FR2912314A1 - Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w. - Google Patents
Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2.
Description
Les rétrovirus endogènes humains (HERVs) constituent 8% du génome humain 5
et sont impliqués à la fois dans des pathologies et dans des phénomènes non pathologiques. La famille des rétrovirus endogènes humains W (HERV-W) est dérivée d'un élément rétroviral infectieux intégré dans la lignée germinale il y a 25 à 40 millions d'années. La protéine d'enveloppe de HERV-W, appelée également syncytine, est une to glycoprotéine fusogène impliquée dans la formation de la couche syncytiotrophoblastique du placenta. Elle est codée par le gène env du locus proviral ERVW1 et synthétisée sous la forme d'un précurseur gPr73 qui est spécifiquement clivé en deux protéines matures, une sous unité de surface gp50 (SU) et une sous unité transmembranaires gp24 (TM). 15 In vitro, la syncytine de la famille HERV-W induit une fusion cellule à cellule dépendante de son interaction avec un récepteur-transporteur d'acides aminés de la famille ASCT (h-ASCT2, hASCT1). Des études phylogéniques ont alors montré que la syncytine est apparentée à un groupe de rétrovirus, comprenant notamment le virus endogène du chat RD114, le virus endogène du singe BaEV, des rétrovirus simiens et 20 des rétrovirus aviaires : virus de la réticuloendothéliose aviaire REV-A et virus de la nécrose de la rate SNV, ayant tous en commun le récepteur-transporteur d'acides aminés neutres sodium dépendant de type 2 ou hASCT2 (Rasko et al, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. 2129û2134; Tailor et al, 1999 JOURNAL OF VIROLOGY, VOL 73(5) May 1999, p. 4470û4474). Ainsi, l'infection de cellules par 25 des virus de ce groupe de rétrovirus conduit à une réduction spécifique du transport des acides aminés (Rasko et al, 1999). L'infection d'une cellule par un de ces rétrovirus (ou l'expression dans la cellule de l'une de ces enveloppes) empêche, par interférence (interaction) vis à vis d'un récepteur de la famille ASCT, l'infection de cette même cellule par un autre de ces rétrovirus ou la fusion avec une autre cellule exprimant une 30 autre enveloppe. Par interférence vis-à-vis d'un récepteur de la famille ASCT, l'infection d'une cellule par un de ces rétrovirus empêche l'infection par un autre de ces rétrovirus. Tous ces rétrovirus appartiennent au même groupe d'interférence du virus HERV-W. Les mécanismes de liaisons entre l'enveloppe et le récepteur ASCT restent 35 obscurs. Cette thématique est pourtant essentielle puisque l'inhibition de l'interaction enveloppe / récepteur ASCT permettrait en outre d'empêcher l'entrée d'un rétrovirus dans la cellule, et donc de bloquer son cycle de réplication, de bloquer le phénomène d'interaction enveloppe / récepteur ASCT et/ou de fusion cellulaire pouvant être impliqué dans la formation de tumeurs, dans la prolifération de cellules métastasiques ou dans des phénomènes de résistance à des médicaments (voir à titre d'illustration la publication Cell fusion : A hidden enemy ?, Cancer Cell : May 2003 Vol.3), de bloquer le phénomène d'interaction enveloppe / récepteur ASCT et/ou de fusion cellulaire pouvant intervenir dans des maladies du système nerveux voire d'inhiber la fusion cellule-cellule impliquée dans la différenciation trophoblastique. ). De plus, l'inhibition de l'interaction enveloppe / récepteur hASCT pourrait empêcher la propagation de tumeur en s'opposant à une immunosuppression locale pouvant découler de l'interaction enveloppe / récepteur hASCT. En effet, il a été montré d'une part que l'infection de cellules par des virus de ce groupe de rétrovirus (notamment ceux induisant des immunodéficiences) conduit à une réduction spécifique du transport des acides aminés (Rasko et al, 1999), et d'autre part il est proposé un lien direct entre l'altération du transport des acides aminés et l'immunosuppression (Espinosa et al., 2000; Rasko et al., 1999). Ainsi, concernant les maladies du système nerveux, il est connu que les récepteurs hASCT sont impliqués dans le transport spécifique d'acides aminés neutres et que les cellules neuronales, pour la transmission des informations, utilisent de manière prépondérante des neuromédiateurs de nature polypeptidique.
