KR101605421B1 - B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 상기 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종 진단용 조성물, 상기 단일클론항체를 이용한 B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공 방법, ⅰ) 상기 항체, ⅱ) 막통과 도메인 및 ⅲ) 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질, 상기 CAR 단백질을 발현하는 재조합벡터, 상기 재조합텍터로 형질전환된 CAR-변형된 T 세포, 상기 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 단일클론항체 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)에 관한 것이다.

Description

B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도 {A monoclonal antibody which specifically recognizes B cell lymphoma and use thereof}
본 발명은 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 상기 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종 진단용 조성물, 상기 단일클론항체를 이용한 B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공 방법, ⅰ) 상기 항체, ⅱ) 막통과 도메인 및 ⅲ) 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질, 상기 CAR 단백질을 발현하는 재조합벡터, 상기 재조합텍터로 형질전환된 CAR-변형된 T 세포, 상기 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 단일클론항체 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)에 관한 것이다.
B 세포 림프종은 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL) 및 비-호지킨 림프종(Non-hodgkin lymphoma, NHL)으로 구성된다. NHL은 성인에게서 가장 많이 발생하는 혈액 암으로, 2008년 미국에서만 6만 6천명 이상 발생하였고 매년 4%씩 새로 발병하고 있다. 또한, 다른 일부 암종의 발생은 감소하고 있지만, 림프종의 발생은 꾸준히 증가하고 있음이 보고되고 있다.
B 세포로부터 발생하는 대부분의 림프종/백혈병(lymphoma/leukemia)들은 세포 표면에 CD19 및 CD20을 발현하기 때문에, 이를 바탕으로 CD20을 인식하는 단일클론항체가 B 세포 림프종/백혈병의 치료를 위한 치료제로 개발되었다. 항-CD20 단일클론항체들은 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxity, CDC), 항체-의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), 및 아폽토시스 유도와 같은 다양한 기전을 통해 암을 제거한다. 1997년 B 세포 NHL을 치료용으로 미국 FDA 승인을 받은 항-CD20 단일클론항체(리툭시맵; rituximab)는 이후 CHOP(cyclophosphamide plus doxorubicin, vincristine, prednisone)과 병용하여 투여하는 방식으로 미만성 거대 B 세포 림프종(diffused Large B cell lymphoma, DLBCL) 및 다른 B 세포 림프종/백혈병에 대한 표준 치료 방법으로 사용되어 왔다. 그러나 악성 B 세포(malignant B cell) 및 리툭시맵은 그 반응이 높음에도 불구하고, 완치효과는 10% 미만으로 낮은 편이다. 이러한 현상은 일부 B 세포 림프종/백혈병 세포들이 CD20의 발현을 감소시켜 리툭시맵의 작용을 회피하기 때문이다. 또한 정상 B 세포 역시 CD20을 발현하기 때문에 정상 B 세포 역시 리툭시맵에 의해 제거되는 문제점 역시 발생한다. 따라서 리툭시맵을 투여받은 암환자는 체액성 면역이 제거되어, B형 간염 발생, 바이러스 감염 증가, 다소성 백질뇌증(multifocal leukoencephalopathy)과 같은 부작용이 발생할 가능성이 높아진다. 따라서 B 세포 림프종/백혈병 세포에만 선택적으로 결합하는 차세대 단일클론항체 개발이 요구되어 왔다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, 악성 B 세포만을 선택적으로 인식하는 단일클론항체의 개발을 위해 예의 노력한 결과, B 세포 림프종과 반응하는 하이브리도마 풀을 제작하였고, 이후 유세포분석을 통해 여러 단계의 스크리닝을 거침으로써 정상 B 세포 및 B 세포 림프종이 아닌 암세포는 인식하지 않는, B 세포 림프종만을 선택적으로 인식하여, 항암 활성을 가지는 하이브리도마 및 이로부터 생산되는 항체를 개발하였다. 또한 본 발명자들은 상기 항체가 in vitro 및 in vivo 모두에서 B 세포 림프종에 대한 우수한 항암 활성을 가지며, 상기 항체를 CAR(chimeric antigen receptor)-T 세포 치료제로 이용할 경우, 우수한 항암 활성을 나타냄을 확인하여, 상기 항체를 ADCC 기전을 주요 효력으로 하는 항암 항체 치료제, 방사선동위원소/항암제/톡신 등과 같은 항암물질과 결합된 형태의 항체 치료제 및 scFv를 이용한 CAR-T 세포치료제와 같은 다양한 형태의 항암치료제로 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 B 세포 림프종 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) B 세포 림프종 의심 개체의 분리된 생물학적 시료에, 상기 단일클론항체를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료에서 B 세포 림프종 세포를 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ⅰ) B 세포 림프종에 특이적인 항체, ⅱ) 막통과 도메인 및 ⅲ) 상기 항체에 항원이 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CAR 단백질을 발현하는 재조합벡터로 형질전환된 CAR-변형된 T 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체 및 약물이 결합된, 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 그 예로, 다클론항체, 단일클론항체, 전장 항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라항체, 인간화 항체, 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전장는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전장 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
생쥐 단일클론항체는 치료 목적으로 인체에 반복적으로 주사할 경우, 인체 내에서 면역반응이 생겨 치료제로서 사용하기에 어려운 부분이 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 치료용 항체로서 유용하게 이용하기 위해서는, 키메라항체, 나아가 인간화 항체의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "키메라항체"는 생쥐 항체의 가변영역 및 인간 항체의 불변영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다. 다만, 단순히 CDR 그래프팅만을 할 경우, 인간화 항체의 친화도가 떨어지게 되므로, CDR의 3차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각되는 몇 개의 중요한 FR 아미노산 잔기를 생쥐 항체의 것으로 친화시킴으로써 원래 생쥐 항체의 친화도와 같은 수준으로 올릴 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체"는 B 세포 림프종 세포을 특이적으로 인식하는 항체로서, 본 발명의 목적상 정상 B 세포가 아닌, B 세포 림프종 세포의 세포막에 위치한 약 41kDa 가량의 분자량을 가진 단백질을 특이적으로 인지하는 단일클론항체를 말한다.
상기 단일클론항체는 바람직하게는, 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 항-MVR (malignancy variant receptor) 항체로 명명하였다.
여기서, 상기 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같이 전장 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있으며, 생쥐 단일클론항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 등 어느 형태도 가능하다.
또한, 상기 단일클론항체가 중쇄 불변 영역을 포함하는 경우, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택된 중쇄 불변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간 IgG1의 불변 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단일클론항체는 B 세포 림프종에 특이적으로 존재하는 단백질을 인지하여, B 세포 림프종에 특이적으로 작용하므로, 이를 B 세포 림프종의 진단 및 치료용 항체로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "B 세포 림프종"은 B 세포 기원의 악성 림프종을 의미한다. 상기 림프종은 호지킨 림프종(hodgkin's lymphoma) 및 비호지킨 림프종(non-hodgkin's lymphoma)을 포함한다. 또한, 상기 B 세포 림프종은, 미만성 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 점막연관 림프조직성 림프종(mucosa-associated lymphatic tissue lymphoma, MALT), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL), 버킷 림프종(burkitt lymphoma), 종격동 거대B 세포 림프종(mediastinal large B cell lymphoma), 발데스트롬 마크로글로불린혈증(waldenstrom macroglobulinemia), 림프절외변연 B 세포 림프종(nodal marginal zone B cell lymphoma, NMZL), 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma, SMZL), 혈관 내의 큰 B 세포 림프종(intravascular large B-cell lymphoma), 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma), 림프종양육아종증( lymphomatoid granulomatosis), 또는 AIDS-연관성 림프종(AIDS-related lymphoma)을 포함하나, B 세포 기원의 림프종이라면, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 기원의 B 세포 림프종 세포를 반복적으로 면역주사한 Balb/c 생쥐로부터 비장세포를 분리하여, SP2/0 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 풀을 제작하였으며, 여러 차례의 선별 과정을 통하여 상기 하이브리도마 풀로부터 B 세포 림프종에만 특이적으로 반응하며 높은 반응성을 나타내는 항-MVR 하이브리도마를 선별하였다(실험예 1). 또한, 상기 하이브리도마에서 생산하는 항체인 항-MVR 단일클론항체가 B 세포 림프종 세포주뿐만 아니라, B 세포 림프종/백혈병 임상 암환자의 암세포에도 특이적으로 결합함을 확인하였다(실험예 3). 또한, 상기 항-MVR 단일클론항체의 가변영역을 인간 IgG1의 불변영역과 결합시킨 키메릭 항-MVR 전체 항체(chiMVR mAb)를 제작하였고, 상기 항체가 B 세포 림프종 세포에서 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 나타냄을 확인하였다(실험예 4 및 5). 또한, 면역 결핍된 RAG2-/-c-/- 생쥐에 LCL 암세포를 등쪽 피하에 주사한 다음, 상기 항-MVR 항체를 복강 투여하여 림프절 전이를 확인한 결과, 상기 항체가 LCL 세포의 림프절 전이를 억제하며, 암세포에 선택적으로 결합하는 것을 확인하였다(실험예 6). 이와 같은 결과는 본 발명의 단일클론항체가 B 세포 림프종에 특이적으로 결합하여, B 세포 림프종의 진단 및 치료를 할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 생쥐 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 B 세포 림프종에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 단일클론항체는 다른 림프종, 정상 세포에는 작용하지 않고, B 세포 림프종을 특이적으로 인지하여 정상 세포 및 다른 종류의 암세포에 대한 영향을 최소화하면서 B 세포 림프종에 대해서는 항암 활성을 나타내므로, 이를 포함하는 상기 약학적 조성물은 B 세포 림프종의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 B 세포 림프종의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 B 세포 림프종의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 항-MVR 단일클론항체가 B 세포 림프종에 특이적으로 결합하며, B 세포 림프종에 작용하여 항암 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 1 내지 5).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 B 세포 림프종 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 치료 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체, B 세포 림프종 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 치료하는 방법은 단일클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 B 세포 림프종이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 B 세포 림프종을 치료하는 방법은 바람직하게는 단일클론항체를 포함하는 조성물을 B 세포 림프종에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종을 치료하는 방법일 수 있다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한 없이 포함된다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) B 세포 림프종 의심 개체의 분리된 생물학적 시료에, 상기 단일클론항체를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료에서 B 세포 림프종 세포를 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 B 세포 림프종에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체를 B 세포 림프종이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시켜, B 세포 림프종 세포의 존재 여부를 통하여 B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다. 상기 B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체는 정상 세포 또는 조직과는 반응하지 않으므로, 상기 단일클론항체에 결합한 B 세포 림프종 세포의 수, 또는 항원의 결합 정도를 조사하여 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 그 양을 비교하여 B 세포 림프종을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 시료이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 B 세포 림프종의 존재 여부를 확인할 수 있다.
