EA045594B1 - Антитела к b7-h4 и способы их применения - Google Patents
Антитела к b7-h4 и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA045594B1 EA045594B1 EA202091810 EA045594B1 EA 045594 B1 EA045594 B1 EA 045594B1 EA 202091810 EA202091810 EA 202091810 EA 045594 B1 EA045594 B1 EA 045594B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- binding fragment
- antigen
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 101
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 title claims description 8
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 title claims 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 415
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 411
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 407
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 407
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 380
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 210
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 122
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 122
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 122
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 111
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 111
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 111
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 100
- 102000055298 human VTCN1 Human genes 0.000 claims description 94
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 85
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 61
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 49
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 34
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 5
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006402 Ductal Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 131
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 37
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 31
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 31
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 16
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 10
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 7
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- -1 antibody Proteins 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 101000663606 Sus scrofa Cornifin Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 3
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical group [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102220492414 Ribulose-phosphate 3-epimerase_H35A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 2
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 3-aminochromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N)=CC2=C1 QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101001084702 Arabidopsis thaliana Histone H2B.10 Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NXTVQNIVUKXOIL-UHFFFAOYSA-N N-chlorotoluene-p-sulfonamide Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NCl)C=C1 NXTVQNIVUKXOIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010070308 Refractory cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053614 Type III immune complex mediated reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007435 diagnostic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013154 diagnostic monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 201000010255 female reproductive organ cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000016178 immune complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 108010023260 immunoglobulin Fv Proteins 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004460 liquid liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DYQNRMCKBFOWKH-UHFFFAOYSA-N methyl 4-hydroxybenzenecarboximidate Chemical compound COC(=N)C1=CC=C(O)C=C1 DYQNRMCKBFOWKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 201000004228 ovarian endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, и к способам получения и использования этих антител, например, для обнаружения В7-Н4.
Уровень техники
В7-Н4 (также известный как В7х, B7-S1 и VTCN1) представляет собой иммунорегулирующую молекулу, которая разделяет гомологию с другими членами семейства В7, включая PD-L1. Это трансмембранный белок типа I, состоящий из эктодоменов как IgV, так и IgC. В то время как экспрессия В7-Н4 в здоровых тканях относительно ограничена на уровне белка, В7-Н4 экспрессируется в нескольких солидных опухолях, таких как гинекологические карциномы молочной железы, яичника и эндометрия. Экспрессия В7-Н4 в опухолях имеет тенденцию к корреляции с неблагоприятным прогнозом. Рецептор В7-Н4 неизвестен, но считается, что он экспрессируется на поверхности Т-клеток. Считается, что В7-Н4 непосредственно ингибирует активность Т-клеток.
Принимая во внимание экспрессию и функцию В7-Н4, существует потребность в антителах, которые специфически связываются с В7-Н4, и в использовании этих антител для обнаружения В7-Н4, включая, например, использование иммуногистохимии (ИГХ) для обнаружения В7-Н4 в образцах рака.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела, которые специфически связываются с В7-Н4, и использование этих антител для обнаружения В7-Н4, включая, например, использование иммуногистохимии (ИГХ) для обнаружения В7-Н4 в образцах рака.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, содержащие определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, CDR2 области VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, CDR3 области VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 области VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 27 или 28, и последовательность CDR3 области VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 7 или 8. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 7 или 8.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, причем антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 6 и 9 соответственно;
(b) SEQ ID NO: 6 и 10 соответственно;
(с) SEQ ID NO: 6 и 11 соответственно;
(d) SEQ ID NO: 7 и 9 соответственно;
(е) SEQ ID NO: 7 и 10 соответственно;
(f) SEQ ID NO: 7 и 11 соответственно;
(g) SEQ ID NO: 8 и 9 соответственно;
(h) SEQ ID NO: 8 и 10 соответственно;
(i) SEQ ID NO: 8 и 11 соответственно;
(j) SEQ ID NO: 89 и 19 соответственно;
(k) SEQ ID NO: 90 и 19 соответственно; или (l) SEQ ID NO: 91 и 19 соответственно.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG2a мыши. В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область легкой цепи. В определенных вариантах осуществления кон- 1 045594 стантная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи IgGK мыши.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 17, 18, 89, 90 или 91. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 30 или 31. В определенных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содер жит тяжелую цепь и легкую цепь, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 16 и 19 соответственно;
(b) SEQ ID NO и 30 соответственно;
(с) SEQ ID NO и 31 соответственно;
и 19 соответственно;
(d) SEQ ID NO (е) SEQ ID NO: 17 и 30 соответственно;
(f) SEQ ID NO: 17 и 31 соответственно;
(g) SEQ ID NO: 18 и 19 соответственно;
(h) SEQ ID NO: 18 и 30 соответственно; или (i) SEQ ID NO: 18 и 31 соответственно.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL антитела, выбранного из группы, состоящей из J512, J513, J514, J515, J516, J517, J518, J519, J520, J521 и J522. В определенных вариантах осуществления CDR представляют собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с одним и тем же эпитопом В7-Н4 человека, что и антитело или его антигенсвязываю щий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента другого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в настоящем изобретении, с В7-Н4 человека.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полноразмерное антитело. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), связанный дисульфидной связью фрагмент Fv, минитело, F(ab')3, диатело, (scFv)2 или scFv-Fc.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит обнаруживаемую метку. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, или тяжелую цепь антитела, или ее антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует область VH из SEQ ID NO: 6, 7 или 8 либо тяжелую цепь из SEQ ID NO: 16, 17 или 18.
В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность SEQ ID NO: 12, 13, 14, 93, 94 или 95.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует область VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11 либо легкую цепь из SEQ ID NO: 19, 30 или 31. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении, и вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем изобретении.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен выделенный вектор, содержащий полинуклеотид, предложенный в настоящем изобретении.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин
- 2 045594 (например, выделенная клетка-хозяин), содержащая полинуклеотид, предложенный в настоящем изобретении, вектор, предложенный в настоящем изобретении, или первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи или легкую цепь, предложенные в настоящем изобретении, и второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь, предложенные в настоящем изобретении. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО или HEK.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с В7-Н4 человека, включающий в себя культивирование клетки-хозяина, предложенной в настоящем изобретении, так что будет экспрессироваться молекула нуклеиновой кислоты и будет вырабатываться антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с В7-Н4 человека и кодируются полинуклеотидом, предложенным в настоящем изобретении.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ обнаружения В7-Н4 в образце, включающий в себя приведение в контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предложенным в настоящем изобретении. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ обнаружения В7-Н4 в образце, включающий в себя приведение в контакт образца с антителом к В7-Н4 или его антигенсвязывающим фрагментом, предложенным в настоящем изобретении, и обнаружение связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с В7-Н4. В определенных вариантах осуществления образец получают из ракового заболевания у субъекта. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя введение терапевтического антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту после обнаружения В7-Н4. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ лечения рака, экспрессирующего В7-Н4, у субъекта, причем способ включает в себя введение субъекту терапевтического антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, причем В7-Н4 был обнаружен в образце, полученном из ракового заболевания, используя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении.
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя обнаружение В7-Н4 в образце, полученном из ракового заболевания.
В определенных вариантах осуществления обнаруженный В7-Н4 представляет собой В7-Н4 клеточной мембраны. В определенных вариантах осуществления обнаруженный В7-Н4 представляет собой цитоплазматический В7-Н4. В определенных вариантах осуществления обнаруженный В7-Н4 представляет собой цельноклеточный В7-Н4.
В определенных вариантах осуществления В7-Н4 обнаруживается в циркулирующих клетках опухоли.
В определенных вариантах осуществления образец представляет собой солидную ткань, биопсию, асциты, аспираты, экстракт жидкости, плазму крови, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешний срез кожи, дыхательных путей, кишечника или мочеполового тракта, слезы, слюну, молоко, опухоль или орган, полученные от субъекта.
В определенных вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, протоковой карциномы, рака эндометрия, рака яичников, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почки и рака мочевого пузыря. В определенных вариантах осуществления рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы, а немелкоклеточный рак легких представляет собой плоскоклеточный рак.
В определенных вариантах осуществления в способе обнаружения используется иммуноферментный анализ (ИФА), сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или иммуногистохимия (ИГХ). В определенных вариантах осуществления в способе обнаружения используется ИГХ, а концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем изобретении, составляет от около 1 мкг/мл до около 50 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем изобретении, составляет от около 1 мкг/мл до около 20 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенных в настоящем изобретении, составляет около 10 мкг/мл.
В определенных вариантах осуществления субъект является человеком.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении, и а) реагент для обнаружения, b) антиген В7-Н4, с) терапевтическое антитело к В7-Н4 или d) их комбинацию.
В определенных вариантах осуществления способа или набора, предложенных в настоящем изобретении, терапевтическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL 20502 или 22213. В определенных вариантах осуществления CDR представляют собой CDR, определенные по Ка
- 3 045594 бату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM. В определенных вариантах осуществления CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32-37 соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 58-63 соответственно. В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 или SEQ ID NO: 64. В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 или SEQ ID NO: 65. В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55; или (ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65.
В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 74. В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 75. В определенных вариантах осуществления терапевтическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; или (ii) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны изображения окрашивания ИГХ, полученные с использованием антител к В7-Н4 А57.1, AET_AB_J516 и AET_AB_J512 (см. пример 4).
На фиг. 2 показан вычислительный анализ изображений (Definiens) окрашивания ИГХ (см. пример 4).
На фиг. 3 показана сегментация положительных клеток с разными уровнями интенсивности (см. пример 4).
На фиг. 4 показано количество и соотношение клеток, связанных с каждым уровнем интенсивности окрашивания и полученных с использованием антител к В7-Н4 А57.1, AET_AB_J516 и AET_AB_J512 (см. пример 4).
На фиг. 5А-5С показано сравнение экспрессии В7-Н4 (интенсивность DAB) в цельных клетках, мембранах и цитоплазме В7-Н4-положительных клеток. На фиг. 5А показана экспрессия В7-Н4 (интенсивность DAB) с использованием антитела А57.1. На фиг. 5В показана экспрессия В7-Н4 (интенсивность DAB) с использованием антитела J512. На фиг. 5С показана экспрессия В7-Н4 (интенсивность DAB) с использованием антитела J516 (см. пример 4).
Подробное описание сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела (например, моноклональные антитела) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека). Антитела к В7-Н4 и их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться для обнаружения В7-Н4, например, с помощью иммуногистохимии в образце рака.
Также предложены выделенные нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), такие как комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Дополнительно предложены векторы (например, векторы экспрессии) и клетки (например, клетки-хозяева), содержащие нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), кодирующие такие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Также предложены способы получения таких антител и их антигенсвязывающих фрагментов. В других аспектах в настоящем изобретении предложены способы обнаружения В7-Н4, например, в образце рака. Также предложены связанные композиции (например, композиции для обнаружения) и наборы.
Терминология.
Термин В7-Н4 в контексте настоящего изобретения относится к полипептидам В7-Н4 млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, нативные полипептиды В7-Н4 и изоформы полипептидов В7-Н4. В7-Н4 охватывает полноразмерные непроцессированные полипептиды В7-Н4, а также формы полипептидов В7-Н4, которые возникают в результате процессинга внутри клетки. Термин В7-Н4 человека в контексте настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Полинуклеотид В7-Н4, нуклеотид В7-Н4 или нуклеиновая кислота В7-Н4 относится к полинуклеотиду, кодирующему В7-Н4.
- 4 045594
Термин антитело означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанного по меньшей мере через один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Термин антитело в контексте настоящего изобретения охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, при условии, что антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может быть любым из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG, и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), на основании идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют отличные и хорошо известные структуры субъединиц, и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированы с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.
Термин фрагмент антитела относится к части интактного антитела.
Антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая область относится к части интактного антитела, которая специфически связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать антигенный участок распознавания интактного антитела (например, определяющие комплементарность области (CDR), достаточные для специфического связывания антигена). Примеры антигенсвязывающих фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела и одноцепочечные антитела. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен из любых видов животных, таких как грызуны (например, мышь, крыса или хомяк) и человека, или может быть получен искусственно.
Термины антитело к В7-Н4 и антитело, которое связывается с В7-Н4 относятся к антителу, которое способно специфически связываться с В7-Н4 с достаточной аффинностью, так что антитело может быть использовано как диагностический и/или терапевтический агент для нацеливания на В7-Н4. Термины специфически связывающий, иммуноспецифически связывающий, иммуноспецифически распознающий и специфически распознающий в контексте настоящего изобретения являются аналогичными терминами в контексте антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Эти термины указывают, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий домен и что связывание влечет за собой некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Соответственно антитело, которое специфически связывается с В7-Н4 человека (SEQ ID NO: 1), может также связываться с В7-Н4 других видов (например, В7-Н4 яванского макака, мыши и/или крысы) и/или белками В7-Н4, продуцируемыми из других аллелей человека, но степень связывания антитела к В7-Н4 с несвязанным белком, не относящимся к В7-Н4 (например, другими членами семейства белков В7, такими как PD-L1), составляет менее чем около 10% связывания антитела с В7-Н4, как измерено, например, радиоиммуноанализом (RIA).
Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к популяции гомогенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, вовлеченного в высокоспецифичное распознавание и связывание одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это отличается от поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных антигенных детерминант. Термин моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую участок распознавания. Кроме того, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к таким антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, полученным любым числом способов, включая, но не ограничиваясь ими, гибридомы, фаговый отбор, рекомбинантная экспрессия и трансгенные животные.
Термины вариабельная область или вариабельный домен в контексте настоящего изобретения используются взаимозаменяемо и являются общими в данной области техники. Вариабельная область обычно относится к части антитела, как правило, к части легкой или тяжелой цепи, обычно к аминоконцу от 110 до 120 аминокислот или от 110 до 125 аминокислот в зрелой тяжелой цепи и от около 90 до 115 аминокислот в зрелой легкой цепи, которые различаются по последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности конкретного антитела к его конкретному антигену. Изменчивость в последовательности сконцентрирована в тех областях, которые называются областями, определяющими комплементарность (CDR), в то время как более высоко консервативные области в вариабельном домене называются каркасными областями (FR). Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом или теорией, полагают, что CDR легкой и тяжелой цепей несут основную ответственность за взаимодействие и специфичность антитела с антигеном. В определенных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область человека. В определенных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область грызуна или мыши.