Ainsi, la liaison de la protéine Env-HERV-W à des récepteurs devant normalement transporter les acides aminés requis pour la synthèse des neuromédiateurs peut affecter la. capacité des neurones à synthétiser les neuromédiateurs en réduisant l'entrée des agonistes physiologiques que sont les acides aminés via les récepteurs ASCT. Par ailleurs, si des neurones, dont les réseaux inter-cellulaires forment des connexions indispensables à la transmission des informations circulant dans le cerveau et la moelle épinière, forment des syncytia suite à une fusion de plusieurs neurones induite par la protéine Env-HERV-W, tous les réseaux de transmission des informations se trouvent perturbés et connectés au même paquet cellulaire fusionné et de plus l'activité de production des neuromédiateurs de chaque cellule n'est plus individualisée, ni connectée aux voies de conduction amont et aval (dendrites et axones) qui lui sont propres. Il est montré maintenant et de manière surprenante que des anticorps qui ne sont pas dirigés spécifiquement contre le site de liaison entre la protéine d'enveloppe de HERV-W et un récepteur de type hASCT, notamment le récepteur hASCT1 ou hASCT2, sont capables de bloquer l'interaction de la protéine d'enveloppe HERV-W et un récepteur de type hASCT, notamment le récepteur hASCT1 ou hASCT2, et/ou d'inhiber la fusion cellulaire induite par ladite protéine. Aussi, la présente invention a pour objet une composition thérapeutique comprenant à titre de substance active ou de principe actif, de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par composition pharmaceutique, on entend une composition diagnostique, prophylactique ou thérapeutique.
Ladite composition ou ledit anticorps au moins est capable d'inhiber l''interaction de la protéine d'enveloppe avec un récepteur de type hASCT et/ou les propriétés fusogènes de ladite protéine. Selon une variante de l'invention, ledit anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe. Un des anticorps adaptés qui sont dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W est l'anticorps monoclonal MoAb2 (aussi nommé 1F 11 B 10). En combinaison ou en variante, un des anticorps adaptés qui sont dirigés contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W est l'anticorps polyclonal PolAb2 (aussi référencé 71). Compte tenu de leurs propriétés, les anticorps ci-dessus trouvent, selon l'invention, les applications suivantes. Ainsi, font partie de l'invention, les utilisations suivantes : une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies associées à une interaction de l'enveloppe de HERV-W et d'un récepteur hASCT; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée à traiter des pathologies associées à la cascade 30 proinflammatoire induite par l'expression de MSRV/HERV-W; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition pharmaceutique destinée à inhiber la fusion cellulaire induite par la protéine env de HERV-W; une utilisation d'au moins un desdits anticorps pour préparer une composition 35 pharmaceutique destinée à inhiber la liaison entre ladite protéine env et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCT1 ou hASCT2 à la surface des cellules qui exprime ledit récepteur. Les pathologies précitées sont des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques. A titre d'illustration, on peut citer l'article de S. Weis et al., J Neural Transm. 2007 Feb;114(2):261-71, associant une altération de l'expression des récepteurs précités dans la schizophrénie, la psychose raaniacodépressive et des dépressions majeures. Selon des variantes d'utilisation selon l'invention, lorsque l'anticorps est dirigé contre l'extrémité C-terminale de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERVW, il est de préférence l'anticorps monoclonal MoAb2; lorsque l'anticorps est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W, il est de préférence l'anticorps polyclonal PolAb2. Un autre objet de l'invention est un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCT1 ou hASCT2, capable d'inhiber la fusion cellulaire induite par la protéine env de HERV-W et/ou d'inhiber la liaison entre la protéine d'enveloppe de F[ERV ùW et un récepteur de type hASCT, tel que le récepteur hASCT1 ou hASCT2. Un anticorps préférentiel est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W. Il est, susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W, selon des techniques qui appartiennent aux connaissances générales de l'homme du métier. Un tel anticorps peut consister en l'anticorps monoclonal MoAb2. Avantageusement, ledit anticorps est humanisé. Encore un anticorps préférentiel est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W. Un tel anticorps peut consister en l'anticorps polyclonal PolAb2.
