KR20200144094A - B7-h4 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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알렉산드로 팔럼보
케이시 밀러
한길 박
네리사 멘도사
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Abstract

본 개시는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, B7-H4를 검출하는 데 유용하다. 면역조직화학 (IHC)은 B7-H4를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본원의 개시내용은 또한 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여함으로써 증가된 B7-H4가 검출되는, 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

Description

B7-H4 항체 및 이의 사용 방법
본 개시내용은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 및 그러한 항체를 제조하고 예를 들면, B7-H4를 검출하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
B7-H4 (B7x, B7-S1, 및 VTCN1로도 공지됨)는, PD-L1을 포함하는 다른 B7 패밀리 일원과 상동성을 공유하는 면역 조절 분자이다. 이는 IgV 및 IgC 엑토도메인 둘 모두로 구성된 I 형 막관통 단백질이다. 건강한 조직에서의 B7-H4 발현이 단백질 수준으로 비교적 제한되는 반면, B7-H4는 유방, 난소, 및 자궁내막의 부인과 암종과 같은 여러 고형 종양에서 발현된다. 종양내 B7-H4의 발현은 불량한 예후와 상관관계를 갖는 경향이 있다. B7-H4를 위한 수용체는 알려져 있지 않지만, T 세포에서 발현된다고 여겨진다. B7-H4는 T 세포 활성을 직접적으로 억제시킨다고 여겨진다.
B7-H4의 발현 및 기능을 고려할때, B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 및 예를 들면, 암 샘플에서 B7-H4를 검출하기 위해 면역조직화학 (IHC)을 사용하는 것을 포함하는 B7-H4를 검출하기 위한 이들 항체의 용도가 요구된다.
본원에서는 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 및 예를 들면, 암 샘플에서 B7-H4를 검출하기 위한 면역조직화학 (IHC)을 사용하는 것을 포함하는 B7-H4를 검출하기 위한 이들 항체의 용도가 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고 이는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열번호 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 (a) 각각 서열번호 6 및 9; (b) 각각 서열번호 6 및 10; (c) 각각 서열번호 6 및 11; (d) 각각 서열번호 7 및 9; (e) 각각 서열번호 7 및 10; (f) 각각 서열번호 7 및 11; (g) 각각 서열번호 8 및 9; (h) 각각 서열번호 8 및 10; (i) 각각 서열번호 8 및 11, (j) 각각 서열번호 89 및 19; (k) 각각 서열번호 90 및 19; 또는 (l) 각각 서열번호 91 및 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가로 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 쥣과 IgG1 또는 IgG2a 중쇄 불변 영역이다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 쥣과 IgGκ 경쇄 불변 영역이다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 16, 17, 18, 89, 90 또는 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 19, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 (a) 각각 서열번호 16 및 19; (b) 각각 서열번호 16 및 30; (c) 각각 서열번호 16 및 31; (d) 각각 서열번호 17 및 19; (e) 각각 서열번호 17 및 30; (f) 각각 서열번호 17 및 31; (g) 각각 서열번호 18 및 19; (h) 각각 서열번호 18 및 30; 또는 (i) 각각 서열번호 18 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 J512, J513, J514, J515, J516, J517, J518, J519, J520, J521, 및 J522로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR이다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 인간 B7-H4의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 또 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 인간 B7-H4로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 쥣과 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 항체이다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항원-결합 단편이다. 특정 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디설파이드 결합된 Fv, 미니바디, F(ab')3, 디아바디, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가로 검출 가능한 표지를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6, 7 또는 8의 VH 또는 서열번호 16, 17 또는 18의 중쇄를 암호화한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 12, 13, 14, 93, 94 또는 95의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 9, 10 또는 11의 VL 또는 서열번호 19, 30 또는 31의 경쇄를 암호화한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 15, 96 또는 97의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 벡터가 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드, 본원에 제공된 벡터, 또는 본원에 제공된 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 본원에 제공된 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들면, 단리된 숙주 세포)가 제공된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 또는 HEK 세포이다.
특정 구현예에서, 본원에서는 핵산 분자가 발현되고 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생성되도록 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 샘플을 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플 중에서 B7-H4를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서는 샘플을 본원에 제공된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키고 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 B7-H4로의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중에서 B7-H4를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플은 대상체의 암으로부터 수득한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 B7-H4가 검출된 후 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서는 대상체에서 B7-H4 발현 암을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, B7-H4는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 암으로부터 수득된 샘플 중에서 검출되었다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 암으로부터 수득된 샘플 중에서 B7-H4를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 검출된 B7-H4는 세포 막 B7-H4이다. 특정 구현예에서, 검출된 B7-H4는 세포질 B7-H4이다. 특정 구현예에서, 검출된 B7-H4는 전체-세포 B7-H4이다.
특정 구현예에서, B7-H4는 순환 종양 세포에서 검출된다.
특정 구현예에서, 상기 샘플은 대상체로부터의 고형 조직, 생검, 복수, 흡인물, 유체 추출물, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 섹션, 호흡관, 장관 또는 비뇨생식관, 눈물, 침, 밀크, 종양 또는 기관이다.
특정 구현예에서, 상기 암은 유방암, 관 암종 (ductal carcinoma), 자궁내막 암종, 난소암, 비-소 세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암이거나, 여기서, 상기 비-소 세포 폐암은 편평 세포 암종이다.
특정 구현예에서, 검출 방법은 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS) 검정 또는 면역조직화학 (IHC)을 사용한다. 특정 구현예에서, 검출 방법은 IHC를 사용하고 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 50 μg/ml이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 20 μg/ml이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 10 μg/mL이다.
특정 구현예에서, 상기 대상체는 사람이다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 a) 검출 시약, b) B7-H4 항원, c) 치료용 항-B7-H4 항체 또는 d) 이의 조합물을 포함하는 키트가 제공된다.
본원에 제공된 방법 또는 키트의 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 20502 또는 22213의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR이다.
특정 구현예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열번호 32 내지 37의 아미노산 서열 또는 각각 서열번호 58 내지 63의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 54 또는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 또는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 (ii) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 56 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 57 또는 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 (ii) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
도 1은 항-B7-H4 항체 A57.1, AET_AB_J516, 및 AET_AB_J512를 사용하여 생성된 IHC 염색 이미지를 보여준다. (실시예 4 참조)
도 2는 IHC 염색의 컴퓨터 이미지 분석 (데피니엔)을 보여준다. (실시예 4 참조)
도 3은 상이한 강도 수준을 갖는 양성 세포의 세분화를 보여준다. (실시예 4 참조)
도 4는 항-B7-H4 항체 A57.1, AET_AB_J516, 및 AET_AB_J512를 사용하여 수득된 각각의 염색 강도 수준과 연관된 세포의 수 및 비율을 보여준다. (실시예 4 참조)
도 5a-5c는 B7-H4 양성 세포의 전체 세포, 막 및 세포질에서 B7-H4 발현 (DAB 강도)의 비교를 보여준다. 도 5a는 A57.1 항체를 사용한 B7-H4 발현 (DAB 강도)을 보여준다. 도 5b는 J512 항체를 사용한 B7-H4 발현 (DAB 강도)을 보여준다. 도 5c는 J516 항체를 사용한 B7-H4 발현 (DAB 강도)을 보여준다. (실시예 4 참조)
본원에서는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들면, 단클론성 항체) 및 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 항-B7-H4 항체 및 이의 항원-결합 단편을 사용하여, 예를 들면, 암 샘플에 대한 면역조직화학을 사용하여 B7-H4를 검출할 수 있다.
또한, 그러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 상보성 DNA (cDNA)와 같은 단리된 핵산 (폴리뉴클레오타이드)이 제공된다. 추가로, 그러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 (폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 벡터 (예를 들면, 발현 벡터) 및 세포 (예를 들면, 숙주 세포)가 제공된다. 또한, 그러한 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 본원에서는 예를 들면, 암 샘플에서 B7-H4를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 관련 조성물(예를 들면, 검출 조성물), 및 키트가 또한 제공된다.
전문용어
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "B7-H4"는, 비제한적으로, 천연 B7-H4 폴리펩타이드 및 B7-H4 폴리펩타이드의 동형체를 포함하는, 포유류 B7-H4 폴리펩타이드를 지칭한다. "B7-H4"는 세포 내에서의 가공에서 비롯되는 B7-H4 폴리펩타이드의 형태 뿐만 아니라 전장, 미가공된 B7-H4 폴리펩타이드를 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "B7-H4"는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. "B7-H4 폴리뉴클레오타이드", "B7-H4 뉴클레오타이드", 또는 "B7-H4 핵산"은 B7-H4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에서 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 또는 전술한 것들의 조합에 특이적으로 결합하고 상기를 인식하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는, 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤 각각으로 지칭되는 중-쇄 불변 도메인의 동일성에 기반하여, 면역글로불린의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 아부류 (아이소타입) (예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류는 상이하고 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 배치형태를 갖는다. 항체는 다른 분자 예컨대 독소, 방사성 동위원소 등에 접합될 수 있거나 노출될 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 한 부분을 지칭한다. "항원-결합 단편", "항원-결합 도메인", 또는 "항원-결합 영역"은 항원에 특정하게 결합하는 온전한 항체의 한 부분을 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전한 항체의 항원 인식 부위 (예를 들면, 항원을 특이적으로 결합시키는데 충분한 상보성 결정 영역 (CDR))를 함유할 수 있다. 항체의 항원-결합 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 임의의 동물 종, 예컨대 설치류 (예를 들면, 마우스, 랫트, 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있거나 인위적으로 생산될 수 있다.
용어 "항-B7-H4 항체", "B7-H4 항체" 및 "B7-H4에 결합하는 항체"는 항체가 B7-H4 표적화에서 진단 및/또는 치료 제제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 B7-H4를 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하는", "면역특이적으로 결합하는", "면역특이적으로 인식하는", 및 "특이적으로 인식하는"은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 맥락에서 유사한 용어이다. 이들 용어는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 그의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하는 그리고 상기 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이 일부 상보성을 수반한다는 것을 나타낸다. 따라서, 인간 B7-H4 (서열번호:1)에 "특이적으로 결합하는" 항체는 또한 다른 종으로부터 B7-H4 (예를 들면, 사이노몰구스 원숭이, 마우스, 및/또는 랫트 B7-H4) 및/또는 다른 인간 대립유전자로부터 생산된 B7-H4 단백질에 결합할 수 있지만, 관련 없는 비-B7-H4 단백질 (예를 들면, 다른 B7 단백질 패밀리 일원 예컨대 PD-L1)에 대한 항-B7-H4 항체의 결합의 정도는, 예를 들면, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 B7-H4에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다.
