MX2010014319A - Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv. - Google Patents
Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.Info
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Abstract
La presente invención trata sobre un ligando que comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) establecidas en SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 o secuencia que tiene ya sea el número de aminoácidos sustituidos dentro de dichas secuencias como se indica en lo siguiente, desde 0 a 3 en CDR1(SEQ ID No.1), desde 0 a 2 en CDR2(SEQ ID No.2), desde 0 a 2 en CDR3(SEQ ID No.3), desde 0 a 1 en CDR4 (SEQ ID No.4), desde 0 a 4 en CDR5 (SEQ ID No.5), desde 0 a 2 en CDR6 (SEQ ID No.6), o aminoácidos sustituidos con otros aminoácidos que tienen funciones y propiedades químicas equivalentes, dentro de dichas secuencias SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 6.
Description
USO TERAPÉUTICO DE LIGANDO ESPECÍFICO EN
ENFERMEDADES ASOCIADAS CON MSRV
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un ligando que despliega enlace importante a la molécula objetivo, el anti-ligando.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con la presente invención, el "anti-ligando" es la proteína MSRV- ENV (envolvente), MSRV para "retro virus asociado con la esclerosis múltiple (Perron, et al. (1997). "Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with m ltiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Múltiple Sclerosis." Proc Nati Acad Sci USA 94(14): 7583-8.). "Proteína MSRV-ENV " se debe entender como el producto de proteínas completo o parcial codificado por los genes MSRV env como se define en Komurian-Pradel, F, et al. (1999). Virology 260(1): 1-9,. y Rolland A, et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44 o cualquier molécula que imite las propiedades antigénicas o de enlace de MRSV-ENV (mimotopo). «ENV-T» corresponde a la proteína completa, que se detalla en el ejemplo 2 (residuos 1 a 542), y « ENV-SU » también nombrada ENV-1 corresponde a la secuencia S30 a K3 16 como se detalla en el ejemplo 2. Env-SU también está referida en Rolland A, et al. (2006) J Immunol
176(12): 7636-44. Como es usual para los retrovirus, MSRV, muestra variabilidad en su proteína de envolvente -ENV- (Perron, H et al. (2000) J Neurovirol 6: S67-75; Voisset, C, O. Bouton, et al. (2000) AIDS Res Hum Retroviruses 16(8): 73 1 -40). Los mimítopos que imitan los fragmentos de proteína parcial MSRV ENV han demostrado que existen y que se enlazan selectivamente por anticuerpos de pacientes con esclerosis múltiple (Jolivet-Reynaud, C, H. Perron, et al . (1999). "Specificities of múltiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93 (3): 283-93.
Más particularmente, el ligando de la presente invención comprende cada una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 o cualquier secuencia que tenga ya sea:
un número de aminoácidos sustituidos dentro de dichas secuencias como se indica en los siguiente, y que se sabe son factibles de obtener secuencias de aminoácidos funcionalmente equivalentes (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991 ; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993 ; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003): desde 0 a 3 en CDR1 (SEQ ID No. l), desde 0 a 2 en CDR2 (SEQ ID No. 2), desde 0 a 2 en CDR3 (SEQ ID No. 3), desde 0 a 1 en CDR4 (SEQ ID No. 4), desde 0 a 4 en CDR5 (SEQ ID No. 5), desde 0 a 2 en CDR6 (SEQ ID No. 6), o
- aminoácidos sustituidos con otros aminoácidos que tienen funciones y propiedades químicas equivalentes, como son bien conocidos por el individuo experto en la técnica (también llamada "similitud de aminoácidos") como se indica, por ejemplo, en la siguiente lista de aminoácidos similares (código de una letra): G o A, F o Y, D o E, N o Q, K o R o H, S o T, C o M, V o L o I, W o P, y/o sustituidos de acuerdo con el arte previo (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991 ; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al . 1992; Lamande and Bateman 1993 ; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003) dentro de dichas secuencias SEQ ID No. l a SEQ ID No. 6.
Estas variantes son el resultado de eliminaciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos en los péptidos de las SEQ ID Nos. 1 a 6 ya también se abarcan por la presente invención y pueden ser obtenidos por métodos conocidos en la técnica tales como por mutagénesis dirigida al sitio o por síntesis química.
Los ligandos de la presente invención tienen la capacidad de enlazar al antiligando de la presente invención.
De acuerdo con la presente invención, por la expresión "enlace" o "enlazar" se entenderá que el ligando reconoce significativamente el anti-ligando de acuerdo con los criterios dados en el ejemplo 5.
En otro aspecto de la invención, dicho ligando, comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 o cualquier secuencia que tenga al menos 80% de identidad y más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias, y un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que comprende las CDRs que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 o cualquier secuencia que tenga al menos 80% de identidad y más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias.
En un aspecto adicional el ligando de la invención comprende una región variable de cadena ligera (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que tenga al menos 75% de identidad y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90%) de identidad con dicha secuencia y una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No. 8 o cualquier secuencia que tenga al menos 75% de identidad y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencia.
Las variantes de estas secuencias VH y VL de acuerdo con la presente invención enlazan significativamente al antiligando.
