CN104955475A - 抗人b7-h4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

披露了抗人B7-H4抗体“6H3”、其抗原结合片段、衍生物、以及其能够免疫特异性地结合到B7-H4的人源化变体，以及此类分子在诊断以及治疗癌症和其他疾病中的用途。在优选实施例中，这些分子被用于延迟或预防肿瘤生长、抑制肿瘤介导的压制、消除肿瘤和/或耗尽或阻滞肿瘤相关巨噬细胞(“TAM”)的活性，以便于改变其活性和/或降低TAM介导的免疫压制。

Description

抗人B7-H4抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年12月19日提交的U.S.S.N.61/739,272、于2012年12月19日提交的U.S.S.N.61/739,287以及于2012年12月19日提交的U.S.S.N.61/739,353的权益和优先权，其中的每个通过引用以其全文而结合。
序列表的引用
本申请包括一个或多个序列表(依照37 C.F.R.1.821等等)，其是以纸版和计算机可读介质两者披露的，并且将其纸版和计算机可读披露通过引用以其整体结合在此。
技术领域
本发明涉及包括鼠抗人B7-H4抗体“6H3”及其嵌合和人源化变体的抗B7-H4结合分子，及其抗原结合片段，并且涉及能够免疫特异性地结合到B7-H4的其衍生物以及此类分子在诊断以及治疗癌症和其他疾病中的用途。本发明特别涉及此类分子用以延迟或预防肿瘤生长、抑制肿瘤介导的压制、消除肿瘤和/或耗尽或阻滞肿瘤相关巨噬细胞(“TAM”)的活性以便改变其活性和/或降低TAM介导的免疫压制的用途。
背景技术
A.细胞介导的免疫应答
人及其他哺乳动物的免疫系统负责针对感染以及疾病提供保护。此类保护是通过体液免疫应答以及细胞介导的免疫应答两者提供的。该体液应答导致能够识别并中和外来靶标(抗原)的抗体以及其他生物分子的产生。相比之下，该细胞介导的免疫应答涉及通过T细胞来活化巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、以及抗原特异性的细胞毒性T-淋巴细胞，并且涉及响应于对一种抗原的识别而释放不同细胞因子(董(Dong)，C.等人(2003)“新颖的共刺激分子的免疫调节(Immune Regulation byNovel Costimulatory Molecules)”，免疫学研究(Immunolog.Res.)28(1)：39-48)。
T细胞最佳地介导针对一种抗原的免疫应答的能力需要两种不同的信号传导交互(维列塔(Viglietta)，V.等人(2007)“调节共刺激(Modulating Co-Stimulation)”，神经治疗学(Neurotherapeutics)4：666-675；科曼(Korman)，A.J.等人(2007)“癌症免疫治疗中的检查点阻滞(Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy)”，免疫学进展(Adv.Immunol.)90：297-339)。第一，已排列在抗原呈递细胞(APC)的表面上的抗原必须被呈递到一种抗原特异性原初CD4+ T细胞。这种呈递通过T细胞受体(TCR)递送一个信号，该信号指导T细胞起始一个免疫应答，该免疫应答对所呈递的抗原将是特异性的。第二，通过APC与不同的T细胞表面分子之间的相互作用介导的一系列共刺激性信号首先触发T细胞的活化以及增殖并且最终触发它们的抑制。因此，该第一信号为该免疫应答赋予了特异性，而该第二信号用以确定该应答的性质、量级以及持续时间。
免疫系统受共刺激性配体以及受体的紧密控制。这些分子针对T细胞活化提供第二信号，并且提供正信号和负信号的平衡网络以使得针对感染的免疫应答最大化同时限制对自身的免疫性(王(Wang)，L.等人(3月7日，2011)“VISTA，一种新颖的负向调节T细胞应答的小鼠Ig超家族配体(VISTA,A Novel Mouse Ig SuperfamilyLigand That Negatively Regulates T Cell Responses)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)10.1084/jem.20100619：1-16；勒佩尼斯(Lepenies)，B.等人(2008)“在寄生虫感染过程中的负向共刺激分子的作用(The Role Of Negative Costimulators During ParasiticInfections)”，内分泌、代谢&免疫紊乱-药物靶标(Endocrine,Metabolic&ImmuneDisorders-Drug Targets)8：279-288)。特别重要的是APC的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)配体与T-淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体之间的结合。(夏普(Sharpe)，A.H.等人(2002)“B7-CD28超家族(The B7-CD28 Superfamily)”，自然综述免疫学(Nature Rev.Immunol.)2：116-126；董(Dong)，C.等人(2003)“新颖的共刺激分子的免疫调节(Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules)”，免疫学研究(Immunolog.Res.)28(1)：39-48；林德利(Lindley)，P.S.等人(2009)“抑制CD28介导的共刺激的临床应用(The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-MediatedCostimulation)”，免疫学综述(Immunol.Rev.)229：307-321)。结合B7.1或B7.2与CD28的结合刺激T细胞活化；B7.1或B7.2与CTLA4的结合抑制这种活化(董(Dong)，C.等人(2003)“新颖的共刺激分子的免疫调节(Immune Regulation byNovel Costimulatory Molecules)”，免疫学研究(Immunolog.Res.)28(1)：39-48；林德利(Lindley)，P.S.等人(2009)“抑制CD28介导的共刺激的临床应用(TheClinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation)”，免疫学综述(Immunol.Rev.)229：307-321；格林沃尔德(Greenwald)，R.J.等人(2005)“B7家族再论(The B7 Family Revisited)”，免疫学年报综述(Ann.Rev.Immunol.)23：515-548)。CD28组成性地表达于T细胞的表面上(格罗斯(Gross)，J.，等人(1992)“在小鼠中的共刺激分子受体CD28的鉴定与分布(Identification And Distribution Of TheCostimulatory Receptor CD28 In The Mouse)”，免疫学杂志(J.Immunol.)149：380–388)，而在T-细胞活化之后CTLA4表达被快速上调(林斯利(Linsley)，P.等人(1996)“CTLA4细胞内运输和对TCR接合位点的焦点定位(Intracellular TraffickingOf CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement)”，免疫(Immunity)4：535–543)。由于CTLA4是更高亲和力受体(夏普(Sharpe)，A.H.等人(2002)“B7-CD28超家族(The B7-CD28 Superfamily)”，自然综述免疫学(Nature Rev.Immunol.)2：116-126)，结合首先启动T细胞增殖(通过CD28)并且然后抑制它(通过CTLA4的初期表达)，从而当不再需要增殖时削弱影响。
对CD28受体的配体的进一步研究已导致了对一组相关的B7分子(“B7超家族”)的鉴定和表征(科伊尔(Coyle)，A.J.等人(2001)“扩大的B7超家族：调节T细胞功能的共刺激信号的复杂性日益增加(The Expanding B7Superfamily:IncreasingComplexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function)”，自然免疫学(NatureImmunol.)2(3)：203-209；夏普(Sharpe)，A.H.等人(2002)“B7-CD28超家族(The B7-CD28Superfamily)”，自然综述免疫学(Nature Rev.Immunol.)2：116-126；格林沃尔德(Greenwald)，R.J.等人(2005)“B7家族再论(The B7 FamilyRevisited)”，免疫学年报综述(Ann.Rev.Immunol.)23：515-548；柯林斯(Collins)，M.等人(2005)“免疫调控配体的B7家族(The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands)”，基因组生物学(Genome Biol.)6：223.1-223.7；洛克(Loke)，P.等人(2004)“免疫调节的新兴机制：扩大的B7家族与调控T细胞(Emerging Mechanisms Of Immune Regulation:The Extended B7 Family And RegulatoryT Cells)”关节炎研究与治疗(Arthritis Res.Ther.)6：208-214；科曼(Korman)，A.J.等人(2007)“癌症免疫治疗中的检查点阻滞(Checkpoint Blockade in CancerImmunotherapy)”，免疫学进展(Adv.Immunol.)90：297-339；弗莱斯(Flies)，D.B.等人(2007)“新B7：在肿瘤免疫中发挥着关键作用(The New B7s:Playing aPivotal Role in Tumor Immunity)”，免疫疗法杂志(J.Immunother.)30(3)：251-260；阿加瓦尔(Agarwal)，A.等人(2008)“在移植与耐受中的正向共刺激分子的作用(The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance)”，器官移植的当前观点(Curr.Opin.Organ Transplant.)13：366-372；兰肖考(Lenschow)，D.J.等人(1996)“T细胞共刺激的CD28/B7系统(CD28/B7System ofT Cell Costimulation)”，免疫学年报综述(Ann.Rev.Immunol.)14：233-258；王(Wang)，S.等人(2004)“B7-CD28家族在T淋巴细胞应答中的正向和负向调节中的共-信号传导分子(Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive AndNegative Regulation Of T Lymphocyte Responses)”，微生物与感染(Microbes Infect.)6：759-766)。存在至少八个该家族成员：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可诱导的共刺激分子配体(ICOS-L；B7-H2)、程序性细胞死亡-1配体1(PD-L1；B7-H1)、程序性细胞死亡-1配体2(PD-L2；B7-DC)、B7-H3(B7-RP2)、B7-H4(也称为B7x和B7S1；西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,Negatively Regulates T CellImmunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 FamilyMember That Inhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family Member ThatNegatively Regulates T Cell Activation)”，免疫(Immunity)18：863-873)和B7-H6(勃兰特(Brandt)，C.S.等人(2009)“B7家族成员B7-H6是一种在人体中激活自然杀伤细胞受体NKp30的肿瘤细胞配体(The B7 family member B7-H6 is a tumor cellligand for the activating natural killer cell receptor NKp30 in humans)”，实验医学杂志(J Exp Med.)206(7)：1495-503)。
B7-CD28家族分子的可溶形式也牵连在类风湿病的进展中。研究已显示，可溶的PD-1在类风湿关节炎(RA)患者中可被检测到，并且可溶的PD-1的水平与滑液中的TNF-α浓度相关。可溶的B7-H4(sH4)作为一个潜在的生物标记物已在卵巢癌患者检测到，并且来自68个RA患者和24个健康志愿者的研究结果指示，可溶的B7-H4存在于65％的RA患者的血液中，与健康人中的仅13％形成对比(西蒙(Simon)，I.等人(2006)“B7-H4是针对卵巢癌的新颖的膜结合蛋白和候选血清和组织生物标记(B7-H4 Is A Novel Membrane-Bound Protein And A Candidate Serum And TissueBiomarker For Ovarian Cancer)”，癌症研究(Cancer Res.)66(3)：1570-1575，阿祖马(Azuma)，T.等人(2009)“在类风湿性关节炎的发病机理中诱饵B7-H4的潜在作用：一种依据临床资料的小鼠模型(Potential Role Of Decoy B7-H4 In ThePathogenesis Of Rheumatoid Arthritis:A Mouse Model Informed By Clinical Data)”，PLoS医学(PLoS Med.)，6(10)：e1000166)。相对于健康人(<5ng/ml)，可溶的B7-H4的水平在RA患者中显著更高(96.1ng/ml)。
鼠模型中的体内研究指示，sH4的过量表达和B7-H4的缺失两者引起炎症(阿祖马(Azuma)，T.等人(2009)“在类风湿性关节炎的发病机理中诱饵B7-H4的潜在作用：一种依据临床资料的小鼠模型(Potential Role Of Decoy B7-H4 In The PathogenesisOf Rheumatoid Arthritis:A Mouse Model Informed By Clinical Data)”，PLoS医学(PLoS Med.)6(10)：e1000166)。小鼠中的症状出现得更早并且比对照更严重，并且显示可溶的B7-H4的炎症性影响依赖于中性粒细胞。使用模拟B7-H4的正常信号传导的一种蛋白，预防了小鼠中的疾病发展。
B.B7-H4
鉴定编码人B7-H4蛋白的cDNA并且从胎盘cDNA克隆(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A MoleculeOf The B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392)。以下中讨论了B7-H4：美国专利号7,931,896；7,875,702；7,847,081；7,622,565；美国专利公开号2011/0085970；2011/0020325；2010/0256000；2010/0240585；2010/0227343；2010/0227335；2010/0158936；2010/0092524；2010/0028450；2009/0275633；2009/0215084；2009/0176317；2009/0142342；2009/0118175；2009/0087416；2009/0048122；2009/0022747；2009/0018315；2008/0206235；2008/0160036；2008/0177039；2008/0050370；2007/0218032；2007/0184473；2007/0172504；2007/0160578；2007/0122378；2007/0036783；2006/0003452；欧洲专利公开号EP2124998和EP 2109455；以及PCT专利公开WO 2011/026132A2；WO 2011/026122A2；WO 2011/005566 A2；WO 2010/144295 A1；WO 2010/102177 A1；WO2010/102167 A1；WO 2009/111315 A2；WO 2009/073533 A2；WO 2008/092153 A2；WO 2008/083239 A2；WO 2008/083228 A2；WO 2007/124361 A2；WO 2007/122369A2；WO 2007/109254 A2；WO 2007/087341 A2；WO 2007/082154 A2；WO2007/067682 A2；WO 2007/067681 A2；WO 2007/041694 A2；WO 2006/138670 A2；WO 2006/133396 A2；WO 2006/121991 A2；WO 2006/066229 A2；以及WO2006/007539 A1。
美国专利号7,888,477；7,737,255；7,619,068；6,962,980，以及美国专利公开号20080199461中披露了抗B7-H4抗体。WO/2013/025779是特别相关的。
人B7-H4蛋白具有282个氨基酸残基，其已被归类为包括一个氨基末端细胞外域，一个大的疏水跨膜域以及一个非常短的胞内域(仅由2个氨基酸残基组成)。像其他B7家族成员一样，B7-H4在其细胞外域中具有一对Ig样区域。该B7-H4蛋白具有一种类型I跨膜蛋白的整个结构。该蛋白与其他B7家族成员具有极小的(约25％)同源性(臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T CellActivation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392)。
该人B7-H4cDNA序列已被用于鉴定鼠B7-H4同系物。鼠和人直向同源物之间的一致性水平(大约87％)表明，B7-H4在演化上是高度保守的(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A MoleculeOf The B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392)。这些蛋白的IgV域的广泛同源性增加至91％，其被认为涉及在结合B7-H4受体中(斯坦珀(Stamper)，C.C.等人(2001)“抑制人免疫应答的B7-1/CTLA-4复合体的晶体结构(Crystal Structure Of The B7-1/CTLA-4 Complex That Inhibits Human ImmuneResponses)，”自然(Nature)410：608-611；施瓦兹(Schwartz)，J.C.等人(2001)“通过人CTLA-4/B7-2复合体的共刺激的结构基础(Structural Basis For Co-StimulationBy The Human CTLA-4/B7-2 Complex)，”自然(Nature)410：604-608)。
相比于其他B7成员，B7-H4 mRNA被广泛表达。已在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、睾丸、胸腺、胸腺、以及子宫中发现其表达(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,NegativelyRegulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A WidelyExpressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7Family Member That Negatively Regulates T Cell Activation)”，免疫(Immunity)18：863-873；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family Member That Negatively Regulates T CellActivation)”，免疫(Immunity)18：863-873)。
尽管B7-H4mRNA广泛表达，B7-H4蛋白在正常细胞的表面上的存在似乎被限制(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；崔(Choi)，I.H.等人(2003)“B7-H4的基因组织形式与表达分析，一种B7家族的免疫抑制分子(Genomic Organization And ExpressionAnalysis Of B7-H4,An Immune Inhibitory Molecule Of The B7 Family)”，免疫学杂志(J.Immunol.)171：4650-4654)。尽管新鲜分离的人T细胞、B细胞、单核细胞、以及树突细胞不在其细胞表面上表达B7-H4(如通过FACS分析确定的)，其表达可以在体外刺激脂多糖(LPS)、植物凝集素(PHA)、γ干扰素(IFN-γ)、佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、或离子霉素之后在此类细胞上诱导(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule OfThe B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861)。对B7-H4表达的这种广泛分布的发现指示，B7-H4的功能与其他抑制性B7分子相当不同(参见，臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T CellActivation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392)。
与B7-H4的细胞外域与其他B8家族成员具有仅约25％氨基酸同源性这个发现和观点一致，B7-H4不会结合到已知B7家族受体(即，CTLA-4、ICOS、PD-1或CD28)。鉴定一种B7-H4-特异性受体的工作已揭示，这样的受体表达于活化的T细胞上。(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,Negatively Regulates T CellImmunity)”，免疫(Immunity)18：849-861)。发现在T细胞上B7-H4融合蛋白与其假定受体的结合显著抑制T细胞增殖和细胞因子(IL-2和IL-10)的产生，并且发现CD28共刺激不可逆转这种抑制(臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member ThatInhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family Member That NegativelyRegulates T Cell Activation)”，免疫(Immunity)18：863-873)。已发现B7-H4停滞在G0/G1期的T细胞的细胞周期进展(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861)，指示该蛋白通过停滞细胞周期而不是通过诱导凋亡来介导其抑制性影响。
已发现抗B7-H4抗体体外通过脾细胞大大增加IL-2产生的水平，并且导致更强的体内免疫应答(普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family Member That Negatively Regulates TCell Activation)”，免疫(Immunity)18：863-873；臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7Family Member That Inhibits T Cell Activation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family MemberThat Negatively Regulates T Cell Activation)”，免疫(Immunity)18：863-873)。
已证实B7-H4的缺少通过直接调节中性粒细胞祖细胞的生长导致对单核细胞增生性李斯特菌感染的耐受(朱(Zhu)，G.等人(2009)“B7-H4缺陷小鼠展示增强的嗜中性粒细胞介导的先天免疫性(B7-H4 Deficient Mice Display Augmented Neutrophil-Mediated Innate Immunity)，”血液(Blood)113：1759-1769；魏(Wei)，J.等人(2011)“B7x的组织-特异性表达保护免于CD4 T细胞介导的自身免疫性(Tissue-Specific Expression Of B7x Protects From CD4 T Cell–Mediated Autoimmunity)，”实验医学杂志(J.Exper.Med.)208(8)：1683-1694)。照此，已经提出这种B7-H4在免疫中发挥作用，尤其在自身免疫以及对感染的耐受性中。因此已经提出激动剂抗B7-H4抗体以及B7-H4的可溶蛋白激动剂用于治疗炎症性失调(美国专利号7,931,896；美国专利公开号2007/0122378；2008/0160036；2009/0142342；和2011/0020325；欧洲专利公开号EP 2124998；PCT专利公开号WO 2006/133396；WO 2007/041694；WO2008/083228；WO 2009/111315；WO 2010/144295；WO 2011/005566；WO2011/026122；以及WO 2011/026132)。
此外在许多肿瘤组织(例如人卵巢癌)中发现的高水平B7-H4表达证明了B7-H4的体内显著性。(崔(Choi)，I.H.等人(2003)“B7-H4的基因组织形式与表达分析，一种B7家族的免疫抑制分子(Genomic Organization And Expression Analysis OfB7-H4,An Immune Inhibitory Molecule Of The B7 Family)”，免疫学杂志(J.Immunol.)171：4650-4654；克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“B7-H4表达识别一种在人卵巢癌中的新颖的压制性巨噬细胞群体(B7-H4 Expression Identifies A Novel SuppressiveMacrophage Population In Human Ovarian Carcinoma)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)203(4)：871-881；比格诺丁(Bignotti)，E.等人(2006)“肿瘤活组织检查以及短期原代培养卵巢浆液性癌之间的差别基因表达谱：用于早期诊断和治疗的新颖的分子生物标记物的鉴定(Differential Gene Expression Profiles Between Tumor BiopsiesAnd Short Term Primary Cultures Of Ovarian Serous Carcinomas:Identification Of NovelMolecular Biomarkers For Early Diagnosis And Therapy)”，妇科肿瘤(Gynecol.Oncol.)103：405-416；特兰格勒(Tringler)，B.等人(2006)“卵巢肿瘤中的B7-H4过表达”，妇科肿瘤(Gynecol.Oncol.)100：44-52；西蒙(Simon)，I.等人(2006)“B7-h4是针对卵巢癌的新颖的膜结合蛋白和候选血清和组织生物标记(B7-h4 Is ANovel Membrane-Bound Protein And A Candidate Serum And Tissue Biomarker For OvarianCancer)”，癌症研究(Cancer Res.)66：1570-1575；萨尔塞达(Salceda)，S.等人(2005)“免疫调节蛋白B7-H4在乳房以及卵巢癌中过表达并且促进上皮细胞转化(The Immunomodulatory Protein B7-H4 Is Overexpressed In Breast And Ovarian CancersAnd Promotes Epithelial Cell Transformation)”，实验细胞研究(Exp.cell Res.)306：128-141)，非小细胞肺癌(孙(Sun)，Y.等人(2006)“非小细胞肺癌中的B7-H3和B7-H4表达(B7-H3 And B7-H4 Expression In Non-Small-Cell Lung Cancer)”，肺癌(Lung Cancer)53：143-151)，导管癌和小叶乳腺癌(萨尔塞达(Salceda)，S.等人(2005)“免疫调节蛋白B7-H4在乳房以及卵巢癌中过表达并且促进上皮细胞转化(The Immunomodulatory Protein B7-H4 Is Overexpressed In Breast And Ovarian CancersAnd Promotes Epithelial Cell Transformation)”，实验细胞研究(Exp.cell Res.)306：128-141；特兰格勒(Tringler)，B.等人(2005)“B7-H4在导管癌和小叶乳腺癌是高表达的(B7-H4 Is Highly Expressed In Ductal And Lobular Breast Cancer)”，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)11：1842-1848)，以及肾细胞癌(卡拉姆贝克(Krambeck)，A.E.等人(2006)“肾细胞癌和肿瘤脉管系统中的B7-H4表达：癌症进展和存活之间的关联(B7-H4 Expression In Renal Cell Carcinoma And Tumor Vasculature:Associations With Cancer Progression And Survival)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))103：10391-10396)。已发现B7-H4在肿瘤细胞上的表达与不利的临床和病理特点(包括肿瘤侵入性)相关(卡拉姆贝克(Krambeck)，A.E.等人(2006)“肾细胞癌和肿瘤脉管系统中的B7-H4表达：癌症进展和存活之间的关联(B7-H4 Expression In Renal Cell Carcinoma And Tumor Vasculature:Associations WithCancer Progression And Survival)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))103(2)：10391-10396)。
C.肿瘤相关巨噬细胞(TAM)
炎症和癌症之间的关联可追溯到超过一个世纪之前提到大量白血细胞浸润到肿瘤位点中的观点(鲍克威尔(Balkwill)，F.等人(2001)“炎症和癌症：回到魏尔啸？(Inflammation And Cancer:Back To Virchow？)”，柳叶刀(Lancet)357：539-545；考森斯(Coussens)，L.M.等人(2002)“炎症和癌症(Inflammation and Cancer)”，自然(Nature)420：860-867)。现在若干研究已鉴定两个连接炎症和癌的主要通路：内在和外在通路(阿拉维纳(Allavena)，P.等人(2008)“连接炎症和癌症的通路(Pathways Connecting Inflammation and Cancer)”，遗传发育新见(Curr.Opin.Genet.Devel.)18：3-10；科洛塔(Colotta)，F.(2009)“癌症相关炎症，癌症的第七个标志：连接到遗传不稳定性”，致癌作用(Carcinogenesis)30(7)：1073-1081；波尔塔(Porta)，C.等人(2009)“连接炎症和癌症的细胞和分子通路(Cellular andMolecular Pathways Linking Inflammation and Cancer)”，免疫生物学(Immunobiology)214：761-777)。内在通路包括导致炎症和致癌作用的遗传改变，而外在通路是通过触发与癌症发育关联的组织中的慢性炎症的微生物/病毒感染或自身免疫疾病来表征的。两个通路激活炎症介质的关键转录因子(例如，NF-κB、STAT3、以及HIF-1)并且导致在炎症中发挥关键作用的白细胞的募集(索利纳斯(Solinas)，G.等人(2009)“作为癌症相关炎症的主要要参与者的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(Tumor-Associated Macrophages(TAM)As Major Players Of The Cancer-RelatedInflammation)”，白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)86(5)：1065-1073)。
TAM提供炎症和癌症之间的连接。巨噬细胞是源自于激活的血液单核细胞的免疫系统细胞。它们最初被识别为通过起作用以去除(即，吞噬)病原体、死细胞、细胞碎片、以及细胞外基质(ECM)的不同组分而参与由病原体或组织损伤诱导的炎症性应答。已发现巨噬细胞构成肿瘤微环境的一个重要成分并且代表多达50％的肿瘤质量。
