JPH09506428A

JPH09506428A - 乳癌および婦人科の癌の検出および治療

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Publication number: JPH09506428A
Application number: JP7512119A
Authority: JP
Inventors: エム．ラコウィック−ズルチェンスカー，エバ
Original assignee: エム．ラコウィック−ズルチェンスカー，エバ
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 1997-06-24
Also published as: AU8079394A; US5939277A; WO1995010777A1; CA2178341A1; EP0723664A1; AU701451B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的試料中のHIV-I交差反応性乳癌および婦人科の癌の関連抗原の存在を検出する方法、およびこれらの癌を治療する方法を提供する。好ましい実施態様では、これらの方法はヒト免疫不全ウイルス（HIV-I）エンベロープタンパク質gp120の可変ドメイン（アミノ酸領域308〜322）に相当する合成ペプチドに対して惹起されたモノクローナル抗体を利用する。HIV-I配列と乳癌および婦人科の癌の配列との間の相同性のある領域は、保存された遺伝配列に基づく診断および治療のための方法として同定される。

Description

【発明の詳細な説明】乳癌および婦人科の癌の検出および治療１.技術分野本発明は、新規に発見された乳癌および婦人科の癌に関連した抗原、ならびに生物学的試料中のこれらの抗原を検出するイムノアッセイ法、ならびにこれらの抗原に結合する抗体でこれらの癌を治療する免疫療法に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)エンベロープタンパク質gp120に対する抗体と、特定の乳癌および婦人科の癌の細胞表面抗原およびクロマチン抗原に対する抗体との間の免疫交差反応性の発見に関する。この交差反応性の結果、本発明の免疫診断法に有用である新規の免疫複合体の形成を生じる。２.背景技術乳癌および卵巣癌は、婦人に生じる全ての癌の１／３を占め、共に女性の癌関連死の約１／４の原因である。女性生殖路の癌はアメリカ合衆国で毎年浸潤性の癌の約80,000例を占め、その大部分は３種の新生物(子宮頚癌、子宮内膜癌、および卵巣の腔上皮癌)の１つである。ヒトパピローマウイルス感染に確実に関連づけられる子宮頚癌を除くと、乳房細胞、卵巣細胞、または子宮内膜細胞の悪性の形質転換に関連する病因は不明のままである。乳癌および卵巣癌の感受性がいくつかの家族で遺伝することは確立されている。乳癌および卵巣癌の5%〜10%は、上皮細胞の遺伝的変化に続く高い危険性を与える遺伝子の遺伝に関連し得る。遺伝した乳癌-卵巣癌の原因であると考えられている遺伝子は、染色体の17q12-2 1に位置し、BRCA 1座と名付けられたが、この座に位置する遺伝子配列は完全には知られていない。婦人の約200人に１人(アメリカ合衆国で600,000人の婦人)は、BRCA1のみならず、P53、Her2/erbB2、エストロゲンレセプターなどのような他の遺伝子における変異にも関連する乳癌感受性が遺伝していた。乳癌および卵巣癌への遺伝した感受性を有する家族に対する遺伝学カウンセリング、および予防的な乳癌切除術または卵巣摘出術は広く議論される課題を示す。外科手術、放射線療法、および化学療法が、悪性の乳癌および婦人科の癌に用いられる３つの基本的な方法の代表である。乳癌および婦人科の癌の患者の高い死亡率は、現在利用可能な診断方法および治療方法が満足のゆくものではないことを示している。モノクローナル抗体(MAb)での免疫療法および免疫診断法は、過去数年の間に広く開発され、改良されてきている他のアプローチてある。直接的なアプローチでは、MAb IgG2aおよびIgG3は抗体依存的な細胞の細胞障害性を媒介するおよび/ または補体依存的細胞障害性を用いる。もっとも頻繁に用いられるのは放射活性標識MAbを用いる放射免疫療法である。免疫毒(リシンまたはジフテリア毒素のサブユニットAとMAbとの結合である)は、高い腫瘍破壊能を示すが、高い細胞障害性を有するため適用が制限される。最近、乳癌、卵巣癌、および子宮頚癌に対する非常に多くのモノクローナル抗体が開発され、その免疫診断剤および免疫療法剤としてこれらのMAbを用いる努力が行われている。しかし、これらの技法を用いる女性生殖路の悪性疾患の処理において重要な進歩は報告されていない。多くのHIV-Iペプチドおよびタンパク質が同定され、それらは動物において中和抗体を誘発する。ヨーロッパ出願公開第339504号に、HIV-Iウイルス由来のアミノ酸配列を有する化学的に合成されたアミノ酸ペプチドが記載されており、AI DSおよびAIDS関連症候群治療のためのHIV阻害抗体の産生の誘発に用いられ得る。しかし先行技術は、乳癌および婦人科の癌を検出および治療する目的のためにモノクローナル抗体を合成して用いる手段を開示していない。乳癌および婦人科の癌を処理するための革新的なアプローチであると考えられる免疫診断法および免疫療法を提供することが本発明の目的である。発明の要旨簡単に述べると、本発明は、生物学的試料中のHIV-I交差反応性の乳癌および婦人科の癌の関連抗原(以下に定義される)の存在を検出する方法およびこれらの癌を治療する方法を提供する。好ましい実施態様では、これらの方法は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)エンベロープタンパク質gp120の可変ドメイン(アミノ酸領域308〜322)に相当する合成ペプチドに対して開発されたモノクローナル抗体 (以下MAb5023とする)を利用する。このMAbはDuPont/NEN，549 Albany Street，B oston，MA 02118から購入され得、カタログ番号NEA-9305でこの会社のカタログ「DuPont/NEN Research Products 1992-1993」にリスト表示されており、この産物の記載は「HIV Monoclonal Antibody gp120-Neutralizing(sequence specific )(mouse)0.5mL」である。本発明によれば、MAb5023は細胞に浸透して細胞核内に局在する能力、ならびに乳癌および婦人科の癌により発現される抗原ファミリーを認識する能力が独特であることがわかっている。従って、本発明によれば、上記癌を有すると疑われる宿主由来の生物学的試料をMAb5023に曝す工程およびHIV交差反応性免疫複合体の存在を検出する工程を包含する乳癌および婦人科の癌の診断方法が提供される。偶然にも、本発明は、他の実施様態では子宮頚管へのMAb5023の投与、次いでこの抗体と細胞表面タンパク質p120およびp41との間で形成される免疫複合体の存在の検出により、子宮頚癌の簡単で直接的なインビボでの診断を可能にする。本発明の１つの局面では、この方法は、生物学的試料中のHIV-I交差反応性乳癌関連抗原を検出する工程を包含し、(a)抗原を含むと疑われる生物学的試料を以下の細胞膜タンパク質：p160、p80、p45、およびp24、ならびに次のクロマチンタンパク質：p24を認識する抗体に曝す工程、ならびに(b)上記抗体と上記タンパク質との間に形成される免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。それと関連して、この方法は、生物学的試料中のHIV-I交差反応性の婦人科の癌の関連抗原を検出する工程を包含し、(a)抗原を含むと疑われる生物学的試料を以下の細胞膜タンパク質：p120、p41、およびp24、ならびにクロマチンタンパク質：p24を認識する抗体に曝す工程、ならびに(b)上記抗体と上記タンパク質との間に形成される免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。このように形成された免疫複合体は、本発明の実施態様を構成し、そして(a) 少なくとも１つの以下の細胞膜タンパク質、p160、p80、p45、またはp24、またはクロマチンタンパク質、p24、ならびに(b)上記の各タンパク質を認識する抗体を含有する。好ましい実施態様では、抗体はMAb5023である。一般的には、本発明の免疫複合体は、固定化形態である。この形態では、免疫複合体は不溶化されているか、あるいは種々の標準の固定化基材上に支持されている。捕捉剤が接着し得る物質の例は、ガラス、合成ポリマー、合成樹脂、セルロース、ニトロセルロース、および種々の金属である。これらの捕捉剤を接着する手順は、用いられる薬剤および基材により多岐にわたるが、一般的には当該技術分野で周知である。抗体の固体マトリックスへの結合方法のいくつかは、E HarlowおよびD Lane、Antibodies: A Laboratory Mannual 、New York: Cold Spring Harbor Laborator y、511-552頁、1988に議論されている。本発明の他の局面は、乳癌、ならびに、卵巣癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、および外陰癌からなる群より選択される婦人科の癌を治療する方法であり、細胞の核へ転移および内部移行し、そして本発明のHIV交差反応性抗原と免疫複合体を形成する抗体、例えばMAb5023、を患者に投与する工程を包含する。抗体は単独であるいは、放射活性または細胞障害性のリガンドと結合して投与され得、そして薬学的に有効な投与形態、一般的には静脈内注射または腹腔内注射、で投与される。本発明のHIV-I交差反応性癌関連抗原は、乳癌ではp160、p80、p45、およびp24 細胞膜タンパク質、ならびにp24クロマチンタンパク質、そして婦人科の癌(すなわち、卵巣癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、および外陰癌)ではp24クロマチンタンパク質である。上記の簡単に述べた方法の全てにおいて、抗体は、酵素、蛍光色素、放射性同位体元素、または発光物質(luminescer)で標識され得る。そのような場合、検出の工程は、通常はそれぞれ、酵素反応、蛍光、放射活性、または発光である。上記の方法は、本発明のHIV-I交差反応性癌関連抗原またはそれらに対する抗体の存在を検出するために、種々の生物学的試料に適用され得る。体分泌物、体液、および組織標本は全て、この点で適切な試料である。体分泌物の例には、子宮頚分泌物、膣分泌物、ヒト母乳、尿、および腹腔内の腹水を含む。