"Identidad de secuencia" significa, por ejemplo, que en una secuencia que tiene 80% de identidad de secuencia, 80% de aminoácidos idénticos están presentes en la misma posición con la alineación de las secuencias, cuya alineación puede efectuarse por métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en Sequence - Evolution - Function Computational Approaches in Comparative genomics. Koonon E. et al., 2003 : Kluwer Academic Publishers o conforme a los parámetros por omisión del libro de instrucciones del software "Mac Vector" (UK).
El ligando de la presente invención también puede ser definido como que está comprendido dentro de una proteína recombinante scFV.
De acuerdo con aspectos adicionales de la invención, el ligando puede estar comprendido en un fragmento Fab, en un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, oligoclonal, quimerizado, preparado por ingeniería o un anticuerpo humanizado. En un aspecto particular de la invención, el anticuerpo que comprende el ligando es una IgG humana, y más particularmente una IgGl o una IgG4.
Los anticuerpos policlonales, oligoclonales, monoclonales pueden ser producidos por métodos clásicos tales como aquellos descritos por Kohler and Milstein (1975) o al usar los procedimientos descritos en Sambrook et al, A Guide to Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) al usar los anti-ligandos antes descritos.
Más particularmente, el anti-ligando de la presente invención que se usa para obtener los anticuerpos es el anti-ligando que consiste de SEQ ID No. 20 o de SEQ ID No. 32 o cualquier secuencia que tenga al menos 75% identidad de secuencia con las secuencias establecidas en SEQ ID No. 20 o SEQ ID No. 32 o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
En particular bajo la forma de un péptido ligado a la proteína portadora tal como albúmina de suero o KLH comúnmente usada para inmunización.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el ligando de la invención como un ingrediente activo. Este ligando también puede estar presente en la composición farmacéutica en la forma de un ScFv, un fragmento Fab o de un anticuerpo.
La composición farmacéutica de la invención se usa para tratar enfermedades asociadas con el MSRV.
Dentro del significado de la presente invención "tratamiento" abarca ya sea tratamientos curativos o profilácticos.
La composición farmacéutica de la presente invención se administra en cantidades que serán terapéuticamente efectivas e inmunogénicas como se conocen en la técnica, la dosificación que se administra depende del individuo que se trate.
En un aspecto adicional, la invención trata sobre un método de tratamiento que comprende administrar el ligando, el ScFv, el fragmento Fab o el anticuerpo o el ligando en cualquier vector molecular o terapéutico adecuado al mantener sus propiedades de enlace como se describen arriba o la composición farmacéutica como se describe anteriormente.
El método de tratamiento de la invención pretende el tratamiento de enfermedades asociadas con MSRV.
El MSRV, es un retrovirus humano que se aisló primero de pacientes con esclerosis múltiple (Perron, H., B . Lalande, et al. (1991 ), Lancet 337(8745): 862-3 ; Perron, EL, J. A. Garson, et al. (1997), Proc Nati Acad Sci USA 94(14) : 7583-8). Las enfermedades o síndromes asociados están definidos por la presencia en los pacientes correspondientes ya sea (i) de ARN específico de MSRV o antígenos, preferiblemente detectados en los fluidos corporales (sangre, fluido cerebrospinal, orina... ), ya sea (ii) de un número de copias elevado de ADN o ARN en células o tejidos de órganos con lesiones o disfunciones, ya sea (iii) de proteínas o antígenos específicos de MSRV en células o tejidos involucrados en el proceso de la enfermedad o del síndrome clínico, o (iv) de proteínas o antígenos de MSRV en fluidos corporales de individuos con la enfermedad o que expresan el síndrome clínico (como se describe en el ejemplo 8, ver a continuación y otros a continuación). Ya que el MSRV tiene homología genética con la familia del retroviral endógeno humano tipo W (HERV-W)
(Blond et al., 1999; Dolei, 2005; Dolei and Perron, 2008) también puede ser obtenida una definición alternativa o complementaria de enfermedades asociadas con MSRV con ácidos nucleicos, antígenos o proteínas de HERV-W o proteínas usadas para las mismas pruebas de detección (Antony et al., 2004; Arru et al., 2007; Karlsson et al., 2004; Mameli et al., 2007). Además, la expresión de MSRV puede asociarse con la sobreregulación de determinadas copias de HERV-W co-detectadas en lesiones patogénicas (Mameli et al., 2009). Así, la definición de enfermedades asociadas con MSRV comprende implícitamente la asociación con los elementos de HERV-W.
La enfermedad asociada con MSRV se selecciona del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome clínicamente aislado (CIS, con síntoma neurológico), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes tal como diabetes de tipo 1 o de tipo 2, cuando se asocia con inflamación o desregulación inmunitaria y con la presencia de productos de expresión de MSRV como se definen anteriormente.
En una modalidad en particular, el método de tratamiento de enfermedades asociadas con MSRV comprende la administración del anticuerpo IgG4 o IgGl como un tratamiento crónico con inyecciones regularmente repetidas.