Exemple 1: caractérisation moléculaire et phénotypique d'enveloppes recombinantes ; Construction et production de la sous-unité SU d'enveloppe 30 B.ERV-W. A partir du vecteur d'expression phCMV-Env-W (Blond J Virol, Vol 74(7) :3321-3329, 2000) contenant le gène de l'enveloppe HERV-W (538 acides aminés) (clone PH74, Blond et al J Virol Vol 73(2) :1175-1185, 1999), un vecteur phCMVEnv-Gp60 permettant l'expression d'une protéine d'enveloppe recombinante 35 soluble a été conçu. L'enveloppe soluble (Gp60,1-435) a été construite comme décrit ci dessous: (1) le site de clivage natif RNKR (AA 314 à 317) entre les sous-unités SU et "CM a été muté en AAAR, afin de permettre la production d'une protéine de fusion stable et non de deux sous-unités SU-TM clivées puis ré-associées par un pont Bisulfure. (2) Les régions transmembranaire (tm) et intracytoplasmique (CYT) correspondant aux acides aminés 436 à 538 on été supprimées afin d'obtenir une protéine soluble. (3) Un bras espaceur de composition (GGGS)3 suivi d'une queue polyhistidine (RGS-HHHHHH) ont été ajoutés en position C-terminale, afin de permettre la 10 purification de cette protéine par IMAC et la détection par un anticorps monoclonal anti-histidine (Qiagen, RGS H6). A partir du vecteur phCMVEnv-Gp60 exprimant l'enveloppe soluble, le vecteur phCMV-EnvSU a été construit, permettant la production d'une protéine SU. La SU soluble est une protéine de fusion contenant une queue polyhistidine C-terminale de 15 séquence RGS-HHHHHH immédiatement en aval de la séquence AAAR, afin de permettre la purification de cette protéine par IMAC et la détection par un anticorps monoclonal anti-histidine (Qiagen, RGS H6). La structure schématique des différentes protéines produites à partir des vecteurs phCMV-Env-W, phCMV-EnvGp60 et phCMV-EnvSU est illustrée en figure 20 la.
Exemple 2 : Obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine d'enveloppe de HERV-W. Immunisation des souris par ADN. 25 Trois souris BALB/c femelles de six semaines (IFFA-Credo) ont été immunisées par injection directe d'ADN plasmidique nu (phCMV-env-W) contenant le gène de l'enveloppe HERV-W. Les injections ont été réalisées par voie intra-dermique à l'aide d'un pistolet ( gene gun ). Cinq injections de 2 g d'ADN ont d'abord été effectuées pour chaque souris suivies d'un rappel avec deux injections de 4 g d'ADN. 30 Les sérums ont été prélevés et le titre en anticorps pour chaque sérum a été déterminé. Le titre en anticorps étant trop faible, un lysat cellulaire a été préparé. Préparation du lysat cellulaire. Les cellules de rhabdomyosarcome Te1CeB6 (ATCC CRL8805) ont été transfectées par le plasmide phCMV-env-W. Après une vingtaine d'heures et présence 35 de syncytia, un extrait cellulaire a été réalisé en tampon PBS 0,5% Triton. Les extraits protéiques ont été dosés par Bradford. La concentration en antigène env-W correspondait à 9,5 g/ l de protéines totales. Immunisation des souris par extrait de lysat cellulaire. Les mêmes souris ont tout d'abord reçu une injection de 10 g de lysat cellulaire par voie intrapéritonéale suivie d'une injection de rappel de 2 x 100 g de lysat cellulaire par voie intrapéritonéale. Trois jours avant la fusion avec les cellules de rnyélome une nouvelle injection a été effectuée, par voie intra-veineuse, de 22 g de la protéine d'enveloppe soluble Gp60 obtenue à partir du plasmide phCMV-Env-Gp60 comme décrit à l'exemple 1 préalablement purifiée, avant injection, sur résine Ni-NTA (Qiagen) selon les conditions suivantes : fixation en tampon phosphate pH 8, lavages en tampon phosphate pH 8 et en acétate d'ammonium pH 6, élution en tampon d'acétate d'ammonium pH 3,5 et concentration par speed vac. 47 g de la protéine Gp6O eucaryote ainsi obtenue ont été réservés pour l'injection par voie intra-veineuse décrite ci-dessus. Après fusion, les surnageants des hybridomes ont été testés par irnmunofluorescence sur les cellules transfectées et fixées (TelCeb6), les anticorps ont été criblés par un test fonctionnel en ELISA en utilisant la protéine Env-W à une concentration de 9,2 g/ l de protéines totales et une protéine Env AS comme contrôle négatif à une concentration de 13,3 g/ l de protéines totales et les anticorps les plus performants ont été sélectionnés. L'anticorps monoclonal MoAb2 a ainsi été obtenu. C'est un anticorps 20 monoclonal dirigé contre la partie C-terminale de la région SU de la protéine Env-HERV-W.