適切な体液には血液が含まれる。組織標本の例は、種々のバイオプシー、例えば、子宮頚部異形成、子宮頚癌、卵巣癌、外陰癌、リンパ節、および骨髄のバイオプシーを含む。さらに全領域由来の組織が死後の検査と関連して試験され得、原発性腫瘍および転移腫瘍、リンパ節、骨髄、および全器官を含む。本発明によれば、連続したハイブリッド細胞株が樹立され得、上記の方法で用いるために本発明のHIV-I交差反応性癌関連抗原の抗原決定基に対するモノクローナル抗体を産生する。特に好ましい実施態様では、細胞株はMAb5023のハイブリドーマクローンを含む。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｅ．SKBr5(A-D)およびMCF7(E)乳癌細胞の、0℃で15分間(A)、または37℃で１時間(B)、3時間(C)、および24時間(D、E)のMAb5023とのインキュベーション後、フルオレセイン結合ヒツジ抗マウスIgGでの免疫蛍光染色。図２．SKBr5細胞との24時間インキュベーション後の遊離の¹²⁵I-MAb5023(レーン１)、ならびに細胞質(レーン２)およびクロマチン(レーン３)に蓄積された¹²⁵ I-MAb5023のオートラジオグラフ検出。細胞質およびクロマチンを5×10⁵細胞から調製した。図３Ａおよび３Ｂ．7.5％(A)または13％(B)のポリアクリルアミドゲルで分離したSKBr5細胞の膜タンパク質(M)およびクロマチンタンパク質(Ch)と、HIV-I gp 120のV3ループに対する種々のMAbとのウエスタンブロッティング。図４Ａおよび４Ｂ．7.5％(A)または13%(B)のポリアクリルアミドゲルて分離した種々の細胞株の膜タンパク質(M)およびクロマチンタンパク質(Ch)と、MAb5023 とのウエスタンブロッティング。図５.SKBr5乳癌細胞(レーン１)およびSW707結腸直腸癌細胞(レーン２)由来の、MAb5023により免疫沈降した[³⁵S]メチオニン標識原形質膜タンパク質の電気泳動分析(7.5%ポリアクリルアミドゲル)およびオートラジオグラフ検出。図６．SKBr5乳癌膜タンパク質(レーン１)およびHIV-I gp120(レーン２)とenv- 2-3に対するヒトHIV-I中和抗体とのウエスタンブロッティング。タンパク質は7. 5%のポリアクリルアミドゲルで分離される。図７Ａ〜７Ｄ．原形質膜含有細胞質画分(C)、または核画分(N)、あるいは純粋なクロマチン(Ch)とHIV-I gp120に対するMAb5023(7A,7B,7C)およびMAb5025(7D) のウエスタンブロッティング。タンパク質を7.5%-10%ポリアクリルアミドゲルで分離した。異なる移動度は、電気泳動の異なる時間および異なるゲル濃度による。あらかじめ染色したタンパク質マーカー(Bio-Radからの高分子量および低分子量)を各実験で用いた。図８．子宮頚癌細胞株SiHaの増殖におけるMAb5023の効果。MAbが腹水として用いられ、濃度は培地中での腹水希釈として１％濃度の腹水1:100が与えられ、およそ0.2μg/mlのMAb濃度に対応する。阻害濃度0.25は0.05μg/mlに対応する。図９Ａ〜９Ｃ．癌(AおよびB、レーン２)および正常細胞(B、レーン２、および C)由来の細胞質タンパク質(C)、クロマチンタンパク質(Ch)、または総タンパク質(C+N)のMAb抗HIV-I gp120を用いた電気泳動分析(10％ゲル)およびウエスタンブロッティング。（標準外科手術の間に得られた癌または正常組織の細胞あるいは切片を、0.35M ショ糖/10mM KCl/1.5mM MgCl₂/10mM Tris-HCl(pH7.6)/0.12% T riton X-100/12mM 2-メルカプトエタノール(1ml/3×10⁶細胞または0.25〜1ml/cm³ 組織)中でホモジナイズし、そして600×gで10分間遠心分離した。上清は粗膜含有細胞質画分であった。核ペレットを、まず0.2M ショ糖/3mM CaCl₂/50mM Tris- HCl(pH7.6)で洗浄し、次いで0.14M NaCl/10mM Tris-HCl(pH8.3)で洗浄し、そして700×gで10分間遠心分離した。ペレットを1mM Tris-HCl(pH7.9)で膨潤し、1.7 M ショ糖、10mM Tris-HCl(pH7)で160,000×gで80分間完全に遠心分離した。クロマチンを試験管の底でペレットにした。タンパク質を、Laemmliら(76)に従って、250mM Tris-HCl(pH8.3)、195mM グリシン、および0.1% SDS中の0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む10%ポリアクリルアミドゲルで分離した。各レーンは、5×10⁴細胞に相当するレーン７を除いて3×10⁵細胞に相当する。ポリアクリルアミドゲルからPVDF膜へのタンパク質のブロッティングを、10%メタノールを含む25mM Tris-HCl(pH8.6)、192mM グリシン緩衝液中で行った。フィルターを、1% BSAと0℃で16時間インキュベートし、次いでMAb抗HIV-I gp120(DuPont)(5μg/ml)とインキュベートし、Tris-グリシン緩衝液で洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGと１時間インキュベートした。TBSTで洗浄後、膜を100mM Tris-HCl pH9.5、100mM NaCl、 5mM MgCl₂中で0.1% 1-ナフチル-ホスフェートおよびFast Redとインキュベートした。）A:MCF7乳癌(レーン１、２)、SiHa子宮頚癌(レーン３、４)、子宮内膜癌 (レーン５、６)、および頚癌(レーン７)のタンパク質。B:卵巣癌(レーン１)および正常卵巣組織(レーン２)。C:正常皮膚、筋肉、および子宮頚組織ならびに正常膣粘膜のタンパク質。図１０．混合Mullerian腫瘍から抽出された細胞質タンパク質に対する、MAbが惹起されたペプチドRIQRGPGRAFVTIGK 配列番号１(B)による、MAb抗HIV-I gp120( A)結合の競合阻害。同量のタンパク質を、AおよびBのレーン１(10⁶細胞当量)で、そしてAおよびBのレーン２(0.5×10⁶当量)で分離した(ペプチド(18μg/ml)をM Ab抗HIV-I gp120(5μg/ml)と１時間氷上でインキュベートし、次にフィルター(B )とインキュベートした。コントロール(A)では、フィルターをMAbのみとインキュベートした）。 MAb抗HIV-I gp120とAIDS患者の血液から抽出したHIVタンパク質(DuPont)を含むPVDFストリップとの反応性(C)。細胞質タンパク質、クロマチンタンパク質、および総タンパク質を、以下に記載されたように得た。（標準外科手術の間に得られた癌または正常組織の細胞あるいは切片は、0.35M ショ糖/10mM KCl/1.5mM MgCl₂/10mM Tris-HCl(pH7.6)/0.12% Triton X-100/12mM 2-メルカプトエタノール(1ml/3×10⁶細胞または0.25〜1ml/cm³組織)中でホモジナイズし、600×gで10 分間遠心分離した。上清は、粗膜含有細胞質画分であった。核ペレットを、まず 0.2M ショ糖/3mM CaCl₂/50mM Tris-HCl(pH7.6)で洗浄し、次いで0.14M NaCl/10m M Tris-HCl(pH8.3)で洗浄し、700×gで10分間遠心分離した。ペレットを、1mM T ris-HCl(pH7.9)で膨潤し、1.7M ショ糖、10mM Tris-HCl(pH7)で160,000×gで80 分間完全に遠心分離した。クロマチンを試験管の底でペレットにした。タンパク質を、Laemmliら(76)に従って、250mM Tris-HCl(pH8.3)、195mM グリシン、および0.1% SDS中の0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む10% ポリアクリルアミドゲルで分離した。各レーンは、5×10⁴細胞に相当するレーン７を除いて3×10⁵に相当する。ポリアクリルアミドゲルからPVDF膜へのタンパク質のブロッティングを、10%メタノールを含む25mM Tris-HCl(pH8.6)、192mM グリシン緩衝液中で行った。フィルターを、1% BSAと0℃で16時間インキュベートし、次いでMAb抗HIV-I gp120(Dupont)(5μg/ml)とインキュベートし、Tris-グリシン緩衝液で洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGと１時間インキュベートした。TBSTで洗浄後、膜を100mM Tris-HCl pH9.5、100mM NaCl、5m M MgCl₂中で0.1% 1-ナフチル-ホスフェートおよびFast Redとインキュベートした。）図１１Ａおよび１１Ｂ．プライマーSK 68/SK 69(A)とP1/P2(B)プライマーを用いる代表的なDNA増幅分析(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を以下を含む溶液中で行った：10mM KCl、10mM(NH₄)SO₄、200mM Tris-HCl、20mM MgSO₄、1% Triton X-10 0、dNTP(10mMの各dATP、dTTP、dCTP、およびdGTP)、120〜250ngのプライマー、2 .5U Taqポリメラーゼ、水で30μlにする。DNAテンプレートを、0.2〜1μg(20μl )およびパラフィンオイル(70〜100μl)の量で添加した。反応をサーマルシリンダー(30〜40サイクル)内で行った。PCR産物をエチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルで分離した)。 A) レーン１：123bpマーカー、レーン２：HIV-I感染T細胞、３：SiHa、４：M CF7、５：混合Mullerian腫瘍、６〜８：正常皮膚(異なる患者)、９：テンプレートなし、10：子宮内膜癌 B) レーン１：HIV-I感染T細胞、２〜３：SiHa(それぞれ１μgおよび0.1μg) 、４：混合Mullerian腫瘍、５〜６：MCF7(それぞれ１μgおよび0.1μg)、７：子宮内膜癌、８：正常皮膚、９：123bpマーカー図１２．子宮頚癌SiHa、標準外科手術(EIV)の間に得た子宮内膜癌、およびプライマーSK 68/SK 69(図3Aを参照のこと)でPCRにより増幅された乳癌MCF7の140 〜150bp DNAフラグメントの配列。少なくとも２つかそれ以上の細胞タイプで一致するヌクレオチドを枠づけしている。HIV-Iと一致するまたは高い相同性を有する21bpの領域は星印をつけている。図１３Ａ〜１３Ｅ．