Термины VL и домен VL используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области легкой цепи антитела.
- 5 045594
Термины VH и домен VH используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области тяжелой цепи антитела.
Термин нумерация по Кабату и подобные термины известны в данной области техники и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента. В определенных аспектах CDR могут быть определены в соответствии с системой нумерации по Кабату (см., например, Kabat E.A. & Wu T.T. (1971), Ann. NY Acad. Sci., 190:382-391; и Kabat E.A. et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S., Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242). Используя систему нумерации по Кабату, CDR в молекуле тяжелой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот от 31 до 35, которые необязательно могут включать одну или две дополнительные аминокислоты, следующие за 35 (упоминается в схеме нумерации по Кабату как 35А и 35В) (CDR1), положениях аминокислот от 50 до 65 (CDR2) и положениях аминокислот от 95 до 102 (CDR3). Используя систему нумерации по Кабату, CDR в молекуле легкой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот 24-34 (CDR1), положениях аминокислот 50-56 (CDR2) и положениях аминокислот 89-97 (CDR3). В конкретном варианте осуществления CDR антител, описанных в настоящем изобретении, были определены в соответствии со схемой нумерации по Кабату.
Чотиа вместо этого относится к расположению структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации согласно системе нумерации по Кабату варьируется между Н32 и Н34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что в схеме нумерации по Кабату в Н35А и Н35В размещаются вставки; если ни 35А, ни 35В не присутствуют, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35А, петля заканчивается на 33; если присутствуют оба 35А и 35В, петля заканчивается на 34). Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями по Чотиа и используются программным обеспечением Oxford Molecular для моделирования антител AbM.
| Петля | По Кабату | АЬМ | По Чотиа |
| L1 | L24-L34 | L24-L34 | L24-L34 |
| L2 | L50-L56 | L50-L56 | L50-L56 |
| L3 | L89-L97 | L89-L97 | L89-L97 |
| Н1 | Н31-Н35В | Н26-Н35В | Н26-Н32..34 |
| (Нумерация Кабат) | |||
| Н1 | Н31-Н35 | Н26-Н35 | Н26-Н32 |
| (Нумерация | Чотиа) | ||
| Н2 | Н50-Н65 | Н50-Н58 | Н52-Н56 |
| НЗ | Н95-Н102 | Н95-Н102 | Н95-Н102 |
Термины константная область и константный домен в контексте настоящего изобретения используются взаимозаменяемо и имеют общие значения в данной области техники. Константная область представляет собой часть антитела, например, карбоксильную концевую часть легкой и/или тяжелой цепи, которая не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но которая может проявлять различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc-рецептором. Константная область молекулы иммуноглобулина обычно имеет более консервативную аминокислотную последовательность относительно вариабельного домена иммуноглобулина. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область или ее часть, достаточную для антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Термин тяжелая цепь в контексте настоящего изобретения при использовании в отношении антитела может относиться к любому отдельному типу, например альфа (а), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основании аминокислотной последовательности константного домена, которая приводит к классам антител IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включая подклассы IgG, например IgG1, IgG2, IgG3, и IgG4. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человека. В конкретных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь грызуна или мыши.
Термин легкая цепь в контексте настоящего изобретения при использовании в отношении антитела может относиться к любому другому типу, например каппа (к) или лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легких цепей хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления легкая цепь представляет собой легкую цепь человека. В конкретных вариантах осуществления легкая цепь представляет собой легкую цепь грызуна или мыши.
Термин химерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты относятся к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, причем аминокислотная последовательность происходит от двух
- 6 045594 или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с желаемой специфичностью, аффинностью и способностью, в то время как константные области гомологичны последовательностям антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученных от другого (обычно человека), чтобы избежать вызывания иммунного ответа у этого вида. Термин гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими иммуноглобулиновыми цепями, химерными иммуноглобулинами или их фрагментами, которые содержат минимальные нечеловеческие (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменены остатками из CDR нечеловеческих видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, аффинность и характеристики (с привитой CDR) (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях определенные остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками в антителе или фрагменте вида, не принадлежащему к человеку, который обладает желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть дополнительно модифицированы путем замены дополнительных остатков либо в каркасной области Fv, и/или в остатках CDR нечеловеческого происхождения для уточнения и оптимизации специфичности антитела, его антигенсвязывающего фрагмента, аффинности и/или способности. В общем гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будет содержать вариабельные домены, содержащие все или по существу все области CDR, которые соответствуют иммуноглобулину, не относящемуся к человеку, тогда как все или по существу все области FR являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также могут содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для создания гуманизированных антител описаны в патенте США 5225539; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994); и Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело с измененной поверхностью.
Термин антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотную последовательность, полученную из генного локуса иммуноглобулина человека, где такое антитело или антигенсвязывающий фрагмент получают с использованием любого способа, известного в данной области техники. Данное определение человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмент включает в себя интактные или полноразмерные антитела и их фрагменты.
Аффинность связывания обычно относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения аффинность связывания относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно может быть представлена константой диссоциации (KD). Аффинность может быть измерена и/или выражена несколькими способами, известными в данной области техники, включая без ограничения константу равновесной диссоциации (KD) и константу равновесной ассоциации (KA). KD вычисляется из отношения koff/kon, тогда как KA вычисляется из отношения kon/koff. kon относится к константе скорости ассоциации, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном, a koff относится к диссоциации, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном, kon и koff могут быть определены способами, известными специалисту в данной области техники, такими как BIAcore® или KinExA.
Термин эпитоп в контексте настоящего изобретения является термином в данной области техники и относится к локализованной области антигена, с которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться. Эпитоп может представлять собой, например, смежные аминокислоты полипептида (линейный или непрерывный эпитоп) или эпитоп, например, может объединяться из двух или более несмежных областей полипептида или полипептидов (конформационных, нелинейных, прерывистых или несмежных эпитопов). В определенных вариантах осуществления эпитоп, с которым специфически связывается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть определен, например, с помощью ЯМР-спектроскопии, исследований рентгеновской дифракционной кристаллографии, анализов ИФА, обмена водород/дейтерий в сочетании с масс-спектрометрией (например, жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией с электрораспылением), анализов на основе олигопептидного сканирования и/или мутагенезного картирования (например, картирование сайт-направленного мутагенеза). В случае рентгеновской кристаллографии кристаллизация может осуществляться с помощью лю
- 7 045594 бых способов, известных в данной области техники (например, Giege R. et al. (1994), Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 50(Pt 4):339-350; McPherson A. (1990), Eur. J. Biochem., 189:1-23; Chayen N.E. (1997), Structure, 5:1269-1274; McPherson A. (1976), J. Biol. Chem., 251:6300-6303). Кристаллы антитело/его антигенсвязывающий фрагмент: антиген могут быть изучены с использованием хорошо известных способов дифракции рентгеновских лучей и могут быть уточнены с использованием компьютерного программного обеспечения, такого как X-PLOR (Yale University, 1992, распространяется Molecular Simulations, Inc.; см., например, Meth Enzymol. (1985), vol. 114 & 115, eds Wyckoff H.W. et al., U.S. 2004/0014194); и BUSTER (Bricogne G. (1993), Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 49(Pt 1):37-60; Bricogne G. (1997), Meth Enzymol., 276A:361-423, ed Carter C.W.; Roversi P. et al. (2000), Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 56(Pt 10):1316-1323). Исследования мутагенезного картирования могут осуществляться с использованием любого способа, известного специалисту в данной области техники. См., например, Champe M. et al. (1995), J. Biol. Chem., 270:1388-1394; и Cunningham В.С. & Wells J.A. (1989), Science, 244:1081-1085 для описания методов мутагенеза, включая методы аланин-сканирующего мутагенеза.
Антитело к В7-Н4, которое связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к В7-Н4, относится к антителу, которое связывается с теми же аминокислотными остатками В7-Н4, что и эталонное антитело к В7-Н4. Способность антитела к В7-Н4 связываться с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к В7-Н4, определяется с помощью анализа обмена водород/дейтерий (см. Coales et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2009, 23:639-647).
Считается, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно связывается с тем же эпитопом или перекрывающимся эпитопом эталонного антитела, так что оно в некоторой степени блокирует связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области техники, например, конкурентным ИФА. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 50%. Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые выделены, представляет собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которая находится в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетка или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что они больше не присутствуют в той форме, в которой они находятся в природе. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются по существу чистой. Термин по существу чистый в контексте настоящего изобретения относится к материалу, который имеет чистоту по меньшей мере 50% (т.е. не содержит загрязнений), чистоту по меньшей мере 90%, чистоту по меньшей мере 95%, чистоту по меньшей мере 98% или чистоту по меньшей мере 99%.
Термины полипептид, пептид и белок используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть разделен не аминокислотами. Кроме того, указанные термины включают аминокислотный полимер, который был модифицирован природным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями, или модификациями, такие как конъюгация с меченым компонентом. Также термин включает в себя, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включающие, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Понятно, что поскольку полипептиды согласно данному изобретению основаны на антителах, в некоторых вариантах осуществления полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или связанных цепей.
Процент идентичности относится к степени идентичности двух последовательностей (например, аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот). Процент идентичности можно определить путем выравнивания двух последовательностей, введения гэпов для максимизации идентичности двух последовательностей. Выравнивание можно создавать с помощью программ, известных в данной области техники. Для целей настоящего изобретения выравнивание нуклеотидных последовательностей можно выполнить с помощь программы blastn, настроенной по умолчанию, и выравнивание аминокислотных последовательностей можно выполнить с помощью программы blastn, настроенной по умолчанию (см. Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information - NCBI) на интернет сайте www.ncbi.nlm.nih.gov).
Термин клетка - хозяин в контексте настоящего изобретения может быть любым типом клеток, например, первичной клеткой, клеткой в культуре, или клеткой из клеточной линии. В конкретных вариантах осуществления термин клетка-хозяин относится к клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, например, из-за мутаций или влияния окружающей среды, которые могут произойти в последующих поколениях или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.
- 8 045594
Термин сверхэкспрессия В7-Н4 в конкретном образце опухоли, ткани или клеток относится к В7-Н4 (полипептиду В7-Н4 или нуклеиновой кислоте, кодирующей такой полипептид), который присутствует на уровне выше, чем тот, который присутствует в непораженной ткани или клетках одного и того же типа или происхождения вблизи опухоли или ракового заболевания. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана, например, мутацией, амплификацией генов, увеличением транскрипции или увеличением трансляции.
Термин первичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в настоящем изобретении относится к антителу или фрагменту, которые специфически связываются с антигеном-мишенью в образце. Первичное антитело, как правило, представляет собой первое антитело, которое используется в иммуногистохимической (ИГХ) процедуре. В одном варианте осуществления первичное антитело является единственным антителом, которое используется в ИГХ процедуре. Термин вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в настоящем изобретении относится к антителу или фрагменту, которые специфически связываются с первичным антителом, тем самым образовывая мостик между первичным антителом и последующим реагентом в случае его наличия. Вторичное антитело, как правило, представляет собой второе антитело, которое используется в иммуногистохимической процедуре. Термин третичное антитело в настоящем изобретении относится к антителу, которое специфически связывается со вторичным антителом, тем самым образовывая мостик между вторичным антителом и последующим реагентом в случае его наличия.
Образец согласно настоящему изобретению имеет биологическое происхождение. В предпочтительных вариантах осуществления образец представляет собой образец человека, однако образцы животных также могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения на практике. Неограничивающие источники образца для использования в настоящем изобретении включают в себя, например, солидную ткань, биопсию, асциты, аспираты, экстракты жидкости, кровь (включая циркулирующие опухолевые клетки), плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешние срезы кожи, дыхательных путей, кишечника и мочеполового тракта, слезы, слюну, молоко, опухоли, органы, клеточные культуры и/или компоненты клеточных культур. Раковый образец - это образец, который содержит раковую клетку.
Для целей настоящего изобретения срез образца ткани относится к одной части или куску образца ткани, например, тонкому срезу ткани или клетки, вырезанному из образца ткани. Следует понимать, что можно получить несколько срезов образцов ткани и подвергнуть их анализу в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых случаях выбранная часть или срез ткани содержит гомогенную популяцию клеток. В других случаях выбранная часть содержит область ткани, например просвет, в качестве неограничивающего примера. Выбранная часть может быть такой маленькой, как одна клетка или две клетки, или может представлять несколько тысяч клеток, например. В большинстве случаев сбор клеток является важным, и хотя настоящее изобретение было описано для применения с целью обнаружения клеточных компонентов, способ может также использоваться для обнаружения неклеточных компонентов организма (например, в качестве неограничивающего примера, растворимых компонентов в крови). Слово метка в контексте настоящего изобретения относится к обнаруживаемому соединению или композиции, которые прямо или косвенно конъюгируются с антителом с целью получения меченного антитела. Метка может быть обнаруживаемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки), или, если речь идет о ферментативной метке, она может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое можно обнаружить. Термин фармацевтический состав относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента, чтобы быть эффективным, и который не содержит каких-либо дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться состав. Состав может быть стерильным.
Термины вводить, вводимый, введение и т.п., используемые в настоящем изобретении, относятся к способам, которые могут использоваться для обеспечения доставки лекарственного средства, например, антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента в желаемый участок биологического действия (например, внутривенное введение). Способы введения, которые можно применять с агентами и способами, описанными в настоящем изобретении, можно найти, например, в Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon; и Remington's, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa.
В контексте настоящего изобретения термины субъект и пациент употребляются взаимозаменяемо. Субъектом может быть животное. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как отличное от человека животное (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса, мышь, обезьяна или другой примат и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой человека.
Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству лекарственного средства, например антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, эффективного для лечения заболевания или расстройства у субъекта. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер или нагрузку опухо
- 9 045594 ли; ингибировать до некоторой степени инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать до некоторой степени метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком; и/или приводят к благоприятному ответу, такому как увеличение выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS), выживаемости без заболевания (DFS), общей выживаемости (OS), полного ответа (CR), частичного ответа (PR) или в некоторых случаях стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), уменьшение времени до прогрессирования (ТТР) или любая их комбинация. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или убивать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Такие термины, как лечение, лечащий, лечить, облегчающий и облегчение относятся к терапевтическим мерам, которые лечат, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет диагноз или подозрение на заболевание. В определенных вариантах осуществления субъект успешно лечится от рака в соответствии со способами по настоящему изобретению, если пациент демонстрирует одно или более из следующего: уменьшение количества или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие проникновения раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; торможение или отсутствие метастазирования опухоли; торможение или отсутствие роста опухоли; облегчение одного или более симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; уменьшение онкогенности, онкогенной частоты или онкогенной способности опухоли; уменьшение количества или частоты раковых стволовых клеток в опухоли; дифференцировка онкогенных клеток в неопухолевое состояние; увеличение выживаемости без прогрессирования (PFS), выживаемость без заболевания (DFS), общая выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR), стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), уменьшенное время до прогрессирования (ТТР) или любая их комбинация.
Термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают в себя без ограничения гинекологические виды рака (например, рак молочной железы (включая трижды негативный рак молочной железы, протоковую карциному, рак яичников и рак эндометрия), немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак почки (например, почечно-клеточная карцинома) и рак мочевого пузыря (например, карцинома уротелиальной клетки). Рак может быть раком, который экспрессирует В7-Н4 или раком, экспрессирующим В7-Н4. Такие термины относятся к раку, содержащему клетки, которые экспрессируют В7-Н4. Рак может представлять собой солидную опухоль, которая экспрессирует В7-Н4. Рак может быть первичной опухолью или может быть запущенным или метастатическим раком.
Рефрактерный рак представляет собой рак, который прогрессирует, даже если противоопухолевое лечение, такое как химиотерапия, применяют к больному раком. Рецидивирующий рак представляет собой рак, который повторно развивается, или на начальном участке или в отдаленном месте, после ответа на начальную терапию.
В контексте настоящего изобретения в настоящем раскрытии и формуле изобретения, формы единственного числа включают формы и множественного числа, если контекст явно не предписывает иное.
Следует понимать, что, в случаях когда варианты осуществления описаны в настоящем изобретении с формулировкой содержащий, также могут предлагаться аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах состоящий из и/или состоящий в основном из. В настоящем раскрытии содержит, содержащий, включающий и имеющий и т.п. может иметь значение, приписанное им в патентном праве США, и может означать включает, включающий и т.п.; состоящий по существу из или состоящий по существу аналогичным образом имеет значение, указанное в патентном праве США, и термин является открытым, что допускает присутствие большего, чем то, что указано, если основные или новые характеристики того, что говорится не изменяются при наличии более того, что указано, но исключают варианты осуществления предшествующего уровня техники.
Если специально не указано или не очевидно из контекста, используемый в настоящем изобретении термин или понимается как включающий. Термин и/или, используемый в фразе, такой как А и/или В в настоящем изобретении, предназначен для включения А и В, А или В, А и В. Аналогично термин и/или, используемый во фразе, такой как А, В и/или С, предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно); и С (отдельно).
Термины около и приблизительно в контексте настоящего изобретения, когда используются для изменения числового значения или числового диапазона, указывают, что отклонения от 5 до 10% выше и от 5 до 10% ниже значения или диапазона остаются в пределах предполагаемого значение приведенного значения или диапазона.
Любые композиции или способы, представленные в настоящем изобретении, могут быть объединены с одной или более любыми другими композициями и способами, представленными в настоящем изо- 10 045594 бретении.
Антитела.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предложены антитела (например, моноклональные антитела) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека). Аминокислотные последовательности для В7-Н4 человека известны в данной области техники и также предложены в настоящем изобретении как SEQ ID NO: 1. В7-Н4 человека:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSD
IVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTD
AGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWA SQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVT ESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK (SEQ Ш NO:1)
В определенных вариантах осуществления антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело, описанное в табл. 1, или представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие определяющие комплементарность области (CDR), вариабельную область тяжелой цепи, и/или вариабельную область легкой цепи, и/или тяжелую цепь, и/или легкую цель антитела, описанного в табл. 1.
Таблица 1
Типовые антитела к В7-Н4
| ИН клона | VH/VL гибридомы | Тип антитела | SEQ ID NO | ||||
| CDR | VH | VL | H | L | |||
| J511 | Мб | mlgGl | 22-26, 29 | 6 | 9 | 89 | 19 |
| J512 | Мб | m!gG2a | 22-26, 29 | 6 | 9 | 16 | 19 |
| J517 | М6- De-N-gly (1) | mIgG2a | 22-25, 27, 29 | 6 | 10 | 16 | 30 |
| J518 | Мб De-N-gly (2) | mIgG2a | 22-25, 28, 29 | 6 | 11 | 16 | 31 |
| J513 | МИ | mlgGl | 22-26, 29 | 7 | 9 | 90 | 19 |
| J514 | МИ | m!gG2a | 22-26, 29 | 7 | 9 | 17 | 19 |
| J519 | МИ - De-N-gly (1) | mIgG2a | 22-25, 27, 29 | 7 | 10 | 17 | 30 |
| J520 | МИ De-N-gly (2) | mIgG2a | 22-25, 28, 29 | 7 | 11 | 17 | 31 |
| J515 | М15 | mlgGl | 22-26, 29 | 8 | 9 | 91 | 19 |
| J516 | М15 | m!gG2a | 22-26, 29 | 8 | 9 | 18 | 19 |
| J521 | М15- De-N-gly (1) | mIgG2a | 22-25, 27, 29 | 8 | 10 | 18 | 30 |
| J522 | М15 De-N-gly (2) | m!gG2a | 22-25, 28, 29 | 8 | 11 | 18 | 31 |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат шесть CDR, перечисленных в табл. 2, т.е. шесть CDR из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-28 и SEQ ID NO: 29.
- 11 045594
Таблица 2
Аминокислотные последовательности CDR
| Описание CDR | Аминокислотная последовательность CDR (SEQ ID NO) |
| VH-CDR1 | GFSLSTYG (SEQ Ш NO:22) |
| VH-CDR2 | WWNDD (SEQ ID NO:23) |
| VH-CDR3 | VDGYYWYFDV (SEQ ID NO:24) |
| VL-CDR1 | RSSQSIVHSNRNTYLE (SEQ ID NO:25) |
| VL-CDR2 | NVSNRFS (SEQ ID NO:26) |
| VL-CDR2, De-N- гликозилированная (1) | NVANRFS (SEQ ID NO:27) |
| VL-CDR2, De-N- гликозилированная (2) | QVSNRFS (SEQ ID NO:28) |
| VL-CDR3 | FQGSHVPLT (SEQ ID NO:29) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, приведенную в табл. 3, например, в комбинации с областью VL.
Таблица 3
Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH)
| Описание VH | Аминокислотная последовательность VH (SEQ ID NO) |
| M6 VH (J511, J512, J517, J518) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQVFLKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:6) |
| Mil VH (J513, J514, J519, J520) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQVFLKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:7) |
| M15 VH (J515, J516, J521, J522) | QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQVFLKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGA GTTVTVSS (SEQ ID NO:8) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VL, приведенную в табл. 4, например, в комбинации с областью VH.
Таблица 4
Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL)
| Описание VL | Аминокислотная последовательность VL (SEQ ID NO) |
| M6,M11,M15 VL (J511-J516) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYNVSNRF SGVPDRF SGSGSGTDFT |
- 12 045594
| LKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO :9) | |
| De-N-гликозилированная VL(1) (J517, J519, J521) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYNVANRF SGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 10) |
| De-N-гликозилированная VL (2) (J518, J520, J522) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYQVSNRF SGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 11) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, приведенную в табл. 3, и область VL, приведенную в табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую или состоящую из последовательности, приведенной в табл. 3, и область VL, содержащую или состоящую из последовательности, приведенной в табл. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности VL из табл. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 85% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 85% идентичной последовательности VL из табл. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности VL из табл. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 96% идентичную последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 97% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 97% идентичную последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 98% идентичную последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически
- 13 045594 связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, содержащую последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную последовательности VH из табл. 3, и область VL, содержащую последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную последовательности VL из табл. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 96% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 96% идентичной последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 97% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 97% идентичной последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 98% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 98% идентичной последовательности VL из табл. 4. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат область VH, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 99% идентичной последовательности VH из табл. 3, и область VL, состоящую из последовательности, по меньшей мере на 99% идентичной последовательности VL из табл. 4.
В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, описываются только их доменом VL, только их доменом VH, только их 3 CDR области VL или только их 3 CDR области VH. См., например, Rader С. et al. (1998), PNAS, 95:8910-8915, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки во всей ее полноте и описывает гуманизацию мышиного антитела к αΎβ3 путем идентификации дополняющей легкой цепи или тяжелой цепи соответственно, от легкой цепи человека или библиотеки тяжелой цепи, приводящей к вариантам гуманизированного антитела, имеющим аффинность настолько же или более высокую, чем аффинность исходного антитела. См. также Clackson T. et al. (1991), Nature, 352:624-628, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки во всей ее полноте и описывает способы получения антител, которые специфически связываются со специфическим антигеном с использованием специфического домена VL (или домена VH), и скрининг библиотеки на дополняющий домен VH (или домен VL). Скрининг привел к 14 новым партнерам для конкретного домена VH и 13 новым партнерам для конкретного домена VL, которые связывались сильнее, как определено с помощью ИФА. См. также Kim S.J. & Hong H.J. (2007), J. Microbiol., 45:572-577, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки во всей ее полноте и описывает способы получения антител, которые специфически связывают специфический антиген с использованием специфического домена VH, и скрининга библиотеки (например, библиотеки VL человека) на дополняющие домены VL; выбранные домены VL в свою очередь могут быть использованы для направленного отбора дополнительных комплементарных доменов VH (например, человека).
В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии со схемой нумерации по Чотиа, которая относится к местоположению структурных петель иммуноглобулина (см., например, Chothia С. & Lesk A.M. (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; AlLazikani В. et al. (1997), J. Mol. Biol., 273:927-948; Chothia С. et al. (1992), J. Mol. Biol., 227:799-817; Tramontano A. et al. (1990), J. Mol. Biol., 215(1):175-82; и патент США № 7709226). Как правило, при использовании системы нумерации по Кабату петля по Чотиа CDR-H1 представлена аминокислотами тяжелой цепи 26-32, 33 или 34, петля по Чотиа CDR-H2 представлена аминокислотами тяжелой цепи 52-56, и петля по Чотиа CDR-H3 представлена аминокислотами тяжелой цепи 95-102, в то время как петля по Чотиа CDR-L1 представлена аминокислотами легкой цепи 24-34, петля по Чотиа CDR-L2 представлена аминокислотами легкой цепи 50-56 и петля по Чотиа CDR-L3 представлена аминокислотами легкой цепи 8997. Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации согласно системе нумерации по Кабату варьируется между Н32 и Н34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что в схеме нумерации по Кабату в Н35А и Н35В размещаются вставки; если ни 35А, ни 35В не присутствуют, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35А, петля заканчивается на 33; если присутствуют оба 35А и 35В, петля заканчивается на 34).
В определенных аспектах в настоящем изобретении предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и содержат CDR областей VH и VL по Чотиа антитела. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и содержат одну или более CDR, в которых CDR по Кабату или по Чотиа имеют такую же аминокислотную последовательность. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и состоят из комбинаций CDR по Кабату и CDR по Чотиа.
В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть оп- 14 045594 ределены в соответствии с системой нумерации IMGT, как описано в Lefranc М-Р (1999), The Immunologist, 7:132-136; и Lefranc М-Р et al. (1999), Nucleic. Acids. Res., 27:209-212. Согласно системе нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52, и VL-CDR3 находится в положениях 89-97. В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и содержат CDR областей VH и VL по IMGT антитела, перечисленные в табл. 3 и 4, например, как описано в Lefranc М-Р (1999) выше и Lefranc М-Р et al. (1999), выше). В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии с MacCallum R.M. et al. (1996), J. Mol. Biol., 262:732-745. См. также, например, Martin A., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains в Antibody Engineering, Kontermann и Dubel, eds., chapter 31, p. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и могут быть определены методом, описанным в MacCallum R.M. et al.
В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии со схемой нумерации AbM, которая относится к гипервариабельным областям AbM, и которая представляют собой компромисс между CDR по Кабат и структурными петлями Чотиа, и используется в программном обеспечении для моделирования антител AbM Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.). В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и могут быть определены в соответствии со схемой нумерации AbM.
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат тяжелую цепь, приведенную в табл. 5, например, в комбинации с легкой цепью.
Таблица 5
Аминокислотные последовательности тяжелой цепи
| Описание тяжелой цепи | Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO) |
| М6Н (J511) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLESDLYTLSSSVT VPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCI CTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDP EVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIM HQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGN TFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:89) |
| М6Н (J512, J517, J518) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLESDLYTLS S SVT VPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCI CTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDP DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPI QHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRA PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWT NNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 16) |
- 15 045594
| МИН (J513) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLESDLYTLS S S VT VPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCI |
| CTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDP EVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIM HQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGN TFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:90) | |
| МИН (J514, J519, J520) | QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLESDLYTLS S SVT VPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCI CTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDP DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPI QHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRA PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWT NNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ TO NO: 17) |
| М15Н (J515) | QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK GYFPEP VT VTWNSGSLS SGVHTFP AVLESDLYTLS S SVT VPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCI CTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDP EVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIM HQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGN TFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:91) |
| М15Н (J516, J521, J522) | QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWI RQPSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTS NNQ VFLKIS S VDT ADTGT YYC AQ VDGYYW YFD VWGA GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK |
- 16 045594
| GYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVT VP S SPRP SET VTCNVAHP AS STK VDKKIVPRDCGCKPCI CTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDP DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPI QHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRA PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWT NNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 18) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат легкую цепь, приведенную в табл. 6, например, в комбинации с тяжелой цепью.