En otro aspecto la invención trata sobre una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico de longitud completa establecida en SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
"Identidad de secuencia" significa, por ejemplo, que en una secuencia que tiene 80% identidad de secuencia, 80% de nucleótidos idénticos están presentes en la misma posición con la alineación de las secuencias, cuya alineación puede ser efectuada por métodos conocidos en la técnica, (ver anteriormente)
En una modalidad preferida del aspecto anterior de la invención, la molécula de ácido nucleico comprende cada una de las secuencias establecidas en SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 18 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
En un aspecto adicional de la invención, el ácido nucleico codifica una cadena VH, y más particularmente, está representado por SEQ ID No. 10 o 12 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más
preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma, sin limitación a los porcentajes previamente descritos de sustituciones, inserciones y eliminaciones que mantienen las propiedades antigénicas y de enlace de las moléculas originales del ligando o anti-ligando (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991 ; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993 ; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).
El secuencia de ácido nucleico puede también codificar una cadena VL que está representada por las secuencias SEQ ID No. 9 o 11 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma sin limitación a los porcentajes previamente descritos de sustituciones, inserciones y eliminaciones que mantienen las propiedades antigénicas y de enlace de las moléculas originales de ligando o anti-ligando (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991 ; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993 ; Verdoliva, Ruvo et al . 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).
Cualesquiera ácidos nucleicos que se hibridicen bajo condiciones de severidad con ácidos nucleicos que codifican al menos uno de los péptidos de acuerdo con la invención también se abarca por la invención. Como se usa en la presente, el término "condiciones de severidad" se refiere a las condiciones que permiten la hibridación entre las secuencias de sondas y la secuencia de nucleótidos a ser detectada. Las condiciones adecuadas de severidad se pueden definir mediante, por ejemplo, las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. En particular, la severidad se puede incrementar al reducir la concentración de sal, incrementar la concentración de formamida, o elevar la temperatura de hibridación. El intervalo de temperatura que corresponde a un nivel particular de severidad se puede estrechar además al calcular la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustar consecuentemente la temperatura. Las variaciones en los intervalos y condiciones anteriores son bien conocidas en la técnica.
La presente invención también se refiere a un gen quimérico que comprende, ligado funcionalmente uno con el otro, al menos un promotor el cual es funcional en un organismo hospedero, un ácido nucleico de acuerdo con la invención, y un elemento terminador que es funcional en el mismo organismo hospedero. Los diversos elementos que un gen quimérico puede comprender son primeramente, elementos que regulan la transcripción, traducción y maduración de proteínas, tales como un promotor, una secuencia que codifica un péptido de señal o un péptido de tránsito, un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación, y en segundo lugar, un polinucleótido que codifica una proteína. La expresión "ligado funcionalmente uno con el otro", significa que dichos elementos del gen quimérico se ligan uno con el otro en una forma tal que la función de uno de estos elementos se afecta por la del otro. A. manera de ejemplo, un promotor se liga funcionalmente a una secuencia de codificación cuando puede afectar la expresión de dicha secuencia de codificación. La construcción del gen quimérico de acuerdo con la invención y el ensamble de sus diversos elementos se puede llevar a cabo al usar técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, en particular aquellas descritas en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La elección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo hospedero en el cual deben funcionar, y aquellos expertos en la técnica pueden seleccionar elementos reguladores que son funcionales en un organismo hospedero dado. El término "funcional" se pretende que signifique capaz de funcionar en un organismo hospedero dado.
Los promotores los cuales puede contener el gen quimérico de acuerdo con la invención son ya sea constitutivos o inducibles. A manera de ejemplo, un promotor universalmente potente usado para la expresión en células de mamíferos es pCMV (promotor de citomegalovirus).
De acuerdo con la invención, el gen quimérico también puede comprender otras secuencias reguladoras, las cuales se localizan entre el promotor y la secuencia de codificación, tales como los activadores de la transcripción (potenciadores).
La presente invención también se refiere a un vector de clonación y/o expresión que comprende un gen quimérico de acuerdo con la invención. El vector de acuerdo con la invención es de uso para la transformación de un organismo hospedero y expresar en este organismo un ligando. Este vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus. Preferentemente, el vector de transformación de acuerdo con la invención es un plásmido. Generalmente, las cualidades principales de este vector debieran ser la capacidad de mantenerse por sí mismo y auto-replicar en las células del organismo hospedero, en particular en virtud de la presencia de un origen de replicación, y expresar un ligando en ello. Para el propósito de transformación estable de un organismo hospedero, el vector también puede integrarse en el genoma. La composición del vector luego puede ser limitada a los elementos requeridos para la síntesis del ligando en los hospederos. La elección de tal vector, y también las técnicas de inserción del gen quimérico de acuerdo con la invención dentro de este vector, se describen por completo en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y son parte del conocimiento general de aquellos expertos en la técnica. Ventajosamente, el vector usado en la presente invención también contiene, además del gen quimérico de acuerdo con la invención, un gen quimérico que codifica un marcador de selección. Este marcador de selección hace posible seleccionar los organismos hospederos los cuales se transforman efectivamente, es decir, aquellos los cuales incorporaron el vector. Se puede hacer mención de los genes que codifican enzimas fácilmente identificables tales como la enzima GUS, o genes que codifican pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en las células transformadas. Tales genes de marcador de selección son descritos en particular en las solicitudes de patente WO 91/02071 , WO 95/06128, WO 96/38567 y WO 97/04103.