Exemple 3: étude dans un modèle Animal Al de la formation in vivo de syncytia lors de transfections de cellules susceptibles, par des plasmides codant 25 pour différentes protéines ENV de la famille MSRV/HERV-W et de l'inhibition de la formation de tels syncytia lors d'injection d'anticorps dirigés contre ces protéines ENV MSRV/HERV-W.
3.1 Matériel: 30 - Cellules en boite 100mmm de diamètre à confluence - Kit LipofectAMINE PLUSTM (Gibco Invitrogen) - Milieu DMEM (Gibco Invitrogen 41966-029) avec du sérum Amérique du Sud - Cellules TelCeB6 (ATCC CRL8805-cellules rhabdomyosarcome ) 35 - ADNs : 409 (enveloppe W clonée en sens) 21.rg/ l - 410 (enveloppe W clonée en antisens) 1,5 g 1 30 35 LQMV (enveloppe mutée non fusogène) 1,31ag/ l
3.2 Protocole : 1 er Jour : Mise en culture des Cellules - Inoculation des boite 0 100mm 4 50-70% de confluence pour les TelCeB6 - Incubation en milieu complémenté (6 ml par boite) 24h à 37 C sous 5% CO2 2ème Jour : Transfection - Kit LipofectAMINE PLUSTM a) Précomplexation de l'ADN -Mélange de 750 l de milieu non-complémenté avec les ADNs dans un tube falcon 15m1 (référence 2096) Soit 211 de 409 ou 311 de 410 ou 3 l LQMV Agitation sous Vortex du PLUS Reagent et en ajouter 2011 à la 15 solution d'ADN Agitation sous Vortex immédiatement 10 sec à 1400 tours/minutes -Incubation 15 min à température ambiante b) Préparation des cellules Remplacement par 5ml de milieu non-complémenté 20 c) Dilution de la Lipofectamine - Dans un tube et pour une boite, mélange de 30 pl de LipofectAMINE Reagent avec 75011 de milieu non-complémenté d) Complexation de l'ADN - Mélange des 780 l de Lipofectamine diluée et des 772 11 de 25 solution d'ADN pré-complexé Agitation sous Vortex immédiatement 10 sec à 1400 tours/minutes Incubation 15 min à température ambiante e) Transfection et obtention d'animaux receveurs greffés avec les cellules cibles, traités ou non par injection d'anticorps anti-ENV. Dépose des 1552 l dans une boite - Incubation 2-3 heures à 37 C sous 5% CO2 Remplacement du milieu de transfection par 6m1 de milieu complémenté - Incubation 1h à 37 C sous 5% CO2 Injection par voie intrapéritonéale (IP) aux souris SCID (sous un volume de 1 ml), 1/Sème de chaque boite à 70% de confluence, avec ou sans 25 30 8 2912314 injection supplémentaire d'anticorps anti-protéines ENV MSRV/HERV-W (anticorps :MoAb2, PolAb2, 69 et 71 au 1/100 - Obtention d'animaux tolérant la greffe et permettant la dissémination des cellules greffées dans l'organisme, parallèlement à l'établissement dune 5 pseudo-ascite dans la cavité péritonéale. 3eme Jour : - Prélèvement des cellules de chaque animal par lavage péritonéal: injection d'abord de 2 ml d'air suivie de 2m1 de sérum physiologique puis massage et récupération des 2m1 de liquide péritonéal (protocole original mis au point pour la 10 récupération chez l'animal greffé des cellules implantées dans la cavité péritonéale) - Observation au microscope phase inverse avec comptage des syncytia et/ou après coloration sur lame. - La lecture est immédiate. Elle est effectuée après étalement sur des lames à chambre quadrillée en présence de bleu Trypan (exclusion des cellules mortes). On dénombre le nombre de cellules ayant fusionné entre elles par champ quadrillé avec un objectif grand champ (40) permettant d'établir le comptage sur plus d'une centaine de cellules afin de disposer de séries de comptage statistiquement représentatives. Un aliquot cellulaire de chaque prélèvement est fixé en présence méthanol/acétone (v/v) puis conservé à -20 C jusqu'à coloration au cristal violet (1%).
Ces lames colorées ont fait l'objet de prises photographiques.
