确诊时是超过50岁。通常，由于较早的检出、改善的疗法以及可能降低的发病率（由于减少使用绝经后的激素治疗），患有乳腺癌的患者的致死率自1989年已经降低。当在早期被检出时，局部的乳腺癌的5年生存率是99%。相比之下，区域的疾病的5年生存率是84%，并且重要地是，对于转移性的疾病其锐减至24%。
B7-H4是B7样分子，其似乎负性地调节T细胞的免疫性。在95-100%的胸腺癌样本中报道了B7-H4的过度表达。不仅它在这种肿瘤类别中上调，而且它的表达与HER-2和孕激素受体的状态呈负相关（Tringler, S. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1842-1848）。 因为在乳腺癌中的目前的疗法利用HER-2（曲妥珠单抗（trastuzumab）和 拉帕替尼（lapatinib））以及孕激素受体表达（激素治疗），三阴性乳癌（对于雌激素受体、孕激素受体和HER-2呈阴性）具有高度侵袭性的并且对常规治疗方案不起反应。B7-H4是用于靶向治疗的极好的抗原，特别是因为在更具侵袭性和难以治疗的案例中发现了较高的过度表达。
今年在美国预计63,920例成年人（39,140例男性和24,780例女性）将被诊断为肾癌。据估计，今年将有13,860例(8,900例男性和4,960例女性)死亡病例来自这种疾病。肾癌是第六大最常见的癌症，以及是男性癌症死亡的第十大常见原因，而且它是女性癌症死亡的第八大常见原因。肾癌患者的五年生存率是72%。在确诊时接近63%的病例没有转移性疾病。对于这一族群，五年生存率改善至92%。相反，对于在肾盂中的肾癌（转移性疾病）的五年生存率是51%。
发明内容
本发明提供了新颖的抗B7-H4抗体和其应用在诊断上和治疗上的方法。在一个方面，本发明在此提供了分离的抗体，所述抗体包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至人类B7-H4的表位，所述B7-H4包含氨基酸序列：IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKA (SEQID NO: 43) 或其等效物。
在本发明公开的某些实施方式中，所述抗体包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至人类B7-H4的表位，所述人类B7-H4的表位包含氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，其中所述HC包含下述HC CDRH1、和/或 HC CDRH2、和/或HC CDRH3的任意一个：所述HC CDRH1包含氨基酸序列GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)、GFTFSSYG (SEQ ID NO: 3)、或GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)，所述HC CDRH2包含氨基酸序列ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、ISSSNSTI (SEQ ID NO: 7)或INPNNGGT (SEQ ID NO: 8)，所述 HC CDRH3 包含氨基酸序列 ARPLYYYGSVMDY (SEQ IDNO: 10)或RPYYYGSSYDY (SEQ ID NO: 11)。
在本发明公开的某些实施方式中，抗体包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至人类B7-H4的表位，所述人类B7-H4的表位包含氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，其中所述LC包含LCCDRL1、和/或LC CDRL2、和/或LC CDRL3；所述LC CDRL1 包含氨基酸序列QSIVHRNGNTY (SEQID NO: 19)、QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 20)或ENIGSY (SEQ ID NO: 21)，所述LC CDRL2包含氨基酸序列KVS (SEQ ID NO: 22) 或AAT (SEQ ID NO: 23)，所述LC CDRL3包含氨基酸序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、 FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 26)、QHYYSTLVT (SEQ IDNO: 27)。
本发明的一些方面涉及嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包含对B7-H4特异的抗原结合结构域—例如抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，编码它们的核酸以及用于生产和使用它们的方法。
本发明的方面涉及嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包括：（a）B7-H4抗体的抗原结合结构域，（b）铰链结构域，（c）跨膜结构域，以及（d）细胞内结构域。本发明的进一步的方面涉及嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包含：（a）B7-H4抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域；（c）CD28跨膜结构域；（d）一种或多种共刺激区域，所述共刺激区域选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域以及OX40共刺激区域；以及（e）CD3 ζ信号传导结构域或其等效物或替代物。
在进一步的方面，本发明提供了嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包含：（a）抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域，（b）CD8 α铰链结构域，（c）CD8 α跨膜结构域，（d）4-1BB共刺激信号传导区域，（e）CD3ζ信号传导结构域或其等效物或替代物。
本发明的进一步的方面涉及分离的核酸序列，所述核酸序列编码所述抗体、含有其的载体和宿主细胞。
本发明的其他方面涉及包含B7-H4 CAR的分离的细胞和生产这样的细胞的方法。本发明的其他方面还涉及用于抑制肿瘤（例如实体肿瘤）的生长的方法以及治疗癌症患者的方法，所述方法包含施用有效量的所述分离的细胞。
本发明的另一方面的方法涉及方法或试剂盒，其用于通过B7-H4抗体和/或B7-H4CAR细胞的应用确定患者是可能响应还是不可能响应B7-H4 CAR治疗。
本发明的额外的方面涉及组合物，所述组合物包含载体和在本发明公开的实施方式中示出的一种或多种产物。在一些方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含载体和以下中的一种或多种：B7-H4抗体，和/或B7-H4 CAR，和/或编码B7-H4抗体或B7-H4 CAR的分离的核酸，和/或包含编码B7-H4抗体或B7-H4 CAR的分离的核酸序列的载体，和/或包含B7-H4CAR的分离的细胞。
附图说明
图1A-1C示出了用作抗原的人类B7-H4-Fc融合蛋白的示意图以及HPLC分析。（图1A）用于构建基因的载体；（图1B）完整的B7-H4-Fc融合蛋白，其中所述B7-H4被融合至人类IgG1的免疫球蛋白Fc区域的N端，以生产用作抗原的二聚的蛋白。（图1C）被纯化的B7-H4-Fc的HPLC分析示出了期望的保留时间，表明它的分子质量。
图2示出了在SKBR-3、HT-29、JAR和T47D细胞系（分别来源于乳腺癌、结直肠腺癌、绒毛膜癌、乳腺导管癌）上对于小鼠单克隆抗-人类B7-H4的代表性的流式细胞术数据。较深的线条代表被感染了B7-H4的细胞，以及较浅的线代表了用同型对照感染的细胞。被偶联至FITC的羊抗小鼠IgG 被用作第二抗体。在这些细胞系中，B7-H4的细胞表面的表达与b7-h4表达的q-PCR数据相匹配（数据未示出）。
图3示出了对于人类B7-H4的新生成的并且纯化的单克隆抗体的流式细胞术筛选的数据。基于这些结果，阳性的杂交瘤的亚克隆（35-8和5F6-6）被选择用于CAR T细胞的生成。然后对克隆35-8测序并且用于生产用于免疫治疗的B7-H4 CAR T细胞。
图4A-4B示出了在正常和癌症组织微阵列上的B7-H4抗体（克隆#35-8）染色的代表性的图像。（图4A）在正常组织上的B7-H4染色。（图4B）在乳腺的正常的组织和癌症组织上的B7-H4 染色。已发现对于B7-H4阳性负性的其他的正常的组织 （未示出）包括如下：肾上腺、骨髓、小脑、食管、垂体、肠、淋巴结、卵巢、前列腺、胃、睾丸、甲状腺、胸腺、舌、子宫、皮肤和神经组织。
图5示出了在质膜中的第三代抗B7-H4 CAR的DNA序列和理论结构的示意图。
图6示出了(A)人乳腺癌活检和（B）SKBR3人乳腺癌细胞系团块的切片上的B7-H4的免疫组织化学染色，示出了对于抗原（棕色染色）的细胞表面阳性。
图7示出了基因转移载体以及转基因的示意图。基因转移载体的骨架是基于HIV的双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen ，其含有HIV-1 5’和3’ 长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）、ZsGreen （绿色荧光蛋白）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40起源（SV40）。通过EF1-α启动子的存在，确保由对B7-H4特异的scFV、CD8铰链结构域和跨膜结构域以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域组成的转基因的组成型表达。检测蛋白ZsGreen的表达由IRES区域执行。可以通过荧光显微镜，通过在细胞中的ZsGreen测定载体的整合。
图8示出了B7-H4 CAR T细胞的细胞毒性。如方法中所述使用LDH细胞毒性试剂盒测定表达B7-H4 CAR的T-细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8小珠激活T-细胞(Stem Cell Technologies, 30 µl至2 ml 的培养基)。用B7-H4慢病毒颗粒转导被激活的T-细胞，随后使用αCD3/CD8小珠激活T细胞。使用未被转导的、被激活的T细胞作为对照。每孔铺3000 个SKBR3细胞。以20:1、10:1、5:1 和1:1 (60,000 – 3000个细胞)的比例，将B7-H4转导的T细胞加入至孔中。每一个数据点代表三次重复测量的平均值。
发明详述
应当解的是，本发明不被限制至所述特定的方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅仅被附加的权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有如属于本发明的技术领域的普通技术人员通常理解一样的含义。尽管也可以在本发明的实践中或试验中使用与本文所述的类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述的是优选的方法和材料。本文提及的所有技术和专利公开其全文都以引用的方式合并入文中。本文的任何描述都不应该被解释为承认通过在先发明本发明无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术之内的。参见例如，Sambrookand Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition;the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology;the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson etal. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford UniversityPress); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Laneeds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture ofAnimal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic AcidHybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation;Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A PracticalGuide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene TransferVectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed.(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press,London); 和Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology。
所有数字指定（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度、以及分子质量，都是在适当时变化（+）或（-）0.1 或1.0、或替代地变化+/- 15 %、或替代地10%、或替代地5%、或替代地2%的增值的近似值。应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是所有的数字指定都有术语“约”在前。还应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。
定义
如在本文和在权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“所述”包括复数指代，除非文中另外明确规定。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。
术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，表示人类和兽医对象，例如人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马和牛。在一些实施方式中，所述对象是人类。
如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物（例如人类、山羊、兔和鼠）以及非哺乳动物物种（例如鲨鱼免疫球蛋白）。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子（或感兴趣的高度相似的分子的群组）至实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”（例如，在生物样本中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少103 M-1、至少104 M-1或至少105 M-1的抗体和抗体片段）。术语“抗体”还包括遗传工程形式，例如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）、异源偶联抗体（例如双特异性抗体）。还请参见Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (PierceChemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman &Co., New York, 1997。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H）链和轻（L）链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链和轻链都包括恒定区域和可变区域（所述区域也被称为“结构域”）。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。重链和轻链可变区域包括被三个高变区域打断的“框架”区域，所述高变区域也被称为“互补决定区域”或“CDR”。框架区域和CDR的范围已经被确定（参见Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其以引用的方式合并入本文中）。Kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区域的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成的轻链和重链的结合的框架区域，主要采用β折叠构象，而CDR形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，其用来通过互链、非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向中。
CDR主要负责结合至抗原的表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，这是从N末端开始依次进行编号，并且也通常由该特定的CDR所位于的链而确定。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合B7-H4的抗体将具有特异性的VH区域和VL区域序列，并因此具有特异性的CDR序列。具有不同的特异性（即对不同抗原的不同结合位点）的抗体具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间不同的是CDR，但是在CDR之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在CDR之内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR）。
如本文使用的，术语“抗原”是指可以被特异性的体液或细胞免疫的产品（例如抗体分子或T细胞受体）特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖（例如寡糖）、脂质和激素以及大分子（例如复合碳水化合物（例如多糖））、磷脂和蛋白质。常见的抗原的类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病的抗原、过敏和移植物排斥、毒素和其他杂项抗原。
如本文使用的，术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。
如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”（CAR）是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体（CAR）”有时被称为“嵌合受体”、“T-体（T-body）”或“嵌合免疫受体（CIR）”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”是指已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链（hinge）结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。在本文中公开了编码每个结构域的组分的非限制性的示例性多核苷酸序列，例如：
铰链结构域： IgG1重链铰链结构域， SEQ. ID NO: 53:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
跨膜结构域：CD28 跨膜结构域 SEQ. ID NO: 54:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
细胞内结构域：4-1BB 共刺激信号传导区域， SEQ. ID NO: 55:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
细胞内结构域：CD28 共刺激信号传导区域，SEQ. ID NO: 56:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
细胞内结构域：CD3 zeta 信号传导区域，SEQ. ID NO: 57:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
每个示例性结构域组分的进一步的实施方式包括与由上述核酸序列编码的蛋白具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的其他蛋白。进一步地，在本文中提供了这样的结构域的非限制性例子。
“组合物”通常是指活性剂（例如化合物或组合物）和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的，例如可检测试剂或标签，或者是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地包括1-99.99%。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA））、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇（葡萄糖醇）和肌醇。
如本文使用的，术语“共有序列”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。
如本文使用的，术语“B7-H4”（也称为VTCN1、H4、B7h.5、B7S1、B7X或PRO129）指与这个名称相关的特定分子以及与B7-H4具有至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文在此提供了B7-H4序列的例子。此外，与GenBank 登录号：AY280973.1（小家鼠）和NP_078902（智人种）相关的蛋白序列提供了在多种动物中的B7-H4示例序列；该参照基因具有87%的同源性。与每一个被列举的GenBank 登录号相关的序列被引入本文。 如本文使用的，关于抗体或受体的术语“抗-B7-H4”是指特异性地结合至B7-H4的抗体或受体，并且包括任何针对B7-H4而生成的抗体。
如本使用的，术语“CD8 α铰链结构域”指与这个名称相关的特定蛋白片段，以及与本文所示的CD8 α铰链结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。对于人类、小鼠和其他物种的CD8 α铰链结构域的例子被提供在 Pinto, R.D. et al. (2006)Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177。与CD8 α铰链结构域相关的序列被提供在Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-17。这样的非限制性的列子包括：