La presente invención también se refiere a organismos hospederos transformados que contienen al menos un gen quimérico de acuerdo con la invención, ya sea integrado dentro de su genoma o llevado en un elemento genético extracromosomal, por ejemplo a plásmido. El término "organismo hospedero" se pretende que signifique cualquier organismo inferior o superior monocelular o pericelular dentro del cual el gen quimérico de acuerdo con la invención puede ser introducido con objeto de producir un ligando de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el organismo hospedero es células CHO (ovario de hámster chino) o HEK (riñon de epitelio humano).
La expresión "organismo hospedero transformado" se pretende que signifique un organismo hospedero que tiene incorporado dentro de su genoma, o en un elemento genético extracromosomal, por ejemplo un plásmido, al menos un gen quimérico de acuerdo con la invención, y produce consecuentemente un ligando en sus tejidos, o en un medio de cultivo. Para obtener los organismos hospederos de acuerdo con la invención, aquellos expertos en la técnica puede usar uno de los muchos métodos conocidos de transformación.
Uno de estos métodos consiste en traer las células o tejidos del organismo hospedero a ser transformado en contacto con polietilenglicol (PEG) y con los vectores de acuerdo con la invención (Chang and Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1 ), 11 1 -1 15; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503- 517). La electroporación es otro método, el cual consiste en someter a las células o tejidos a ser transformados y los vectores de la invención a un campo eléctrico (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1 ), 56-62). Otro método consiste en inyectar directamente los vectores dentro de las células o los tejidos por microinyección (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121 - 136). Ventajosamente, el método "biolístico" puede ser usado. Consiste en bombardear células o tejidos con partículas sobre las cuales los vectores de la invención son adsorbidos (Bruce et al., 1989, Proc. Nati . Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al ., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291 ; U.S. Pat. No. 4,945,050).
La invención también abarca un método para la producción del ligando, el ScFv, el fragmento Fab o los anticuerpos antes descritos que comprende la etapa de cultivar la célula hospedera antes descrita bajo condiciones que permitan la síntesis del ligando, fragmento Fab o anticuerpo.
El ligando de la invención se caracteriza por sus propiedades de enlace a un anti-ligando. En una forma específica el anti-ligando de la invención se caracteriza porque consiste de la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID No. 20, con selección preferida representada por SEQ ID N° 32.
Un método de detección en una muestra biológica del antiligando, al usar el ligando en la forma de un ScFv, un fragmento Fab o un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, también es parte de la presente invención. El método comprende las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra con el ligando de acuerdo con la invención, el ScFv, el fragmento Fab o un anticuerpo como se describe anteriormente,
(b) detectar la presencia de anti-ligando en la muestra.
Dicho método de detección se puede completar por una etapa adicional de poner en contacto la muestra con un ligando que enlaza específicamente al antígeno MSRV GAG, codificado por el gen MSRV como se describe en "Komurian-Pradel et al. Virology, 1999 ; 260(1 ), páginas 1 -9".
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también trata sobre un kit de inmunoensayo para la detección del anti-ligando en una muestra biológica, dicho kit que comprende un ligando de acuerdo con la invención, un ScFV, un fragmento Fab o un anticuerpo como se describe anteriormente, y reactivos para la detección de enlace específico de anti-ligando al ligando anterior, fragmento Fab o antígeno, dicho kit también que comprende todos los reactivos necesarios para la reacción inmunológica.
Dicho kit puede comprender adicionalmente un ligando que enlaza específicamente un antígeno GAG, como se define previamente.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también trata sobre el uso de tal kit de inmunoensayo, como se describe anteriormente, en la detección de una enfermedad asociada con MSRV seleccionada del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome clínicamente aislado, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes, y más particularmente diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.
La muestra biológica pueden ser sueros, orina, saliva, material de biopsia y los similares.
El diseño de inmunoensayos es convencional en la técnica y protocolos tales como el uso de soportes sólidos o inmunoprecipitación son técnicas bien conocidas. El anticuerpo puede ser etiquetado para propósitos de detección al usar etiquetas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o de colorantes. Los ensayos que amplifican las señales del complejo inmunitario tales como ensayos que usan biotina y avidina o estreptavidina e inmunoensayos ligados a enzimas tales como ELISA o ensayos de intercalado son parte de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: (A) secuencia de aminoácidos de VL, (B) secuencia de aminoácidos de VH, las secuencias CDR están subrayadas.
Figura 2: estructura de la proteína completa ENV (ENV-T) y fragmento de escisión de superficie (ENV 1 o ENV-SU)
Figura 3 : Medida de densidad óptica por colorimetría con sustrato de peroxidasa al comparar el ligando de anticuerpo murino GNb AC1 (IgGl murino perox) y fragmento recombinante de ScFv con Ligando (ScFv VH+VL biot) solamente.
La concentración del anticuerpo de recubrimiento y de cada ligando de detección fue de 5 µg/ml cada una; la dilución de estreptavidina-conjugado de peroxidasa fue 1/2000.