3.3 Nombre de souris : Des lots de 2 souris seront inoculés avec : Les cellules transfectées avec les trois types de plasmide (2 codants et un antisens pour contrôle) sans anticorps (3x2=6 souris) Les trois types de cellules transfectées et l'anticorps monoclonal MoAb2 (3x2=6 souris) Les trois types de cellules transfectées et un anticorps polyclonal anti TM PolAb2(3x2=6 souris)
3.4 Résultats : Les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 des résultats sur le modèle animal Al LECTURE ECP (Bleu Trypan*) : Lecture directe (syncytia) (nombre de cellules fusionnées, lecture sur chambre de numération quadrillée pour 100 cellules) Lignées Numération Numération Moyenne Sl* S2* 409cont. 19 22 22 409MoAb2 1 3 2 409PolAb2 9 9 9 410cont. 8 11 9.5 414MoAb2 3 5 4 410polAb2 9 14 11.5 LQMVcont. 8 5 6.5 LQMVMoAb2 4 2 3 LQMVPolAb2 8 4 6 *S1, S2 = Souris 1, Souris 2 Bleu Trypan: exclusion des cellules mortes
Chaque chiffre représente le nombre de cellules visualisées comme fusionnées 25 par champ étudié. Certaines cellules pouvant être superposées dans le trajet optique, le compte des cellules apparaissant fusionnées dans les conditions témoins est donc supérieur à zéro. La réalité des syncytia et la discrimination avec des empilements de cellules a par la suite été vérifié par coloration des cellules sur lame, avec visualisation de multiples noyaux cellulaires inclus dans un espace délimité par la continuité d'une 30 seule et unique membrane cellulaire. Par ailleurs des photos montrant des cellules en cours de fusion permettent d'objectiver la réalité de la fusion dès l'analyse en microscopie en contraste de phase et l'absence totale de phénomène équivalent dans les contrôles. Cependant, pour objectiver statistiquement l'analyse primaire représentée par 35 les chiffres indiqués dans le tableau des résultats du modèle animal Al, nous avons procédé à un test de Chi-2 pour comparer les données relevées dans les conditions où 10 15 20 (i) la protéine ENV est correctement exprimée (409) versus les contrôles où elle ne s'exprime pas (410) ou est mutée de façon à réduire son effet fusogène (LQMV)et (ii) où la protéine est correctement exprimée (409) sans injection d'anticorps anti-ENV versus injection de différents anticorps.
Ainsi, les résultats de l'analyse statistique qui tient compte du bruit de fond de la lecture primaire, sans analyse secondaire après coloration sur lame ou recherche de cellules typiques en cours de fusion (n'étant jamais vues dans les contrôles, sont les suivants.
Validation statistique de la spécificité de l'effet pathogène in vivo : ENV exprimée (409) : 22 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules ENV antisens (410 non exprimée) : 9,5 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules - ENV mutée (LQMV activité supprimée) : 6,5 positifs comptés en moyenne 15 sur 100 cellules - Moyenne des contrôles (410 et LQMV): 9,5+6,5/2= 8% 1) ENV versus contrôle 410 : Chi-2 = 5,89 (p< 0.02) 2) ENV versus contrôle LQMV : Chi-2 = 9,83(p< 0.002) 3) ENV versus tous contrôle (410 et LQMV) : Chi-2 = 7,69 (p< 0.01) 20 4) contrôle 410 versus contrôle LQMV : Chi-2 = 0,61 (Différence Non Significative). Les contrôles sont donc bien statistiquement équivalents et il n'y a pas de différence réelle liée au type de contrôle. Les résultats obtenus dès ce stade de l'analyse (en n'excluant pas le bruit de 25 fond lié aux images artéfactuelles et en comparant entre eux les deux types de contrôles qui s'avèrent équivalents) est statistiquement très significatif (globalement p<0,01). Les analyses ultérieures par coloration de la spécificité des effets ne font donc que confirmer la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV, validant ainsi le modèle animal Al pour la production et l'étude in vivo de syncytia 30 dont la fusion a été induite par ENV HERV-W.
Validation statistique de l'activité thérapeutique des anticorps testés sur l'effet pathogène in vivo : - ENV exprimée (409) + anticorps monoclonal MobAb2 (409MoAb2) : 2 35 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules 11 2912314 - ENV exprimée (409) + anticorps polyclonal 71(409PolAb2) : 9 positifs comptés en moyenne sur 100 cellules 1) ENV seul versus injection anticorps MoAb2 : Chi-2 = 18,94(p< 0.001) 2) ENV seul versus injection anticorps PolAb2 : Chi-2 = 6,45 (p< 0.05) 5 Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement très inférieur à 0,001). (Chi-2 =18,94). Les analyses ultérieures par coloration de la spécificité des effets confirment, ici aussi, la spécificité de l'effet obtenu in vivo en 10 présence de la protéine ENV et d'anticorps, validant ainsi l'effet thérapeutique sur le modèle animal Al.