SiHa細胞(A,C)およびMCF7細胞(B,C)中のウイルス粒子およびMCF7細胞(D)から得られた細胞外小胞の透過型電子顕微鏡写真。ウイルス粒子を酢酸ウラニルでネガティブに染色した(E)。A、D、およびEにおいて、試料をMA b抗HIV-I gp120と免疫-金(immuno-gold)標識した。免疫-金粒子のサイズは、15n m(A、D)および10nm(E)であった。V-ウイルス粒子。図１４Ａおよび１４Ｂ．アンチセンスオリゴヌクレオチドRAK-Iの乳癌MCF7細胞株の増殖における効果。細胞を、100μg/ml(１日目)および50μg/ml(２および３日目)の濃度で毎日添加したアンチセンスオリゴヌクレオチドRAK-I(5'-CCAGAC TGTGAGTTGCAACAG-3')配列番号６の非存在下(A)または存在下(B)において４日間増殖した。オリゴヌクレオチド5'-TGTGACATCAGGCTCAAATC-3'をネガティブコントロールとして用い、これは細胞増殖に影響を与えなかった(データを示さず)。発明の詳細な説明 HIV-Iの可変V3ループのアミノ酸残基308〜322に対して惹起されたMAb5023を、 160,000 M₂(p160)および80,000 M₂(p80)細胞表面抗原とウエスタンブロッティングで反応させた。タンパク質p160は、p80のオリゴマー形態を示すようである。同じ領域308〜322に対する他のMAb5025、ならびにアミノ酸領域307〜328および3 08〜332に対するMAbは、p160またはp80を認識しない。MAb5023およびMAb5025が同じ合成ペプチドに対して惹起されたが、これらのMAbにより認識されたコアエピトープの構造に少しの相違があり、これがMAb5023の親和性がMAb5025の親和性よりも数倍高い理由である。試験したMAbの全部が他の細胞膜抗原p45を認識した。p45がp160の独立したタンパク質、分解産物、またはプロセシング産物を提示するかどうかは確定されていない。MAb5023が乳癌細胞に進入し、核に移行し得た唯一のMAbであるので、p160および(p80)がMAbの内部移行に重要である特異的なエピトープを発現するようである。細胞分画の間の細胞膜結合¹²⁵I-MAb5023のクロマチンへの非特異的吸着は、p160、p80、およびp45が細胞膜画分の特異的マーカーを提示し、クロマチンで見いだされないため、除去され得る。MAb5023は内部移行するが他のMAbはいずれも内部移行しない事実は、細胞表面抗原に結合する抗体が内部移行のプロセスを誘導するに十分ではないことを示唆している。そのかわり、細胞表面抗原の特異的なエピトープが含まれていなければならない。最近の観察は以前の研究と一致し、腫瘍関連抗原に対して惹起された多くのMA bからは少しのみが内部移行するが、他は細胞に進入し得ないことを証明した。４つの抗原(p160/p80、p45、およびp24)は乳癌で検出され、そして３つの抗原 (p120、p41、およびp24)は、子宮頚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、および外陰癌によって通常発現される。p24以外の全ての抗原は、細胞質/原形質膜画分に選択的に発現される。タンパク質p24は原形質膜画分とクロマチン画分の両方で検出された。タンパク質p160/p80、p45、p120、およびp41は、黒色腫、結腸直腸癌、通常の乳房上皮細胞、および非感染のリンパ球では検出されなかった。低分子量タンパク質p24は、上皮細胞、リンパ球、およびいくつかの癌タイプで発現される。 MAb5023の内部移行はまた、p120を発現する子宮頚癌細胞において検出された。MAb5023により認識されるエピトープ(内部移行に関連し得る)は、良く特徴付けられている。MAb5023はHIV-I gp120の可変ループのアミノ酸配列308〜322(RIQ RGPGRAFVTIGK)に対して惹起されたか、このMAbはエピトープGRAFに結合する。RA Fの前のGは内部移行に重要であると考えられる。 MAb5023のみが、p160およびp120が内部移行を媒介するタンパク質であることを示唆する癌抗原と交差反応するが、HIVに対する他のMAbのいずれも交差反応しない。p160およびp120のHIV-I gp120のV3ループに対する他のMAbとの反応性の欠如は、癌抗原とHIV抗原との相同性(holology)が偶発的であり得、そして非常に短いアミノ酸領域に限定され得ることを示唆する。他方、婦人科の癌の抗原とHI V抗原の同じ分子量(Mr 120,000)、およびHIV gp120(Mr 160,000)の前駆体と乳癌抗原の分子量の相関関係は、癌タンパク質がHIVに相同なレトロウイルスの産物を示し得ることを示唆する。この推論は、他の癌抗原(p45/41、p24)のHIV抗原との相同性により支持される。HIV gp120の可変領域に対する他のMAbは、ほとんど細胞膜上のp45を認識しなかった。さらに、HIV-I gp120を用いてアフィニティー精製したAIDS患者由来の抗体は、乳癌細胞中のp80およびp45；卵巣癌におけるp4 1を認識した。 MAb5023は内部移行し、核に転移する場合、RNA合成を刺激し、そして乳癌細胞の増殖を促進した。対照的に、子宮頚癌細胞の増殖はMAb5023により30〜50%阻害された。乳癌細胞の増殖におけるMAb5023の刺激効果、および子宮頚癌細胞の増殖における阻害効果は、癌細胞により発現されたp160およびp120が細胞のプロト癌遺伝子の成長因子レセプター様産物を示し得ることを示唆する。HIV交差反応性抗原のレトロウイルス起源もまた１つの可能性である。 HIV交差反応性癌抗原の潜在的な診断価値および予防価値に加えて、MAb5023を内部移行する能力がこれらの抗原を免疫療法の優れた標的にする。乳癌および婦人科の癌とのMAb5023の相互作用の特異性、ならびに内部移行およびクロマチン結合は、MAb5023を細胞質および／または核に向けた種々の薬物に潜在的に有用な媒体にする。本発明に従って、MAb5023はまた放射活性リガンド(¹²⁵I)についておよびプロト癌遺伝子Neu/HER-2(erbB-2とも呼ばれる)に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドについての媒体として用いられる。Neu癌遺伝子は、EGFレセプターに強い構造相同性を示す細胞表面レセプターp185Neuをコードする。Neu の癌遺伝子の能力は、トランスメンブレン領域内における点変異、細胞質ドメインおよび細胞外ドメインの両方での非触媒配列の短縮を含む、多くの遺伝学的メカニズムにより、または増幅により解放される。特に、Neu増幅と過剰発現との間の強い関連ならびに臨床結果が、乳癌および卵巣癌において報告された。癌遺伝子Neu産物に対するMAbが、癌の増殖を阻害することが示された。細胞表面レセプターNeuの発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーションは、乳癌および卵巣癌の増殖を顕著に阻害する。MAb5023は効果的に内部移行されるため、本発明の他の実施態様はアンチセンス療法であり、ここでプロト癌遺伝子Neuの特異領域に相補的なオリゴヌクレオチドがMAb5023と結合される。アンチセンス研究は最近５年間に拡大されている。アンチセンスは、タンパク質産物の産生を阻害するセンス(mRNA前駆体またはmRNA)分子に相補的なオリゴヌクレオチド間の相互作用を記載するために造られた用語である。核酸とのあらゆる治療的オリゴヌクレオチド相互作用を記載することに広げられた。アンチセンスオリゴヌクレオチド作用に関連するメカニズムは以下を含む：mRNAの特異領域に結合するブロッキングタンパク質を介する翻訳阻害、二本鎖mRNAとアンチセンスとの間のRNase Hにより分解される三重鎖の形成、転写開始または転写の伸長、スプライシングの阻害、必要なRNA構造の破壊、不安定化、ポリアデニル化の阻害などを抑制するDNAへのオリゴヌクレオチドの結合後の転写阻止。アンチセンス概念の適用で明らかになったいくつかの主要な問題は：1)投与部位の血液、皮膚、および他の組織に存在するヌクレアーゼによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞外分解、2)エンドサイトーシスを介した細胞による取り込みおよび適切な細胞コンパートメントへの放出、3)核酸とのハイブリダイゼーションのキネティクスおよび標的(garget)核酸への親和性。オリゴヌクレオチドの3'および 5'末端での化学的改変が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を減少するために開発された。２つのアプローチが細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド送達を増加をするために試験されている：リポソーム媒介取り込みおよび膜レセプター媒介輸送システム。コレステロール、ポリ(Ｌ-リジン)、インターロイキン、1,2-ジ-0-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスフェート結合オリゴヌクレオチドが、特異的タンパク質媒介細胞内経路を用いるために合成された。特異的リガンドと結合したオリゴヌクレオチドの取り込みが著しくより高かった。エンドソームの小胞からのオリゴヌクレオチドの放出のメカニズムは明らかではなく、それはエンドソーム膜の構造変化、一時的な膜不安定化、または他のメカニズムにより誘導され得ることが推測される。本発明の他の実施態様は、細胞核への内部移行および局在化を可能にするMAb( 例えばMAb5023)の標的細胞(例えば、抗Neuおよび他の標的)へのアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するための適用である。他の送達システムと比較して、乳癌細胞および婦人科の癌の細胞と特異的に相互作用するMAbの使用により、特異的な遺伝子座へアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的するための新しい機会が与えられる。さらに、MAbが非分解形態で細胞内で発見され、非常に有効に細胞内膜を通過するため、免疫アンチセンス療法は遺伝学的療法のさらに一般的な方法へのアプローチを示し得る。本発明に従ったモノクローナル抗体の産生において、連続的ハイブリドーマ細胞株が樹立され、これは本発明のHIV-I交差反応性癌関連抗原に結合するモノクローナル抗体を合成して分泌する。好ましい実施態様では、MAbはヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)エンベロープタンパク質gp120(アミノ酸領域308〜322)の可変ドメインに相当するペプチドに特異的である。