人类CD8 α铰链结构域， SEQ. ID NO: 45：PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
小鼠CD8 α 铰链结构域，SEQ. ID NO: 46：KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
猫CD8 α铰链结构域, SEQ. ID NO: 47：PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY。
如本文使用的，术语“CD8 α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的CD8 α跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001759.3）、或者小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001074579.1）、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸（NCBI参考序列：NP_ 113726.1）相关的片段序列，提供了CD8 α跨膜结构域的其他的示例性序列。与列出的NCBI的每一个相关的序列提供如下：
人类 CD8 α跨膜结构域，SEQ. ID NO: 48：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
小鼠 CD8 α 跨膜结构域，SEQ. ID NO: 49：
IWAPLAGICVALLLSLIITLI
大鼠CD8 α跨膜结构域，SEQ. ID NO: 50：
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI。
如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。与列出的登录号的每一个相关的序列提供如下：由SEQID NO: 56编码的序列。
如本文使用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域（signaling region）”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号 US20130266551A1（以美国专利申请号US 13/826,258提交）中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的示例性序列。与美国公开号US20130266551A1相关的4-1BB共刺激信号传导区域的序列提供如下：
4-1BB共刺激信号传导区域，SEQ. ID NO: 51:KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger, T. L. et al., Blood 98: 2364-2371(2001)；Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001)；Maher, J. et al.Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002)；Haynes, N. M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002)；Haynes, N. M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)中提供了示例性的CD28共刺激信号传导区域。非限制性的例子包括以下CD28序列的114-220残基：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHLCPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 58)，及其等效物。
如本文使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：
ICOS 共刺激信号传导区域， SEQ ID NO: 59：
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGAGCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA。
如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。
OX40共刺激信号传导区域，SEQ ID NO: 60：
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC。
如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段以及与本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号US20130266551A1中提供了CD3ζ信号传导结构域的示例性序列。与CD3ζ信号传导结构域相关的序列被列出如下：
CD3ζ信号传导结构域， SEQ. ID NO: 52：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
如本文使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后开发记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞（例如T细胞）的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性例子包括AHH-1 (ATCC® CRL-8146™)、BC-1 (ATCC® CRL-2230™)、BC-2 (ATCC® CRL-2231™)、BC-3 (ATCC® CRL-2277™)、CA46 (ATCC® CRL-1648™)、DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™)、DS-1 (ATCC® CRL-11102™)、EB-3 [EB3](ATCC® CCL-85™)、Z-138 (ATCC #CRL-3001) 、DB (ATCC CRL-2289) 、Toledo (ATCCCRL-2631) 、Pfiffer (ATCC CRL-2632) 、SR (ATCC CRL-2262) 、JM-1 (ATCC CRL-10421)、NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693)；NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694) 、NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695) 、和SUP-B15 (ATCC CRL-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于源于间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6, Karpas 299、Ki-JK、Mac-2A Ply1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda 519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞（例如B细胞）的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC®CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC #CRL-11386) 细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF-CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas 45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT 3、MOLT-4、MOLT 13、MOLT-16、MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3和-4、CCRF-HSB-2(CCL-120.1)、J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153)、J45.01 (ATCC CRL-1990)、J.CaM1.6 (ATCCCRL-2063)、RS4;11 (ATCC CRL-1873)、CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78 (ATCC CRM-TIB-161)、MJ[G11] (ATCC CRL-8294)、HuT102 (ATCCTIB-162)。无白血病（Null leukemia）细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“NK细胞”（也被称为自然杀伤细胞）是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性例子包括NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。进一步的例子包括但不限于HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT NK细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type CultureCollection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、DNA基因组、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的补体，并且编码序列可以由此导出。
如本文使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等制造冰毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列（例如基因）的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在此控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。
如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞（HSC）的白血细胞（白细胞）、淋巴细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞）和骨髓来源的细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。
如本文使用的，术语“自体同源的（autologous）”在涉及细胞时是指，被分离并且被灌注回相同的对象（受体或宿主）的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。
“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。
“实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。
术语“卵巢癌”是指这样的一类型癌症，它在卵巢的组织中形成，并且经历了恶性转化，该恶性转化使得癌症之内的细胞对宿主生物体有病态作用并且具有入侵或扩散至身体的其他部分的能力。本文的卵巢癌包括组织学分级低的I型癌症和组织学分级更高的II型癌症。特别地，卵巢癌包括但不限于上皮癌、浆液性癌、透明细胞癌、性索间质瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、混合肿瘤、继发性卵巢癌、低恶性潜在肿瘤。
术语“前列腺癌”是指在男性生殖系统中的腺体前列腺中发展的一类型癌症。本文的前列腺癌包括但不限于腺癌、肉瘤、小细胞癌、神经内分泌肿瘤、移行细胞癌。
如本文使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体（例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等）中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接制造可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光制造可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团（例如荧光剂、发光染料）、带有通过电子显微镜或通过其电性质（例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗）检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法（例如原子力谱、隧道效应）、或放射性分子（例如 32 P、35 S或125 I）。
如本发明使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚（NANP）、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、 Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域（例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列）上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60%同一性、优选地至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被对齐的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein +SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代基的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40%的同一性、或者替代地少于25%的同一性。
短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。
在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过ELISA或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。如本文使用的，在指示蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70%同源性或同一性、或至少80%同源性或同一性和替代地、或至少约85%、或替代地至少约90%、或替代地至少约95%、或替代地98%百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ+ PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应来形成复合物的反应，该复合物通过核酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定。通过沃森-克里克（Watson-Crick）碱基配对、Hoogstein结合或以任意其他序列特异性的方式，氢键结合可以存在。该复合物包含形成双链结构的两条链，形成多链复合体的两条或三条链，单条自杂交的链或任意这些的组合。杂交反应可以构成更延伸的过程的步骤，例如PCR反应的开始，或通过核酶的多核苷酸的酶促切割。
严格的杂交条件的例子包括：约25°C 至约37°C 的孵育温度，约6x SSC 至约10xSSC 的杂交缓冲浓度，约0% 至约 25%的甲酰胺浓度，以及从约4x SSC至约 8x SSC的冲洗溶液。适当的杂交条件的例子包括：约40°C至约 50°C的孵育温度，约 9x SSC至约 2x的缓冲液浓度， 约30%至约50%的甲酰胺浓度，以及约5x SSC至约 2x SSC的冲洗溶液。高度严格的条件的例子包括：约55°C至约68°C 的孵育温度，约1x SSC 至约0.1x SSC 的缓冲浓度，约55% 至约75%的甲酰胺浓度，以及从约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的冲洗溶液。总之，杂交孵育时间为从5分钟至24小时，具有1次、2次或更多的冲洗步骤，并且冲洗孵育时间是约1、2或15分钟。SSC是0.15 M NaCl和15 mM SSC柠檬酸缓冲液。 应当理解的是，应用其他缓冲系统的SSC的等效物可以被应用。
“与肿瘤组织类型对应的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同的组织类型的正常细胞。非限制性例子是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或者来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。
术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸（例如DNA或RNA）或蛋白或多肽（例如抗体或其衍生物）或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基（当通过重组DNA技术生产时）、或化学前体或其他化学品（当化学合成时）。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指，通过B淋巴细胞的单一克隆制造的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞制造的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法制造的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单元可以通过其他键（例如酯键、醚键等）而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以进行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段（例如探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之前。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。
如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80%的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90%、通常大于95%的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。
如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10−6 M。在一些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10−7 M，并且优选10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M。
如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术制造的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。
如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指（1）防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；（2）抑制疾病或阻止其发展；或者（3）改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症（包括疾病）的程度的降低，病症（包括疾病）的稳定化（即不恶化）状态，病症（包括疾病）的延迟或减缓，病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。
如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中生产的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。
如本文使用的，术语“接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或替代地至约8、或替代地至约6、或替代地约5、或4或替代地3、或替代地2次的1至10个、或替代地8个氨基酸、或替代地6个氨基酸、或替代地5个氨基酸。例如，接头可以包括由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一个方面，接头序列是包括甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸的三个拷贝的（甘氨酸4丝氨酸）3柔性多肽接头。
如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能（例如至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的野生型活性，即全长序列的活性），则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。
如本文使用的，术语“WPRE”或“土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调控元件”是指与该名称相关的特定的核苷酸片段以及与本文所示的WPRE序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。例如，WPRE是指在土拨鼠肝炎病毒基因组序列（GenBank登录号J04514）中出现的类似于人类乙型肝炎病毒转录后调控元件（HBVPRE）的区域，并且该基因组序列的1093位至1684位的592个核苷酸对应于转录后调控区域（Journal of Virology, Vol. 72,p.5085-5092, 1998）。使用逆转录病毒载体的分析显示，被插入至感兴趣的基因的3'末端未翻译区域的WPRE提高了产生的蛋白的量5至8倍。还被报道的是，WPRE的引入抑制了mRNA降解（Journal of Virology, Vol. 73, p.2886-2892, 1999）。在广义上，例如WPRE的通过使mRNA稳定而提高氨基酸翻译的效率的元件也被认为是增强子。
缩写词列表
CAR：嵌合抗原受体