이때, 상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는, B 세포 림프종 진단용 조성물을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 B 세포 림프종에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 단일클론항체는 B 세포 림프종을 특이적으로 인지하므로, 이를 이용하여 분리된 생물학적 시료에서 B 세포 림프종이 포함되어 있는지를 검출하여, B 세포 림프종을 진단하는 데 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ⅰ) 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체; ⅱ) 막통과 도메인 및 ⅲ) 상기 항체에 항원이 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 단백질을 제공한다.
본 발명에서, 상기 CAR 단백질은 본 발명의 단일클론항체와, 공지의 막통과 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인으로 구성됨으로써 특정될 수 있다. 구체적으로 상기 CAR 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 54로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에서는, 암의 면역 치료에 효과적으로 사용할 수 있는 CD8+T세포를 빠른 시간 내에 대량생산할 수 있는, CAR-변형된 T 세포를 고안하였다. 구체적으로, B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 항-MVR 항체를 포함하는 세포 외 도메인, 막투과성 도메인 및 상기 항체에 항원이 결합하면 T 세포 증식 신호 전달을 가져오는 세포 내 도메인을 포함하는 CAR 단백질을 개발하였고, 상기 CAR 단백질을 포함하는 T 세포가 B 세포 림프종의 치료에 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "CAR(chimeric antigen receptor)"는, 면역 효과기 세포에 특정 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 자연적으로 존재하지 않는 수용체를 의미한다. 보통, 상기 CAR은 T 세포에 단일클론항체의 특이성을 이식하기 위하여 사용되는 수용체를 말한다. CAR은 대개 세포 외 도메인(Ectodomain), 막투과성 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 도메인(Ectodomain)으로 구성된다.
상기 세포 외 도메인은 항원 결합 부위(antigen recognition region)를 포함하며, 본 발명에서 상기 항원 결합 부위는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, B 세포 림프종에 특이적인 항체이다. CAR에 사용되는 항체는 항체 단편의 형태인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 Fab 또는 scFv 형태이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, CAR의 막통과 도메인은 세포 외 도메인과 연결된 형태로서, 자연적 또는 합성된 것에서 유래한 것일 수 있다. 자연적으로 존재하는 것에 유래한 경우, 막 결합 또는 막투과성 단백질에서 유래한 것일 수 있으며, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154 또는 CD8 등 다양한 단백질의 막 투과성 영역에서 유래한 부분일 수 있다. 이러한 막통과 도메인의 서열은 막투과성 단백질의 막투과성 영역 부분을 공지하고 있는 당업계에 공지된 문헌 등으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 막통과 도메인이 합성된 것일 경우, 이는 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기를 주로 포함할 수 있으며, 그 예로 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)이 합성된 막통과 도메인에 존재할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 막통과 도메인에 대한 서열정보는 합성된 막통과 도메인에 대한 당업계에 공지된 문헌으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 CD8-힌지 부위를 막통과 도메인으로 사용하였다.
본 발명의 CAR에서 상기 세포 내 도메인은 세포 내에 존재하는 CAR의 도메인 일부로서, 막통과 도메인과 연결된 형태이다. 본 발명의 상기 세포 내 도메인은 CAR의 항원 결합 부위에 항원이 결합하면 T 세포 활성화, 바람직하게는 T 세포 증식을 가져오는 것이 특징인, 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
상기 세포 내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포 내 신호전달 도메인이 사용될 수 으며, 그 예로 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프(tyrosine-based activation motif) 또는 ITAM일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3 제타(ξ, zeta), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 CAR의 세포 내 도메인은 세포 내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인(costimultatory domain)을 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공동자극 도메인은, 본 발명의 CAR에 포함되어 세포 내 신호전달 도메인에 의한 신호에 더하여, T 세포에 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, CAR의 세포 내 부분을 의미한다.
상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 림프구의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 그 예로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
또한, 선택적으로, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 CAR의 세포 내 도메인 및 막투과성 도메인을 연결할 수 있으며, 상기 링커는 본 발명의 CAR에 포함되어도, 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 링커라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않으며, 그 예로, (GLY4SER)3 링커로 불리우는, GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 52)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소루신 I
루신 L 라이신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명의 일 실시예에서는, 항-MVR 항체의 VH및 VL 부분을 (GLY4SER)3 링커로 연결하여 MVR scFv를 제작한 후, CD8-힌지를 막통과 영역으로, 4-1BB 세포 내 도메인 및 CD3ξ 체인의 세포 내 도메인을 순차적으로 연결된 CAR 단백질을 제작하였으며, 이를 MVR-CAR로 명명하였다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 상기 MVR-CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 렌티바이러스 벡터에 넣어, 렌티바이러스를 이용하여 CD8+ T세포에 도입할 수 있도록 구성하였다(실험예 7).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 CAR에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 벡터는 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전달하는데 사용할 수 있는 물질을 의미한다. 당업계에 공지된 다양한 벡터들이 본 발명의 범위에 포함되며, 그 예로 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물이 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 자율 복제 플라스미드(autonomously replicating plasmid) 또는 바이러스를 포함하며, 또한, 상기 벡터는 세포 내로 핵산을 전달할 수 있는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대 리포좀 등도 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 레트로바이러스 벡터인 재조합 렌티바이러스 벡터를 이용하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CAR-변형된 T 세포를 제공한다.
상기 CAR 단백질, 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "T 세포"는 흉선에서 유래하는 림프구로서, 세포의 면역에 주된 역할을 하는 림프구를 의미한다. 상기 T 세포는 CD4+ T세포(도움 T 세포, TH 세포), CD8+ T세포(세포독성 T 세포, CTL), 기억 T 세포, 조절 T 세포(Treg 세포) 자연살해 T 세포 등 있으며, 본 발명에서 CAR이 도입되는 T 세포는 바람직하게는 CD8+ T세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "CAR-변형된 T 세포"는 CAR을 발현하는 T 세포를 의미한다. 상기 CAR-변형된 T 세포는 ⅰ) HLA(human leukocyte antigen)에 비의존적인 방식으로 암 항원을 인지하므로, 세포 표면에 HLA 발현을 감소시켜 항암제의 작용을 회피하는 암들을 치료할 수 있는 이점을 지니며, ⅱ) HLA 타입과 무관하므로, 환자의 HLA 타입과 관계없이 치료에 이용할 수 있으며, ⅲ) 짧은 시간 내에 많은 양의 암 특이적 T 세포를 만들어 낼 수 있으므로, 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있는 이점을 지닌다.