"단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 항원성 결정인자, 즉 에피토프의 고도로 특이적 인식 및 결합에 관여된 동종 항체 또는 항원-결합 단편 모집단을 지칭한다. 이것은 상이한 항원성 결정인자에 관한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체와 대조적이다. 용어 "단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 두 온전한 및 전장 단클론성 항체 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 또한, "단클론성" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비제한적으로 하이브리도마, 파아지 선택, 재조합 발현, 및 형질전환 동물을 포함하는 임의의 수의 방식으로 만들어진 그와 같은 항체 및 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 호환적으로 사용되고 당업계에서 통상적이다. 가변 영역은 항체의 한 부분, 일반적으로, 경쇄 또는 중쇄의 한 부분, 전형적으로 성숙 중쇄에서 약 아미노-말단 110 내지 120개의 아미노산 또는 110 내지 125개의 아미노산 그리고 성숙 경쇄에서 약 90 내지 115개의 아미노산을 전형적으로 지칭하고, 이는 항체 중에서 서열이 상이하고 그의 특정 항원용 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역 (CDR)로 불리는 그들 영역에 집중되는 반면 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 영역은 골격 영역 (FR)으로 불린다. 임의의 특정 기전 또는 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당한다고 여겨진다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 가변 영역이다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
용어 "카밧 넘버링" 및 유사 용어는 당업계에서 인식되어 있고 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기 넘버링의 시스템을 지칭한다. 특정 측면에서, CDR는 카밧 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다 (예를 들면, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242을 참고한다). 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR는 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35에 존재하고, 이는 선택적으로, 35 (카밧 넘버링 체계에서 35A 및 35B로서 지칭됨) (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65 (CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102 (CDR3)에 따라, 1 또는 2개 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 카밧 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR는 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34 (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56 (CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97 (CDR3)에 존재한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항체의 CDR는 카밧 넘버링 체계에 따라 결정되어 왔다.
대신에 초티아는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 카밧 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때의 초티아 CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다양하다 (이것은 카밧 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 배치하기 때문이고; 35A도 35B도 존재하지 않으면 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재하면 루프는 33에서 끝나고; 35A 및 35B 둘 모두가 존재하면 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 카밧 CDR와 초티아 구조적 루프 사이에서의 절충을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
Figure pct00001
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "불변 영역" 및 "불변 도메인"은 호환성이고 당업계 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여되지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체와의 상호작용을 나타낼 수 있는 항체 부분, 예를 들면, 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 측면에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)에 충분한 불변 영역 또는 이의 부분을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 사용된 경우 용어 "중쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한 임의의 구별되는 유형, 예를 들면, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ), 및 뮤 (μ)를 지칭할 수 있으며, 이들은 IgG의 아부류, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 비롯하여 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 부류를 초래한다. 중쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특이적 구현예에서, 중쇄는 인간 중쇄이다. 특이적 구현예에서, 중쇄는 설치류 또는 쥣과 중쇄이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 사용된 경우 용어 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 임의의 구별되는 유형, 예를 들면, 카파 (κ) 또는 람다 (λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특이적 구현예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다. 특이적 구현예에서, 경쇄는 설치류 또는 쥣과의 경쇄이다.
용어 "키메라" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가진 포유동물 (예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 영역에 해당하는 반면, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응 유발을 피하기 위해 또 다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열과 상동성이다.
용어 "인간화된" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 최소의 비-인간 (예를 들면, 쥣과) 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린, 또는 이의 단편인 비-인간 (예를 들면 쥣과) 항체 또는 항원-결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상보성 결정 영역 (CDR)로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가지고 있는 비-인간 종 (예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 ("CDR 그라프팅된") 인간 면역글로불린이다 (Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 특정 Fv 골격 영역 (FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 가지고 있는 비-인간 종으로부터의 항체 또는 단편에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 개선 및 최적화하기 위해 Fv 골격 영역에서 및/또는 비-인간 CDR 잔기 내에서 추가의 잔기 치환으로 추가 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린에 해당하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 함유하는 가변 도메인을 포함할 것이고 반면에 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열이다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 생성하는데 사용된 방법의 예는 미국 특허 5,225,539; Roguska 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), 및 Roguska 등, Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, "인간화된 항체"는 재표면화된 항체이다.
용어 "인간" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린 유전자 좌로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 의미하고, 여기에서 그와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 당업계에서 공지된 임의의 기법을 사용하여 만들어진다. 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 이 정의는 온전한 또는 전장 항체 및 이의 단편을 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들면, 항원)간의 비-공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항원)간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (KD)로 제시될 수 있다. 친화성은 비제한적으로 평형 해리 상수 (KD), 및 평형 결합 상수 (KA)를 포함하는, 당업계에서 공지된 수많은 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되고, 반면에 KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은, 예를 들면, 항원에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 속도 상수를 지칭하고, koff는, 예를 들면, 항원으로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 당업계에서 숙련가에 공지된 기법, 예컨대 BIAcore® 또는 KinExA로 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이고 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭한다. 에피토프는, 예를 들면, 폴리펩타이드의 인접 아미노산일 수 있거나 (선형 또는 인접 에피토프) 또는 에피토프는, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 2개 이상의 비-인접 영역으로부터 합칠 수 있다 (형태적, 비-선형, 불연속, 또는 비-인접 에피토프). 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 특이적으로 결합하는 에피토프는, 예를 들면, NMR 분광법, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분광분석법 (예를 들면, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광분석법)과 커플링된 수소/중수소 교환, 어레이-기반 올리고-펩타이드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이유발 맵핑 (예를 들면, 부위-지향된 돌연변이유발 맵핑)으로 결정될 수 있다. X-선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에서 공지된 임의의 방법 (예를 들면,
Figure pct00002
R 등, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303)을 사용하여 달성될 수 있다. 항체/이의 항원-결합 단편:항원 결정은 널리 공지된 X-선 회절 기법을 사용하여 연구될 수 있고 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 X-PLOR (Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc. 배급; 예를 들면, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW 등,; U.S. 2004/0014194을 참조한다), 및 BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P 등, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)을 사용하여 개선될 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업계에서 숙련가에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기법을 포함하는, 돌연변이유발 기법의 설명에 대하여 Champe M 등, (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085을 참고한다.
참조 B7-H4 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는" B7-H4 항체는 참조 B7-H4 항체와 동일한 B7-H4 아미노산 잔기에 결합하는 항체를 언급한다. 참조 B7-4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 B7-H4 항체의 능력은 수소/중수소 교환 검정에 의해 결정된다 (Coales 등 Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009; 23: 639-647).
항체는 이것이 어느 정도로 참조 항체의 에피토프로의 결합을 차단하도록 참조 항체의 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 경우, 참조 항체의 소정의 에피토프로의 결합을 "경쟁적으로 억제하는" 것으로 일컬어진다. 경쟁 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 참조 항체의 소정의 에피토프로의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제하는 것으로 일컬어질 수 있다.
"단리된" 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩타이드, 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 자연에서 발견되는 형태로 이들이 더 이상 존재하지 않는 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리되는 항체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물질이 없는), 적어도 90% 순수한, 적어도 95% 순수한, 적어도 98% 순수한, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 차단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합으로 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들면, 비천연 아미노산, 등 포함), 뿐만 아니라 당업계에서 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩타이드가 본 정의 내에서 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드가 항체에 기반하기 때문에, 특정 구현예에서, 폴리펩타이드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 일어날 수 있음이 이해된다.
"퍼센트 동일성"은 2개의 서열 (예를 들면, 아미노산 서열 또는 핵산 서열)간의 동일성 정도를 언급한다. 퍼센트 동일성은 서열 간의 동일성을 최대화하기 위해 갭을 도입하면서 2개의 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 정렬은 당업계에 공지된 프로그램을 사용하여 생성될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열의 정렬은 디폴트 파라미터에서 blastn 프로그램 세트로 수행될 수 있고, 아미노산 서열의 정렬은 디폴트 파라미터에서 blastp 프로그램으로 수행될 수 있다 (the worldwide web, ncbi.nlm.nih.gov에서의 National Center for Biotechnology Information (NCBI)을 참조한다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들면, 일차 세포, 배양물내 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염된 세포 그리고 그와 같은 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 그와 같은 세포의 자손은, 예를 들면, 숙주 세포 게놈에의 핵산 분자의 계속되는 생성 또는 통합에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해, 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수 있다.
특정 종양, 조직 또는 세포 샘플에서 용어 B7-H4의 "과발현"은 동일 유형 또는 기원의 비-환부 조직 또는 세포 또는 종양 또는 암에 인접한 기타 세포에 존재하는 것 보다 높은 수준으로 존재하는 B7-H4 (B7-H4 폴리펩타이드 또는 그러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)를 언급한다. 그러한 과발현은 예를 들면, 돌연변이, 유전자 증폭, 증가된 전사 또는 증가된 해독에 의해 유발될 수 있다.
본원에서 용어 "일차" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 샘플 중에서 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편을 언급한다. 일차 항체는 일반적으로 면역조직화학 (IHC) 과정에서 사용되는 제1 항체이다. 하나의 구현예에서, 일차 항체는 IHC 과정에 사용되는 유일한 항체이다. 본원에서 용어 "2차" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 일차 항체에 특이적으로 결합함으로써 일차 항체와 임의의 경우 후속 시약 간에 브릿지를 형성하는 항체 또는 단편을 언급한다. 이차 항체는 일반적으로 면역조직화학 과정에 사용되는 제2 항체이다. 본원에서 용어 "삼차 항체"는 이차 항체에 특이적으로 결합함으로써 이차 항체와 임의의 경우 후속 시약 간에 브릿지를 형성하는 항체를 언급한다.
본 발명의 "샘플"은 생물학적 기원이다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 사람 샘플이지만 동물 샘플이 또한 본 발명의 수행에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 샘플의 비제한적인 공급원은 예를 들면, 고형 조직, 생검, 복수, 흡인물, 유체 추출물, 혈액 (순환 종양 세포를 포함함), 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 섹션, 호흡관, 장관, 및 비뇨생식관, 눈물, 침, 밀크, 종양, 기관, 세포 배양물 및/또는 세포 배양물 성분들을 포함한다. "암성 샘플"은 암성 세포를 함유하는 샘플이다.
본원의 목적을 위해, 조직 샘플의 "섹션"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들면, 얇은 슬라이스의 조직 또는 조직 샘플로부터 절단된 세포를 언급한다. 조직 샘플의 다수의 섹션이 취해질 수 있고 본 발명에 따른 분석에 적용되는것으로 이해된다. 일부 경우에,조직의 선택된 부분 또는 섹션은 균질한 세포 집단을 포함한다. 다른 경우에, 선택된 부분은 조직 영역, 예를 들면, 비제한적인 예로서 루멘을 포함한다. 선택된 부분은 하나의 세포 또는 2개의 세포 정도로 소형일 수 있거나, 예를 들면, 수천 개의 세포를 나타낼 수 있다. 대부분의 경우에, 세포의 수거는 중요하고, 본 발명은 세포 성분의 검출에서의 용도에 대해 기재되었지만, 방법은 또한 유기체의 비-세포 성분 (예를 들면, 비제한적인 예로서 혈액 내 가용성 성분)을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 경우 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는조성물을 언급한다. 표지는 자체적으로 검출될 수 있거나 (예를 들면, 방사능동위원소 표지 또는 형광성 표지), 효소 표지의 경우에, 검출될 수 있는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하기 위해 그러한 형태로 존재하고 제형이 투여될 대상체에게 허용 가능하지 않게 독성인 어떠한 추가의 성분들을 함유하지 않는 제제를 언급한다. 제형은 멸균성일 수 있다.