HLA：组织相容性淋巴细胞抗原
Ip：腹腔内
IRES：内部核糖体进入位点
MFI： 平均荧光强度
MOI： 感染复数
PBMC：外周血单核细胞
PBS： 磷酸盐缓冲盐水
scFv：单链可变片段
WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件
上述列出的每一个GenBank 登录号、UniProt参考号以及参考文献相关的序列以引用方式合并入文中。
用于实施本发明的模型
由于在B-细胞淋巴瘤和白血病中使用的自体同源的治疗取得了空前的成果，所述自体同源的治疗使用基因工程化的嵌合抗原受体（CAR）T-细胞（Maude, S.L. et al. (2014)New Engl. J. Med. 371:1507-1517; Porter, D.L. et al. (2011) New Engl. J. Med.365:725-733），大量实验室已经开始将这种方法应用至实体肿瘤，包括卵巢癌、前列腺癌和胰腺肿瘤。CAR修饰的T-细胞将单克隆抗体的独立于HLA的靶向特异性与被激活的T-细胞的细胞溶解活性、增殖以及归巢特性结合，但是对于检查点抑制不响应。由于它们的直接杀死表达靶标的抗原的能力，CAR T细胞对于任何抗原阳性的细胞或组织是高度有毒的，使得有需要使用高度肿瘤特异性的抗体构建CAR。迄今为止，已经针对抗α-叶酸受体、间皮素、MUC-CD、PSMA和其他靶标构建了对于人类实体肿瘤的CAR修饰的T-细胞，但是大多数在正常组织中具有抗原的一些脱靶表达。这些构建体在患者中没有示出相同的优越成果，强调了需要额外的研究来识别可以被用于抗实体肿瘤的新的靶标以及CAR T-细胞构建的方法。
因此，本发明提供了对B7-H4 特异的抗体(或者 “抗-B7-H4”)以及涉及其使用和生产的方法和组合物。此外，本发明提供了嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包含对B7-H4特异的抗原结合结构域（在某些方面是抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域），以及涉及其使用和生产的方法和组合物。
抗体及其使用
I.组合物
抗体的大体结构在本领域中是已知的，在此仅将进行简要的概述。免疫球蛋白单体包括通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。每条重链都和轻链中的一个配对，它们通过二硫键被直接结合。每条重链包括恒定区域（其根据抗体的同种型而变化）和可变区域。可变区域包括三个高度可变区域（或互补决定区域），其被命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3并且被支撑在框架区域之内。每条轻链包括恒定区域和可变区域，可变区域包括三个高度可变区域（命名为CDRL1、CDRL2和CDRL3），其以与重链的可变区域类似的方式被支撑在框架区域中。
每对重链和轻链的高度可变区域相互配合来提供能够结合靶标抗原的抗原结合位点。每对重链和轻链的结合特异性由重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列来界定。因此，一旦确定了引起特定的结合特异性的一组CDR序列（即重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列），则原则上该组CDR序列能够被插入进通过任何抗体恒定区域来连接的任何其他抗体的框架之内的适当位置，从而提供具有相同的抗原结合特异性的不同的抗体。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述抗体包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列以及轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列形成结合至人类B7-H4的表位的抗原结合位点。在一个方面，所述抗体具有至少10−6 M的结合亲和性。在某些方面，所述抗体以至少10−7 M的亲和性以及优选地10−8 M、10−9M、10−10 M、10−11 M或10−12 M的亲和性结合。
在一些实施方式中，重链可变结构域包含CDRH1序列，所述CDRH1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成：所述氨基酸序列以GXTF (SEQ ID NO:1)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，所述CDRH1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以下列序列中的任意一个开始：(i)GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)、(ii) GFTFSSYG (SEQ ID NO: 3)、(iii) GYTFTDY (SEQ IDNO: 4)或其等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，重链可变区域包含CDRH2序列，所述CDRH2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以ISSXXXT (SEQ IDNO: 5)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，所述CDRH2序列包含这样氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸以下列序列中的任意一个开始：(i)ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、(ii) ISSSNSTI (SEQ ID NO: 7)或其等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在其他实施方式中，重链可变区域包含CDRH2序列，所述CDRH2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以INPNNGGT (SEQ IDNO: 8)或其等效物开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，重链可变区域包含CDRH3 序列，所述CDRH3 序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以ARPXYY (SEQ IDNO: 9)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或接着约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，所述CDRH3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸以下列序列中的任意一个开始：(i)ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10), (ii) ARPYYYGSSYDY (SEQ ID NO: 11) 或其等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成： GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTC (SEQ ID NO: 12) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或进一步由其组成： EVQLEESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMKLPSLCYGLLGSRNLSHRLL (SEQ ID NO: 13 ) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGAATTCACTGGGTTCGTCAGGTTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTTATTAGTAGTAGCAATTCTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCGAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACCCCTTTACTACTATGGTAGCGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 14) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中， 重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或进一步由其组成： DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSYGIHWVRQVPEKGLEWVAFISSSNSTIYYADTVKGRFTISRDNAENTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARPLYYYGSVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 15)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，重链可变区域包含由下示的多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGATGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGTCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCTTATTACTACGGTAGTAGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 16) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中， 重链可变区域包含以下氨基酸序列、或者基本上由其组成、或进一步由其组成： EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYYGSSYDYWGQGTTLTVS (SEQ ID NO: 17)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL1序列，所述CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以QSIVHXNGTY (SEQ IDNO: 18)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步地的实施方式中，所述CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以下述序列中的任一个开始： (i) QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)、(ii) QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 20)或其等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL1序列，所述CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以ENIGSY (SEQ ID NO:21) 或其等效物开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL2序列，所述CDRL2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以KVS (SEQ ID NO:22)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL2序列，所述CDRL2序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以AAT (SEQ ID NO:23) 或其等效物开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL3序列，所述CDRL3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以FQGSXVPXT (SEQ IDNO: 24)开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。在进一步的实施方式中，CDRL1序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以下述序列中的任一个开始：(i)FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、(ii) FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 26)或其等效物，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含CDRL3序列，所述CDRL3序列包含这样的氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成，所述氨基酸序列以QHYYSTLVT (SEQ IDNO: 27)或其等效物开始，在羧基末端接着额外的50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：GACATTGTGATCACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGGAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACTTGCAGCAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 28) 或其抗原结合片段或每一个的其等效物。
在一些实施方式中， 轻链可变区域包含以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成： DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQQPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSYVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 29)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATAAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 30)或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成： DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 31) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含由以下多核苷酸序列编码的多肽、或基本上由其组成、或进一步由其组成：GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTGGCAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACACTCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCGAGATATTACTGTCAACATTATTATAGTACTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 32) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在一些实施方式中，轻链可变区域包含以下氨基酸序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成： DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIGSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATLLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTLVTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 33) 或其抗原结合片段或其每一个的等效物。
在本技术的另一个方面，所述分离的抗体包括以下特征中的一个或多个：
（a）轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85%相同的一个或多个CDR；
（b）重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85%相同的一个或多个CDR；
（c）轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85%相同；
（d）HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85%相同；以及
（e）所述抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
包含公开的CDR序列以及重链和轻链可变序列的示例性的抗体被分别公开在表1和表2中。
表1:
表2:
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体与选自B7H4 5F6、B7H4 # 33-14和 B7H4 #36-1的抗体至少85%是相同的。
在进一步的方面，上述指出的抗体具有至少10−6 M 的结合亲和性。在某些方面，抗体以至少约10−7 M、优选地10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M 的亲和性结合。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含B7H4 5F6的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体与B7H4 5F6至少85%是相同的。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含B7H4 # 33-14的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体与B7H4 # 33-14至少85%是相同的。
在一个方面， 本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体包含B7H4 #36-1的CDR。在一个方面，本发明提供了分离的抗体，所述分离的抗体与B7H4 #36-1至少85%是相同的。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4 5F6的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4 5F6的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4 # 33-14 的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4 # 33-14的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC可变结构域序列包含B7H4 #36-1的可变结构域序列，以及LC可变结构域序列包含B7H4 #36-1的可变结构域序列。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体以小于10−4 M、10−5 M、10−6 M、10−7 M、10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M的解离常数（KD）结合人类B7-H4。在本发明在此提供的抗体的一些方面，抗原结合位点特异性地结合至人类B7-H4。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是可溶性的Fab。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC和LC可变结构域序列是相同的多肽链的组分。在本发明在此提供的抗体的一些方面，HC和LC可变结构域序列是不同的多肽链的组分。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是全长的抗体。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是单克隆抗体。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是嵌合的或人源化的。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体选自Fab、F(ab)'2、Fab’、scFv、和 Fv 。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体包含Fc 结构域。在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是兔抗体。在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体是人类或人源化的抗体，或者在人体内是非免疫原性的。
在本发明在此提供的抗体的一些方面，所述抗体包含人类抗体框架区域。
在其他方面，在本发明在此提供的抗体的CDR中的一种或多种氨基酸残基被另外的氨基酸取代。这种取代可以是“保守的”，意为在相同的氨基酸的家族内的取代。天然存在的氨基酸可以被分成下述的四个家族，保守的取代将在这些家族中进行。
1) 具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
2) 具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸。
3)具有不带电极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸，酪氨酸。
4) 具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
在另一个方面，一个或多个氨基酸残基被添加至一个或多个抗体的CDR或被从一个或多个抗体的CDR中删除。这样的添加或缺失出现在CDR的N或C端或在CDR之内的位置处。
通过氨基酸的添加、缺失或取代将抗体的CDR的氨基酸序列改变，可以获得各种效果，例如增加了对于靶定抗原的结合亲和性。