Exemple 4 : Etude in vivo, dans un modèle animal A2, de la liaison des protéines ENV MSRV/HERV-W aux cellules possédant des récepteurs ASCT de type 1 ou 2 ou n'en possédant pas et de l'inhibition de cette liaison au niveau de la membrane plasmique par injection d'anticorps dirigés contre les protéines ENV MSRV/HERV-W. 4.1 Matériel: Protéine soluble : surnageant filtré sur 0,45 m contenant la protéine soluble 20 (293T tranfectées avec le plasmide 460 (enveloppe-spacer-His6). Expression vérifiée par Western blot avec un anticorps anti- RGS-His Les anticorps : - Anticorps polyclonal de lapin (anti-peptide) anti-SU (69) Anticorps polyclonal de lapin (anti-peptide) anti-TM (71) 25 Les cellules : XChASCT2 Clone cellulaire XC (ATCC CCL-165, cellules de rat) exprimant le récepteur hASCT2 - Milieu DMEM (Gibco Invitrogen 41966-029) avec du sérum Amérique du Sud Pré-incubation, incubation, marquage en tube Eppendorf 1,5m1 30 4. 2 Protocole : a) Inoculation IP des cellules XChASCT1, XChASCT2 et de cellules témoins XC (ASCT-) à des souris SCID Injection aux souris de 1/5eme de flacon à 70% de confluence sous un 35 volume de 2m1. b) Pré-incubation - Incubation du surnageant protéine soluble (surnageant filtré de la lignée 293T) avec les anticorps (2H 1 H8, l F l 1 B 10, 69 et 71) 990 l de surnageant avec l01.11 d'anticorps (dilution au 100 ème) 1 heure à 37 C dans l'incubateur des cellules avec une agitation de temps en temps (toutes les 15 minutes) Inoculation des protéines seules ou avec des anticorps, en IP aux souris greffées avec les cellules (1 106 cellules par point soit 1/5 d'une boite 0l00mm confluente). Après injection des anticorps (200 microlitres) maintien en IP, pendant 6 heures, avec un massage péritonéal de temps en temps (toutes les 30-60 minutes) 1 o c) Récupération des cellules par lavage péritonéal des souris greffées -Centrifugation 3000 tours pendant 5 minutes à +4 C Récupération du culot cellulaire et dilution dans les milieux de marquage (maintien à +4 C jusqu'à fixation) d) Marquage 15 Anticorps primaire : - Culot repris par 1000 d'anticorps anti-RGS His (dilution au 100ème-Qiagen) dans un tampon PBA (PBS avec 2% Sérum de veau foetal et 0,1% azide de sodium), maintenu à +4 C. - 1 heure dans la glace avec une agitation de temps en temps (toutes 20 les 15minutes) - lavage en tampon PBA, (1ml par tube), maintenu à +4 C. Anticorps secondaire : - Centrifugation 3000 tours pendant 5 minutes à +4 C - Culot repris par l00111 d'anticorps anti-souris-FITC (dilution au 25 20e'-DAKO, référence : F0479) dans un tampon PBA), maintenu à +4 C. - 1 heure dans la glace avec une agitation de temps en temps (toutes les 15 minutes) 2 lavages en tampon PBA (1ml par tube), maintenu à +4 C. culot repris par 5000 de PBA), maintenu à +4 C. et analyse par 30 FACS. Alternativement analyse par IF après fixation sur lame en acétone/méthanol (50%/50%) à -20 C et contre-coloration au bleu EVANS.