용어 "투여한다", "투여하는", "투여" 등은 본원에서 사용된 바와 같이, 생물학적 작용의 원하는 부위에 약물, 예를 들면, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 전달을 가능하게 하는데 사용될 수 있는 방법 (예를 들면, 정맥내 투여)을 지칭한다. 본원에서 기재된 제제 및 방법과 이용될 수 있는 투여 기법은 예를 들면, Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon; 및 Remington's, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa에서 구해진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 호환적으로 사용된다. 대상체는 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 동물 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트, 마우스, 원숭이 또는 다른 영장류, 등)과 같은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약물, 예를 들면, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소; 종양 크기 또는 부담을 감소; 주변 기관에, 어느 정도까지, 암 세포 침윤을 억제; 어느 정도까지, 종양 전이를 억제; 어느 정도까지, 종양 성장을 억제; 암과 관련된 하나 이상의 증세를, 어느 정도까지, 완화; 및/또는 양호한 반응 예컨대 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS), 전체 생존 (OS), 완전한 반응 (CR), 부분적 반응 (PR), 또는, 일부 경우에, 안정한 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)의 감소, 감소된 진행 시간 (TTP), 또는 이들의 임의의 조합을 초래할 수 있다. 약물이 성장을 예방 및/또는 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"치료하는", "치료", "치료하기 위해", "경감하는", 및 "경감하기 위해"와 같은 용어는 병리적 상태 또는 장애의 증세를 치유, 둔화, 저감, 및/또는 이의 진전을 중지시키는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 이들은 장애를 갖는 것으로 이미 진단된 또는 의심되는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 환자가 하나 이상의 하기를 나타내면 본 발명의 방법에 따라 암에 대하여 성공적으로 "치료된"다: 암 세포의 수에서의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기에서의 감소; 예를 들면, 암의 연 조직 및 뼈로의 만연을 포함하는 주변 기관에의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특이적 암과 관련된 하나 이상의 증세의 완화; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질에서의 개선; 종양의 종양형성능, 종양형성 빈도, 또는 종양형성 능력에서의 감소; 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도에서의 감소; 종양형성 세포의 비-종양형성 상태로의 분화; 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS), 전체 생존 (OS), 완전한 반응 (CR), 부분적 반응 (PR), 안정한 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)에서의 감소, 감소된 진행 시간 (TTP), 또는 이들의 임의의 조합.
용어 "암" 및 "암성"은 세포의 모집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물내 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는, 비제한적으로, 부인과 암 (예를 들면, 유방암 (삼중 음성 유방암, 관상 암종, 난소암, 및 자궁내막암 포함), 비-소세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 (예를 들면, 신장 세포 암종) 및 방광암 (예를 들면, 요상피 세포 암종)을 포함한다. 암은 "B7-H4를 발현시키는 암" 또는 "B7-H4 발현 암"일 수 있다. 그와 같은 용어는 B7-H4를 발현시키는 세포를 포함하는 암을 지칭한다. 상기 암은 B7-H4를 발현시키는 고형 종양일 수 있다. 상기 암은 일차 종양일 수 있거나 진전된 또는 전이성 암일 수 있다.
"난치성" 암은 항-종양 치료, 예컨대 화학요법이 암 환자에 투여되더라도 진행하는 암이다.
"재발성" 암은, 원래 부위에서 또는 원위 부위에서, 초기 요법에 대한 반응 후 재성장된 암이다.
본 개시내용 및 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "한", "하나", 및 "상기"는 문맥이 달리 명확히 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
구현예가 언어 "포함하는"으로 본원에서 기재되는 모든 경우에 "으로 이루어지는" 및/또는 "으로 본질적으로 이루어지는" 용어로 기재된 것을 달리하고 유사한 구현예가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 본 개시내용에서, "포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에 부여된 의미를 가질 수 있고 "포괄한다", "포괄하는", 및 기타 등등을 의미할 수 있고; "으로 본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"은 마찬가지로 미국 특허법에서 부여된 의미를 갖고 상기 용어는, 인용되는 것의 기본적 또는 신규한 특성이 인용되는 것 초과의 존재에 의해 변화되지 않는 한 인용되는 것 초과의 존재를 허용하는, 개방형이지만, 선행기술 구현예를 배제한다.
구체적으로 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 어구에서 사용된 경우 용어 "및/또는" 예컨대 본원에서 "A 및/또는 B"는 "A 및 B," "A 또는 B," "A," 및 "B." 모두를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, 어구에서 사용된 경우 용어 "및/또는" 예컨대 "A, B, 및/또는 C"는 각각의 하기 구현예를 포괄하기 위한 것이다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 수치 또는 수치 범위를 변형시키는데 사용된 경우, 값 또는 범위 5% 내지 10% 위 그리고 5% 내지 10% 아래의 편차가 인용된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 남아 있는 것을 나타낸다.
본원에서 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공된 하나 이상의 임의의 다른 조성물 및 방법과 조합될 수 있다.
항체
특이적 측면에서, 본원에서는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들면, 단클론성 항체) 및 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 인간 B7-H4에 대한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 또한 서열번호 1에 의해 나타낸 바와 같이 본원에 제공된다.
인간 B7-H4:
Figure pct00003
특정 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1에 개시된 항체이거나 또는 표 1에 개시된 항체의 상보성 결정 영역 (CDR), 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄, 및/또는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
Figure pct00004
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 표 2에 열거된 6개의 CDR, 즉, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25의 6개의 CDR, 서열번호 26-28 및 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
Figure pct00005
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, VL과 조합하는, 표 3에 열거된 VH를 포함한다.
Figure pct00006
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, VH와 조합하는, 표 4에 열거된 VL을 포함한다.
Figure pct00007
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 표 3에 열거된 VH 및 표 4에 열거된 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 표 3에 열거된 서열을 포함하는 또는 이들로 이루어진 VH 및 표 4에 열거된 것을 포함하는 또는 이들로 이루어진 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 80% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 80% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 96% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 96% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 97% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 97% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 98% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 98% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 표 3에서의 VH 서열과 적어도 99% 동일한 서열로 이루어진 VH 및 표 4에서의 VL 서열과 적어도 99% 동일한 서열로 이루어진 VL을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 그의 VL 도메인 단독, 그의 VH 도메인 단독, 그의 3개 VL CDR 단독, 또는 그의 3개 VH CDR 단독에 의해 기재된다. 예를 들면, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 Rader C 등, (1998) PNAS 95: 8910-8915을 참고하며, 상기 문헌은 최초 항체의 친화성만큼 높은 또는 보다 더 높은 친화성을 갖는 인간화된 항체 변이체를 초래하는, 인간 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터의 보완성 경쇄 또는 중쇄 각각을 확인함으로써 마우스 항-αvβ3 항체의 인간화를 기재한다. 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 Clackson T 등, (1991) Nature 352: 624-628을 또한 참고하며, 상기 문헌은 특이적 VL 도메인 (또는 VH 도메인)의 사용 그리고 상보성 VH 도메인 (또는 VL 도메인)용 라이브러리의 스크리닝에 의해 특이적 항원을 특이적으로 결합하는 항체의 생산 방법을 기재한다. 스크린은 ELISA에 의해 결정된 경우에, 강한 결합제이었던, 특이적 VH 도메인에 대하여 14개의 신규한 파트너 그리고 특이적 VL 도메인에 대하여 13개의 신규한 파트너를 생산하였다. 또한 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577을 참고하며, 상기 문헌은 특이적 VH 도메인의 사용 그리고 상보성 VL 도메인용 라이브러리 (예를 들면, 인간 VL 라이브러리)의 스크리닝에 의해 특이적 항원을 특이적으로 결합하되; 결국에 선택된 VL 도메인이 추가의 상보성 (예를 들면, 인간) VH 도메인의 선택을 안내하는데 사용될 수 있는 항체의 생산 방법을 기재한다.
특정 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR은 면역글로불린 구조적 루프의 위치를 지칭하는, 초티아 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다 (예를 들면, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B 등, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C 등, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A 등, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 번호 7,709,226를 참고한다). 전형적으로, 카밧 넘버링 관례를 사용하는 경우, 초티아 CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, 초티아 CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, 초티아 CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 반면, 초티아 CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, 초티아 CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, 초티아 CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. 카밧 넘버링 관례를 사용하여 넘버링된 경우 초티아 CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이 다양하다 (이것은 카밧 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이고; 35A도 35B도 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재하면, 루프는 33에서 끝나고; 35A 및 35B 둘 모두가 존재하면, 루프는 34에서 끝난다).
특정 측면에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 항체의 초티아 VH 및 VL CDR를 포함하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 CDR를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로, 여기서 초티아 및 카밧 CDR가 동일한 아미노산 서열을 가짐. 특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 카밧 CDR 및 초티아 CDR의 조합을 포함하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR는 Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 및 Lefranc M-P 등, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212에서 기재된 바와 같이 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. IMGT 넘버링 체계에 따르면, VH-CDR1은 26 내지 35 위치에 있고, VH-CDR2는 51 내지 57 위치에 있고, VH-CDR3은 93 내지 102 위치에 있고, VL-CDR1은 27 내지 32 위치에 있고, VL-CDR2는 50 내지 52 위치에 있고, VL-CDR3은 89 내지 97 위치에 있다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 표 3 및 4에서 열거된, 예를 들면, 전술된 Lefranc M-P (1999) 및 전술된 Lefranc M-P 등, (1999))에 기재된 바와 같이 항체의 IMGT VH 및 VL CDR를 포함하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR는 MacCallum RM 등, (1996) J Mol Biol 262: 732-745에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", in Antibody Engineering, Kontermann 및
Figure pct00008
eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)를 또한 참고한다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 MacCallum RM 등에서의 방법에 의해 결정되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR은 카밧 CDR와 초티아 구조적 루프간의 절충을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용되는 AbM 초가변 영역을 지칭하는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고 AbM 넘버링 체계에 의해 결정되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, 경쇄와 조합하는, 표 5에 열거된 중쇄를 포함한다.
Figure pct00009
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 예를 들면, 중쇄와 조합하는, 표 6에 열거된 경쇄를 포함한다.
Figure pct00010
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 표 5에 열거된 중쇄 및 표 6에 열거된 경쇄를 포함한다.
특이적 측면에서, 본원에서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체가 제공된다. 중쇄와 관련하여, 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄를 포함하고, 여기서, VH 도메인의 아미노산 서열은 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역은 쥣과 IgG2a 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는 중쇄를 포함하고, 여기서, VH 도메인의 아미노산 서열은 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00011
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄를 포함하고, 여기서, VH 도메인의 아미노산 서열은 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역은 쥣과 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄를 포함하고, 여기서, VH 도메인의 아미노산 서열은 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00012
경쇄와 관련하여, 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 경쇄를 포함하고, 여기서, VL 도메인의 아미노산 서열은 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역은 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00013
또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, (i) VH 도메인의 아미노산 서열이 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역이 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (ii) VL 도메인의 아미노산 서열이 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역이 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, (i) VH 도메인의 아미노산 서열이 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역이 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (ii) VL 도메인의 아미노산 서열이 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄의 불변 영역이 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자 또는 쥣과 IgG, IgE, IgM, IgD, 또는 IgA 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 임의의 부류 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 임의의 아부류 (예를 들면, IgG2a 및 IgG2b)의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 불변 영역은 쥣과 IgG, IgE, IgM, IgD, 또는 IgA 면역글로불린 분자, 면역글로불린 분자의 임의의 부류 (예를 들면, IgG1, IgG2, 및 IgG3,), 또는 임의의 아부류 (예를 들면, IgG2a 및 IgG2b)의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인 및 쥣과 불변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인 및 토끼 불변 도메인을 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가공된 변이체에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 여기서, 상기 가공은 예를 들면, 하나 이상의 CDR (예를 들면, VL-CDR2)에서 하나 이상의 당화 부위를 제거한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6 및 10의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 6 및 11의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 6의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 쥣과 IgG1 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J511)을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 6의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 쥣과 IgG2a 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J512)을 추가로 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 7 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가공된 변이체에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 7 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 여기서, 상기 가공은 예를 들면, 하나 이상의 CDR (예를 들면, VL-CDR2)에서 하나 이상의 당화 부위를 제거한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 7 및 10의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 7 및 11의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 7의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 추가로 쥣과 IgG1 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J513)을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 7의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 쥣과 IgG 2a 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J514)을 추가로 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가공된 변이체에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 8 및 9의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 여기서, 상기 가공은 예를 들면, 하나 이상의 CDR (예를 들면, VL-CDR2)에서 하나 이상의 당화 부위를 제거한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 8 및 10의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 서열번호 8 및 11의 아미노산 서열의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 8의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 추가로 쥣과 IgG1 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J515)을 포함한다. 특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 8의 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 쥣과 IgG 2a 중쇄의 불변 도메인 (예를 들면, J516)을 추가로 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) M6의 CDR 서열 (예를 들면, 서열번호 22-26 및 29의 아미노산 서열), (ii) M6 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 VH 및 VL 서열 (예를 들면, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL), (iii) 쥣과 IgG2a M6 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄) 또는 (iv) 쥣과 IgG1 M6의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄)을 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) M11의 CDR 서열 (예를 들면, 서열번호 22-25, 27 및 29의 아미노산 서열), (ii) M11 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 VH 및 VL 서열 (예를 들면, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL), (iii) 쥣과 IgG2a M11 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄) 또는 (iv) 쥣과 IgG1 M11의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄)을 포함한다.