Figura 4: Medida de densidad óptica por colorimetría con sustrato de peroxidasa al comparar el anticuerpo murino GNb AC1. Ligando y fragmento de enlace de Fab solamente con Ligando. La concentración de cada Ligando de detección o IgGl fue 10µg/ml + anti-Fab o anti-IgG de peroxidasa Jackson diluida a 1/250. Se probaron diferentes concentraciones de ENV-T.
Figura 5: Prueba de GNbACl y anticuerpos quiméricos IgGl e IgG4 de acuerdo con la invención en la dilución en serie de antígeno ENV (ENV-T). La concentración de anticuerpos fue de 1 mg/ml y el anti IgG 1/250 de anticuerpo etiquetado con peroxidasa secundaria. El anticuerpo 2G5E12 es un anticuerpo irrelevante que no enlaza al antígeno ENV, usado aquí como un control negativo.
Figura 6: Prueba de GNbACl y construcciones quiméricas IgGl e IgG4 en una concentración constante de antígeno (ENV-T) en dos lotes de ligandos (A) lote 1 , (B) lote 2. La concentración de antígeno fue de 1 a 0.0078 de anticuerpo original murino monoclonal (GNb AC1 ), indicado como muIgG, los constructos humanos IgGl o IgG4 con el ligando (indicados como µg/ml de huIgGl y huIgG4. La dilución de anticuerpo secundario anti-ratón Jackson o IgG anti-humano fue: 1/250.
Figura 7: Constructos GNbACl , ScFv, IgGl e IgG4 quiméricos humanos con Ligando: inhibición de la actividad pro-inflamatoria de PBMCs por el antígeno ENV (ENV SU) como se representa por la reducción de IL-6. La relación entre el anticuerpo o ScFv y el antígeno ENV fue 25/1.
Figura 8: Resultados ApoH-ELISA. Sueros del estudio europeo de multicentros sobre Esclerosis múltiple se probaron de forma ciega en un laboratorio independiente.
Figura 9: Antigenemia de MSRV-ENV y GAG en pacientes con esquizofrenia y controles. Los anticuerpos usados son 2A12A5 y 6A2B2 para ENV y 2G5E12 para GAG.
Figura 10: Densidad óptica (OD) de ApoH-ELISA para la detección de antígeno MSRV-ENV con anticuerpo monoclonal específico 6A2B2.
Figura 11: Seguimiento clínico de ratones humanizados SCID que desarrollan neuroinflamación aguda y desmielinización (encefalomielitis experimental alérgica, un modelo animal de esclerosis múltiple): comparación del resultado clínico de grupos tratados con diferentes anticuerpos en comparación con los grupos no tratados. El anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC 1 ) se indica como muIgG, los constructos humanos IgGl o IgG4 con el ligando se indican como huIgGl y huIgG4.
Figura 12: curvas de supervivencia de ratones humanizados SCID que desarrollan neuroinflamación aguda y desmielinización (encefalomielitis alérgica experimental, y modelo animal de Esclerosis múltiple): comparación del resultado clínico de grupos tratados con diferentes anticuerpos en comparación con los grupos no tratados. El anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1) se indica como muIgG, los constructos humanos de IgGl o IgG4 con el ligando se indican como huIgGl y huIgG4.
Figura 13: Curvas de peso de cada ratón NOD-SCID probado en el experimento actual.
La dosis de la proteína ENV inyectada para cada ratón se indica en paréntesis. La última inyección de proteína ENV emulsificada en IFA y PTX (P 14) se indica por la flecha. Los ratones se nombraron MI a M6, de acuerdo con la dosis de ENV que recibieron, lo cual se indica a continuación del código entre paréntesis (desde 0 a 20 microgramos) en la leyenda gráfica. La interrupción de las curvas corresponde al día de la muerte del animal en la categoría correspondiente.
Figura 14: Concentraciones de glucosa en sangre (glicemia) en ratones de control (control) y NOD-SCID inyectados con ENV (ENV): comparación entre el día de la primera inyección (PO) y una semana después de la última inyección (P30). La glicemia medida en P30 es expresada como un porcentaje de aquella medida en PO (eje Y) en grupos inyectados con ENV e inyectados con imitación (eje: -Controles y "ENV").
Figura 15: Definición de la CDR de la cadena pesada de anticuerpo GNb AC1 :
15A: Los aminoácidos identificados de acuerdo con la definición de Chothia se presentan con tipo de letra pequeña. Los aminoácidos identificados de acuerdo con la definición de Kabat se presentan con letras subrayadas.
15B: De acuerdo con la definición preferida que combina tanto la determinación, las regiones CDR murinas originales a considerarse para el ligando funcional que se injertan en la cadena pesada variable de anticuerpo humano IgG4 están subrayadas.
Figura 16: Definición de la CDR de cadena ligera de anticuerpo GNb
AC1.
CDR identificada de acuerdo con la definición Kabat está subrayada.
CDR identificada de acuerdo con la definición de Contacto (no estándar) tiene letras minúsculas.
Figura 17: Actividad de enlace de anticuerpo quimérico GNb AC1 a la proteína inmovilizada ENV. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la medida de densidad óptica (OD) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo enlazada a la proteína objetivo ENV. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para el recubrimiento de los pozos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de proteína correspondiente inmovilizada en placas.