除介导吞噬作用外，巨噬细胞分泌促血管生成因子和基质重塑蛋白酶，并因此在肿瘤发育和生长所需要的血管基本结构的发育(即，血管生成)中起到一个作用。(波拉德(Pollard)，J.W.(2009)“发育和疾病中的营养性巨噬细胞(TrophicMacrophages In Development And Disease)”，自然综述免疫学(Nat.Rev.Immunol.)9：259-270)。照此，巨噬细胞在肿瘤内的存在显现出有助于该肿瘤的生长。多个研究提供了证据说明肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤内的存在是存活的预后不利因子(法里尼亚(Farinha)，P.等人(2005)“多个生物标记物的分析显示淋巴瘤相关巨噬细胞(LAM)含量是滤泡淋巴瘤(FL)中对存活的独立预测因子(Analysis Of MultipleBiomarkers Shows That Lymphoma-Associated Macrophage(LAM)Content Is AnIndependent Predictor Of Survival In Follicular Lymphoma(FL))”，血液(Blood)106：2169-2174；戴夫(Dave)，S.S.等人(2004)“基于肿瘤浸润免疫细胞的分子特征预测滤泡淋巴瘤中的存活(Prediction Of Survival In Follicular Lymphoma Based On MolecularFeatures Of Tumor-Infiltrating Immune Cells)”，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)351：2159-2169；索利纳斯(Solinas)，G.等人(2009)“作为癌相关炎症的主要要参与者的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(Tumor-Associated Macrophages(TAM)As MajorPlayers Of The Cancer-Related Inflammation)”，白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)86(5)：1065-1073)。
初期肿瘤需要产生其自身脉管系统以使得能够将氧和营养递送至扩张中的肿瘤细胞。因此，肿瘤的进展需要肿瘤微环境中肿瘤细胞和非恶性细胞之间的协调的信号传导(卡拉尔(Kaler)，P.等人(2010)“肿瘤相关巨噬细胞通过在肿瘤细胞中Snail的IL-1β依赖性稳定化来保护结肠癌细胞免受TRAIL诱导的凋亡(Tumor AssociatedMacrophages Protect Colon Cancer Cells from TRAIL-Induced Apoptosis through IL-1β-Dependent Stabilization of Snail in Tumor Cells)”，公共科学图书馆·综合(PLoS One)5(7)：e117001-13)。现在确立的是，TAM连同中性粒细胞、成纤维细胞以及其他细胞与肿瘤细胞协作而有助于肿瘤中的血管生成(努切拉(Nucera)，S.等人(2011)“在发育、组织损伤以及再生中巨噬细胞与血管生成之间的相互影响(The InterplayBetween Macrophages And Angiogenesis In Development,Tissue Injury AndRegeneration)”，发育生物学国际杂志(Int.J.Dev.Biol.)doi：10.1387/ijdb.103227sn；扎马龙(Zamarron)，B.F.等人(2011)“在癌症发展和进展中免疫细胞及其因子的双重作用(Dual Roles Of Immune Cells And Their Factors In CancerDevelopment And Progression)”，国际细胞生物科学杂志(Int.J.Biol.Sci.)7(5)：651-658；刘(Liu)，J.等人(2011)“在小鼠中肿瘤相关巨噬细胞通过增强CCL20产生来募集CCR6+调控T细胞并且促进结直肠癌的发展(Tumor-Associated MacrophagesRecruit CCR6+ Regulatory T Cells And Promote The Development Of Colorectal Cancer ViaEnhancing CCL20 Production In Mice)”，公共科学图书馆·综合(PLoS One.)6(4)：e19495；里戈(Rigo)，A.等人(2010)“巨噬细胞可通过CXCL12增强的GM-CSF/HB-EGF旁分泌循环促进癌生长(Macrophages May Promote Cancer Growth Via AGM-CSF/HB-EGF Paracrine Loop That Is Enhanced By CXCL12)”，分子癌症(Molec.Cancer)9(273)：1-13；林(Lin)，J.Y.等人(2011)“声门上喉癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的临床显著性(Clinical Significance Of Tumor-Associated MacrophageInfiltration In Supraglottic Laryngeal Carcinoma)”，癌症临床杂志(Chin.J.Cancer)30(4)：280-286；沃尔加蒂(Vergati)，M.(2011)“在使用治疗性癌症疫苗中免疫压制细胞的结果和其在免疫监测中的重要性(The Consequence Of Immune SuppressiveCells In The Use Of Therapeutic Cancer Vaccines And Their Importance In ImmuneMonitoring)，”生物医学和生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)2011：182413)。
已显示B7-H4在TAM(包括存在于卵巢肿瘤中的那些)中过表达(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“B7-H4表达识别一种在人卵巢癌中的新颖的压制性巨噬细胞群体(B7-H4 Expression Identifies A Novel Suppressive Macrophage Population InHuman Ovarian Carcinoma)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)203(4)：871-881；克雷切克(Kryczek)，I.等人(2007)“在人卵巢癌中B7-H4、调控T细胞、以及患者结果之间的关系(Relationship Between B7-H4,Regulatory T Cells,And Patient Outcome InHuman Ovarian Carcinoma)”，癌症研究(Cancer Res.)67(18)：8900-8905)。
尽管在炎症和癌症的治疗中有所有的在先进展，对能够针对癌症治疗提供增强的免疫治疗的经改进的组合物仍存在需要。因此，提供了组合物及其用于治疗癌症和其他疾病以及病况的用途。
本发明的一个目的是提供用于治疗癌症、或细菌或病毒感染的诱导表面B7-H4内化以压制B7-H4介导的免疫逃避的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供B7-H4mAb-有效负载的药物-轭合物以靶向B7-H4阳性肿瘤而用于治疗癌症的组合物以及方法。
发明内容
披露了鼠抗人B7-H4抗体“6H3”，及其嵌合和人源化变体的抗B7-H4结合分子，及其抗原结合片段，并且涉及能够免疫特异性地结合到B7-H4的其衍生物以及此类分子在诊断以及治疗癌症和其他疾病中的用途。此类分子用以延迟或预防肿瘤生长、抑制肿瘤介导的压制、消除肿瘤和/或耗尽或阻滞B7-H4-表达细胞(包括但不限于肿瘤相关巨噬细胞(“TAM”))的活性的用途。也披露了降低或阻滞B7-H4的活性可改变TAM活性和/或降低TAM介导的免疫压制。
例如，提供了如下分子，包括抗人B7-H4抗体6H3的一个抗原结合片段，其免疫特异性地结合到人B7-H4。在一些实施例中，该B7-H4结合分子能够结合到排列于一个活细胞的表面上的B7-H4和/或该B7-H4结合分子能够结合到可溶的B7-H4或结合到以内源浓度表达的B7-H4。在一个具体实施例中，该B7-H4结合分子能够基本上阻滞可溶的B7-H4或膜结合的B7-H4的活性。
披露了包括抗体6H3的抗原结合片段的分子，其中这些分子免疫特异性地结合到人B7-H4。例如，提供了可免疫特异性地结合到人B7-H4的分子，该人B7-H4：
(I)排列于一个细胞(尤其是一个活细胞)的表面；
(II)以内源浓度排列于一个细胞(尤其是一个活细胞)的表面；
(III)排列于一个活细胞的表面，并且调节B7-H4与其细胞受体之间的结合；
(IV)排列于一个活细胞的表面，并且抑制肿瘤相关巨噬细胞的免疫压制；
(V)排列于一个活细胞的表面，并且调节一个肿瘤相关巨噬细胞的活性；
(VI)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且抑制肿瘤介导的压制；
(VII)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且引起肿瘤特异性的细胞溶解
或其任意组合。
也提供了鼠抗人B7-H4抗体“6H3”的人源化变体及其抗原结合片段以及其能够免疫特异性地结合到B7-H4的衍生物，以及此类分子在诊断以及治疗癌症和其他疾病中的用途。也披露了此类分子用于延迟或预防肿瘤生长、抑制肿瘤介导的压制、消除肿瘤和/或耗尽或阻滞肿瘤相关巨噬细胞(“TAM”)的活性以便于改变其活性和/或降低TAM介导的免疫压制的用途。
例如，提供了包括抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个抗原结合片段的分子，这些分子免疫特异性地结合到人B7-H4，其中该抗原结合片段包括：
(1)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个轻链可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO：18-23中任一个的氨基酸序列；以及
(2)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个重链可变区，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：24-29中任一个的氨基酸序列。
在一个具体实施例中，该人B7-H4结合分子能够结合到排列于一个活细胞的表面上的B7-H4和/或该B7-H4结合分子能够结合到可溶的B7-H4或结合到以内源浓度表达的B7-H4，并且特别地该B7-H4结合分子能够基本上阻滞可溶的B7-H4或膜结合B7-H4的活性。
因此提供了包括抗体6H3的一种人源化变体的一个抗原结合片段的分子，其中这些分子免疫特异性地结合到人B7-H4。例如，提供了可免疫特异性地结合到人B7-H4的分子：
(I)排列于一个细胞(尤其是一个活细胞)的表面；
(II)以内源浓度排列于一个细胞(尤其是一个活细胞)的表面；
(III)排列于一个活细胞的表面，并且调节B7-H4与其细胞受体之间的结合；
(IV)排列于一个活细胞的表面，并且抑制肿瘤相关巨噬细胞的免疫压制；
(V)排列于一个活细胞的表面，并且调节一个肿瘤相关巨噬细胞的活性；
(VI)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且抑制肿瘤介导的压制；
(VII)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且引起肿瘤特异性的细胞溶解或其任意组合。
也披露了此类分子的实施例，其中此类分子是可检测地标记的或包括轭合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。在一些实施例中，所披露的分子能够被内化至该细胞中，并且介导该细胞的死亡。
该活细胞可以是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或巨噬细胞。
该分子可以是单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其抗原结合片段。
该分子可以是IgG1或IgG4抗体。该分子可以具有ADCC活性，可具有直接的肿瘤杀伤活性，可具有ADC活性，和/或可抑制TAM介导的和/或肿瘤介导的压制。
该分子可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的抗体，例如，该抗体能够结合B7-H4和在相同细胞上的一个不同分子。
披露了包括所披露的B7-H4结合分子的药物组合物，及其用于治疗癌症或感染性疾病的用途。这些药物组合物可包括治疗有效量或预防有效量的一个或多个B7-H4结合分子，以及一种生理学上可接受的载体或赋形剂，其中该分子拮抗B7-H4介导的压制以上调免疫应答。
这些药物组合物可被用于在展现癌症或感染性疾病的症状的受试者中治疗该癌症或感染性疾病(尤其是慢性病毒感染)或用于在受试者展现该症状之前预防癌症或感染性疾病。因此，也提供了预防用途。
也披露了用于治疗炎症的药物组合物，包括治疗有效量或预防有效量的一个或多个B7-H4结合分子，以及一种生理学上可接受的载体或赋形剂，其中该分子增强B7-H4介导的压制以下调免疫应答。
该药物组合物可被用于治疗炎症(尤其是自身免疫疾病、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、或移植排斥反应，并且该用途是治疗自身免疫疾病、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、或移植排斥反应)。
所披露的分子可用在用于诊断受试者中一种疾病(尤其是癌症或影响T细胞数目或健康的一种疾病)的存在的细胞学测定中。在一个具体实施例中，该细胞学测定包括针对结合至该分子的能力测定该受试者的细胞。
所披露的分子可以用于确定受试者对于用抗癌剂治疗肿瘤的适合性。该用途可包括在该肿瘤中确定肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度和/或肿瘤细胞上B7-H4表达的水平。在一个具体实施例中，该抗癌剂或用该抗癌剂进行的治疗的剂量是基于所确定的这些肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度来设置或调整的。
治疗有效量的所披露的药物组合物可用于治疗患者中的癌症。在一些实施例中，该患者被鉴定为在肿瘤细胞上展现高水平的B7-H4表达和/或升高的有效浓度的表达B7-H4的肿瘤相关巨噬细胞。
治疗有效量的所披露的药物组合物也可用于在受试者中刺激、增强、或增加免疫刺激应答，以减少、延迟、或预防免疫抑制性应答，或其组合。在一些实施例中，该受试者患有或很可能发展癌症或一种肿瘤，或患有或很可能发展一种感染。在一些实施例中，该药物组合物有效于刺激、增强或增加针对癌细胞或被感染细胞的免疫刺激应答。
在一些实施例中，此外对一种肿瘤或癌症的治疗包括化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法或外科手术。
在一些实施例中，所披露的B7-H4结合分子中的一种或多种接触肿瘤细胞、病原体感染的细胞或巨噬细胞。
在具体实施例中，该B7-H4结合分子调节B7-H4和其细胞受体之间的结合。
附图说明
图1A-1B是显示鼠抗体6H3的轻链(图1A)和重链(图1B)的可变域的珍珠串型(Collier Perles)2D表示的图表。这些链的三个CDR环显示于这些图表的顶部。
图2A-2B是显示如通过胸腺嘧啶核苷掺入(图2A)以及IL-17表达(图2B)测量的抗体6H3阻滞B7-H4 Ig介导的对T细胞活化的压制的能力作为抗体浓度(μg/ml)的函数的线图。
图3A-3D是来自卵巢癌患者(图3A：CD4，同种型对照；图3B：CD8，同种型对照；图3C：CD4，抗B7-H4抗体6H3；图3D：CD8，抗B7-H4抗体6H3)的散点图，显示了在存在TAM的情况下，抗体6H3能够增强卵巢癌患者的T细胞应答(产生IL-17或INFγ的功能性CD4以及CD8细胞)。
图4A-4I是散点图，显示卵巢癌患者肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对B7-H4(图4H)以及其他抗原(CD11b(图4A)、CD14(图4B)、CD123(图4C)、CD86(图4D)、CD80(图4E)、HLA-DR(图4F)、B7-H1(图4G)、以及B7-DC(图4I))的表达，以及抗体6H3检测由此类细胞表达B7-H4的能力。
图5是显示了作为抗体浓度(nM)的函数，抗体6H3结合到B7-H4的结合动力学的结合曲线。
图6是显示了相对于其他抗B7-H4抗体，作为抗体浓度(log[mAb]，ng/ml)的函数，人H7-H4结合抗体6H3(即，抗体H74、2D1、2H9、2E11以及8E11)的动力学的结合曲线。
图7是显示了抗体6H3结合到B7-H4(变体1：SEQ ID NO：1的IgV残基29-149；变体2：SEQ ID NO：1的IgV残基29-154；变体3：SEQ ID NO：1的IgV残基29-158；变体4：ECD-hIgG4；变体5：SEQ ID NO：1的IgC残基154-259；变体6：ECD-hIgG1-SEQ ID NO：7)的IgC区的能力作为抗体浓度(nM)的函数的结合曲线。
图8A-8C是由抗人B7-H4抗体2H9(图8A)、2D1(图8B)和H74(图8C)(变体1：SEQ ID NO：1的IgV残基29-149；变体2：SEQ ID NO：1的IgV残基29-154；变体3：SEQ ID NO：1的IgV残基29-158；变体4：ECD-hIgG4；变体5：SEQ ID NO：1的IgC残基154-259；变体6：ECD-hIgG1-SEQ ID NO：7)识别的B7-H4的区域作为抗体浓度(nM)的函数的结合曲线。
图9是比较了抗人B7-H4抗体6H3、2H9以及2D1用以阻滞B7-H4 Ig介导的对T细胞活化(通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入(ΔCPM)测量的增殖)的压制的能力作为抗体浓度(μg/ml)的函数的线图。
图10A-10F是显示了抗体(无单核细胞对照，帕利珠单抗，2H9，2D1，6H3，抗B7-H1，抗PD1)逆转IFNγ引发的单核细胞介导的压制的能力的条形图。针对IL-2(CD4+ T细胞，图10A；CD8+ T细胞，图10B)、TNF-α(CD4+ T细胞，图10C；CD8+ T细胞，图10D)或IL-8(CD4+ T细胞，图10E；CD8+ T细胞，图10F)将T细胞染色。
图11A-11B揭示抗体6H3诱导了表达于B7-H4转染的细胞系和B7-H4阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3两者的表面上的B7-H4的稳固内化。图11A是一系列的直方图，显示了用CypHer标记的抗体6H3孵育0、1以及3小时之后293T B7-H4转染子的CypHer5B荧光的流式细胞术测量的结果。图11B是显示了随着时间的推移的B7-H4表面染色以及CyperHer荧光的线图。
图12A-12B是直方图，显示了相对于在用CypHer标记的6H3孵育的过程中B7-H4阳性人乳腺癌细胞系SK-BR3细胞上的对照，随着时间的推移的B7-H4表面染色以及CypHer荧光。
图13A-13C是显示了抗体6H3检测组织学样品的B7-H4阳性肿瘤细胞的能力的显微照片。图13A和13B是6H3染色的唾液腺组织的图像；图13C显示卵巢的两个不同但相关的浆液性囊性损伤。
图14是显示了在4℃处理30min之后嵌合的2E11(-●-)、嵌合的2H9(-■-)、嵌合的2D1(-▲-)、以及嵌合的6H3(-▼-)在EG7(B7-H4阴性细胞)、EG7.IG7(B7-H4低表达细胞)以及EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)中的内化的线图。
图15是显示了在4℃处理30min之后嵌合的6H3(-●-)、人源化变体2(-▲-)、人源化变体6(-▲-)、人源化变体7(-▲-)、人源化变体9(-▲-)、人源化变体12(-▲-)、以及人源化变体14(-▲-)在EG7(B7-H4阴性细胞)、EG7.IG7(B7-H4低表达细胞)以及EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)中的内化的线图。
图16是显示了在有利于内化的条件下抗B7-H4抗体的内化作为B7-H4的细胞表面表达的函数的线图。
图17是显示了在不利于内化的条件下抗B7-H4抗体的内化作为B7-H4的细胞表面表达的函数的线图。
图18A以及18B是显示了以下抗B7-H4抗体在E.G7ova/hB7-H4细胞(图18A)和CT26/hB7-H4细胞(图18B)中的内化的条形图(沿x-轴从左向右)：人嵌合的6H3、人源化6H3V2、人源化6H3V6、人源化6H3V7、人源化6H3V9、人源化6H3V12、人源化6H3V14、6H3.m1(小鼠IgG1)、6H3.m2a(小鼠IgG2a)、阴性对照(抗PD-1抗体)、以及无处理。
图19A-19C是线图，显示了在被设计为测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的一个测定中，以三个不同效应细胞:靶细胞比率：500,000:25,000(图19A)、500,000:10,000(图19B)、以及500,000:5,000(图19C)，针对四个不同的健康外周血单核细胞(PBMC)供体(117、119、121、122)而言由效应细胞对EG7.B7H4靶细胞的特异性溶解％作为嵌合的6H3抗体浓度(log(ng/ml)的函数。
图20是条形图，显示了在被设计为测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(抗体浓度10ng/ml；1:20的靶细胞:效应细胞比率)的一个测定中，针对6H3的14种不同的人源化变体，由来自三个不同供体外周血单核细胞(PBMC)(114、121、122)的效应细胞对EG7.B7H4靶细胞的特异性溶解％。
图21A-21D是条形图，显示了在被设计为测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的一个测定中，渐增浓度的变体11或变体14人源化6H3抗体(log[ng/mL抗体]与来自四个不同供体：供体118(图21A)、供体117(图21B)、供体121(图21C)、或供体122(图21D)的作为效应细胞的外周血单核细胞(PBMC)的组合，对靶细胞的特异性溶解％。
图22A-22B是条形图，显示了在被设计为测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的一个测定中，在对照IgG1或六个不同浓度的嵌合的6H3抗体(2000ng/ml、500ng/ml、125ng/ml、31.3ng/ml、7.81ng/ml、1.95ng/ml)中的一个存在的情况下，在三个不同的效应细胞:靶细胞比率下(20:1、50:1、100:1)，由117(图22A)或120(图22B)供体细胞对SK-BR-3细胞的总溶解％。
图23A-23B是条形图，显示了在被设计为测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的一个测定中，在对照IgG1或六个不同浓度的嵌合的6H3抗体(2000ng/ml、500ng/ml、125ng/ml、31.3ng/ml、7.81ng/ml、1.95ng/ml)中的一个存在的情况下，在三个不同的效应细胞:靶细胞比率下(20:1、50:1、100:1)，由117(图23A)或120(图23B)供体细胞对SK-BR-3细胞的特异性溶解％。
图24A-24B是显示了利用对照、嵌合的6H3抗体以及赫赛汀(HERCEPTIN)抗体的补体依赖性细胞毒作用测定的结果的条形图。图24A显示针对不同抗体和抗体浓度以对照、1:2补体、以及1:5补体稀释的RFU(相对荧光单位-空白校正的)。针对每个补体稀释，从左向右，这些条的集群代表：配制品缓冲液，50μg/ml IgG1(阴性对照)，5μg/ml IgG1(阴性对照)，0.5μg/ml IgG1(阴性对照)，50μg/ml嵌合的6H3，5μg/ml嵌合的6H3，0.5μg/ml嵌合的6H3，50μg/ml5μg/ml 0.5μg/ml图24B显示针对不同抗体以及抗体浓度以对照、1:2补体、以及1:5补体稀释的特异性溶解。针对每个补体稀释，从左向右，这些条的集群代表：50μg/ml嵌合的6H3，5μg/ml嵌合的6H3，0.5μg/ml嵌合的6H3，50μg/ml 5μg/ml0.5μg/ml
图25是显示在CTL介导的溶解测定中，在不同的效应细胞:靶细胞比率下，Ag+靶细胞(在不存在CTL的情况下平均的％)的存活的条形图。
图26是条形图，显示在CTL介导的溶解测定中，在存在对照IgG或嵌合的6H3抗体的情况下，在不同效应细胞：靶细胞比率下，对EG7.B7H4+OVA靶细胞的特异性溶解％。针对每个效应细胞:靶细胞比率，从左向右，这些条的集群代表：1μg/ml对照IgG，10μg/ml对照IgG，1μg/ml嵌合的6H3，以及10μg/ml嵌合的6H3。
图27A是线图，显示在第一个实验中，利用路易斯肺癌(LCC)肿瘤小鼠模型，随着时间的推移(肿瘤接种后天数)的肿瘤体积(mm3)，其中用配制品缓冲液对照(-◆-)、6H3.m1(-■-)、或6H3.m2a(-▲-)处理荷瘤小鼠。图27B是卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线，显示在路易斯肺癌(LCC)肿瘤小鼠模型中小鼠随着时间的推移(肿瘤接种后天数)的存活％，其中用配制品缓冲液对照(-●-)、6H3.m1(-■-)、或6H3.m2a(-▲-)处理小鼠。
图28A是线图，显示在第二个实验中，利用路易斯肺癌(LCC)肿瘤小鼠模型，随着时间的推移(肿瘤接种后天数)的肿瘤体积(mm3)，其中用配制品缓冲液对照(-◆-)、6H3.m1(-■-)、或6H3.m2a(-▲-)处理荷瘤小鼠。图28B是卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线，显示在路易斯肺癌(LCC)肿瘤小鼠模型中小鼠随着时间的推移(肿瘤接种后天数)的存活％，其中用配制品缓冲液对照(-●-)、6H3.m1(-■-)、或6H3.m2a(-▲-)处理小鼠。
图29A是点图，显示在CT26.B7H4肺癌模型中，在不存在处理的情况下，在肿瘤细胞的静脉内接种后，随着时间的推移(天)，肿瘤的生长动力学(肿瘤数目)。图29B是点图，显示在CT26.B7H4肺癌模型中，在肿瘤细胞的静脉内接种并且用配制品缓冲液(FB)、在第10天开始10mg/kg 6H3.m2a(10mg/kg-10)；在第10天开始1mg/kg 6H3.m2a(1mg/kg-10)；在第14天开始10mg/kg 6H3.m2a(10mg/kg-14)；或在第14天开始1mg/kg 6H3.m2a(1mg/kg-14)的处理之后，随着时间的推移(天)的肿瘤数目。
图30是点图，显示在四个每周一次的剂量的配制品缓冲液或100mg/kg的6H3.m1或6H3.m2之后，在第24天小鼠的血糖(mg/dl)。
图31是点图，显示在第四个每周一次的剂量的100mg/kg的6H3.m1或6H3.m2之后，针对6H3.m1或6H3.m2的峰(Cmax)以及波谷(Cmin)，小鼠(mg/ml)的血清中的抗体水平。
图32A-32B是显示针对6H3.m1(32A)或6H3.m2(32B)，相对荧光单位(RFU)作为血清抗体浓度(log[抗体]，pg/ml)的函数的线图。
图33是一个结合曲线，显示了测量人嵌合的6H3和十四种人源化变体与B7-H4的细胞外域的结合的ELISA测定(OD450作为抗体浓度(Log10(nM)的函数)的结果。
图34A-34B是结合曲线，显示了测量嵌合的6H3和人源化变体V1-V7(图34A)以及V8-V14(图34B)与B7-H4-Ig的结合的竞争ELISA测定(在450nm的吸光度作为抗体浓度((ng/ml)log)的函数)的未加工结果。
图35A-35B是结合曲线，显示了测量嵌合的6H3，人源化变体V2、V6、V7、V9、V12、V14，以及一种阴性对照抗PD-1抗体(仅图34A)与表达B7-H4的细胞的结合的竞争ELISA测定(在450nm的吸光度作为抗体浓度((ng/ml)log)的函数)的未加工的(图35A)以及减去背景的(图35B)结果。
图36是显示6H3的人源化变体与表达B7-H4的HEK293转染子的结合的抗体结合的结合曲线(平均荧光强度(MFI)作为抗体浓度(nM)的函数)。
图37是显示测量抗体嵌合的6H3和6H3的人源化变体与小鼠B7-H4-mIg融合蛋白的结合的ELISA测定的结果的结合曲线(OD450作为抗体浓度(log10(nM)的函数)。
图38A-38D是线图，显示了针对用B7-H4-Ig融合蛋白与不同浓度(0，1.11μ/g/ml，3.33μ/g/ml，或10μ/g/ml)的嵌合6H3(“亲本”)或6H3的一种人源化变体组合处理的细胞，IL-17(图38A)、IFNγ(图38B)的分泌、增殖([3H]-胸腺嘧啶核苷掺入)(图38C)、以及IL-10的分泌(图38D)。*采用对照Ig。
具体实施方式
在许多肿瘤组织例如人卵巢癌中发现的高水平的B7-H4表达指出了B7-H4在介导免疫压制中的关键作用。另外，已发现表达B7-H4的TAM压制肿瘤相关抗原特异性的T细胞免疫(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“B7-H4表达识别一种在人卵巢癌中的新颖的压制性巨噬细胞群体(B7-H4 Expression Identifies A Novel SuppressiveMacrophage Population In Human Ovarian Carcinoma)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)203(4)：871-881)。在TAM中B7-H4表达的强度与肿瘤中的Treg细胞数目显著相关。此外，表达于TAM上的B7-H4与差的患者结果相关联(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“B7-H4表达识别一种在人卵巢癌中的新颖的压制性巨噬细胞群体(B7-H4 Expression Identifies A Novel Suppressive Macrophage Population In Human OvarianCarcinoma)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)203(4)：871-881)。之前公开的数据也显示，TAM自发地产生趋化因子CCL22，该趋化因子CCL22介导Treg细胞至肿瘤中的运输以及Treg细胞诱导的B7-H4在抗原呈递细胞(APC)(包括TAM它们本身)上的表达(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“先锋：在APC上通过IL-10诱导B7-H4：针对调控T细胞的新颖的压制模式(Cutting Edge:Induction Of B7-H4 OnAPCs Through IL-10:Novel Suppressive Mode For Regulatory T Cells)”，免疫杂志(J.Immunol.)177(1)：40-44)。一起考虑，此类发现指示，肿瘤细胞以及表达B7-H4的TAM在允许肿瘤避避免被免疫系统检测到(“免疫逃避”)的免疫压制的肿瘤微环境中发挥非常重要的作用。通过阻滞B7-H4、调节其表面表达、调节B7-H4介导的信号转导、或耗尽TAM，能够免疫特异性地结合到B7-H4或预防与其天然受体相互作用的所披露的分子提供了作为对癌症的有效免疫治疗的一个策略。
提供了能够免疫特异性地结合到B7-H4的分子，连同此类分子在诊断以及治疗癌症和其他疾病中的用途。也提供了此类分子用于延迟或预防肿瘤生长、抑制肿瘤介导的压制、消除肿瘤和/或耗尽或阻滞肿瘤相关巨噬细胞(“TAM”)的活性以便于改变其活性和/或降低TAM介导的免疫压制的用途。
具体而言，此类分子以及具体地是hIgG1或hIgG4抗体的此类分子，可以用于靶向于表达B7-H4的细胞、肿瘤或TAM并且针对不同功能性活性进行筛选，这些功能性活性包括调节B7-H4和其一个或多个受体之间的相互作用、调节B7-H4水平以及衰减负向信号传导和/或耗尽B7-H4阳性细胞。使用重组DNA技术，此类分子可被工程化以包括恒定区，以形成具有少许或无Fc受体(FcR)结合活性、增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的Fc域。此类重组分子可用作调节分子以降低或防止肿瘤或TAM上B7-H4与肿瘤微环境中T细胞或其他细胞上的一个或多个抑制性受体的相互作用，从而从B7-H4检查点(“断裂”)/压制性信号传导释放T细胞或其他功能性细胞。相比之下，此类分子可被工程化为包括恒定区，以形成功能性Fc域，并且因此可诱导ADCC或CDC，引起这些表达B7-H4的肿瘤细胞或TAM的耗尽，这除了具有其他活性诸如来自压制性细胞的表面的B7-H4调节、或直接杀伤B7-H4表达细胞外，还潜在地从检查点阻滞释放T细胞或其他功能性细胞。具有ADCC活性的抗B7-H4抗体对于同时耗尽表达B7-H4的肿瘤细胞和抑制TAM介导的免疫压制可以是特别有用的。
在一个特定方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区在选自下组的一个或多个位置包括至少一个修饰(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，该组由以下各项组成：通过EU索引以数字编号的228，234，235以及331，如在卡巴特(Kabat)等人(1991，NIH出版91-3242，国家技术信息服务(National TechnicalInformation Service)，斯普林菲尔德(Springfield)，弗吉尼亚州(Va.)中所述)。
在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下各项组成：228P、234F、235E、235F、235Y、以及331S，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。
在另一个特定方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区是一个IgG4 Fc区，并且在选自下组的一个或多个位置包括至少一个修饰，该组由以下各项组成：228以及235，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在再另一个特定方面，该Fc区是一个IgG4 Fc区，并且这些非天然存在的氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：228P、235E以及235Y，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。