应当理解的是，包含这样的被改变的CDR序列的本发明的抗体仍然通过与被公开的抗体相似的特异性和灵敏度而结合B7-H4。这可以通过结合测试来进行检测。
抗体的恒定区域也可以是被改变的。例如抗体可以设有任意的同种型的Fc区域：IgA (IgA1、IgA2) 、IgD、IgE、IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM 。恒定区域序列的非限制性的例子包括：
人类IgD 恒定区域，Uniprot: P01880 SEQ ID NO: 34APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人类IgG1 恒定区域， Uniprot: P01857 SEQ ID NO: 35 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类 IgG2恒定区域，Uniprot: P01859 SEQ ID NO: 36 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类 IgG3恒定区域，Uniprot: P01860 SEQ ID NO: 37 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人类IgM恒定区域，Uniprot: P01871 SEQ ID NO: 38 GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人类IgG4恒定区域， Uniprot: P01861 SEQ ID NO: 39 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人类IgA1恒定区域，Uniprot: P01876 SEQ ID NO: 40 ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类IgA2恒定区域，Uniprot: P01877 SEQ ID NO: 41 ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类Ig κ恒定区域，Uniprot: P01834 SEQ ID NO: 42 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些方面，所述抗体包含重链恒定区域，其与SEQ ID NO: 12 至 17的任意一个至少80%是相同的。
在一些方面，所述抗体包含轻链恒定区域，其与SEQ ID NO: 28 至 33的任意一个至少80%是相同的。
在本发明提供的抗体的一些方面，所述抗体结合至表位，所述表位被B7H4 5F6、B7H4 # 33-14和B7H4 #36-1抗体结合。
在本发明提供的抗体的一些方面，B7-H4-特异性抗体与B7H4 5F6、B7H4 # 33-14和 B7H4 #36-1竞争结合人类B7-H4 。
在本发明提供的抗体的一些方面，所述抗体含有结构的修饰来促进快速的结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，B7-H4 抗体包括在抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速的结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，Fab 片段被用于促进快速的结合和细胞摄取、和/或降低释放。在一些方面，F(ab)'2 片段被用于促进快速结合和细胞摄取、和/或降低释放。
所述抗体、片段及其等效物可以与载体结合（例如药学上可接受的载体或其他试剂），以提供用于使用和/或储藏的制剂。
进一步提供的是一种分离的多肽，其包括可用来产生结合至B7-H4的抗体的B7-H4的氨基酸序列或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，以及编码它们的分离的多核苷酸。在一个方面，所述分离的多肽或多核苷酸进一步包括标记和/或连续的多肽序列（例如匙孔血蓝蛋白（KLH）载体蛋白），或者在多核苷酸的情况下，包括可操作地结合至多肽或多核苷酸的编码该序列的多核苷酸。所述多肽或多核苷酸可以与各种载体（例如磷酸盐缓冲盐水）结合。进一步提供了宿主细胞，例如原核或真核细胞，例如细菌、酵母、哺乳动物（大鼠、类人猿、仓鼠、或人类），其包括所述分离的多肽或多核苷酸。所述宿主细胞可以与载体结合。
II.用于制备组合物的方法
抗体、它们的制造和用途是广为人知的并且被公开于例如Harlow, E. and Lane, D.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1999。可以使用本领域已知的标准方法来生产抗体。抗体的例子包括（但不限于）单克隆、单链、和抗体的功能性片段。
可以在一定范围的宿主（例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等）内制造抗体。可以通过使用具有免疫原性特性的靶标抗原或其片段或寡肽（例如B7-H4的C末端片段或分离的多肽）进行的注射来使它们免疫。根据宿主种类，可以加入和使用各种佐剂，以提高免疫反应。这样的佐剂包括但不限于弗氏（Freund's）试剂、矿物凝胶（例如氢氧化铝）、以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克（pluronic）多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、以及二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，BCG（卡介苗）和小棒杆菌（Corynebacteriumparvum）是特别有用的。本发明还提供了分离的多肽和佐剂。
在一些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的抗B7-H4抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的CDR的多个类型的抗B7-H4抗体的混合物。因此，培养制造不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从得到的培养物纯化的抗体（参见WO 2004/061104）。
单克隆抗体生产。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来制备B7-H4的单克隆抗体。这样的技术包括但不限于杂交瘤技术（Kohler &Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)）；三肿瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术（参见例如Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)）以及EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体（参见例如Cole, et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, AlanR. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)）。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人类杂交瘤（参见例如Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030(1983)）或者通过用Epstein Barr病毒体外转染人类B细胞（参见例如Cole, et al., in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985) ）来生产。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的PCR，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段（例如可变结构域）的DNA。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白（例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白）的DNA，用于表达和展示噬菌体或细菌上的融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于B7-H4多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代地，可以通过例如使用包括B7-H4的氨基酸序列或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成的分离的多肽，使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，来制备表达杂交瘤的抗B7-H4单克隆抗体。参见例如Milstein et al., (Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))。使用标准方法来筛选杂交瘤将制造不同特异性（即对不同表位的特异性）和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性（例如B7-H4结合）的选择的单克隆抗体可以（i）被用作通过杂交瘤来表达，（ii）被结合至例如聚乙二醇（PEG）的分子以改变其特性，或（iii）可以通过各种方法来分离、序列化和操纵编码所述单克隆抗体的cDNA。在一个方面，通过杂交瘤来生产抗B7-H4单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物（例如转基因小鼠）获得的B细胞，其中该转基因非人动物具有包括被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et al., MonoclonalAntibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)中教导的技术。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来生产本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗B7-H4抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库（例如人类或鼠类）中选择具有期望的结合特性的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括具有Fab、Fv的fd和M13，或者二硫化稳定化的Fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。此外，方法可以适用于构建Fab表达文库（参见例如Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989），以允许具有B7-H4多肽（例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物）的所需的特异性的单克隆Fab片段的快速和有效的识别。可以被用来制造本发明的分离的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括在以下文献中公开的方法：Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988)；Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1066-1070 (1990)；Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995)；Ames etal., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995)；Kettleborough et al., Eur. J.Immunol. 24: 952-958 (1994)；Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997)；Burton etal., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994)；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047 (Medical Research Council et al.)；WO 97/08320 (Morphosys)；WO 92/01047 (CAT/MRC)；WO 91/17271 (Affymax)；以及美国专利号5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727和5,733,743。
洛宁的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上显示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，编码来自噬菌体的区域的抗体可以被分离并且被用来产生整个抗体（包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段），并且被表达在任何期望的宿主（包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌）中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，例如在WO 92/22324；Mullinax et al., BioTechniques 12:864-869 (1992)；Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995)；以及Better et al., Science240: 1041-1043 (1988)中公开的。
通常，可以针对合适的抗体来选择被克隆进显示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而识别维持了良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如Barbas III et al., Phage Display, A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)。但是，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体（被修饰的T7或Lambda Zap系统）以用于选择和/或筛选。
抗体生产的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或面板，来产生抗体（Orlandi et al.,PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299 (1991)）。
替代地，可以使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体（scFv）包括通过接头肽（通常长度为5至25个氨基酸）连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scFv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scFv，例如通过编码该scFv的载体在宿主生物（例如E. coli）中的表达。可以通过以下方法获得编码scFv的DNA：使用部分DNA作为模板进行扩增，其中该部分DNA编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的DNA和编码其轻链或轻链的可变区域的DNA的DNA的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的PCR，并且进一步结合编码多肽接头部分的DNA和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将接头的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scFv的DNA的表达载体和由该表达载体转化的宿主。
还可以产生抗原结合片段，例如F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生，而Fab片段可以通过减少F(ab′)2片段的二硫键而产生。替代地，可以构建Fab表达文库来进行具有期望的特异性的单克隆Fab片段的快速和简单的识别（Huse et al.,Science, 256: 1275-1281 (1989)）。
抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将IgG CH3结构域结合至两个scFv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本文公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂（免疫偶联物）之间形成的偶联物的形式。在一个方面，本文公开的抗体被偶联至放射性物质。在另一个方面，本文公开的抗体可以被结合至多种分子，例如聚乙二醇（PEG）。
抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以识别具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在B7-H4、或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的B7-H4表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试（Maddox etal., J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983)）。
抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质化。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。
仅仅作为例子，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用，分离和纯化抗体。Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)。
色谱法的例子包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液体色谱（例如HPLC或FPLC）进行色谱。
在一个方面，在亲和色谱中可以使用Protein A柱或Protein G。其他示例性的柱包括Protein A柱、Hyper D、POROS、Sepharose F. F. (Pharmacia)等。
使用方法
概述。本文公开的抗体可用于本领域中涉及B7-H4多肽的定位和/或定量的方法（例如用于测量在适当的生理样品之内的B7-H4多肽的水平、用于诊断方法、用于使多肽成像等）。本文公开的抗体可用于通过标准技术（例如亲和色谱或免疫沉淀）分离B7-H4多肽。本文公开的B7-H4抗体可以促进来自生物样品（例如哺乳动物血清或细胞）的天然B7-H4多肽以及在宿主系统中表达的重组地制造的B7-H4多肽的纯化。再者，可以使用B7-H4抗体来检测B7-H4多肽（例如在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中），从而评估多肽的表达的丰度和模式。可以诊断性地使用本文公开的B7-H4多肽，以作为临床测试过程的一部分来监控组织中的B7-H4水平，例如从而确定给定的治疗方案的功效。可以通过将本文公开的B7-H4抗体结合（即物理地连接）至可检测的物质，以促进检测。
在另一个方面，本文提供了一种组合物，其包括结合至肽的本文公开的抗体或抗原结合片段，所述肽包括例如人类B7-H4蛋白或其片段。在一个方面，所述肽与细胞相关。例如，所述组合物可以包括采用本文公开的抗体或抗体片段进行标记的被分解的细胞样品，该组合物可用于例如用于分离细胞的亲和色谱方法或基于流式细胞术的细胞分析或细胞分选。作为另一个例子，所述组合物可以包括采用本文公开的抗体或抗体片段进行标记的固定的组织样品或细胞涂片，该组合物可用于例如免疫组织化学或细胞学分析。在另一个方面，所述抗体或抗体片段被结合至固体支撑物，其可用于例如：ELISA；亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离B7-H4蛋白或其片段、B7-H4阳性细胞、或含有B7-H4和其他细胞组分的复合物。在另一个方面，所述肽被结合至固体支撑物。例如，所述肽可以通过对该肽特异的二级抗体而被结合至固体支撑物，其可用于例如夹心ELISA。作为另一个例子，所述肽可以被结合至色谱柱，其可用于例如根据本技术的抗体的分离或纯化。在另一个方面，所述肽被置于溶液中，例如裂解溶液或含有被分馏的细胞的亚细胞组分的溶液，其可用于例如ELISA和亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离B7-H4蛋白或其片段、或含有B7-H4和其他细胞组分的复合物。在另一个方面，所述肽与基质相关，例如凝胶电泳凝胶或通常被用于蛋白免疫印迹的基质（例如由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯制成的膜），该组合物可用于电泳和/或免疫印迹技术，例如蛋白免疫印迹。
B7-H4多肽的检测。用于检测生物样品中的B7-H4多肽的水平的示例性方法涉及从对象获得生物样品，并且将所述生物样品与能够检测B7-H4多肽的本文公开的B7-H4抗体相接触。
在一个方面，B7-H4抗体B7H4 5F6、B7H4 # 33-14或B7H4 #36-1或其片段被可检测地标记。关于抗体的术语“标记”旨在包括抗体的直接标记和抗体的间接标记，前者通过将可检测的物质结合（即物理地连接）至抗体，而后者通过与被直接地标记的另一种化合物的反应性。间接标记的非限制性例子包括使用荧光标记的二级抗体进行的初级抗体的检测，以及使用生物素进行的DNA探针的末端标记，使得它能够通过荧光标记的链霉亲和素而被检测。
本发明的检测方法可以被用来体外及体内检测生物样品中的B7-H4多肽的表达水平。用于B7-H4多肽的检测的体外技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光（例如IHC）。进一步地，用于B7-H4多肽的检测的体内技术包括将被标记的抗B7-H4抗体引入对象中。仅仅作为例子，可以使用放射性标记物来标记所述抗体，可以通过标准的成像技术来检测该标记物在对象中的存在和位置。在一个方面，所述生物样品包括来自测试对象的多肽分子。