このようなモノクローナル抗体の産生における最初の工程として、動物宿主は抗原に対する抗体を産生する特異的な免疫リンパ球(血漿細胞として公知)の発達を誘導するために従来のプロトコルに従って免疫される。これらのリンパ球は免疫された宿主の脾臓から回収され、同じ動物種に由来するミエローマ腫瘍細胞と従来の実験プロトコルに従って融合され、巨大体細胞ハイブリッドを形成する。 G KohlerおよびC Milstein(Nature 256: 495-497，1975)により最初に報告されたこれらのハイブリッド融合プロトコルは、一般的に当業者に公知である。細胞-細胞ハイブリッドは融合に用いられた両親細胞タイプの特徴を表す：悪性ミエローマの親株のように、融合した細胞ハイブリッドは、組織培養において迅速かつ無期限に増殖する能力を有する；さらに、これらは融合に関連した正常抗体分泌リンパ球親株の遺伝子により特定された大量の抗体を分泌する能力を有する。これらのハイブリッド細胞株は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。適切な選択およびクローニング後、抗原に対する抗体を持続して産生するために、それらは組織培養であるいは遺伝的に一致するまたは免疫寛容した動物において無期限に増殖する。これらが特定のアッセイで簡単に検出可能であるために、本発明の抗体は種々の標準物質(放射活性、蛍光、または酵素マーカー)で標識され得る。このような標準マーカーの例は：１．放射活性：トリチウム、カーボン-14、リン32、ヨウ素-125；２．蛍光：フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド；３．酵素：西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂ-ガラクトシダーゼ。これらのマーカーで抗体を標識する方法、およびこのようなマーカーを検出する方法は、一般的に当該技術分野で周知であり、例えば、GolubおよびGeen、「Imm unology：A Synthesis」、第２版、Sinauer Associates，Inc.,Sunderland，MA( 1991)、167-175頁を参照のこと。材料および方法細胞株 SKBr5、SKBr3、MCF7、BT12、およびCAMA乳癌細胞株、SW1116およびSW707結腸直腸癌細胞株、黒色腫451 LU(The Wistar Institute)、およびＴ細胞リンパ球細胞株SUPT1が、10%ウシ胎児血清を添加したイーグルの最少必須培地/Leibovitz's L15(3:4)培地中で増殖した。細胞株SiHa(子宮頚癌)はアメリカン組織カルチャーコレクションから得た。ヒト癌：婦人科の癌(子宮頚癌、卵巣癌、外陰癌、および子宮内膜癌)を通常の外科手術手順の間に得た(University of Nebraska Medical Center)。 MAbおよびヒト抗体 MAb5023およびMAb5025(HIV-I gp120アミノ酸領域308〜322)は、DuPont Compan yから入手する。(AIDS Res and Human Retroviruses 1990; 6: 1115-1123を参照のこと)。この領域に対するMAb 0.5bを、日本のKumamoto University Medical S choolのDr．S．Matsushitaから得た。(AIDS Res and Human Retroviruses 1988; 4; 187-197を参照のこと)。VM77(307〜328)を、Bionetics Research，Inc.のDr ．F．Veroneseから入手した。env-2-3に対するヒト抗体は、Dr．K.S．Steimer， Chiron Research Laboratories，Emeryville，CAにより供与された。env-2-3に対する抗体は、HIV-I血清学的アッセイで血清反応陽性であると同定および確認されたヒト由来のプールした血清画分を示し、遺伝的に操作した酵母で産生されたHIV-Iエンベロープタンパク質gp120の非グリコシル化形態を含むアフィニティーカラムで精製することにより得られた。(Vaccines 1990．Cold Spring Harbor Labs，Cold Spring Harbor，NY，1990，313-320頁；およびScience 1991;254: 105-108を参照のこと)。MAbのヨウ素化を、IODOGEN法によりルーチンで行った。（Arch Biochem Biophys 1989; 271: 366-379を参照のこと）。MAbの比活性は10 〜20cpm/pgであり、そしてヒト抗体の比活性は3〜6cpm/pg IgGであった。間接免疫蛍光染色により示された未処理細胞でのMAbの細胞内局在化単層で増殖した細胞をNuncスライドフラスコ(Denmark)に5×10⁵mlの密度で再播種した。24時間後、試験したMAbを10〜100ng/mlの濃度で添加した。30分後または１時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、50%および100%エタノール(各10分)で固定し、PBSで３回洗浄し、そしてフルオレセイン結合ヒツジ抗マウスIgG血清(Collaborative Research)と37℃で１時間インキュベートした。PBSで３回洗浄した後、細胞を蛍光顕微鏡で検査した。コンフルエントの単層で増殖された細胞を、Nunclone(Denmark)フラスコ中10⁵ 細胞/cm²の密度で新鮮な培地に播いた。24時間後、¹²⁵I-標識マウスMAbまたは¹² ⁵ I-標識ヒトIgGを100〜300ng/mlの濃度で添加し、細胞(10〜20×10⁶)を24時間標識した。細胞画分をArch Biochem Biophys，1989; 271:366-379に記載されたように得た。細胞をPBSで３回から５回洗浄し、0.35M ショ糖/10mM KCl/1.5mM MgCl₂/10mM Tris-HCl(pH7.6)/0.12% Triton X-100/12mM 2-メルカプトエタノールでホモジナイズし、そして600gで10分間遠心分離した。上清(細胞質画分(粗)として定義される)は、ミトコンドリアを除くために10,000gでさらに30分間遠心分離し、次いでミクロソーム(原形質膜)画分を得るために100,000gで１時間遠心分離した。核ペレットをまず0.2M ショ糖/3mM CaCl₂/50mM Tris-HCl(pH7.6)で洗浄し、次いで 0.14M NaCl/10mM Tris-HCl(pH8.3)で洗浄し、そして700gで10分間遠心分離した。0.14M NaClで抽出した核質タンパク質を「sapタンパク質」画分と定義した。ペレットを、少量の1mM Tris-HCl(pH7.9)で膨潤し、1.7M ショ糖、10mM Tris-HC l(pH7)中、160,000gで80分間完全に遠心分離した。クロマチンを試験管の底でペレットにし、核膜を境界面で得た。核質(0.14M NaClで抽出後の残りの画分)を上層から回収し、そして「sapタンパク質」画分と混合した。特定の細胞画分に結合した¹²⁵I-MAbの放射活性をアボガドロ数と¹²⁵I-MAbの比活性を用いて計算した。未処理の核を、0.25Mショ糖、10mM KCl、1.5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl(pH7.6) 、12mM 2-メルカプトエタノール、0.02% Triton X-100中でホモジナイズし、600 gで10分間遠心分離し、そして2.2M ショ糖、10mM Tris-HCl(pH7.9)、1.5mM MgCl₂ で精製する(90,000gで60分間)ことにより単離した。核(2〜3×10⁶)を、0.25Mショ糖、20mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl₂、および 500ng/mlの非標識ウシ胎児血清アルブミンを含むインキュベーション培地中で、¹²⁵ I-MAb(10ng/ml)とインキュベートした。インキュベート後、核を遠心分離し( 600gで10分間)、50mM Tris-HCl(pH7.5)、12.5mM NaCl、12.5mM MgCl₂で３回洗浄し、1mM Tris-HCl(pH7.6)でホモジナイズし、そして1.7Mショ糖および10mM Tris -HCl(pH7.9)で遠心分離した。核質を上層から得、核膜を境界面から、そしてクロマチンを試験管の底から得た。上記の核画分中の¹²⁵I-MAbの放射活性を測定し、そして¹²⁵I-MAb分子の数を(Narod SAら、Lancet，338，82-83，1991)に記載されたように算出した。¹²⁵I-MAb取り込みの特異性を、¹²⁵I-BSAまたは¹²⁵I-非内部移行MAbの非特異的吸着レベルを比較することにより評価した(Narod SAら、Lancet ，338 82-83，1991)。小麦胚芽アグルチニン(WGA)の阻害効果(核孔タンパク質のN-アセチルグルコサミンを結合し、タンパク質の細胞内取り込みをブロックする(11、12))を、WGAの増加させた濃度(0.625〜2.5mg/ml)の存在下、¹²⁵I-MAbとともに単離した核をインキュベートすることにより試験した。タンパク質の電気泳動クロマチンおよび膜タンパク質を、Laemmliら(Nature 1971;227:680-685)に従って、250mM Tris-HCl(pH8.3)、195mM グリシンおよび0.1% SDSを含む緩衝液中に0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む7.5〜15%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより分析した。ゲルを100Vで４時間泳動し、クマシーブルーで染色し、乾燥し、そしてオートラジオグラフを行った。別のアプローチでは、¹²⁵ I-抗ヒトIgGをアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgGに置き換えた。ウエスタンブロッティングポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースまたはPVDF膜へのタンパク質のブロッティングを、10mM Tris-HCl(pH8)、150mM NaCl、および0.05% Tween 20を含むTBST 緩衝液中で行った。転写を50Vで一晩行う。膜を水で洗浄し、次いでTBST緩衝液で洗浄した。フィルターをTBST中1% BSAで０℃にして16時間インキュベートし、次いで、マウスMA bまたはヒト抗HIV-I抗体(2mg/ml)と１時間インキュベートし、TBSTで洗浄し、¹² ⁵ I-ヒツジ抗マウスIgGまたは¹²⁵I-標識抗ヒトIgG(1mCi)と１時間インキュベートした。