본 발명에서 상기 CAR-변형된 T 세포는 B 세포 림프종에 특이적으로 존재하는 CD74 변이체에 대한 CAR를 포함하는 T 세포이다. 본 발명의 CAR의 세포 외 도메인에 위치한 항체는, B 세포 림프종을 특이적으로 인지하고, 정상 세포 또는 다른 세포에 대해서는 거의 반응성을 나타내지 않으므로, 본 발명의 CAR을 발현하는 T 세포는 B 세포 림프종에 선택적인 암 세포 제거능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 MVR-CAR을 발현하는 CD8+ T세포를 제작하였으며, 상기 T 세포가 항-MVR 양성인 B 세포 림프종에 특이적으로 작용하여 항암 활성을 나타냄을 확인하였다(도 12).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CAR-변형된 T 세포를 포함하는, B 세포 림프종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CAR-변형된 T 세포, B 세포 림프종, 예방 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 CAR-변형된 T 세포는 단독으로 B 세포 림프종의 치료에 사용될 수 있으나, 희석제 또는 다른 성분들과 함께 약학적 조성물의 형태로 사용될 수도 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 CAR-변형된 T 세포 군집과 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 접합한 담체, 희석제, 또는/및 부형제를 함께 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수 또는 기타 다른 완충액을 포함할 수 있으며, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스, 만니톨 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 단백질, 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, EDTA 또는 글루타치온과 같은 킬레이트제, 보조제 또는/및 첨가제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 상기 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 세포 선택 전달(Adoptive cell transfer)을 위하여, 정맥 내 투여에 적합한 조성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CAR-변형된 T 세포를 B 세포 림프종 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 치료 방법을 제공한다.
상기 CAR-변형된 T 세포, B 세포 림프종 및 치료 방법에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
특히, CAR-변형된 T 세포를 이용한 본 발명의 B 세포 림프종의 치료 방법은, CAR-변형된 T 세포 자체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 B 세포 림프종 의심 개체 또는 B 세포 림프종으로 진단된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 이때 투여는 세포 선택 전달을 위하여, 정맥 내 투여로 치료하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 T 세포를 포함하는, 분리된 생물학적 시료에 상기 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, CAR-변형된 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
상기 B 세포 림프종, T 세포, CAR 단백질 및 CAR-변형된 T 세포에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"는 개체에서 분리한 세포, 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 시료로서, T 세포를 포함하고 있는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 B 세포 림프종 의심 또는 진단된 개체에서 분리한 T 세포를 포함하고 있는 시료로서, B 세포 림프종 의심 또는 진단된 개체에서 분리한 T 세포에 상기 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 바이러스 등을 통하여 도입시킴으로써, CAR-변형된 T 세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 MVR-CAR 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 이용하여, MVR-CAR을 발현하는 CD8+ T세포를 제조하였다(실험예 7).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체 및 약물이 결합된, 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)"는 본 발명의 단일클론항체와 약물이 연결된 접합체를 의미하며, 면역접합체로도 불릴 수 있다. 상기 항체-약물 접합체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약물"은 본 발명의 항체에 결합하여 치료 항체 자체의 효율을 증가시키거나, 항체의 혈중 내의 반감기를 증가시킬 수 있거나, 항체가 표적으로 하는 위치에 도달하여, 상기 표적 내의 암 등을 사멸시켜서 질병의 치료에 사용할 수 있는 물질을 제한없이 포함하며, 그 예로 세포독성약물, 독소, 항생제, 핵산분해효소와 같은 효소 및 방사선 핵종 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포독성약물은 질병의 치료에 사용할 수 있는 약물을 의미하며, 바람직하게는 항암 활성을 지닌 약물로서, 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제 또는 DNA 인터컬레이터(DNA intercalators)가 있다. 상기 세포 독성 약물은 메이탄시노이드(maytansinoid), 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), 트리코테센(trichothecene), CC-1065 약물(NSC 298223), 칼리케아미신(calicheamicin), 에네딘(enediynes), 탁산(taxane), 안트라시클린(anthracycline), 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 빈데신(vindesine), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 카르미노마이신(carminomycin), 아미노프테린(aminopterin), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 에스페라미신(esperamicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 멜팔란(melphalan), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[nitrogen mustar(mechlorethamine HCL)], 시스-백금 및 그 동족체, 시스플라틴(cisplatin), CPT-11, 독소루비신(doxorubicin), 도세탁셀(docetaxel)을 포함한다.
본 발명에서 용어, "독소(toxin)"는 생물체가 만들어내는 독성을 가지는 약물을 의미하며, 그 종류는 특별히 제한되지 않으나, 식물독소, 동물독소, 균체외 독소 또는 세균 독소 등이 있다.
또한, 상기 방사선 핵종은 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 단일클론항체는 B 세포 림프종만을 특이적으로 인지하여 항암 활성을 나타내므로, 이를 항암 항체 치료제, 항체-약물 결합체 및 CAR T 세포 치료제 등의 다양한 형태로 B 세포 림프종의 치료에 이용할 수 있다.
도 1은, B 세포 림프종의 세포 표면 단백질을 인식하는 하이브리도마의 제작 과정을 요약한 도이다.
도 2는, B 세포 림프종과 특이적으로 반응하는 하이브리도마의 선별 과정을 나타낸 도이다. (A) 다양한 종류의 암세포를 항-MVR, IRC97, IRC120, IRC278 하이브리도마의 배양 상층액으로 30분간 1차 염색한 후, 항-생쥐 IgG-FITC 항체로 세포표면 염색하여 유세포 분석한 결과이다. (B) 6 종류의 B 세포 림프종 세포를 대상으로 항-MVR, IRC97, IRC120, IRC278 하이브리도마의 배양 상층액으로 30분간 1차 염색한 후, 항-생쥐 IgG-FITC로 B 림프종 세포를 염색하여 유세포 분석한 결과이다. (C) 두 사람의 건강한 자원자의 혈액으로부터 분리한 말초혈액세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMC)를 대상으로 항-MVR-FITC 항체와 항-CD4, -CD8, -CD19, -CD14-PE로 각각 염색하여 유세포 분석한 결과이다.
도 3은, 항-MVR 항체와 결합하는 막 단백질의 동정 과정을 나타낸 도이다. (A-B) 항-MVR 단일클론항체가 인식하는 세포 표면 단백질을 동정하기 위하여 단백질A/G-아가로오스 레진에 항-MVR 항체를 교차 연결한 후 빈 컬럼에 충진하였으며, LCL 또는 1A2 B 세포 림포종 세포를 이용하여 준비한 세포 용해물을 컬럼에 통과시켜 항-MVR 항체에 이에 대한 항원 단백질이 결합하도록 하였다. 컬럼을 3회 세척한 후, 100mM 글리신(pH 3.0) 용액을 이용하여 항-MVR 항체와 결합한 단백질을 추출하였다. 분리된 단백질은 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리한 후, 실버 염색하여 분리된 단백질이 육안으로 보이도록 하였다. 실버 염색에 의해 나타난 단백질 밴드를 오려 Q-TOF 분석하여 분리된 단백질을 동정하였다. (B) 앞의 과정을 통해 항-MVR과 결합하는 것으로 나타난 단백질을 12% SDS-PAGE 상에서 분리한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨 항-CD74 단클론항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. (C) 항-MVR 단일클론항체와 높은 반응성을 나타내는 LCL B 세포 림포종 세포에 CD74 siRNA를 농도별로 트랜스펙션한 후, 항-MVR 항체에 대한 반응성을 유세포 분석하였다. (D) CD74 siRNA가 트랜스펙션된 LCLs 세포를 항-CD74 단일항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석하였다. (E-F) HeLa-CⅡTA 세포에 GFP-CD74 p35, -CD74 p41, -CD74 p43을 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션하고 36시간 배양하였다. GPF를 발현하는 세포들을 형광현미경을 사용하여 확인하였다(E). GFP의 발현을 확인한 후, 각각의 세포를 대상으로 항-CD74 mAb MB741 또는 항-MVR 항체로 1차 염색하였으며, 이후 항-생쥐 IgG-PE로 염색하여 유세포분석하였다(F).
도 4는, 임상 암환자의 B 세포 림프종/백혈병 세포에 대한 항-MVR 단일클론항체의 반응성을 확인한 도이다. (A) ALL 또는 CLL 환자의 혈액 또는 골수로부터 면역세포를 분리한 후, anti-CD19-PE 항체로 세포 표면 염색하였으며, 이후 항-MVR-FITC 항체로 세포 내 또는 세포 표면 염색을 수행하여 유세포 분석하였다. (B) 4명의 서로 다른 DLBCL 암 환자의 암 조직을 대상으로 항-MVR 단일클론항체를 이용하여 면역화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 항-MVR 항체의 경쇄 및 중쇄를 PCR 증폭한 결과를 나타낸 도이다. 항-MVR 하이브리도마로부터 전체 RNA를 분리한 후, Superscript Ⅱ(Invitrogen)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로 사용하고, 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭된 DNA는 1.5% 아가로오스 겔에서 분리하였다.