특이적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) M15의 CDR 서열 (예를 들면, 서열번호 22-25, 28 및 29의 아미노산 서열), (ii) M15 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 VH 및 VL 서열 (예를 들면, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL), (iii) 쥣과 IgG2a M15 또는 이의 탈-N-당화된 변이체의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄) 또는 (iv) 쥣과 IgG1 M15의 중쇄 및 경쇄 서열 (예를 들면, 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄)을 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서, (i) 중쇄는 표 1에 열거된 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 22-24)을 포함하는 VH 도메인을 포함하고; (ii) 경쇄는 표 1에 열거된 동일한 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 25, 26, 및 29, 25, 27, 및 29, 또는 25, 28, 및 29)을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; (iii) 중쇄는 쥣과 IgG1 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함함) 또는 쥣과 IgG2a 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함함)을 추가로 포함하고; (iv) 경쇄는 쥣과 카파 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함함)을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서, (i) 중쇄는 표 1에 열거된 항체의 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 6-8)을 포함하는 VH 도메인을 포함하고; (ii) 경쇄는 표 1에 열거된 동일한 항체의 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 9-11)을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; (iii) 중쇄는 쥣과 IgG1 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함함) 또는 쥣과 IgG2a 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함함)을 추가로 포함하고; (iv) 경쇄는 쥣과 카파 불변 도메인 (예를 들면, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함함)을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 표 7에 제시된 항체에 대해 본원에 기재된 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 38-49)을 갖는 1개, 2개 이상의 VH 골격 영역 (FR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 표 7에 제시된 항체에 대해 본원에 기재된 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 50-53)을 갖는 1개, 2개 이상의 VL 골격 영역 (FR)을 포함한다. 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 표 7에 제시된 항체에 대해 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개 이상의 VH 골격 영역, 및 표 7에 제시된 동일한 항체에 대해 본원에 기재된 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 38-41 및 50-53; 서열번호 42-45 및 50-53; 또는 서열번호 46-49 및 50-53)을 갖는 1개, 2개 이상의 VL 골격 영역을 포함한다.
Figure pct00014
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 표 7에서 본원에 기재된 VH 골격 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 골격 영역 (FR)을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 표 7에서 본원에 기재된 VL 골격 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 골격 영역 (FR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 것으로, 상기 표 7에서 본원에 기재된 VH 골격 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 골격 영역 (FR) 및 표 7에서 본원에 기재된 VL 골격 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 골격 영역 (FR)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, J511-J522)과 동일한 B7-H4의 에피토프 (예를 들면, 인간 B7-H4의 에피토프)에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
2개의 항체가 중첩 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 경쟁 결합 검정이 사용될 수 있다. 경쟁 결합은 시험 중에 있는 면역글로불린이 참조 항체의 B7-H4와 같은 통상의 항원으로의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 결정될 수 있다. 수많은 유형의 경쟁 결합 검정은 예를 들면 공지되어 있다: 고형상 직접적 또는 간접적 방사선면역검정 (RIA), 고형상 직접적 또는 간접적 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (Stahli C 등, (1983) Methods Enzymol 9: 242-253을 참조한다); 고형상 직접적 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland TN 등, (1986) J Immunol 137: 3614-9을 참조한다); 고형상 직접적 표지된 검정, 고형상 직접적 표지된 샌드위치 검정(Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press을 참조한다); I-125 표지를 사용한 고형상 직접적 표지 RIA (Morel GA 등, (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15을 참조한다); 고형상 직접적 비오틴-아비딘 EIA (Cheung RC 등, (1990) Virology 176: 546-52을 참조한다); 및 직접적 표지된 RIA. (Moldenhauer G 등, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82을 참조한다). 전형적으로, 그러한 검정은 고형 표면 또는 이들 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린 중 어느 하나를 함유하는 세포에 결합된 정제된 항원 (예를 들면, 인간 B7-H4와 같은 B7-H4)의 용도를 포함한다. 경쟁 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고형 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일반적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이것은 참조 항체의 통상의 항원으로의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 이상으로 억제할 것이다. 경쟁 결합 검정은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용한 다수의 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 상기 검정의 통상의 버전에서, 항원은 96-웰 플레이트상에 고정화시킨다. 이어서, 표지된 항체의 항원으로의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사능활성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다. 추가의 세부 사항에 대해 예를 들면, Wagener C 등, (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C 등, (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M 등, (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M 등, (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M 등, (1992) Hybridoma 11: 391-407 및 Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors 상기, pp. 386-389을 참조한다.
하나의 구현예에서, 경쟁 검정은 예를 들면, Abdiche YN 등, (2009) Analytical Biochem 386: 172-180에 기재된 것과 같은 "탠덤 접근법"에 의해 표면 플라스몬 공명 (BIAcore®)을 사용하여 수행되고, 이에 의해 B7-H4 항원은 칩 표면, 예를 들면, CM5 센서 칩상에 고정화되고, 이어서 항-B7-H4 항체를 칩 상에 전개한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에 기재된 항-B7-H14 항체와 경쟁하는지를 결정하기 위해, 항-B7-H4 항체를 먼저 칩 표면 상에 전개하여 포화를 성취하고, 이어서 잠재적 경쟁 항체를 첨가한다. 이어서, 경쟁 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 결정되고 비-경쟁 대조군에 상대적으로 정량화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 포르테비오 옥테트 (Fortebio Octet) 경쟁 결합을 사용하여 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 또 다른 B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 B7-H4로의 결합을 경쟁적으로 억제하는지를 결정한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 당업자에게 공지된 또는 본원에 기재된 검정 (예를 들면, ELISA 경쟁 검정 또는 현탁 어레이 또는 표면 플라스몬 공명 검정)을 사용하여 결정시, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 대한 결합으로부터 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, J511-J522)을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체가 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에서는 J511-J522의 임의의 것과 동일한 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4) 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
특이적 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 것으로, Fab, Fab', F(ab')2, 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 상기 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 본원에 기재된 바와 같은 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 하기 섹션 5.3에서 논의된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다.
항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 표지 또는 물질에 융합되거나 접합될 수 있다 (예를 들면, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다). 검출 가능한 표지 또는 물질의 예는 효소 표지, 예를 들면, 글루코스 옥시다제; 방사능동위원소, 예를 들면, 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 트리튬 (3H), 인듐 (121In), 및 테크네튬 (99Tc); 발광성 표지, 예를 들면, 루미놀; 및 형광성 표지, 예를 들면, 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 그러한 표지된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4) 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들면, 하기 섹션 5.4.1을 참조한다.
항체 생산
B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 화학적 합성으로 또는 재조합 발현 기법으로 항체 및 이의 항원-결합 단편의 합성을 위하여 당업계에서 공지된 임의의 방법으로 생산될 수 있다. 본원에서 기재된 방법은, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전적 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 당업계 내의 관련된 분야에서 종래의 기법을 이용한다. 이들 기법은, 예를 들면, 본원에 인용된 참고문헌에서 기재되고 상기 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들면, Sambrook J 등, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B 등, (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고한다.
특정 측면에서, 본원에서는 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 단계 포함하는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 본원에서는 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포 (예를 들면, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 (예를 들면, 재조합적으로 발현하는) 단계를 포함하는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 세포는 단리된 세포이다. 특정 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 세포에 도입되었다. 특정 구현예에서, 방법은 추가로 세포 또는 숙주 세포로부터 수득된 항체 또는 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 포함한다.
다클론성 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 등, eds., John Wiley and Sons, New York를 참조한다).
단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술, 효모-기반 제공 기술 또는 이의 조합물의 사용을 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지되고, 예를 들면, Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)에 교시되거나 Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495에 기재된 바와 같은 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 기재된 항체를 선택하고 생성하기 위해 사용될 수 있는 효모-기반 제공 방법의 예는 예를 들면, WO2009/036379A2; WO2010/105256; 및 WO2012/009568에 기재된 것들을 포함하고, 상기 문헌 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
특이적 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 먼저 상기 언급된 바와 같이 Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)에 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 또 다른 적당한 숙주 동물은 상기 기재된 바와 같이 면역화하여 면역화를 위해 사용되는 단백질, 예를 들면, B7-H4 외부 세포 도메인 (ECD) 단백질 (서열번호 20)에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발한다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986).
특이적 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 클론 세포 (예를 들면, 재조합 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생성되는 항체 또는 항원-결합 단편이고, 여기서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들면, ELISA 또는 당업계에 공지되거나 본원에 제공된 실시예에서의 다른 항원-결합 검정에 의해 결정된 바와 같이 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 설치류 또는 쥣과 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 본원에 기재된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 예를 들면, 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현되는 단클론성 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 다른 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들면, 상기 Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 등을 참조한다).
본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인 (Fab 단편을 생성하기 위해) 또는 펩신 (F(ab')2 단편을 생성하기 위해)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질용해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 사량체 항체 분자의 2개의 동일한 아암 중 하나에 상응하고 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 형성하는 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 결합된 사량체 항체 분자의 2개의 항원-결합 아암을 함유한다.
추가로, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 당업계에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 및/또는 효모-기반 제공 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 단백질은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반하는 파아지 입자의 표면상에 나타낸다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리 (예를 들면, 환부 조직의 인간 또는 쥣과 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고 파아지미드 벡터에 클로닝된다. 벡터를 이. 콜라이에 전기 천공시키고 이. 콜라이에 헬퍼 파아지를 감염시킨다. 이들 방법에 사용되는 파아지는 전형적으로 필라멘트 파아지이고, 이는 fd 및 M13을 포함하고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 재조합적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 융합된다. 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 파아지는 항원을 사용하여, 예를 들면, 표지된 항원 또는 고형 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택되거나 동정될 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 Brinkman U 등, (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS 등, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA 등, (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L 등, (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT 출원 번호 PCT/GB91/001134; International Publication Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO 97/13844; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호에 개시된 것들을 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입을 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
특정 측면에서, 본원에서는 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4) 항원에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인 (예를 들면, 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 벡터, 예를 들면, 숙주 세포 (예를 들면, 이. 콜라이 및 포유류 세포)에서 재조합 발현을 위해 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
특정 측면에서, 본원에서는 B7-H4 폴리펩타이드 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하고 본원에 기재된 바와 같이 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 뿐만 아니라, B7-H4 폴리펩타이드 (예를 들면, 용량 의존성 방식으로) 결합하는 것에 대해 그러한 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁하거나 그러한 항체 또는 항원-결합 단편의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
또한, 본원에서는 서열번호 6-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 본원에서는 서열번호 9-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 본원에서는 서열번호 22-24로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 서열번호 22-24 전부의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다. 또한, 본원에서는 서열번호 25-29로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 서열번호 25, 26, 및 29 전부를 포함하거나, 서열번호 25, 27, 및 29 전부를 포함하거나, 서열번호 25, 28, 및 29 전부를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 본원에서는 서열번호 16-18, 89, 90 및 91로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 본원에서는 서열번호 19, 30 및 31로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 본원에서는 표 8에 나타낸 중쇄 및/또는 경쇄-암호화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 예를 들면, 여기서, 암호화된 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 B7-H4에 특이적으로 결합한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 13의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 14의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 93의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 94의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 95의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다.