大量に洗浄した後、フィルターを乾燥し、そしてオートラジオグラフを行った。いくつかの例では、¹²⁵I-抗ヒトIgGをアルカリホスファターゼ/結合抗マウスIgGで置換した。モノクローナル抗体MAb5023により認識される細胞膜タンパク質の免疫沈降 SKBr5細胞を、[³⁵S]メチオニン(10mCi/ml、比活性1000Ci/mmol)と18時間インキュベートし、上記の細胞質、核質、核膜、およびクロマチンに分画した。細胞質を遠心分離し(105,000g、１時間)、ミクロソーム画分を含むペレットを10mM T ris(pH7.4)、0.5%Nonidet NP40、0.14M NaCl、5mM EDTA、および1mM フェニルメチルスルホニルフルオリドに溶解した。原形質膜を含む溶解したミクロソーム画分を、HIV-I gp120に対するMAb5023(2〜5mg/膜、5×10⁵細胞由来)と４℃で１時間、ホルマリン固定したStaphyloccus aureus(Calbiochem)とともにインキュベートした。インキュベート後、MAb細胞表面タンパク質複合体を含むS.aureusを、10mM Tris-HCl(pH7.4)、0.5% Nonidet NP40、0.1% SDS、および0.14M NaClで洗浄した。免疫沈降したタンパク質をLaemmli(Nature 1971;227:680-685)に従って電気泳動で分析した。 RNA合成および細胞増殖におけるMAb5023の効果 SKBr5細胞を、[5,6 3H]ウリジン(Amersham、比活性 48Ci/mmol)および0または 100ng/mlのMAb5023を含む細胞培養培地中で１時間または24時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を上記のように細胞質、核質、核膜、およびクロマチンに分画した。クロマチン結合RNA、核質RNA、および細胞質RNAの放射活性を、10%トリクロロ酢酸で沈殿し、Whatman GF/Cフィルターで濾過した画分で試験した。 MAb5023の細胞増殖における効果を、0または100ng/mlのMAb5023に曝した４日後、細胞を計数することにより試験した。結果乳癌細胞内のMAb5023の免疫蛍光検出乳癌SKBr5、MCF7、および結腸直腸癌SW1116細胞を、HIV-I gp120のV3ループに対する５つのMAbと異なる期間インキュベートし、次いでフルオレセイン標識ヒツジ抗マウスIgGとともにインキュベートした(図１)。 SKBr5細胞のMAb5023との０℃でのインキュベーションの15分後、免疫蛍光リングが乳癌細胞を取り囲み、これはMAb5023が細胞表面レセプターへ結合したことを意味する(図１Ａ)。37℃でのインキュベーションの15分から１時間の後、蛍光スポットが細胞質内に検出され(図１Ｂ)、MAbが内部移行し、エンドソーム小胞に局在化したことを示唆する。長時間(3〜5時間)曝した後、細胞質の蛍光がさらに拡散し、細胞質および核内に分布されるようであった(図１Ｃ)。乳癌細胞のインキュベーションの24時間後、核の強い蛍光は細胞質の非常に弱い蛍光とは容易に区別し得た(図１Ｄ)。MAb5 023が主に核に位置することはまた、MCF7細胞にも観察された(図１Ｅ)。MAb5023 は、インキュベーションの24時間後、コントロールの結腸直腸癌細胞では検出され得なかった(データを示さず)。MAb5025、0.5b、およびVM77は、乳癌細胞では検出され得なかった(データを示さず)。乳癌細胞によるMAb5023の細胞内取り込みはまた、¹²⁵I-標識MAbに曝した細胞の分画により観察された(表１)。¹²⁵I-MAb5023は、細胞により内部移行されそして細胞質内および核内に局在化した(表１)。gp120に対して試験した他のMAbはいずれも乳癌細胞により内部移行されなかった。内部移行した¹²⁵I-MAb5023の電気泳動分析は、インキュベーションの24時間後、細胞質およびクロマチンから抽出された¹²⁵I-MAb5023が、本来のMAbが示したと同じ分子量の重鎖および軽鎖の両方を表したことを示した(図２)。 gp120に対する内部移行するMAbと交差反応性の乳癌抗原の同定 MAb5023の内部移行が特異抗原により媒介されるかどうかを決定するために、M Ab5023および４つの他のMAbを、乳癌SKBr5の原形質膜タンパク質およびクロマチンタンパク質との反応性についてウエスタンブロッティングで試験した(図３)。高分子量タンパク質(200,000M_rおよび45,000M_r)を7.5%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により(図３Ａ)、低分子量タンパク質を13%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により(図３Ｂ)分離した。タンパク質の電気泳動を7.5%ポリアクリルアミドゲルで行った場合、MAb5023は原形質膜の主要な160,000M_r(p160)抗原、 M_r80,000(p80)の弱いバンド、およびM_r,45,000(p45)のシャープなバンドと反応した(図３Ａ、レーン２)。gp120に対する他のMAbはp45を認識したが、p160およびp80を認識しなかった(図３Ａ、レーン3〜5)。原形質膜画分で検出されたタンパク質バンドのいずれもクロマチンでは検出されなかった(図３Ａ、レーン１)。 13%ポリアクリルアミドゲルにおいて、M_r24,000(p24)の主要なタンパク質バンドが、MAb5023により細胞膜画分およびクロマチンの両方で検出された(図３Ｂ、レーン３および４)。試験した他のMAbはp24を認識しなかった(図３Ｂ、レーン１、２、および5〜8)。 HIV-Iのgp120に対するMAbと交差反応する乳癌抗原がSKBr5細胞株に特異的であるかどうかの試験を、SKBr3、MCF7、BT20、およびCAMAのような他の乳癌由来の原形質膜およびクロマチンを、MAb5023との反応について試験した(図４)。全ての乳癌が、膜画分中に抗原p160、p80、およびp45(図４Ａ)を、ならびに膜およびクロマチン画分中の両方にp24(図４Ｂ)を発現した。クロマチンにおいて、24,00 0M_rタンパク質に加えて、23,000M_rの弱いバンドを検出した。MAb5023(図４)または他のいかなるMAb(データを示さず)のいずれも、結腸直腸癌SW1116(図４Ａ、レーン８)、肺ガンSW900(図４Ａ；レーン６)、黒色腫451 Lu(図４Ａ、レーン７)、またはＴリンパ球細胞株ST1(データを示さず)中に原形質膜抗原を何ら認識しなかった。黒色腫細胞株451 Luにおいて、クロマチン中にp24/p23の低い発現が検出されたが、試験した他の細胞株では検出されなかった(図４Ｂ、レーン５)。 MAb5023の膜タンパク質とのウエスタン反応の典型的なプロフィルは、1% 2-メルカプトエタノールの存在において、その非存在においてと同じであった。しかし、2-メルカプトエタノールの濃度が5%に増加すると、p80はp160より高い濃度で存在した(データを示さず)。[³⁵S]メチオニン標識したSKBr5細胞由来の原形質膜画分のMAb5023との免疫沈降か、p160、p45(図５、レーン１)、およびp24(データを示さす)を明らかにした。結腸直腸癌SW707細胞(図５、レーン２)からはMAb5 023によりタンパク質は免疫沈降されす、これは乳癌抗原との反応性のMAb5023特異性を確認する。乳癌細胞の原形質膜におけるウエスタンブロッティングにより検出されたタンパク質p80(図４Ａ)は免疫沈降では検出されなかった。発明者らは、p160がp80のダイマー形態を表すことを示唆し、ここで本来の形態のモノマーp80はMAb5023により認識されなかった。発明者らはまた、細胞膜におけるp45 およびp24がp160の分解産物を表す可能性を排除し得ない。あるいは、MAb5023により認識される全てのタンパク質は、１つの前駆体タンパク質から派生し得る。 p160、p80、およびp24の相対量は、独立した実験から得られた試料において類似していた。p45の相対量は実験間で変動していた。乳癌細胞交差反応性およびヒトHIV-I中和血清の内部移行 HIV-Iを中和するenv-2-3に対するヒト抗体(方法を参照のこと)は、80,000Mrおよび45,000Mrの乳癌細胞膜抗原とウエスタンブロッティングで反応した(図６)。従って、HIV-Iに対するヒト抗体画分かMAb5023によっても認識される乳癌細胞上のエピトープを認識したようであった。ヒト抗体がマウスMAb5023が内部移行されたように内部移行するかどうかを決定するために、env-2-3に対する抗体を¹²⁵ Iで標識し、SKBr5細胞とインキュベートした。抗体画分を細胞質内および核内に見いだした(表１)。この研究は、ヒト抗HIV-I抗体画分が乳癌細胞に浸透し得ることを示している。婦人科の癌の抗原とHIV-I gp120の免疫学的交差反応性婦人科の癌は、the Clinic of the Department of Obstetrics and Gynecolog y，University of Nebraska Medical Centerで行われた標準的な外科手術の間に得られた。MAb5023は、試験した卵巣癌組織の６つに５つ、未知の起源の子宮頚癌、子宮内膜癌、外陰癌、および骨盤癌の６つに４つで抗原p120を検出した(図７)。タンパク質は直腸癌では特異的には検出されなかった。p120の他に、タンパク質p41をいくつかの癌で検出した。ほとんどの婦人科の癌の組織は、細胞質画分および核画分の両方においてp24も発現したが、他のタンパク質は細胞質においてのみ検出された(図７Ａ、Ｂ、Ｃ)。MAb5025のようなHIV-Iに対する他のMA bは、いかなるタンパク質も検出しなかった。単離された核によるMAb5023の取り込み ¹²⁵I-MAb5023は、SKBr5乳癌細胞から単離された核とインキュベートした場合、核に進入し、クロマチンに結合することが見いだされた(表２)。コントロール実験において、¹²⁵I-BSAを¹²⁵I-MAbの代わりに用いた。¹²⁵I-BSAは核に進入しなかった。BSA(M_r65,000)は、免疫グロブリン(Mr 155,000)よりずっと小さい分子であり、従って調製の間の核ダメージによるMAbの受動拡散、または核の分画の間のクロマチンへの免疫グロブリンの非特異的吸着が除去され得る。MAb5023が、N-アセチルグルコサミン結合核膜レセプターの媒介(SV40ラージＴ抗原および核局在シグナルを含む他のタンパク質の核転移を媒介することが見いだされた) を通して核により取り込まれるかどうかを決定するために、MAb5023の核取り込みにおけるWGAの効果を試験した。