도 6은, 본 발명의 항-MVR 항체의 서열을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은, 키메릭 항-MVR 항체를 발현하기 위한 DNA 작제물의 구성을 나타낸 도이다.
도 8은, 키메릭 항-MVR 항체를 이용한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 293 세포에 pdCMV-dhfr-chiMVR 유전자를 도입한 후, 이틀간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. ChiMVR 항체를 포함한 배양 상층액 또는 항-MVR 항체로 LCL 세포를 염색한 후, 항-생쥐 IgG 또는 항-인간 IgG-FITC로 이차 염색하여 유세포 분석을 수행하였다.
도 9는, ChiMVR 항체를 이용한 in vitro ADCC 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, LCL 세포를 chiMVR 또는 인간 IgG로 30분간 염색한 후, 51Cr으로 1시간 동안 표지하였다. 인간 NK 세포는 혈액으로부터 분리한 PBMC에 10ng/㎖ 항-CD3 mAb 및 500 IU/㎖ 인간 재조합 IL-2를 처리하여 14일간 배양한 후, CD56-마이크로비드를 이용하여 분리하였다. 준비된 NK 세포와 LCL 세포를 그림에 표시된 비율로 섞어 4시간 동안 배양한 후, 배지 내로 방출된 51Cr의 양을 측정하여 ADCC를 측정하였다.
도 10은, 암세포 성장에 대한 ChiMVR 항체의 in vitro 및 in vivo 효과를 나타낸 도이다.
도 11은, 본 발명의 CAR인 MVR-BBξ에 대한 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 12는, 본 발명의 CAR인 MVR-BBξ에 의해 변형된 T 세포의 항암 활성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항체 및 시약
항-CD74 단일클론항체 MB741, 항-HLA-DR-FITC, 항-CD19-FITC, 항-CD3 단일클론항체, 항-생쥐 IgG-FITC & PE는 BD 파미젠 사(BD Phamingen)에서, 항-CD74 단일클론항체 By2는 산타크루즈 사(Santa cruz)에서, 알렉사 플루오로(alexa Fluor) 546 항-생쥐 IgG는 인비트로젠 사(Invitrogen)에서 구입하였다.
또한, 재조합 인간 IL-2는 펩프로테크(Peprotech)에서 구입하였다. RAG2-/-c-/- 생쥐는 CIEA(Central Institute for Experimental Animals, japan)에서 제공받았다. Hela-CⅡTA(class Ⅱ transactivator) 세포주는 Dr. Philippe Pierre(Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Marseille, France)로부터 분양받았다.
실시예 2: 세포주(Cell line)
L3055 세포는 IMDM(Iscoves modified Dulbeccos medium, Irvine Science, Santa Ana, CA)에 10% FBS, 3mM 글루타민, 100U/㎖ 페니실린 G, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 만든 배지로 배양하였다. THP-1, 293, PC3, Jurkat, CCRF-CEM, A431, 1A2, JVM2, BC-1 세포주는 ATCC 세포주 은행(Manassas, VA)에서 구입하였으며, SNU638, SNU20, SNU538 세포주는 KCLB(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받았다. EBV-transformed lymphoblastoid 세포(LCL)는 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)에 EBV B95-8 세포주를 감염시킨 후, 1㎍/㎖ CsA가 주어진 상태로 10% FBS와 항생제를 첨가한 RPMI1640 배지(WellGene, Korea)에 배양하여 제작하였다.
실시예 3: B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체의 제작
Balb/c 생쥐에 L3055 세포주를 2X107 개로 2주일마다 총 2번 복강 주사하였으며, 두번째 주사로부터 3주가 지난 뒤에 1X107 개의 동일한 세포를 정맥 주사하였다. 마지막 면역주사로부터 4일째 되는 날 생쥐의 비장세포를 분리하고 SP2/0 골수종 세포 및 PEG를 이용하여 융합하였다. 이 융합된 세포들을 96-웰 플레이트에 5X105 세포수/웰의 농도로 분주한 후, 히포크산틴(H), 아미노프테린(A), 티미딘(T)을 포함하는 HAT 선별 배지를 첨가하여 배양하였다.
실시예 4: B 세포 림프종에 특이적인 하이브리도마의 분리
B 세포 림프종에 특이적인 하이브리도마 클론을 선별하기 위해서, 1 내지 10개의 하이브리도마 콜로니가 포함되어 있는 각 웰의 배양 상층액을 수거하여 L3055 세포의 세포 표면 염색을 위하여 사용하였다. 그 다음, 유세포 분석에서 반응성이 나타난 양성 웰(positive well)의 하이브리도마들을 다시 96 웰 플레이트에 2 세포수/웰의 농도로 분주하여 단일 세포 클로닝(single cell cloning)을 수행하였다. 배양 14일째에 하나의 하이브리도마 콜로니를 포함하는 웰의 배양상층액을 수거하여 L3055 세포의 세포 표면 염색을 위한 1차 항체로 사용하여 유세포 분석을 수행하였다.
실시예 5: 항- MVR 단일클론항체에 의해 인지되는 단백질의 동정
항-MVR 단일클론항체가 인식하는 단백질을 분리하기 위해, 1㎖의 단백질 A/G 레진(Santa Cruz)을 충진한 컬럼에, 10mg의 항-MVR 항체를 통과시켜 결합시킨 후, 디숙시이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)를 이용하여 교차연결(cross-link)하였으며, PBS로 여러번 세척하여 항-MVR 단일클론항체가 교차연결된 레진(항-MVR mAb-cross-linked resin)이 충진된 컬럼을 준비하였다. LCL 또는 1A2 세포(2X108 세포)를 Triton X-100이 1% 포함된 TBS(Tris-buffered saline, 50mM pH 7.5 Tris, 150mM NaCl)에 현탁시키고 글라스 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리를 통해 세포 찌꺼기를 제거한 후, 상층액만을 회수하여 세포 용해물을 준비하였으며, 준비된 친화성 컬럼에 반복적으로 통과시켰다. 그 다음, TBS로 세 번 세척한 후, 100mM 글리신 용액(pH 3.0)을 이용하여 결합된 단백질을 분리하였다. 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid) 침전법을 사용하여 분리된 단백질을 농축한 후, 분리된 단백질을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 실버 SNAP 키트(Pierce)를 사용하여 겔 상의 분리된 단백질을 실버 염색(silver staining)하였으며, 육안으로 확인된 단백질 밴드를 절단하여 Q-TOF(ESI-MS/MS)를 수행하였다.
실시예 6: 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
각 샘플은 5X SDS 샘플 완충액으로 희석하여 SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼다. CD74 단백질은 항-CD74 단일클론항체(By-2 클론) 및 이차 항체-HRP를 사용하여 검출한 후, ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) 키트를 사용하여 발색하였다.
실시예 7: siRNA(Short interference RNA) 트랜스펙션
Liu YH et al (J Immunol 2008;181:6584-94.)에 보고된 바에 따라, CD74의 siRNA(5'-GCAACAUGACAGAGGACCATGTGAC-3', 서열번호 17)를 합성하였다.
0.4cm의 큐벳(cuvette)에 4X106 세포수/㎖ 농도의 LCL 세포를 0.5㎖ 넣고 10, 100, 500pM의 CD74 siRNA를 첨가한 후, 250볼트 및 950μF 조건에서 GenePulser XcellTM(Bio-Rad)을 이용하여 전기천공법(electroporation)을 수행하였다. 그 다음, 6 웰 플레이트에서 36시간 배양 후 유세포 분석 및 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하였다.
실시예 8: 재조합 CD74 이소폼의 발현
GFP-fused CD74 이소폼을 제조하기 위해서, p33, p41, p43의 CD74 이소폼들의 각 PCR 생산물을 pAcGFP1-C3 벡터(Clontech, CA)의 Xho I/EcoR I 사이트에 넣었다.
CD74 이소폼 중 p35와 p43은 정방향 프라이머로서, 5'-CTCGAGATGCACAGGAGAAGCAGGA-3'(서열번호 18)을 사용하였으며, p41은 5'-CTCGAGATGGATGACCAGCGCGACC-3'(서열번호 19)를 사용하였다. 역방향 프라이머는 세 경우 모두 5'-GAATTCTCACATGGGGACTGGGCC-3'(서열번호 20)을 사용하여 증폭시켰다.
이와 같은 방법으로 제작이 완료된 pAcGFP-p33, -p41, -p43는 LipofectaminTM 2000(Invitrogen)을 이용하여 HeLa-CⅡTA 세포에 도입하였다. 그 후, 각 세포를 36시간 배양한 후, GFP 발현을 형광현미경으로 확인하였다.
실시예 9: 환자의 malignant B cell 과 항- MVR 단일클론항체 간의 결합
본 발명에 사용된 모든 혈액 및 조직 시료는 IRB 승인 후 제공받았으며, 실험은 국립암센터 연구실에서 수행하였다.