또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 96의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 97의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함한다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 12 또는 93의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 13 또는 94의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 14 또는 95의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 3개의 CDR-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 13의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 14의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 93의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 94의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 95의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다.
또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 96의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다. 또한 본원에서는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 97의 가변 도메인-암호화 서열을 포함한다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 12 또는 93의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 13 또는 94의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 본원에서는 (i) 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 14 또는 95의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 (ii) 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 서열번호 15, 96 또는 97의 가변 도메인-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 80%, 85% 또는 90% 동일한 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 96% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 97% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 또한, 본원에서는 각각 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 조합은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함하고, 여기서, 상기 중쇄는 표 3에 제시된 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 6-8)을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 쥣과 감마 (γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역 (예를 들면, IgG1 또는 IgG2a)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 조합은 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하고, 여기서, 상기 경쇄는 표 4에 제시된 아미노산 서열 (예를 들면, 서열번호 9-11)을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 쥣과 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함한다.
특이적 구현예에서, 본원에서는 본원에 지정된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 예를 들면, 표 1을 참조한다.
또한, 예를 들면, 코돈/RNA 최적화, 이종성 신호 서열로의 대체, 및 mRNA 불안정 요소의 제거에 의해 최적화되는 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에서 제공된다. mRNA에서 억제 영역의 제거 및/또는 코돈 변화 (예를 들면, 유전자 암호의 축퇴로 인해 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 변화)의 도입으로 재조합 발현을 위하여 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인 (예를 들면, 중쇄, 경쇄, VH 도메인, 또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화된 핵산의 생성 방법은, 따라서, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; 및 6,794,498에 기재된 최적화 방법을 적용함으로써 수행될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 널리 공지된 방법 (예를 들면, PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원 (예를 들면, 하이브리도마) 기원의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들면, 공지된 서열의 3' 및 5' 말단에 하이브리드화될 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 관심 대상의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득할 수 있다. 그러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득할 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포에서 발현을 위해 그리고 예를 들면, 키메라 및 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하기 위한 추가의 클로닝을 위해 벡터에 클로닝될 수 있다.
본원에서 제공된 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들면, RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고, DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일 가닥이면, DNA는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 초과의 내인성 인트론이 결핍된 DNA 또는 cDNA이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비-자연 발생 폴리뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합으로 생산된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 단리된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 순수하다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 천연 성분으로부터 정제된다.
세포 및 벡터
특정 측면에서, 본원에서는 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포에서 재조합 발현을 위해 항-B7-H4 항체 및 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 또한, 본원에서는 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 재조합적으로 발현하기 위해 그러한 벡터를 포함하는, 세포, 예를 들면, 숙주 세포가 제공된다. 특정 측면에서, 본원에서는 숙주 세포에서 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하기 위한 방법이 제공된다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인(예를 들면, 본원에 기재된 중쇄 또는 경쇄)의 재조합 발현은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 포함한다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인 (예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성을 위한 벡터는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인 (예를 들면, 경쇄 또는 중쇄) 암호화 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 도메인 (예를 들면, 경쇄 또는 중쇄) 암호화 서열 및 적당한 전사 및 해독 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 예를 들면, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전학적 재조합을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 중쇄 또는 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 프로모터에 작동적으로 연결된 중쇄 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 그러한 벡터는 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 불변 영역 (예를 들면, 국제 공개 번호 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호를 참조한다)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄 또는 전체 중쇄 및 경쇄 둘 다의 발현을 위해 그러한 벡터에 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 세포 (예를 들면, 숙주 세포)에 전달될 수 있고, 이어서 수득한 세포는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 6개 CDR, 서열번호 6-8의 VH, 서열번호 9-11의 VL, 서열번호 6-8의 VH 및 서열번호 9-11의 VL, 서열번호 16-18, 89, 90, 또는 91의 중쇄, 서열번호 19, 30, 31의 경쇄, 또는 서열번호 16-18, 89, 90 또는 91의 중쇄 및 서열번호 19, 30 또는 31의 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 생성하기 위해, 통상적인 기술에 의해 배양될 수 있다. 따라서, 본원에서는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 6개의 CDR, 서열번호 6-8의 VH, 서열번호 9-11의 VL, 서열번호 6-8의 VH 및 서열번호 9-11의 VL, 서열번호 16-18, 89, 90, 또는 91의 중쇄, 서열번호 19, 30 또는 31의 경쇄, 또는 서열번호 16-18, 89, 90 또는 91의 중쇄 및 서열번호 19, 30 또는 31의 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포가 제공되고, 숙주 세포에서 그러한 서열의 발현을 위해 프로모터에 작동적으로 연결된다. 특정 구현예에서, 이중-쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터는 개별적으로 하기에 상세히 기재된 바와 같이 전체 면역글로불린의 발현을 위해 숙주 세포에서 동시 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다 또는 이의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 함유한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 2개의 상이한 벡터를 함유하고, 제1 벡터는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 벡터는 본원에 기재된 항체 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27 또는 28 및 29의 6개의 CDR을 포함하는 항체) 또는 이의 도메인의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 숙주 세포는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27 또는 28 및 29의 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특이적 구현예에서, 중쇄/중쇄 가변 영역은 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 형성하기 위해 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 연합된 제1 세포에 의해 발현된다. 특정 구현예에서, 본원에서는 그러한 제1 숙주 세포 및 그러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 집단이 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에서는 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄/경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 중쇄/중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단이 제공된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본원에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,807,715호를 참조한다). 그러한 숙주-발현 시스템은 비히클을 나타내고 이에 의해 관심 대상의 암호화 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있고 또한 적당한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우 동일계 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (예를 들면, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스 (B. Subtilis))과 같은 미생물; 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들면, 사카로마이세스 피키아 (Saccharomyces Pichia)); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템 (예를 들면, 클라미도모나스 레인하르트티 (Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹색 조류); 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 레이트 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유류 세포 시스템 (예를 들면, COS (예를 들면, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 이의 항원-결합 단편 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 발현하기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들면, CHO GS System™ (Lonza)으로부터의 CHO 세포이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체를 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예를 들면, 인간 세포주이다. 특이적 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 특정 구현예에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)와 같은 세균 세포 또는 진핵 세포 (예를 들면, 포유류 세포)는 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스로부터 주요 중간체 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 연계된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유류 세포는 항체를 위해 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105; 및 Cockett MI 등, (1990) Biotechnology 8: 662-667). 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 또는 VL을 함유하는 벡터를 작제하는 데 사용된다. 하나의 특이적 구현예에서, VH 서열에 대한 발현 벡터를 작제하기 위해 사용되는 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 4에 제공된다. 또 다른 특이적 구현예에서, VL 서열에 대한 발현 벡터를 작제하기 위해 사용되는 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 5에 제공된다.
하나의 특이적 구현예에서, VH 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 ATGGGC AGGCTT ACTTCT TCATTC CTGCTA CTGATT GTCCCT GCATAT GTCCTG TCC (서열번호 2)로서 제공된다. 또 다른 특이적 구현예에서, VH 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 MGRLTSSFLLLIVPAYVLS (서열번호 4)로서 제공된다.
하나의 특이적 구현예에서, VL 신호 펩타이드의 뉴클레오타이드 서열은 ATGAAG TTGCCT GTTAGG CTGTTG GTGCTG ATGTTC TGGATT CCTGCT TCCGGC AGT (서열번호 3)로서 제공된다. 또 다른 특이적 구현예에서, VL 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 MKLPVRLLVLMFWIPASGS (서열번호 5)로서 제공된다.
추가로, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 목적하는 특정 측면으로 유전자 생성물을 변형시키고 처리하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 그러한 변형 (예를 들면, 당화) 및 처리 (예를 들면, 절단)는 단백질의 기능에 기여할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체, 당화 및 인산화의 적당한 처리를 위한 세포 기구를 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 그러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (내인성으로 임의의 면역글로불린 쇄를 생성하지 않는 쥣과 골수종 세포주), CRL7O3O, COS (예를 들면, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 생성된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 (예를 들면, 서열번호 22-25, 26, 27, 또는 28, 및 29의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 Potelligent® CHOK1SV 세포에서 생성된다.
본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 재조합 발현에 의해 생성되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기재되거나 다른 방법으로 정제를 촉진시키기 위해 당업계에 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
특이적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단리 또는 정제된다. 일반적으로, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과는 상이한 항원성 특이성을 가진 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 실질적으로 없다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제제는 세포성 물질 및/또는 화학적 전구체가 실질적으로 없다.
용도 및 방법
검출 및 진단학적 용도
본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들면, 섹션 5.2을 참조한다)을 사용하여, 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 면역조직화학 (IHC), 면역침전 및 웨스턴 블롯팅과 같은 면역검정을 포함하는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 B7-H4 단백질 수준을 검정할 수 있다.
적합한 항체 검정 표지는 당업계에 공지되어 있고 효소 표지, 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 및 글루코스 옥시다제; 방사능동위원소, 예를 들면, 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 트리튬 (3H), 인듐 (121In), 및 테크네튬 (99Tc); 합텐, 형광성 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 발광성 분자, 광친화성 분자, 유색 입자 및/또는 리간드, 예를 들면, 비오틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 (효소 태그)는 발색성 기질과의 접촉시 유색 생성물을 생성할 것이다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼린 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 및/또는 글루코스 옥시다제를 포함한다.
그러한 표지를 사용하여 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 표지할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인지하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표지될 수 있고 B7-H4 단백질 수준을 검출하기 위해 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 이차 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들면, 항-마우스 또는 항-설치류 항체는 효소 (예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제)로 표지되고 효소의 기질 (예를 들면, 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB))을 사용하여 검출된다.
여러 방법들이 항체의 이의 접합체 모이어티로의 접착 또는 접합을 위해 당업계에 공지되어 있다. 일부 접착 방법은 예를 들면, 유기 킬레이팅제, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착물의 용도를 포함한다 (미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다). 단클론성 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응될 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재하에 제조되거나 또는 이소티오시아네이트와 반응시킴으로써 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미지화는 예를 들면, 단클론성 항체를 사용하여 성취되고, 검출 가능한 이미지화 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-석신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 구현예에서, 항체 조합 부위를 변형시키지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에서 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 상기 방법론에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내는 것으로 개시되어 있다 (본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,196,066호). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역에서 탄수화물 잔기로 접합되는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 접착은 또한 문헌(O'Shannessy 등, Biotechnol Appl Biochem.　1987　Dec;9(6):488-96)에 개시되어 있다.