在另一个特定方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区在选自下组的一个或多个位置包括至少一个非天然存在的氨基酸，该组由以下各项组成：239、330以及332，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下各项组成：239D、330L、330Y、以及332E，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。参见美国专利号7,317,091，通过引用以其全文结合在此。
在一个特定方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区在选自下组的一个或多个位置包括至少一个非天然存在的氨基酸，该组由以下各项组成：252、254、以及256，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下各项组成：252Y、254T以及256E，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。参见美国专利号7,083,784，通过引用以其全文结合在此。
在某些方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区在位置428包括一个非天然存在的氨基酸，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在一个方面，在位置428的修饰是选自下组，该组由以下各项组成：428T、428L、428F、以及428S，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。参见美国专利号7,670,600，通过引用以其全文结合在此。在另一个方面，一种Fc变体可进一步在位置434包括一个非天然存在的氨基酸，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在一个方面，在位置434的修饰是选自下组，该组由以下各项组成：434A、434S、以及434F，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在其他方面，本披露提供了一种Fc变体，其中该Fc区在位置428以及434包括一个非天然存在的氨基酸，如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的。在一个特定方面，该Fc区包括428L、434S。参见美国专利号8,088,376。
人B7-H4的氨基酸序列是(SEQ ID NO：1)：
MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGKHSITVT TVASAGNIGEDGILSCTFEP DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGRTAVFADQVIV GNASLRLKNV QLTDAGTYKC YI ITSKGKGN ANLEYKTGAFSMPEVNVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTVV WASQVDQGAN FSEVSNTSFELNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV TESEIKRRSHLQLLNSKASL CVSSFFAISW ALLPLSPYLM LK
鼠B7-H4的氨基酸序列是(SEQ ID NO：2)：
MASLGQIIFW SIINIIIILA GAIALI IGFG ISGKHFITVT TFTSAGNIGE
DGTLSCTFEP DIKLNGIVIQ WLKEGIKGLV HEFKEGKDDL SQQHEMFRGR
TAVFADQVVV GNASLRLKNV QLTDAGTYTC YIRTSKGKGN ANLEYKTGAF
SMPEINVDYN ASSESLRCEA PRWFPQPTVA WASQVDQGAN FSEVSNTSFE
LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV TDSEVKRRSQ
LQLLNSGPSP CVFSSAFVAG WALLSLSCCL MLR
如此处使用的，如果这种结合展现一种抗体结合至其同源抗原的特异性以及亲和力的话，则称一个分子能够“免疫特异性地结合”一个第二分子。如果这种结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点的话，则称抗体能够“免疫特异性地结合”至抗原(并且特别是抗原B7-H4)的一个靶区域或构造(“表位”)。免疫特异性地结合到一种具体的抗原的一种抗体可以按更低的亲和力结合到其他抗原，前提是如果该其他抗原具有由如通过例如免疫测定、测定、或本领域中已知的其他测定确定的抗原识别位点所识别的一些序列或构造相似性的话，但不会结合至完全不相关的抗原。然而，优选地，抗体(及其抗原结合片段)将不与其他抗原发生交叉反应。抗体也可以按非免疫特异性的方式结合到其他分子，诸如结合到FcR受体，凭借该分子的不涉及该抗原识别位点的其他区域/域中的结合域，诸如Fc区。如果此类结合展现一个受体与其同源结合配体的特异性以及亲和力的话，则称一个分子“物理特异性地结合”一个第二分子。如果此类结合涉及B7-H4受体识别位点的话，则称B7-H4分子(例如，B7-H4蛋白或融合分子等)能够“物理特异性地结合”至一个受体或B7-H4的一个靶区域或构造(“表位”)。一个分子可以能够物理特异性地结合到多于一个的其他分子。
所披露的分子可具有“耗尽”(即，部分地或完全地降低)存在于肿瘤内的B7-H4表达细胞(包括但不限于TAM)的浓度或阻滞B7-H4表达细胞的活性的能力。此类耗尽可涉及绝对数目的存在于肿瘤内(或募集至肿瘤)的巨噬细胞，或它可涉及有活性的巨噬细胞的浓度(即，具有介导促血管生成或促肿瘤发生影响的能力的在肿瘤内或募集至肿瘤的巨噬细胞的浓度)。优选地，此类耗尽将提供可测量的免疫系统活性(例如，巨噬细胞计数，血管生成潜力，血管形成，巨噬细胞活力等)的至少10％的改变，更优选地这种活性方面至少50％的改变，或这种活性方面至少2倍、5倍、10倍、或仍更优选地至少100倍的改变。
如此处使用的术语“调节”涉及改变效果或结果的能力。例如，提供了如下多肽，这些多肽包括鼠抗人B7-H4抗体6H3，或其一种嵌合或人源化变体，或免疫特异性地结合人B7-H4的其抗原结合片段中的任一个或物理特异性地结合B7-H4或其同源受体的分子)，其能够调节B7-H4和其同源受体之间的结合和/或调节作为B7-H4同源受体结合的结果而发生的信号转导。此类调节可以是部分的(即，衰减但不消除B7-H4的活性)或它可完全消除此类活性(例如，中和B7-H4介导信号转导的能力)。调节可包括在该抗体结合或靶细胞上的受体表达减少之后该受体的内化。在一个另外的实施例中，这种调节可增强或以另外方式激动B7-H4及其同源受体之间的相互作用，有助于B7-H4同源受体结合或信号转导。在仍另一个实施例中，这种调节可改变B7-H4及其同源受体之间的相互作用的性质，以改变所引出的信号转导的性质。例如，这些分子可通过结合到B7-H4改变此类分子结合到其他受体并且从而改变其全部活性的能力。优选地，这种调节将提供可测量的免疫系统活性方面的至少10％的改变，更优选地在这种活性方面至少50％的改变，或在这种活性方面至少2倍、5倍、10倍，或仍更优选地至少100倍的改变。这种调节可因此导致衰减或完全消除B7-H4(例如，肿瘤细胞上的)结合到其同源受体的能力，并因此降低(或预防)对B7-H4介导的免疫应答的抑制。照此，也披露了针对癌症、感染性疾病、以及其他疾病的治疗，其中增强的免疫应答是所希望的。可替代地，结合B7-H4的分子可对肿瘤特异性的B7-H4施加调节活性，该肿瘤特异性的B7-H4可直接影响该肿瘤的生长、发展、活力、活性等。
如在结合或展现的效果的背景下使用的术语“基本上”旨在表示所观察到的效果是生理学或治疗相关的。因此，例如，如果阻滞的程度是生理学或治疗相关的话(例如如果这种程度大于完全阻滞的60％，大于完全阻滞的70％，大于完全阻滞的75％，大于完全阻滞的80％，大于完全阻滞的85％，大于完全阻滞的90％，大于完全阻滞的95％，或大于完全阻滞的97％)，一个分子能够基本上阻滞可溶的B7-H4或膜结合的B7-H4的活性。类似地，如果此类免疫特异性以及表征是大于60％相同的，大于70％相同的，大于75％相同的，大于80％相同的，大于85％相同的，大于90％相同的，大于95％相同的，或大于97％相同的，则称一个分子与另一个分子具有基本上相同的免疫特异性和/或表征)。
如此处使用的，由B7-H4介导的“共刺激性”信号包括阳性共刺激性信号(例如，导致增强一种活性的信号)以及阴性共刺激性信号(例如，导致抑制一种活性的信号)。
如此处使用的，术语“抗体”旨在表示具有一个“可变区”抗原识别位点的一个免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将该免疫球蛋白的这种域与抗体广泛共享的域(例如一个抗体Fc域)区分。该可变区包括一个“高变区”，其残基对抗原结合负责。该高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，典型地大约在轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)以及89-97(L3)以及大约在重链可变域中的残基27-35(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)处；卡巴特(Kabat)等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务(Public Health Service)，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，在轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)以及91-96(L3)以及在重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)；乔西亚(Chothia)以及莱斯克(Lesk)，1987，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917)。“框架区”或“FR”残基是除了如在此定义的高变区残基以外的那些可变域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体(参见例如，幕德曼斯(Muyldermans)等人，2001，生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)26：230；纳托尔(Nuttall)等人，2000，当前药剂生物技术(Cur.Pharm.Biotech.)1：253；莱兴曼(Reichmann)以及梅尔德曼斯(Muyldermans)，1999，免疫法杂志(J.Immunol.Meth.)231：25；国际公开号W094/04678和W094/25591；美国专利号6,005,079)，单链Fvs(scFv)(参见，例如，参见普拉克图恩(Pluckthun)于单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，罗森堡(Rosenburg)和摩尔(Moore)编辑，施普林格出版社，纽约，第269-315页(1994))，单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、胞内抗体、以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗体的抗Id以及抗抗Id抗体)。具体而言，此类抗体包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或子类的免疫球蛋白分子。
如此处使用的，术语一种抗体的“抗原结合片段”是指一种抗体的包含以下项的一个或多个部分：该抗体的互补决定区(“CDR”)以及任选地包括该抗体的“可变区”抗原识别位点、并且展现免疫特异性地结合抗原的能力的框架残基。此类片段包括Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)，及其突变体、天然存在的变体，以及包括该抗体的“可变区”抗原识别位点以及一种异源蛋白(例如，毒素、针对不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)的融合蛋白。如此处使用的，术语“片段”是指一种肽或多肽，该肽或多肽包括至少5个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基、或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。
还披露了所披露的抗体和抗原结合片段中任一个的“衍生物”的生产以及用途。术语“衍生物”是指免疫特异性地结合到人B7-H4但相对于抗体6H3在氨基酸序列方面通过包括一、二、三、四、五、或更多个氨基酸取代、添加、缺失或修饰而不同于鼠抗人B7-H4抗体6H3的一种抗体或其抗原结合片段。优选地，此类衍生物将与抗体6H3具有基本上相同的免疫特异性和/或特性，或相同的免疫特异性以及特性。此类衍生物的氨基酸取代或添加可包括天然存在(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”包含例如，抗体6H3的嵌合或人源化变体，连同具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区域的变体，以形成例如具有展现增强或受损的效应子或结合特性的变体Fc区域的抗体等。术语“衍生物”另外包含非氨基酸修饰，例如氨基酸可通过已知的保护/阻滞基团、蛋白质水解裂解而被糖基化(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-二醇神经氨酸等内容物)、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、衍生化，连接至细胞配体或其他蛋白等。在一些实施例，该改变的碳水化合物修饰调节以下中一个或多个：溶解抗体，利于抗体的亚细胞转运和分泌，促进抗体装配，构象完整性，以及抗体介导的效应子功能。在一个特定实施例中，相对于缺少该碳水化合物修饰的抗体，该改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。导致改变的抗体介导的效应子功能的碳水化合物修饰在本领域中是众所周知的(例如，参见希尔兹(Shields)，R.L.等人(2002)“人IgG N联寡糖上岩藻糖的缺少改进了与人FcγRIII的结合以及抗体依赖性细胞毒性(Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding ToHuman FcγRIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.)”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(30)：26733-26740；戴维斯(Davies)J.等人(2001)“GnTIII在重组抗CD20CHO生产细胞系中的表达：具有改变的糖型的抗体的表达通过对FCγRIII的更高亲和力导致ADCC的增加(Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHOProduction Cell Line:Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To AnIncrease In ADCC Through Higher Affinity For FCγRIII)”，生物技术&生物工程74(4)：288-294)。改变碳水化合物含量的方法对于本领域的普通技术人员来说是已知的，参见，例如，华力克(Wallick)，S.C.等人(1988)“针对α(1----6)右旋糖酐的单克隆抗体的VH残基的糖基化增加其对抗原的亲和力(Glycosylation Of A VHResidue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha(1----6)Dextran Increases Its Affinity ForAntigen)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)168(3)：1099-1109；涛(Tao)，M.H.等人(1989)“对未糖基化的嵌合的小鼠-人IgG的研究(Studies Of AglycosylatedChimeric Mouse-Human IgG).碳水化合物在人IgG恒定区介导的结构以及效应子功能中的作用(Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By TheHuman IgG Constant Region)”，免疫学杂志(J.Immunol.)143(8)：2595-2601；劳特利奇(Routledge)，E.G.等人(1995)“无糖基化对人源化治疗性CD3单克隆抗体的免疫原性的影响(The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A HumanizedTherapeutic CD3Monoclonal Antibody)”，移植60(8)：847-53；艾略特(Elliott)，S.等人(2003)“通过糖工程学增强治疗性蛋白体内活性”，自然生物技术(NatureBiotechnol.)21：414-21；希尔兹(Shields)，R.L.等人(2002)“人IgG N联寡糖上岩藻糖的缺少改进了与人FcγRIII的结合以及抗体依赖性细胞毒性(Lack Of Fucose OnHuman IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human FcγRIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.)”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(30)：26733-26740)。
“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子的分子，如具有衍生自一种非人抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如，莫里森(Morrison)，1985，科学(Science)229：1202；维(Oi)等人，1986，生物技术(BioTechniques)4：214；吉利斯(Gillies)等人，1989，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)125：191-202；以及美国专利号6,311,415、5,807,715、4,816,567、以及4,816,397。包含来自一个非人物种的一个或多个CDR以及来自一个人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可以使用多个本领域已知的技术产生，这些技术包括例如CDR-接枝(EC 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101、以及5,585,089)、饰面或表面重修(EP592,106；EP 519,596；帕德兰(Padlan)，1991，分子免疫学(MolecularImmunology)28(4/5)：489-498；斯图德尼卡(Studnicka)等人，1994，蛋白质工程(Protein Engineering)7：805；和罗吉斯卡(Roguska)等人(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.USA)91：969)。以及链改组(美国专利号5,565,332)。
此处披露的抗体包括“人源化抗体”(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400、EP592,106、以及EP 519,596；国际公开号WO 91/09967以及WO 93/17105；美国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886、以及6,407,213；以及帕德兰(Padlan)，1991，分子免疫学(Molecular Immunology)28(4/5)：489-498；斯图德尼卡(Studnicka)等人，1994，蛋白质工程(Protein Engineering)7(6)：805-814；罗吉斯卡(Roguska)等人，1994，PNAS 91：969-973；坦(Tan)等人，2002，免疫学杂志(J.Immunol.)169：1119-1125；卡尔达斯(Caldas)等人，2000，蛋白质工程(Protein Eng.)13：353-360；摩瑞亚(Morea)等人，2000，方法(Methods)20：267-79；巴卡(Baca)等人，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：10678-10684；罗吉斯卡(Roguska)等人，1996，蛋白质工程(Protein Eng.)9：895-904；科托(Couto)等人，1995，癌症研究(Cancer Res.)55(23增刊)：5973s-5977s；科托(Couto)等人，1995，癌症研究(Cancer Res.)55：1717-22；桑德胡(Sandhu)，1994，基因(Gene)150：409-10；佩德森(Pedersen)等人，1994，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)235：959-973；琼斯(Jones)等人，(1986)自然(Nature)321：522-525；莱兴曼(Reichmann)等人，(1988)自然(Nature)332：323-329；以及普雷斯塔(Presta)，1992，当前结构生物学观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2：593-596)。如此处使用的，术语“人源化抗体”是指包括一个人框架区以及来自一种非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称作“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白称作“受体”。恒定区不需要存在，但如果它们存在，它们应该与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85％-99％、优选地约95％或更多是相同的。因此，除了可能地CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。一种人源化抗体是包含人源化轻链以及人源化重链免疫球蛋白的一种抗体。例如，一种人源化抗体将不包含一种典型的嵌合抗体，因为，例如一种嵌合抗体的整个可变区是非人的。有人说，通过“人源化(humanization)”的过程一个供体抗体被“人源化”，因为预期所得到的人源化抗体结合到与提供该CDR的供体抗体针对的相同的抗原上。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中该受体的高变区残基被来自具有希望的特异性、亲和力、以及能力的一个非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长动物的高变区残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可以包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。作出这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，该人源化抗体将包括基本上至少一个、并且典型地两个可变域的全部，其中这些高变区的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人类免疫球蛋白序列的那些。该人源化抗体任选地也将包括一个免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是免疫特异性地结合到一个FcγRIIB多肽的人免疫球蛋白的那部分，其已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加(即，突变)改变。
在一个特别优选的实施例中，将这些抗体和抗原结合片段针对其结合至肿瘤或TAM的能力进行选择并从而耗尽此类细胞或调节其活性。
鼠抗人B7-H4抗体6H3的人嵌合或人源化衍生物对于在人体内使用是特别优选的，然而，可有利地采用鼠抗体或其他物种的抗体用于许多用途(例如，体外或原位检测测定，急性体内使用等)。这种人或人源化抗体可包括在一个或多个非人CDR中的氨基酸残基取代、缺失或添加。当与一种非衍生物人源化抗体比较时，该人源化抗体衍生物可具有基本上相同的结合、更强的结合或更弱的结合。在特定实施例中，该CDR的一、二、三、四、或五个氨基酸残基已被取代、缺失或添加(即，突变)。完全人抗体对于人受试者的治疗性治疗是特别令人希望的。
此类人抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制造，包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法(参见美国专利号4,444,887以及4,716,111；以及国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO96/34096、WO 96/33735、以及WO 91/10741)。此类人抗体可以使用转基因小鼠来产生，这些转基因小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因。例如，可以随机地或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入到小鼠胚胎干细胞之中。可替代地，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和多样区(diversity region)引入到小鼠胚胎干细胞之中。可以单独使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能，或在引入人免疫球蛋白基因座的同时通过同源重组来使这些免疫球蛋白基因无功能。具体地说，JH区的纯合缺失防止内源性抗体产生。修饰的胚胎干细胞扩增并且微注射到胚囊中以便产生嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以便产生表达人抗体的纯合子代。使用常规方法以一个选择的抗原(例如，一种多肽的全部或一部分)来对转基因小鼠免疫。针对抗原的单克隆抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得(参见，例如美国专利号5,916,771)。转基因小鼠所具有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并且随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM以及IgE抗体。对于产生人抗体的这种技术的概要，参见朗伯格(Lonberg)以及胡萨尔(Huszar)(1995，国际免疫学综述(Int.Rev.Immunol.)13：65-93，将其通过引用以其全文结合在此)。对于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及产生此类抗体的方案的详细讨论，参见，例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096、以及WO96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、以及5,939,598，将其通过引用以其全文结合在此。此外，公司诸如安根尼克斯(Abgenix)公司(弗里蒙特，CA)以及梅达瑞克斯(Medarex)(普林斯顿，NJ)能够参与使用类似于上述的技术针对一个选择的抗原提供人抗体。
在一些实施例中，所披露的抗体是单特异性的。特别感兴趣的是此类抗体的双特异性的衍生物、此类抗体的三特异性的衍生物或具有更多的多特异性的衍生物抗体，这些展现除其针对人B7-H4的特异性外对不同免疫系统靶标的特异性。例如，此类抗体可结合到人B7-H4和如下的一种抗原两者上，该抗原对将该抗体靶标至一个具体的细胞类型或组织是重要的(例如，靶标至与正治疗的一种肿瘤的癌抗原关联的一种抗原)。在另一个实施例中，在一个分子中，为了增强免疫调节影响并且组合多个作用机制，诸如配体阻滞、免疫细胞活化并且引导肿瘤靶向，这种多特异性的抗体结合到涉及可替代免疫调节通路的分子(受体或配体)，诸如B7-H1、PD-1、CTLA4、TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、LIGHT或LAG3。例如，B7-H1也表达于肿瘤以及TAM上，并且靶向B7-H1以及B7-H4两者的双特异性抗体会提供增强的对TAM介导的免疫压制的抑制，连同增强的对肿瘤介导的B7-H1+和B7-H4+免疫压制的抑制。此外，靶向于PD-1以及B7-H4两者的一种双特异性的抗体将抑制TAM介导的免疫压制，抑制肿瘤介导的免疫压制(通过B7-H4以及PD-1通路两者)，振兴耗损的T细胞以便增强效应物CTL识别，并且通过一个PD-1:B7-H4“桥”将效应物CTL重新引导/靶向至肿瘤。此外，该多特异性的抗体可结合到效应分子，诸如细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4 TGF-β、IL-10、IL-17、IFNg、Flt3、BLys)以及趋化因子(例如，CCL21)，其对于调节急性以及慢性免疫应答两者可能是特别相关的。同样地，可以采用能够结合B7-H4的一种内化抗体或毒素轭合的抗体来介导细胞内摄取并且诱导对表达B7-H4的肿瘤细胞的杀伤。
巨噬细胞已显示显著有助于HIV感染的初始步骤(卡特(Carter)，C.A.等人(2008)“巨噬细胞的HIV-1感染的细胞生物学(Cell Biology Of HIV-1 Infection OfMacrophages)”，微生物学年报综述(Ann.Rev.Microbiol.)62：425-443；努尔萨迪吉(Noursadeghi)，M.等人(2006)“单核吞噬细胞的HIV-1感染：AIDS中细菌性先天免疫缺陷的情况(HIV-1 Infection Of Mononuclear Phagocytic Cells:The Case ForBacterial Innate Immune Deficiency In AIDS)”，柳叶刀传染病(Lancet Infect.Dis.)6：794-804)。因此，结合B7-H4以及一种巨噬细胞特异性的标记物(诸如CD14、CD68、CD163、TLR2等)的所披露的抗体或其抗原结合片段(特别是如果轭合至一种毒素的话)可用于预防HIV感染。
编码优选的人受体框架序列的DNA序列包括但不限于来自人种系VH区段VH1-18和JH6以及人种系VL区段VK-A26和JK4的FR区段。在一个特定实施例中，使用常规重组DNA技术将这些CDR中的一个或多个插入框架区内。构架区可以是天然存在的或是共有的构架区，并且优选地是人构架区(针对人框架区列表，参见，例如，乔西亚(Chothia)等人，1998，“在免疫球蛋白可变域序列中的结构因素(StructuralDeterminants In The Sequences Of Immunoglobulin Variable Domain)，”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)278：457-479)。
人源化或嵌合的人抗体衍生物可包含基本上至少一个、并且典型地为2个可变域的全部，其中全部或基本上全部这些CDR区对应于一种非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，并且全部或基本上全部这些框架区是一种人免疫球蛋白共有序列的那些。优选地，此类抗体还包括一种免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地为一种人免疫球蛋白的那种。可相对于所提出的此类抗体的功能(具体而言可能需要的效应子功能)来选择此类抗体的恒定域。在一些实施例中，此类抗体的恒定域是或可以包括人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。在一个特定实施例中，当该人源化抗体衍生物旨在治疗用途，并且需要抗体效应子功能(如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及补体依赖性细胞毒性(CDC)活性)时，使用尤其是IgG1以及IgG3同种型的人IgG恒定域。在可替代的实施例中，当该抗体旨在治疗目的，并且不需要抗体效应子功能时，使用IgG2以及IgG4同种型。Fc恒定域可包括改变抗体效应子功能的一个或多个氨基酸修饰，诸如披露于美国专利申请公开号2005/0037000以及2005/0064514中的那些。
在一些实施例中，所披露的分子包含抗体轻链以及至少抗体重链的可变域两者。在其他实施例中，此类分子可进一步包括该重链的CH1、铰链、CH2、CH3、以及CH4区域中的一个或多个(尤其是CH1以及铰链区，或CH1、铰链、以及CH2区域，或CH1、铰链、CH2以及CH3区域)。该抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一些实施例中，恒定域是一个补体固定恒定域，其中希望该抗体展现出细胞毒性活性，并且类别典型地是IgG1。在其他实施例中，在这种细胞毒性活性不是令人希望的情况下，恒定域可以属于IgG2或IgG4类别。该抗体可以包括来自多于一个的类别或同种型的序列，并且选择具体的恒定域来优化所希望的效应子功能是在本领域普通技术范围内的。