Таблица 6
Аминокислотные последовательности легкой цепи
| Описание легкой цепи | Аминокислотная последовательность легкой цепи (SEQ ID NO) |
| M6, M11,M15L (J511-J516) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYNVSNRF SGVPDRF SGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERH NSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 19) |
| De-N-гликозилированная L(l) (J517, J519, J521) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYNVANRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERH NSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:30) |
| De-N-гликозилированная L(2) (J518, J520, J522) | DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYQVSNRF SGVPDRF SGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID |
| GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERH NSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:31) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, специфически связываются с В7-Н4 человека и содержат тяжелую цепь, приведенную в табл. 5, и легкую цепь, приведенную в табл. 6.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложены антитела, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь. Что касается тяжелой цепи, в конкретном варианте осуществления тяжелая цепь антитела, описанного в настоящем изобретении, может представлять собой тяжелую цепь альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) или мю (μ). В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи IgG2a мыши.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87:
- 17 045594
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLES
DL YTLS S S VT VP S SPRP SET VTCNVAHP AS STKVDKKIVPRDCGCKPCICT VPEVS S VFIFP
PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVV SALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQ VTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVE RNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO:87)
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 мыши.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLES
DL YTLS S S VT VP S SPRP SET VTCNVAHP AS STKVDKKIVPRDCGCKPCICT VPEVS S VFIFP
PKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVS ELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKV SLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGN TFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:92)
Что касается легкой цепи, в конкретном варианте осуществления легкая цепь антитела, описанного в настоящем изобретении, представляет собой легкую цепь каппа или легкую цепь лямбда. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит легкую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VL содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 4, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88:
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQ
DSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:88).
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит (i) тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87; и (ii) легкую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VL содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 4, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит (i) тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92; и (ii) легкую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VL содержит аминокислотную последовательность, указанную в табл. 4, и причем константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит домен VH и домен VL, содержащие любую аминокислотную последовательность, описанную в настоящем изобретении, и причем константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY либо мышиной молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD или IgA. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит домен VH и домен VL, содержащие любую аминокислотную последовательность, описанную в настоящем изобретении, и причем константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY, любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей мышиной молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD или
- 18 045594
IgA, любого класса (например, IgG1, IgG2 и IgG3,) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержит домен VH и домен VL, содержащие любую аминокислотную последовательность, описанную в настоящем изобретении, и мышиные константные домены. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в настоящем изобретении, которое иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7Н4 человека), содержит домен VH и домен VL, содержащие любую аминокислотную последовательность, описанную в настоящем изобретении, и кроличьи константные домены. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 9 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в сконструированном варианте антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 9, причем при конструировании удаляется один или более сайтов гликозилирования, например, в одной или более CDR (например, VL-CDR2). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 10 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 11 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 6 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG1 (например, J511). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 6 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG2a (например, J512). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 9 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в сконструированном варианте антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 9, причем при конструировании удаляется один или более сайтов гликозилирования, например, в одной или более CDR (например, VL-CDR2). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 10 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 7 и 11 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 7 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG1 (например, J513). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 7 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG2a (например, J514).
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8 и 9 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в сконструированном варианте антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8 и 9, причем при конструировании удаляется один или более сайтов гликозилирования, например, в одной или более CDR (например, VL-CDR2). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8 и 10 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности VH и VL из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8 и 11 соответственно. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 8 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG1 (например, J515). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH из SEQ ID NO: 8 и VL из SEQ ID NO: 9, 10 или 11) дополнительно содержит константный домен мышиной тяжелой цепи IgG2a (например, J516). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) последовательности CDR М6 (например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22-26 и 29);
(ii) последовательности областей VH и VL М6 или их De-N-гликозилированные варианты (например, VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и VL, содержащая аминокис-
- 19 045594 лотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11);
(iii) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного М6 IgG2a или их De-Nгликозилированные варианты (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, или 31); или (iv) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного М6 IgG1 (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19).
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) последовательности CDR M11 (например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22-25, 27 и 29);
(ii) последовательности областей VH и VL M11 или их De-N-гликозилированные варианты (например, VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11);
(iii) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного М11 IgG2a или их De-Nгликозилированные варианты (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 30 или 31); или (iv) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного М11 IgG1 (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19).
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) последовательности CDR M15 (например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 22-25, 28 и 29);
(ii) последовательности областей VH и VL M15 или их De-N-гликозилированные варианты (например, VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11);
(iii) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного M15 IgG2a или их De-Nгликозилированные варианты (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 30 или 31); или (iv) последовательности тяжелой и легкой цепей мышиного M15 IgG1 (например, тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, и легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19).
В другом конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат тяжелую цепь и легкую цепь, причем (i) тяжелая цепь содержит домен VH, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 области VH, CDR2 области VH и CDR3 области VH антитела, указанного в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 22-24);
(ii) легкая цепь содержит домен VL, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL того же антитела, указанного в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 25, 26 и 29, 25, 27 и 29 или 25, 28 и 29);
(iii) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен IgG1 мыши (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92) или константный домен IgG2a мыши (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87); и (iv) легкая цепь дополнительно содержит мышиный константный домен каппа (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88).
В другом конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат тяжелую цепь и легкую цепь, причем (i) тяжелая цепь содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность антитела, указанного в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 6-8);
(ii) легкая цепь содержит домен VL, содержащий аминокислотную последовательность того же антитела, указанного в табл. 1 (например, SEQ ID NO: 9-11);
(iii) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен IgG1 мыши (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92) или константный домен IgG2a мыши (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87); и (iv) легкая цепь дополнительно содержит мышиный константный домен каппа (например, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88).
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат одну, две или более каркасных областей VH (FR), имеющих аминокислотные по- 20 045594 следовательности, описанные в настоящем изобретении для антитела, указанные в табл. 7 (например, SEQ ID NO: 38-49). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат одну, две или более каркасных областей VL (FR), имеющих аминокислотные последовательности, описанные в настоящем изобретении для антитела, указанные в табл. 7 (например, SEQ ID NO: 50-53). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат одну, две или более каркасных областей VH, имеющих аминокислотные последовательности, описанные в настоящем изобретении для антитела, указанные в табл. 7 выше, и одну, две или более каркасных областей VL, имеющих аминокислотные последовательности, описанные в настоящем изобретении для того же антитела, указанные в табл. 7 (например, SEQ ID NO: 38-41 и 50-53; SEQ ID NO: 42-45 и 50-53; или SEQ ID NO: 46-49 и 50-53).
Таблица 7
Каркасные аминокислотные последовательности
| VH/VL гибридомы | FR1 (SEQ ID NO) | FR2 (SEQ ID NO) | FR3 (SEQ ID NO) | FR4 (SEQ ID NO) |
| Мб VH | QVTLKESGP GILQPSQTLS LTCSFS (SEQ IDNO:38) | GVGWIRQPSG KGLDWLANI (SEQ ID NO:39) | KYYNSALKSRLTISKD TSNNQVFLKISSVDTA DTGTYYCAQ (SEQ ID NO:40) | WGAGTTVT VSS (SEQ ID NO:41) |
| МИ VH | QVTLKESGP GILQPSQTLS LTCSLS (SEQ ID NO:42) | GVGWIRQPSG KGLGWLANI (SEQIDNO:43) | KYYNSALKSRLTISKD TSNNQVFLKISSVDTA DTGTYYCAQ (SEQ ID NO:44) | WGAGTTVT VSS (SEQ ID NO:45) |
| М15 VH | QVTLKESGP GILQSSQTLS LTCSFS (SEQ ID NO:46) | GVGWIRQPSG KGLDWLANI (SEQIDNO:47) | KYYNSALKSRLTISKD TSNNQVFLKISSVDTA DTGTYYCAQ (SEQ ID NO:48) | WGAGTTVT VSS (SEQ ID NO:49) |
| Мб, ми, М15 VL | DVLMTQTPL SLPVSLGDQ ASISC (SEQ IDNO:50) | YLQKPGQSPK LLIY (SEQ ID NO:51) | GVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDLGVYY C (SEQ ID NO:52) | FGAGTKLE LK (SEQ ID NO:53) |
В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат каркасные области VH (FR), имеющие по меньшей 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с каркасными областями VH, описанными в настоящем изобретении в табл. 7. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат каркасные области VL (FR), имеющие по меньшей 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с каркасными областями VL, описанными в настоящем изобретении в табл. 7. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), содержат каркасные области VH (FR), имеющие по меньшей 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с каркасными областями VH, описанными в настоящем изобретении в табл. 7 выше, и каркасные области VL (FR), имеющие по меньшей 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичности последовательности с каркасными областями VL, описанными в настоящем изобретении в табл. 7.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают один и тот же эпитоп В7-Н4 (например, эпитоп В7-Н4 человека), что и антитело
- 21 045594 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении (например, J511-J522).
Анализы конкурентного связывания могут использоваться для определения того, связываются ли два антитела с перекрывающимися эпитопами. Конкурентное связывание можно определять с помощью анализа, в котором исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как В7-Н4. Известны различные типы анализов конкурентного связывания, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммунологический анализ (EIA), конкурентный сэндвичанализ (см. Stahli С. et al. (1983), Methods Enzymol., 9:242-253); прямой твердофазный биотин-авидиновый EIA (см. Kirkland T.N. et al. (1986), J. Immunol., 137:3614-9); твердофазный прямой анализ с мечением, твердофазный прямой сэндвич-анализ с мечением (см. Harlow E. & Lane D. (1988), Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой RIA с применением метки I-125 (см. Morel G.A. et al. (1988), Mol. Immunol., 25(1):7-15); прямой твердофазный биотин-авидиновый EIA (Cheung R.C. et al. (1990), Virology, 176:546-52) и прямой RIA с мечением. (Moldenhauer G. et al. (1990), Scand. J. Immunol., 32:77-82). Обычно такой анализ включает в себя использование очищенного антигена (например, В7-Н4, такого как В7-Н4 человека), связанного с твердой поверхностью, или клеток, содержащих любой из этих компонентов: немеченного исследуемого иммуноглобулина и меченного эталонного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование можно измерить путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более. Анализ конкурентного связывания может быть разработан в большом количестве разных форматов с использованием меченного антигена или меченного антитела. В общем варианте этого анализа антиген иммобилизуют на 96-луночном планшете. Способность немеченных антител блокировать связывание меченных антител с антигеном затем измеряют, используя радиоактивные или ферментные метки. Для получения дополнительной информации см., например, Wagener С. et al. (1983), J. Immunol., 130:2308-2315; Wagener С. et al. (1984), J. Immunol. Methods, 68:269-274; Kuroki M. et al. (1990), Cancer Res., 50:4872-4879; Kuroki M. et al. (1992), Immunol. Invest, 21:523-538; Kuroki M. et al. (1992), Hybridoma, 11:391-407 and Antibodies: A Laboratory Manual, ed Harlow E. & Lane D. editors выше, p. 386-389.
В одном варианте осуществления конкурентный анализ выполняют с использованием поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore ), например, с помощью тандемного подхода, такого как описан у Abdiche Y.N. et al. (2009), Analytical. Biochem., 386:172-180, где антиген В7-Н4 иммобилизуют на поверхности чипа, например, сенсорного чипа СМ5, а антитела к В7-Н4 затем пропускают через этот чип. Чтобы определить, конкурирует ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с антителом к В7Н4, описанным в настоящем изобретении, антитело к В7-Н4 сначала пропускают через поверхность чипа для достижения насыщения, а затем добавляют потенциальное конкурирующее антитело. Связывание конкурирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно затем установить и количественно определить относительно неконкурирующего контроля.
В одном варианте осуществления используется конкурентное связывание Fortebio Octet для определения того, что антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент конкурентно ингибирует связывание другого антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента с В7-Н4.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложены антитела, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем изобретении (например, J511-J522), с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), как определено с помощью анализов, известных специалисту в данной области техники или описанных в настоящем изобретении (например, конкурентные анализы ИФА, или анализ методом suspension array, или анализ поверхностного плазмонного резонанса).
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
- 22 045594
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) антитела, содержащего домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, и домен VL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с одним и тем же эпитопом В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), что и любое из J511-J522. В конкретном аспекте антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем изобретении, который иммуноспецифически связывается с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, и ScFv, причем Fab, Fab', F(ab')2 или ScFv содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи последовательности антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении. Fab, Fab', F(ab')2 или scFv могут быть получены с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники, включая без ограничения описанные в разделе 5.3 ниже. Антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть слиты или конъюгированы (например, ковалентно или нековалентно связаны) с обнаруживаемой меткой или веществом. Примеры обнаруживаемых меток или веществ включают в себя ферментные метки, такие как глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (125I, 121I), углерод (14С), сера (35S), тритий (3Н), индий (121In) и технеций (99Тс); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин, родамин и биотин. Такие меченные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться для обнаружения белка В7-Н4 (например, В7-Н4 человека). См., например, раздел 5.4.1 ниже.
Производство антител.
Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с В7Н4 (например, В7-Н4 человека), могут быть получены любым способом, известным в данной области техники для синтеза антител и их антигенсвязывающих фрагментов, например, химическим синтезом или методами рекомбинантной экспрессии. Способы, описанные в настоящем изобретении используют, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, синтеза олигонуклеотидов и их модификации, гибридизации нуклеиновых кислот и методы смежных областей в пределах области техники. Эти методики описаны, например, в ссылках, цитируемых в настоящем изобретении, и полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook J. et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren В et al. (eds.) (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
В определенном аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения антитела или анти- 23 045594 генсвязывающего фрагмента, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), включающий в себя культивирование клетки или клетки-хозяина, описанной в настоящем изобретении. В определенном аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), включающий в себя экспрессию (например, рекомбинантную экспрессию) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, используя клетку или клетку-хозяина, описанную в настоящем изобретении (например, клетку или клетку-хозяина, содержащую полинуклеотиды, кодирующие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении). В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой выделенную клетку. В конкретном варианте осуществления экзогенные полинуклеотиды были введены в клетку. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает в себя этап очистки антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полученных из клетки или клетки-хозяина. Способы получения поликлональных антител известны в данной области техники (см., например, главу 11 в Short Protocols in Molecular Biology (2002), 5th ed., Ausubel F.M. et al., eds., John Wiley and Sons, New York).
Моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием широкого спектра методов, известных в данной области техники, включая использование технологий гибридомной, рекомбинантной и фаговой индикации, технологий презентации на основе дрожжей или их комбинации. Например, моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием гибридомных методов, включая известные в данной области техники и описанные, например, в Harlow E. & Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); Hammerling G.J. et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563681 (Elsevier, N.Y., 1981), или как описано у Kohler G. & Milstein С. (1975), Nature, 256:495. Примеры способов презентации на основе дрожжей, которые могут применяться для отбора и получения антител, описанных в настоящем изобретении, включают в себя способы, описанные, например, в WO 2009/036379 A2; WO 2010/105256; и WO 2012/009568, каждый из которых в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно получить с помощью гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), как упоминалось выше. В гибридомном способе мышь или другое подходящее животноехозяина иммунизируют, как было описано выше, чтобы вызвать выработку лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации, например, белком внеклеточного домена (ECD) B7-H4 (SEQ ID NO: 20). Лимфоциты затем сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для получения гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986). В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, полученные из клональной клетки (например, гибридомы или клетки-хозяина, вырабатывающей рекомбинантное антитело или антигенсвязывающий фрагмент), причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), как определено, например, с помощью ИФА или других анализов связывания антигена, известных в данной области техники или описанных в примерах, предложенных в настоящем изобретении. В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой антитело грызуна или мыши или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой химерное или гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой Fab-фрагмент или F(ab')2-фрагмент. Моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, могут, например, быть получены с помощью гибридомного способа, как описано у Kohler G. & Milstein С. (1975), Nature, 256:495, или могут, например, быть выделены из фаговых библиотек, используя, например, способы, как описано в настоящем изобретении. Другие способы получения клональных клеточных линий и экспрессируемых ими моноклональных антител и их антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области техники (см., например, главу 11 в Short Protocols in Molecular Biology (2002), 5th ed., Ausubel F.M. et al., выше).
Антигенсвязывающие фрагменты антител, описанных в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники. Например, Fab- и F(ab')2-фрагменты, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены вследствие протеолитического расщепления молекул иммуноглобулина, используя ферменты, такие как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). Fab-фрагмент соответствует одному из двух идентичных плеч молекулы тетрамерного антитела и содержит полную легкую цепь, спаренную с доменами VH и СН1 тяжелой цепи. F(ab')2-фрагмент содержит два антигенсвязывающих плеча молекулы тетрамерного антитела, связанных дисульфидными связями в шарнирной области.
Более того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении,
- 24 045594 могут также быть получены с помощью различных способов фаговой индикации и/или презентации на основе дрожжей, известных в данной области техники. В способах фаговой индикации белки отображаются на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, человеческих или мышиных библиотек кДНК пораженных тканей). ДНК, кодирующие домены VH и VL, рекомбинируют вместе с линкером scFv путем ПЦР и клонируют в фагмидный вектор. Вектор электропорируют в Е.coli и Е.coli инфицируют хелперным фагом. Фаг, используемый в этих способах, как правило, представляет собой нитчатый фаг, включая fd и М13, а домены VH и VL обычно рекомбинантно слиты с фаговым геном III или геном VIII. Фаг, экспрессирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с конкретным антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например, используя меченный антиген или антиген, связанный или захваченный на твердой поверхности или грануле. Примеры способов фаговой индикации, которые могут использоваться для получения антител или фрагментов, описанных в настоящем изобретении, включают в себя способы, описанные у Brinkman U. et al. (1995), J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames R.S. et al. (1995), J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough C.A. et al. (1994), Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic L. et al. (1997), Gene, 187:9-18; Burton D.R. & Barbas C.F. (1994), Advan. Immunol., 57:191-280; в заявке РСТ № PCT/GB91/001134; международных публикациях № WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO 97/13844; а также в патентах США № 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть выбраны из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, а также из любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Полинуклеотиды.
В определенных аспектах в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, или их домен (например, вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи), который иммуноспецифически связывается с антигеном В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), а также векторы, например, векторы, содержащие такие полинуклеотиды для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах (например, Е.coli и клетки млекопитающих).
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с полипептидом В7-Н4 (например, В7-Н4 человека) и содержат аминокислотную последовательность, как описано в настоящем изобретении, а также антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые конкурируют с такими антителами или антигенсвязывающими фрагментами за связывание с полипептидом В7-Н4 (например, дозозависимым образом) или которые связываются с тем же эпитопом, что и такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-8. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-11. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-24, или содержащий все аминокислоты из SEQ ID NO: 22-24. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25-29, или содержащий все из SEQ ID NO: 25, 26 и 29, все из SEQ ID NO: 25, 27 и 29 или все из SEQ ID NO: 25, 28 и 29. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 и 91. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 30 и 31. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие полипептид, иммуноспецифически связываются с В7-Н4.
- 25 045594
Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь и показанную в табл. 8, например, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие кодируемую тяжелую цепь и/или легкую цепь, специфически связываются с В7-Н4.
Таблица 8 Полинуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь
| Антитело | Полинуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую/легкую цепь (SEQ Ш NO) |
| J511 НС | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA GCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAAGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCA CCATTACTCTGACTCcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCA AGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCA CTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTC AATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGC |
- 26 045594
| CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCT CCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGG ATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGAC ATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACA AGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTAC AGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTT TCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAG AAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO:93) | |
| J512, J517, J518HC | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA GCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAAGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCA TGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGC GAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGA AGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGT ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGAT GAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCA GCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAG CTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAG AAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGA CATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTAC AAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTA |
- 27 045594
| CAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAG CTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGA CTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAGTAA (SEQ ID NO: 12) | |
| J513HC | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA GCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTCTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGGCTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCA CCATTACTCTGACTCcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCA AGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCA CTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTC AATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCT CCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGG ATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGAC ATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACA AGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTAC AGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTT TCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAG AAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO:94) |
| J514, J519, J520 НС | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA |
- 28 045594
| GCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTCTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGGCTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCA TGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGC GAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGA AGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGT ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGAT GAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCA GCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAG CTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAG AAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGA CATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTAC AAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTA CAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAG CTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGA CTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAGTAA (SEQ ID NO: 13) | |
| J515HC | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA GTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA |
- 29 045594
| CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCA CCATTACTCTGACTCcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCA AGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAG GTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCA CTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTC AATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCT CCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGG ATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGAC ATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACA AGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTAC AGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTT TCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAG AAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO:95) | |
| J516, J521, | ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATAT |
| J522 НС | GTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCA GTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACT GAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGA AGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGATAAATAC TATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTC CAACAACCAGGTATTCCTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATA CTGGCACATACTACTGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCG ATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACG ACACCACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTG AGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTG |
- 30 045594
| CACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAG CTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCT GCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAAT TGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAG AAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCA TGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGC GAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGA AGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGT ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGAT GAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCA GCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAG CTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAG AAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGA CATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTAC AAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTA CAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAG CTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGA CTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAGTAA (SEQ ID NO: 14) | |
| J511-J516 | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCT |
| LC | TCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTC AGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCAT TGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAAC CAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAACGTTTCCAACCGATTTT CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTC ACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTA CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAA GCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCC CACCATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGC TTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGAT TGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATC AGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTT GACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCC ACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 15) |
- 31 045594
| J517, J519 и J521 LC | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCT TCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTC AGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCAT TGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAAC CAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAACGTTGCCAACCGATTT TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTT CACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATT ACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCA AGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC CCACCATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTG CTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGA TTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGAT CAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGT TGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGC CACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGA ATGAGTGTTAG (SEQ Ш NO:96) |
| J518, J520 и J522 LC | ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCT TCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTC AGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCAT TGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAAC CAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACCAGGTTTCCAACCGATTTT CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTC ACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTA CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAA GCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCC CACCATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGC TTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGAT TGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATC AGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTT GACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCC ACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID NO :97) |
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 12. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 13. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 14. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 93. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 94. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 95.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабель
- 32 045594 ный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 15. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 96. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 97.
Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 12 или 93; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах. Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 13 или 94; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах. Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 14 или 95; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую три CDR последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 12. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 13. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 14. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 93. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 94. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 95.
Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 15. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирую
- 33 045594 щую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 96. Также в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 97. Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 12 или 93; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах. Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 13 или 94; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах.
Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая (i) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 14 или 95; и (ii) полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи, причем нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, содержит кодирующую вариабельный домен последовательность SEQ ID NO: 15, 96 или 97.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном полинуклеотиде или в разных полинуклеотидах. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи, и нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен легкой цепи, могут находиться в одном векторе или в разных векторах.
Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно.
Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, которые по меньшей мере на около 80, 85 или 90% идентичны нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно.
Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на около 95% идентична нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно. Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на около 96% идентична нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно. Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на около 97% идентична нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно. Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на около 98% идентична нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно. Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на около 99% идентична нуклеотидной последовательности, которая кодирует SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 соответственно.
В конкретном варианте осуществления полинуклеотид или комбинация полинуклеотидов, предло
- 34 045594 женные в настоящем изобретении, содержат нуклеотидную последовательность или комбинацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в табл. 3 (например, SEQ ID NO: 6-8), и константную область, содержащую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи гамма (γ) мыши (например, IgG1 или IgG2a).
В конкретном варианте осуществления полинуклеотид или комбинация полинуклеотидов, предложенные в настоящем изобретении, содержат нуклеотидную последовательность или комбинацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые иммуноспецифически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, причем легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в табл. 4 (например, SEQ ID NO: 9-11), и константную область, содержащую аминокислотную последовательность константной области легкой цепи каппа мыши. В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, или их домен, обозначенный в настоящем изобретении; см., например, табл. 1.
Также в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, или их домен, которые являются оптимизированными, например, путем оптимизации кодонов/РНК, замены гетерологичными сигнальными последовательностями, а также путем устранения нестабильных элементов мРНК. Способы для генерирования оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент или домен (например, тяжелую цепь, легкую цепь, домен VH, или домен VL) для рекомбинантной экспрессии путем внесения изменений в кодоны (например, изменение кодона, кодирующего ту же аминокислоту из-за вырожденности генетического кода) и/или устранения ингибирующих областей в мРНК, может быть осуществлено путем адаптации способов оптимизации описанных, например, патентах США № 5965726, 6174666, 6291664, 6414132 и 6794498 соответственно. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, или его домен может быть получен из нуклеиновой кислоты из подходящего источника (например, гибридомы), используя способы, хорошо известные в данной области техники (например, ПЦР и другие способы молекулярного клонирования). Например, ПЦР-амплификация с использованием синтетических праймеров, которые способны гибридизироваться с 3'- и 5'-концами известной последовательности, может быть выполнена с помощью геномной ДНК, полученной из клеток гибридомы, вырабатывающих представляющее интерес антитело. Такие способы ПЦР-амплификации могут быть использованы для получения нуклеиновых кислот, содержащих последовательность, кодирующую легкую цепь и/или тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Такие способы ПЦР-амплификации могут быть использованы для получения нуклеиновых кислот, содержащих последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее антигенсвязывающий фрагмент.
Амплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в векторы для экспрессии в клетках-хозяевах и для дальнейшего клонирования, например, с получением химерных или гуманизированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Полинуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть, например, в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает в себя к ДНК геномную ДНК и синтетическую ДНК, а также ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Будучи одноцепочечной, ДНК может являться кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой кДНК или ДНК, в которой отсутствует один или более эндогенных интронов. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой не встречающийся в природе полинуклеотид. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид продуцируется рекомбинантно. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды являются изолированными. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды являются по существу чистыми. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид очищают от природных компонентов.
Клетки и векторы.
В определенных аспектах в настоящем изобретении предложены векторы (например, векторы экспрессии), содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к В7-Н4 и их антигенсвязывающие фрагменты или их домен, для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, предпочтительно в клетках млекопитающих. Также в настоящем изобретении предложены клетки, например, клетки-хозяева, содержащие такие векторы для рекомбинантной экспрессии антител к В7-Н4 или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем изобретении. В конкретном аспекте в настоящем изобретении предложены способы получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем изобретении, включающие в себя экспрессию такого
- 35 045594 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантная экспрессия антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, или его домена, описанных в настоящем изобретении (например, тяжелой или легкой цепи, описанной в настоящем изобретении), которые специфически связываются с В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), включает в себя конструирование вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его домен. После получения полинуклеотида, кодирующего антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его домен (например, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи), описанные в настоящем изобретении, вектор для создания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК, используя способы, хорошо известные в данной области техники. Таким образом, в настоящем изобретении описаны способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его домен (например, легкую цепь или тяжелую цепь), кодирующие нуклеотидную последовательность. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, содержащих антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его домен (например, легкую цепь или тяжелую цепь), кодирующие последовательности, и соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Эти способы включают в себя, например, методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Также предложены реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, тяжелую или легкую цепь, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи либо CDR тяжелой или легкой цепи, функционально связанные с промотором. Такие векторы, например, могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (см., например, международные публикации № WO 86/05807 и WO 89/01036; а также патент США № 5122464), а вариабельные домены антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть клонированы в такой вектор для экспрессии всей тяжелой цепи, всей легкой цепи или как всей тяжелой, так и всей легкой цепей.
Вектор экспрессии может быть перенесен в клетку (например, клетку-хозяина) с помощью обычных методик, и полученные клетки могут быть затем культивированы с помощью обычных методов для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем изобретении (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих шесть CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28, и 29, область VH из SEQ ID NO: 6-8, область VL из SEQ ID NO: 9-11, область VH из SEQ ID NO: 6-8 и область VL из SEQ ID NO: 9-11, тяжелую цепь из SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 или 91, легкую цепь из SEQ ID NO: 19, 30, 31, или тяжелую цепь из SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 или 91 и легкую цепь из SEQ ID NO: 19, 30 или 31). Таким образом, в настоящем изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие шесть CDR из SeQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28, и 29, область из VH SEQ ID NO: 6-8, область VL из SEQ ID NO: 9-11, область VH из SEQ ID NO: 6-8 и область VL из SEQ ID NO: 9-11, тяжелую цепь из SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 или 91, легкую цепь из SEQ ID NO: 19, 30, 31, или тяжелую цепь из SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 или 91 и легкую цепь из SEQ ID NO: 19, 30 или 31, функционально связанные с промотором для экспрессии таких последовательностей в клетке-хозяине. В определенных вариантах осуществления для экспрессии двухцепочечных антител или их антигенсвязывающих фрагментов могут быть совместно экспрессированы векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, индивидуально, в клетке-хозяине для экспрессии всего иммуноглобулина, как описано ниже. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь и легкую цепь антитела, описанного в настоящем изобретении, или их домен. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит два разных вектора, причем первый вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении, а второй вектор содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела, описанного в настоящем изобретении (например, антитела, содержащего шесть CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28, и 29), или их домен. В других вариантах осуществления первая клетка-хозяин содержит первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении, а вторая клетка-хозяин содержит второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего шесть CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29). В конкретных вариантах осуществления тяжелая цепь/вариабельная область тяжелой цепи, экспрессируемая первой клеткой, связана с легкой цепью/вариабельной областью легкой цепи второй клетки с образованием антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего шесть CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29). В опре- 36 045594 деленных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложена популяция клеток-хозяев, содержащая такую первую клетку-хозяина и такую вторую клетку-хозяина.