구체적으로, 15㎖ 코니컬 튜브에 5㎖의 피콜(Ficoll)을 채운 후, 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL) 또는 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL) 환자의 혈액을 피콜 용액 상층에 올려 840xg/20분의 조건으로 원심분리하였다. 그 다음, 피콜 용액과 혈장 용액 사이에 위치하는 단핵구 세포를 수거하여 세척하였다. 또한, 세포 표면 염색을 수행하기 위해, 분리된 세포들에 인간 AB 세럼을 첨가하였으며, PE-접합된 항-CD19 단일클론항체(PE-conjugated anti-CD19 mAb) 단독, PE-항 CD19 + FITC-접합된 항-MVR 단일클론항체, PE-항 CD19 + 항-CD74 MB741 단일클론항체를 각각 처리하였다. 세포 내 염색을 위해서는 분리된 세포에 인간 AB 세럼을 첨가하여 PE-접합된 항-CD19 단일클론항체로 세포 표면 염색을 수행한 후, Cytofix/Cytoperm 용액을 사용하여 CD19가 염색된 세포를 고정 및 투과화(fix/permeabilize)하였다. 이후, FITC-접합된 항-MVR 단일클론항체 또는 항-CD74 단일클론항체 MB741를 각각 세포 내 염색하였다.
이와는 별도로, Catholic Research Tissue Specimen Bank(Seoul, Korea)로부터 제공받은 미만성 거대 B 세포 림프종(diffused large B-cell lymphoma, DLBCL) 환자의 동결조직 절편(frozen tissue section)을 Cytofix/Cytoperm 용액으로 고정시키고, 항-MVR 단일클론항체로 2시간 동안 염색하였다. 염색된 조직을 세척한 후, 항-생쥐 IgG-HRP로 이차 염색하였다. 그리고 3'-다이미노벤지딘(3'-diaminobenzidine) 처리하여 발색시켰으며, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counterstaining)하였다. 모든 시료는 영구적인 마운팅 용액(permanent mounting solution)으로 고정한 뒤 커버슬립으로 덮고 형광현미경으로 사진을 찍었다.
실험예 1: B 세포 림프종 특이적인 항- MVR 하이브리도마의 선별
Balb/c 생쥐에 살아있는 인간 기원의 B 세포 림프종 L3055 세포를 반복하여 2주 간격으로 면역주사하였으며, 3차 면역주사 후 4일째에 생쥐의 비장세포를 분리하여 SP2/0 골수종 세포와 융합하였다. 융합된 세포들은 96 웰 배양 플레이트에 1x106 세포수/웰의 농도로 분주하였으며, 1X HAT이 포함된 상태로 배양하였다. 배양 14일째에 각 웰의 상층액을 1차 항체로 사용하여 L3055 세포를 대상으로 유세포분석을 수행하였다. L3055 세포에 높은 반응성을 나타내는 웰들을 선별하였으며, 약 1-10개의 하이브라도마 콜로니들을 포함하고 있는 것으로 선별된 웰의 세포들을 다시 96 웰 컬쳐 플레이트에 분주하는 방식으로 단일 클로닝(single cloning)을 수행하였다. 14일 후 단일 콜로니(single colony)를 포함한 웰들을 선별한 후, 각 웰의 배양상층액을 1차 항체로 사용하여 L3055 세포에 대한 반응성을 유세포분석하여, L3055 세포의 표면 단백질을 인식하는 단일클론항체를 생산하는 30여개의 하이브리도마들을 선별하였다(도 1).
또한, 도 1의 과정을 통해 선별된 L3055 세포 표면 단백질을 인식하는 하이브리도마들 중, B 세포 림프종에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마들을 선별하기 위해, THP-1, 293, SNU638, PC3, Jurkat, CCRF-CEM, A431와 같은 B 세포 림프종이 아닌 다양한 종류의 암세포에 대해 1차 선별된 하이브리도마들의 반응성을 조사하였다.
그 결과, 약 30여 개의 하이브리도마 중 4 종류의 하이브리도마(항-MVR, IRC97, IRC120 및 IRC278 하이브리도마) 만이 이들 암세포에 대한 반응성이 없는 것으로 나타났다(도 2A).
이에, 2차 선별된 4 종류의 하이브리도마들이 6 종류의 서로 다른 B 세포 림프종 세포주에 대해서도 높은 반응성을 나타내는지 3차 조사하였다.
그 결과, 4 종류의 하이브리도마 중에서 항-MVR 하이브리도마는 6종류의 B 세포 림프종 중 1A2, JVM2, SNU538, LCL과 가장 높은 반응성을 나타내는 것으로 나타났으며, BC1과 SNU20 세포에 대해서는 낮은 반응성을 나타내는 결과를 보였다(도 2B). 특히, 유세포 분석 결과, 항-MVR 하이브리도마는 여러 종류의 B 세포 림프종 세포와는 강력한 반응성을 나타내지만, 정상적인 CD19+ B 세포를 포함한 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 CD14+ 단핵구와는 반응하지 않을 뿐만 아니라, 그 외의 어떤 림프구(lymphocyte)와도 반응하지 않는 결과를 나타내었다(도 2C).
상기와 같은 결과들은 항-MVR 단일클론항체가 B 세포 림프종에만 존재하는 막 단백질을 인식한다는 것을 시사하는 결과이다.
실험예 2: 항- MVR 단일클론항체의 결합 항원 확인
상기 실험예 1의 결과를 기초로, 항-MVR 단일클론항체가 인식하는 막 단백질을 동정하기 위해, 항-MVR mAb-교차연결 친화성 정제 컬럼을 준비하였다. 그 다음, LCL과 1A2로부터 세포 용해물(cell lysate)을 만들어 준비된 친화성 정제 컬럼에 이를 반복하여 통과시켰다. 그 다음, 컬럼으로부터 분리된 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리한 후, 실버 염색하였다.
그 결과, LCL 세포로부터는 두 개의 단백질을, 1A2 세포로부터는 한 개의 단백질을 분리할 수 있었다(도 3A). 분리된 단백질을 젤로부터 오려 Q-TOF 분석한 결과, ~30 kDa 단백질은 HLA 클래스 조직 적합성 항원(HLA class histocompatibility antigen)으로 동정되었으며, ~40 kDa 단백질은 CD74 항원(invariant chain)으로 동정되었다(도 3A).
인간 CD74 단백질은 타입 Ⅱ 막 단백질로서, p33, p35, p41, p43의 이소폼이 존재한다(Henne C et al., Immunology 1995;84:177-82). 따라서, 항-MVR 항체에 의해 분리된 ~40 kDa 단백질은 p41 또는 p43 CD74로 추정하였다. 이를 확인하기 위해 항-MVR 단일클론항체에 의해 친화성 정제한 단백질을 대상으로 항-인간 CD74 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 항-MVR 단일클론항체에 의해 분리된 단백질은 항-인간 CD74 항체에 의해 인식되는 것으로 나타났으며, 그 크기는 41 KDa인 것으로 판정하였다(도 3B).
또한, 항-MVR 단일클론항체에 의해 인식되는 단백질이 CD74인지를 추가 확인하기 위해, 항-MVR 항체에 대해 높은 반응성을 나타내는 LCL 세포주에 CD74 siRNA를 트렌스펙션하였다.
그 결과, CD74 siRNA의 양이 증가할수록 항-MVR 항체에 의해 염색되지 않는 세포가 점차 증가하는 결과를 나타내었으며(도 3C), 항-CD74 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에서도 CD74 이소폼들의 발현이 CD74 siRNA의 양이 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다(도 3D).
항-MVR 단일클론항체가 p41 CD74를 인식하는지 직접적으로 확인하기 위해 Hela-CⅡTA 세포주에 p33, p41, p43 CD74 이소폼들을 과발현시켰다.
그 결과, GFP 형광단백질과 융합시킨 각각의 CD74 이소폼들은 세포 내 발현이 서로 조금씩 다른 것으로 나타났다(도 3E). 또한, 항-CD74 항체는 과발현된 CD74 이소폼들을 모두 인식하는 것으로 나타났지만, 본 발명의 항-MVR 단일클론항체는 과발현된 CD74 이소폼들을 인식하지 못하는 것으로 나타났다(도 3F).
상기와 같은 결과들로부터, 본 발명의 항-MVR 항체는 아직 알려지지 않은 CD74 변이체(CD74v)를 인지하고 있는 것으로 추정하였다.
실험예 3: B 세포 림프종/백혈병 임상암환자의 암세포에 대한 항- MVR 단일클론항체의 반응성 확인
상기 실험예를 통하여, 본 발명의 항-MVR 단일클론항체가 여러 종류의 B 세포 림프종 세포주에 대해 높은 반응성을 나타낸다는 것을 증명하였지만, 실제 임상 암환자의 B 세포림프종/백혈병 세포에 대해서도 높은 반응성을 나타낼지는 불확실하였다. 따라서 임상 B 세포 림프종/백혈병 세포에 대한 항-MVR 단일클론항체의 특이성을 조사하였다.