免疫测试和成像。本文公开的B7-H4抗体可以被用来使用基于抗体的技术测试生物样品（例如人类血浆）中的B7-H4多肽水平。例如，可以使用经典的免疫组织化学（IHC）染色方法来研究组织中的蛋白表达。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985(1985)；Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)。可用于检测蛋白基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测试，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）和放射免疫测定（RIA）。合适的抗体测试标签在本领域中是已知的并且包括：酶标签，例如葡萄糖氧化酶；以及放射性同位素或其他放射剂，例如碘（125I、121I、131I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（112In）、和锝（99mTc）；以及荧光标签，例如荧光素和罗丹明、以及生物素。
除了在生物样品中测试B7-H4多肽水平之外，还可以通过成像而在体内检测B7-H4多肽水平。可以与抗B7-H4抗体结合以用于B7-H4多肽水平的体内成像的标签包括能够通过X射线照相、NMR或ESR检测的标签。对于X射线照相，适当的标签包括放射性同位素（例如钡或铯），其发射可检测的辐射但不对对象显著有害。用于NMR和ESR的适当的标记物包括具有可检测的特性螺旋的标记物（例如氘），其可以通过对于相关的scFv克隆的营养素的标记而被结合进B7-H4抗体。
已经标记有合适的可检测的成像部分（例如放射性同位素（例如131I、112In、99mTc）、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的材料）的B7-H4抗体，被引入（例如肠胃外、皮下或腹膜内）进所述对象。在本领域中将理解的是，对象的大小和使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况中，对于人类对象，注射的放射性的量将通常为约5至20毫居里99mTc。被标记的B7-H4抗体然后将会优先地积累在含有特异性靶标多肽的细胞的位置。例如，在S. W. Burchiel et al., Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer 13 (1982)中描述了体内肿瘤成像。
在一些方面，含有促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的结构性修饰的LHR抗体可用于体内成像检测方法。在一些方面，LHR抗体包括在抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
B7-H4抗体的诊断性使用。本文公开的B7-H4抗体组合物可用于诊断和预后方法。因此，本发明提供了用于在对象中的B7-H4相关的医疗状况的诊断中使用本文公开的抗体的方法。可以选择本文公开的抗体，使得它们具有对B7-H4多肽的高水平的表位结合特异性和高的结合亲和力。一般来说，抗体的结合亲和力越高，则在免疫测试中可以进行的洗涤条件越严格，以在不移除靶标多肽的情况下移除非特异性结合的材料。相应地，可用于诊断性测试的本技术的B7-H4抗体通常的结合亲和力为至少10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12 M。在一些方面，被用作诊断试剂的B7-H4抗体具有足够的动力学上的速率（kinetic on-rate），以在至少12小时、至少5小时、至少1小时、或至少30分钟在标准条件下达到平衡。
本技术的一些方法采用了抗B7-H4抗体的多克隆制剂以及作为诊断试剂的抗B7-H4抗体的多克隆制剂，以及其他方法采用单克隆分离物。在采用根据上述方法制备的多克隆人类抗B7-H4抗体的方法中，制剂通常含有B7-H4抗体的混合物，例如具有对于靶定多肽的不同表位特异性的抗体。本发明的单克隆抗-B7-H4抗体可用于在存在或可能存在紧密相关的抗原的情况下检测单一的抗原。
本发明的B7-H4抗体可以被用作对于任何类型的生物样品的诊断试剂。在一个方面，本文公开的B7-H4抗体可用作对于人类生物样品的诊断试剂。B7-H4抗体可以被用来在多种标准测试方式中检测B7-H4多肽。这样的方式包括免疫沉淀、蛋白免疫印迹、ELISA、放射免疫测定、流式细胞术、IHC和免疫测定。参见Harlow & Lane, Antibodies, ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074、3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。可以从对象的任何组织（包括活组织检查）、细胞或体液中获得生物样品。
B7-H4抗体的预后使用。本发明还提供了预后（或预测）测试，用于确定对象是否有风险发展与提高的B7-H4多肽表达或活性（例如癌前细胞的检测）相关的医学疾病或病症。这样的测试可以被用于预后或预测目的，从而因此在以B7-H4多肽表达为特征或与其相关的医学疾病或病症的发作之前，预防性地治疗个体。
本发明的另一个方面提供了用于确定在对象中的B7-H4表达的方法，从而选择用于对象的适当治疗的或预防性的化合物。
替代地，所述预后测试可以被利用来识别具有或有风险发展癌症和/或实体肿瘤的对象。在某些实施方式中，所述癌症和/或实体肿瘤是乳腺、结肠、前列腺、卵巢或更具体地绒毛膜癌。因此本发明提供了用于识别与增加的B7-H4多肽表达水平相关的疾病或病症的方法，其中测试样品从对象以及被检测的B7-H4多肽被获取，其中相比于对照的样品，增加的B7-H4多肽表达水平的呈现可预测对象具有或有风险发展与增加的B7-H4多肽表达水平相关的病或病症。 在一些方面，与增加的B7-H4相关的疾病或病症选自癌症和/或实体肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症和/或实体肿瘤是乳腺、结肠、前列腺、卵巢的，更具体地是绒毛膜癌。
在另一个方面，本发明提供了用于确定对象是否可以用化合物有效地治疗与增加的B7-H4多肽表达相关的失调或病症，其中生物学的样品是从对象获得的并且使用B7-H4抗体检测所述B7-H4多肽。在从对象被获取的生物样品中，B7-H4多肽的表达水平被确定并且与从无疾病的对象被获取的样品中发现的B7-H4表达水平相比较。相比于从健康对象获取的样品，在从怀疑具有疾病或病症的对象被获取的样品中，提高的B7-H4多肽的水平表明了在被测试对象中的B7-H4相关的疾病或病症。
有许多疾病状态其中提高的B7-H4多肽的表达水平被已知来指示患有该疾病的对象是否可能响应于对特定类别的疗法或治疗。因此，检测生物样品中的B7-H4多肽的方法可以被用作预后的方法，例如从而评估该对象将会响应于疗法或治疗的可能性。确定来自对象的合适的组织或体液样品中的B7-H4多肽的水平，并将其与合适的对照进行比较，所述对照例如是患有相同的疾病但是有利地响应该治疗的对象中的水平。
在一个方面，本发明提供了监控试剂（例如药物、化合物或小分子）对B7-H4多肽的表达的影响的方法。这样的测试可以被应用在基本药物筛选和临床实验中。例如，降低B7-H4多肽水平的试剂的效力可以在展现了提升的B7-H4表达的对象（例如被诊断有癌症的患者）的临床实验中被监测。通过施用试剂和观察反应，可以识别影响B7-H4多肽的表达的试剂。以这种方式，B7-H4多肽的表达类型可以当做标记，表明对象对试剂的的生理反应。相应地，可以在使用该试剂的对象的治疗之前、以及在期间的各种时间点，确定该反应状态。
本发明的进一步的方面涉及用于确定患者是可能响应还是不可能响应B7-H4 CAR疗法的方法。在特定的实施方式中，该方法包括将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的B7-H4抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在。在进一步的实施方式中，结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应所述B7-H4 CAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应B7-H4疗法。在一些实施方式中，所述方法包括额外的步骤，其中向被确定可能响应B7-H4 CAR疗法的患者施用有效量的B7-H4 CAR疗法。在一些实施方式中，所述肿瘤和/或癌症为实体肿瘤，例如乳腺癌、结肠癌或绒（毛）膜癌。
III.试剂盒
如本文所述，本发明提供了用于测定B7-H4的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒，以及用于进行本发明的方法的说明，例如收集组织和/或进行筛选、和/或分析结果。
所述试剂盒包括本文公开的B7-H4抗体组合物（例如单克隆抗体）以及使用说明、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述试剂盒可用于检测生物样品中B7-H4多肽的存在，所述生物样品例如是任何体液，包括但不限于例如痰液、血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液并且包括身体组织的活检样品。测试样品也可以是肿瘤细胞、肿瘤附近的正常细胞、对应于肿瘤组织类型的正常细胞、血细胞、外周血淋巴细胞、或其组合。根据测试形式、测试方法的特性和被用作被测试的样品的组织、细胞或提取物，在上述方法中使用的测试样品将会发生改变。用于制备蛋白提取物或细胞的膜提取物的方法在本领域中是已知的，并且可以被容易地适应，从而获得能够与采用的系统兼容的样品。
在一些方面，所述试剂盒可以包括：能够结合生物样品中的B7-H4多肽的一种或多种B7-H4抗体（例如具有B7-H4抗体B7H4 5F6、B7H4 # 33-14或B7H4 #36-1的相同的抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段）；用于确定样品中的B7-H4多肽的量的装置；以及用于将所述样品中的B7-H4多肽的量与标准进行比较的装置。所述B7-H4多肽中的一种或多种可以被标记。所述试剂盒组件（例如试剂）可以被包装在合适的容器中。所述试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒来检测B7-H4多肽的说明。在一些方面，所述试剂盒包括：第一抗体，例如被连接至固体支撑物，其结合至B7-H4多肽；以及任选地2）第二、不同的抗体，其结合至所述B7-H4多肽或所述第一抗体，并且被偶联至可检测的标签。
所述试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒可以进一步包括检测所述可标记的标签（例如酶或底物）必要的组件。所述试剂盒还可以包括对照样品或一系列的对照样品，其可以被检测并且与测试样品相比较。所述试剂盒的每个组件都可以被包裹在单个容器之内，并且所有的各种容器可以与用于解读使用该试剂盒进行的测试的结果的说明一起，处于单一的包装之内。本发明的试剂盒可以包括在所述试剂盒容器之上或之内的书面产品。所述书面产品描述了如何使用被包含在试剂盒之内的试剂。
经得起考验的是，可以以本领域技术人员习惯使用的方式来包装这些建议的试剂盒组件。例如，这些建议的试剂盒组件可以被提供于溶液中或者作为液体分散体等。
IV.载体
所述抗体或LHR CAR还可以被结合至许多不同的载体。因此，本发明还提供了含有所述抗体和活性或惰性的另一种物质的组合物。熟知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂和磁铁矿。所述载体的性质可以是可溶的或不可溶的以用于本发明。本领域技术人员将会知晓用于结合抗体的其他合适的载体、或者将会能够使用常规实验来确定这些载体。
嵌合抗原受体及其使用
I.组合物
本发明提供了结合至B7-H4的嵌合抗原受体（CAR），所述嵌合抗原受体包含包含细胞外、跨膜或细胞内结构域的细胞激活部分，或基本上由其组成，或进一步由其组成。细胞外结构域包含靶向特异性结合元件，或被称为抗原结合结构域。细胞内结构域或细胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ链部分。所述CAR可选地进一步包含多至300个氨基酸、优选地10至100个氨基酸、更优选地25至50个氨基酸的隔离结构域。
抗原结合结构域。在某些方面，本发明提供CAR，所述CAR包含对B7-H4特异的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在 一些实施方式中，抗原结合结构域包含抗B7-H4抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的实施方式中，抗B7-H4抗体的重链可变区域和轻链可变区域包含抗B7-H4抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。
在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区域包含SEQ ID NO: 12 至17或其等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成，和/或包含一种或多种包含SEQ ID NO: 1至11或其等效物的CDR区域。在一些实施方式中，抗体的轻链可变区域包含SEQ ID NO: 28至 33或其等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成，和/或包含一种或多种包含SEQ IDNO: 18 至27或其等效物的CDR区域。
跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154、TCR。替代地所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头（优选长度为2至10个氨基酸）可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
细胞质结构域。CAR的细胞质结构域（胞质域）或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。TCR和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。因为通过TCR产生的信号单独不足以进行T细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD- 1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原- 1(LFA-1 )、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、或特异性地与CD83结合的配体也可以被包括在CAR的细胞质结构域中。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白、和CD3-ζ蛋白。
在具体的实施方式中，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，所述共刺激信号传导区域包括CD28共刺激信号传导区域和4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。
在一些实施方式中，所述CAR可以进一步包括可检测的标记物或纯化标记物。
II.用于制备CAR的程序
本发明还提供生产表达B7-H4 CAR的细胞的方法，所述方法包含以下步骤、或基本上由其组成、或进一步由其组成：(i) 用如本文所述的编码CAR的核酸序列转导分离的细胞的群体，以及(ii)选择已经使用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的分离细胞的亚种体，从而生产表达B7-H4 CAR的细胞。在一个方面，所述分离的细胞选自T细胞和NK细胞。
本发明的方面涉及包含B7-H4 CAR的分离的细胞和生产这样细胞的方法。所述细胞是原核的或真核的细胞。在一个方面，所述细胞是T细胞或NK细胞。所述真核细胞可以来自任意优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞（例如人类、猫、或犬细胞）。
在具体的实施方式中，所述分离的细胞包括外源性CAR、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗B7-H4抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。
在一些实施方式中，公开了生产表达B7-H4 CAR的细胞的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成：（i）使用编码B7-H4 CAR的核酸序列转导分离的细胞的群体，和（ii）选择已经使用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的细胞的亚群体。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞，从而生产B7-H4 CAR T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞，从而生产B7-H4 CAR NK细胞。
分离的细胞的来源。在本发明公开的这些细胞的扩增和基因修饰之前，可以从对象获得细胞，例如在涉及自体治疗的实施方式中，或者从商业上可获得的培养物获得，例如从美国模式培养物保藏所（ATCC）获得。
细胞可以从对象中的许多来源获取，包括外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。
分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies Dynabeads®系统；STEMcell Technologies EasySep™、RoboSep™、RosetteSep™、SepMate™；Miltenyi Biotec MACS™细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群体。例如，MACS™ CD4+和CD8+ MicroBeads可以被用来分离CD4+和CD8+ T细胞。
替代地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对T细胞，BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)细胞系；以及对于NK细胞，NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。
载体。可以使用载体制备CAR。本发明的方面涉及编码B7-H4 CAR的分离的核酸序列以及载体，所述载体包含编码CAR的分离的核酸序列及其补体以及其每一个的等效物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。
在一些实施方式中，分离的核酸序列编码CAR，其包括、或基本上由其组成，或进一步由其组成：抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括编码以下的序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域、随后的（b）CD8 α铰链结构域、（c）CD8 α跨膜结构域、接着的（d）CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、接着的（e）CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，分离的核酸序列包含位于编码抗-B7-H4抗体的抗原结合结构域的序列的上游的Kozak共有序列、或基本上由其组成、或进一步由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括赋予抗生素抗性的多核苷酸。
在一些实施方式中，分离的核酸序列被包含在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在某些实施方式中，所述载体是病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。
在以下的例子中详细地讨论示例性的载体的制备以及使用所述载体生成表达CAR的细胞。总的来说，通常通过可操作地将编码CAR多肽的核酸或其部分的核酸连接至启动子以及将构建体整合进入表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体适用于复制和整合真核生物。用于生产包含载体和/或外源的核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
在一个方面，术语 “载体”意指重组的载体，其保持感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞，并且整合进入靶细胞基因组的能力。在一些方面，所述载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒（HIV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和猫免疫缺陷病毒（FIV）。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒（MLV）。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包括衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包括合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组的载体源于自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类慢病毒群组包括 “慢病毒”原型visna/maedi病毒（VMV）、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,07,993；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。
美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组。该专利教导了每个逆转录病毒包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复（LTR）的区域而被处于两个末端的侧翼。所述LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合（A）加成（终止）的位点是在LRT右手边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞（在某些情况下为病毒）转录激活蛋白。
关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA（基质）、CA（衣壳）和NC（核衣壳）。pol基因编码逆转录酶（RT），其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶（IN），它们介导基因组的复制。