Figura 18: Actividad de enlace de anticuerpo humanizado H2/VK3 a la ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la medida de densidad óptica (OD) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo enlazada a la proteína objetivo ENV. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para el recubrimiento de los pozos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de proteína correspondiente inmovilizada en placas de la proteína correspondiente inmovilizada en placas.
Figura 19: Actividad de enlace de anticuerpo humanizado H4A/K3 a ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El ej e Y representa la medida de densidad óptica (OD) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo enlazada a la proteína objetivo ENV. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para el recubrimiento de los pozos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de proteína correspondiente inmovilizada en placas.
Figura 20: Comparación de la actividad de enlace de anticuerpo hum anizadoH2 A/K3 (H2vk3) y anticuerpo quimérico (GNbAC l IgG4) con ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la medida de densidad óptica (OD) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo enlazada a la proteína objetivo ENV. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para el recubrimiento de los pozos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de proteína correspondiente inmovilizada en placas.
Figura 21 : Anticuerpo purificado H2V 3 en gel no reductor. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. A la izquierda, los números D indican los niveles (barras) a los cuales las proteínas estándar con peso molecular definido (KD) han migrado en el gel, como se muestra en la pista izquierda de la imagen. El anticuerpo purificado H2A/K3 se muestra (flecha) como una banda sencilla en la pista media de la imagen, con albúmina de suero de bovino (estándar en las soluciones amortiguadoras de anticuerpos, como un control que se muestra por una flecha a un peso molecular diferentes), que se muestra en la pista izquierda de la imagen;
Figura 22: Comparación de las actividades de enlace de H2A/K3 purificado (hH2+hVK3 purificados) y anticuerpo quimérico purificado (GNbACl IgG4) a ENV inmovilizada (0.5 microg/ml).
El eje X representa la concentración del anticuerpo IgG4 quimérico o seleccionado humanizado en nanog/ml. El eje Y representa la densidad óptica medida por colorimetría, que correlaciona la cantidad de anticuerpo enlazado a la concentración constante inmovilizada de proteína ENV en el ensayo.
Figura 23 : Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada H2 y la cadena ligera VK3 del anticuerpo humanizado.
Los aminoácidos en las letras negritas en superíndice representan aminoácidos murinos mantenidos en la estructura, con base en su posición de consenso con secuencias humanas de anticuerpo analizadas en bases de datos.
Figura 24 : Citoquinas pro-inflamatorias se sobre regulan fuertemente por la estimulación de células de astrocitos con proteínas relacionadas con ENV HERV-W. Los resultados se presentan como la media de valores por triplicado. ENV: MSRV-ENV; Sincitina: HERV-W ENV de la copia del cromosoma 7q; X: anticuerpo irrelevante (isotipo de control); anti-ENV murino: anticuerpo murino GNb AC1 ; anti-ENV quimérico: IgG4 humano quimérico de GNb AC1 ; Pg/ml: Picogramos por Mililitro.
Figura 25: Cultivos de células mononucleares de sangre periférica Los resultados se presentan como la media de valores por triplicado.
ENV: MSRV-ENV; Sincitina: HERV-W ENV de la copia del cromosoma 7q; X: anticuerpo irrelevante (isotipo de control); anti-ENV murino: anticuerpo murino GNb AC1 ; anti-ENV quimérico: IgG4 humano quimérico de GNb AC1 ; Pg/ml: Picogramos por Mililitro
Figura 26: Detección de proteínas ENV HERV-W relacionadas glicosiladas humanas con tres formas del ligando GNb AC 1 (anticuerpo murino, quimérico y humanizado). A) Detección de proteínas ENV HERV-W relacionadas glicosiladas humanas con el anticuerpo murino GNb AC1. B): Detección de proteínas ENV HERV-W relacionadas glicosiladas humanas con el anticuerpo quimérico GNb AC1 ; C): Detección de proteínas ENV HERV-W relacionadas glicosiladas humanas con el anticuerpo humanizado. Eje Y: Densidad óptica; Eje X: proteína bacteriana MSRV-ENV (lote ENV-T 7A); fragmento de superficie bacteriana MSRV-ENV (lote ENV-SU4A); Sincitina glicosilada humana; proteína MSRV-ENV glicosilada humana (lote ENV-T P l).
Figura 27: Calificación de neuro comportamiento de ratas inyectadas intracerebralmente con MSRV ENV de solución de imitación (simulado):
Horizontal —representado por líneas cruzadas en el eje Y- (A) y vertical -representado por crías en el eje Y- (B) actividad locomotora después de la exposición a novedad en diversos puntos de tiempo después de la inyección intracerebral (P5, P6, P7, Pl l y P 12) en simulado (solución PBS), ratas con ENV-icv (ventrículos intracerebrales inyectados con ENV) y ENV-hipp.
Figura 28: Calificación de neuro-comportamiento de ratas inyectadas intracerebralmente con MSRV ENV de solución de imitación (simulado) :
Horizontal -representado en el eje Y por el número de líneas cruzadas- (A) y vertical -representado en el eje Y por el número de crías-(B) actividad locomotora después de inyección salina en simulado, ratas de ENV-icv y ENV-hipp a PH .