B 세포 백혈병의 경우, 하나의 골수와 두 개의 혈액을 확보할 수 있었으며, B 세포 림프종의 경우 4명의 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 환자의 동결된 조직을 준비할 수 있었다. 또한, B 세포 백혈병인 ALL 환자의 골수와 혈액; 및 CLL 환자의 혈액으로부터 림프구를 분리하였고, 항-CD19-PE 항체로 세포 표면을 염색한 후, 항-CD74-FITC(MB741) 또는 항-MVR-FITC로 각각 세포 내 또는 세포 표면을 염색하였다. 이때, 세포 표면 염색을 통해 세포 표면에 발현되는 단백질의 수준을, 세포 내 염색(intracellular staining)을 통해 B 세포 백혈병 세포의 CD74v 및 CD74의 전체 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 세포 표면 염색과 세포 내 염색으로 확인한 결과, 항-MVR 항체에 의해 인식되는 CD74v는 세포 표면 및 세포 내에 유사한 수준으로 높은 발현율을 나타낸 반면, CD74의 경우 발현율은 높지만, 세포 표면에는 일부만 존재하는 결과를 나타내었다(도 4A). 또한, ALL 환자의 골수 림프구의 CD74v 및 CD74의 세포 표면 발현 수준을 유세포 분석한 결과, CD74v 및 CD74의 발현이 유사한 수준으로 골수의 B 세포 백혈병 세포에서 발현되는 것으로 조사되었다(도 4A). CLL 환자의 혈액 림프구를 대상으로 CD74v 및 CD74의 세포 표면 발현을 조사한 결과에서도 항-MVR 단일클론항체에 의해 인식되는 CD74v는 높은 수준으로 세포 표면에 발현되는 반면, CD74의 발현 수준은 낮은 것으로 확인되었다(도 4A).
항-MVR 단일클론항체는 변성된 단백질을 인지하지 못하기 때문에 파라핀 조직을 대상으로 염색하지 못한다. 따라서 4명의 다른 DLBCL 환자로부터 동결 조직을 준비하여 5㎛ 두께로 자른 후 항-MVR 단일클론항체로 염색하였으며, 항-생쥐 IgG-HRP로 이차 염색하여 발색시킴으로써 항-MVR 항체와의 결합여부를 확인하였다.
그 결과, 조직염색이화학 검사를 한 대부분의 DLBCL 환자의 암세포들에서 CD74v이 발현되고 있는 결과를 나타내었다(도 4B).
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 항-MVR 단일클론항체가 임상 B 세포 림프종/백혈병 암세포를 인식할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
실험예 4: 항- MVR 단일클론항체의 중쇄 및 경쇄의 염기 및 아미노산 서열 동정
항-MVR 하이브리도마 1×106 세포로부터 트라이졸(TRIZOL)을 이용하여 전체 RNA를 분리한 후, 단일가닥 cDNA를 superscript Ⅲ(Invitrogen) 키트를 사용하여 제작하였다. 항-MVR 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 증폭하기 위해 하기 표 1 및 2에 기술된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행하였다.
Primer sequences to amplify the variable region of light chain (Y:CT; R:AG; W:AT; M:AC; S:GC; H:ACT).
Forward primers for variable region of light chain(5'->3') 서열번호
MVK1 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAYATCCAGATGACACARWC 21
MVK2 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAAWTGTGCTCACCCAGTC 22
MVK3 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATTGTGCTRACMCAGTC 23
MVK4 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATTGTGATGTCACAGTC 24
MVK5 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGATATTGTGCTAACTCAGTC 25
MVK6 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATCYGGATGACTCAGTC 26
MVK7 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCAACATTGTRMTGACCCAATC 27
MVK8 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATYCAGATGACHCAGTC 28
MVK9 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAACAACTGTGACCCAGTC 29
MVK10 GCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATTGTGCTSACCCAATC 30
Backward primer(5'->3')
MCK GTTGTTCAAGAAGCACACGACTGA 31
Primer sequences to amplify the variable region of heavy chain (Y:CT; R:AG; W:AT; M:AC; S:GC; K:TG; H:ACT; B:AGT; V:ACG)
Forward primers for variable region of heavy chain(5'->3') 서열번호
MVH1 ATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTC 32
MVH2 ATGGCCGAGGTBCAGCTBCAGCAGTC 33
MVH3 ATGGCCGAGGTGCAGCTGAAGSASTC 34
MVH4 ATGGCCGAGGTCCARCTGCAACARTC 35
MVH5 ATGGCCGAGGTYCAGCTBCAGCARTC 36
MVH6 ATGGCCGAGGTYCARCTGCAGCAGTC 37
MVH7 ATGGCCGAGGTCCACGTGAAGCAGTC 38
MVH8 ATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC 39
MVH9 ATGGCCGAGGTGAWGYTGGTGGAGTC 40
MVH10 ATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC 41
MVH11 ATGGCCGAGGTGCAMCTGGTGGAGTC 42
MVH12 ATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTC 43
MVH13 ATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTC 44
MVH14 ATGGCCGAGGTRAAGCTTCTCGAGTC 45
MVH15 ATGGCCGAGGTGAARSTTGAGGAGTC 46
MVH16 ATGGCCGAGGTTACTCTRAAAGWGTSTG 47
MVH17 ATGGCCGAGGTCCAACTVCAGCARCC 48
MVH18 ATGGCCGAGGTGAACTTGGAAGTGTC 49
MVH19 ATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTC 50
Backward primer(5'->3')
MVC AGGACAGCCGGGAAGGTGTGCAC 51
각각의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물을 아가로오스 겔에서 분리한 결과, 경쇄의 가변영역의 경우 MVK1, 3, 4, 7 및 10 프라이머에 의해 유전자가 증폭되었으며, 중쇄의 가변영역의 경우, MVH 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12 및 15 프라이머에 의해 유전자가 증폭되는 결과를 나타내었다(도 5).
이에 대한 서열을 동정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 상기 항-MVR 항체의 중쇄 가변영역 아미노산 서열을 서열번호 1, 중쇄 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호 2, 중쇄 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호 3, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호 4, 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 서열번호 5, 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호 6, 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 서열번호 7 및 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타내었다(도 6).
또한, 클로닝한 항-MVR 중쇄 가변영역(항-MVR VH) 및 경쇄 가변영역(항-MVR VL)이 항-MVR 항체인지 최종 확인하기 위해, 도 7에 모식도로 나타낸 것처럼 항-MVR VH는 인간 IgG1 아이소타입(isotype) 불변 영역인 CH1, CH2, CH3와 결합시켰으며, 항-MVR VL은 인간 Igκc의 CL1과 결합시켜 pdCMV-dhfr 벡터에 클로닝하였다. 이렇게 제작된 키메릭 항-MVR 전체 형태 항체(chiMVR)를 발현시키기 위한 작제물을 제작하였다.
제작된 DNA 작제물을 HEK 293 세포주에 트랙스펙션하여 이틀간 배양한 후, 배양 상층액을 1차 항체로 사용하여 LCL 세포를 세포 표면 염색하였다. EBV-LCL(Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines)은 항-MVR 항체가 인식하는 CD74v 단백질을 과발현하는 대표적인 암 세포주이다. 따라서 HEK 293 세포에서 발현된 chiMVR과 항-MVR 항체로 EBV-LCL 세포를 염색한 후, 염색 패턴을 유세포 분석하였다. Parental 항-MVR 항체는 생쥐 IgG 형태이므로, 항-생쥐 IgG-FITC를 사용하여 염색하였으며, chiMVR 항체는 인간 IgG 형태이므로 항-인간 IgG-FITC를 사용하여 염색하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 것처럼, 항-MVR 항체 및 chiMVR 항체는 동일한 패턴으로 EBV-LCL에 결합하였으며, 따라서 클로닝된 VH 및 VL는 항-MVR 항체의 VH 및 VL인 것으로 판정하였다.