对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的DNA构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列（“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个），以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的部件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2 “ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of HopeResearch Institute实验室生成和使用；“Lenti-X” 慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由德国柏林的Virology (CBF)的Charité Medical School, Institute实验室生成和使用。
不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行各种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段（ELlSA和蛋白质印迹）或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将CAR包装进逆转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体包括促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包括至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′ LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′ LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点（例如SV40聚腺苷酸化位点）、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、或长臂猿白血病病毒（GALV）。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒（HCMV）即刻早期（IE）增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒（MMSV）的增强子和启动子（U3区域）、Rous肉瘤病毒（RSV）的U3区域、脾病灶形成病毒（SFFV）的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV 或GALV 的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的（貂病灶形成）或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒（GALV）env蛋白、人类免疫缺陷病毒env（gp160）蛋白、水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白、人类T细胞白血病（HTLV）I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，包装质粒和表达B7-H4的逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞（ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.），从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞）共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞或造血干细胞）一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。
在另一个方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞（例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞）的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地（episomally）维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。
T细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的T细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增T细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7, 144,575；7,067,318；7, 172,869；7,232,566；7, 175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中描述的方法。使用B7-4抗原离体刺激能够激活并扩增表达所选的CAR的T细胞亚种群。替代地，可以通过与B7-H4抗原相互作用，体内激活T细胞。
激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies Dynabeads®系统激活和扩增试剂盒；BD Biosciences Phosflow™激活试剂盒、Miltenyi Biotec MACS™激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚种群。例如，α-CD3/α-CD28 Dynabeads®可以被用来激活和扩增分离的T细胞的群体。
III.使用方法
治疗应用。本发明的方法方面涉及用于在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法、和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，所述肿瘤/癌症是实体肿瘤，例如乳腺癌、结肠癌、绒毛膜癌、卵巢癌或前列腺癌。在一些实施方式中，肿瘤或癌症表达或过度表达B7-H4。在一些实施方式中，这些方法包括向所述对象或患者施用有效量的所述分离的细胞、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的实施方式中，该分离的细胞包括B7-H4 CAR。在更进一步的实施方式中，所述分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞对于被治疗的所述对象或患者来说是自体同源的。在进一步的方面，所述肿瘤表达B7-H4抗原，并且所述对象已经通过诊断（例如本文所述的一种）而被选择进行治疗。
本文公开的CAR细胞可以被单独地施用，或者与稀释剂、已知的抗癌治疗剂、和/或与其他组分（例如细胞因子或免疫刺激性的其他细胞群体）一起施用。它们可以是一线、二线、三线、四线、或进一步的疗法。它们可以与其他疗法一起组合。这些的非限制性的例子包括化学疗法或生物制剂。合适的治疗方案将由治疗医师或兽医确定。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的LHR CAR的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
载体
本发明的其他方面涉及组合物，其包括载体和在本文公开的实施方式中描述的产品中的一种或多种，例如包括B7-H4 CAR的分离的细胞、分离的核酸、载体、任何抗B7-H4抗体的分离的细胞或CAR细胞、抗- B7-H4。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。
细胞或组合物的施用可以是一个剂量上有效的、贯穿整个治疗过程持续地的或间歇地有效的。确定最有效的方式和给药的剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将与用于治疗的组合物、治疗的目的以及被治疗的对象一起变化。通过由治疗的临床医生选择的剂量水平和类型，可以施行单次或多次给药。适当的剂量配方和施用试剂的方法是本领域已知的。在进一步的方面，可以与其他治疗组合施用本发明的细胞和组合物。
使用本领域已知的和例如在PCT/US2011/064191中描述的方法，将细胞和细胞的种群施用至宿主。可以实施本发明的细胞或组合物的给药，以生成期望的疾病、失调、或病症的动物模型，以用于实验和筛选测试。
下述的实施例阐明了在使本发明实施生效中用于各种例子的步骤。
实施例1- 小鼠抗人类B7-H4单克隆抗体的生成
1. B7H4-Fc融合蛋白的构建
编码人类B7-H4信号传导结构域和被融合至人类IgG1的Fc区域的细胞外结构域的表达载体被构建如下：通过来自购买于Open Biosystem (Lafayette, CO)的全长cDNA的PCR扩增，生成了编码人类的B7-H4的信号传导结构域和细胞外结构域的cDNA。所述cDNA从在信号传导序列中的起始Met延伸穿过总的蛋白序列的Gly236。使用5’和3’引物（分别为5’-TCGATC AAG CTT GCC GCC ACC ATG GCT TCC CTG GGG CAG ATC-3’ 和5’-TGT GTG AGT TTTGTC AGC CTT TGA CAG CTG-3’）执行 B7-H4的初级PCR。用5’ 引物 5’-CTA AAC TCA AAGGCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA-3’ 和 3’ 引物5’-TGA TTA ATG ATC AAT GAA TTCTCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3’，PCR扩增人类IgG1的铰链CH2-CH3部分。通过将B7-H4的5’引物和人类Fc 3’ 引物各自装配，产生了编码 huB7-H4-Fc 的基因。被使用的B7-H4-Fc的全部序列如下（加粗: B7-H4 (SEQ ID NO: 43)，未加粗：人类 Fc）：IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44)。
随后用Hind3和EcoRI 消化B7H4-Fc 融合基因，然后将其插入pN24表达载体的Hind3和EcoRI位点，生成了表达载体pN24/B7-H4-Fc。
2. B7-H4-Fc抗原的表达、纯化和表征
根据制造商的方案(Lonza Biologics, Inc.)，B7-H4-Fc融合蛋白被表达在NS0小鼠骨髓瘤细胞中，用于长期稳定表达。最高生产的克隆被按比例放大以在充气的3L搅拌瓶生物反应器中孵育，使用3％热灭活的透析胎牛血清。然后从通过序列蛋白A亲和色谱和离子交换程序滤过用过的培养基，纯化融合蛋白。通过HPLC分析和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下分析融合蛋白，并且用考马斯蓝染色来显示正确的组装和纯度。如图1A-1C所示完整的载体和分子的示意图，结合HPLC数据证明它的大小。
3. 免疫程序
用10 ug的完整的弗氏佐剂（第一和第二次免疫）或非完整弗氏佐剂（第三和第四次免疫）乳化的KLH 偶联的huB7-H4-Fc每周两周x4，将购买于哈伦（Harlan）实验室的四周龄的雌性BALB/c 小鼠免疫化。用分成三份的共25ug的抗原/佐剂皮内注射进入每一只免疫化小鼠的背上的分离点。在最后的免疫之后十天，通过在抗原包被的板上的ELISA程序获取和滴定血液样品。随后示出了最高滴度的小鼠接受了B7-H4-Fc的第五免疫扩大，不需要静脉注射佐剂或KLH偶联物，其中10ug在100ul无菌的磷酸盐缓冲生理盐水溶液中通过横向尾静脉被注射。
4. 杂交瘤生产
四天后，处死被免疫扩大的小鼠，然后摘除脾脏用于杂交瘤程序。将在含有Pen/Strep抗生素的RPMI-1640培养基的溶液中的脾脏细胞分散后，使用PEG(Hybri MAX, mol wt1450, Cat. No: p7181, Sigma)融合脾脏细胞与小鼠NSO细胞。HAT选择随后被用于使融合的细胞能够生长。然后最初通过针对抗B7-H4-Fc抗原包被的板的ELISA，其次通过在B7-H4阳性和阴性肿瘤细胞系（分别为SK-BR-3 和HT-29）上的流式细胞术，筛选来自具有正在生长的杂交瘤细胞的孔的上清液。为了消除对B7-H4-Fc的Fc区域阳性的杂交瘤，还针对IL-2-Fc包被的板筛选上清液，然后从进一步的研究中消除示出对于两种抗原阳性的这些克隆。通过有限稀释方法，选择示出阳性和高的平均荧光指数（MFI）的杂交瘤用于亚克隆。然后通过流式细胞术再次测试亚克隆，将其冰冻在液氮中并且在2L容器中扩增，然后通过tandoriProtein A或G以及离子交换色谱法纯化抗体。 然后将被纯化的抗体装瓶，并储存在-20°C直至使用。
5. 流式细胞术数据
为了确定结合最好的抗体，使用等分的纯化抗体，在B7-H4阳性（SK-BR-3）和阴性（HT-29、JAR、和T47D）细胞系上进行流式细胞术。如图2所示，与阴性抗体同型对照相比，阳性细胞系已经增加了结合特性。阳性克隆的比较显示了杂交瘤35-8 和5F6-6对表达B7-H4的SK-BR-3细胞系产生了最高的MFI（图3），并且因此被选为如下述的CAR-T细胞构建的候选者。
6. 免疫组织化学数据
使用这些单克隆抗体，筛选人类正常组织的组织微阵列(FDA808c, Biomax, Inc.)，以确定在24器官（每个器官有3个捐赠者）中的抗体结合。虽然大多数组织对于染色是阴性的，但是在消化道的上皮细胞中和在肾脏的进曲小管和远曲小管中存在不一致的细胞质染色(图4A-4B)。仅仅在乳腺导管细胞的顶部和在某些肾小管中发现了强烈、一致的膜染色（图4A-4B）。然而与在如下所示的乳腺癌组织中的染色相比，在正常乳腺组织中的染色较苍白，其中在5个不同癌症病例中的5个标注了强烈的膜和细胞质染色。
在被生成的抗人类B7-H4-Fc的抗体中，两种单克隆抗体已经通过流式细胞术显示了针对B7-H4阳性而非阴性的肿瘤细胞系产生高的结合力。为了预防针对B7-H4 CAR T细胞的人类抗小鼠反应的可能性，在患者中使用之前，可以为了它们的构建而生成人源化的抗体。
实施例2 - B7-H4 CAR T细胞的生成
1.单链抗人类B7-H4抗体基因的构建和合成
从MCLAB(South San Francisco, CA)获得所生成的35-8和5F6-6高结合力的抗B7-H4抗体的DNA序列。测试两种抗体来确定在下述的测试中哪一个生产最有效的CAR T细胞。对于这些研究，构建由下列的串联基因组成的第二或第三（图5）代CAR载体，所述串联基因：kozak共有序列、CD8信号肽、抗B7-H4重链可变区域、(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头、各自的抗B7-H4轻链可变区域、CD8铰链和跨膜结构域、CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导结构域。从Carl June的专利(参见US 20130287748 A1)确定了铰链、跨膜和信号传导结构域DNA序列。通过Genewiz, Inc. (South Plainfield, NJ) ，在含有bla 基因的pUC57载体骨架内合成抗-B7-H4 CAR基因，其对载体宿主赋予氨苄青霉素抗性。
2.CAR基因亚克隆进慢病毒质粒
用B7-H4质粒cDNA转化NovaBlue Singles™化学感受态E. coli细胞。在被转化的E.coli细胞生长之后，纯化CAR质粒并且用适当的限制性酶消化，通过过夜T4 DNA聚合酶（NewEngland Biosciences; Ipswich, MA）反应插入基于HIV-1的慢病毒载体，该载体含有HIV-1长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）。然后用生成的含有抗B7-H4的慢病毒质粒转化NovaBlueSingles™ 化学感受态E. coli细胞。
3.慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将HEK293T细胞接种在10 mL完整Tet-DMEM 中的4.0 × 106 细胞/100mm组织培养物处理的板，并且在湿润的5% CO2培养器中37oC孵育过夜。一旦80-90% 融合，用CAR基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，以及专用反应缓冲液和聚合物，共转染HEK293T，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在将被转染的HEK293T细胞培养物在37ºC孵育4小时之后，用10mL 新鲜的完全Tet DMEM替换转染培养基。然后孵育HEK293T细胞48小时，在此后收取细胞上清液，并且通过针对p24（主要的慢病毒衣壳蛋白）的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。等分含有慢病毒的上清液，并且储存在–80ºC ，直至用于靶向CD4+和CD8+细胞的转导。
4.人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、激活和富集
将通过使用Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; Little Chalfont,Buckinghamshire, UK)的梯度密度离心富集的外周血单核细胞（PBMC）回收，并且通过用含0.5%牛血清蛋白（BSA）和2 mM EDTA的PBS离心洗涤。使用MACS CD4+和 CD8+ MicroBeads(Miltenyi Biotec; San Diego, CA)试剂盒分离这些人类T细胞亚群，使用磁性地激活的LS柱来主动选择CD4+ 和 CD8+ T 细胞。然后将磁性地结合的T细胞从磁性的MACS分离器中移除，从LS柱冲洗，并且在新鲜的完全培养基中洗涤。使用Life Technologies AcousticAttune® Cytometer通过流式细胞术评估CD4+和CD8+T细胞种群的纯度，并且在有需要的情况下通过执行在USC流式细胞术核心设备的荧光激活细胞分选进行富集。在适当的细胞培养容器中的补充有100 IU/mL IL-2的完全培养基中，将CD4+和CD8+T细胞保持在1.0 ×106 细胞/mL的密度，将α-CD3/α-CD28 人类T细胞Dynabeads加入至其中以激活培养的T细胞。在湿润的5% CO2 的培养器37ºC孵育T细胞2天，然后用CAR慢病毒颗粒转导。
5.CD4+ CD8+ T 细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并且通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或MACS 死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec; San Diego, CA)的使用，移除死细胞。在6孔板中，将被激活的T细胞以1.0 × 106 细胞/ mL 完整培养基的浓度铺板。对于各个孔，以不同的感染复数(MOI)（例如1、5、10和 50），将含有B7-H4 CAR的慢病毒颗粒添加至细胞悬浮液。以4 µg/mL的最终浓度添加聚凝胺，它是一种阳离子聚合物，通过促进在慢病毒颗粒核靶细胞表面之间的相互作用而协助转导。在800 × g 32ºC对板进行离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并且将细胞团块重悬在含有100 IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。将细胞置于37ºC 5% CO2 湿润的培养器中过夜。在转导之后三天，细胞被团块化并且被重悬在有IL-2和400 µg/mL遗传霉素(G418 硫酸盐) (Life Technologies; Carlsbad, CA) 的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析评估B7-H4 CAR 修饰的T细胞 ，以证明成功的转导过程。在体外和体内试验之前，通过FACS将B7-H4 CAR T 细胞富集，并且1:1混合用于体内研究。
6.通过钙黄绿素释放细胞毒性试验进行CAR功效的体外评估
将B7-H4抗原阳性和阴性细胞系收集、洗涤并且以1.0 x 106 细胞/mL重悬在完全培养基中。以15 µM将钙黄绿素乙酰羟甲基酯(AM)添加至靶向细胞样品，然后其在37°C 5% CO2湿润的培养器中孵育30分钟。将被染色阳性和阴性的靶细胞洗涤两次并且通过离心重悬在完全培养基中，并且将其以1.0 × 104细胞/孔的浓度添加至96孔板。以50:1、5:1和1:1的效应与靶细胞的比例，将B7-H4 CAR T 细胞添加至在板中的完全培养基。被染色的靶向细胞悬浮在完全培养基和具有2% triton X-100的完全培养基中，分别地作为自发对照和最大释放对照。在365 x g、20ºC离心所述板2分钟，然后将所述板放回培养器3小时。然后将所述板离心10分钟，将细胞上清液等分至在黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别在485/20 nm和528/20 nm的激发和发射波长在Bio-Tek® Synergy™ HT酶标仪上评估荧光度。
7.通过Luminex生物测定进行的人类细胞因子的定量
使用在实验室中常规执行的标准程序，测量B7-H4 CAR修饰的T细胞和B7-H4阳性和阴性的肿瘤细胞系的上清液的细胞因子的分泌，作为CAR T细胞激活的测量。 与培养基单独比较，并且与使用未被激活的人类T细胞的培养物进行比较，以测定背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12的浓度和其他相关细胞因子的浓度。
8. 在两个异种移植的B7-H4阳性癌症模型中的CAR T细胞效力的体内评估
使用两种不同的人类肿瘤细胞系异种移植肿瘤模型，进一步体内评估B7-H4 CAR T细胞。对于两者，通过5 x 106 B7-H4阳性或阴性的实体肿瘤细胞系的注射，在6-8周龄雌性裸鼠皮下地建立实体肿瘤。当肿瘤达到0.5 cm 的直径时，用1或3 x 107人类T细胞（做为阴性对照）或基于体外研究结果从候选的B7-H4抗体构建的B7-H4 CAR T细胞处理各组小鼠（n=5）。然后通过游标卡尺3X /周测量肿瘤体积，以及然后生成了体积生长曲线，证明了相比对照的实验治疗的有效性。
一般情况下，B7-H4被表达在肿瘤上来抑制免疫反应。在正常细胞组织上，它的表达是非常有限的，使得它对于CAR T细胞成为可行的靶标。
实施例 3 – 抗-B7-H4 CAR T-细胞
CAR慢病毒构建体的构建