В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предложена популяция векторов, содержащая первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь/вариабельную область легкой цепи антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении, и второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь/вариабельную область тяжелой цепи антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем изобретении (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29). В альтернативном варианте может использоваться один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепей.
Для экспрессии антител и их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем изобретении (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29), можно использовать множество векторных систем экспрессии хозяина (см., например, патент США № 5807715). Такие системы экспрессии хозяина являются носителями, с помощью которых могут быть получены и затем очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, а также они представляют клетки, которые при трансформации или трансфекции соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями могут экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, in situ. Они включают в себя без ограничения микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е.coli и В. Subtilis),), трансформированные векторами экспрессии рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими последовательности, кодирующие антитела; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие антитела; системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, бакуловируса), содержащие последовательности, кодирующие антитела; системы растительных клеток (например, зеленые водоросли, такие как Chlamydomonas reinhardtii), инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti-плазмида), содержащими последовательности, кодирующие антитела; или клеточные системы млекопитающих (например, клетки COS (например, COS1 или COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa и NIH 3Т3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSCl, BSC40, YB/20 и ВМТ10), несущие рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса коровьей оспы 7,5K). В конкретном варианте осуществления клетками для экспрессии антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем изобретении (например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов, содержащих CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29), являются клетки СНО, например, клетки СНО из СНО GS System™ (Lonza). В конкретном варианте осуществления клетками для экспрессии антител, описанных в настоящем изобретении, являются клетки человека, например, клеточные линии человека. В конкретном варианте осуществления вектор экспрессии млекопитающих представляет собой pOptiVEC™ или pcDNA3.3. В конкретном варианте осуществления бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, или эукариотические клетки (например, клетки млекопитающих), особенно для экспрессии целой молекулы рекомбинантного антитела, используются для экспрессии молекулы рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО) в сочетании с вектором, таким как основной элемент промотора промежуточного раннего гена из цитомегаловируса человека, являются эффективной системой экспрессии для антител (Foecking M.K. & Hofstetter H. (1986), Gene, 45:101-105; и Cockett M.I. et al. (1990), Biotechnology, 8:662-667). В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, вырабатываются клетками СНО или клетками NS0.
В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид используется при конструировании вектора, содержащего область VH или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в настоящем изобретении. В одном конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность сигнального пептида, используемого для конструирования вектора экспрессии для последовательности VH, представлены в SEQ ID NO: 2 и 4 соответственно. В другом конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность сигнального пептида, используемого для конструирования вектора экспрессии для последовательности VL, представлены в SEQ ID NO: 3 и 5 соответственно.
В одном конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность сигнального пептида VH представлена в виде ATGGGC AGGCTT ACTTCT TCATTC CTGCTA CTGATT GTCCCT GCATAT GTCCTG ТСС (SEQ ID NO: 2). В другом конкретном варианте осуществления аминокислотная последовательность сигнального пептида VH представлена в виде MGRLTSSFLLLIVPAYVLS (SEQ ID NO: 4). В одном конкретном варианте осуществления нуклеотидная последовательность сигнального пептида VL
- 37 045594 представлена в виде ATGAAG TTGCCT GTTAGG CTGTTG GTGCTG ATGTTC TGGATT CCTGCT TCCGGC AGT (SEQ ID NO: 3). В другом конкретном варианте осуществления аминокислотная последовательность сигнального пептида VL представлена в виде MKLPVRLLVLMFWIPASGS (SEQ ID NO: 5). Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и обрабатывает генный продукт конкретным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать функции белка. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают в себя без ограничения клетки СНО, VERO, BHK, HeLa, MDCK, HEK 293, NIH 3Т3, W138, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ20 и T47D, NSO (клеточная линия миеломы мышей, которая эндогенно не вырабатывает никаких цепей иммуноглобулина), CRL7O3O, COS (например, COS1 или COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSCl, BSC40, YB/20, BMT10 и HsS78Bst. В определенных вариантах осуществления антитела к В7-Н4, описанные в настоящем изобретении (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29), вырабатываются в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО.
В определенных вариантах осуществления антитела к В7-Н4, описанные в настоящем изобретении (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие CDR из SEQ ID NO: 22-25, 26, 27 или 28 и 29), вырабатываются в клетках Potelligent® CHOK1SV.
После того как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, были выработаны путем рекомбинантной экспрессии, они могут быть очищены любым способом, известным в данной области техники для очистки молекулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионный обмен, аффинность, в частности, по аффинности к специфическому антигену после белка А, и колоночная хроматография с распределением по размерам); центрифугирования, дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методики очистки белков. Более того, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в настоящем изобретении или известными в данной области техники для облегчения очистки.
В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, выделяют или очищают. Обычно изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой такое, которое по существу не содержит других антител или их антигенсвязывающих фрагментов с антигенной специфичностью, отличной от выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, в конкретном варианте осуществления состав антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанный в настоящем изобретении, по существу не содержит клеточного материала и/или химических предшественников.
Применения и способы.
Применения для обнаружения и диагностики.
Антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении (см., например, раздел 5.2), могут использоваться для количественного определения уровней белка В7-Н4 в биологическом образце, используя способы, известные специалистам в данной области техники, включая иммуноанализы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS), иммуногистохимия (ИГХ), иммунопреципитация и вестерн-блоттинг.
Подходящие метки для анализа антител известны в данной области техники и включают в себя ферментные метки, такие как пероксидаза хрена (HRP) и глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (125I, 121I), углерод (14С), сера (35S), тритий (3Н), индий (121In) и технеций (99Тс); гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцирующие молекулы, хемилюминесцентые молекулы, хромофоры, люминесцентные молекулы, фотоаффинные молекулы, окрашенные частицы и/или лиганды, такие как биотин. В некоторых вариантах осуществления фермент (ферментная метка) будет генерировать окрашенный продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают в себя уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу водорода (хрена) и/или глюкозооксидазу.
Такие метки могут использоваться для мечения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем изобретении. Альтернативно второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, могут быть помечены и использованы в комбинации с антителом к В7-Н4 или его антигенсвязывающим фрагментом для обнаружения уровней белка В7-Н4. В некоторых вариантах осуществления такое вторичное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело мыши или грызуна, помечены ферментом (например, пероксидазой хрена) и обнаруживаются с помощью субстрата фермента (например, 3,3'-диаминобензидина (DAB)).
В данной области техники известно несколько способов для присоединения или конъюгации антитела с его фрагментом конъюгата. Некоторые способы присоединения включают в себя применение комплекса хелатов металлов с использованием, например, органического хелатирующего агента, такого как ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусная кислота;
- 38 045594
N-хлор-п-толуолсульфонамид и/или тетрахлор-3а-6а-дифенилгликоурил-3, присоединенных к антителу (патенты США № 4472509 и 4938948, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки). Моноклональные антитела также могут реагировать с ферментом в присутствии сочетающего агента, такого как глутаральдегид или периодат. Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии таких сочетающих агентов или путем реакции с изотиоцианатом. В патенте США № 4938948 визуализация опухолей молочных желез, например, достигается путем использования моноклональных антител, а обнаруживаемые фрагменты для визуализации связываются с антителом с помощью линкеров, таких как метил-п-гидроксибензимидат или N-сукцинимидил-3-(4-гидроксифенил)пропионат.
В других вариантах осуществления обсуждается дериватизация иммуноглобулинов селективным введением сульфгидрильных групп в Fc-область иммуноглобулина с использованием условий реакции, которые не изменяют участок связывания антитела. Описано, что конъюгаты антител, получаемые в соответствии с этой методологией, проявляют улучшенную долговечность, специфичность и чувствительность (патент США № 5196066, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Сайтспецифическое присоединение эффекторных или репортерных молекул, где репортерную или эффекторную молекулу конъюгируют с углеводным остатком в Fc-области, также было описано в литературе (O'Shannessy et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 1987 Dec, 9(6):488-96). Проведение анализа на уровень экспрессии белка В7-Н4 предназначено для включения качественного или количественного измерения или оценки уровня белка В7-Н4 в первом биологическом образце прямо (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка) или косвенно (например, путем сравнения с уровнем белка В7-Н4 во втором биологическом образце или эталонном образце). Уровень экспрессии полипептида В7-Н4 в первом биологическом образце можно измерить или оценить и сравнить с эталонным уровнем белка В7Н4, при этом эталон определяют на основании второго непораженного биологического образца или определяют путем усреднения уровней в популяции непораженных образцов. Как будет понятно специалистам в данной области техники, как только будет известен эталонный уровень полипептида В7-Н4, его можно систематически использовать в качестве эталона для сравнения. Термин биологический образец в контексте настоящего изобретения относится к любому биологическому образцу, полученному от субъекта, из клеточной линии, ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих В7Н4. Неограничивающие источники биологического образца для использования в настоящем изобретении включают в себя, например, солидную ткань, биопсию, асциты, аспираты, экстракты жидкости, кровь (включая циркулирующие опухолевые клетки), плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешние срезы кожи, дыхательных путей, кишечника и мочеполового тракта, слезы, слюну, молоко, опухоли, органы, клеточные культуры и/или компоненты клеточных культур. Способы получения образцов биопсии тканей и жидкостей организма у животных (например, людей) хорошо известны в данной области техники. Примеры способов получения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) описаны в Ferreira et al., Molecular Oncology, 10:374-394, которая в полном объеме включена в настоящий документ посредством ссылки. Например, ЦОК могут быть обогащены из образца крови, используя стратеги на основе иммуноаффинности или биофизики. ЦОК также могут быть получены, используя методы прямой визуализации. Примеры способов получения и обработки образцов биопсии, которые могут использоваться в иммуногистохимических (ИГХ) анализах, представлены в настоящем изобретении в примере 4.
Антитело к В7-Н4, описанное в настоящем изобретении, может использоваться в диагностических применениях, включая применения in vitro, которые хорошо известны и являются стандартными для специалиста, а также основаны на настоящем описании. Диагностические анализы и наборы для оценки В7-Н4 in vitro могут использоваться для изучения образцов пациента, включая образцы, известные как имеющие рак или подозрение на рак. Такой тип прогностического и диагностического мониторинга и оценки применяется на практике, например, используя антитела к белку HER2 при раке молочной железы (HercepTest™, Dako), где анализ применяется для оценки пациента на предмет терапии антителами с использованием герцептина®.
Антитела к В7-Н4 и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, могут нести обнаруживаемую или функциональную метку. В случае использования флуоресцентных меток доступная в настоящее время микроскопия и сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), или комбинация двух способов, известных в данной области техники, могут применяться для идентификации и количественного определения членов специфического связывания. Антитела к В7-Н4 или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, могут нести флуоресцентную метку. Примеры флуоресцентных меток включают в себя, например, реактивные и конъюгированные зонды, например, аминокумарин, флуоресцеин и техасский красный, красители Alexa Fluor, красители Су и красители DyLight. Антитело к В7-Н4 может нести радиоактивную метку, такую как изотопы 3Н, 14С, 32Р, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Со, 58Со, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Тс, 1nIn, 117Lu, 121I, 1241, 1251, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac и 186Re. В случае использования радиоактивных меток доступные в настоящее время способы подсчета, известные в данной области техники, могут использоваться для идентификации и количественного определения специфического связывания антитела к В7-Н4 или антигенсвязывающего фрагмента с В7-Н4
- 39 045594 (например, В7-Н4 человека). В случае когда метка представляет собой фермент, обнаружение может выполняться с помощью любого метода, применяемого в настоящее время в данной области техники: колориметрического, спектрофотометрического, флуороспектрофотометрического, амперометрического или газометрического метода. Этого можно достичь путем приведения в контакт образца или контрольного образца с антителом к В7-Н4 или его антигенсвязывающим фрагментом в условиях, которые позволяют образовать комплекс между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и В7-Н4. Все комплексы, образованные между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и В7-Н4, обнаруживаются и сравниваются в образце и контрольном образце. В свете специфического связывания антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем изобретении, с В7-Н4 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться для специфического обнаружения экспрессии В7-Н4, например, в цельных клетках, на клеточных мембранах или в цитоплазме. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, также могут использоваться для очистки В7-Н4 путем иммуноаффинной очистки.
В настоящее изобретение также включена система анализа, которая может быть получена в виде набора для анализа для количественного определения степени присутствия, например, В7-Н4. Система или набор для анализа могут содержать меченный компонент, например, меченное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, а также один или более дополнительных иммунохимических реагентов. Дополнительную информацию о наборах см., например, в разделе 5.4.3 ниже.
В некоторых аспектах способы обнаружения В7-Н4 в образце in vitro включают в себя приведение в контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано в настоящем изобретении. В некоторых аспектах в настоящем изобретении предложено использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении, для обнаружения В7-Н4 в образце in vitro. В одном аспекте в настоящем изобретении предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, для использования с целью обнаружения В7-Н4 у субъекта или в образце, полученном от субъекта. В одном аспекте в настоящем изобретении предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, для использования в целях диагностики. В одном варианте осуществления антитело содержит обнаруживаемую метку. В одном предпочтительном варианте осуществления В7-Н4 представляет собой В7-Н4 человека. В одном предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека. В дополнительном варианте осуществления субъект, например, субъект-человек, имеет рак. В некоторых аспектах настоящее изобретение рассматривает способы иммунологического анализа для связывания и обнаружения В7-Н4. Антитела, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут применяться для обнаружения В7-Н4. Некоторые способы иммунологического анализа включают в себя, помимо прочего, иммуногистохимию, проточную цитометрию, иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунологический анализ (RIA), иммунорадиометрический анализ, иммунофлуоресцентный анализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и вестерн-блоттинг. Этапы различных способов иммунологического анализа были описаны в научной литературе, как, например, в Doolittle M.H., Ben-Zeev О., Methods Mol. Biol., 1999, 109:215-37; Gulbis В., Galand P., Hum Pathol., 1993 Dec, 24(12):1271-85; и De Jager R. et al., Semin. Nucl. Med., 1993 Apr, 23(2):165-79, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.