실험예 5: ChiMVR 단일클론항체의 B 세포 림프종에 대한 in vitro 항암 효과 확인
ChiMVR 단일클론항체는 인간 IgG1 Fc 부위를 가지고 있으므로, 인간 NK(natural killer) 세포에 의한 항체-의존성 세포 독성(ADCC)를 측정할 수 있다. 따라서, 단일 공여자로부터 혈액을 채혈하여 EBV로 형질전환한 B 세포림프종인 LCL을 제작하였으며, 동시에 같은 공여자의 혈액으로부터 분리한 인간 NK 세포를 배양하여 in vitro ADCC를 수행하기 위한 효과기 세포(effector cell) 및 표적 세포를 준비하였다. 그 다음, ChiMVR 항체로 염색된 LCL과 염색하지 않은 LCL을 준비한 후, 51Cr으로 1시간 동안 LCL 세포를 표지하였다. 효과기 세포인 NK 세포와 표적 세포인 LCL을 10:1, 1:1, 1:10, 1:100 비율로 섞은 후, 4시간 동안 배양하여 51Cr의 방출량을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, chiMVR 항체로 표지된 EBV-LCL 세포들은 인간 IgG로 표지된 세포에 비해 NK 세포에 의한 세포 용해가 높게 유도되는 결과를 나타내었다.
상기와 같은 결과는 chiMVR 항체가 LCL 세포에 부착할 경우, NK 세포에 세포 용해를 증가시켜, 항암 효과를 가져올 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 6: ChiMVR 단일클론항체의 B 세포 림프종에 대한 in vivo 항암 효과
항-MVR 항체에 높은 반응성을 나타내는 1A2 및 LCL B 세포 림프종 세포를 96 웰 컬쳐 플레이트에 분주한 후, 항-MVR 항체 또는 생쥐 IgG를 대조군으로 첨가한 후 세포를 5일간 배양하였다. 구체적으로, 1×104 세포수/웰로 96 웰 플레이트에 분주한 후, 5㎍/㎖의 항-MVR 항체 또는 mouse IgG를 처리하여 배양하였다.
살아있는 세포 수를 4% 트립판 블루 용액을 이용하여 매일 5일 간 측정한 결과, 항-MVR 항체를 첨가하여도 1A2 또는 LCL의 증식에는 전혀 차이가 없는 결과를 나타내었으며(도 10A), 따라서 항-MVR 항체는 B 세포 림프종 세포의 증식에는 직접적인 영향이 없는 것으로 판정하였다.
또한, 면역이 결핍된 RAG2-/-c-/- 생쥐의 등쪽 피하에 LCL 세포를 주사할 경우, LCL 세포는 주사된 자리에서 일시적으로 증식하지만, 약 4주 정도 후에는 주사된 위치에서는 암 조직이 사라지고, 가까운 림프절인 서혜부 림프절(inguinal lymph node) 또는 액와 림프절(axillary lymph node)로 전이되어 증식한다. 따라서 암세포 주사 8주 후, 서혜부 또는 액와 림프절을 분리하여 OCT 컴파운드에 넣어 냉동한 후 절편을 제작하였다. 그 다음, 준비된 동결 조직 섹션(frozen tissue section)을 항-MVR 항체 및 항-생쥐 IgG-HRP 항체로 염색하였으며, DAB 기질로 발색하였다.
그 결과, 림프절을 구성하고 있는 대부분의 세포들이 항-MVR 항체 양성인 상태로 전이된 LCL 세포가 증식하여 림프절이 커진 것임을 확인하였다. 이러한 현상은 등쪽 피하에 주사된 LCL 암세포가 일시적으로 증식하는 과정에서 일부 암세포가 림프절로 전이하여 증식하기 때문인 것으로 판단되었다(도 10B).
또한, LCL 암세포를 면역이 결핍된 RAG2-/-γc-/- 생쥐의 등쪽 피하로 주사하였으며, 암세포 주사 후 1주일째부터 항-MVR 단일클론항체를 5일 간격으로 매일 복강 주사하였다. 암세포 주사 후 8주째 서혜부 림프절(inguinal lymph node) 또는 액와 림프절(axillary lymph node)을 분리하여 무게를 측정함으로서 암세포의 성장을 측정하였다.
그 결과, LCL 암세포를 면역이 결핍된 RAG2-/-c-/- 생쥐의 등쪽 피하에 주사한 후, 1주일째부터 5일 간격으로 항-MVR 항체를 복강 투여할 경우, 림프절이 커지는 현상이 억제되는 것으로 나타났다(도 10C). 이러한 현상은 항-MVR 항체가 LCL 세포에 결합할 경우, LCL 세포의 림프절 전이가 억제될 수 있다는 것을 의미하는 것이다.
또한, LCL 세포를 면역이 결핍된 RAG2-/-γc-/- 생쥐의 등쪽 피하로 주사하였으며, 7주 후, 131I-labeled 항-MVR 항체를 정맥주사하였다. 항체 투여 후 1일째 및 6일째 각 생쥐를 핀홀 콜리메이터(pinhole collimator)가 장착된 ADAC argus 감마 카메라로 촬영하여, 항체가 암조직에 선택적으로 결합하는지 확인하였다.
그 결과, 항-MVR 항체는 갑상선 및 간에 비특이적으로 축적되는 것으로 나타났지만, 암세포에 선택적으로 결합하여 최소 6일간 결합을 유지하고 있는 것으로 조사되었다(도 10D).
실험예 7: MVR - CAR CD8 T 세포의 B 세포 림프종에 대한 항암 효과 확인
항원 특이적 CD8+ T 세포는 암의 면역치료에 가장 효과적인 면역 세포로 평가되고 있다. 그러나 암의 면역치료에 사용할 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하기 위해서는 복잡한 과정과 오랜 기간이 필요하다. 이에, 항원 특이적 CD8+ T 세포를 빠른 시간 내에 대량 생산하기 위한 방법 중 하나로 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)-변형된 T 세포가 고안되었다(Porter DL et al., N Engl J Med. 2011;365:725-33.). CAR은, 특정 항원을 인식하는 항체의 scFv를 T 세포 활성화를 가져오는 신호전달 도메인, 바람직하게는 공동자극분자 및 CD3ξ의 신호전달도메인과 결합시킨 형태의 단백질로, CAR를 구성하는 항체 부분이 특정 항원을 인식할 경우, 강력한 T 세포 증식 신호전달을 유도하여 CD8 T 세포를 선택적으로 증식시키는 원리를 가지고 있다(도 11).
따라서 본 발명에서는 항-MVR 항체의 VH 및 LH 부분을 (GLY4SER)3 링커로 연결하여 항-MVR scFv를 제작한 후, CD8-힌지를 막통과 영역으로, 4-1BB 세포 내 도메인(cytoplasmic domain) 및 CD3ξ 체인의 세포 내 도메인을 순차적으로 연결하여 MVR-CAR를 구성하였다 (서열번호 53)(도 11 참조). 구체적으로 CD8α leader sequence (서열번호 55), anti-MVR VL & GlySer linker & anti-MVR VH (서열번호 56), CD8α (spanning from hinge region to transmembrane region) (서열번호 57), 4-1BB signaling domain (서열번호 58), 및 TCRζ signaling domain (서열번호 59)로 구성된다. MVR-CAR는 렌티바이러스 벡터인 pELPS에 넣어 렌티바이러스를 이용하여 MVR-CAR 유전자를 CD8 T 세포에 도입할 수 있도록 구성하였으며, 이 벡터를 pELPS-IRC5-BBξ로 명명하였다.
상기에서 제작한 pELPS-IRC5-BBξ DNA를 293 세포에 도입한 후, 5일간 배양하여 MVR-CAR 렌티바이러스를 생산하였다. Lenti-X◎Concentrator(Clontech)을 이용하여 배양 상층액 내 렌티바이러스를 농축하여, T 세포에 MVR-CAR 유전자를 도입하기 위한 준비를 하였다.
또한, 정상 지원자의 혈액으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리한 후, CD8-마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD8+ T 세포만을 분리하였으며, 분리된 CD8+ T 세포에 항-CD3 mAb 및 항-CD28이 코팅된 다이날-비드(Dynal-bead)를 첨가하여 이틀간 배양하였다. 배양 이틀째 농축된 MVR-CAR/렌티바이러스를 농도별로 첨가하여 5일간 배양하였으며, 경쇄의 LH 부위을 인식하는 것으로 알려진 단백질 L을 이용하여 CD8+ T 세포의 MVR-CAR 발현 수준을 측정하였다.
유세포분석 결과, 첨가된 MVR-CAR/렌티바이러스의 양이 증가할수록 단백질 L에 대한 반응성이 증가하는 것으로 나타났으며(도 12A), 따라서 제작된 MVR-CAR가 CD8+ T 세포에서 성공적으로 발현하는 것으로 판단하였다.
상기 MVR-CAR를 발현하는 CD8 T 세포의 선택적 암세포 제거 능력을 평가하기 위하여 MVR-양성 및 MVR-음성 암세포인 BC-1 세포 및 LCL를 준비한 후, 각각 다른 농도의 CFSE로 염색하여 두 세포를 구분할 수 있도록 하였다. 이들 세포를 1:1 비율로 혼합한 후, MVR-CAR/렌티바이러스로 감염시킨 CD8 T 세포와 1:1 비율로 4시간 또는 18시간 배양하여 유세포 분석하였다. CFSEhigh MVR-positive LCL 세포의 선택적 감소비율을 측정하여 lysis %를 계산하였다.