CAR由结合B7-H4的细胞外抗原结合部分或scFV组成。通过CD8铰链区域将scFV连接至细胞质信号传导结构域，其由CD8跨膜区域以及来自CD28、4-1BB和 CD3z的信号传导结构域（图7）组成。通过Genewiz Gene合成服务(Piscataway, NJ)综合地合成包含信号传导结构域的scFV序列。用适当的限制酶纯化和消化质粒，以通过T4 DNA聚合酶反应（New EnglandBiosciences; Ipswich, MA）过夜将其插入基于HIV-1的双顺反子慢病毒载体（pLVX-IRES-ZsGreen, Clontech, Signal Hill,CA），其含有HIV-1 5’和3’ 长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）、ZsGreen （绿色荧光蛋白）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、和猿病毒40起源（SV40）。然后用生成的含有CAR的慢病毒质粒转化NovaBlue Singles™化学感受态E. coli细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，将4.0 × 106 个HEK 293T细胞接种在150 cm2 组织培养物处理的培养瓶的20 mL 补充了10%透析的FCS的DMEM中，并且将其在37oC 5% CO2 的湿润的培养器中孵育过夜。一旦80-90%融合，在37oC 5% CO2 的湿润的培养器中在20 mL 补充了1-%透析的FCS且不含青霉素/链霉素的DMEM中孵育HEK 293T 细胞两小时。用pLVX-B7-H4-CAR质粒，以及含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒封装质粒，共转染HEK293T细胞。加入专用的反应缓冲液和聚合物，以促进结合至HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在将被转染的HEK293T细胞培养物在37ºC孵育24小时之后，用20 mL新鲜的完全DMEM替换转染培养基。然后每24小时收集慢病毒上清液，收集三天，然后在1,250 rpm 4oC离心上清液5分钟，在过滤灭菌后，在超速离心机中以20,000g 4oC离心2小时。将浓缩的慢病毒重悬在含有7% 海藻糖和1%BSA的PBS中。然后等分所述慢病毒，并且储存在–80ºC，直到用于靶向CD4+ 和 CD8+ T 细胞的转导。在24小时后收取细胞上清液，通过针对p24（主要的慢病毒衣壳蛋白）的夹心ELISA测试其中的慢病毒颗粒。通过在荧光显微镜下显示，预估由蛋白标记物ZsGreen 的表达确定的转染效力在20%-50%之间。
人类CD4+和CD8+ 外周血T细胞的纯化、激活和富集
回收通过Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; Little Chalfont,Buckinghamshire, UK)的密度梯度离心而被富集的外周血液单核细胞(PBMC) ，通过含有0.5%牛血清蛋白（BSA）和2mM EDTA的PBS进行洗涤。使用T细胞富集试剂盒(Stem CellTechnologies) 来磁性地分离这些人类T细胞亚群，使用对CD4+ 和CD8+T细胞的负性选择。通过流式细胞术（使用Life Technologies Acoustic Attune® Cytometer）评估 CD4+和CD8+ T细胞种群的纯度，并且通过荧光-激活细胞分选术进行富集。在适当的细胞培养瓶中的补充有100 IU/mL IL-2 的50%的Click完全培养基/50 % RPMI-1640培养基中，将1:1混合的 CD4+和CD8+ T细胞维持在1.0 × 106 细胞/mL 的密度，将αCD3/αCD28 人类T细胞激活小珠(Stem Cell Technologies)添加至其中来激活该被培养的T细胞。然后在37ºC 5%CO2 培养器中孵育T细胞2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+ CD8+ T细胞的慢病毒转导
收集被激活的T细胞，并且通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或MACS 死细胞移除试剂盒(Miltenyi Biotec; San Diego, CA)，移除死细胞。在6孔板中，在完全培养基中以1.0× 106 细胞/mL的密度接种被激活的T细胞。 随后用补充了Lentiblast转染助剂（OzBiosciences, San Diego, CA）的慢病毒颗粒转导该细胞。在37ºC在5% CO2湿润的培养器中将被转导的细胞孵育24小时。将该细胞旋转减慢，然后更换媒介，接着添加T细胞激活剂小珠(Stem Cell Technologies, San Diego, CA)。
细胞毒性测试
使用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试剂盒(Thermo Scientific, Carlsbad, CA)确定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并且用如上述的B7-H4 CAR 慢病毒构建体转导1 x 106 细胞。在细胞毒性分析前，使用T细胞激活剂小珠(Stem Cell Technologies,San Diego,CA)激活细胞2天。根据制造商的方案确定靶向细胞的最佳数量。对于此测试，在37oC 5% CO2的培养器中将适当的靶细胞一式三份地接种在96孔板24小时，随后以20:1、10:1、5:1 和1:1的比例添加激活的CAR T细胞，然后在37oC 5% CO2的培养器中孵育24小时。然后在37oC将细胞裂解45分钟，然后在1250 rpm离心5分钟。将上清液转移至新鲜的96孔板，接着持续30分钟添加反应混合物。使用终止溶液将反应终止，并且将该板在450nm处读数，使用在650nm的吸光度来校正读数。
体内肿瘤消退测试
Foxn1裸鼠被注射表达B7-H4的永生的乳腺癌细胞系MDA-MB-468。使用0.2 mL的接种器，将在200 ul 的磷酸盐缓冲生理水中的2 x106 肿瘤细胞注射入小鼠的左侧。用αCD3/CD28激活剂复合物（Stem Cell Technologies, San Diego, CA）将T细胞激活2天。然后用B7-H4 CAR慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，接着用αCD3/CD28激活剂复合物再激活2天。然后在肿瘤接种后的第7天将被激活的B7-H4 CAR T 细胞(2.5 x 106) 静脉注射入小鼠。使用游标卡尺每周两次评估肿瘤的大小并且计算体积。
B7-H4 CAR T细胞的细胞毒性
使用SKBR3（一种乳腺癌细胞系）测试B7-H4 CAR T细胞的细胞溶解活性。如通过FACS测试确定的，SKBR3 表达B7-H4（图8）。以效应器比靶细胞20:1、10:1、5:1 和1:1的比率，将B7-H4 CAR T细胞添加至SKBR3中。在10,000:1的比率时，B7-H4 CAR T细胞显示了增高的靶向SKBR3细胞的裂解，裂解率为25%。相比之下，在任意的被测试的比例下，未转导的T细胞都不裂解SKBR3细胞。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。
可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。
因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和例子是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。
此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。
在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。
在以下权利要求中阐述了其他方面。
B7-H4 序列
CDRH1
GXTF (SEQ ID NO: 1)
GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)
GFTFSSYG (SEQ ID NO: 3)
GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)
CDRH2
ISSXXXT (SEQ ID NO: 5)
ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)
ISSSNSTI (SEQ ID NO: 7)
INPNNGGT (SEQ ID NO: 8)
CDRH3
ARPXYY (SEQ ID NO: 9)
ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10)
ARPYYYGSSYDY (SEQ ID NO: 11)
HC1
GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTC (SEQ ID NO: 12)
EVQLEESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMKLPSLCYGLLGSRNLSHRLL (SEQ ID NO: 13 )
HC2
GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGAATTCACTGGGTTCGTCAGGTTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTTATTAGTAGTAGCAATTCTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCGAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACCCCTTTACTACTATGGTAGCGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 14)
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSYGIHWVRQVPEKGLEWVAFISSSNSTIYYADTVKGRFTISRDNAENTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARPLYYYGSVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 15)
HC3
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGATGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGTCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCTTATTACTACGGTAGTAGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 16)
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYYGSSYDYWGQGTTLTVS (SEQ ID NO: 17)
CDRL1
QSIVHXNGTY (SEQ ID NO: 18)
QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)
QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 20)
ENIGSY (SEQ ID NO: 21)
CDRL2
KVS (SEQ ID NO: 22)
AAT (SEQ ID NO: 23)
CDRL3
FQGSXVPXT (SEQ ID NO: 24)
FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)
FQGSHVPLT (SEQ ID NO: 26)
QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)
LC1
GACATTGTGATCACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGGAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACTTGCAGCAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 28)
DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQQPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSYVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 29)
LC2
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATAAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 30)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 31)
LC3
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTGGCAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACACTCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCGAGATATTACTGTCAACATTATTATAGTACTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAA (SEQ ID NO: 32)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIGSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATLLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTLVTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 33)
Ig 恒定区域
人类 IgD 恒定区域，Uniprot: P01880 SEQ ID NO: 34
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人类IgG1 恒定区域，Uniprot: P01857 SEQ ID NO: 35
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG2恒定区域，Uniprot: P01859 SEQ ID NO: 36
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG3 恒定区域，Uniprot: P01860 SEQ ID NO: 37
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人类IgM恒定区域，Uniprot: P01871 SEQ ID NO: 38
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人类 IgG4 恒定区域，Uniprot: P01861 SEQ ID NO: 39
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人类IgA1恒定区域， Uniprot: P01876 SEQ ID NO: 40
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类IgA2恒定区域，Uniprot: P01877 SEQ ID NO: 41
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类 Ig κ恒定区域, Uniprot: P01834 SEQ ID NO: 42
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
B7-H4
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKA(SEQ ID NO: 43)
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44)
CAR 组分
人类 CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO: 45：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
小鼠CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO: 46：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
猫 CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO: 47：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
人类 CD8 α 跨膜结构域，SEQ. ID NO: 48：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
小鼠 CD8 α 跨膜结构域，SEQ. ID NO: 49：
IWAPLAGICVALLLSLIITLI
大鼠CD8 α 跨膜结构域，SEQ. ID NO: 50：
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
4-1BB 共刺激信号传导区域， SEQ. ID NO: 51：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3 ζ信号传导结构域，SEQ. ID NO: 52：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Claims (65)

1.一种分离的抗体，其包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至人类B7-H4的表位，所述B7-H4包含氨基酸序列
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKA (SEQ ID NO:43)、或其等效物。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中
(a)所述HC包含CDRH3序列ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10) 或ARPYYYGSSYDY (SEQID NO: 11) 或其等效物；或
(b) 所述LC包含CDRL3序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、FQGSHVPLT (SEQ ID NO:26)、QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)或其每一个的等效物；或
(c)所述HC包含CDRH3序列ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10) 或ARPYYYGSSYDY (SEQID NO: 11)，并且其中所述LC包含CDRL3序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、FQGSHVPLT(SEQ ID NO: 26)、QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)或其每一个的等效物。
3.根据权利要求1或2的任一项所述的抗体，其中所述HC进一步包含CDRH2序列ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、ISSSNSTI (SEQ ID NO: 7)或INPNNGGT (SEQ ID NO: 8)或其每一个的等效物。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的抗体，其中所述HC进一步包含CDRH1序列GFTFSSFG(SEQ ID NO: 2)、 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 3)或GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)或其每一个的等效物。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的抗体，其中所述LC进一步包含CDRL2序列KVS (SEQID NO: 22) 或AAT (SEQ ID NO: 23)或其每一个的等效物。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的抗体，其中所述LC进一步包含CDRL1序列QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)、QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 20)或 ENIGSY (SEQ ID NO:21)或其每一个的等效物。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的抗体，其中所述HC包含
(a) HC CDRH1，其包含氨基酸序列GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)、GFTFSSYG (SEQ ID NO:3)或GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)或其每一个的等效物；和/或
(b) HC CDRH2，其包含氨基酸序列ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、ISSSNSTI (SEQ ID NO:7)、或INPNNGGT (SEQ ID NO: 8)或其每一个的等效物；和/或
(c) HC CDRH3，其包含氨基酸序列ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10) 或ARPYYYGSSYDY(SEQ ID NO: 11)或其每一个的等效物；和/或
所述LC包含
(a) LC CDR1，其包含氨基酸序列QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)、QSIVHSNGNTY (SEQID NO: 20)或ENIGSY (SEQ ID NO: 21)或其每一个的等效物；和/或
(b) LC CDR2，其包含氨基酸序列KVS (SEQ ID NO: 22) 或AAT (SEQ ID NO: 23)或其每一个的等效物；和/或