一个人源化抗体的框架区和CDR区不需要精确地与亲本序列对应，例如，供体CDR或共有构架可以通过至少一个残基的取代、插入或缺失来进行诱变，以使得在那个位点处的CDR或构架残基不与共有抗体或供体抗体相对应。然而，这类突变优选地不是大规模的。通常，至少75％的人源化抗体残基会与亲本框架区(FR)和CDR序列的那些相对应，更经常90％，并且最优选大于95％。人源化抗体可以使用多种本领域中已知的技术产生，这些技术包括但不限于CDR接枝(欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101、以及5,585,089)、饰面或表面重修(欧洲专利号EP 592,106以及EP 519,596；帕德兰(Padlan)，1991，分子免疫学(Molecular Immunology)28(4/5)：489-498；斯图德尼卡(Studnicka)等人，1994，蛋白质工程(Protein Engineering)7(6)：805-814；和罗吉斯卡(Roguska)等人，1994，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91：969-973)，链改组(美国专利号5,565,332)，以及披露于以下中的技术，例如，美国专利号6,407,213、5,766,886、5,585,089，国际公开号WO 9317105，坦(Tan)等人，2002，免疫学杂志(J.Immunol.)169：1119-25，卡尔达斯(Caldas)等人，2000，蛋白质工程(Protein Eng.)13：353-60，摩瑞亚(Morea)等人，2000，方法(Methods)20：267-79，巴卡(Baca)等人，1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：10678-84，罗吉斯卡(Roguska)等人，1996，蛋白质工程(Protein Eng.)9：895-904，科托(Couto)等人，1995，癌症研究(Cancer Res.)55(23增刊)：5973s-5977s，科托(Couto)等人，1995，癌症研究(Cancer Res.)55：1717-22，桑德胡(Sandhu)，1994，基因(Gene)150：409-10，佩德森(Pedersen)等人，1994，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)235：959-73，琼斯(Jones)等人，(1986)自然(Nature)321：522-525，莱兴曼(Riechmann)等人，1988，自然(Nature)332：323，以及普雷斯塔(Presta)，1992，当前结构生物学观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2：593-596。这些框架区中的框架残基将经常用来自CDR供体抗体的对应残基来取代以便改变、优选地改进抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴别，例如通过模拟CDR与框架残基的相互作用以便鉴别对于抗原结合重要的框架残基、和用于鉴别具体位置的不寻常框架残基的序列比较。(参见，例如，奎因(Queen)等人，美国专利号5,585,089；美国公开号2004/0049014以及2003/0229208；美国专利号6,350,861；6,180,370；5,693,762；5,693,761；5,585,089；以及5,530,101和莱兴曼(Riechmann)等人，1988，自然(Nature)332：323)。
这些B7-H4结合分子可通过本领域中已知的对于产生多肽有用的任何方法产生，这些方法是例如体外合成、重组DNA生产等。优选地，该人源化抗体是通过重组DNA技术产生的。该抗体可使用重组免疫球蛋白表达技术产生。免疫球蛋白分子重组产物(包括人源化抗体)描述于美国专利号4,816,397(博斯(Boss)等人)、美国专利号6,331,415以及4,816,567(两者都是卡比利(Cabilly)等人)、英国专利GB2,188,638(温特(Winter)等人)以及英国专利GB 2,209,757。免疫球蛋白(包括人源化免疫球蛋白)的重组表达技术也可见于戈德尔(Goeddel)等人，酶学基因表达技术方法(Gene Expression Technology Methods in Enzymology)第185卷学术出版社(Academic Press)(1991)，以及博勒巴克(Borreback)，抗体工程(AntibodyEngineering)，W.H.弗里曼(Freeman)(1992)。涉及重组抗体的生产、设计以及表达的另外信息可以发现于梅福思(Mayforth)，设计抗体(Designing Antibodies)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(1993)。
用于生产该重组嵌合抗体的示例性工艺可包括以下：a)通过常规分子生物学方法，构建编码并表达抗体重链的一种表达载体，其中抗B7-H4抗体的CDR以及可变区融合到源自于一种人免疫球蛋白的一个Fc区，从而产生用于表达嵌合抗体重链的载体；b)通过常规分子生物学方法，构建编码并表达鼠抗人B7-H4单克隆抗体的抗体轻链的一个表达载体，从而产生用于表达嵌合抗体轻链的载体；c)通过常规分子生物学方法将这些表达载体转移到宿主细胞，以产生用于表达嵌合抗体的经转染的宿主细胞；并且d)通过常规细胞培养技术培养该转染细胞，以产生嵌合抗体。
用于产生重组人源化抗体的示例性工艺可包括以下：a)通过常规分子生物学方法，构建编码并表达抗人B7-H4重链的一种表达载体，其中需要来保持供体抗体结合特异性的CDR以及最小部分的可变区框架源自于抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体，并且抗体的剩余部分源自于一种人免疫球蛋白，从而产生用于表达一种人源化抗体重链的一个载体；b)通过常规分子生物学方法，构建编码并表达抗体轻链的一种表达载体，其中需要来保持供体抗体结合特异性的CDR以及最小部分的可变区框架源自于一种非人免疫球蛋白，诸如鼠抗人B7-H4单克隆抗体6H3，并且抗体的剩余部分源自于一种人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体轻链的一个载体；c)通过常规分子生物学方法将这些表达载体转移到宿主细胞，以产生用于表达人源化抗体的经转染的宿主细胞；并且d)通过常规细胞培养技术培养该转染细胞，以产生人源化抗体。
相对于任一个示例性方法，可将宿主细胞用此类表达载体共转染，这些表达载体可包含不同的选择性标记，但除重链以及轻链编码序列外，优选地是相同的。此程序提供了重链和轻链多肽的等同表达。可替代地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA或两者。用于表达该重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞，诸如大肠杆菌，或更优选地是真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK-293细胞)。对表达载体的选择依赖于对宿主细胞的选择，并且可如此选择以在所选择的宿主细胞中具有希望的表达以及调控特性。可使用的其他细胞系包括但不限于，CHO-K1、NSO、以及PER.C6(库赛尔，莱顿，荷兰)。
可使用本领域普通技术人员所熟知的技术将所披露的抗体中的任一个产生抗独特型抗体(参见，例如，格林斯潘(Greenspan)，N.S.等人(1989)“独特型：结构以及免疫原性(Idiotypes:Structure And Immunogenicity)”，FASEB杂志(FASEB J.)7：437-444；以及尼西诺夫(Nisinoff)，A.(1991)“独特型：概念和应用(Idiotypes:Concepts And Applications)”，免疫学杂志(J.Immunol.)147(8)：2429-2438)。
一种衍生物抗体或抗体片段可使用本领域的普通技术人员已知的技术通过化学修饰进行修饰，这些技术包括但不限于，特异性的化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等。在一个实施例中，一种抗体衍生物将与亲本抗体具有类似或相同的功能。在另一个实施例中，一种抗体衍生物将展现相对于亲本抗体改变的活性。例如，相比于亲本抗体，一种衍生物抗体(或其片段)可更紧密地结合到其表位或对蛋白水解更加耐受。
在衍生化的抗体中的取代、添加或缺失可在该抗体的Fc区并且可由此起作用以修饰该抗体至一个或多个FcγR的结合亲和力。用于修饰抗体(具有修饰的至一个或多个FcγR的结合)的方法在本领域中是已知的，参见例如PCT出版号WO 04/029207、WO 04/029092、WO 04/028564、WO 99/58572、WO 99/51642、WO 98/23289、WO89/07142、WO 88/07089、以及美国专利号5,843,597以及5,642,821。在一些实施例中，包含如下抗体，这些抗体的Fc区缺失(例如，一个Fab或F(ab)2等)或被修饰，使得该分子展现减弱的或无Fc受体(FcR)结合活性，或展现增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施例中，这些抗体具有改变的对激活FcγR，例如FcγRIIIA的亲和力。优选地，此类修饰也具有改变的Fc介导的效应子功能。影响Fc介导的效应子功能的修饰在本领域中是众所周知的(参见美国专利号6,194,551，以及WO 00/42072)。在一个具体实施例中，对Fc区的修饰得到如下的一种抗体，该抗体具有改变的抗体介导的效应子功能、改变的与其他Fc受体(例如，Fc激活受体)的结合、改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、改变的C1q结合活性、改变的补体依赖性细胞毒性活性(CDC)、吞噬细胞活性、或其任何组合。
衍生化抗体可用于改变哺乳动物(优选地人)中的亲本抗体的半衰期(例如，血清半衰期)。优选地，此类改变会使得半衰期超过15天，优选超过20天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月或超过5个月。在哺乳动物(优选地人)中的人源化抗体或其片段的增加的半衰期导致在该哺乳动物中所述抗体或抗体片段的更高血清滴度，并且因此减少给予所述抗体或抗体片段的频度和/或减少待给予的所述抗体或抗体片段的浓度。具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过本领域的普通技术人员已知的技术产生。例如，具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过修饰(例如，取代、缺失或添加)多个鉴别为涉及到Fc域与FcRn受体之间的相互作用中的氨基酸残基来产生。该人源化抗体可被工程化以增加生物半衰期(参见，例如美国专利号6,277,375)。例如，人源化抗体可在Fc-铰链域中被工程化以具有增加的体内或血清半衰期。
具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过将多聚体分子诸如高分子量聚乙二醇(PEG)附接至所述抗体或抗体片段来产生。PEG可以在存在或不存在多官能连接子的情况下，通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端的位点特异性轭合或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基基团附接到所述抗体或抗体片段。可以使用使生物活性的损失最少的线性或分支聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱密切监测轭合的程度，来确保PEG分子与抗体的正确轭合。未反应的PEG可以通过例如尺寸排阻法或离子交换色谱法从抗体-PEG轭合物分离。
该抗体也可通过戴维斯(Davis)等人(参见美国专利号4,179,337)所述的方法以及偶联剂修饰，以提供可以注射到哺乳动物循环系统中而基本上无免疫原性应答的组合物。
可以修饰这些人源化抗体的框架残基。框架区中的残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改进抗原结合。这些构架取代是通过本领域众所周知的方法鉴定的，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，并且通过序列比较以鉴定在特定位置上的不寻常构架残基。(参见，例如美国专利号5,585,089；和莱兴曼(Riechmann)，L.等人(1988)“再成形人抗体用于治疗(Reshaping Human Antibodies For Therapy)”，自然332：323-327)。
所披露的B7-H4结合分子可以重组地融合或化学地轭合(包括共价和非共价轭合两者)至一个异源分子(即，不相关的分子)。该融合未必需要直接进行，而是可以通过接头序列发生。
在一个实施例中，此类异源分子是具有至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽。此类异源分子可以可替代地是酶、激素、细胞表面受体、药物部分，诸如：巨噬细胞特异性靶向试剂(例如细胞内羧酸酯酶，hCE1(尼达姆(Needham，L.A.等人(2011)“使用酯酶敏感的化学基序靶向单核细胞以及巨噬细胞的药物(Drug Targeting To Monocytes AndMacrophages Using Esterase-Sensitive Chemical Motif)”，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)DOI:10.1124/jpet.111.183640)，壳多糖以及壳聚糖(牧扎雷丽(Muzzarelli)，R.A.(2010)“作为免疫佐剂以及非变应原药物载体的壳多糖以及壳聚糖(Chitins And Chitosans As Immunoadjuvants And Non-Allergenic Drug Carriers)”，海洋药物(Mar Drugs)8(2)：292-312)，半乳糖基化的低密度脂蛋白(吴(Wu)，F.等人(009)“半乳糖基化的LDL纳米颗粒：一种新颖的用以递送抗原至巨噬细胞并且增强抗原特异性T细胞应答的靶向递送系统(Galactosylated LDL Nanoparticles:ANovel Targeting Delivery System To Deliver Antigen To Macrophages And Enhance AntigenSpecific T Cell Responses)”，分子药理学(Molec.Pharm.)6(5)：1506-1517)，N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLF)，一种巨噬细胞特异性的化学引诱剂(万(Wan)，L.等人(2008)“针对巨噬细胞的PEG-Fmlf(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸)纳米载体摄取而优化尺寸以及拷贝数(Optimizing Size And Copy Number For PEG-Fmlf(N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine)Nanocarrier Uptake By Macrophages)”，生物轭合化学(Bioconjug.Chem.)19(1)：28-38)，马来酰化或甘露糖基化蛋白，诸如马来酰化白蛋白(阿纳泰利(Anatelli)，F.等人(2006)“通过瘤内注射递送的靶向巨噬细胞的光敏剂轭合物(Macrophage-Targeted Photosensitizer Conjugate Delivered ByIntratumoral Injection)”，分子药理学(Mol Pharm.)3(6)：654-664；班赛尔(Bansal)，P.等人(1999)“结合至清道夫受体的马来酰化蛋白的MHC类别I限定呈递(MHC Class I-Restricted Presentation Of Maleylated Protein Binding To ScavengerReceptors)”，免疫学杂志162(8)：4430-4437)；还参见穆克霍帕蒂亚(Mukhopadhyay)，A.等人(2003)“药物向巨噬细胞的细胞内递送(IntracellularDelivery Of Drugs To Macrophages)”，生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)84：183-209)，毒素(例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素、或美洲商陆抗病毒蛋白)，蛋白质(例如肿瘤坏死因子、干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活剂、或凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))，生物反应调节剂(诸如，例如淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或巨噬细胞菌落刺激因子(“M-CSF”)、或生长因子(例如，生长激素(“GH”)))，细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同源物)，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))，烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、(卡莫司汀；BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二氨钼(II)(DDP)顺钼)，蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(以前的放线菌素(actinomycin))、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，或抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
在另一个实施例中，这些分子轭合至一种第二抗体以形成一种抗体杂轭合物，如通过西格尔(Segal)在美国专利号4,676,980中所述的。此类杂轭合物抗体可另外结合到半抗原(例如荧光素等)，或结合到细胞标记物(例如4-1-BB、B7-H1、PD-1、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、TLR2、LIGHT等)或到细胞因子(例如IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、TGF-β、IFNg、Flt3、BLys)或趋化因子(例如，CCL21)等。
该融合蛋白的Fc部分可按照同种型或子类而不同，可以是嵌合体或杂合体，和/或可经过修饰以便例如改进效应子功能、控制半衰期、组织可接近性、增进生物物理特性例如稳定性，并且改进产生效率(并且成本更小)。在构建所披露的融合蛋白中有用的许多修饰以及制备它们的方法在本领域是已知的，参见例如穆勒(Mueller)，J.P.等人(1997)“具有嵌合的IgG2/G4恒定区的人源化猪VCAM特异性单克隆抗体阻滞人白细胞结合到猪内皮细胞(Humanized Porcine VCAM-Specific MonoclonalAntibodies With Chimeric IgG2/G4Constant Regions Block Human Leukocyte Binding ToPorcine Endothelial Cells)”，分子免疫学(Mol.Immun.)34(6)：441-452，斯旺(Swann)，P.G.(2008)“对于开发治疗性单克隆抗体的考虑(Considerations For TheDevelopment Of Therapeutic Monoclonal Antibodies)”，当前免疫学观点(Cur.Opin.Immun.)20：493-499(2008)，以及帕斯塔(Presta)，L.G.(2008)“治疗性抗体的分子工程以及设计(Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies)”，当前免疫学观点(Cur.Opin.Immun.)20：460-470。在一些实施例中，该Fc区为天然IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施例中，该Fc区是杂合体，例如由IgG2/IgG4 Fc恒定区组成的嵌合体。该Fc区的修饰包括但不局限于：IgG4被修饰以阻止与Fcγ受体和补体的结合，IgG1被修饰以改进与一种或多种Fcγ受体的结合，IgG1被修饰以最小化效应因子功能(氨基酸变化)，IgG1具有改变的/不具有聚糖(典型地通过改变表达宿主)，以及IgG1具有与FcRn的改变的pH-依赖性结合。该Fc区可以包括整个铰链区，或不足整个铰链区。
对于与个体的Fcγ受体的等位基因变体(这些变体对于人IgG1的Fc域具有不同的内在亲和力)表达相关的非霍奇金氏淋巴瘤或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，在用利妥昔单抗(一种针对CD20的嵌合小鼠/人IgG1单克隆抗体)治疗的患者中的治疗成果。具体而言，具有低亲和力激活型Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的高亲和力等位基因的患者显示更高的反应率，并且在非霍奇金氏淋巴瘤的情况下显示改进的无进展生存期。因此，所披露的抗体和片段的Fc域包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代减少与低亲和力抑制性Fc受体CD32B(FcγRIIB)的结合，并且保持野生型水平的与低亲和力激活型Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的结合或增强与之的结合。
另一个实施例包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，它们具有降低的与FcγR的结合，这增加了它们的半衰期。代表性IgG2-4杂合体和IgG4突变体描述于安盖尔(Angal)，S.等人(1993)“单个氨基酸取代消除了嵌合的小鼠/人(Igg4)抗体的异质性(A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of ChimericMouse/Human(Igg4)Antibody)”，分子免疫学(Molec.Immunol.)30(1)：105-108；穆勒(Mueller)，J.P.等人(1997)“具有嵌合的IgG2/G4恒定区的人源化猪VCAM特异性单克隆抗体阻滞人白细胞结合到猪内皮细胞(Humanized Porcine VCAM-SpecificMonoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4Constant Regions Block Human LeukocyteBinding To Porcine Endothelial Cells)”，分子免疫学(Mol.Immun.)34(6)：441-452；以及美国专利号6,982,323。在一些实施例中，该IgG1和/或IgG2域被修饰；例如，安盖尔(Angal)，S.等人(1993)描述了其中丝氨酸241被脯氨酸替代的IgG1以及IgG2变体。
在一个优选实施例中，此类分子的Fc域含有氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代增强与CD16A的结合。在人IgG1的Fc域内增加与CD16A的结合并且减少与CD32B的结合的大量取代在本领域是已知的并且描述于斯塔文哈根(Stavenhagen)，J.B.等人(2007)“治疗性抗体的Fc优化通过低亲和力激活型Fcγ受体增强其体外杀死肿瘤细胞并且控制肿瘤体内扩展的能力”，癌症研究(Cancer Res.)57(18)：8882-8890。具有降低的与CD32B的结合和/或增加的与CD16A的结合的人类IgG1Fc域的示例性变体包含F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可按任何组合存在于人IgG1Fc域中。在一个实施例中，该人IgG1Fc域变体含有F243L、R929P以及Y300L取代。在另一个实施例中，该人IgG1Fc域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I以及P296L取代。在另一个实施例中，该人IgG1Fc域变体含有N297Q取代，因为这个突变消除FcR结合。
用于使治疗部分轭合至抗体的技术是熟知的；参见例如，阿尔农(Arnon)等人，“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)”，单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy)，莱斯菲尔德(Reisfeld)等人(编辑)，1985，第243-56页，艾伦R.利斯有限公司(Alan R.Liss，Inc.)；赫尔斯特伦(Hellstrom)等人，“用于药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)”，控制药物递送(Controlled Drug Delivery)(第2版)，罗宾逊(Robinson)等人(编辑)，1987，第623-53页，马塞尔德克有限公司(Marcel Dekker，Inc.)；索普(Thorpe)，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：评论(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review)”，单克隆抗体'84：生物和临床应用(Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications)，平凯拉(Pinchera)等人(编辑)，1985，第475-506页；“癌症治疗中放射性标记抗体的治疗用途的分析、结果、以及未来前景(Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy)”，用于癌症检测和治疗的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy)，鲍德温(Baldwin)等人(编辑)，1985，第303-16页，学术出版社(Academic Press)；以及索普等人(1982)“抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性特性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)”，免疫学评论(Immunol.Rev.)62：119-158。
所披露的分子中的任一个可以融合到标记序列(如一种肽)以促进纯化。在优选的实施例中，标记氨基酸序列是一种六-组氨酸肽，即血球凝集素“HA”标签，其对应于源自于流感血球凝集素蛋白的表位(威尔逊(Wilson)，I.A.等人(1984)“抗原决定簇在蛋白中的结构(The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein)”，细胞，37：767-778)并且“flag”标签(克纳皮克(Knappik)，A.等人(1994)“基于FLAG肽改进的亲和力标签用于重组抗体片段的检测以及纯化(An Improved Affinity Tag BasedOn The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant AntibodyFragments)”，生物技术17(4)：754-761)。
所披露的B7-H4结合分子可以轭合至一种诊断或治疗剂或另一种希望血清半衰期增加的分子。这些抗体可诊断地使用(体内、原位或体外)以例如作为一个临床测试程序的部分监测一种疾病、失调或感染的发展或进展，例如以确定给定治疗方案的效力，或选择更很可能对具体治疗有反应的患者(例如具有高水平的浸润TAM的那些，以及尤其表达高水平的B7-H4的那些)。
具体而言，人中的大部分癌生长为由缠结有对于肿瘤存活、生长以及进展而言所需要的一组支持结构(间质)的癌细胞组成的实体瘤。肿瘤间质中的主要组分是成纤维细胞、新血管系统、以及免疫细胞，包括巨噬细胞。此类肿瘤相关巨噬细胞不仅是肿瘤间质中最重要的组分之一，而且包括对于起始以及维持肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞免疫是关键的抗原递呈细胞(APC)。
肿瘤环境的巨噬细胞数目明显超过存在于肿瘤内的其他APC，诸如树突细胞(DC)，并且代表实体瘤中APC的一个突出的亚群体(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“B7-H4表达识别一种在人卵巢癌中的新颖的压制性巨噬细胞群体(B7-H4Expression Identifies A Novel Suppressive Macrophage Population In Human OvarianCarcinoma)”，实验医学杂志(J.Exper.Med.)203(4)：871-881)。肿瘤环境的巨噬细胞(呈B7-H4+)显著压制T细胞活化。B7-H4–巨噬细胞可以在体外通过IL-10以及IL-6被转化为B7-H4+巨噬细胞(克雷切克(Kryczek)，I.等人(2006)“先锋：在APC上通过IL-10诱导B7-H4：针对调控T细胞的新颖的压制模式(Cutting Edge:Induction Of B7-H4 On APCs Through IL-10:Novel Suppressive Mode For Regulatory TCells)”，免疫杂志(J.Immunol.)177(1)：40-44)。由于在卵巢肿瘤环境中发现高水平的IL-10以及IL-6，在入侵性肿瘤中看到，此类细胞因子诱导B7-H4表达的能力被认为与增加的对T细胞活化的抑制相关。重要地是，此类压制性活性可以通过GM-CSF或IL-4两种树状细胞分化细胞因子而降低，这两种树状细胞分化细胞因子起作用以阻滞B7-H4表达。此类压制性活性也可通过用所披露的组合物阻滞B7-H4活性而降低。
尽管已经调查了在肿瘤免疫性中树突细胞的表型以及所发挥的作用，此类研究还未阐明在患有癌症的患者的肿瘤环境内B7-H4+以及B7-H4–巨噬细胞所发挥的作用。所披露的B7-H4结合分子在阐明由B7-H4+以及B7-H4–巨噬细胞所发挥的作用以及作为评价患者中肿瘤的临床预后的一种手段中有用(即，B7-H4+巨噬细胞相对总巨噬细胞的程度与肿瘤入侵性以及癌症的严重性相关)。与确定B7-H1+巨噬细胞相对总巨噬细胞的程度相关联，此类评价特别有用，因为肿瘤B7-H1表达和阳性肿瘤B7-H4表达与患癌死亡是独立地关联的(卡拉姆贝克(Krambeck)，A.E.等人(2006)“肾细胞癌和肿瘤脉管系统中的B7-H4表达：癌症进展和存活之间的关联(B7-H4 Expression InRenal Cell Carcinoma And Tumor Vasculature:Associations With Cancer Progression AndSurvival)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))103(2)：10391-10396)。
可以通过使分子诸如抗体或其一个抗原结合片段偶联到可检测物质上促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。该可检测物质可被直接偶联或轭合至该抗体，或使用本领域中已知的技术间接通过一个中间体(诸如，例如本领域中已知的一个接头)进行。参见例如美国专利号4,741,900关于可以轭合至抗体用作诊断剂的金属离子。可通过将抗体与可检测物质偶联完成这种诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基复合体，诸如但不限于抗生蛋白链菌素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三唤胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于发光胺；生物发光材料，诸如但不限于荧光素酶、荧光素、以及水母发光蛋白；放射性材料，诸如但不限于铋(213Bi)，碳(14C)，铬(51Cr)，钴(57Co)，氟(18F)，钆(153Gd，159Gd)，镓(68Ga，67Ga)，锗(68Ge)，钬(166Ho)，铟(115In，113In，112In，111In)，碘(131I，125I，123I，121I)，镧(140La)，镏(177Lu)，锰(54Mn)，钼(99Mo)，钯(103Pd)，磷(32P)，镨(142Pr)，钷(149Pm)，铼(186Re，188Re)，铑(105Rh)，钌(97Ru)，钐(153Sm)，钪(47Sc)，硒(75Se)，锶(85Sr)，硫(35S)，锝(99Tc)，铊(201Ti)，锡(113Sn，117Sn)，氚(3H)，氙(133Xe)，镱(169Yb，175Yb)，钇(90Y)，锌(65Zn)；使用不同正电子发射断层扫描以及非放射性顺磁金属离子的正电子发射金属。
所披露的这些分子可被附接至固相支撑体，其对于靶标抗原或能够结合到靶标抗原的其他分子的免疫测定或纯化是特别有用的，该靶标抗原已通过结合到一种抗体或抗原结合片段而固定到支撑体上。此类固相支持体包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
还披露了编码任何此类抗体、融合蛋白或片段的核酸分子(DNA或RNA)，连同能够转染或复制此类核酸分子的载体分子(例如质粒)。这些核酸可以是单链的、双链的，可包含单链以及双链部分两者。
A.鼠抗人B7-H4抗体6H3及其CDR
所披露的鼠抗人B7-H4抗体6H3，具有调节排列于人类细胞的表面上的人B7-H4的活性的能力(尤其当此类B7-H4以内源浓度表达时)。术语“内源浓度”是指如下的水平，在此水平一个分子被一个细胞(此细胞可以是正常细胞、癌细胞或受感染细胞)天然表达(即，在不存在表达载体或重组启动子的情况下)。
在一个实施例中，此类调节将由此类抗体与B7-H4(优选地为内源地表达和排列)的结合引起。在一个可替代实施例中，此类调节将包括增强或以其他方式促进内源地表达和排列的B7-H4的结合
对编码鼠抗人B7-H4抗体6H3的DNA进行测序。该轻链和重链的可变域的氨基酸序列以及编码多核苷酸序列是如下文指出的。CDR序列以加粗和加下划线示出：
抗人B7-H4克隆6H3轻链可变区：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSLHW YLQKPGQSPK
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC
FGAGTKLE LK(SEQ ID NO：3)
编码该轻链可变区的多核苷酸：
gatgttgtga tgacccaaac tcctctctcc ctgcctgtca gtcttggaga
tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacattaatg
gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag
gtcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt
cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg
aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac
(SEQ ID NO：4)
重链可变区：
EVQLQQSGPV LVKPGTSVKM SCKASMNWVKQS HGKSLEWIGV
TY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MEVNSLTFED SAVYYC
WGQGTL VTVSA(SEQ ID NO：5)
编码该轻链可变区的多核苷酸：
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgta ctggtgaagc ctgggacttc
agtgaagatg tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactata
tgaactgggt gaagcagagc catggaaaga gtcttgagtg gattggagtt
attaatcctt acaacggtga cactacctac aaccagaagt tcaagggcaa
ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac atggaggtca
acagcctgac atttgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatacccg
gagagtactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca
(SEQ ID NO：6)
使用乔西亚(Chothia)以及莱斯克(Lesk)的标准，轻链CDR1被推断为具有类别4典型结构；轻链CDR2和CDR3以及重链CDR1被推断为具有类别1典型结构；重链CDR2被推断为具有类别2典型结构(乔西亚(Chothia)，C.等人(1987)“免疫球蛋白的高变区的典型结构(Canonical Structures For The Hypervariable Regions OfImmunoglobulins)”，分子生物学(J.Mol.Biol.)196：901-917)。珍珠串型(Collierde Perles)是可变域的2D表示，并且提供β链中氨基酸位置以及可变域中的环的信息(鲁伊斯(Ruiz)等人(2002)“具有已知3D结构的人免疫球蛋白的IMGT基因鉴定和珍珠串型(IMGT Gene Identification And Colliers de Perles Of Human ImmunoglobulinsWith Known 3D Structures)，”免疫遗传学(Immunogenetics)53(10-11)：857-883)。鼠6H3抗体轻链和重链可变区的珍珠串型分别示于图1A和图1B中。这些链的三个CDR环显示于这些图表的顶部。在可变轻链或重链区域中不存在游离的Cys残基或N联糖基化位点。
B.抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体
所披露的鼠抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体及其抗原结合衍生物典型地包括免疫特异的或物理特异性的B7-H4-结合分子，这些分子可具有与鼠抗人B7-H4抗体6H3基本上相同或相同的结合特性。例如，它们可具有调节排列于人类细胞的表面上的人B7-H4的活性的能力(尤其是当这种B7-H4以内源浓度表达时)。
制备了抗人B7-H4抗体6H3的多个优选轻链以及重链人源化衍生物。优选的人源化变体的轻链可变区的氨基酸序列(源自于IGKV2-30*02 IGKJ4*01受体框架)如下示出(CDR被加下划线示出)：
1.VL1A IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化1)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLNW FQQRPGQSPR
RLIYNRD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：18)
2.VL1B IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化2)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YQQRPGQSPR
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：19)
3.VL1C IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化3)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YLQRPGQSPK
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：20)
抗人B7-H4抗体6H3的优选的人源化变体的轻链可变区的氨基酸序列(源自于CAA85590受体框架)如下示出(CDR被加下划线示出)：
1.VL2A CAA85590(人源化1)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLNW FQQRPGQSPR
RLIYNRD SGVPDRFSGS GSGADFTLKI SRVEAEDVGV YYC
FGQGTKVE IK(SEQ ID NO：21)
2.VL2B CAA85590(人源化2)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YQQRPGQSPR
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGQGTKVE IK(SEQ ID NO：22)
3.VL2C CAA85590(人源化3)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YLQRPGQSPK
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGAGTKVE IK(SEQ ID NO：23)
抗人B7-H4抗体6H3的优选的人源化变体的重链可变区的氨基酸序列(源自于IGHV1-46*03 IGHJ4*01受体框架)如下示出(CDR被加下划线示出)：
1.VH1A IGHV1-46*03IGHJ4*01(人源化1)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMHWVRQA PGQGLEWMGI
Y AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：24)
2.VH1B IGHV1-46*03 IGHJ4*01(人源化2)：
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQGLEWMGI
SY NQKFQGRVTL TVDKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：25)
3.VH1C IGHV1-46*03 IGHJ4*01(人源化3)：
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQGLEWIGI
SY NQKFKGRVTL TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：26)
抗人B7-H4抗体6H3的优选的人源化变体的重链可变区的氨基酸序列(源自于ABF83259受体框架)如下示出(CDR被加下划线示出)：：
1.VH2A ABF83259(人源化1)：
QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASIHWVRQA PGQSLEWMGW
KY SQKFQGRVTV ARDTSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：27)
2.VH2B ABF83259(人源化2)：
EVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASGYTFTMNWVRQA PGQSLEWMGV
TY NQKFQGRVTV AVDKSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：28)
3.VH2C ABF83259(人源化3)：
EVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQSLEWIGV
TY NQKFQGRVTV TVDKSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：29)
提供了包括抗人B7-H4抗体6H3的所披露的人源化变体的36个组合中任一个的抗体及其抗原结合片段。确切地，此类抗体包括示于表1中的人源化变体组合：
这些抗体或其片段可包括展现与人B7-H4免疫特异性结合的且与由以上克隆中任一个产生的抗体的可变重链和/或轻链的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列。这些抗体或其片段可包括展现与B7-H4免疫特异性结合的且与以上列出的克隆的CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致的CDR。两种氨基酸序列的百分比一致性的确定可以由BLAST蛋白比较来确定。
该分子可以是包括一、二或三个轻链CDR以及一、二或三个重链CDR(最优选地三个轻链CDR以及三个重链CDR)的一个免疫球蛋白分子(例如抗体、双抗体、融合蛋白等)，其中这些轻链CDR包括：
(1)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1；
(2)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR2；
(3)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR3；
(4)小鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1以及轻链CDR2；
(5)小鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1以及轻链CDR3；
(6)小鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR2以及轻链CDR3；
或
(7)小鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1、轻链CDR2以及轻链CDR3。
该分子可以是包括一、二或三个轻链CDR以及一、二或三个重链CDR(最优选地三个轻链CDR以及三个重链CDR)的一个免疫球蛋白分子，其中这些重链CDR包括：
(1)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1；
(2)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR2；
(3)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR3；
(4)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1以及重链CDR2；
(5)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1以及重链CDR3；
(6)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR2以及重链CDR3；
或
(7)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3。
该分子可以是包括一、二或三个轻链CDR以及一、二或三个重链CDR(最优选地三个轻链CDR以及三个重链CDR)的一个免疫球蛋白分子，其中这些轻链CDR包括：
(1)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1；
(2)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR2；
(3)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR3；
(4)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1以及轻链CDR2；
(5)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1以及轻链CDR3；
(6)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR2以及轻链CDR3；
或
(7)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的轻链CDR1、轻链CDR2以及轻链CDR3，
并且其中这些重链CDR包括：
(1)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1；
(2)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR2；
(3)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR3；
(4)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1以及重链CDR2；
(5)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1以及重链CDR3；
(6)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR2以及重链CDR3；
或
(7)鼠抗人B7-H4抗体6H3或其一种人源化变体的重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3。
例如，该抗体可具有鼠6H或其一种嵌合抗体的CDR，或具有的CDR对应于抗人B7-H4抗体6H3的CDR的一种人源化变体。
在一个特定实施例中，一种抗体或其一个抗原结合片段包括抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体的一、二、三、四、五、或更优选地所有6个CDR，并且将展现与抗体6H3相同的结合至人B7-H4的能力。
C.治疗和预防用途
典型地，在受体受试者中，所披露的抗体免疫特异性地结合到B7-H4。如此处使用的，“受试者”优选地是哺乳动物，诸如非灵长类(例如，母牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如，猴以及人)，并且最优选是人。在优选的实施例中，这些抗体是免疫特异性地结合到人B7-H4的人源化抗体、或其抗原结合片段。
在一些实施例中，此类分子能够耗尽表达B7-H4的肿瘤细胞或受体人或人组织中的TAM(原位或体外)或调节这类细胞的活性。B7-H4阳性肿瘤细胞或TAM的耗尽或在B7-H4水平中有益的减少可以通过肿瘤组织的IHC使用所披露的抗B7-H4抗体或另一个肿瘤特异性的或TAM特异性的标记物进行监测，或通过PCR、原位杂交或本领域的普通技术人员已知的另一种其他方法监测B7-H4 mRNA水平上的降低。很可能受益于用抗B7-H4抗体进行的治疗的患者将在肿瘤或TAM上表达靶标B7-H4蛋白，并且这可以通过肿瘤样本的IHC、FAC、原位杂交或本领域的普通技术人员已知的另一种其他方法进行评估。
如此处使用的，术语“治疗(treat、treating、treatment)”以及“治疗用途”是指消除、减少或改善通过B7-H4与其一个或多个受体的相互作用、或通过B7-H4的表达或其排列于一个细胞的表面上的存在而加重的一种疾病或失调的一个或多个症状。如此处使用的，“治疗有效量”是指一种治疗剂足够介导此类症状的一个临床相关消除、降低或改善的量。如果一个效果的量级足以影响接受者受试者的健康或预后的话，则该效果是临床上相关的。治疗有效量可以是指治疗剂足够延迟或最小化疾病的发作，例如延迟或最小化癌症的传播的量。治疗有效量还可以是指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。进一步地，针对治疗剂的治疗有效量意指治疗剂单独或与其他疗法组合在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的量，该治疗益处是例如，足以增强一种治疗性抗体的治疗效力，足以治疗或管理一种疾病。
如此处使用的，术语“预防剂”是指可在检测到一种失调或疾病的任何症状之前在预防这种失调或疾病中使用的一种药剂。“预防有效”量是足够介导这种保护的预防剂的量。预防有效量还可以是指在疾病的预防中提供预防益处的预防剂的量。进一步地，针对预防剂的预防有效量意指预防剂单独或与其他药剂组合在疾病的预防中提供预防益处的量。
1.免疫系统的上调剂的使用
在一个优选实施例中，所披露的B7-H4结合分子结合到B7-H4以“基本上”破坏(即，损坏、防止、或衰减)B7-H4与其一个或多个受体之间的结合(例如，通过在B7-H4和其受体的结合位点的一个或多个近端和破坏性位点处结合，或在构象被这种结合破坏并因此其结合至受体的能力受到损坏的一个区域处结合等)。如上所讨论的，B7-H4与其受体之间的相互作用抑制T细胞增殖并减少炎症，包括多个细胞因子的产生。(臧(Zang)，X.等人(2003)B7x：一个广泛表达的抑制T细胞的活化的B7家族成员(B7x:A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T CellActivation)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100：10388-10392；普拉萨德(Prasad)，D.V.等人(2003)B7S1，一种新颖的负向调节T细胞活化的B7家族成员(B7S1,A Novel B7 Family Member That Negatively Regulates T CellActivation)”，免疫(Immunity)18：863-873)。因此，在一个优选的实施例中，给予此类分子至一个受试者通过拮抗结合到其受体的正常B7-H4上调了受试者的免疫应答。
免疫系统的上调在治疗癌症以及慢性感染上是特别希望的，并且因此此处所披露的组合物可在治疗此类失调中使用。B7-H4在HIV感染时过表达(卡特(Carter)，C.A.等人(2008)“巨噬细胞的HIV-1感染的细胞生物学(Cell Biology Of HIV-1 InfectionOf Macrophages)”，微生物学年报综述(Ann.Rev.Microbiol.)62：425-443；努尔萨迪吉(Noursadeghi)，M.等人(2006)“单核吞噬细胞的HIV-1感染：AIDS中细菌性先天免疫缺陷的情况(HIV-1 Infection Of Mononuclear Phagocytic Cells:The Case ForBacterial Innate Immune Deficiency In AIDS)”，柳叶刀传染病(Lancet Infect.Dis.)6：794-804)。因此，所披露的抗B7-H4抗体作为用于HIV感染以及AIDS治疗的治疗剂具有特别用途。如此处使用的，术语“癌症”是指起因于细胞的非正常不受控制的生长的一种赘生物或肿瘤。如此处使用的，癌症明确地包括白血病以及淋巴瘤。该术语是指涉及如下细胞的一种疾病，所述细胞具有转移至末端位点的潜力，并且展现与非癌细胞不同的表型性状，例如，在一种三维基质诸如软琼脂中形成集落或在一种三维基底膜或细胞外基质制品中形成管状网络或网状矩阵。非癌细胞不在软琼脂中形成集落和在一种三维基底膜或细胞外基质制品中形成不同的球体样结构。
认为B7-H4的表达代表了在这些效应细胞的水平下调抗肿瘤免疫性(特别地为T-细胞应答)的机制。因此，阻滞B7-H4介导的信号转导(特别是表达于癌细胞或肿瘤相关巨噬细胞的表面上的B7-H4，特别是在肿瘤微环境中)，可用于增加抗肿瘤免疫应答并且减少该癌症的一个或多个症状。治疗癌症(包括由增加无细胞的B7-H4的表达表征的癌症)的方法典型地包括以减少B7-H4介导的信号转导、肿瘤相关巨噬细胞依赖性B7-H4介导的信号转导、或肿瘤依赖性B7-H4介导的信号转导的有效量，向有需要的受试者给予跨膜B7-H4或其受体的拮抗剂，或其组合。
以上讨论了B7-H4介导的信号传导的适合的拮抗剂，包括此处披露的用于治疗癌症的抗体。治疗癌症的方法可包括向该受试者给予一种结合到跨膜B7-H4并且预防、减少、阻滞、或抑制跨膜B7-H4介导的免疫压制的抗体。在一个优选实施例中，该抗体结合到B7-H4的IgC域。在一些实施例中，该抗体引起B7-H4内化，导致降低细胞表面上跨膜B7-H4的可用性并且降低跨膜B7-H4介导的免疫压制。认为内化的B7-H4被引导至酸性溶酶体隔室中，在此处它降解并因此不再有效于介导免疫压制性信号转导。这样的方法也可用于治疗逃避了机体针对由B7-H4介导的免疫压制的感染的免疫应答的细菌性、病毒性、以及其他感染。
在一些实施例中，该抗体轭合到一种活性剂上。该活性剂可以是，例如，细胞毒性剂诸如化学治疗药，或放射性同种型。在结合到跨膜B7-H4时，该抗体及其细胞毒性有效载荷可以被靶细胞内化。以此方式，该抗体-药物轭合物可进行对这些靶细胞的选择性破坏。本领域中已知适合的药物轭合物连同制备抗体-药物轭合物以及在治疗免疫失调以及癌症中使用抗体-药物轭合物的方法。参见例如，美国公开申请号2012/0288512，其描述了抗CD70-药物轭合物，确切地通过引用以其全文结合。
靶细胞包括但不限于表达B7-H4的细胞，例如，当未转化时典型地不表达B7-H4的转化细胞，或与对照细胞相比由增加的表达而表征的细胞。优选的靶细胞包括癌细胞以及肿瘤相关巨噬细胞。在一些实施例中，该组合物被直接给予至该肿瘤或肿瘤微环境以增强该组合物至该肿瘤位点的定位并降低对表达B7-H4的非靶细胞的毒性。
在一些实施例中，结合到IgC域的一种抗体是与结合IgV域的一种抗体相组合共给予的。
B7-H4特异性的活性剂可独自给予，或与常规癌症疗法，例如化疗、放疗和外科手术组合给予。
可以由所披露的方法以及组合物治疗或预防的癌症和相关失调包括但不限于以下：白血病，包括但不限于急性白血病，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(诸如成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病(erythroleukemia leukemias)以及骨髓增生异常综合症)，慢性白血病，诸如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，诸如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多发性骨髓瘤，诸如但不限于焖燃型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤以及髓外型浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；意义未明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨和结缔组织肉瘤，诸如但不限于骨肉瘤、骨原性肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳房癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特氏病、以及炎性乳腺癌；肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，诸如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和未分化甲状腺癌；胰腺癌，包括但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，包括但不限于库欣氏症、催乳素分泌肿瘤、肢端肥大症、和糖尿病尿崩症；眼癌，包括但不限于眼黑色素瘤，如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、和睫状体黑色素瘤、以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、以及黑色素瘤；外阴癌，包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基细胞癌、肉瘤、以及佩吉特病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌、以及腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、生殖细胞瘤、以及间质肿瘤；食道癌，诸如但不限于鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌、以及燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，诸如但不限于腺癌、蕈伞型(息肉)、溃疡型、浅表扩散型、弥散扩散型、恶性淋巴瘤、脂肉瘤、纤雏肉瘤以及癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，诸如但不限于肝细胞癌以及肝母细胞瘤；胆囊癌，包括但不限于腺癌；胆管癌，包括但不限于乳头状、结节性以及弥漫性；肺癌，包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(上皮癌)、腺癌、大细胞癌以及小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、退化发育、经典(典型)、精母细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)；前列腺癌，包括但不限于腺癌，平滑肌肉瘤以及横纹肌肉瘤；阴茎癌(penal cancer)；口癌，包括但不限于鳞状细胞癌；基底癌症；唾液腺癌症，包括但不限于腺癌，粘液表皮样癌、以及腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌以及疣型；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌以及黑色素瘤、浅表性扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、小痣恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌，包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；韦尔姆斯氏肿瘤；膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌以及乳头状腺癌(为了综述此类失调，参见菲什曼(Fishman)等人，1985，医药(Medicine)，第2版，J.B.利平科特公司(Lippincott Co.)，费城(Philadelphia)以及墨菲(Murphy)等人，1997，明智的决策：癌症诊断、治疗和恢复全书(Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,andRecovery)，海盗企鹅(Viking Penguin)，美国企鹅图书公司，美利坚合众国)。
因此，所披露的方法以及组合物在治疗或预防多种癌症(具体地，卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、甲状腺癌、以及子宫癌)或包括(但不限于)以下的其他异常增生性疾病中也是有用的：癌，包括膀胱、乳房、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰、胃、宫颈、甲状腺、以及皮肤的癌，包括鳞状细胞癌；淋巴系统的造血肿瘤、包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Berketts)淋巴瘤、骨髓系统的造血细胞肿瘤，包括急性以及慢性髓细胞白血病以及前髓细胞白血病；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤以及横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌(tetratocarcinoma)、成神经细胞瘤以及神经胶质瘤；中央以及外周神经系统肿瘤，包括星形胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、以及神经鞘瘤；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及骨肉瘤；以及其他的肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病(xenoderma pegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌症以及畸胎癌(teratocarcinoma)。还考虑的是，由细胞凋亡失常引起的癌症也将通过在此披露的方法和组合物来治疗。此类癌症可以包括但不限于滤泡性淋巴瘤，伴有p53突变的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤以及癌前病变如家族性腺瘤样息肉病和脊髓发育不良综合征。在特定实施例中，通过所披露的方法和组合物在卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰腺、或子宫中治疗或预防恶性肿瘤或异常增殖性变化(如化生和发育异常)或过度增殖性失调。在其他特定实施例中，通过提供的方法以及组合物治疗或预防肉瘤、黑色素瘤、或白血病。
虽然通过不同机制，癌细胞在其发育过程中均获得一组特征性的功能能力。此类能力包括逃避凋亡、生长信号上的自给自足、对抗生长信号不敏感、组织浸润/转移、无限的发展潜力(explicative potential)、以及持续的血管生成。术语“癌细胞”意在包含变恶性癌前细胞和恶性癌细胞两者。在一些实施例中，癌症是指良性瘤，其保持在局部。在其他实施例中，癌症是指恶性肿瘤，其已经侵入和破坏邻近的身体结构并扩散到远处部位。在又其他实施例中，该癌症与一种特异性癌抗原(例如，pan-癌抗原(KS 1/4)、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、HER2/neu等)关联。
类似于如上讨论的其在肿瘤上的应用，这些抗体和抗原结合片段可单独使用，或作为一种佐剂与疫苗或抗微生物剂组合，以刺激针对如下的免疫应答：毒素或自身抗原或病原体(例如，病毒，诸如HIV、HTLV、肝炎病毒、流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、牛痘病毒、狂犬病毒；细菌，诸如分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌(Conococci)、克雷白氏菌属、变形菌、沙雷氏菌属、假单胞菌属、军团杆菌属、棒状菌、沙门氏菌、弧菌属、梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌、巴斯德菌属、细螺旋体病、博德特菌属的那些，并且具体地与霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、和莱姆病关联的此类病原体；或真菌或寄生病原体，诸如念珠菌属(白色念珠菌、克鲁氏念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新生隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌目的属(Genus Mucorales)(毛霉属、犁头霉属、根霉菌属(rhizophus))、孢子丝菌(申克氏)、芽生菌(皮炎)、副球孢子菌(巴西)、球孢子菌(粗)及组织胞浆菌(荚膜)、以及由以下寄生虫：内阿米巴属(溶组织内(histolytica))、结肠小袋纤毛虫、福勒氏耐格里原虫、棘阿米巴属种、兰伯贾第虫、隐孢子虫属种、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、冈氏(Toxoplasma gondi)等)、孢子丝菌属、芽生菌鼠、副球孢子菌属、球孢子菌属、组织胞浆菌属、内阿米巴属(溶组织内(Histolytica))、肠袋虫属、耐格里属、棘阿米巴属、贾第虫属、隐孢子虫属、肺囊虫属、疟原虫属、巴贝虫属、或锥虫属等。因此，这些抗体和抗原结合片段在治疗感染性疾病中可以使用。
如上指示的，所披露的抗体和抗原结合片段的一个特别优选的用途是结合到并且优选地基本上阻滞肿瘤细胞或TAM以便调节其免疫压制性活性。此外，此类抗体可用于耗尽肿瘤微环境内的表达B7-H4的肿瘤细胞或TAM，或耗尽外周血中它们的TAM浓度。在一个实施例中，此类调节或耗尽是使用结合到一个位点的抗B7-H4抗体完成的，以便损坏或破坏正常的B7-H4功能。作为此类破坏的结果，TAM活性被降低(调节)，和/或肿瘤中巨噬细胞的实际或有效(功能性)浓度被耗尽。可替代地，这种调节或耗尽是使用轭合至一种毒素的抗B7-H4抗体完成的，使得其与一种肿瘤细胞或TAM的结合导致该肿瘤细胞或巨噬细胞的死亡。优选地，在任一个实施例中，该抗体的Fc区的序列已经缺失(例如，Fab或F(ab)2等)或被修饰，使得该分子展现减弱的或无Fc受体(FcR)结合活性，或展现增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。展现减弱的或无Fc受体结合活性的Fc区域的抗体优先充当防止肿瘤或TAM上的B7-H4与肿瘤微环境中T细胞上的一个或多个抑制性受体相互作用的阻滞剂。另一方面，使用具有展现出增强的对ADCC或CDC的诱导的Fc区域的抗体将优先用于引起表达了B7-H4的肿瘤细胞或TAM的耗尽。
2.免疫系统的下调剂的使用