MAb5023の核転移はWGAにより有意にブロックされ(表２)、核膜レセプターがこのMAbの核内転移に関連し得ることを示唆する。 RNA合成および細胞増殖におけるMAbの効果 RNA合成は、TCA沈殿可能画分への[³H]ウリジン取り込みとして測定され、MAb5 023に曝されなかった細胞と比較して、細胞に曝した１時間後で25％、および24 時間後で40％増加した(表２)。 MAb5023は、細胞培養培地に100ng/mlの濃度で添加した場合、細胞増殖を50%刺激した(表３)。乳癌細胞におけるMAb5023の増殖促進作用とは対照的に、p120の中レベルを発現する子宮頚癌細胞株SiHaの増殖は、0.2ug/mlの濃度でMAb5023により30%〜50%阻害された(図８)。細胞表面抗原p160およびp120の種々の構造が、 MAbに対するポジティブまたはネガティブな増殖反応を決定し得るようである。考察 HIV-I gp120に対して惹起したMAbが乳癌細胞株の抗原および婦人科の癌で発現される抗原と交差反応することがわかった。HIV-Iの可変V3ループのアミノ酸残基308〜322に対して惹起したMAb5023が、160,000M_r(P160)および80,000M_r(p80) の細胞表面抗原とウエスタンブロッティングで反応した。タンパク質p160はp80 のオリゴマー形態を表すようである。子宮頚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、および外陰癌において、MAb5023は120,000M_r(P120)タンパク質および41,000 M_r(p41)タンパク質を検出する。同じ領域308〜322に対する別のMAbである5025、ならびにアミノ酸領域307〜328および308〜332に対するMAbは、p160またはp80を認識しない。MAb5023およびMAb5025は同じ合成ペプチドに対して惹起されたが、これらのMA bにより認識されるコアエピトープの構造に小さい相違があることが以前に示され、これがMAb5025の親和性よりも数倍高いMAb5023の親和性をもたらす原因である。試験した全てのMAbは、他の細胞膜抗原(乳癌におけるp45および婦人科の癌におけるp41)を認識した。p45およびp41が、それぞれp160およびp120の独立したタンパク質分解物またはプロセシングした産物を示すかどうかは確立されていない。 MAb5023は、乳癌細胞に進入し得、核に転移し得る唯一のMAbであったのて、p160 (およびp80)がMAbの内部移行に重要な特異的エピトープを発現するようである。細胞分画の間、細胞膜結合した¹²⁵I-MAb5023のクロマチンへの非特異吸着が除かれ得る。これは、P160、P80、およびp45、ならびにp120およびp41が細胞膜画分の特異マーカーを示しており、クロマチンにおいて見いだされないためである。 MAb5023が内部移行したが他のMAbは内部移行しなかったという事実は、細胞表面抗原に結合する抗体が内部移行のプロセスを誘導するに十分ではないことを示唆する。かわりに、細胞表面抗原の特異エピトープが含まれていなければならない。最近の観察は発明者らの以前の研究と一致し、腫瘍関連抗原に対して惹起された多くのMAbからの少しのみが内部移行するが、他は細胞に進入し得ないことが証明された。 MAb5023は細胞膜画分においておよびクロマチンにおいてp24を認識したが、他のMAbを全く認識しなかった。p24の主要バンドに加えて、クロマチンは弱いp23 バンドも発現する。クロマチンは、p160、p80、およびp45のトレース量を示さず、細胞分画の間、細胞質タンパク質のp24がクロマチンに非特異的に付着した可能性を排除する。発明者らは、p24が転移したMAb5023のクロマチンへの結合に関連し得ると考えている。p24は細胞表面上ならびに乳癌細胞および婦人科の癌の細胞のクロマチンにおいて発現された抗原を表すようである。p24の弱い発現はまた、黒色腫細胞における451のクロマチンにおいても観察された(図４Ｂ；レーン５)。Ｔリンパ球のクロマチンはp24/p23を発現しなかった。p24の低い発現がいくつかのＴリンパ球細胞株の原形質膜画分において検出可能であったことは注目すべきことである。MAb5023のp24への結合は、合成ペプチドのRIQRGPGRAFVTIG K(MAb5023がこれにより惹起された)により特異的に阻害された。乳癌抗原p160、p45(図５)、およびp24(データなし)がMAb5023により効果的に免疫沈降され、これは本来のエピトープもまたMAbにより認識されることを示唆する。タンパク質p80は免疫沈降されす、これはダイマー形態(p160)がMAb5023により認識されるエピトープを発現することを示唆する。得られた結果は、HIV-I gp120と乳癌および婦人科の癌の抗原との明確な免疫学的交差反応性を示す。最近、KhalifeらがHIV-Iビリオン感染因子(vif)とS.man soniの170 Mr表面抗原との間の免疫学的交差反応性を報告した。しかし、HIV-I 構造タンパク質とS.mansoni抗原との間の抗原交差反応性はない。乳癌抗原p160( およびそのモノマー形態p80)は、特に注意をするに値する。その認識はMAbの内部移行に重要であるエピトープを含有するようであるためである。内部移行した MAb5023は、アミノ酸308〜322(RIQRGPGRAFVTIGK)を含むHIV-I gp120の短い領域に対して惹起されたが、このMAbはさらに短いアミノ酸領域GRAFへ結合する。このコアエピトープはまた乳癌p160においても発現されなければならないようである。あるいは、gp160はHIV-I gp120と相同なコンホメーションエピトープを発現し得る。HIV-I gp120に対するMAbと交差反応性である、乳癌およびHIV-Iにおいて同様のM_rのタンパク質が、ヒト遺伝子またはレトロウイルス遺伝子の産物であるかどうかは、現在のところ知られていない。発明者らは、HIV-Iに非常に相同なレトロウイルスが乳癌において存在し得ると考える。乳癌p160およびそのgp12 0に対する免疫学的相同性の研究により、発明者らは、感染された細胞を貫通し得る抗体がヒトHIV感染の間に発現し得る可能性に焦点をあてる。非グリコシル化形態のgp120を認識し得るヒトHIV-I中和抗体の画分を示す、env-2-3に対する¹ ²⁵ I抗体の内部移行を試験した。env-2-3に対する抗体の画分を内部移行させ、そしてウエスタンブロッティングにおいて細胞膜上のp80およびp45を認識させた（図６）。この結果は、内部移行した抗体がAIDS患者により合成された抗体の画分を示すことを示唆する。HIV感染した細胞を貫通し得る抗体は、シンシチウム形成の阻害に、およびウイルスの中和の過程に重要な役割を演じ得る。 HIV-I交差反応性癌抗原の起源を決定するために行ったさらなる研究は、HIV-I に対して遺伝学的および免疫学的に相同性を有する女性癌ウイルス（Female Can cer Virus）が、乳癌および婦人科の癌で特異的に発現していることを示唆する。乳癌MCF7細胞株（図９Ａ、レーン１、２）および子宮頚癌SiHa細胞株（図９Ａ、レーン３、４）由来の、ならびに新鮮な子宮内膜癌（図９Ａ、レーン５、６）、子宮頚癌（図９Ａ、レーン７）、および卵巣癌（図９Ｂ）、または混合Muller ian腫瘍（図１０、レーン１、２）（DeBraekeleer Mら、Cancer Genet Cytogene t 、59(2)、135-137、1992．;Rakowicz-Szulczynska EMら、Nuclear Localizatio n o f Growth Factors and of Monoclonal Antibodies 、E.M．Rakowicz-Szulczynska 編、CRC Press、180-197頁、1993）由来の細胞質およびクロマチンタンパク質の、MAb抗−HIV-Iエンベロープタンパク質gp120とのウエスタンブロットハイブリダイゼーションは、HIV-Iのエンベロープタンパク質（p120、p42）、主要構造タンパク質（p24）、およびミリスチル化Gagタンパク質（p17）に対するサイズに相当する抗原p120、p42、p25、およびp17を示した。HIV-I中のエンベロープタンパク質の前駆体に相当する抗原p160はまた、混合Mullerian腫瘍（図１０）において、ならびに数種の乳癌細胞株（Rakowicz-Szulczynska EMら、Nuclear Local ization of Growth Factors and of Monoclonal Antibodies 、E.M．Rakowicz-Sz ulczynska編、CRC Press、180-197頁、1993；Rakowicz-Szulczynska EMら、Brea st Cancer Res Treatment 、1994）および婦人科の癌（Rakowicz-Szulczynska EM ら、Breast Cancer Res Treatment、1994；Rakowicz-Szulczynska EMら、Breast Cancer Res Treatment 、1994）において、より少量で検出可能であった。抗原p 160およびp120は、細胞質画分では選択的に検出されたが、タンパク質p42および p25は細胞質およびクロマチン画分の両方で検出された（図９および図１０）。正常卵巣組織（図９Ｂ）、皮膚、筋肉、正常子宮頚組織、および正常膣粘膜は、試験の結果ネガティブであり（図９Ｃ）、これは、MAb抗HIV-Iが選択的に癌と反応したことを示す。黒色腫、肺癌、および結腸癌もまた、MAb抗HIV-I gp120（Ra kowicz-Szulczynska EMら、Nuclear Localization of Growth Factors and of M onoclonal Antibodies 、E.M．Rakowicz-Szulczynska編、CRC Press、180-197頁、1993；Rakowicz-Szulczynska EMら、Breast Cancer Res Treatment、1994）と反応しなかった。これは、HIV交差反応性抗原が選択的に乳癌および婦人科の癌と結合することを証明する。癌細胞でp160、p120、p42、およびp24を認識するMAbは、HIV-I gp120の可変ループのアミノ酸配列308〜322（RIQRGPGRAFVTIGK）配列番号１に対して惹起され、そしてこのMAbは、エピトープGRAFに結合する（Durda PJ、Bacheler L、Claph am P、Jenowski AM、Leece B、Matthews TJ、McKnoght A、Pomerantz R、Rayner MおよびWeinhold KJ．