4.3 Nombre de souris : Des lots de 2 souris seront inoculés avec : Avec chaque type de cellules (exprimant les 2 types de récepteurs ASCT1 et ASCT2 et une n'en exprimant pas pour contrôle) sans anticorps (3x2=6 souris) -Les trois types de cellules avec la protéine ENV et l'anticorps 5 monoclonal en (3x2=6 souris) Les trois types de cellules avec la protéine ENV et un anticorps polyclonal anti TM (3x2=6 souris)
4.4 Résultats : 1 o Les résultats obtenus sont récapitulés dans le tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 des résultats du modèle Animal A2
LECTURE IF (microscope) (nombre de cellules fluorescentes/total dans un même champ, nombre de cellules 15 indiquées dans le tableau) Lignée Nbre cell.fluo/total moyennes Xcont. 1/18, 0/10 = 1/28 XMoAb2 0/10, 0/12, 1/16 = 1/38 XPolAb2 3/25, 2/40 = 5/65 ASCT1cont. 12/40, 3/12.. 9/25 = 24/77 ASCT1MoAb2 1/50, 0/30 = 1/80 ASCT1PolAb2 6/37 = 6/37 ASCT2cont. 8/22, 15/35 = 23/57 ASCT2MoAb2 3/28 = 3/28 ASCT2PolAb2 2/36 = 2/36 30 Chaque chiffre représente le nombre de cellules visualisées comme fluorescentes par champ étudié. Certaines cellules pouvant avoir fixé une fluorescence de manière non spécifique, le compte des cellules apparaissant fluorescentes dans les conditions témoins est donc supérieur à zéro dans un des deux champs compté 35 (rnoyenne des deux champs = 1/28, soit 0,036%, ce qui est tout à fait correct pour le bruit de fond d'une telle technique de lecture). La réalité des cellules ayant fixé de la 20 25 protéine ENV sur leur récepteur ASCT 1 ou 2 a par la suite été vérifiée par analyse cytofluorométrique. Pour objectiver statistiquement l'analyse présentée dans le tableau des résultats du modèle animal A2, un test de Chi-2 a été réalisé pour comparer les données relevées 5 dans les conditions où : (i) la protéine ENV peut se fixer sur un récepteur ASCT1 (ASCTlcont) ou ASCT2 (ASCT2cont) présent à la surface des cellules greffées sur souris SCID versus les cellules contrôles greffées qui n'ont aucun récepteur (Xcont) et, de fait, sur ;lesquelles la protéine ENVinjectée aux animaux correspondants ne peut se fixer et ne 10 donne pas de fluorescence membranaire en présence d'un anticorps anti-ENV. et (ii) où la protéine ENV peut se fixer sur un récepteur ASCT1 (ASCTlcont) ou ASCT2 (ASCT2cont) présent à la surface des cellules greffées sur souris SCID versus injection d'anticorps.
15 Ainsi, les résultats de l'analyse statistique sont les suivants. Validation statistique de la spécificité de l'effet pathogène in vivo : ASCTlcont : 24 positifs comptés en moyenne sur 77 cellules ASCT2cont : 23 positifs comptés en moyenne sur 57 cellules Cellules ASCT Négatives (Xcont): 1 positif compté en moyenne sur 28 20 cellules 1) ENV+greffes ASCT1 versus contrôle ASCT NEGATIVES Xcont : Chi-2 = 8,62(p< 0.01) 2) ENV+greffes ASCT2 versus contrôle ASCT NEGATIVES Xcont : Chi-2 = 12,53(p< 0.001) 25 3) ENV+greffes ASCT1 versus ENV+greffes ASCT2: Chi2 = 1,21 (Différence Non Significative). Les cellules exprimant les récepteurs ASCT1 ou ASCT2 à leur surface sont donc bien statistiquement équivalentes et il n'y a pas de différence de liaison de ENV sur le récepteur liée au sous-type 1 ou 2, dans les conditions de ce modèle animal A2. 30 Les résultats obtenus avec les animaux greffés avec les cellules exprimant les récepteurs membranaires ASCT1 ou ASCT2 sont statistiquement très significatif au regard des résultats obtenus avec les animaux contrôles greffés avec les cellules n'exprimant aucun de ces récepteurs à leur surface. Cependant, bien qu'il ne soit pas 35 mis en évidence de différence statistique entre les modèles ASCT1+ et ASCT2+, la différence du nombre de cellules positives entre le modèle ASCT2 et le contrôle est plus importante pour ASCT2+ (p<0,001). Ces résultats confirment la spécificité de l'effet obtenu in vivo en présence de la :protéine ENV dans les modèles A2/ASCT1+ et A2/ASCT2+. Validation statistique de l'activité thérapeutique des anticorps testés sur ]l'effet pathogène in vivo : Modèle A2/ASCT1+ - ENV+greffes ASCT1: 24 positifs comptés en moyenne sur 77 cellules 10 - ENV+greffes ASCT1 + anticorps monoclonal MobAb2 (MoAb2) : 1 positifs comptés en moyenne sur 80 cellules - ENV+greffes ASCT1 + anticorps polyclonal 71(PolAb2) : 6 positifs comptés en moyenne sur 37 cellules