可以采用该抗B7-H4抗体来产生抗独特型肽或抗体(沃尔曼(Wallmann)，J.等人(2010)“过敏症中的抗Id：一个经典概念的及时性(Anti-Ids in Allergy:Timelinessof a Classic Concept)”，世界过敏症组织期刊(World Allergy Organiz.J.)3(6)：195-201；纳迪(Nardi)，M.等人(2000)“针对血小板抗GpIIIa的抗独特型抗体有助于调节HIV-1-ITP患者中的血小板减少(Antiidiotype Antibody Against Platelet Anti-GpIIIa Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP Patients)”，实验医学杂志(J.Exp.Med.)191(12)：2093-2100)或B7-H4的模拟物(臧(Zang)，Y.C.等人(2003)“由对应于髓鞘碱性蛋白-反应性T细胞中的常见CDR3序列基序的TCR肽诱导的人抗独特型T细胞(Human Anti-Idiotypic T Cells Induced ByTCR Peptides Corresponding To A Common CDR3Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells)”，国际免疫杂志(Int.Immunol.)15(9)：1073-1080；洛伊阿罗(Loiarro)，M.等人(电子出版2010年4月8日)“人类疾病中的靶向TLR/IL-1R信号传导(Targeting TLR/IL-1R Signalling In Human Diseases)”，炎症介质(MediatorsInflamm.)2010：674363)。此类分子充当B7-H4的替代，并且激动或增强B7-H4受体活性，并因此其至一个受试者的给予通过模仿或促进B7-H4结合来下调此类受试者的免疫系统。因此，可在治疗炎症和自身免疫疾病中使用此类分子。
对免疫系统的下调在治疗炎症性以及自身免疫疾病中是希望的，是对移植排斥，移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病的一种应答。可通过给予披露的这些抗体治疗的自身免疫失调的实例包括但不限于斑形脱发、僵直性脊椎炎、抗磷脂综合症、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺的自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎以及睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜湾性皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能紊乱综合症(CFIDS)、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、肢端硬化综合症(CREST syndrome)、冷凝集素疾病、克罗恩氏疾病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维性肌炎、急性肾小球肾炎、格拉夫疾病、格林-巴利综合症(guillain-barre)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、青少年性关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、耳性眩晕病、混合结缔组织病、多发性硬化症、视神经脊髓炎(NMO)、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性结节性动脉炎、多发性软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多发性肌炎以及皮肤肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、夏科氏肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon)、赖特氏综合症(Reiter'ssyndrome)、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、修格连氏综合症、僵人综合症、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、高安氏动脉炎(Takayasu arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癜风以及韦格纳氏肉芽肿(Wegener's granulomatosis)。
可根据所披露的方法预防、治疗或管理的炎性失调的实例包括但不限于哮喘、脑炎、发炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏病症、败血性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节炎(undifferentitated spondyloarthropathy)、未分化的关节炎、关节炎、炎性骨质溶解以及慢性病毒性或细菌性感染所致的慢性炎症。
因此，所披露的抗体和抗原结合片段可在治疗炎症性以及自身免疫疾病中使用，是对移植排斥，移植物抗宿主疾病以及宿主抗移植物疾病的一种应答。
D.给药方法
各种递送系统是己知的并且可以用于给予所披露的治疗或预防组合物，例如，封装在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如，吴(Wu)等人，1987，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：4429-4432)，构建作为一个逆转录病毒或其他载体的部分的核酸等。
给予免疫球蛋白分子(例如抗体、双抗体、融合蛋白等)的方法包括但不限于：肠胃外给予(例如，真皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的以及皮下的)、硬膜外给予、以及粘膜给予(例如，鼻内途径和口腔途径)。在一个特定实施例中，这些抗体是经肌内、静脉内、或皮下给药的。可以通过以下方式给予这些组合物：例如通过输注或单次快速静脉注射(bolus injection)、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜，等等)吸收，并且可以将其与其他生物活性剂一起给予。给药可以是全身性的或局部的。此外，也可以例如通过使用吸入器或雾化器以及具有雾化剂的配制品而采用肺部给药。参见，例如美国专利号6,019,968；5,985,20；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；以及4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；以及WO99/66903。在一个特定实施例中，可能期望将该药物组合物局部给予到需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于下列方式实现：局部输注：通过注射或通过植入物的方式，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶的材料，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。优选地，当给予一种抗体时，应注意使用不会吸收该抗体或该融合蛋白的材料。
在一些实施例中，该人源化或嵌合抗体是以脂质体配制用于靶向递送这些抗体。脂质体是由同心有序的磷脂双分子层组成的囊泡，其封装水相。脂质体典型地包括不同类型的脂类、磷脂和/或表面活性剂。脂质体的组分是以双层构型安排的，类似于生物膜的脂类安排。脂质体是特别优选的递送运载体，部分归因于其生物相容性、低免疫原性、以及低毒性。用于制备脂质体的方法是本领域中已知的，参见，例如，爱泼斯坦(Epstein)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，82：3688；黄(Hwang)等人，1980美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77：4030-4；美国专利号4,485,045以及4,544,545。
也提供了制备具有延长的血清半衰期即增强的循环时间的脂质体的方法，诸如披露于美国专利号5,013,556中的那些。在所披露的方法中使用的优选脂质体不是迅速地从循环中清除的，即未被吸收至单核吞噬细胞系统(MPS)中。
所披露的分子也可被配制为免疫脂质体。免疫脂质体是指一种脂质体组合物，其中一种抗体或其一个片段被共价或非共价地连接到该脂质体表面。连接一种抗体至该脂质体表面的化学是本领域中已知的，参见例如美国专利号6,787,153；艾伦(Allen)等人，1995，隐形脂质体(Stealth Liposomes)，博卡拉顿：CRC出版社(Boca Rotan:CRC Press)，233-44；汉森(Hansen)等人，1995，生物化学和生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1239：133-144。
所披露的分子可以被包装在指明抗体的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。在一个实施例中，这些抗体是作为一种处于密封容器中的干燥的无菌冻干粉或无水浓缩物来提供，并且可以用水或盐水重构至用于给予受试者的适当浓度。优选地，这些抗体是作为一种干燥的无菌冻干粉在密封容器中按以下单位剂量提供的：至少5mg、更优选地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、或至少75mg。冻干的抗体应在2℃与8℃之间在其原始容器中储存，并且这些抗体在重构之后应在12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内给予。在一个可替代实施例中，抗体是以液体形式在指明该抗体的量和浓度的密封容器中提供的。优选地，液体形式的抗体是在密封容器中以至少1mg/ml、更优选至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml的抗体提供。
配制品中采用的精确剂量还将取决于给药途径和病症的严重性，并且应当根据执业医师的判断和每一患者的情况来决定。可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推出有效剂量。对于抗体，给予至患者的剂量典型地是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，给予至患者的剂量是0.0001mg/kg以及20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg之间，0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重。通常，人抗体在人体内相比其他物种具有更长的半衰期，归因于对外来多肽的免疫应答。因此，更低剂量的人抗体以及更小频率给予常常是合适的。进一步，给予抗体或其片段的剂量和频率可通过增强这些抗体的摄取以及组织渗透性(通过修饰诸如，例如脂化)来减少。
在又另一个实施例中，可以在控释或持续释放系统中递送这些组合物。可使用本领域的普通技术人员已知的任何技术来产生包括一种或多种抗体的持续释放配制品。参见，例如美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；宁(Ning)等人，1996，“使用持续释放凝胶进行的人类结肠癌异种移植物的瘤内放射免疫治疗(Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Usinga Sustained-Release Gel)”，放射治疗&肿瘤学(Radiotherapy&Oncology)39：179-189，桑(Song)等人，1995，“长循环乳剂的抗体介导的肺部靶向(Antibody MediatedLung Targeting of Long-Circulating Emulsions)”，药物科学&技术的PDA杂志(PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology)50：372-397；克里克(Cleek)等人，1997，“用于心血管应用的bFGF抗体的生物可降解聚合载体(Biodegradable PolymericCarriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application)”，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；以及兰(Lam)等人，1997，“用于局部递送的重组人源化单克隆抗体的微囊化(Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery)”，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759--760。在一个实施例中，一种泵可被用于控释系统(参见兰格(Langer)，同上；塞夫顿(Sefton)，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；布赫瓦尔德(Buchwald)等人，1980，外科手术(Surgery)88：507；以及索德科(Saudek)等人，1989，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)321：574)。在另一个实施例中，聚合材料可用以实现抗体的控释(参见例如，控释的医学应用(Medical Applications of ControlledRelease)，兰格(Langer)以及怀斯(Wise)(编辑)，CRC出版社，博卡拉顿，佛罗里达(1974)；受控的药物生物利用率，药物产物设计以及性能(Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance)，斯莫伦(Smolen)以及鲍尔(Ball)(编辑)，威利，纽约(1984)；兰杰(Ranger)以及佩帕斯(Peppas)，1983，大分子科学综述杂志大分子化学(J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)23：61；还参见利维(Levy)等人，1985，科学(Science)228：190；杜林(During)等人，1989，神经学年鉴(Ann.Neurol.)25：351；霍华德(Howard)等人，1989，神经外科杂志(J.Neurosurg.)71：105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253)。用于持续释放配制品中的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、以及聚原酸酯。在又另一个实施例中，可以将控释系统置于治疗靶标(例如肺)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如古德森(Goodson),控释的医学应用(Medical Applications of ControlledRelease)，同上，第2卷，第115-138页(1984))。在另一个实施例中，根据邓恩(Dunn)等人(参见U.S.5,945,155)使用可用于作为控释移植物的聚合组合物。这种具体的方法是基于来自该聚合物系统的生物活性材料的原位控释的治疗效果。移植通常可发生在需要治疗性治疗的患者的体内的任何处。在另一个实施例中，使用一个非聚合持续递送系统，借此该受试者的体内的非聚合移植物被用作药物递送系统。在体内移植时，该移植物的有机溶剂会从该组合物消散、分散或浸出至周围组织液中，并且该非聚合材料会逐渐凝结或沉淀以形成实心微孔基质(参见U.S.5,888,533)。控释系统在兰格(Langer)的综述中讨论(1990，科学(Science)249：1527-1533)。可以使用本领域的普通技术人员已知的任何技术来生产包括一种或多种治疗剂的持续释放配制品。参见，例如美国专利号4,526,938；国际公开号W091/05548和W096/20698；宁(Ning)等人，1996，放射治疗&肿瘤学(Radiotherapy&Oncology)39：179-189；桑(Song)等人，1995，药物科学&技术的PDA杂志(PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology)50：372-397；克里克(Cleek)等人，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；以及兰(Lam)等人，1997，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760。
在一个特定实施例中，其中该治疗或预防组合物包括编码一种抗体或其一个抗原结合片段的一种核酸，该核酸可体内给予以促进其编码的抗体的表达，通过将其构建为适当的核酸表达载体的部分并且将它给予以便其进入细胞内，例如，通过使用一种反转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，一种基因枪；生物射弹的，杜邦公司(Dupont))，或用脂类或细胞表面受体或转染剂涂覆，或通过与已知进入细胞核的一种同源框样肽连接来给予它(参见例如，约里奥(Joliot)等人，1991，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：1864-1868)等。可替代地，核酸可以引入细胞内且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。
用治疗有效量或预防有效量的抗体对受试者进行的治疗可以包括一种单一治疗、或优选地可以包括一系列治疗。
E.组合治疗
此处披露的分子还可与本领域内普通技术人员已知的一个或多个其他治疗组合给予用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、感染性疾病或中毒，包括但不限于当前标准的以及实验性化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法、或外科手术。在一些实施例中，这些分子是与治疗或预防有效量的一个或多个药剂、治疗抗体或本领域内普通技术人员已知的其他药剂组合给予的，以用于治疗和/或预防癌症、自身免疫疾病、感染性疾病或中毒。此类药剂包括例如所披露的生物反应调节剂、细胞毒素、抗代谢药、烷基化剂、抗生素、或抗有丝分裂剂中的任一种，连同免疫治疗剂(例如ERBITUXTM(也被称为IMC-C225)(ImClone系统公司)，即一种针对EGFR的嵌合的单克隆抗体；(Trastuzumab)(基因技术公司(Genentech)，CA)，其是用于治疗患有转移性乳腺癌的患者的一种人源化抗HER2单克隆抗体；(阿昔单抗)(山陶克公司(Centocor))，其是用于防止凝块形成的血小板上的一种抗糖蛋白IIb/IIIa受体；(达利珠单抗)(罗氏药物(RochePharmaceuticals)，瑞典)，其是用于预防急性肾同种异体移植排斥的一种免疫压制性人源化抗CD25单克隆抗体。其他实例是一种人源化抗CD18 F(ab')2(基因技术公司(Genentech))；CDP860，其是一种人源化抗CD18 F(ab')2(细胞技术公司(Celltech)，UK)；PRO542，其是与CD4融合的一种抗HIV gp120抗体(普罗杰尼克(Progenics)/遗传酶转基因公司(Genzyme Transgenics))；C14，其是一种抗CD14抗体(ICOS药物公司)；一种人源化抗VEGF IgG1抗体(基因技术公司(Genentech))；OVAREXTM，其是一种鼠抗CA 125抗体(Altarex)；PANOREXTM，其是一种鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素威康(GlaxoWellcome)/山陶克公司(Centocor))；IMC-C225，其是一种嵌合抗EGFR IgG抗体(ImClone系统)；VITAXINTM，其是一种人源化抗αVβ3整联蛋白抗体(应用分子演化公司(Applied Molecular Evolution)/米迪缪尼(MedImmune))；Campath 1H/LDP-03，其是一种人源化抗CD52IgG1抗体(Leukosite)；斯马特(Smart)M195，其是一种人源化抗CD33 IgG抗体(蛋白设计实验室(Protein Design Lab)/嘉娜宝(Kanebo))；RITUXANTM，其是一种嵌合抗CD20IgG1抗体(IDEC药物公司/基因技术公司(Genentech)，罗氏/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其是一种人源化抗CD22IgG抗体(免疫医疗公司(Immunomedics))；斯马特(Smart)ID10，其是一种人源化抗HLA抗体(蛋白设计实验室)；ONCOLYMTM(Lym-1)是一种放射性标记的鼠抗HLA DR抗体(技术克隆公司(Techniclone))；抗CD11a是一种人源化IgG1抗体(基因技术公司/Xoma)；ICM3TM是一种人源化抗ICAM3抗体(ICOS药物公司)；IDEC-114TM是一种灵长动物化抗CD80抗体(IDEC药物公司/三菱公司(Mitsubishi))；ZEVALINTM是一种放射性标记的鼠抗CD20抗体(IDEC/先灵(Schering)AG)；IDEC-131TM是一种人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫材(Eisai))；IDEC-151TM是一种灵长动物化抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152TM是一种灵长动物化抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3是一种人源化抗CD3IgG(蛋白设计实验室)；5G1.1TM是一种人源化抗补体因子5(C5)抗体(亚力兄药物公司(Alexion Pharm))；IDEC-151TM是一种灵长动物化抗CD4 IgG1抗体(IDEC药物公司/史克必成(SmithKline Beecham))；MDX-CD4TM是一种人抗CD4 IgG抗体(梅达瑞克斯(Medarex)/卫材/Genmab)；CDP571TM是一种人源化抗TNF-α IgG4抗体(细胞技术公司(Celltech))；LDP-02TM是一种人源化抗α4β7抗体(LeukoSite/基因技术公司(Genentech))；OrthoClone OKT4ATM是一种人源化抗CD4 IgG抗体(奥多生物技术(Ortho Biotech))；ANT虫卵TM是一种人源化抗CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM是一种人源化抗VLA-4 IgG抗体(埃朗(Elan))；MDX-33TM是一种人抗CD64(FcγR)抗体(梅达瑞克斯/Centeon)；rhuMab-E25TM是一种人源化抗IgE IgG1抗体(基因技术公司(Genentech)/诺华/唐纳克斯生物系统(Tanox Biosystems))；IDEC-152TM是一种灵长动物化抗CD23抗体(IDEC药物公司)；ABX-CBLTM是一种鼠抗CD-147 IgM抗体(安根尼克斯(Abgenix))；BTI-322TM是一种大鼠抗CD2 IgG抗体(米迪缪尼/生物移植(Bio Transplant))；Orthoclone/OKT3TM是一种鼠抗CD3IgG2a抗体(奥多生物技术)；SIMULECTTM是一种嵌合抗CD25IgG1抗体(诺华药物公司(Novartis Pharm))；LDP-01TM是一种人源化抗β2-整联蛋白IgG抗体(LeukoSite)；抗LFA-1TM是一种鼠抗CD18 F(ab')2(巴斯德(Pasteur)-梅里埃(Merieux)/免疫技术(Immunotech))；猫-152TM是一种人抗TGF-β2抗体(剑桥Ab技术(Cambridge Ab Tech))；以及Corsevin MTM是一种嵌合抗因子VII抗体(山陶克公司(Centocor))等)。在另一个实施例中，所披露的分子是与如下分子组合给予的，所述分子破坏或增强可替代的免疫调节通路(例如CTLA4、TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H1、PD-1、LIGHT或LAG3)或调节效应物分子诸如细胞因子(例如IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、GF-β、IFNg、Flt3、BLys)以及趋化因子(例如，CCL21)的活性以便增强免疫调节影响。在又另一个实施例中，所披露的分子是与如下分子组合给予的，所述分子活化免疫应答的不同阶段或方面以便实现更广泛的免疫应答。例如，用一种抗B7-H4分子阻滞肿瘤介导的或TAM介导的免疫压制可以与如下分子组合，所述分子增强T细胞活化或引发以便实现更稳健的免疫应答。
在某些实施例中，将所披露的分子中的一种或多种与一种或多种可用于治疗癌症的其他治疗剂同步地给予至哺乳动物，优选人。术语“同步地”不限制于以精确相同的时间给予预防或治疗剂，而是意指以一个顺序并且在一个时间间隔内将两种药剂给予哺乳动物，以使得这两种药剂可一起起作用以提供与如果以另外方式给予它们的情况相比增加的效益。例如，每种预防或治疗剂(例如，化学疗法、放射疗法、激素疗法或生物治疗)可在相同的时间或以任何次序顺序地在不同时间点给予；然而，如果不是同时给予，应当在时间上足够接近地给予它们，以提供所希望的治疗或者预防效果，或以已显示提供治疗益处的方案进行。可以按任何适当形式并且通过任何适合的路径分开给予每种治疗剂。在不同实施例中，这些预防或治疗剂是间隔少于1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时给予的。在优选的实施例中，在同一次患者就诊(patent visit)中给予两个或更多个组分。
在其他实施例中，所披露的预防或治疗剂是间隔约2至4天、间隔约4至6天、间隔约1周、间隔约1至2周、或间隔超过2周给予的。在优选的实施例中，这些预防或治疗剂是以其中两种药剂仍有活性、或药效影响存在的一个时间范围给予的。本领域的普通技术人员将能够通过确定所给予的药剂的半衰期确定这样的时间框架。
在某些实施例中，所披露的预防或治疗剂是按周期给予至一个受试者的。周期治疗涉及在一个时间段给予一个第一剂，随后在一个时间段给予一个第二剂和/或第三剂并且重复此顺序给予。周期治疗可减少对这些疗法中一个或多个的耐受性的发展，避免或减少这些疗法之一的副作用，和/或改进治疗的效力。
在某些实施例中，所披露的预防或治疗剂是以少于约3周、约每两周一次，约每10天一次或约每周一次的周期给予的。一个周期可包括通过输注经每个周期约90分钟、每个周期约1小时、每个周期约45分钟给予一种治疗或预防剂。每个周期可包括至少1周休止、至少2周休止、至少3周休止。给予的周期的数目是从约1至约12个周期，更典型地从约2至约10个周期，以及更典型地从约2至约8个周期。
在又其他实施例中，该治疗以及预防剂是以有节奏的给药方案给予的，通过连续输注或频繁的给予而没有延伸的休止期。这种有节奏的给予可涉及以恒定间隔而没有休止期地给药。典型地，这些治疗剂，具体而言细胞毒性剂，是以更低剂量使用的。此类给药方案包括慢性按天给予相对低剂量持续延伸的时间段。在优选的实施例中，使用更低剂量可最小化有毒副作用并且消除休止期。在某些实施例中，这些治疗以及预防剂是通过范围从约24小时至约2天、至约1周、至约2周、至约3周至约1个月至约2个月、至约3个月、至约4个月、至约5个月、至约6个月的慢性低剂量或连续输注来递送的。此类剂量方案的进度安排可以由熟练的医生优化。
在其他实施例中，同步地向哺乳动物给予多个疗程，即，在一个时间间隔内分开给予单独剂量的治疗剂，使得所披露的分子可与其他一种药剂或多种药剂一起作用。例如，一个组分可与可每两周给予一次或每三周给予一次的其他组分组合而每周给予一次。换言之，用于这些治疗剂的给药方案是同步进行的，即使这些治疗剂未同时或在同一患者就诊中给予。
当与其他预防剂和/或治疗剂组合使用时，所披露的分子以及该预防的和/或额外的治疗剂可起叠加作用，或更优选地起协同作用。例如，在一些实施例中，一种抗体或其抗原结合片段是在相同的药物组合物中与一种或多种额外的治疗剂同步给予的。在另外的实施例中，一种抗体或其抗原结合片段是在分开的药物组合物中与一种或多种其他治疗剂同步给予的。在再另一个实施例中，所披露的分子中的一个或多个是在给予另一种预防或治疗剂之前或之后给予的。一种组合或同步治疗中的两种或更多种药剂可通过相同或不同给予途径(例如口服以及肠胃外)给予。在某些实施例中，当一种披露的分子与潜在地产生不利副作用(包括但不限于毒性)的一种第二预防剂或治疗剂同步给予时，该第二预防剂或治疗剂可以按照低于引出该不利副作用的阈值的剂量有利地给予。
此处提供的给药剂量和频率被术语治疗有效以及预防有效所包含。剂量以及频率进一步将典型地根据对于每一位患者而言特定的因素而变化，取决于所给予的特定的治疗性或预防性药剂，癌症的严重性和类型，给药途径，连同该患者的年龄、体重、反应、以及既往病史。适宜的方案可以由本领域的普通技术人员通过考虑到此类因素并且通过按照例如文献中所报道的以及在医师手册(Physician's Desk Reference)(第56版，2002)中所推荐的剂量进行选择。
F.药物组合物
提供了包括所披露的分子中的一个或多个的组合物。这些组合物包括在药用组合物的制造中有用的散装药物组合物(例如不纯的或非无菌的组合物)以及可用于单位剂型的制备的药用组合物(即适合于给予受试者或病人的组合物)。典型地，此类组合物包括在此披露的预防或治疗有效量的预防和/或治疗剂或那些药剂与药学上可接受的载体的组合。优选地，这些组合物包括预防或治疗有效量的所披露的人源化抗体或其抗原结合片段中的一种或多种以及药学上可接受的载体。
在一个特定的实施例中，术语“药学上可接受的”表示联邦或州政府的管理机构批准的或者在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内的使用。术语“载体”是指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂(如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或运载体。此类药物载体可以为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当该药用组合物是静脉内给药时，水是一种优选的载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以及类似试剂。如果希望的话，组合物还可包含少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放配制品等形式。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩剂，所述密封容器例如是指明活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注给予组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶配制。在通过注射给予组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可以在给药前将这些成分混合。
可将组合物配制成为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括但不限于由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
G.试剂盒
也提供了包括被所披露的人源化抗体或其抗原结合片段充满的一个或多个容器的药物包以及试剂盒。此外，一个或多个其他对治疗一种疾病有用的预防或治疗剂也可包括于药物包或试剂盒中。一个药物包或试剂盒包括填充有药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。可任选地，与这样一个或多个容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映该机构针对人类给予，对制造、使用或销售的许可。
包括所披露的人源化抗体或其抗原结合片段中的一个或多个的试剂盒可以用于所披露的方法中的一个或多个。例如，用于在治疗癌症中使用的一种试剂盒可包括在一个或多个容器中的一种或多种其他可用于治疗癌症的预防剂或治疗剂。在另一个实施例中，试剂盒包括一种或多种另外的抗体，例如结合一种或多种与癌症关联的一种或多种癌症抗原的细胞毒性抗体。在某些实施例中，另一种预防剂或者治疗剂是一种化学治疗剂。在其他实施例中，预防剂或治疗剂是一种生物的或激素的治疗剂。
H.诊断方法
所披露的抗B7-H4结合分子可用于诊断的目的，如检测、诊断或监测与B7-H4表达关联的疾病、失调或感染，或用以确定或协助确定或鉴定适合的患者群体或概况。对一种疾病、失调或感染特别是一种自身免疫疾病进行的检测或诊断可以包括：(a)使用免疫特异性地结合到此类抗原的一个或多个抗体(或其片段)测定B7-H4或其衍生物在一个受试者的细胞、血清、血浆、血液或组织样品中的表达；并且(b)将该抗原的水平与对照水平(例如，在正常组织样品中的水平)进行比较，借此相比于该抗原的对照水平而言该抗原的测定水平的增加或降低指示该疾病、失调或感染。在免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)以及荧光激活的细胞分选(FACS)中优选采用此类抗体以及片段。
在一些实施例中，这些抗体或片段被用于体外或原位组织样品或体内细胞中的IHC分析。例如，由于B7-H4具体地是由癌细胞而非正常组织表达的(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule Of The B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861；崔(Choi)，I.H.等人(2003)“B7-H4的基因组织形式与表达分析，一种B7家族的免疫抑制分子(Genomic Organization And ExpressionAnalysis Of B7-H4,An Immune Inhibitory Molecule Of The B7 Family)”，免疫学杂志(J.Immunol.)171：4650-4654)，通过此类细胞与此类抗体或片段的结合来检测其在一个细胞上的存在是对癌细胞的指示和诊断。因此，提供了用于诊断在受试者中癌症的存在的细胞学测定。