AIDS Res Human Retroviruses、6、1115-1118、1988；La ngedijk JPM、Back NKT、Durda PJ、Goudsmit JおよびMeloen RH．J Gen Virol 、7 2、2519-2526、1991）。RAFの前のGは、癌抗原結合に重要である。なぜなら、RA Fを認識するがＧとの弱い相互作用を形成する他のMAbは、癌抗原を認識しないからである（Rakowicz-Szulczynska Eら、Antibody Immunoconj Radiopharm、6、2 09-219、1993）。MAb抗HIV-I gp120の癌細胞エピトープへの結合特異性を評価するために、MAbを惹起したペプチドRIQRGPGRAFVTIGK配列番号１の存在および非存在下でウエスタンブロットを行った。混合Mullerian腫瘍から単離した細胞質をS DSを含む10％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離し、PVDF膜にブロットし、そしてペプチドとプレインキュベートした（図１０Ｂ）あるいはプレインキュベートしなかった（図１０Ａ）抗HIV-I gp120 MAbに曝した。抗原p120、p42 、およびp25は、プレインキュベートしなかったMAb抗HIV-I gp120と強く反応したが（図１０Ａ）、ペプチドとプレインキュベートしたMAbとは反応しなかった（図１０Ｂ）。このように、ペプチドRIQRGPGRAFVTIGK配列番号１は、癌抗原に対するMAbの結合を競合的にブロックし（図１０Ｂ、レーン１、２）、これは、H IV-I gp120では、少なくともMAbにより認識されるエピトープGRAFもまた癌抗原中に存在しなければならないことを示す。MAb抗HIV-I gp120により認識される癌抗原の異種性は明らかではないままである。なぜなら、gp120およびその前駆体p 160のみがHIV-I感染した細胞から得られた抽出物中の同じMAbにより認識されたからである（図１０Ｃ）。このペプチドが全ての癌抗原（p160、p120、p42、およびp25）に対するMAb抗HIV-I gp120の結合をブロックしたので、非特異的相互作用が排除され得る。 HIV-Iゲノムと癌抗原との間のどの範囲の遺伝学的相同性が理解され得るかどうかを決定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を、HIV-I由来のプライマーを用いて、癌細胞由来のDNAで行った。２つのセットのプライマーは、MAb抗HI V-I gp120により認識される可変領域をコードする配列とは異なる領域に位置するHIV配列由来であった。第１のセットのプライマー（SK 68/SK 69）： SK 68（7801〜7820、領域gp41 Env）： SK 69（7922〜7942、領域gp41 Env）：は、HIV-Iのエンベロープタンパク質gp41の遺伝子由来の２つの20マーからなる（Laure F、Courgnaud V、Rouzioux C、Blanche S、Veber F、Burgard M、Jacom et C、Griscelli CおよびBrechot C．Lancet、2、538、1988）。第２のセットのプライマー（P1/P2）： P1（764〜786、領域Gag）： P2（1041〜1066、領域Gag）：は、HIV-IのGag遺伝子由来であった（Ou CY、Kwok S、Mitchell SW、Mack DH、S ninsky JJ、Krebs JW、Feorino P、Warfield DおよびSchochetman G．Science、 239、295、1988）。両方のセットのHIV由来プライマーは、HIV-I感染したリンパ球から、あるいは、乳癌MCF7、子宮頚癌SiHa細胞、子宮内膜癌、または外科手術中に得た混合Mullerian腫瘍からのいずれかから単離されたDNAの存在下でPCRを開始した（図１１）。ネガティブ反応が、正常皮膚から単離したコントロールDN Aで得られた（図１１）。非感染リンパ球から単離したDNAでのPCRは、報告されているようにネガティブであり（Laure Fら、Lancet、2、538、1988）、そして発明者らの研究でもネガティブであった（データを示していない）。プライマーSK 68/SK 69で得られたPCR産物は、MCF7、SiHa、および婦人科の癌のDNAの場合、テンプレートとして使用されたHIV感染細胞から単離したDNAの場合と、同じサイズ（約140bp）であった（図１１Ａ）。増幅したフラグメントの配列分析では、いかなる公知のヒト遺伝子とも顕著な相同性のない140bpの癌DNA を示した。140bpのうち、105bpは、試験した３つの癌の少なくとも２つと同一であり、そして53bpは３つの全ての癌で同一であった（図１２）。MCF7乳癌DNAの増幅領域の3'末端に位置する21bpは、HIV配列と同一であった（図１２）。SiHa 細胞DNAでは、21bpのうち20bpがHIV配列と同一であった。子宮内膜癌DNAでは、１9bpは、HIV-I配列と同一であり、2bpが異なり、そして2bpをHIV-I、MCF7、およびSiHaと相同な領域内に挿入した。第２のセットのプライマー（P1/P2-Gag由来）の存在下でのPCRにより増幅した DNAフラグメントは、HIV-I感染細胞から単離したDNAを用いて得た304bp長フラグメントと比較して、乳癌、子宮頚癌、および子宮内膜癌のDNAではわずか130bp長であり（図１１Ｂ）、そしてHIV-Iゲノムと限定された相同性を示した（データを示していない）。癌およびHIV-I配列との高い相同性があり、さらにHIV-I gp120の可変ループと癌抗原の免疫学的相同性がある、HIV-I gp41およびGag由来のプライマーの存在下での、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、および混合Mullerian腫瘍のDNA配列の増幅は、HIV-Iゲノムに相同なレトロウイルス配列が乳癌および婦人科の癌のDNAとともに組み込まれ得ることを、強く示唆した。細胞培養物中または新鮮な癌組織中のHIVの存在は、HIV-I p24がネガティブであると試験されたので、排除された。HIV-I Gag由来配列の存在下で増幅されたDNAフラグメントが、HIV-Iに組み込まれたDNAにおけるよりも癌DNAにおいてより短かったので、ヒト癌細胞のHIV感染は、完全に排除され得る。SiHa細胞株およびMDF7細胞株から単離したDNAの存在下で、外科手術中に得た子宮内膜癌から単離したDNAの存在下のように、同様のDNA配列が増幅されたという事実は、数種のヒト細胞培養物に関連するウイルスを有する細胞培養物の夾雑を排除した（Ilyin KV、Bykovsky AFおよびZhdanov VM．CA、32、89-96、1973；Porovic M、Kalyanaraman VS、Reitz MSおよびSarn gadharan MG．Am J Cancer、30、93-99、1982）。HIV-I関連ウイルスと関連のある女性癌の存在を確認するために、電子顕微鏡による研究をSiHa細胞およびMCF7 細胞で行った。 SiHa子宮頚癌細胞およびMCF7乳癌細胞の薄切片の電子顕微鏡分析は、細胞質中（図１２Ａ）、ならびに細胞の辺縁上（図１２Ｂ）および細胞外（図１２Ｃ）にある大きな膜被覆小胞（液胞）を示した。MAb抗HIV-I gp120での免疫−金染色で、細胞質中にある同様の大きな小胞を可視化した（図１２Ａ、Ｂ）。細胞表面、ならびに細胞内および細胞外粒子上の絨毛様構造の強い免疫−金標識もまた観察された（図１２Ｂ）。細胞表面に密着して存在する大きな細胞質小胞の断面（図１２Ｄ）の可視化により、小胞内にあるいくつかの卵形状のウイルス様粒子が示された。ウイルス様粒子はまた、細胞外液胞からの「出芽」であった（図１２Ｂ）。この粒子のサイズは、約120〜150nmであった。SiHaまたはMCF7細胞培養培地の超遠心分離（100,000g×１時間）により得られた膜被覆小胞の免疫−金染色は、膜で覆われた小胞の内部にある同様のウイルス様粒子を示した（図１２Ｅ）。精製したウイルス粒子のネガティブ染色を図１２Ｅに示す。ウイルスのサイズ（120n m）が示唆され得る。MAb抗gp120を有する単離したウイルス粒子の免疫−金標識は、HIV交差反応性癌抗原のウイルス起源についての仮説を強く支持し、そしてD NAレベルで観察される遺伝学的相同性に一致する。ウイルス様粒子の局在化の分析は、ウイルスが膜被覆小胞内で合成されるか、または合成後細胞質内液胞中に発芽するいずれかであることを強く示唆する。ここで、細胞質内液胞は、次いで細胞表面に分泌され、膜と融合し、そしてエキソサイト−シスによりウイルス粒子を放出する。ウイルス含有小胞のエキソサイト−シスは、非常に長い絨毛様構造とともに、癌細胞の特徴的な「半島（penlnsula）様」表面の形成に関与し得る。あるいは、そのままの小胞は細胞から除去され得、従ってウイルス粒子は表面から出芽される。通常細胞表面から出芽する、HIVおよび数種の他のウイルス（Levy JA．The Retroviridae、Plenum Press、1、2および3巻）とは異なり、癌関連ウイルス粒子は、細胞表面から直接出芽することが見出されていない。同一の球形状は、これらの粒子がＤタイプのウイルスを示し得ることを示唆した。Ｄレトロウイルスは、シミアンAIDSに関連しており、そして1970年に、捕獲したカニクイザルの天然に生じた乳癌から最初に単離された（Chopra HCおよびM ason MM．Cancer Res、30、2081-2086、1970）。いくつかの研究室が、樹立したヒト細胞株中のＤタイプのウイルスを証明した（Ilyin KV、Bykovsky AFおよびZ hdanov VM．CA、32、89-96、1973；Porovic M、Kalyanaraman VS、Reits MSおよびSarngadharan MG．Am J Cancer、30、93-99、1982）が、これらのウイルスの起源は確立されていない。子宮頚癌SiHa細胞および乳癌NCF7細胞でMAb抗HIV-I g p120を用いて検出される、ウイルス粒子の免疫−金標識は、同定したウイルスの HIVとの上記遺伝学的および免疫学的相同性を確証する。PCR分析が相同的配列を示し、そしてウエスタンブロット分析が子宮頚癌、乳癌、および子宮内膜癌の細胞株または患者から単離した混合Mullerian腫瘍で同一のタンパク質を示したので、レトロウイルスがヒト起源であることを示唆する。HIV様タンパク質gp120、 gp42、およびp25のヒト起源および癌との関連は、同一のタンパク質が、外科手術により得られたほとんどの卵巣癌、子宮頚癌、混合Mullerian癌、および外陰癌で、ならびに５つの異なる乳癌細胞株で見られたという事実により、強く支持されている（Rakowicz-Szulczynska EM、Kaczmarski W、Steimer KS、およびDur da PJ．