Figura 29: Calificación de neuro comportamiento de ratas inyectadas intracerebralmente con MSRV ENV de solución de imitación (simulado):
Horizontal -representado en el eje Y por el número de líneas cruzadas- (A) y vertical—representado en el eje Y por el número de crías-(B) actividad locomotora después de tensión en restricción en simulado, ratas ENV-icv y ENV-hipp en P 13.
Figura 30: Calificación de neuro-comportamiento de ratas inyectadas intracerebralmente con MSRV ENV que muestran el efecto terapéutico del ligando IgG4 GNbAC l . :
(A) Actividad locomotora horizontal medida en un campo abierto después de la exposición a novedad en P 12 y en P32—como se indica en el eje X- en ratas simuladas, ratas no tratadas inyectadas con ENV (ENV+), y ratas ENV+ tratadas con IgG4, como se indica en la leyenda.
(B) Confirmación del efecto terapéutico del ligando IgG4 observado en
P32 con actividad locomotora horizontal después de tensión por restricción; se mide -número de líneas cruzadas en el eje Y- en un campo abierto después de una tensión por restricción después de la inyección sistémica de consulta de la proteína ENV en ratas con simulado, ratas ENV+ sin tratar y ratas ENV+ tratadas con IgG4, como se indica en el eje X.
Figura 31 : Estudio de ratones sin pelo injertados con linfoma "ENV-positivo" que muestra el efecto terapéutico del ligando IgGl GNbAC l
El índice esplénico (eje Y) se calculó en ratones tratados con control e IgGl (eje X) 19 días después de la inyección de Células de linfoma. El índice esplénico se calculó como sigue: [(peso del bazo/peso corporal) x 100] . Barras de error sin traslape indican importancia estadística.
Figura 32: Estudio de ratones SCID injertados con linfoma "positivo a ENV" que muestra el efecto terapéutico del ligando IgGl GNbACl .
La relación de bazo/peso del cuerpo (eje "Y") calculada en ratones SCID sin tratar y tratados con IgGl 7 días después de la inyección de células B de linfoma. La relación de bazo/peso del cuerpo se calculó como sigue: [(peso del bazo/peso del cuerpo) x 100].
Figura 33 : Estudio de ratones SCID injertados con linfoma "positivo a ENV" que muestra el efecto terapéutico del Ligando IgGl GNbACl
Número de células linfoblastoides viables y muertas -eje Y- (A), y de otras células de glóbulos blancos (B) en el fluido peritoneal recolectado en ratones tratados con control e IgGl - eje X-, 7 días después de la inyección de células de linfoma y 6 días después de la inyección del anticuerpo.
Los siguientes ej emplos sirven para ilustrar la invención sin limitar en ninguna forma la presente invención.
Ejemplos
EJEMPLO 1 : Análisis de anticuerpo específico de murino (GNbACl) : identificación de la secuencia y estructura de un ligando molecular específico para proteína MSRV ENV y sus equivalentes.
Un hibridoma de murino se obtuvo después de la fusión de mieloma de ratón y células esplénicas de un ratón Balb-C inmunizado con una proteína MSRV recombinante producida en E. coli y purificada de un clon MSRV "ENV", como se describe en 'Komurian-Pradel, F., G. Paranhos-Baccala, et al. (1999), Virology 260(1 ) : 1 -9).
La amplificación PCR de regiones VH y VL de este IgG l/Kappa (GNbAC l ) que produce hibridoma se hizo de acuerdo al siguiente protocolo .
Los Poly(A+) ARN se extrajeron y purificaron de 5x107 células de hibridoma que producen IgGl /Kappa usando un kit de purificación mARN (Amersham Bioscience) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó desde 800 ng mARN usando un kit RT-PCR (Amersham Bioscience) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias del gen de región variable que codifica el ADNc de cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) se obtuvieron usando la amplificación rápida del método de los extremos ADNc (RACE), como se describe previamente (Ruberti et al., 1994, J. Immunol. Methods 173, 33-39).
El cebador delantero fue el siguiente SEQ ID No. 21 (RACEdelantero), cebadores traseros fueron los siguientes: SEQ ID No. 22 (CL_Alal 30_Fwd) amplificación VL, y SEQ ID No. 23 (CHl_Prol 19_Fwd) para amplificación VH, con el código de letras R = A/G, K = G/T, H = A/T/C. Los cebadores traseros CL_Alal 30_Trasero y CHl_Prol 19_Trasero, se deducen de secuencias de consenso publicadas por Kabat et al. (1991 ) Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD), son específicos de extremidades de terminal N de dominio kappa/CL de ratón y dominio IgG/CH l , respectivamente.
Los productos PCR se obtuvieron usando la polimerasa ADN Taq y directamente ligados en el vector pCR®2.1-TOPO® usando un kit de clonación TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ADN clonados se determinaron al procesar por secuencia en secuenciador automático ABI310 usando un Kit de Reacción Listo para Procesamiento por Secuencia del Ciclo Terminador del Pigmento (Applied Biosystems).