由于B7-H4在HIV感染时过表达(卡特(Carter)，C.A.等人(2008)“巨噬细胞的HIV-1感染的细胞生物学(Cell Biology Of HIV-1 Infection Of Macrophages)”，微生物学年报综述(Ann.Rev.Microbiol.)62：425-443；努尔萨迪吉(Noursadeghi)，M.等人(2006)“单核吞噬细胞的HIV-1感染：AIDS中细菌性先天免疫缺陷的情况(HIV-1 Infection Of Mononuclear Phagocytic Cells:The Case For Bacterial Innate ImmuneDeficiency In AIDS)”，柳叶刀传染病(Lancet Infect.Dis.)6：794-804)，B7-H4在此类细胞上的表达(如通过所披露的抗体和抗原结合片段检测的)可以用于在人中诊断HIV。
因此，这些抗体以及片段可以在检测以及诊断人的疾病、失调、或感染中使用。在一个实施例中，此类诊断包括：a)将有效量的此类标记的抗体或抗原结合片段给予至一个受试者(例如，经肠胃外、皮下、或腹膜内)；b)在给药后等待一个时间间隔以允许该标记的分子优先集中在受试者中B7-H4表达的部位(并且未结合的标记的分子被清除至背景水平)；c)测定背景水平；并且d)检测该受试者中的标记的抗体，使得在背景水平之上对标记的抗体的局部检测指示该受试者患有该疾病、失调、或感染。根据此实施例，可以用一个成像部分标记该抗体，该成像部分可使用本领域的普通技术人员已知的成像系统在体内检测到。背景水平可以通过不同方法确定，这些方法包括将所检测到的标记的分子的量与之前针对一个具体系统测定的标准值进行对比。
在本领域中应理解，该受试者和使用的成像系统的大小将决定需要用来产生诊断图像的成像部分的量。体内肿瘤显像描述于S.W.比尔谢尔(Burchiel)等人，“放射性标记的抗体及其片段的免疫药代动力学(Immunopharmacokinetics of RadiolabeledAntibodies and Their Fragments)”，(肿瘤显像：癌的放射化学检测(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer)，第13章，S.W.比尔谢尔(Burchiel)以及B.A.罗兹(Rhodes)编辑，马森出版公司(Masson Publishing Inc.)(1982)。
依赖于若干变量，包括所使用的标记的类型以及给予模式，在给药后用以允许该标记的分子优先集中在受试者的部位并且未结合的标记的分子被清除至背景水平的一个时间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施例中，给药后的时间间隔是5至20天或5至10天。
在一个实施例中，通过重复用于诊断疾病、失调或感染的方法对该疾病、失调或感染进行监测，例如，初次诊断一个月之后，初次诊断六个月之后，初次诊断一年之后等。
可以使用本领域中已知的用于体内扫描的方法在受试者中检测该标记的分子的存在。这些方法依赖于所使用的标记的类型。技术人员将能够确定用于检测一种具体的标记的适当的方法。可用于这些诊断方法的方法以及装置包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描诸如正电子发射体层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、以及超声检查。
在一个特定实施例中，该分子是用放射性同位素标记的，并且在患者中使用辐射响应外科仪器检测(瑟斯顿(Thurston)等人，美国专利号5,441,050)。在另一个实施例中，该分子是用荧光化合物标记的，并且在患者中使用荧光响应的扫描仪器检测。在另一个实施例中，该分子是用正电子发射金属标记的，并且在患者中使用正电子发射断层摄影检测。在又另一个实施例中，该分子是用顺磁标记来标记的，并且在患者中使用磁共振成像(MRI)检测。
本领域技术人员将认识到，或者仅采用常规实验能够确定与本文所述的本发明的具体实施例等同的许多实施例。此类等效物旨在由以下权利要求书涵盖。
实例1
抗人B7-H4抗体6H3的表征
材料和方法
将原初T(CD4+CD62L+)细胞首先从DO11.10小鼠分离并且在存在重组TGF-β(10ng/mL)、IL-6(50ng/mL)、IL-23(4ng/mL)、抗IL-4(1μg/mL)、抗IFN-γ(1μg/mL)以及抗IL-2(1μg/mL)加上OVA323-339脉冲处理的APC(APC/OVA)的情况下极化为Th17细胞用于OVA特异性的刺激。在存在5μg/mL的6H3的情况下，将鼠B7-H4 Ig或对照IgG在不同剂量直接添加至培养物中并且培养3天。为了增殖评估，在收获之前24小时添加1μci的[3H]-胸腺嘧啶核苷。通过胸腺嘧啶核苷掺入评估T细胞增殖(图2A)。将条件培养上清液针对IL-17产生进行分析(图2B)。
结果
使用多个独立途径以确立抗体6H3能够免疫特异性地结合到人B7-H4。在一个此类途径中，评估了该抗体阻滞B7-H4 Ig介导的对Th17(和Th1)分化的抑制的能力。因此，将来自8-9周大NOD小鼠的脾细胞在Th17极化条件下在存在对照Ig或鼠B7-H4.Ig的情况下用抗CD3/CD28培养3天。评估了抗体6H3(10mg/ml)中和B7-H4.Ig在培养物中的影响的能力。此实验的结果显示，如通过降低的胸腺嘧啶核苷掺入(图2A)连同降低的IL-17表达(图2B)显示的，给予B7-H4 Ig抑制了增殖。此抑制被抗体6H3的给予(或共给予)逆转。使用流式细胞术评估IL-17的产生。
在一个第二途径，在同种(allo)T细胞测定中评估该抗体的用以增强卵巢癌TAM共孵育后细胞的CTL应答的能力。图3A-3D显示，抗体6H3能够介导这样的一个增强的CTL应答(表2)。
在一个第三途径中，将抗体6H3针对其检测卵巢癌患者肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对B7-H4的表达的能力进行测试。如图4A-4I所示，抗体6H3检测此类细胞上的B7-H4。
为了确定抗体6H3结合到B7-H4的结合动力学，在RPMI完全培养基(10％FBS)中，在存在变化浓度的抗体(0、0.01ng、0.03ng、0.1ng、0.3ng、1ng、10ng、30ng、100ng、300ng、1000ng、3000ng、10000ng、或30000ng)的情况下，将表达全长人B7-H4的HEK293细胞进行孵育(在4℃用1x 105于200μl孔持续20分钟)。用一种第二抗体(抗人Ig PE、抗小鼠Ig APC、抗仓鼠Ig PE或抗大鼠IgPE)孵育之后使用FACS染色板分析(FACS Canto II)结合。该分析的结果在表3中显示。
在图5中用图形示出这些结果。
图6显示相对于其他抗B7-H4抗体(即，抗体H74、2D1、2H9、2E11以及8E11)而言，抗体6H3与人H7-H4结合的动力学。将B7-H4 Ig涂覆到微量滴定板，洗涤，阻滞，并且再洗涤。允许变化浓度的抗B7-H4抗体结合。对于克隆H74、6H3、以及8E11使用纯化的蛋白。使用来自杂交瘤2D1、2H9、以及2E11的条件培养基。在孵育以后，洗涤各板。使用HRP-轭合的山羊抗小鼠(杰克逊免疫研究(JacksonImmunoResearch))检测结合的抗B7-H4。
实例2
抗B7-H4抗体6H3识别B7-H4 IgC区
材料和方法
将稀释于PBS的由不同区段的B7-H4细胞外域组成的100μl 1μg/ml人IgG1 Fc融合蛋白在4℃固定于平底96孔板(科斯塔尔(Costar)9017)过夜。B7-H4融合蛋白包括变体1：SEQ ID NO：1的IgV残基29-149；变体2：SEQ ID NO：1的IgV残基29-154；变体3：SEQ ID NO：1的IgV残基29-158；变体4：ECD-hIgG4；变体5：SEQ ID NO：1的IgC残基154-259；变体6：ECD-hIgG1-SEQ ID NO：7)。将板用PBS+0.1％PS-20洗涤两次，并且在室温用200μl/孔PBS 10％FBS封闭1小时。将稀释于PBS 10％FBS中的滴定的小鼠抗人B7-H4抗体2H9、2D1、2E11、6H3、8E11或H74添加到这些板，并且在室温孵育1小时。将板洗涤三次，并且将100μl 1μg/ml抗小鼠Ig HRP(西格玛)添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。将板洗涤六次，并且将100μl TMB底物(SurModics)添加到每个孔中持续5-15min。将100μl终止液(0.1M硫酸)添加到每个孔中。在吸光度450nm通过珀金埃尔默(PerkinElmer)EnVision 210多标记读取器对各板读取。
结果
B7-H4的细胞外域包含一个IgV样域(SEQ ID NO：1的残基Ile 48-Phe 150)以及一个IgC样域(SEQ ID NO：1的残基Val 157-Gly 236)(西卡(Sica)，G.L.等人(2003)“B7-H4，B7家族的一种分子，负向调节T细胞免疫(B7-H4,A Molecule OfThe B7 Family,Negatively Regulates T Cell Immunity)”，免疫(Immunity)18：849-861)。该IgV样域包含针对CD28的完全结合位点；该IgC样域被认为参与针对CTLA4的亲和力方面的增加(参见，伊延(Inobe)，M.等人(1994)“B7的鼠同源物的可变剪接形式的鉴定(Identification Of An Alternatively Spliced Form Of The MurineHomologue Of B7)”，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)200(1)：443-449)。
为了确定抗体6H3识别的B7-H4域，将该抗体在存在具有定义的缺失的B7-H4变体的情况下进行孵育，并且测量结合的程度。此研究的结果指示，抗体6H3未结合到包含SEQ ID NO：1的残基29-149的B7-H4变体(变体1)或结合到包含SEQ IDNO：1的残基29-154的B7-H4变体(变体2)、或结合到包含SEQ ID NO：1的残基29-158的B7-H4变体(变体3)；但结合到包含B7-H4细胞外域(ECD)-hIgG4的B7-H4变体(变体4)，并且结合到包含SEQ ID NO：1的残基154-259的B7-H4变体(变体5)，并且结合到包含B7-H4 ECD-hIgG1-KRRSKQQS的B7-H4变体(变体6；KRRSKQQS是SEQ ID NO：7)(图7)。因此，抗B7-H4抗体6H3识别B7-H4 IgC区。
该分析也使用抗人B7-H4抗体2H9、2D1以及H74进行。抗B7-H4 mAb 2H9以及2D1的轻链和重链可变区的氨基酸序列如下(CDR被加下划线)；抗体H74是一种可商购抗人B7-H4抗体(e生物科学(eBioscience)，圣地亚哥，CA))：
抗人B7-H4克隆2H9
轻链可变区：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCWY QQKPGQPPKL
LIYGIPARFSGSG SRTDFTLTIN PVETDDVATY FC
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)
重链可变区：
EVQLVESGGN LVKPGGSLKL SCAASWVRQT PEKRLEWVA
RFTI SRDNAKNNLY LQMSHLKSED TALYYCAR
WGT GATVTVSS(SEQ ID NO：9)
抗人B7-H4克隆2D1
轻链可变区：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCW YLQKPGQSPN
LLIYGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC
FGAGTKLE LK(SEQ ID NO：10)
重链可变区：
EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASWVRQT PEKRLDWVA
RFTI SRDNAKNNLY LQMSHLKSED TAMYYCAR
WGQGT LVTVSA(SEQ ID NO：11)
此分析的结果示于图8A-8C，并且总结于表4中。
这些结果是使用蛋白质印记分析证实的。
实例3
抗人B7-H4抗体6H3具有相对于其他抗人B7-H4抗体而言意料之外的特征
材料和方法
将原初CD4+ T细胞(CD4+CD62L+)从DO11.10小鼠分离并且在存在增加浓度的人B7-H4 Ig加上10μg/mL的抗B7-H4 Ab的情况下，将其与从用OVA323-339肽脉冲处理的Balb/C小鼠中收获的已辐照的抗原递呈细胞(APC)一起培养3天。在胸腺嘧啶核苷掺入分析之前最后24小时在培养物中添加[3H]-胸腺嘧啶核苷。
结果
抗B7-H4抗体阻滞对T细胞活化的B7-H4 Ig介导的压制。为了证明抗体6H3的特殊性，在存在增加浓度的人B7-H4 Ig加上10mg/mL的抗B7-H4 mAb 2E11以及2H9的情况下，将原初CD4+ T细胞(从DO11.10小鼠分离)与已辐照的OVA特异性的抗原递呈细胞(APC)一起培养。抗B7-H4抗体2H9的轻链和重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：8-9。抗B7-H4抗体2E11的轻链和重链可变区的氨基酸序列如下(CDR被加下划线)：
抗人B7-H4克隆2E11
轻链可变区：
DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT VSCWFQQKPGQSP
KLLIYGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYC
FGTGTKL ELK(SEQ ID NO：12)
重链可变区：
EVKLVESEGG LVQPGSSMKL SCTASWVRQV PEKGLEWVA
RFII SRDNAKNILY LQMNSLKSED TATYYCAR
WGQGTT LTVSS(SEQ ID NO：13)
如图9所示，发现抗体6H3提供了针对T细胞活化的B7-H4 Ig介导的压制的最大阻滞。
比较了抗人B7-H4抗体逆转单核细胞介导的压制的能力，并且测量了T细胞产生的细胞因子。将来自健康供体的IFN-γ引发的单核细胞与抗B7-H4抗体、抗B7-H1抗体、抗PD-1抗体、或阴性对照抗体一起孵育。将自体的T细胞用抗CD3抗体活化，并且在存在抗体的情况下用预处理的单核细胞在10个T细胞/1个巨噬细胞的比率进行共孵育。收获T细胞并且针对CD4以及CD8染色，并且针对IL-2、TNF-α以及IL-8进行细胞内染色。图10A-10F显示了此实验的结果。发现抗体6H3引出IL-2、TNF-α以及IL-8的最高表达。在存在阴性对照抗体的情况下对所引发的单核细胞的孵育导致显著的单核细胞压制。在不存在单核细胞的情况下，不存在对T细胞活性的压制。
实例4
抗人B7-H4抗体6H3诱导B7-H4的细胞表面内化
材料和方法
为了证明抗人B7-H4抗体6H3诱导表达于细胞表面上的B7-H4(即，膜结合的B7-H4)的内化的能力，将抗体6H3以及对照抗体用CypHer5E NHS酯(在内化时在酸性溶酶体隔室处放射最大荧光的pH-敏感性菁染料)标记。将该CypHer5E-标记的6H3抗体与表达人B7-H4(293T.hB7-H4)的稳定的HEK 293T细胞系或用B7-H4阳性乳腺癌肿瘤细胞系SK-BR-3(ATCC)的细胞一起孵育，持续不同时间。抗体内化被测量为由流式细胞术使用BD FACS Canto II仪器确定的CypHer5E荧光的增加。
结果
研究的结果示于图11A-11B以及图12A-12B，并且揭示抗体6H3诱导表达于B7-H4转染细胞系以及B7-H4阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3两者的表面上的B7-H4的稳固内化。这种内化降低两个细胞系的表面B7-H4水平。这些结果证实，抗体6H3可用于靶向B7-H4阳性肿瘤、肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)以减少其各自的B7-H4表面水平并且抑制肿瘤或TAM B7-H4介导的免疫压制。这些结果另外证实，可以采用抗体6H3的轭合物(例如，药物毒素轭合物等)来选择性地靶向并且杀伤B7-H4阳性肿瘤、肿瘤细胞以及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。图12A-12B是直方图，显示了相对于在用CypHer标记的6H3孵育的过程中B7-H4阳性人乳腺癌细胞系SK-BR3细胞上的对照，随着时间的推移的B7-H4表面染色以及CypHer荧光。
实例5
抗人B7-H4抗体6H3能够通过IHC对B7-H4阳性细胞染色
材料和方法
通过IHC使用克隆6H3评价人组织样品中的B7-H4表达并且使用碱性过氧化物酶以及DAB进行检测；通过病理学家读取各玻片。还将来自相同样品的玻片使用在医用诊断中最广泛使用的染色剂苏木精和伊红染色(H+E)进行染色。
结果
为了证明抗人B7-H4抗体6H3检测B7-H4阳性细胞的能力，该抗体被标记并且在存在组织的情况下孵育。图13A-13C显示该抗体检测样品的B7-H4阳性肿瘤细胞的能力，这些样品在当该组织已被(H+E)染色时看起来是正常的。图13A和13B是在H+E染色中看起来正常的经6H3染色的唾液腺组织的图像。B7-H4似乎被导管上皮细胞最强表达(在两个图像的上部右侧看得最清楚)。存在腺泡细胞的少量表达(在底部右侧)。图13C显示卵巢的两个不同但相关的浆液性囊性损伤。左侧图是良性的(浆液性囊腺瘤)，并且右侧图是一种恶性的浆液性囊腺癌。在两个图中，上皮表达B7-H4，但恶性对应物更强烈于良性瘤中的情况，此处该表达显现在腔面加重；这种增加的强度被认为反映了B7-H4的过量表达。
实例6
抗人B7-H4抗体6H3的人源化
使用如下的工艺将鼠抗B7-H4抗体6H3人源化，该工艺包括产生一个同源建模抗体3D结构，并且基于结构建模建立亲本抗体的谱。产生一组人源化重链和轻链可变区序列，其每个将亲本抗体序列的特异性区域和人框架序列的大多数进行了组合。产生了总共6个人源化重链序列以及6个人源化轻链序列。
使用Geneious产生了对鼠抗体6H3的可变域与人种系框架序列和重排的框架序列数据库进行比较的序列比对。优选的受体框架是基于跨框架的整体序列一致性、匹配界面位置、类似地归类的CDR典型位置以及必须去除的N-糖基化位点的存在而鉴定的。
在Discovery Studio中产生鼠抗体6H3可变轻链以及重链的结构模型。模板结构是通过用6H3轻链和重链可变域序列(有和没有其CDR)搜索PDB数据库鉴定的。使用MODELLER进行6H3序列与模板的比对并且基于同源性对结构建模(萨利(Sali)，A.等人(1993)“通过空间约束的满意度进行的比较性蛋白质建模(Comparative Protein Modelling By Satisfaction Of Spatial Restraints)”，分子生物学(J.Molec.Biol.)234(3)：779-815)。
使用3D模式系统地分析多个将亲本抗体序列的不同区域与人框架的区域合并的杂交序列，以鉴定被预测对这些CDR的定义结构具有最少影响的杂交序列(乔西亚(Chothia)，C.等人(1987)“免疫球蛋白的高变区的典型结构(Canonical StructuresFor The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins)”，分子生物学(J.Mol.Biol.)196：901-917；马丁(Martin)，A.C.等人(1996)“同源蛋白质的环的结构家族：自动分类、建模和在抗体上的应用(Structural Families In Loops Of Homologous Proteins:Automatic Classification,Modelling And Application To Antibodies)”，分子生物学(J.Molec.Biol.)263(5)：800-815)。特别应注意包含如下氨基酸的杂交体序列，这些氨基酸来自人框架在CDR环的内，在韦尼耶(Vernier)区，在VH/VL链间界面中，或在CDR典型类别决定位置中，因为判断这些杂交序列很可能对所得到的人源化抗体的功能具有不利影响。
基于CDR分析以及结构建模建立该亲本抗体的谱。基于序列以及同源性比较鉴定人受体框架。通过建立将该亲本抗体序列的部分与人框架序列融合的多个杂交序列设计人源化抗体。使用3D模式，通过肉眼并且通过计算机建模有条理地分析这些人源化序列，以分离最可能保持抗原结合的序列。目标是使得最终的人源化抗体中的人序列的量最大化的同时保持原始抗体特异性。
产生比较了鼠6H3抗体可变域与人种系数据库的序列比对。基于整体序列一致性、匹配界面位置、以及类似地归类的DR典型位置，种系家族IGKV2-30*02被鉴定为该轻链的可能受体框架。在FR4和J-区段上将J-区段基因与亲本序列进行比较，并且针对轻链选择IGKJ4*01。在将亲本可变轻链与无冗余的数据库比对之后，重排的人κ轻链，CAA85590，被鉴定为一种第二可能受体框架。亲本(6H3)可变轻链与这些受体框架的比对示于表5中，不相同的残基以下划线示出。
发现鼠抗体6H3的重链最类似于种系IGHV1-46*03。在FR4和J-区段上将J-区段基因与鼠6H3重链序列进行比较，并且针对重链选择IGHJ4*01。在将亲本VL与无冗余的数据库比对之后，重排的人κ轻链，ABF83259，被鉴定为一种第二可能受体框架。鼠可变重链与这些受体框架的比对示于表6中。
对于轻链，针对两个受体框架IGKV2-30*02 IGKJ4*01和CAA85590中每个建立三条人源化链，从而形成六条人源化6H3轻链。针对每个受体框架(VL1A，VL2A)的第一人源化链包含大部分人框架(人源化轻链1)。针对每个受体框架(VL1B，VL2B)的第二人源化链包含一些量的与人框架序列融合的亲本序列，这应该有助于保持原始的CDR构象(人源化轻链2)。针对这些受体框架(VL1C，VL2C)中每个的第三人源化链包含甚至更多的与人框架融合的亲本序列，这应该有助于维持原始的抗体特异性以及CDR结构(人源化轻链3)。这些链的氨基酸序列是如下示出的。
抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体的轻链可变区的氨基酸序列，如源自于IGKV2-30*02 IGKJ4*01受体框架(CDR被加下划线示出)：
1.VL1A IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化1)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLNW FQQRPGQSPR
RLIYNRD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：18)
2.VL1B IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化2)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YQQRPGQSPR
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：19)
3.VL1C IGKV2-30*02 IGKJ4*01(人源化3)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YLQRPGQSPK
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGGGTKVE IK(SEQ ID NO：20)
抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体的轻链可变区的氨基酸序列，如源自于CAA85590受体框架(CDR被加下划线示出)：
1.VL2A CAA85590(人源化1)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLNW FQQRPGQSPR
RLIYNRD SGVPDRFSGS GSGADFTLKI SRVEAEDVGV YYC
FGQGTKVE IK(SEQ ID NO：21)
2.VL2B CAA85590(人源化2)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YQQRPGQSPR
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGQGTKVE IK(SEQ ID NO：22)
3.VL2C CAA85590(人源化3)：
DIVMTQTPLS LPVTLGQPAS ISCRSSLHW YLQRPGQSPK
VLIYNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFC
FGAGTKVE IK(SEQ ID NO：23)
对于重链，针对以上鉴定的IGHV1-46*03 IGHJ4*01以及ABF83259受体框架中的每个建立三条人源化链。以与轻链类似的方式，针对每个受体框架(VH1A，VH2A)的第一人源化链包含大部分人序列(人源化1)。针对每个受体框架(VH1B，VH2B)的第二人源化链应该有助于保持原始的CDR构象(人源化2)。针对这些受体框架(VH1C，VH2C)中每个的第三链应该有助于维持原始的抗体特异性以及CDR结构(人源化3)。这些链的氨基酸序列是如下示出的。
抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体的重链可变区的氨基酸序列，如源自于IGHV1-46*03 IGHJ4*01受体框架(CDR被加下划线示出)：
1.VH1A IGHV1-46*03IGHJ4*01(人源化1)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMHWVRQA PGQGLEWMGI
SY AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：24)
2.VH1B IGHV1-46*03 IGHJ4*01(人源化2)：
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQGLEWMGI
SY NQKFQGRVTL TVDKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：25)
3.VH1C IGHV1-46*03 IGHJ4*01(人源化3)：
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQGLEWIGI
SY NQKFKGRVTL TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：26)
抗人B7-H4抗体6H3的人源化变体的重链可变区的氨基酸序列，如源自于ABF83259受体框架(CDR被加下划线示出)：
1.VH2A ABF83259(人源化1)：
QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASIHWVRQA PGQSLEWMGW
KY SQKFQGRVTV ARDTSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：27)
2.VH2B ABF83259(人源化2)：
EVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASGYTFTMNWVRQA PGQSLEWMGV
TY NQKFQGRVTV AVDKSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：28)
3.VH2C ABF83259(人源化3)：
EVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKASMNWVRQA PGQSLEWIGV
TY NQKFQGRVTV TVDKSATTAY MELSSLRSED TAVYYC
WGQGTL VTVSS(SEQ ID NO：29)
此处披露的这些抗体及其抗原结合片段包括抗人B7-H4抗体6H3的所披露的人源化变体的36个组合中的任一个。确切地，此类抗体包括示于表1中的组合。
构建的三十六种人源化变体中的二十种保留了与人B7-H4的结合特异性。结合B7-H4但未进一步在功能测定中研究的六个额外的重链以及轻链组合是：H1A L1C(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：20)、H1A L2C(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：23)、H1B L1B(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：19)、H1B L1C(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：20)、H1B L2B(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：22)以及H1B L2C(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：23)
实例7
嵌合的以及人源化6H3抗体被细胞内化
材料和方法
抗B7-H4抗体6H3的嵌合和人源化变体
在如下的实例中嵌合的6H3(也称为人嵌合6H3、c6H3以及hc6H3)是指包括小鼠轻链和重链可变区(SEQ ID NOS：3以及5)以及来自人IgG1重链以及人κ轻链的恒定区的嵌合的6H3抗体。
在如下的实例中制备了具有表7的轻链可变区以及重链可变区组合的6H3的人源化变体并称为变体1-14(也称为V1-V14)。
表7：抗B7-H4抗体6H3的人源化变体
内化测定
EG7细胞
将用pH-敏感的荧光素CypHER-5标记的嵌合6H3以及人源化6H3变体针对内化至EG7(B7-H4阴性细胞)、EG7.IG7(B7-H4低表达细胞)、以及EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)中进行测试。
根据以下条件处理细胞：4℃，0.1％叠氮化物，30min(有利于“无”内化)；4℃，30min；或37℃；4小时(有利于内化)并且通过流式细胞术分析。
624mel/hB7-H4稳定系
也在624mel/hB7-H4稳定细胞系中检验嵌合的抗B7-H4抗体(c2E11、c2H9、c2D1、c6H3)以及人变体抗B7-H4抗体内化。简言之，将细胞用CypHer5-标记的抗B7-H4抗体(10μg/ml)脉冲处理30分钟，洗涤一次以去除未结合的探针并且在37℃孵育4小时。通过流式细胞术测量细胞表面B7-H4表达以及抗体内化。
CT26/hB7-H4稳定细胞系—克隆E4F2
也在CT26/hB7-H4稳定细胞系—克隆E4F2中检验抗B7-H4抗体内化。简言之，将100,000个细胞在37℃用CypHer5-标记的抗B7-H4抗体(2μg/ml)标记四小时。将这些细胞用0.1％叠氮化钠在冰上预处理30分钟。然后将这些细胞在4℃用包含0.1％叠氮化物的CypHer5-标记的抗B7-H4抗体标记四小时。在孵育期之后，将所有细胞沉淀，重悬于Fc阻滞培养基，并且用PE标记的抗B7-H4抗体(H74)染色，以便测量细胞表面上的B7-H4水平。然后将细胞洗涤并且用Live/Dead nearIR活力染料进行染色。
小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)以及6H3.m2a(小鼠IgG2a)mAb
还在CT26/hB7-H4以及E.G7ova/hB7-H4稳定细胞系中检验抗B7-H4抗体内化，包括小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)以及6H3.m2a(小鼠IgG2a)mAb内化。简言之，在培养基中，将100K个细胞在37℃用CypHer5-标记的抗B7-H4抗体(2μg/ml)标记四小时。在被标记之前，将细胞用10μg小鼠IgG进行Fc-受体阻滞10分钟。然后将细胞沉淀、洗涤，并且用PE标记的抗B7-H4抗体(H74)染色，以便测量细胞表面上的B7-H4水平。最终，将细胞洗涤，用该Live/DeadTM nIR活力染料染色并固定。
使用共聚焦显微镜进行内化研究
将B7-H4 mAb嵌合的6H3、嵌合的2E11、嵌合的2H9、嵌合的2D1、6H3人源化变体V2、V6、V7、V9、V12、以及V14用CypHer5E NHS酯(一种pH-敏感的菁染料，其在内化时在酸性溶酶体隔室放射最大的荧光)标记。将1μg/ml CypHer5E-标记的6H3、2E11、2H9、2D1或6H3人源化变体V2、V6、V7、V9、V12以及V14与293T.hB7-H4或B7-H4阳性乳腺癌肿瘤细胞系SK-BR-3一起孵育不同时间并且通过共聚焦荧光显微镜(珀金埃尔默奥佩雷塔(Perkin Elmer Operetta))监测内化(数据未显示)。
结果
在有利于内化的染色方案(37℃，4小时)中，嵌合的6H3被EG7.IG7(B7-H4低表达细胞)以及EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)两者内化的水平超过阴性对照。
嵌合的6H3甚至在应该防止内化的条件下由细胞内化。例如，在4℃，30min-不利于内化的条件下，嵌合的6H3在EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)中内化的水平超过阴性对照。
在4℃处理30min之后，其他嵌合的抗B7-H4抗体(c2E11，c2H9，c2D1)在EG7.IG7(B7-H4低表达细胞)和/或EG7.IVB3(B7-H4高表达细胞)中也显示一定程度的内化，然而，嵌合的6H3内化程度最大(图14)。
在细胞内化测定中还测试了六种人源化变体。所有六种变体保留了内化的能力。相对于嵌合的6H3以及测试的其他变体，变体9显示增加的内化(图15)。
还在624mel/hB7-H4稳定细胞系中检验抗B7-H4抗体内化。通过流式细胞术建立B7-H4的细胞表面表达水平。624mel细胞不表达B7-H4，克隆B7以低量表达并且克隆B6以最高量表达。CypHer5-标记的嵌合的抗B7-H4 mAb(c2H9，c2D1c6H3)的内化大于阴性对照抗体(抗PD-1抗体)在624Mel.B7H4细胞(克隆B6)中的内化。内化的程度与细胞表面hB7-H4表达的水平相关。在嵌合的抗B7-H4 mAb中，c6H3显示最大内化。CypHer5-标记的人变体抗B7-H4mAb(V2、V6、V7、V9、V12以及V14)在624Mel.B7H4细胞(克隆B6)中的内化类似于c6H3。
也在CT26/hB7-H4稳定细胞系—克隆E4F2中检验抗B7-H4抗体内化。嵌合的抗B7-H4抗体(c2H9、c2D1、c6H3，并且在一定程度上c2E11)被内化，而阴性对照抗体(抗PD-1抗体)显示未内化。同样地，标记的人变体抗B7-H4mAb(V2，V6，V7，V9，V12以及V14)被内化，而阴性对照抗体显示未内化。内化的程度与细胞表面hB7-H4表达的水平相关(图16)。在孵育期之后在细胞表面上可获得的B7-H4的量与内化的抗体的量成反比。抗B7-H4抗体(c2H9、c2D1、c6H3、以及变体V2、V6、V7、V9、V12以及V14)在4℃+叠氮化物条件下也被内化，尽管为稍微少一些的程度(图16以及17)。不清楚为什么这些条件不能更大程度地抑制内化。在这些条件下，CT26亲本细胞系没有显示抗B7-H4抗体的内化。