В общем способы иммунного связывания включают в себя получение образца, например образца, подозреваемого в наличии В7-Н4, и приведение в контакт этого образца с первым антителом к В7-Н4 в соответствии с настоящим изобретением в условиях, эффективных для образования иммунных комплексов.
Приведение в контакт выбранного биологического образца с антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов), как правило, включает в себя добавление в образец композиции антител и инкубацию смеси в течение периода времени, достаточного для образования антителами иммунных комплексов, т.е. для специфического связывания, с любыми присутствующими В7-Н4. После этого композицию образца с антителами, такую как срез ткани, планшет для ИФА, дот-блот или вестерн-блот, обычно промывают для удаления любых неспецифически связанных антител, позволяя обнаруживать только те антитела, которые специфически связаны с первичными иммунными комплексами.
В общем обнаружение образования иммунных комплексов хорошо известно в данной области техники и может достигаться путем применения различных подходов. Такие способы обычно основаны на обнаружении метки или маркера, таких как любая из радиоактивной, флуоресцентной, биологической или ферментативной меток. Патенты США, касающиеся использования таких меток, включают в себя патенты США № 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления вторичный связывающий агент, такой как вторичное антитело и/или система связывания лигандов биотина/авидина, может использоваться в соответствии с методологиями, известными в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления первое антитело, которое связывается в пределах первичных иммунных комплектов, может быть обнаружено при помощи второго связывающего агента, обладающего аффинностью связывания с антителом. В таких случаях второй связывающий агент может быть связан
- 40 045594 с обнаруживаемой меткой. Второй связывающий агент часто сам по себе является антителом, которое, таким образом, может быть названо вторичным антителом. Первичные иммунные комплексы контактируют с меченным вторичным связывающим агентом, или антителом, в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования вторичных иммунных комплексов. Вторичные иммунные комплексы затем, как правило, промывают для удаления любых неспецифически связанных меченных вторичных антител или лигандов, а затем обнаруживают оставшуюся метку во вторичных иммунных комплексах.
Дополнительные способы включают в себя обнаружение первичных иммунных комплексов с помощью двухэтапного подхода. Второй связывающий агент, такой как антитело, который обладает аффинностью связывания с антителом, используется для образования вторичных иммунных комплексов, как было описано выше. После промывания вторичные иммунные комплексы приводят в контакт с третьим связывающим агентом или антителом, которые обладают аффинностью связывания со вторым антителом, опять-таки в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (третичных иммунных комплексов). Третий лиганд или антитело связаны с обнаруживаемой меткой, позволяя обнаруживать третичные иммунные комплексы, образованные таким образом. Такая система может обеспечить амплификацию сигнала, если это желательно.
В другом варианте осуществления биотинилированное моноклональное или поликлональное антитело используется для обнаружения антигенов-мишеней, а антитело второго этапа затем используется для обнаружения биотина, присоединенного к комплексу антитела. В этом способе образец, подлежащий анализу, сначала инкубируют в растворе, содержащем антитело первого этапа. В случае присутствия антигена-мишени некоторые антитела специфически связываются с антигеном для образования комплекса биотинилированного антитела с антигеном. Комплекс антитела с антигеном затем амплифицируют путем инкубации в последующих растворах стрептавидина (или авидина) и биотинилированной ДНК, и/или комплементарной биотинилированной ДНК, при этом на каждом этапе к комплексу антитела с антигеном добавляются дополнительные сайты биотина. Этапы амплификации повторяют до тех пор, пока не будет достигнут подходящий уровень амплификации, после чего образец инкубируют в растворе, содержащем антитело второго этапа против биотина. Такое антитело второго этапа является меченным, например, ферментом, который может использоваться для обнаружения присутствия комплекса антитела с антигеном с помощью гистоэнзимологии, используя хромогенный субстрат. При подходящей амплификации можно получить конъюгат, который будет макроскопически видимым.
В одном варианте осуществления для иммунологического обнаружения применяется иммуногистохимия (ИГХ). Используя ИГХ, обнаружение в образце В7-Н4 достигается путем нацеливания на образец связывающего агента, например, антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Связывающий агент может быть связан, прямо или косвенно, с обнаруживаемой меткой или может обнаруживаться с помощью другого связывающего агента, который прямо или косвенно связан с обнаруживаемой меткой. В одном варианте осуществления в ИГХ анализе используется 3,3'-диаминобензидин (DAB) для обнаружения первичного антитела, связанного с В7-Н4. В одном варианте осуществления концентрация антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента в ИГХ анализе составляет от около 1 мкг/мл до около 50 мкг/мл. В одном варианте осуществления концентрация антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента в ИГХ анализе составляет от около 1 мкг/мл до около 20 мкг/мл. В одном варианте осуществления концентрация антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента в ИГХ анализе составляет около 10 мкг/мл. ИГХ может выполняться на клетках, клеточном осадке, тканях, препаратах крови, плазме, сыворотке или лимфатической жидкости и т.д. В некоторых вариантах осуществления образцы представляют собой фиксированные образцы. В некоторых вариантах осуществления образцы представляют собой погруженные в парафин образцы. В некоторых вариантах осуществления образцы представляют собой фиксированные формалином и погруженные в парафин образцы.
В одном варианте осуществления для иммунологического обнаружения применяется проточная цитометрия. Таким образом, например, число связанных антител на одну клетку (antibodies bound per cell ABC) можно оценить с помощью проточной цитометрии.
Терапевтические применения и способы.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены способы лечения рака, экспрессирующего В7-Н4, у субъекта, включающие в себя введение субъекту терапевтического антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента, причем экспрессия В7-Н4 была обнаружена в образце, полученном от этого субъекта, используя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя обнаружение В7-Н4 в образце, полученном от субъекта.
В определенных вариантах осуществления представленный в настоящем изобретении рак выбран из группы, состоящей из: рака молочной железы (например, тройной негативный рак молочной железы, положительный на рецептор гормона (HR) рак молочной железы, рак протоков), рака эндометрия, рака яичника, немелкоклеточного рака легкого (например, плоскоклеточный рак), рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почки (например, почечно-клеточный рак) и рака мочевого пузыря (например, уротелиальноклеточный рак).
- 41 045594
Терапевтические антитела к В7-Н4 или их антигенсвязывающие фрагменты включают в себя, например, 20502 и 22213, а также их антигенсвязывающие фрагменты. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности антител 20502 и 22213 представлены в табл. 9 и 10.
Таблица 9
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности антитела 20502
| Домен антитела (AA/N) | Последовательность (SEQ ID NO) |
| VHCDR1 (АА) | GSIKSGSYYWG (SEQ Ш NO:58) |
| VH CDR2 (АА) | NIYYSGSTYYNPSLRS (SEQ ID NO:59) |
| VH CDR3 (АА) | AREGSYPNQFDP (SEQ ID NO:60) |
| VL CDR1 (АА) | RASQSVSSNLA (SEQ ID NO:61) |
| VL CDR2 (АА) | GASTRAT (SEQ ID NO:62) |
| VL CDR3 (АА) | QQYHSFPFT (SEQ ID NO:63) |
| VH(AA) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYYWGWI RQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVTISVDTSKN QF SLKLS S VT AADT AVYYC AREGS YPNQFDPWGQGTL V TVSS (SEQ ID NO:64) |
| VL (АА) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYHSFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:65) |
| VH FR1 (АА) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO:66) |
| VH FR2 (АА) | WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:67) |
| VH FR3 (АА) | RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO :68) |
| VH FR4 (АА) | WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :69) |
| VL FR1 (АА) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO:70) |
| VL FR2 (АА) | WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:71) |
| VL FR3 (АА) | GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDF AVYYC (SEQ ID NO :72) |
| VL FR4 (АА) | FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:73) |
| Тяжелая цепь (АА) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYYWGWI RQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVTISVDTSKN QF SLKLS SVT AADT AVYYC AREGS YPNQFDPWGQGTL V TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVI<FNWYVDGVEVHNAI<TI<PREEQYNSTYRVVSVL |
- 42 045594
| TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO:74) | |
| Легкая цепь (АА) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYHSFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:75) |
| VH (N) | CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGGCTCCATCAAAAGTGGTAGTTACTACTGGGG CTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GATTGGGAACATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTAC AACCCGTCCCTCAGAAGTCGAGTCACCATATCCGTAG ACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTC TGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCC AGAGAAGGATCTTACCCCAATCAGTTTGATCCATGGG GACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO :76) |
| VL(N) | GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTG TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGC CAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAG CAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATG GTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACC ATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATT ACTGTCAGCAGTACCACTCCTTCCCTTTCACTTTTGGC GGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO:77) |
- 43 045594
Таблица 10
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности антитела 22213
| Домен антитела (AA/N) | Последовательность (SEQ ID NO) |
| VH CDR1 (АА) | GSIGRGSYYWG (SEQ Ш NO:32) |
| VH CDR2 (АА) | NIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO:33) |
| VH CDR3 (АА) | AREGSYTTVLNV (SEQ ID NO:34) |
| VL CDR1 (АА) | RASQSVASSHLA (SEQ ID NO:35) |
| VL CDR2 (АА) | DAVSRAT (SEQ ID NO :36) |
| VL CDR3 (АА) | QQAASYPLT (SEQ ID NO:37) |
| VH(AA) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGRGSYYWGWI RQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYTTVLNVWGQGTM VTVSS (SEQ ID NO:54) |
| VL (АА) | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSHLAWYQQ KPGQAPRLLIYDAVSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQQAASYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:55) |
| VH FR1 (АА) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO:78) |
| VH FR2 (АА) | WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:79) |
| VH FR3 (АА) | RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO :80) |
| VH FR4 (АА) | WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:81) |
| VL FR1 (АА) | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:82) |
| VL FR2 (АА) | WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:83) |
| VL FR3 (АА) | GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO :84) |
| VL FR4 (АА) | FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:98) |
| Тяжелая цепь (АА) | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGRGSYYWGWI RQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYTTVLNVWGQGTM VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE |
- 44 045594
| DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:56) | |
| Легкая цепь (АА) | EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSHLAWYQQ KPGQAPRLLIYDAVSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQQAASYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:57) |
| VH(N) | CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGGCTCCATCGGGAGGGGGAGTTACTACTGGGG CTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GATTGGGAACATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTAC AACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAG ACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTC TGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCC AGAGAAGGATCTTACACAACCGTGTTAAACGTATGG GGTCAGGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:85) |
| VL (N) | GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGC CAGTCAGAGTGTTGCCAGCAGCCACTTAGCCTGGTAC CAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCT ATGACGCAGTCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCT CACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTG TATTACTGTCAGCAGGCCGCCAGTTACCCTCTCACTTT TGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO :86) |
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL антитела 20502. CDR могут представлять собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL антитела 22213. CDR могут представлять собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32-37 соответственно. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 58-63 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий
- 45 045594 фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к В7-Н4 или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.
Наборы.
В настоящем изобретении предложены наборы, содержащие одно или боле антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем изобретении, или их конъюгатов (например, детектирующих конъюгатов). Как предложено в настоящем изобретении, наборы могут использоваться в способах диагностики. В одном варианте осуществления набор содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, предпочтительно очищенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в одном или более контейнеров.
В конкретном варианте осуществления наборы, описанные в настоящем изобретении, содержат по существу выделенный антиген В7-Н4 (например, В7-Н4 человека), который может использоваться в качестве контроля. В конкретных вариантах осуществления набор, предложенный в настоящем изобретении, может содержать полученный рекомбинантным способом или химически синтезированный антиген В7-Н4. Антиген В7-Н4, представленный в наборе, также может быть присоединен к твердой подложке.
В другом конкретном варианте осуществления наборы, описанные в настоящем изобретении, дополнительно содержат контрольное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые не реагируют с антигеном В7-Н4. В другом конкретном варианте осуществления наборы, описанные в настоящем изобретении, содержат один или более элементов для обнаружения специфического связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном В7-Н4 (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с обнаруживаемым субстратом, таким как флуоресцентное соединение, фермент, ферментативный субстрат, радиоактивное соединение или люминесцентное соединение, или второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые распознают первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут быть конъюгированы с обнаруживаемым субстратом). В еще одном конкретном варианте осуществления элементы для обнаружения из описанного выше набора включают в себя твердую подложку, к которой присоединен антиген В7-Н4. Подобный набор может также включать в себя неприсоединенное меченое репортером антитело мыши/грызуна или его антигенсвязывающий фрагмент. В этом варианте осуществления связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном В7-Н4 может быть обнаружено путем связывания указанного меченого репортером антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В другом конкретном варианте осуществления наборы, описанные в настоящем изобретении, дополнительно содержат терапевтическое антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент и информацию о том, что терапевтическое антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент должны вводиться, когда В7-Н4 обнаружен в образце, используя антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем изобретении.
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.
- 46 045594
Примеры
Примеры в этом разделе (т.е. в разделе 6) предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
Пример 1. Получение гибридомы.
Панель антител, которые селективно связываются с В7-Н4, была получена с помощью рекомбинантного растворимого варианта белка внеклеточного домена (ECD) В7-Н4:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSD
IVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTD AGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWA SQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVT ESEIKRRSHLQLLNSKASGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO:20).
В каждую заднюю подушечку лапы мыши линии NZB/W инъецировали белок ECD B7-H4, ресуспендированный в Sigma Adjuvant System® (Sigma-Aldrich, Inc., г. Сент-Луис, штат Миссури). Через 21 день после первой инъекции сыворотку отбирали и титровали путем иммуноферментного анализа (ИФА), сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и проточной цитометрии, чтобы обеспечить хороший иммунный ответ у мыши. Скрининги ИФА и FACS подробно описаны в примерах 2 и 3 соответственно. Через 3 дня после последней инъекции клетки подколенных узлов, полученные от мышей с положительным титром, сливали с линиями миеломных клеток мыши (см., например, Chuntharapai et al., 1997, Methods Enzymol., 288:15-27). Было получено около 2880 гибридомных клонов крысы.