그 결과, 대조군 T 세포는 MVR-positive LCL의 비율을 감소시키지 않는 반면, 본 발명의 MVR-CAR CD8 T 세포는 MVR-positive LCL의 비율을 선택적으로 감소시키는 결과를 나타내었다(도 12B).
상기와 같은 결과는 MVR-CAR를 과발현시킨 CD8 T 세포가 MVR-positive LCL 만을 선택적으로 인식하여 제거한다는 것을 의미하는 것으로, 이를 B 세포 림프종의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 시사하는 결과이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> A monoclonal antibody which specifically recognizes B cell lymphoma and use thereof <130> NP14-1063 <160> 59 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of anti-MVR heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of anti-MVR heavy chain <400> 2 Arg Tyr Ser Val His 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of anti-MVR heavy chain <400> 3 Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of anti-MVR heavy chain <400> 4 Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 15 Trp <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of anti-MVR light chain <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of anti-MVR light chain <400> 6 Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of anti-MVR light chain <400> 7 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of anti-MVR light chain <400> 8 Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of anti-MVR heavy chain <400> 9 caggtgcagc tgaaagagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat 180 tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaatgagggg 300 gatactacgg ctgggacctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 gcg 363 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of anti-MVR heavy chain <400> 10 agatatagtg tacac 15 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of anti-MVR heavy chain <400> 11 atgatatggg gtggtggaag cacagactat aattcagctc tcaaatcc 48 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of anti-MVR heavy chain <400> 12 tgtgccagaa atgaggggga tactacggct gggacctggt ttgcttactg g 51 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of anti-MVR light chain <400> 13 gacattcaga tgacccaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctccattcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggagatcaa a 321 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of anti-MVR light chain <400> 14 aaggcaagtg accacattaa taattggtta gcc 33 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of anti-MVR light chain <400> 15 ggtgcaacca gtttggaaac t 21 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of anti-MVR light chain <400> 16 caacagtatt ggagtactcc attcacg 27 <210> 17 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for CD74 <400> 17 gcaacaugac agaggaccat gtgac 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD74 p35 and p43 <400> 18 ctcgagatgc acaggagaag cagga 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CD74 p41 <400> 19 ctcgagatgg atgaccagcg cgacc 25 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CD74 p35, p43 and p41 <400> 20 gaattctcac atggggactg ggcc 24 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK1 <400> 21 gctaccgtag cacaggcagc cgayatccag atgacacarw c 41 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK2 <400> 22 gctaccgtag cacaggcagc cgaaawtgtg ctcacccagt c 41 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK3 <400> 23 gctaccgtag cacaggcagc cgacattgtg ctracmcagt c 41 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK4 <400> 24 gctaccgtag cacaggcagc cgacattgtg atgtcacagt c 41 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK5 <400> 25 gctaccgtag cacaggcagc cgatattgtg ctaactcagt c 41 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK6 <400> 26 gctaccgtag cacaggcagc cgacatcygg atgactcagt c 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK7 <400> 27 gctaccgtag cacaggcagc caacattgtr mtgacccaat c 41 <210> 28 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK8 <400> 28 gctaccgtag cacaggcagc cgacatycag atgachcagt c 41 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK9 <400> 29 gctaccgtag cacaggcagc cgaaacaact gtgacccagt c 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVK10 <400> 30 gctaccgtag cacaggcagc cgacattgtg ctsacccaat c 41 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCK <400> 31 gttgttcaag aagcacacga ctga 24 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH1 <400> 32 atggccgagg trmagcttca ggagtc 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH2 <400> 33 atggccgagg tbcagctbca gcagtc 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH3 <400> 34 atggccgagg tgcagctgaa gsastc 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH4 <400> 35 atggccgagg tccarctgca acartc 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH5 <400> 36 atggccgagg tycagctbca gcartc 26 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH6 <400> 37 atggccgagg tycarctgca gcagtc 26 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH7 <400> 38 atggccgagg tccacgtgaa gcagtc 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH8 <400> 39 atggccgagg tgaasstggt ggaatc 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH9 <400> 40 atggccgagg tgawgytggt ggagtc 26 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH10 <400> 41 atggccgagg tgcagskggt ggagtc 26 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH11 <400> 42 atggccgagg tgcamctggt ggagtc 26 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH12 <400> 43 atggccgagg tgaagctgat ggartc 26 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH13 <400> 44 atggccgagg tgcarcttgt tgagtc 26 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH14 <400> 45 atggccgagg traagcttct cgagtc 26 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH15 <400> 46 atggccgagg tgaarsttga ggagtc 26 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH16 <400> 47 atggccgagg ttactctraa agwgtstg 28 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH17 <400> 48 atggccgagg tccaactvca gcarcc 26 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH18 <400> 49 atggccgagg tgaacttgga agtgtc 26 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVH19 <400> 50 atggccgagg tgaaggtcat cgagtc 26 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVC <400> 51 aggacagccg ggaaggtgtg cac 23 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (GLY4SER)3 linker <400> 52 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR protein <400> 53 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu 20 25 30 Ser Val Ser Leu Gly Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp 35 40 45 His Ile Asn Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile 85 90 95 Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Trp Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 130 135 140 Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser 165 170 175 Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 195 200 205 Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 210 215 220 Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 225 230 235 240 Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 54 <211> 1467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR protein <400> 54 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacattc agatgaccca atcttcatcc tacttgtctg tatctctagg aggcagagtc 120 accattactt gcaaggcaag tgaccacatt aataattggt tagcctggta tcagcagaaa 180 ccaggaaatg ctcctaggct cttaatatct ggtgcaacca gtttggaaac tggggttcct 240 tcaagattca gtggcagtgg atctggaaag gattacactc tcagcattac cagtcttcag 300 actgaagatg ttgctactta ttactgtcaa cagtattgga gtactccatt cacgttcggc 360 tcggggacaa agttggagat caaaggcgga ggcggatctg gcggcggagg aagtggcgga 420 gggggatctc aggtgcagct gaaagagtca ggacctggcc tggtggcacc ctcacagagc 480 ctgtccatca catgcactgt ctctgggttc tcattatcca gatatagtgt acactgggtt 540 cgccagcctc caggaaaggg tctggagtgg ctgggaatga tatggggtgg tggaagcaca 600 gactataatt cagctctcaa atccagactg agcatcagca aggacaactc caagagccaa 660 gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatgtacta ctgtgccaga 720 aatgaggggg atactacggc tgggacctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 780 actgtctctg cgagcaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840 gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900 cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960 tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1020 ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080 ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140 agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200 aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260 atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440 cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1467 <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha leader sequence <400> 55 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 56 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti MVR VL and GlySer linker and anti MVR VH <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu 115 120 125 Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys 130 135 140 Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly 165 170 175 Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser 180 185 190 Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln 195 200 205 Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr 210 215 220 Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 57 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha spanning from hinge region to transmembrane region <400> 57 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 58 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB signaling domain <400> 58 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR zeta signaling domain <400> 59 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110

Claims (20)

  1. 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, B 세포 림프종에 특이적인 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 전장 항체(full-length antibody) 또는 항체 단편의 형태인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 단편은 scFv(single chain variable fragment), dsFv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택된 중쇄 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  6. 제1항의 단일클론항체를 포함하는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항의 단일클론항체를 포함하는, B 세포 림프종(B cell lymphoma) 진단용 조성물.
  8. (a) B 세포 림프종 의심 개체의 분리된 생물학적 시료에, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 시료에서 B 세포 림프종 세포를 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 림프종의 진단을 위한 정보의 제공방법.
  9. ⅰ) 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체;
    ⅱ) 막통과 도메인(transmembrane domain) 및
    ⅲ) 상기 항체에 항원이 결합하면 T 세포 활성화를 가져오는 것이 특징인 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signlaing domain)을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체는 항체 단편의 형태인 것을 특징으로 하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab 또는 scFv인 것을 특징으로 하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  12. 제9항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 제타(ξ, zeta) 신호전달 도메인인 것을 특징으로 하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인(costimultatory domain)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공동자극 분자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질.
  15. 제9항의 CAR(chimeric antigen receptor) 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 벡터는 도 11에 도시된 개열지도를 갖는 pELPS-IRC5-BBξ인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  17. 제15항의 재조합 벡터로 형질전환된 CAR(chimeric antigen receptor)-변형된 T 세포.
  18. 제17항의 CAR(chimeric antigen receptor)-변형된 T 세포를 포함하는, B 세포 림프종(B cell lymphoma)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항의 단일클론항체 및 약물이 결합된 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate).
  20. 제19항에 있어서, 상기 약물은 마이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터컬레이터(DNA intercalators), 독소(toxin) 및 방사선 핵종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
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