B7-H4 단백질의 발현 수준에 대한 검정은 직접적으로 (예를 들면, 절대 단백질 수준을 결정하거나 평가함으로써) 또는 상대적으로 (예를 들면, 제2 생물학적 샘플 또는 표준물에서 B7-H4 단백질 수준과 비교함으로써) 제1 생물학적 샘플에서 B7-H4 단백질의 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 평가하는 단계를 포함하는 것으로 의도된다. 제1 생물학적 샘플에서의 B7-H4 폴리펩타이드 발현 수준은 측정되거나 평가될 수 있고, 표준물 B7-H4 단백질 수준과 비교될 수 있고, 표준물은 질병을 갖지 않는 제2 생물학적 샘플로부터 결정되거나 또는 질병을 갖지 않는 샘플 집단으로부터 수준을 평균화시킴으로써 결정된다. 당업계에서 인지되는 바와 같이, "표준물" B7-H4 폴리펩타이드 수준이 공지되어 있다면, 이것은 비교를 위한 표준물로서 반복적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 샘플"은 대상체, 세포주, 조직 또는 잠재적으로 B7-H4를 발현하는 세포의 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 언급한다. 본 발명에 사용하기 위한 생물학적 샘플의 비제한적인 공급원은 예를 들면, 고형 조직, 생검, 복수, 흡인물, 유체 추출물, 혈액 (순환 종양 세포를 포함함), 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 섹션, 호흡관, 장관, 및 비뇨생식관, 눈물, 침, 밀크, 종양, 기관, 세포 배양물 및/또는 세포 배양물 성분들을 포함한다. 동물 (예를 들면, 인간)로부터 조직 생검 및 체액을 수득하기 위한 방법은 당업계에서 널리 공지되어 있다. 순환 종양 세포 (CTC)를 수득하는 예시적인 방법은 Ferreira 등, Molecular Oncology 10: 374-394에 개시되어 있고, 상기 문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 예를 들면, CTC는 면역친화성-기반 또는 생물리학적-기반의 전략을 사용하여 혈액 샘플로부터 집적될 수 있다. CTC는 또한 직접적인 이미지화 모달리티를 사용하여 수득될 수 있다. 면역조직화학 (IHC) 검정에 사용될 수 있는 생검을 수득하고 처리하는 예시적인 방법은 본원의 실시예 4에서 제공된다.
본원에 기재된 항-B7-H4 항체는 당업자에게 널리 공지된 시험관내 적용 및 표준물을 포함하는 진단학적 적용을 위해 사용될 수 있고 본원의 개시내용을 기준으로 한다. B7-H4의 시험관내 평가를 위한 진단학적 검정 및 키트를 사용하여 암에 걸린 것으로 알려졌거나 암에 걸린 것으로 의심되는 환자를 포함한 환자 샘플을 평가할 수 있다. 상기 유형의 예후적 및 진단학적 모니터링 및 평가는 실제로 예를 들면, 유방암 (HercepTestTM, Dako)에서 HER2 단백질에 대해 항체를 사용하는 것이고, 여기서, 상기 검정은 Herceptin®을 사용한 항체 치료요법에 대한 환자를 평가하기 위해 사용된다.
본원에 기재된 항-B7-H4 항체 및 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 또는 기능적인 표지를 가질 수 있다. 형광성 표지가 사용되는 경우, 현재 가용한 현미경 및 형광-활성화된 세포 분류기 분석 (FACS) 또는 당업계에 공지된 방법 과정 둘 다의 조합을 사용하여 특이적 결합 구성원을 동정하고 정량화할 수 있다. 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 형광성 표지를 가질 수 있다. 예시적인 형광성 표지는 예를 들면, 반응성 및 접합된 프로브, 예를 들면, 아미노쿠마린, 플루오레세인 및 텍사스 레드, 알렉사 플루오르 염료, Cy 염료 및 DyLight 염료를 포함한다. 항-B7-H4 항체는 방사능활성 표지, 예를 들면, 동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac 및 186Re를 가질 수 있다. 방사능활성 표지가 사용된 경우, 당업계에 공지된 현재 가용한 계수 과정을 사용하여 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편의 B7-H4 (예를 들면, 인간 B7-H4)로의 특이적 결합을 동정하고 정량화할 수 있다. 표지가 효소인 경우에, 검출은 당업계에 공지된 바와 같이, 현재 사용되는 비색측정, 분광측정, 형광분광측정, 전류 측정 또는 가스측정 기술 중 어느 하나에 의해 성취될 수 있다. 이것은 샘플 또는 대조군 샘플을 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 B7-H4 간의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 성취될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 B7-H4 간에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. B7-H4에 대해 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특이적 결합의 측면에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, 전체 세포에서, 세포 막 상에서 또는 세포질에서 B7-H4 발현을 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 면역친화성 정제를 통해 B7-H4를 정제하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본원에는 예를 들면, B7-H4의 존재 정도에 대한 정량적 분석을 위해 시험 키트 형태로 제조될 수 있는 검정 시스템이 포함된다. 시스템 또는 시험 키트는 표지된 성분, 예를 들면, 표지된 항체 또는 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 추가의 면역화학적 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트에 대한 보다 상세한 내용은 하기 섹션 5.4.3을 참조한다.
일부 측면에서, 샘플에서 B7-H4를 검출하기 위한 시험관내 방법은 샘플과 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에서는 샘플 중에 B7-H4를 시험관내 검출하기 위해 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도가 제공된다. 하나의 측면에서, 본원에서는 대상체 또는 대상체로부터 수득된 샘플에서 B7-H4의 검출에 사용하기 위한 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 하나의 측면에서, 본원에서는 진단제로서 사용하기 위해 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 검출 가능한 표지를 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, B7-H4는 인간 B7-H4이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다. 추가의 구현예에서, 대상체, 예를 들면, 인간 대상체는 암에 걸렸다.
일부 측면에서, 본 발명은 B7-H4에 결합시키고 이를 검출하기 위한 면역검출 방법을 고려한다. 본 발명에 따라 제조된 항체는 B7-H4를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 면역검출 방법은 몇몇을 거론하자면 면역조직화학, 유동 세포측정, 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA), 면역방사선측정 검정, 형광면역검정, 화학발광검정, 생물발광 검정, 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 다양하게 유용한 면역검출 방법의 단계는 예를 들면, Doolittle M H 및 Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37; Gulbis B 및 Galand P, Hum Pathol. 1993 Dec;24(12):1271-85; 및 De Jager R 등, Semin Nucl Med. 1993 Apr;23(2):165-79과 같은, 본원에 참조로 각각 인용된 과학적 문헌에 기재되어 있다.
일반적으로, 면역결합 방법은 샘플, 예를 들면, B7-H4를 포함할 것으로 의심되는 샘플을 수득하고 상기 샘플을 면역복합체의 형성을 가능하게 하는 데 효과적인 조건하에서 본 발명에 따른 제1 항-B7-H4 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
면역 복합체 (일차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하는 효과적인 조건하에 그리고 이에 충분한 일정 기간 동안 선택된 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키는 단계는 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 첨가하고 항체가, 존재하는 임의의 B7-H4와 면역 복합체를 형성하고, 즉 특이적으로 결합하기에 충분한 일정 기간 동안 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함한다. 상기 시간 후, 샘플-항체 조성물, 예를 들면, 조직 섹션, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은 일반적으로 임의의 비-특이적으로 결합된 항체 종을 제거하기 위해 세척되어 일차 면역 복합체 내 특이적으로 결합된 이들 항체만이 검출되도록 할 것이다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있고 수많은 접근법의 적용을 통해 성취될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 이들 방사능활성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중 어느 하나와 같은 표지 또는 마커의 검출을 기준으로 한다. 그러한 표지의 용도에 관한 미국 특허는 미국 특허 번호 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241를 포함하고, 이들 각각은 본원에서 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 이차 결합제, 예를 들면, 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 정렬은 당업계에 공지된 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 일차 면역 복합체내에 결합하게 되는 제1 항체는 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 결합제에 의해 검출될 수 있다. 이들 경우에, 제2 결합제는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합제는 따라서 흔히 그 자체가 "이차" 항체로 호칭될 수 있는 항체이다. 일차 면역 복합체는 이차 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 효과적인 조건하에서 및 이에 충분한 일정 기간 동안 표지된 이차 결합제 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서, 이차 면역 복합체는 일반적으로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 표지된 이차 항체 또는 리간드를 제거하고, 이어서 이차 면역 복합체 내 나머지 표지가 검출된다.
추가의 방법은 2-단계 접근법에 의한 일차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 항체와 같은 제2 결합제는 상기 기재된 바와 같이 이차 면역 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 세척 후, 이차 면역 복합체는 다시 면역 복합체 (삼차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하는 효과적인 조건하에 그리고 이에 충분한 일정 기간 동안 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 결합제 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 이와 같이 형성된 삼차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이러한 시스템은 이것이 요구되는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 비오티닐화된 단클론성 또는 다클론성 항체는 표적 항원(들)을 검출하기 위해 사용되고, 이어서, 제2 단계 항체는 복합체화된 항체에 접착된 비오틴을 검출하기 위해 사용된다. 상기 방법에서, 시험될 샘플은 먼저 제1 단계 항체를 포함하는 용액 중에서 항온처리한다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부는 특이적으로 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는 스트렙타비딘 (또는 아비딘) 및 비오티닐화된 DNA 및/또는 상보성 비오티닐화된 DNA의 연속 용액 중에서 항온처리함으로써 증폭되고, 각각의 단계는 부가적 비오틴 부위를 항체/항원 복합체에 부가한다. 증폭 단계는 적합한 수준의 증폭이 성취될 때까지 반복되고 상기 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 포함하는 용액 중에서 항온처리된다. 상기 제2 단계 항체는 예를 들면, 크로모겐 기질을 사용하여 조직효소법에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적합한 증폭과 함께, 거시적으로 가시적인 접합체가 생산될 수 있다.
하나의 구현예에서, 면역조직화학(IHC)은 면역학적 검출을 위해 사용된다. IHC를 사용하여, 샘플 중에 B7-H4의 검출은 샘플을 결합제, 예를 들면, 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 표적화시킴으로써 성취될 수 있다. 결합제는 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지에 연결될 수 있거나 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지에 결합된 또 다른 결합제에 의해 검출될 수 있다. 하나의 구현예에서, 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)은 IHC 검정에서 B7-H4에 결합된 일차 항체를 검출하기 위해 사용된다. 하나의 구현예에서, IHC 검정에서 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 μg/ml 내지 약 50 μg/ml이다. 하나의 구현예에서, IHC 검정에서 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 μg/ml 내지 약 20 μg/ml이다. 하나의 구현예에서, IHC 검정에서 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 10 μg/ml이다.
IHC는 혈액, 혈장, 혈청 또는 림프액 등으로부터의 세포, 세포 펠렛, 조직, 제제에 대해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 고정된 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 파라핀 매립된 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 샘플이다.
하나의 구현예에서, 유동 세포측정은 면역학적 검출을 위해 사용된다. 따라서, 예를 들면, 세포 당 결합된 항체 (ABC)의 수는 유동 세포측정을 사용하여 평가될 수 있다.
치료학적 용도 및 방법
하나의 측면에서, 본원에서는 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 B7-H4-발현 암을 치료하기 위한 방법이 제공되고, 여기서, B7-H4 발현은 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 검출되었다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 B7-H4를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 특정 구현예에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유방암 (예를 들면, 3중 음성 유방암, 호르몬 수용체 (HR) 양성 유방암, 관 암종), 자궁내막 암종, 난소암, 비-소세포 폐암 (예를 들면, 편평 세포 암종),췌장암, 갑상선암, 신장암 (예를 들면, 신장 세포 암종), 및 방광암 (예를 들면, 요로상피 세포 암종).