レトロウイルス疾患に対する有効なツールとしての内部移行抗体、Nucle ar Localization of Growth Factors and of Monoclonal Antibodies 、E.M．Rak owicz-Szulczynska編、CRC Press、180-197頁、1993；Rakowicz-Szulczynska E 、Raso V、Kaczmarski W、およびDurda PJ．Antibody Immunoconj Radiopharm、 6、209-219、1993；Rakowicz-Szulczynska EM、McIntosh DG、およびSmith ML．Infect Dis Obstet Gynecol 、1994、印刷中；Rakowicz-Szulczynska EM、McInto sh DG、およびSmith ML．HIV-I中和抗体による癌増殖プロモーションのメカニズム、Breast Cancer Res Treatment、1994）。 MAb抗HIV-I gp120での乳癌細胞の標識は、免疫蛍光法を用いる場合にも観察された（Rakowicz-Szulczynska EM、Kaczmarski W、Steimer KS、およびDurda PJ ．レトロウイルス疾患に対する有効なツールとしての内部移行抗体、Nuclear Lo calization of Growth Factors and of Monoclonal Antibodies 、E.M．Rakowicz -Szulczynska編、CRC Press、180-197頁、1993）。細胞質および核の蛍光染色は非常に強く、これは、MAb抗HIV-I gp120が、HIV-I感染Ｔリンパ球によるのと同様に乳癌細胞により認識されそして内部移行されることの観察を確証した（Rako wicz-Szulczynska E、Raso V、Kaczmarski W、およびDurda PJ．Antibody Immun oconj Radiopharm 、6、209-219、1993）。同定したHIV交差反応性癌抗原が、細胞の悪性増殖に役割を演じるかどうかを評価するために、癌DNAの同定した配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成して、インビトロてSiHA細胞およびMCF7細胞を処理するために用いた (図１３)。HIV-I由来のプライマーを用いて増幅した癌DNA配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドRAK-I(21マー、5'-CCAGACTGTGAGTTGCAACAG-3')配列番号６、RAK-II（15マー、5'-CAACAGCCTACAACC-3'）配列番号７、およびRAK-I II（15マー、5'-TCTTCTAATCCCAAA-3'）配列番号８は、４日以内に細胞の成長をそれぞれ50、70および30％阻害した（図１３）。コントロールアンチセンスオリゴヌクレオチド（5'-TGTGACATCAGGCTCAAATC-3'）は、細胞増殖を阻害しなかった。この結果は、HIV関連癌抗原の発現が乳癌細胞および子宮頚癌細胞の増殖に重要であることを示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞培養物中の逆転写酵素の活性を95％阻害するので、同定したレトロウイルスが女性の癌の増殖プロモーションに重要な役割を演じることが示唆され得る。癌ウイルスは、HIVの種々の単離物に相同性を有するハイブリッドゲノムを含むようである。なぜなら、MAb抗HIV-I gp120が、HIV-I_IIIbのgp120可変ドメイン、および単離したHIV-I_ARV-2に由来するPCRプライマーSK 68/SK 69に対して惹起されたからである。HIV配列と同一の、乳癌、子宮頚癌、および子宮内膜癌DNAの 21bpセグメントは、種々のHIV-I株で非常によく保存されている。保存されたセグメントの前の配列は数種のHIV-I株にある程度相同性であった。 HIV様抗原p120、p42、およびp25は、乳癌および婦人科の癌で選択的に検出されたが、正常組織では検出されず、従って、女性の悪性腫瘍の独特のマーカーを示す。HIV交差反応性抗原の１つは乳癌患者の血液中で検出可能であり、自然発生の女性の悪性腫瘍の新規マーカーを示すようである。アンチセンスオリゴヌクレオチドRAK-I、II、およびIIIはインビトロで乳癌細胞および子宮頚癌細胞の増殖を阻害したので、新規女性癌ウイルス（Female Cancer Virus）は癌の診断、予後、および治療についての有望な標的を示す。本発明の特定の実施態様が例示の目的で本明細書中に記載されているが、種々の改変が本発明の意図および範囲から逸脱することなく行われ得ることが、上記から理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲に記載の以外に限定されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＶＧ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/569 Ｈ 33/569 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/21 ＡＤＹ // Ａ６１Ｋ 39/21 ＡＤＹ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的試料中のHIV-I交差反応性乳癌関連抗原を検出する方法であって、該抗原を含むと疑われる生物学的試料を、以下のファミリーの細胞膜タンパク質、p160、p80、p45、およびp24、ならびに以下のファミリーのクロマチンタンパク質、p24、の全てのメンバーを認識する抗体に曝す工程、および該抗体と該タンパク質とで形成される免疫複合体の存在を検出する工程であって、該細胞膜タンパク質およびクロマチンタンパク質が健常な生物学的試料中で検出され得ない工程、を包含し、ここで、該方法が該生物学的試料がHIV-I抗原を含まないことを保証するコントロールを包含する、方法。２．HIV-I交差反応性の婦人科の癌の関連抗原を検出するための請求項１に記載の方法であって、該抗原を含むと疑われる生物学的試料を、以下のファミリーの細胞膜タンパク質、p120、p41、およびp24、ならびに以下のファミリーのクロマチンタンパク質、p24、の全てのメンバーを認識する抗体に曝す工程、および該抗体と該タンパク質とで形成される免疫複合体の存在を検出する工程であって、該細胞膜タンパク質およびクロマチンタンパク質が健常な生物学的試料中で検出され得ない工程、を包含する方法。３．前記抗体が標識されている、請求項１または２に記載の方法。４．前記標識が、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、および発光物質からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。５．前記検出の工程が、酵素反応、蛍光、発光、または放射活性によるものである、請求項１または２に記載の方法。６．前記生物学的試料が、体分泌物、体液、および組織標本からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。７．前記生物学的試料が、前記抗体に曝す前に、ゲル電気泳動により分離される、請求項１または２に記載の方法。８．前記抗体がモノクローナル抗体5023である、請求項１または２に記載の方法。９．卵巣癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、および外陰癌からなる群より選択される婦人科の癌ならびに乳癌の治療のための、患者への薬学的に有効な投与形態でのモノクローナル抗体5023の使用。１０．前記モノクローナル抗体が放射活性リガンドまたは細胞障害性リガンドと結合されている、請求項９の使用。１１．乳癌細胞および婦人科の癌の細胞の増殖を阻害するHIV交差反応性抗原に結合するモノクローナル抗体5023を含む抗原−抗体複合体であって、 HIV抗原自体ではないがHIV交差反応性抗原である抗原に結合するモノクローナル抗体5023を含む、抗原−抗体複合体。１２．前記抗原が、以下の細胞膜タンパク質、p160、p80、p45、またはp24、あるいは、クロマチンタンパク質、p24、の１つである、請求項１１に記載の複合体。１３．固定化形態である、請求項１１に記載の複合体。１４．ニトロセルロース膜上に固定化されている、請求項１２に記載の複合体。１５．乳癌および婦人科の癌を診断する方法であって、該癌と関連する遺伝配列を含むと疑われる生物学的試料を、HIV-Iに相同なレトロウイルス配列の存在についてアッセイする工程であって、ここで、細胞膜タンパク質およびクロマチンタンパク質が健常な生物学的試料中に検出され得ない、工程を包含し、該方法が、調査中の該生物学的試料がHIV-I抗原自体を含まないことを保証するコントロールを包含する、方法。１６．前記配列がPCR増幅により決定される、請求項１５に記載の方法。１７．前記PCR増幅がHIV-I配列由来のプライマーにより生じる、請求項１５に記載の方法。１８．前記プライマーが、HIV-I gp120の可変領域、またはgp41から選択される、請求項１７に記載の方法。１９．前記プライマーが、配列番号２および３ならびに配列番号４および５からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。２０．乳癌細胞および婦人科の癌の細胞の増殖を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用であって、HIV-I交差反応性の癌抗原をコードする癌細胞のオリゴヌクレオチド配列を同定する工程、該癌細胞配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する工程、および該細胞を該オリゴヌクレオチドに曝す工程、を包含し、ここで、細胞膜タンパク質およびクロマチンタンパク質が健常な生物学的試料中に検出され得ない、方法。２１．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。２２．乳癌細胞および婦人科の癌の細胞の増殖を阻害する組成物であって、HIV- I交差反応性の抗原をコードする癌細胞配列のアンチセンスである、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、組成物。