15 1) ENV+greffes ASCT1 seul versus injection anticorps MoAb2: Chi-2 = 26,23(p< 0.001) 2) ENV+greffes ASCT1 seul versus injection anticorps 3) ENV+greffes ASCT1 seul versus injection anticorps PolAb2 : Chi-2 = 2,88 (Différence Non Significative). 20 Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement très inférieure à 0,001) (Chi-2 =26,23). Ceux obtenus avec l'anticorps polyclonal sont non-significatifs. Les analyses confirment, ici aussi, la spécificité de l'effet obtenu in vivo 25 en présence de la protéine ENV et d'anticorps, validant ainsi l'effet thérapeutique sur le modèle animal A2/ASCT1+ avec des anticorps Monoclonaux. Cependant, à la grande différence du modèle animal Al et ce, ce manière inattendue, seuls des monoclonaux sont efficaces pour inhiber la liaison de la protéine ENV HERV-W injectée à l'animal sous forme de protéine extracellulaire. 30 Modèle A2/ASCT2+ ENV+greffes ASCT2: 23 positifs comptés en moyenne sur 57 cellules - ENV+greffes ASCT2 + anticorps monoclonal (409MoAb2) : 3 positifs comptés en moyenne sur 28 cellules 35 - ENV+greffes ASCT2 + anticorps polyclonal (409PolAb2) : 2 positifs comptés en moyenne sur 36 cellules5 1) ENV+greffes ASCT2 seul versus injection anticorps MoAb2 : Chi-2 = 7,77(p< 0.01) 2) ENV+greffes ASCT2 seul versus injection anticorps PolAb2 : Chi-2 = 13,59 (p< 0.001) Les résultats obtenus montrent un effet statistiquement très significatif pour l'anticorps monoclonal (probabilité de résultat dû au hasard (p) globalement inférieur à 0,01). Ceux obtenus avec l'anticorps polyclonal sont différents des résultats obtenus précédemment avec le modèle animal. greffé avec les cellules ASCT1+: ceux-ci présentant un effet nettement significatif (p<0,001) sur la liaison au récepteur ASCT2. L'effet obtenu in vivo en présence de la protéine ENV et d'anticorps, valide aussi l'effet thérapeutique sur le modèle animal A2/ASCT2+.
Ainsi, en ayant validé les modèles animaux Al et A2 (A2/ASCT1+ et A2/ASCT2+) contre les témoins appropriés, il a été trouvé que des anticorps monoclonaux testés sur ces modèles animaux ont une activité thérapeutique potentielle en inhibant très significativement les effets pathogéniques de la protéine ENV HERVW.
Claims (16)
1. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit anticorps est susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W.
5. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit anticorps est humanisé.
7. Utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2, pour préparer une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques, lesdites pathologies étant associées à une interaction de l'enveloppe de HERV-W et d'un récepteur hASCT.
8. Utilisation d'au moins un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2, pour préparer une composition pharmaceutique destinée à traiter des pathologies du système nerveux ou des pathologies neuropsychiatriques, lesdites pathologies étant associées à la cascade proinflammatoire induite par l'expression de MSRV/HERV-W.
9. Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique est destinée à traiter une pathologie choisie parmi la schizophrénie, la 35 psychose maniacodépressive et les dépressions majeures.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendication 7 à 9, caractérisée ence que l'anticorps est choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que l'anticorps est humanisé.
12. Anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe de HERV-W, à l'exclusion de tout anticorps dirigé spécifiquement contre le site de liaison entre ladite protéine env et le récepteur hASCT1 ou hASCT2, ledit anticorps étantt choisi parmi les anticorps dirigés contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de ladite protéine d'enveloppe et les anticorps dirigés contre la région transmembranaire (TM) de ladite protéine d'enveloppe.
13. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre l'extrémité C-terminale, glycosylée ou non, de la région SU de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
14. Anticorps selon la revendication 13, susceptible d'être obtenu à partir d'un hybridome issu de splénocytes de cellules de souris immunisées par le gène de l'enveloppe HERV-W.
15. Anticorps selon la revendication 12 à 14, caractérisé en ce qu'il est humanisé.
16. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre la région transmembranaire de la protéine d'enveloppe de HERV-W.
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