还通过以下方式进行内化测定：将小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)和6H3.m2a(小鼠IgG2a)mAb与嵌合的6H3和6H3的人源化变体在CT26/hB7-H4和E.G7ova/hB7-H4稳定细胞系中的内化进行比较。抗B7-H4抗体在两者细胞系中是内化的而该阴性对照(抗PD-1抗体)显示没有内化(图18A以及18B)。6H3.m1和6H3.m2a内化到类似的程度。人源化变体7内化最强烈，而变体2、9、以及12内化程度稍微较小。如上所观察的，在孵育期后细胞表面上可获得的B7-H4的量通常是与内化抗体的量成反比。
使用一种共聚焦显微镜，6H3的内化通过单独细胞内的点状荧光是可视化的。与内化过程一致，荧光信号在5小时在细胞质膜附近积累，而在24小时积累的荧光小泡可在大的胞质区清楚地观察到。
在用HEK293.hB7-H4细胞孵育五小时之后，使用共聚焦显微镜，在四个嵌合的B7-H4 mAb(2E11，2H9，2D1，6H3)中，CypHer5E标记的6H3显示最好的内化能力。
在与HEK293.hB7-H4细胞孵育五小时之后，使用共聚焦显微镜，在六个人源化6H3变体中，CypHer5E标记的6H3人源化变体V2、V6以及V7显示最好的内化能力。相比之下，与SK-BR-3细胞孵育五小时之后，在六个人源化6H3变体中，CypHer5E标记的6H3人源化变体V6、V7以及V14显示最好的内化能力。人源化6H3V6以及V7是诱导内化的前两个最好的变体。
实例8
嵌合的6H3以及6H3的人源化变体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
材料和方法
ADCC测定
设计抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定以测试嵌合的6H3以及6H3的人源化变体通过效应细胞介导靶细胞溶解的能力。
EG7.hB7-H4(克隆IVB3)细胞以及SK-BR-3细胞作为靶细胞测试。来自四个不同健康供体的外周血单核细胞(PBMC)(称为117、119、121、以及122)作为效应细胞测试。
检验四个不同的效应物-靶标比率(例如，E:T比率为100:1、50:1、以及20:1)。
预实验发现EL4衍生的细胞对PBMC进行的溶解是高度敏感的，并且该测定被优化以最小化此背景。在利用EG7.hB7-H4的测定中溶解的孵育期是4小时。在利用SK-BR-3细胞的测定中溶解的孵育期是20小时。
通过活力染色测量总溶解。特异性溶解＝100x([％死的]抗B7-H4抗体处理-[％死的]对照IgG处理)÷(100-[％死的]对照IgG处理)。
结果
在利用嵌合的6H3以及EG7.B7H4靶细胞的初始测定中，靶细胞的特异性溶解是在测试的所有比率针对所有四个供体检测的。图19A-19C说明了在3个不同效应细胞:靶细胞比率下的结果。20:1被选择用于未来测定，因为它最好反映了体内ADCC活性。
采用优化的测定条件以在单个浓度(10ng/mL)比较6H3的14个人源化变体(图20)。四个效应细胞供体中的三个(114，120，122)证明特异性溶解。变体4、5、8、以及11展示出最高的ADCC活性。十四个测试的变体中变体11展示最高的ADCC活性，而变体14展示最低的ADCC活性。采用了变体11和14与不同供体/效应细胞组合的剂量滴定实验揭示了抗体ADCC活性方面的相对差异是供体特异性的(图21A-21D)。
在另外的ADCC测定中，SK-BR-3细胞被用作靶细胞。认为SK-BR-3细胞，比较于上述的测定中使用的EG7.B7H4细胞，是体内靶标表达的一种更好模拟物(跨膜B7-H4)。测试了三种不同的效应细胞:靶细胞比率(20:1、50:1、以及100:1)，并且在嵌合的6H3抗体的剂量滴定中测试了两种不同的效应细胞供体(117以及120)。
针对PBMC供体(117以及120)两者观察到的总溶解(Live/Dead染料阳性的靶细胞的％)是高的(图22A-22B)。该测定进行了20小时，并且尽管有高背景，两个供体都以抗体剂量依赖性方式展现了特异性溶解(图23A-23B)。50:1被确定为观察到两个供体的剂量依赖性活性的优选效应物:靶标比率。
实例9
6H3不诱导补体依赖性细胞毒性
材料和方法
设计一个测定来测试6H3抗体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。SK-BR-3细胞(ATCC)被用作靶标。在存在6H3或对照蛋白以及代谢指示剂染料阿尔玛蓝(生命技术公司(Life Technologies))的情况下，将这些靶细胞与未稀释的或稀释的正常人血清补体(Quidel)混合。(也是一种人IgG1抗体)被用作一个阳性对照，并且人IgG1同种型对照被用作一个阴性对照。使用EnVision酶标仪(珀金埃尔默(PerkinElmer))测量阿尔玛蓝的相对荧光强度(其与有活细胞的数目成比例)。
结果
SK-BR-3细胞表达补体耐受性因子(例如CD46、CD55、CD59)，因此利用了极高量的补体。介导的杀伤是使用未稀释的、1:2、以及1:5-稀释的补体观察到的。在任何测试的病况下，针对c6H3都未观察到CDC活性(图24A-24B)。
实例10
6H3增强CTL介导的B7-H4-表达细胞的溶解
材料和方法
CTL介导的溶解测定利用OT-1 TCR转基因的CD8 T细胞而不是已经在体外引发，在存在用抗原性SIINFEKL(SEQ ID NO：30)肽脉冲处理并且补充以IL-2的APC的情况下。然后将该CTL在变化的效应物-靶标(E:T)比率与荧光标记的靶细胞共孵育。
EG7细胞系不呈现OVA衍生的肽，因此将EG7或EG7.hB7-H4细胞用肽脉冲处理并且用琥珀酰亚胺酯CFSE标记。将抗原-阴性(Ag-)的EG7细胞用DDAO标记并且与抗原-阳性(Ag+)靶标以1:1比率混合。
孵育4小时之后，将细胞用Live/Dead染色剂染色并且定量有活的靶细胞。CTL介导的溶解是由CFSE(Ag+)以及DDAO(Ag-)靶标之间的比率上的改变确定。
结果
在不同效应物:靶细胞比率研究不同浓度的嵌合6H3抗体对CTL介导的B7-H4-表达细胞的溶解的影响。如图25所示，随着E:T比率增加，Ag+靶标的频度相对于Ag-降低。
通过Ag+与Ag-靶标的起始比率调节存活来确定该特异性溶解。在测试的两个浓度，人嵌合的6H3抗体增加EG7.B7-H4细胞的特异性溶解(图26)。此外，与在不存在CTL的情况下对照IgG相比较，嵌合的6H3诱导B7-H4+细胞的溶解(图26，最后四个条形)。
实例11
在路易斯(Lewis)肺癌同系肿瘤模型中6H3减少肿瘤体积并且增加存活
材料和方法
路易斯(Lewis)肺癌(LLC)细胞被接种至27Bl6小鼠。选择荷瘤小鼠(150-250mm3)，并且在第8天分成三个组(9只小鼠/组)。将小鼠用小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)或6H3.m2a(小鼠IgG2a)mAb，或用配制品缓冲液在10mg/kg一周处理两次(总共5个剂量)。一周三次监测肿瘤尺寸。
结果
设计一个实验来在有或没有效应子功能的潜在性的情况下在癌症模型下评价抗B7-H4mAb的效力。选择路易斯(Lewis)肺癌(LLC)模型部分是因为在此模型中在体内肿瘤以及肿瘤相关巨噬细胞中观察到B7-H4表达。将建立了LLC细胞肿瘤的小鼠用小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)或6H3.m2a(小鼠IgG2a)处理，并且随着时间的推移监测肿瘤。
在第18天，用配制品缓冲液处理的小鼠被观察到具有成为溃疡的LLC肿瘤，创伤几乎与肿瘤一样大。用6H3.m1处理的小鼠显现与配制品缓冲液处理的组类似。用6H3.2ma处理的小鼠具有更小的创伤，这些创伤正开始闭合。观察到6H3.m2a减缓肿瘤生长并且增加存活时间(p＝0.015)(图27A以及27B)。在一个第二测定中证实该结果(图28A以及28B)。
实例12
CT26.B7H4同系鼠肿瘤模型
材料和方法
将小鼠用CT26-B7H4(1E05)通过尾静脉注射在第0天接种，并且开始于第10天或第14天用10mg/kg或1mg/kg的小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)或6H3.m2a(小鼠IgG2a)处理。在第24天将小鼠安乐死，并且记录肺中肿瘤结节的数目以及尺寸。将来自所有实验组的肺去除并且储存在固定溶液中。该实验设计以及时间安排如下示出。12-13只小鼠/组，两个剂量/周：
组1，配制品缓冲液(12只小鼠)
组2，在第10天，6H3.mIgG2a，10mg/kg(12只小鼠)
组3，在第10天，6H3.mIgG2a，1mg/kg(12只小鼠)
组4，在第14天，6H3.mIgG2a，10mg/kg(13只小鼠)
组5，在第14天，6H3.mIgG2a，1mg/kg(13只小鼠)
结果
在CT26-B7H4转移性肺肿瘤模型中测试6H3抗体的效力。在不存在处理的情况下随着时间的推移肿瘤的生长动力学说明于图29A中。在该实验测定中，将小鼠用CT26-B7H4(1E05)通过尾静脉注射在第0天接种，并且开始于第10天或第14天用10mg/kg或1mg/kg的小鼠6H3.m1(小鼠IgG1)或6H3.m2a(小鼠IgG2a)处理。通常，体重不存在显著改变，除了已给予配制品缓冲液的一只小鼠，减轻6％体重并且在第24天显示生病。用6H3.mIgG2a处理时转移性肿瘤的数目显著降低(p<0.001)(图29B)。
实例13
毒性的评价
材料和方法
将BALB/c小鼠，7-9周大，8只/组用6H3.mIgG1、6H3.mIgG2a、或配制品缓冲液以100mg/kg每周一次的剂量处理一个月(5个剂量)。在第4个剂量之后测试血糖。
收集血清用于PK的初次评价(第4个剂量之后的峰以及波谷)。用B7-H4-Ig融合蛋白从血清捕获抗体，并且用生物素-抗小鼠IgG1(6H3.mIgG1)或IgG2a(6H3.mIgG2a)检测并且用铕-抗生蛋白链菌素检测。
针对组织病理学收集器官：心脏、肝、脾、肺、肾(尤其是肾小球)、肠(回肠、十二指肠、空肠、盲肠、结肠)、子宫、唾液腺、胆囊和胰腺(特别注意小岛)。
结果
在有和没有免疫效应子功能的潜在性的情况下，进行毒物学研究以提供对抗B7-H4抗体的毒性的初步评价。所有小鼠存活直至计划的处死。血糖水平不受影响(图30)。没有检测到测试-物品-相关的毒性影响。在第4个剂量之后评价峰以及波谷抗体浓度。证实了高血清浓度，并且在Cmax和Cmin之间观察到适度的差异(图31以及32A-32B)。
在组织病理学分析过程中没有注意到测试品相关的显微发现。观察到的以下显微发现被认为是偶然的，具有在此菌株以及小鼠年龄常观察到的的性质，和/或具有与在接受配制品缓冲液的动物以及接受6H3.m1和6H3.m2a的动物中类似的发生率以及严重性，并且因此被认为与给予6H3.m1和6H3.m2a不相关。在组间在肾神经纤维球或胰岛中未注意到差异。
肺的一些以及肠截面中的许多显示了自溶的迹象。不能被评价的少数自溶的组织以及针对评价不可用的少数组织不被认为对评估与给予6H3.m1以及6H3.m2a相关的显微改变具有影响。
实例14
6H3的人源化变体的结合表征
材料和方法
将稀释于PBS中的100μl 1μg/ml B7-H4ECD his-标记的蛋白(信乐生物制剂(Sinobiologics))在4℃固定于平底96孔板(科斯塔尔(Costar)9017)过夜。将板用PBS+0.1％PS-20洗涤两次，并且在室温用200μl/孔PBS 10％FBS封闭1小时。将稀释于PBS 10％FBS中的100μl嵌合的6H3以及14个所选择的6H3人源化变体添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。将板洗涤三次，并且将100μl 1μg/ml抗人IgHRP(西格玛)添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。将板洗涤六次，并且将100μl TMB底物(SurModics)添加到每个孔中持续5-15min。将100μl终止液(0.1M硫酸)添加到每个孔中。在吸光度450nm通过珀金埃尔默(PerkinElmer)EnVision 2104多标记读取器对各板读取。
结果
设计一个ELISA测定来表征人源化变体6H3抗体与B7-H4细胞外域相对于人嵌合6H3的结合。
这些结果呈现于图33以及表8中，并且显示与人嵌合的6H3相比较，14个测试的人源化变体保持±2倍的针对人B7-H4亲和力。
表8：mAB 6H3抗体至B7-H4的EC50
抗体 EC50(nM)
hc6H3 0.62
V1 8.67
V2 0.51
V3 1.19
V4 1.16
V5 0.95
V6 1.64
V7 1.07
V8 11.44
V9 0.75
V10 0.89
V11 0.97
V12 0.78
V13 0.92
V14 0.68
实例15
人源化6H3的竞争结合表征
材料和方法
制备范围从100μg/ml至0.5ng/ml的12个点，3倍系列稀释的14个人源化6H3抗体变体。在以5ng/ml包含生物素酰化的小鼠抗人B7-H46H3(针对轻链可变区以及重链可变区分别为SEQ ID NOS：3和5)的测定稀释剂中制备稀释物。允许抗体结合到B7-H4-Ig-涂覆的测定板(200ng/孔)上在室温下持续1小时，并且用抗生蛋白链菌素HRP检测。
B7-H4-Ig是具有以下序列的一种融合蛋白：
GFGISGRHSI TVTTVASAGN IGEDGIQSCT FEPDIKLSDI VIQWLKEGVL GLVHEFKEGK
DELSEQDEMF RGRTAVFADQ VIVGNASLRL KNVQLTDAGT YKCYIITSKG KGNANLEYKT
GAFSMPEVNV DYNASSETLR CEAPRWFPQP TVVWASQVDQ GANFSEVSNT SFELNSENVT
MKVVSVLYNV TINNTYSCMI ENDIAKATGD IKVTESEIKR RSEPKSCDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
(SEQ ID NO：31)。
结果
在14个人源化6H3抗体变体(V1-V14)上进行竞争ELISA测定。竞争结合的优点在于在比较下mAb未被标记或直接检测，并且因此标记或结合至第二抗体方面的差异不会影响相对亲和力。
如表9以及图34A以及34B所示，变体V1以及V8具有明显降低的针对B7-H4-Ig的结合亲和力。所有其他变体具有抗体6H3的人嵌合形式的1.5倍内的EC50值。这些发现与非竞争性结果一致，这些非竞争性结果也显示变体1以及8展现对于B7-H4-Ig的差的结合亲和性。所有其他变体是嵌合的6H3的2倍内。
表9：人源化变体抗体V1-V14的结合特性
实例16
人源化6H3的饱和结合表征
材料和方法
在624mel/B7-H4细胞上使用嵌合的6H3mAb以及6H3的人源化变体进行饱和结合实验。简言之，将50,000个细胞用0.1％叠氮化物在冰上预处理30分钟以抑制B7-H4内化，然后用生物素酰化的抗B7-H4 mAb染色30分钟。以范围从200μg/ml低至1ng/ml的12个点，3倍系列稀释将这些mAb稀释。将细胞用抗生蛋白链菌素PE染色10分钟，洗涤，固定并通过流式细胞术分析。
结果
图35A-35B是针对原始(图35A)以及减去背景的数据(图35B)的结合曲线。减去背景的数据是通过从所有其他点减去来自抗PD-1抗体(245MFI)的平均信号产生的。减去的值用于确定Kd以及Bmax。基于Kd值，这些抗体显现出落入两个组(表10)。
表10：抗B7-H4抗体结合动力学
实例17
内化影响结合以及Kd估算
材料和方法
对于每次染色，将20万个HEK293.hB7-H4转染子重悬于100μl流式细胞术缓冲液(PBS+2％FBS)中。将0、0.1ng、0.3ng、1ng、3ng、10ng、30ng、100ng、300ng、1μg、3μg以及10μg的嵌合的6H3以及14个人源化变体的连续稀释物添加到细胞，并在4℃孵育30min。然后将细胞用2ml流式细胞术缓冲液洗涤两次，并且重悬于100μl流式细胞术缓冲液中。添加1μl抗hIg PE第二抗体(生物传奇公司)并与细胞孵育15min。然后将样本进行洗涤，并且重悬于100μl流式细胞术缓冲液中。使用BD Canto(BD生物科学)以板形式获取流式细胞术数据，并且通过FlowJo软件分析。然后将染色数据(MFI)输入至Prism 5软件中以产生结合曲线。使用了单一位点特异性结合算法的曲线拟合计算每个变体的个体KD。
结果
设计一个测定来确定6H3的人源化变体结合到表达B7-H4的HEK293转染子细胞的动力学。结果呈现于下表11和图36中。结果指示，抗体的细胞内化影响细胞结合以及Kd估算。
表11：6H3的人源化变体与表达B7-H4的HEK293细胞结合的动力学
抗体 KD(nM) Bmax(MFI)
嵌合的6H3 5.8 316
V1 18.8 204
V2 2.4 603
V3 6.0 583
V4 5.2 580
V5 4.2 646
V6 5.0 526
V7 6.5 513
V8 24.3 273
V9 1.8 553
V10 5.5 662
V11 6.9 648
V12 3.2 597
V13 7.0 648
V14 5.8 629
实例18
6H3结合至小鼠B7-H4
材料和方法
将稀释于PBS中的100μl 1μg/ml小鼠B7-H4ECD mIgG2a Fc融合蛋白在4℃固定于平底96孔板(科斯塔尔(Costar)9017)过夜。将板用PBS+0.1％PS-20洗涤两次，并且在室温用200μl/孔PBS 10％FBS封闭1小时。将稀释于PBS 10％FBS中的100μl嵌合的6H3以及14个所选择的6H3人源化变体添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。将板洗涤三次，并且将100μl 1μg/ml抗人Ig HRP(西格玛)添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。将板洗涤六次，并且将100μl TMB底物(SurModics)添加到每个孔中持续5-15min。将100μl终止液(0.1M硫酸)添加到每个孔中。在吸光度450nm通过珀金埃尔默(PerkinElmer)EnVision 210多标记读取器对各板读取。
结果
设计一个ELISA测定，基于6H3的人源化变体结合到小鼠B7-H4-mIg融合蛋白的能力来确定这些变体是否结合到小鼠B7-H4。结果呈现于下表12和图37中。当与人嵌合的6H3结合比较时，所有14个所测试的变体维持±2倍的对小鼠B7-H4的亲和力。这些结果指示，6H3的人变体的功能性分析可以使用鼠模型系统进行，其中细胞和/或动物表达小鼠B7-H4蛋白。
表12：6H3的人源化变体与小鼠B7-H4-小鼠-Ig融合蛋白结合的特性
抗体 EC50(nM)
嵌合的6H3 0.09
V1 0.10
V2 0.08
V3 0.10
V4 0.08
V5 0.05
V6 0.13
V7 0.11
V8 0.06
V9 0.07
V10 0.13
V11 0.11
V12 0.09
V13 0.13
V14 0.11
实例19
6H3逆转B7-H4-Ig的影响
材料和方法
从PLP139-151免疫的SJL小鼠在免疫后第8天收获小鼠淋巴结(LN)。将LN T细胞用10μg/mL的PLP139-151和10μg/mL的B7-H4 Ig(SEQ ID NO：31)或对照Ig加不同浓度的6H3的人源化变体(10，3.33，1.11&0μg/mL)进行刺激。将[3H]-胸腺嘧啶核苷添加至培养物中持续培养的最后48小时以用于T细胞增殖评估。将条件培养基针对IL-17、IFNγ以及IL-10产生进行分析。
结果
设计一个测定来测试6H3的人源化变体对用B7-H4-Ig进行的细胞处理的影响。图38A-38D显示了该测定的结果。用6H3、或人源化变体2、6、7、11、12、或14孵育B7-H4-Ig处理的细胞增加了促炎性细胞因子诸如IL-17(图38A)以及IFNγ(图38B)的分泌，增加细胞增殖([3H]-胸腺嘧啶核苷掺入)(图38C)，并且减少抗炎性细胞因子诸如IL-10的分泌(图38D)。这些结果指示6H3以及人源化变体逆转B7-H4-Ig介导的免疫抑制性应答。
本说明书提到的所有公开和专利均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开或专利申请特定地并且单独地指示通过引用以其全文结合在此一般。在结合本发明的特定实施例对其进行描述的同时，将会理解，能够进行进一步的修改，且本申请意在涵盖任何一般而言依循本发明的原理的变化、用途或改编，且包括这样的偏离当前披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内、且可适用于此前所示的关键特征。

Claims (39)

1.一种分子，该分子包括抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个抗原结合片段，其中所述分子免疫特异性地结合到人B7-H4，并且其中所述抗原结合片段包括：
(1)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个轻链可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO：18-23中任一个的氨基酸序列；以及
(2)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的一个重链可变区，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：24-29中任一个的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分子，其中所述分子免疫特异性地结合到人B7-H4，该人B7-H4：
(I)排列于一个细胞的表面；
(II)以内源浓度排列于一个活细胞的表面；
(III)排列于一个活细胞的表面，并且调节B7-H4与其细胞受体之间的结合；
(IV)排列于一个活细胞的表面，并且抑制肿瘤相关巨噬细胞的免疫压制；
(V)排列于一个活细胞的表面，并且调节一个肿瘤相关巨噬细胞的活性；
(VI)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且抑制肿瘤介导的压制；或
(VII)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且引起肿瘤特异性的细胞溶解。
3.如权利要求1-2中任一项所述的分子，其中该分子包括
(1)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：19的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：24的一个重链可变区；
(2)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：19的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：26的一个重链可变区；
(3)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：19的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：28的一个重链可变区；
(4)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：19的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：29的一个重链可变区；
(5)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：20的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：26的一个重链可变区；
(6)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：20的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：28的一个重链可变区；
(7)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：20的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：29的一个重链可变区；
(8)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：22的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：24的一个重链可变区；
(9)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：22的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：26的一个重链可变区；
(10)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：22的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：28的一个重链可变区；
(11)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：22的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：29的一个重链可变区；
(12)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：23的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：26的一个重链可变区；
(13)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：23的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：28的一个重链可变区；或
(14)抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：23的一个轻链可变区，以及抗人B7-H4抗体6H3的一种人源化变体的、包括氨基酸序列SEQ ID NO：29的一个重链可变区。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分子，其中所述分子是可检测地标记的，或包括轭合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。
5.如权利要求2-4中任一项所述的分子，其中所述分子能够内化到所述细胞中并且介导所述细胞的死亡。
6.如权利要求2-5中任一项所述的分子，其中所述活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或巨噬细胞。
7.如权利要求1所述的分子，其中所述分子是一种抗体，并且其中所述抗体是：
(I)单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体；或
(II)一种双特异性的、三特异性的或多特异性的抗体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分子，其中所述分子是一种IgG1或IgG4抗体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分子，其中所述分子具有ADCC活性，并且能够引导肿瘤或TAM杀伤活性和/或抑制TAM或肿瘤介导的压制。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分子，其中所述分子是一种双特异性的、三特异性的或多特异性的抗体，该抗体能够结合B7-H4以及在相同细胞上的一个不同分子。
11.一种用于治疗癌症或感染性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量或预防有效量的如权利要求1-10中任一项所述的分子，以及一种生理学上可接受的载体或赋形剂，其中所述分子拮抗B7-H4介导的压制从而上调免疫应答。
12.如权利要求11所述的药物组合物用于在展现癌症或感染性疾病的一个症状的一位受试者中治疗所述癌症或感染性疾病或者用于在一位受试者展现所述症状之前预防癌症或感染性疾病的用途。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其中用于治疗慢性病毒性疾病以及所述用途的所述组合物是所述慢性病毒性疾病的治疗。
14.如权利要求1-10中任一项所述的分子在细胞学测定中用于诊断一位受试者中的一种疾病的存在的用途，其中所述细胞学测定包括对所述受试者的细胞针对其结合至所述分子的能力进行测定。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述疾病是癌症或一种影响T细胞数目或健康的疾病。
16.如权利要求1-10中任一项所述的分子用于确定一位受试者对于用抗癌剂治疗肿瘤的适合性的用途，其中所述用途包括在所述肿瘤的微环境中确定肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述抗癌剂或用所述抗癌剂进行的所述治疗的剂量是基于所确定的所述肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度来设置或调整的。
18.治疗有效量的如权利要求11所述的药物组合物在一位患者中治疗癌症的用途，该患者被鉴定为展现升高的有效浓度的表达B7-H4的肿瘤相关巨噬细胞。
19.如权利要求12、16或18中任一项所述的用途，其中所述肿瘤或所述癌症的所述治疗另外包括化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法或外科手术。
20.一种分子，该分子包括抗体6H3的一个抗原结合片段，其中所述分子免疫特异性地结合到人B7-H4。
21.如权利要求20所述的分子，其中所述分子免疫特异性地结合到人B7-H4，该人B7-H4：
(I)排列于一个细胞的表面；
(II)以内源浓度排列于一个活细胞的表面；
(III)排列于一个活细胞的表面，并且调节B7-H4与其细胞受体之间的结合；
(IV)排列于一个活细胞的表面，并且抑制肿瘤相关巨噬细胞的免疫压制；
(V)排列于一个活细胞的表面，并且调节一个肿瘤相关巨噬细胞的活性；
(VI)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且抑制肿瘤介导的压制；或
(VII)排列于一个活肿瘤细胞的表面，并且引起肿瘤特异性的细胞溶解。
22.如权利要求20-21中任一项所述的分子，其中所述分子是可检测地标记的，或包括轭合的毒素、药物、受体、酶、受体配体。
23.如权利要求21-22中任一项所述的分子，其中所述分子能够内化到所述细胞中并且介导所述细胞的死亡。
24.如权利要求21-23中任一项所述的分子，其中所述活细胞是肿瘤细胞、病原体感染的细胞或巨噬细胞。
25.如权利要求20所述的分子，其中所述分子是一种抗体，并且其中所述抗体是：
(I)单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体；或
(II)一种双特异性的、三特异性的或多特异性的抗体。
26.如权利要求20-25中任一项所述的分子，其中所述分子是一种IgG1或IgG4抗体。
27.如权利要求20-26中任一项所述的分子，其中所述分子具有ADCC活性，并且能够引导肿瘤或TAM杀伤活性和/或抑制TAM或肿瘤介导的压制。
28.如权利要求20-27中任一项所述的分子，其中所述分子是一种双特异性的、三特异性的或多特异性的抗体，该抗体能够结合B7-H4以及在相同细胞上的一个不同分子。
29.一种用于治疗癌症或感染性疾病的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量或预防有效量的如权利要求20-28中任一项所述的分子，以及一种生理学上可接受的载体或赋形剂，其中所述分子拮抗B7-H4介导的压制从而上调免疫应答。
30.如权利要求29所述的药物组合物用于在展现癌症或感染性疾病的一个症状的一位受试者中治疗所述癌症或感染性疾病或者用于在一位受试者展现所述症状之前预防癌症或感染性疾病的用途。
31.如权利要求29所述的药物组合物或如权利要求34所述的其用途，其中用于治疗慢性病毒性疾病以及所述用途的所述组合物是所述慢性病毒性疾病的治疗。
32.如权利要求20-28中任一项所述的分子在细胞学测定中用于诊断一位受试者中的一种疾病的存在的用途，其中所述细胞学测定包括对所述受试者的细胞针对其结合至所述分子的能力进行测定。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述疾病是癌症或一种影响T细胞数目或健康的疾病。
34.如权利要求21-28中任一项所述的分子用于确定一位受试者对于用抗癌剂治疗肿瘤的适合性的用途，其中所述用途包括在所述肿瘤中确定肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述抗癌剂或用所述抗癌剂进行的所述治疗的剂量是基于所确定的所述肿瘤相关巨噬细胞的有效或实际浓度来设置或调整的。
36.治疗有效量的如权利要求29所述的药物组合物在一位患者中治疗癌症的用途，该患者被鉴定为展现升高的有效浓度的表达B7-H4的肿瘤相关巨噬细胞。
37.如权利要求30、34或36中任一项所述的用途，其中所述肿瘤或所述癌症的所述治疗另外包括化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法或外科手术。
38.一种分子，该分子包括小鼠抗人B7-H4抗体6H3的一个抗原结合片段，其中所述分子免疫特异性地结合到人B7-H4，并且其中所述抗原结合片段包括：
(1)小鼠抗人B7-H4抗体6H3的一个轻链可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及
(2)小鼠抗人B7-H4抗体6H3的一个重链可变区，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
39.如权利要求1-10或38中任一项所述的分子用于确定一位受试者对于用抗癌剂治疗肿瘤的适合性的用途，其中所述用途包括通过免疫组织化学确定肿瘤细胞的表面上的B7-H4的水平，并且如果与来自相同组织的非肿瘤细胞相比，这些肿瘤细胞上的B7-H4水平升高，则确定该受试者适合于治疗。
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