치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, 20502 및 22213 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 20502 및 22213 항체에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 표 9 및 10에 제공된다.
Figure pct00019
Figure pct00020
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 20502의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 22213의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR일 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 각각 서열번호 32-37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 각각 서열번호 58-63의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
키트
본원에서는 본원에 기재된 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 접합체 (예를 들면, 검출 접합체)를 포함하는 키트가 제공된다. 본원에 제공된 바와 같이, 키트는 진단학적 방법에 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 정제된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특이적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 대조군으로서 사용될 수 있는 실질적으로 단리된 B7-H4 항원 (예를 들면, 인간 B7-H4)을 함유한다. 특이적 구현예에서, 본원에 제공된 키트는 재조합적으로 생산되거나 또는 화학적으로 합성된 B7-H4 항원을 포함할 수 있다. 키트에 제공되는 B7-H4 항원은 또한 고형 지지체에 접착될 수 있다.
또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 추가로 B7-H4 항원과 반응하지 않는 대조군 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 B7-H4 항원으로의 특이적 결합을 검출하기 위해 하나 이상의 요소들을 함유한다 (예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 형광성 화합물, 효소, 효소 기질, 방사능활성 화합물, 또는 발광성 화합물과 같은 검출 가능한 기질에 접합될 수 있거나, 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인지하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 기질에 접합될 수 있다). 보다 특이적 구현예에서, 상기 기재된 키트의 검출 요소들은 B7-H4 항원이 부착된 고형 지지체를 포함한다. 그러한 키트는 또한 비-접착된 리포터-표지된 항-마우스/설치류 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 B7-H4 항원으로의 결합은 상기 리포터-표지된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 특이적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 B7-H4가 본원에 제공된 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 샘플에서 검출된 경우 투여되어야만 한다는 정보를 추가로 포함한다.
하기의 실시예는 설명을 위해 제공되고 제한되지 않는다.
실시예
본 섹션 (즉 섹션 6)에서의 실시예는 설명을 위해 제공되고 제한되지 않는다.
실시예 1: 하이브리도마 생성
B7-H4에 선택적으로 결합하는 항체 패널은 B7-H4 외부 세포 도메인 (ECD) 단백질의 재조합 가용성 버전을 사용하여 생성하였다:
Figure pct00021
NZB/W 마우스의 각 뒷발 바닥에 Sigma Adjuvant System® (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)에 재현탁된 B7-H4 ECD 단백질을 주사하였다. 혈청을 제1 부스팅 21일 후에 취득하고 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 유동 세포측정에 의해 역가 측정하여 마우스가 양호한 면역 반응을 나타냈는지를 확인하였다. ELISA 및 FACS 스크리닝은 각각 실시예 2 및 3에 상세히 기재되어 있다. 최종 부스팅 3일 후에, 역가-양성 마우스로부터의 슬와림프절 세포를 마우스 골수종 세포주와 융합하였다 (예를 들면, Chuntharapai 등, 1997, Methods Enzymol. 288: 15-27을 참조한다). 약 2880개 래트 하이브리도마 클론을 생성하였다.
이어서, 상기 공정에 의해 생성된 하이브리도마 클론을 B7-H4 ECD 단백질 (서열번호 20), B7-H4 N-말단 IgV-도메인 (아미노산 1-151)-huIgG Fc 융합 단백질 (서열번호 21), 및 이들의 표면 상에 전장 인간 B7-H4 (서열번호 1)를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포에 결합하는 단클론성 항체의 생성에 대해 스크리닝하였다.
Figure pct00022
실시예 2: ELISA 스크리닝
실시예 1에서 생성된 하이브리도마 클론을 스크리닝하기 위해, ELISA를 일반적으로 Baker 등, 2002, Trends Biotechnol, 20:149-156에 기재된 바와 같이 수행하였다.
간략하게, 96-웰 플레이트를 코팅 완충액 (0.05M 카보네이트 완충액, pH 9.6) 중에서 2 μg/ml의 농도로 50 μl의 B7-H4 ECD 단백질 (서열번호 20) 또는 B7-H4 N-말단 Fc 융합 단백질(서열번호 21)로 코팅하고, 밀봉하고 40℃에서 밤새 저장하였다. 코팅 용액을 제거한 후, PBS (pH 7.4) (ELISA 희석제) 중에 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% Tween®-20을 함유하는 200 μl의 검정/차단 용액을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 교반과 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 웰을 PBS (세척 완충액) 중에 300 μl의 0.05% Tween®-20으로 3회 세척하였다. 세척 후, ELISA 희석제 중에 100 μl의 하이브리도마 상등액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 교반과 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 웰을 이전에 기재된 바와 같이 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, ELISA 희석제 중에 서양고추냉이 퍼옥시다제로 커플링된 양 항-마우스 IgG의 100 μl의 1:1000 희석물을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 교반과 함께 1시간 동안 실온에서 항온처리하고, 이전에 기재된 바와 같이 세척 완충액으로 3회 세척하였고, 두드려 건조시켰다. 웰을 100 μl의 테트라메틸벤지딘 (TMB) 마이크로웰 퍼옥시다제 기질을 각각의 웰에 첨가하고 5 내지 10분 동안 또는 양호한 색 변화가 관찰될 때까지 실온에서 항온처리함으로써 전개하였다. 전개는 100 μl의 TMB 종료 용액을 각각의 웰에 첨가하여 중단하였다. 플레이트를 650 nm에서 분석하였다.
사전채혈 및 다혈청을 대조군으로서 사용하였다. 사전채혈 샘플은 면역화 이전의 마우스 혈청을 함유하였고 다혈청 샘플은 면역화 이후 수득된 마우스 항-혈청을 함유하였다. 양성의 ELISA 신호를 부여하는 항체를 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의한 추가의 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 3: FACS 스크리닝
실시예 1에 생성된 하이브리도마 클론을 추가로 스크리닝하기 위해, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)는 전장의 인간 B7-H4 (서열번호 1)를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포를 사용하여 수행하였다. 표준 HEK 293 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 재현탁시키고 5분 동안 40℃에서 500g에서 원심분리하였다. 배지를 흡인 제거하고 세포를 40℃에서 1% 태아 소 혈청 (FBS) (세포 염색 완충액)을 갖는 BD FACSFlowTM 염색 완충액 (BD Biosciences, San Jose, CA) 중에 재현탁시켰다. 세포를 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하고, 배지를 흡인 제거하고, 세포를 40℃에서 세포 염색 완충액 중에 2x106　세포/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 50 μl/웰에서 96-웰 환저 플레이트에 첨가하였다. 각각의 하이브리도마 클론으로부터의 100 μl의 상등액을 각각의 웰에 첨가하여 각각의 하이브리도마 상등액을 B7-H4를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포주 또는 음성 대조군 세포주를 함유하는 하나의 웰과 함께 항온처리하였다. 플레이트를 30분 동안 빙상에서 항온처리하고 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 흡인 제거하였다. 각각의 웰을 40℃에서 200 μl의 세포 염색 완충액 중에 재현탁시켰다. 후속적으로, 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하고 세포 염색 완충액을 흡인 제거하였다. 세척 단계 후, 각각의 웰 중에 세포를 40℃에서 세포 염색 완충액 중에서 R-피코에리트린 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)에 커플링된 염소 항-마우스 IgG Fc의 100 μl의 1:1000 희석물 중에 재현탁시키고, 플레이트를 30분 동안 빙상에서의 암실에서 항온처리하였다. 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하고 상등액을 흡인 제거하였다. 각각의 웰을 40℃에서 200 μl의 세포 염색 완충액 중에 재현탁시키고, 플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 세포 염색 완충액을 흡인 제거하였다. 각각의 웰에서의 세포를 40℃에서 200 μl의 세포 염색 완충액 중에 재현탁시키고, 1.2 ml의 마이크로 역가튜브에 전달하였다. FACS는 FACScanTM 또는 FACSCaliburTM (BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 수행하였다. FACS 검정에서 세포 결합을 보여주는 항체를 면역조직화학 (IHC)에 의한 추가의 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 4: IHC 스크리닝
실시예 1에서 생성된 하이브리도마 클론을 추가로 스크리닝하기 위해, 면역조직화학 (IHC) 염색을 침입성 관 암종 유방 종양을 갖는 대상체로부터 수득된 섹션에 대해 수행하였다.　 포르말린-고정된 파라핀 매립된 (FFPE) 섹션을 5 마이크론으로 절단하고, Superfrost 플러스 하전된 슬라이드 상에서 공기 건조시키고, 60℃에서 1시간 동안 베이킹하였다.　 섹션을 탈파라핀화하고 디스커버리 울트라 자동염색기 (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) 상에서 염색하였다.　 95℃에서 울트라 CC1을 사용한 항원 검색 1시간 후, B7-H4를 제조업자의 지침에 따라 실온에서 1시간 동안 항-B7-H4 마우스 일차 항체로 검출한 다음, Omni-맵 항-마우스 HRP, 크로모맵 (ChromoMap) 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 검출 시스템 및 헤마톡실린 대비염색으로 검출하였다.
7개의 항-B7-H4 일차 항체를 사용하였다: 대조군으로서 사용된 A57.1 (미국 특허 제7,619,068호를 참조한다) (1.25 μg/mL)과 함께 실시예 1에서 생성된 6개 재조합 항체 (10 μg/mL). 2개의 재조합 항체 (J516 및 J512)는 A57.1과 유사한 패턴으로 세포막 및 세포질 상에서 B7-H4를 검출하였고, 다수의 B7-H4-양성 세포가 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이 종양 격실에서 관찰되었다. 재조합 항체는 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 A57.1 보다 1+ 신호 강도 (J512에 의한 35% 대 J516%에 의한 35% 대 A57.1에 의한 58%)를 갖는 보다 적은 수의 B7-H4-발현 세포를 검출하였다. B7-H4 발현이 컴퓨터 이미지 분석에 의해 측정된 경우 (Definiens, Cambridge, MA), J516 및 J512는 도 5a-5c에 나타낸 바와 같이 A57.1에 대한 세포 격실에 걸쳐 있는 B7-H4 신호의 유사한 분포를 입증하였다.
실시예 5: 서열 결정
모두 IHC 염색을 보인 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 항-B7-H4 항체 M6, M11, 및 M15의 서열을 하기의 과정에 따라 결정하였다.
RNA는 트리졸 시약 (Thermofisher Scientific, Carlsbad, CA)을 사용하여 하이브리도마로부터 수거하였고, cDNA는 Smartscribe 역전사효소 (Clontech, Mountain View, CA) 및 어드밴티지 2 폴리머라제 (Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여 제조하였다. PCR은 표준 PCR 조건 하에서 Phusion Taq 폴리머라제(NEB, Ipswich, MA)를 사용하여 수행하였다. 이어서, PCR 생성물은 Zero Blunt® TOPO® 클로닝 키트(Thermofisher Scientific, Carlsbad, CA)를 사용하여 클로닝하였다. 클론은 삽입체에 대해 스크리닝하고, 다중 클론을 서열 분석하여 본래의 중쇄 및 경쇄 유전자 서열을 입증하였다. 중쇄 및 경쇄 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 표 8에 제공된다.