Гибридомные клоны, полученные таким образом, затем подвергали скринингу на предмет выработки моноклональных антител, связывающихся с белком ECD В7-Н4 (SEQ ID NO: 20), слитым Fc-белком N-концевого IgV-домена В7-Н4 (аминокислоты l-151)-huIgG (SEQ ID NO: 21) и с клетками HEK 293, стабильно экспрессирующими полноразмерный В7-Н4 человека (SEQ ID NO: 1) на своей поверхности.
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSD IVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTD AGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO:21).
Пример 2. Скрининг ИФА.
Для скрининга гибридомных клонов, полученных в примере 1, выполнили ИФА, в целом как описано в Baker et al., 2002, Trends Biotechnol, 20:149-156. Вкратце 96-луночные планшеты покрывали 50 мкл белка ECD B7-H4 (SEQ ID NO: 20) или N-концевого слитого Fc-белка В7-Н4 (SEQ ID NO: 21) в концентрации 2 мкг/мл в покрывающем буфере (0,05 М карбонатный буфер, рН 9,6), запечатывали и хранили в течение ночи при температуре 40°С. После удаления покрывающего раствора в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 200 мкл аналитического/блокирующего раствора, содержащего 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA) и 0,05% Tween®-20 в ФСБ (рН 7,4) (разбавитель ИФА). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с перемешиванием. Лунки затем трижды промывали 300 мкл 0,05% Tween®-20 в ФСБ (промывочный буфер). После промывания в каждую лунку добавляли 100 мкл гибридомного супернатанта в разбавителе ИФА, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с перемешиванием. Лунки трижды промывали промывочным буфером, как было описано выше. После промывания в каждую лунку добавляли 100 мкл разведения 1:1000 овечьих антител против мышиного IgG, соединенных с пероксидазой хрена в разбавителе ИФА. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с перемешиванием, трижды промывали промывочным буфером, как было описано выше, и высушивали. Лунки обрабатывали добавлением 100 мкл микролуночного субстрата пероксидазы хрена тетраметилбензидина (ТМВ) в каждую лунку и инкубацией при комнатной температуре в течение 5-10 минут или пока не происходило изменение цвета. Обработку останавливали добавлением 100 мкл стоп-раствора ТМВ в каждую лунку. Планшеты анализировали при 650 нм. В качестве контролей использовали предотбор и полисыворотку. Образцы предотбора содержали мышиную сыворотку до иммунизации, а образцы полисыворотки содержали мышиную антисыворотку после иммунизации. Антитела, которые дали положительный сигнал ИФА, были отобраны для последующего скрининга с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
- 47 045594
Пример 3. Скрининг FACS.
Для дальнейшего скрининга гибридомных клонов, полученных в примере 1, выполнили сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS), используя клетки HEK 293, стабильно экспрессирующие полноразмерный В7-Н4 человека (SEQ ID NO: 1). Стандартные клеточные линии HEK 293 служили в качестве отрицательного контроля. Клетки ресуспендировали и центрифугировали при 500g в течение 5 минут при температуре 40°С. Среду аспирировали, а клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания BD FACSFlow™ Stain Buffer (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния) с 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (буфер для окрашивания клеток) при температуре 40°С. Клетки центрифугировали, как было описано ранее, среду аспирировали, а клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания клеток при температуре 40°С до конечной концентрации 2х106 клеток/мл. Затем клетки добавляли в 96-луночные планшеты с круглым дном в концентрации 50 мкл/лунку. 100 мкл супернатанта от каждого гибридомного клона добавляли в каждую лунку, так что каждый гибридомный супернатант инкубировали с одной лункой, содержащей клеточную линию HEK 293, стабильно экспрессирующую В7-Н4, или клеточную линию отрицательного контроля. Планшеты инкубировали на льду в течение 30 минут и центрифугировали, как было описано ранее. Затем супернатанты аспирировали. Каждую лунку ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания клеток при температуре 40°С. После этого планшеты центрифугировали, как было описано ранее, а буфер для окрашивания клеток аспирировали. После этапа промывания клетки в каждой лунке ресуспендировали в 100 мкл разведения 1:1000 козьего Fc-фрагмента против мышиного IgG, соединенного с R-фикоэритрином (Jackson Immunoresearch, Вест Гров, штат Пенсильвания), в буфере для окрашивания клеток при температуре 40°С, и планшеты инкубировали в темноте на льду в течение 30 минут. Планшеты центрифугировали, как было описано ранее, а супернатанты аспирировали. Каждую лунку ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания клеток при температуре 40°С, а планшеты центрифугировали, как было описано ранее. Буфер для окрашивания клеток аспирировали. Клетки в каждой лунке ресуспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания клеток при температуре 40°С и переносили в пробирки для микротитрования объемом 1,2 мл. FACS выполняли на приборе FACScan™ или FACSCalibur™ (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния). Антитела, которые продемонстрировали клеточное связывание в анализе FACS, отбирали для дальнейшего скрининга с помощью иммуногистохимии (ИГХ).
Пример 4. Скрининг ИГХ.
Для дальнейшего скрининга гибридомных клонов, полученных в примере 1, выполнили иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание срезов, полученных от субъекта с инвазивной протоковой карциномой молочной железы. Фиксированные формалином и погруженные в парафин (FFPE) срезы вырезали на расстоянии 5 микрон, сушили на воздухе на заряженных предметных стеклах Superfrost Plus и выпекали в течение одного часа при температуре 60°С. Срезы депарафинизировали и окрашивали на автоматической системе окрашивания Discovery Ultra (Ventana Medical Systems, Тусон, штат Аризона). Через 1 ч демаскировки антигена с помощью Ultra CC1 при температуре 95°С В7-Н4 обнаруживали с помощью мышиных первичных антител к В7-Н4 в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим использованием системы обнаружения на основе антимышиных антител Omni-Map, конъюгированных с HRP, 3,3'-диаминобензидина (DAB) ChromoMap и контрастным окрашиванием гематоксилином в соответствии с инструкциями производителя.
Использовали семь первичных антител к В7-Н4: шесть рекомбинантных антител, полученных в примере 1 (в концентрации 10 мкг/мл), а также А57.1 (см. патент США № 7619068) (в концентрации 1,25 мкг/мл), которое использовалось в качестве контроля. Два рекомбинантных антитела (J516 и J512) обнаружили В7-Н4 на клеточных мембранах и в цитоплазме аналогичным с А57.1 образом, при этом большинство В7-Н4-положительных клеток наблюдалось в опухолевом отделе, как показано на фиг. 1 и 2. Рекомбинантные антитела обнаружили меньшее количество В7-Н4-экспрессирующих клеток с интенсивностью сигнала 1+, чем А57.1 (35% с помощью J512 по сравнению с 35% с помощью J516% по сравнению с 58% с помощью А57.1), как показано на фиг. 3 и 4. При измерении экспрессии В7-Н4 с помощью вычислительного анализа изображений (Definiens, Кембридж, штат Массачусетс) J516 и J512 продемонстрировали аналогичное распределение сигнала В7-Н4 по клеточным отделам, что и А57.1, как показано на фиг. 5А-5С.
Пример 5. Определение последовательностей.
Последовательности тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) антител к В7-Н4 М6, M11 и M15, все из которых продемонстрировали окрашивание ИГХ, были определены в соответствии со следующей процедурой.
РНК собирали из гибридом с помощью реагента тризол (Thermofisher Scientific, Карлсбад, штат Калифорния), а кДНК получали с помощью обратной транскриптазы Smartscribe (Clontech, Маунтин Вью, штат Калифорния) и полимеразы Advantage 2 (Clontech, Маунтин Вью, штат Калифорния). ПЦР выполняли с использованием полимеразы Phusion Taq (NEB, Ипсвич, штат Массачусетс) в стандартных условиях ПНР. Продукты ПЦР затем клонировали с использованием набора для клонирования Zero Blunt® TOPO® (Thermofisher Scientific, Карлсбад, штат Калифорния).
-
Claims (21)
- Проводили скрининг клонов на предмет вставок, и множественные клоны секвенировали для проверки исходных генных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, представлены в табл. 8 выше.Вариабельные домены антитела к В7-Н4 затем субклонировали в векторы экспрессии с различными Fc-областями с получением антител с константными областями IgG2a мыши и IgG1 мыши. Вариабельные домены тяжелой цепи антитела к В7-Н4 затем клонировали в векторы экспрессии с различными Fcобластями с получением антител с константными областями IgG2a мыши и IgG1 мыши. Вариабельные домены легкой цепи антитела к В7-Н4 клонировали в векторы экспрессии с константной областью IgK мыши. После проверки последовательностей выделенным антителам присвоили ID J511-J516, как указано в табл. 1 выше.Изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем изобретении. Действительно различные модификации изобретения в дополнение к описанным будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеуказанного описания и сопроводительных фигур. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.Все ссылки (например, публикации, или патенты, или патентные заявки), цитированные в настоящем изобретении, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная ссылка (например, публикация, или патент, или заявка на патент) была конкретно и индивидуально включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другие варианты осуществления находятся в пределах следующей формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с В7-Н4 человека, содержащее определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, CDR2 области VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, CDR3 области VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, CDR2 области VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 27 или 28, и последовательность CDR3 области VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
- 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 7 или 8, и/или VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 10 или 11.
- 3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с В7-Н4 человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 6 и 9 соответственно;(b) SEQ ID NO: 6 и 10 соответственно;(c) SEQ ID NO: 6 и 11 соответственно;(d) SEQ ID NO: 7 и 9 соответственно;(e) SEQ ID NO: 7 и 10 соответственно;(f) SEQ ID NO: 7 и 11 соответственно;(g) SEQ ID NO: 8 и 9 соответственно;(h) SEQ ID NO: 8 и 10 соответственно; или (i) SEQ ID NO: 8 и 11 соответственно.
- 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, в котором антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь и легкую цепь, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 16 и 19 соответственно;(b) SEQ ID NO: 16 и 30 соответственно;(c) SEQ ID NO: 16 и 31 соответственно;(d) SEQ ID NO: 17 и 19 соответственно;(e) SEQ ID NO: 17 и 30 соответственно;(f) SEQ ID NO: 17 и 31 соответственно;(g) SEQ ID NO: 18 и 19 соответственно;(h) SEQ ID NO: 18 и 30 соответственно;(i) SEQ ID NO: 18 и 31 соответственно;(j) SEQ ID NO: 89 и 19 соответственно;(k) SEQ ID NO: 90 и 19 соответственно; или (l) SEQ ID NO: 91 и 19 соответственно.
- 5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывает-- 49 045594 ся с В7-Н4 человека, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 области VH, CDR2 области VH, CDR3 области VH, CDR1 области VL, CDR2 области VL и CDR3 области VL антитела, выбранного из группы, состоящей из J512, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 6 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 9, J513 или J514, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 9, J515 или J516, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 9, J517, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 6 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 10, J518, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 6 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 11, J519, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 10, J520, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 11, J521, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 10, и J522, содержащего аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 11.
- 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором CDR представляют собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM.
- 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, который представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, причем антигенсвязывающий фрагмент содержит Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), связанный дисульфидной связью фрагмент Fv, минитело, F(ab')3, диатело, (scFv)2 или scFv-Fc.
- 8. Конъюгат антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7 и токсина.
- 9. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.2 или 3.
- 10. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.2 или 3.
- 11. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7.
- 12. Выделенный полинуклеотид по п.11, в котором молекула нуклеиновой кислоты кодирует область VL SEQ ID NO: 9, 10 или 11 либо легкую цепь SEQ ID NO: 19, 30 или 31.
- 13. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7.
- 14. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь антител, или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.2-4 и вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.2-4.
- 15. Выделенный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп.9-14.
- 16. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пп.9-13, вектор по п.15 или первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи по п.9 или 13, и второй вектор, кодирующий вариабельную область легкой цепи по любому из пп.10-12.
- 17. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с В7-Н4 человека, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи по любому из пп.9-14, таким образом, чтобы экспрессировался полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, и вырабатывалось антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
- 18. Способ обнаружения В7-Н4 в образце, включающий приведение в контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-7 и обнаружение связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с В7-Н4.
- 19. Способ по п.18, в котором образец получают от субъекта, имеющего рак.
- 20. Способ по п.19, в котором рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, протоковой карциномы, рака эндометрия, рака яичников, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почки и рака мочевого пузыря.
- 21. Применение терапевтического антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающего фрагмента для лечения рака, экспрессирующего В7-Н4, причем экспрессия В7-Н4 была обнаружена в образце, полученном от субъекта с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7, при этом терапевтическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/637,740 | 2018-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045594B1 true EA045594B1 (ru) | 2023-12-11 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11939383B2 (en) | B7-H4 antibodies and methods and use thereof | |
| US11814431B2 (en) | B7-H4 antibodies and methods of use thereof | |
| AU2020294193B2 (en) | Anti-pro/latent-Myostatin antibodies and uses thereof | |
| AU2013361617B2 (en) | Antibodies that bind to human programmed Death Ligand 1 (PD-L1) | |
| US20220127356A1 (en) | Trem2 antibodies and uses thereof | |
| US20220153863A1 (en) | Prame binding molecules and uses thereof | |
| US20230279078A1 (en) | Sars-cov-2 proteins, anti-sars-cov-2 antibodies, and methods of using the same | |
| CA3092414A1 (en) | Progastrin as a biomarker for immunotherapy | |
| EA045594B1 (ru) | Антитела к b7-h4 и способы их применения | |
| EP3814376A1 (en) | Transthyretin antibodies and uses thereof | |
| US20240218078A1 (en) | Anti-GM2AP ANTIBODY AND APPLICATIONS THEREOF | |
| TW202302635A (zh) | Ｉｌ－３８專一性抗體 | |
| US20230374149A1 (en) | Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof | |
| KR20230026956A (ko) | 항 gm2ap 항체 및 이의 응용 | |
| CN114907478A (zh) | 结合lag-3的抗体及其用途 | |
| TW202423980A (zh) | Ｂ７－ｈ４抗體及其使用方法 |