(c) LC CDR3，其包含氨基酸序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、FQGSHVPLT (SEQ IDNO: 26)、QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)或其每一个的等效物。
8.根据权利要求1-6的任一项所述的抗体，其中所述HC包含
(a) HC CDRH1，其包含氨基酸序列GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)、GFTFSSYG (SEQ ID NO:3)或 GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)或其每一个的等效物；和/或
(b) HC CDRH2，其包含氨基酸序列ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、ISSSNSTI (SEQ ID NO:7)或INPNNGGT (SEQ ID NO: 8)或其每一个的等效物；和/或
(c) HC CDRH3，其包含ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10) 或ARPYYYGSSYDY (SEQ IDNO: 11)或其每一个的等效物；和/或
所述LC包含
(a) LC CDRL1，其包含氨基酸序列QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)、 QSIVHSNGNTY(SEQ ID NO: 20)或ENIGSY (SEQ ID NO: 21)或其每一个的等效物；和/或
(b) LC CDRL2，其包含氨基酸序列KVS (SEQ ID NO: 22)或AAT (SEQ ID NO: 23)或其每一个的等效物；和/或
(c) LC CDRL3，其包含氨基酸序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、FQGSHVPLT (SEQ IDNO: 26)、QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)或其每一个的等效物。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的抗体，其中所述HC免疫球蛋白可变结构域序列包含SEQ ID NO: 13、15或17或其每一个的等效物的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的抗体，其中所述LC免疫球蛋白可变结构域序列包含SEQ ID NO: 29、31或33或其每一个的等效物的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的抗体，其中所述HC免疫球蛋白可变结构域序列包含SEQ ID NO: 13、15或17或其每一个的等效物的氨基酸序列，并且其中所述LC免疫球蛋白可变结构域序列包含SEQ ID NO: 29、31或33或其每一个的等效物的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的抗体，其中所述抗体选自：单克隆抗体、嵌合抗体或人源化的抗体。
13.权利要求1-12的任一项所述的抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和 Fv。
14.根据权利要求1至13的任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中等效物包含与该多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽、或者由在高度严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高度严格条件包含：约25°C 至约37°C 的孵育温度；约6x SSC 至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4xSSC至约8x SSC的洗涤溶液。
15.一种分离的间接体内复合物，其包含权利要求1-12的任一项所述的抗体或权利要求13所述的抗原结合片段，并且任选地包含可检测的标记。
16.一种分离的间接体内细胞，其包含权利要求15所述的复合物。
17.一种检测生物样品中的B7-H4的方法，其包含将所述样品与权利要求1-12的任一项所述的抗体或权利要求13所述的抗原结合片段接触，并且检测由所述抗体或抗原结合片段结合至B7-H4而形成的复合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含细胞样品或组织样品。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品从被诊断为患有、被怀疑患有、或有风险患有癌症的对象获得。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自实体肿瘤癌症，其任选地为乳腺癌、结肠癌、绒毛膜癌、前列腺癌或卵巢癌。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述检测包含免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种。
22.一种检测从对象分离的样品中的病理性细胞的方法，其包含
(a) 通过检测在所述样品中由权利要求1-12的任一项所述的抗体或抗原结合片段结合至B7-H4而形成的复合物，检测在来自所述对象的生物样品中的B7-H4的水平；以及
(b) 将在步骤（a）中观察到的B7-H4的水平与在对照生物样品中观察到的B7-H4的水平进行比较；
其中当B7-H4的水平与在对照生物样品中观察到的相比提高时，检测到所述病理性细胞，而当B7-H4的水平与在对照生物样品中观察到的相比未提高时，检测不到所述病理性细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述对象的生物样品包含从实体肿瘤分离的样品中的一种或多种，所述实体肿瘤任选地为乳腺癌、结肠癌、绒毛膜癌、前列腺癌或卵巢癌。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述检测包含免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA 中的一种或多种。
25.根据权利要求22-24的任一项所述的方法，其进一步包含从所述对象中分离所述生物样品。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物选自：鼠、猫、犬、羊、牛、类人猿以及人类。
28.一种B7-H4特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与权利要求1-13的任一项所述的抗体具有相同的表位特异性。
29.一种用于检测B7-H4的试剂盒，其包含权利要求1-12的任一项所述的抗体或权利要求13所述的抗原结合片段，以及使用说明。
30.一种检测肿瘤样品中的B7-H4的方法，其包含：
(a) 将所述样品与抗体或所述抗体的抗原结合片段接触，其中所述抗体包含重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列、以及轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至人类B7-H4的表位，所述B7-H4包含氨基酸序列，
其中所述HC包含
HC CDRH1，其包含氨基酸序列GFTFSSFG (SEQ ID NO: 2)、GFTFSSYG (SEQ ID NO: 3)或GYTFTDY (SEQ ID NO: 4)或其每一个的等效物；
HC CDRH2，其包含氨基酸序列ISSGSSTL (SEQ ID NO: 6)、ISSSNSTI (SEQ ID NO: 7)或INPNNGGT (SEQ ID NO: 8) 或其每一个的等效物；和
HC CDRH3，其包含氨基酸序列ARPLYYYGSVMDY (SEQ ID NO: 10) 或ARPYYYGSSYDY(SEQ ID NO: 11)或其每一个的等效物；和
所述LC包含
LC CDRL1，其包含氨基酸序列QSIVHRNGNTY (SEQ ID NO: 19)、QSIVHSNGNTY (SEQ IDNO: 20)或ENIGSY (SEQ ID NO: 21)或其每一个的等效物；和
LC CDRL2，其包含氨基酸序列KVS (SEQ ID NO: 22)或AAT (SEQ ID NO: 23)或其每一个的等效物；和
LC CDRL3，其包含氨基酸序列FQGSYVPPT (SEQ ID NO: 25)、FQGSHVPLT (SEQ ID NO:26)、QHYYSTLVT (SEQ ID NO: 27)或其每一个的等效物；
(b) 检测由所述抗体或抗原结合片段结合至B7-H4而形成的复合物。
31.一种嵌合抗原受体（CAR），其包含：（a）抗B7-H4抗体的抗原结合结构域；（b）CD8 α铰链结构域；（c）CD8 α跨膜结构域；（d）CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB 共刺激信号传导区域；和（e）CD3ζ信号传导结构域。
32.根据权利要求31所述的CAR，其包含含有抗B7-H4抗体的抗原结合结构域的抗B7-H4重链可变区域和抗B7-H4轻链可变区域。
33.根据权利要求32所述的CAR，其进一步包含位于抗B7-H4重链可变区域和抗B7-H4轻链可变区域之间的接头多肽。
34.根据权利要求32或33所述的CAR，其中所述抗B7-H4重链可变区域包含CDR区域，该CDR区域包含 SEQ ID NO: 1至11中的任一个或其等效物。
35.根据权利要求32或33所述的CAR，其中所述抗B7-H4重链可变区域包含SEQ ID NO:12至17中的任一个或其等效物。
36.根据权利要求32或33所述的CAR，其中抗B7-H4轻链可变区域CDR区域包含SEQ IDNO: 18至27中的任一个或其等效物。
37.根据权利要求32或33所述的CAR，其中所述抗B7-H4轻链可变区域CDR区域包含SEQID NO: 28至33中的任一个或其等效物。
38.根据权利要求32至37的任一项所述的CAR，其中通过甘氨酸-丝氨酸接头连接所述抗B7-H4重链可变区域和轻链可变区域。
39.根据前述权利要求的任一项所述的CAR，其进一步包含可检测的标记物或纯化标记物。
40.根据权利要求34至39的任一项所述的CAR，其中等效物包含与该多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽、或者由在高度严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高度严格条件包含：约25°C 至约37°C 的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。
41.一种分离的核酸序列，其编码权利要求31至40的任一项所述的CAR或其补体或其每一个的等效物。
42.根据权利要求41所述的分离的核酸，其进一步包含Kozak 共有序列，所述共有序列位于抗B7-H4抗体或B7-H4配体的抗原结合结构域的上游。
43.根据权利要求41或42所述的分离的核酸序列，其进一步包含抗生素抗性的多核苷酸。
44.根据权利要求41至43的任一项所述的分离的核酸，其中其等效物包含与该核酸具有至少80%的氨基酸同一性的多核苷酸、或者在高度严格条件下与该核酸的补体杂交的多核苷酸，其中高度严格条件包含：约25°C 至约37°C 的孵育温度；约6x SSC 至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。
45.一种载体，其包含权利要求41至43的任一项所述的分离的核酸序列。
46.根据权利要求45所述的载体，其中所述载体是质粒。
47.根据权利要求45所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
48.一种分离的细胞，其包含：权利要求31至40的任一项所述的CAR；和/或权利要求41至43的任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求44至47的任一项所述的载体。
49.根据权利要求48所述的分离的细胞，其中所述细胞是T细胞。
50.根据权利要求48所述的分离的细胞，其中所述细胞是NK细胞。
51.一种分离的核酸，其编码权利要求1-30的任一项所述的分离的抗体或其补体。
52.一种组合物，其包含载体和以下中的一种或多种：包含权利要求31至40的任一项所述的CAR的分离的细胞；和/或权利要求41至43或51的任一项所述的分离的核酸；和/或权利要求44至47的任一项所述的载体；和/或权利要求48至50或16的任一项所述的分离的细胞；和/或权利要求1至12的任一项所述的抗体；和/或权利要求13所述的抗原结合片段；和/或权利要求15所述的复合物。
53.一种生产表达B7-H4 CAR 的细胞的方法，其包含：
(i) 使用编码权利要求31至51的任一项所述的CAR的核酸序列，转导分离的细胞的群体；以及
(ii) 选择已经使用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的所述分离的细胞的亚群体，从而生产表达B7-H4 CAR的细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述分离的细胞选自T细胞或NK细胞。
55.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法，其包含向所述对象施用有效量的权利要求48至50的任一项所述的分离的细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述分离的细胞对于被治疗的所述对象来说是自体同源的。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤，其任选地为乳腺癌、结肠癌或绒毛膜癌。
58.根据权利要求55至57的任一项所述的方法，其中肿瘤细胞表达或过度表达B7-H4。
59.一种治疗有需要的癌症患者的方法，其包含向对象施用有效量的权利要求48至50的任一项所述的分离的细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述分离的细胞对于被治疗的所述对象来说是自体同源的。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述肿瘤是实体肿瘤，其任选地为乳腺癌、结肠癌或绒毛膜癌。
62.根据权利要求59至61的任一项所述的方法，其中癌症细胞表达或过表达B7-H4。
63.根据权利要求59至62的任一项所述的方法，其中所述对象是人类患者。
64.一种用于确定患者是可能响应还是不可能响应B7-H4 CAR疗法的方法，所述方法包括将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的抗B7-H4抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在，其中结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应所述B7-H4 CAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应所述B7-H4 CAR疗法。
65.根据权利要求64所述的方法，进一步包括向被确定可能响应所述B7-H4 CAR疗法的所述患者施用有效量的B7-H4 CAR疗法。
CN201680024423.4A 2015-03-27 2016-03-25 用于表达b7‑h4的实体肿瘤的治疗的car t‑细胞 Pending CN107531782A (zh)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019154315A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 江苏豪森药业集团有限公司 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN113156120A (zh) * 2021-03-26 2021-07-23 中国医学科学院北京协和医院 B7h4在制备子宫内膜癌分子分型试剂及系统中的应用
CN113574169A (zh) * 2019-08-01 2021-10-29 南克维斯特公司 抗b7-h4嵌合抗原受体修饰的nk-92细胞

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10814011B1 (en) 2017-06-16 2020-10-27 Nantbio, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and methods
US20220233588A1 (en) 2017-06-30 2022-07-28 Cellectis Cellular immunotherapy for repetitive administration
WO2019040780A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Five Prime Therapeutics Inc. ANTI-B7-H4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN107903326B (zh) * 2018-01-02 2020-06-30 广东省人民医院(广东省医学科学院) 包含C3aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物
AU2019228600A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibodies and methods of use thereof
KR20210096627A (ko) * 2019-03-21 2021-08-05 쑤저우 카노바 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 항-b7s1 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2021231959A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1333830A (zh) * 1998-12-17 2002-01-30 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断卵巢癌的组合物和方法
US20140294861A1 (en) * 2011-11-03 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
CN104955475A (zh) * 2012-12-19 2015-09-30 艾普利穆恩公司 抗人b7-h4抗体及其用途
CN105189552A (zh) * 2013-03-14 2015-12-23 基因泰克公司 抗b7-h4抗体和免疫缀合物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005306997B2 (en) * 2004-10-25 2012-07-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US7858752B2 (en) * 2006-12-05 2010-12-28 Abbott Laboratories Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same
AU2010254136B2 (en) * 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
WO2013130565A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 The Brigham And Women's Hosptial, Inc. Neutralizing antibody for epstein barr virus associated disease
US20150231240A1 (en) * 2012-10-09 2015-08-20 Igenica Biotherapeutics, Inc. Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
JP6288621B2 (ja) * 2013-08-23 2018-03-07 学校法人藤田学園 インフルエンザウイルスに対する抵抗力の判定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1333830A (zh) * 1998-12-17 2002-01-30 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断卵巢癌的组合物和方法
US20140294861A1 (en) * 2011-11-03 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
CN104955475A (zh) * 2012-12-19 2015-09-30 艾普利穆恩公司 抗人b7-h4抗体及其用途
CN105189552A (zh) * 2013-03-14 2015-12-23 基因泰克公司 抗b7-h4抗体和免疫缀合物

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019154315A1 (zh) * 2018-02-11 2019-08-15 江苏豪森药业集团有限公司 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US11472882B2 (en) 2018-02-11 2022-10-18 Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
TWI823895B (zh) * 2018-02-11 2023-12-01 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司 抗b7-h4抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN113574169A (zh) * 2019-08-01 2021-10-29 南克维斯特公司 抗b7-h4嵌合抗原受体修饰的nk-92细胞
CN113156120A (zh) * 2021-03-26 2021-07-23 中国医学科学院北京协和医院 B7h4在制备子宫内膜癌分子分型试剂及系统中的应用

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