이어서, 항-B7-H4 항체 가변 도메인은 상이한 Fc 영역을 갖는 발현 벡터에 서브클로닝하여 마우스 IgG2a 및 마우스 IgG1 불변 영역을 갖는 항체를 생성하였다. 이어서, 항-B7-H4 중쇄 가변 도메인은 상이한 Fc 영역을 갖는 발현 벡터에 클로닝하여 마우스 IgG2a 및 마우스 IgG1 불변 영역을 갖는 항체를 생성하였다. 항-B7-H4 경쇄 가변 도메인은 마우스 IgK 불변 영역과 함께 발현 벡터에 클로닝하였다. 서열 입증 시, 단리된 항체는 상기 표 1에 특정된 바와 같이 ID J511-J516을 할당하였다.
* * *
본 발명은 본원에서 기재된 특이적 구현예에 의해 범위에서 제한되지 않는다. 사실상, 기재된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 수반되는 도면으로부터 당업계에서 숙련가들에게 명백해질 것이다. 그와 같은 변형은 첨부된 청구항들의 범위 내에 해당하기 위한 것이다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌 (예를 들면, 공보 또는 특허 또는 특허 출원)은 각각의 개별 참고문헌 (예를 들면, 공보 또는 특허 또는 특허 출원)이 참고로 그 전체가 모든 목적을 위해 편입되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그리고 그들 전체가 본원에서 참고로 편입된다.
다른 구현예는 하기 청구항의 범위 내이다.
SEQUENCE LISTING <110> FIVE PRIME THERAPEUTICS, INC. <120> B7-H4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 3986.015PC01/EKS/CLD/M-S <150> US 62/637,740 <151> 2018-03-02 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human B7-H4 <400> 1 Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser 20 25 30 Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile 35 40 45 Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu 50 55 60 Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val 65 70 75 80 His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met 85 90 95 Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr 115 120 125 Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu 130 135 140 Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn 145 150 155 160 Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln 165 170 175 Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser 180 185 190 Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met 195 200 205 Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser 210 215 220 Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val 225 230 235 240 Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser 245 250 255 Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu 260 265 270 Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys 275 280 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH signal peptide <400> 2 atgggcaggc ttacttcttc attcctgcta ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcc 57 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL signal peptide <400> 3 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cggcagt 57 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH signal peptide <400> 4 Met Gly Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL signal peptide <400> 5 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ser <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M6 VH <400> 6 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Asp 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Gln Val Asp Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M11 VH <400> 7 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Gly 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Gln Val Asp Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M15 VH <400> 8 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Leu Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Asp 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Gln Val Asp Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M6, M11, M15 VL <400> 9 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> De-N-glycosylated VL <400> 10 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Val Ala Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> De-N-glycosylated VL <400> 11 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody J512, J517, J518 Heavy chain <400> 12 atgggcaggc ttacttcttc attcctgcta ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60 gtcactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tatggtctgg gtgtaggttg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga ctggctggcc aacatttggt ggaatgatga taaatactat 240 aactcagccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctccaacaa ccaggtattc 300 ctcaagatct ccagtgtgga cactgcagat actggcacat actactgtgc tcaagttgat 360 ggttactact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 420 aaaacgacac caccaagtgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgga gtctgacctc 600 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagccctc ggcccagcga gaccgtcacc 660 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaagtggaca agaaaattgt 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gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact 1140 ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac 1200 gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc tggactctga tggttcttac 1260 ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc 1320 tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat caccacacga ctaagagctt ctcccggact 1380 ccgggtaaat agtaa 1395 <210> 15 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody J511 to J516 Light chain <400> 15 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cggcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatagaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca acgtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttgaca tctggaggtg cctcagtcgt 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Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 93 <211> 1391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J511 Heavy chain <400> 93 tgggcaggct tacttcttca ttcctgctac tgattgtccc tgcatatgtc ctgtcccagg 60 tcactctgaa agagtctggc cctgggatat tgcagccctc ccagaccctc agtctgactt 120 gttctttctc tgggttttca ctgagcactt atggtctggg tgtaggttgg attcgtcagc 180 cttcagggaa gggtctggac tggctggcca acatttggtg gaatgatgat aaatactata 240 actcagccct gaagagccgg ctcacaatct ccaaggatac ctccaacaac caggtattcc 300 tcaagatctc cagtgtggac actgcagata ctggcacata ctactgtgct caagttgatg 360 gttactactg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc tcctcagcca 420 aaacgacacc accaagtgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca 480 tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga 540 actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctggag tctgacctct 600 acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagccctcg gcccagcgag accgtcacct 660 gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aagtggacaa gaaaattgtg cccagggatt 720 gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc 780 caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag 840 acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc 900 acacagctca gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg 960 aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca 1020 gtgcagcttt ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg 1080 ctccacaggt gtacaccatt ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc 1140 tgacctgcat gataacagac ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg 1200 ggcagccagc ggagaactac aagaacactc agcccatcat gaacacgaat ggctcttact 1260 tcgtctacag caagctcaat gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct 1320 gctctgtgtt acatgagggc ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc 1380 ctggtaaatg a 1391 <210> 94 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J513 Heavy chain <400> 94 atgggcaggc ttacttcttc attcctgcta ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60 gtcactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 tgttctctct ctgggttttc actgagcact tatggtctgg gtgtaggttg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctggg ctggctggcc aacatttggt ggaatgatga taaatactat 240 aactcagccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctccaacaa ccaggtattc 300 ctcaagatct ccagtgtgga cactgcagat actggcacat actactgtgc tcaagttgat 360 ggttactact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 420 aaaacgacac caccaagtgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgga gtctgacctc 600 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagccctc ggcccagcga gaccgtcacc 660 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tgaacacgaa tggctcttac 1260 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380 cctggtaaat ga 1392 <210> 95 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J515 heavy Chain <400> 95 atgggcaggc ttacttcttc attcctgcta ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60 gtcactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagtcct cccagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tatggtctgg gtgtaggttg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga ctggctggcc aacatttggt ggaatgatga taaatactat 240 aactcagccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctccaacaa ccaggtattc 300 ctcaagatct ccagtgtgga cactgcagat actggcacat actactgtgc tcaagttgat 360 ggttactact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 420 aaaacgacac caccaagtgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgga gtctgacctc 600 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagccctc ggcccagcga gaccgtcacc 660 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tgaacacgaa tggctcttac 1260 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380 cctggtaaat ga 1392 <210> 96 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J517, J519, and J521 Light Chain <400> 96 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cggcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatagaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca acgttgccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttgaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717 <210> 97 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J518, J520, and J522 Light Chain <400> 97 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cggcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatagaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctacc aggtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttgaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL Framework 4 (AA) <400> 98 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (62)

  1. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열번호 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 각각 서열번호 6 및 9;
    (b) 각각 서열번호 6 및 10;
    (c) 각각 서열번호 6 및 11;
    (d) 각각 서열번호 7 및 9;
    (e) 각각 서열번호 7 및 10;
    (f) 각각 서열번호 7 및 11;
    (g) 각각 서열번호 8 및 9;
    (h) 각각 서열번호 8 및 10; 또는
    (i) 각각 서열번호 8 및 11.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 쥣과 IgG1 또는 IgG2a 중쇄 불변 영역인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 쥣과 IgGκ 경쇄 불변 영역인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 16, 17, 18, 89, 90 또는 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 1 내지 6 또는 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 19, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 각각 서열번호 16 및 19;
    (b) 각각 서열번호 16 및 30;
    (c) 각각 서열번호 16 및 31;
    (d) 각각 서열번호 17 및 19;
    (e) 각각 서열번호 17 및 30;
    (f) 각각 서열번호 17 및 31;
    (g) 각각 서열번호 18 및 19;
    (h) 각각 서열번호 18 및 30;
    (i) 각각 서열번호 18 및 31;
    (j) 각각 서열번호 89 및 19;
    (k) 각각 서열번호 90 및 19; 또는
    (l) 각각 서열번호 91 및 19.
  14. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 J512, J513, J514, J515, J516, J517, J518, J519, J520, J521, 및 J522로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 인간 B7-H4의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 인간 B7-H4로의 결합을 경쟁적으로 억제하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 쥣과 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디설파이드 결합된 Fv, 미니바디, F(ab')3, 디아바디, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는, 항원-결합 단편.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 6, 7 또는 8의 VH 또는 서열번호 16, 17 또는 18의 중쇄를 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 12, 13, 14, 93, 94 또는 95의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  26. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 9, 10 또는 11의 VL 또는 서열번호 19, 30 또는 31의 경쇄를 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 15, 96 또는 97의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  29. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  30. 청구항 23 내지 29 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 벡터.
  31. 청구항 23 내지 29 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 30의 벡터, 또는 청구항 23 내지 25 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터 및 청구항 26 내지 28 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  32. 청구항 31에 있어서, CHO 또는 HEK 세포인, 숙주 세포.
  33. 청구항 31 또는 32의 숙주 세포를 배양하여 핵산 분자가 발현되고 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생산되는 단계를 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법.
  34. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 청구항 23 내지 29 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 청구항 1 내지 22 또는 34 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플 중에서 B7-H4를 검출하기 위한 방법으로서, 임의로, 상기 방법은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 B7-H4로의 결합을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 샘플은 대상체의 암으로부터 수득되는, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 B7-H4가 검출된 후 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 대상체에서 B7-H4 발현 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료용 항-B7-H4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, B7-H4 발현은 청구항 1 내지 21 또는 33 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 상기 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 검출된, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 암으로부터 수득된 샘플 중에서 B7-H4를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 청구항 35 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 B7-H4는 세포막 B7-H4인, 방법.
  41. 청구항 35 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 B7-H4는 세포질 B7-H4인, 방법.
  42. 청구항 35 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, B7-H4는 전체 세포에서 검출되는, 방법.
  43. 청구항 35 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, B7-H4는 순환 종양 세포 상에서 검출되는, 방법.
  44. 청구항 35 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 고형 조직, 생검, 복수, 혈장, 혈청, 림프액 또는 대상체 기원의 종양인, 방법.
  45. 청구항 36 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 관 암종 (ductal carcinoma), 자궁내막 암종, 난소암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암이거나 또는 상기 비-소세포 폐암은 편평 세포 암종인, 방법.
  47. 청구항 35 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 방법은 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS) 검정 또는 면역조직화학 (IHC)을 사용하는, 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 검출 방법은 IHC를 사용하고, 청구항 1 내지 21 또는 34 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 50 μg/ml인, 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 20 μg/ml인, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 10 μg/mL인, 방법.
  51. 청구항 47 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 방법은 IHC를 사용하고, 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)은 검출을 위해 사용되는, 방법.
  52. 청구항 36 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  53. 청구항 1 내지 21 또는 34 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 a) 검출 시약, b) B7-H4 항원, c) 치료용 항-B7-H4 항체, 또는 d) (a) 내지 (c)의 임의의 조합물을 포함하는 키트.
  54. 청구항 37 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 20502 또는 22213의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는, 방법 또는 키트.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 CDR은 카밧-정의된 CDR, 초티아-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR인, 방법 또는 키트.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열번호 32 내지 37의 아미노산 서열 또는 각각 서열번호 58 내지 63의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 또는 키트.
  57. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 54 또는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 또는 키트.
  58. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 또는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는, 방법 또는 키트.
  59. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 항원-결합 단편은 (i) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 (ii) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법 또는 키트.
  60. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 56 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 방법 또는 키트.
  61. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 57 또는 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법 또는 키트.
  62. 청구항 37 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (i) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 또는 (ii) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 방법 또는 키트.
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