Estas amplificaciones PCR, seguidas por las etapas de clonación y procesado por secuencia proporcionan las secuencias de cadenas VL y VH como se representa SEQ ID No. 7 y 8, respectivamente, por sus secuencias de aminoácido deducidas de las secuencias de nucleótido originales.
Además, el análisis de estas secuencias de aminoácido han permitido la identificación de las regiones que determinan la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) involucradas en la especificidad del ligando (de acuerdo con Kabat (Wu and Kabat 1970, An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132:21 1 -250; Kabat et al. 1987, 1991 , Sequences of proteins of immunological interest; 4a edición. Impresión Oficial del Gobierno de E.U.A. No.165-492) o por estructura de acuerdo con Chothia (Chofhia and Lesk 1987, Canonical structures for the hypervahable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196:901 -917; Chothia et al. 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342: 877-883).
Las tres secuencias CDR se identifican en la secuencia de aminoácido VH (Figura IB) y corresponden a SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID NO. 6 y tres secuencias CDR se identifican en la secuencia de aminoácido VL (Figura 1A) corresponden a SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 y SEQ ID NO. 3. Estas seis secuencias CDR representan las secuencias "mínimas" del núcleo requeridas para la especificidad de enlace del ligando y, por lo tanto, están compuestas en cualquier composición o constructo molecular que mantiene la actividad del ligando específico identificado actualmente. Sin embargo, se conoce de los expertos en la técnica que pocos aminoácidos pueden sustituirse con propiedades equivalentes, de esta manera mantienen la especificidad de las secuencias del ligando originales y hacen un ligando equivalente. Tales variaciones se conocen para ser posibles dentro de un intervalo máximo de 10-12 %.
EJEMPLO 2 : Ejemplo de un antígeno MSRV ENV, producción y purificación para inmunización de ratón con objeto de obtener esplenocitos reactivos anti-ENV para la generación de hibridomas específicos:
Fuente: El plásmido pV14 de virus MSRV (Perron, Jouvin-Marche et al. 2001) que comprende la secuencia de proteína correspondiente al número de acceso a la base de Datos (NCBI-Entrez/Genbank): AF331500.1 , La Figura 2 representa la estructura de la proteína ENV completa (ENV-T, SEQ ID No. 19) y fragmento de desdoblamiento de superficie (ENV 1 o ENV-SU, SEQ ID No.24). En la Figura 2 el péptido de señal inicia en el residuo #1 (Metionina) y finaliza en el residuos #29 (Treonina).
Método de producción:
Después de la ligación de la secuencia de codificación ENV-T proporcionada por Geneart (EUA) en el plásmido de expresión el vector de expresión pET- 15b suministrado por Novagen (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, ESTADOS UNIDOS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor y transformación de la cepa BL21 E. coli de las bacterias por permeabilización CaC12 clásica como se describe en "DNA Isolation and
Sequencing" (Essential Techniques Series) por Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree and Akbar S . Khan Publicada por John Wiley & Sons, ISBN 0-471 -97324-0 QP625. N89R64 1 996 John Wiley & Sons y en "Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course (Paperback) por Katharine G. Field (Autor), Walt Ream (Autor), las bacterias transformadas se hacen crecer en medio LB en presencia de 30µg/mL canamicina a 37°C hasta la densidad óptica.
La expresión de la proteína luego se induce por IPTG 1 mM y el cultivo continua después a 37°C durante 4 horas.
Método de extracción:
Después de la centrifugación a 5000 g 20 minutos 4°C, el peletizado bacteriano se vuelve a suspender en 20 mL/L de cultivo de solución amortiguadora de lisis (Tris 20mM pH 7.5; NaCl 0.15M; leupeptina 1 µg/mL, pepstatina 1 µg/mL, PMSF 1 mM, MgC12 2mM, lisozima 50µg/mL). La solución se incuba 30 min a 4°C con agitación y luego se sónica en hielo/etanol (4 etapas de 7 min a 80% 0.5). DNasa 1 mM se agrega y la solución se incuba una hora a 4°C con agitación. La suspensión se centrifuga a 40 000 g durante 30 min a 4°C.
El peletizado se vuelve a suspender en 7.5mL/L de cultivo de una solución amortiguadora de solubilización (Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, urea 2M, SDS 1 ,5%, Pmercaptoetanol 50mM). La solución se incuba 2 horas a 8°C con agitación. La suspensión luego se centrifuga a 40 OOOg durante 30 min a l O°C.
Método de purificación:
El sobrenadante de urea' se diluye 5 veces en una solución amortiguadora Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1 ,5%.
La purificación se realiza en 1 mL/L de cultivo por cromatografía de afinidad con Columna de Flujo Rápida de Sefarosa Ni (Amersham BioScience). El sobrenadante se carga en 2mL/mn en la resina después del equilibrio con una solución amortiguadora Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, urea 500mM, SDS 1 ,5%, ß-mercaptoetanol l OmM. La elución de Env se realiza por etapas en Imidazol 30 y 50mM. La purificación se realiza con columna desalada (Amersham BioScience, 25mL de resina). El grupo de la cromatografía de afinidad se carga en 2mL/min en la resina después del equilibrio con una solución amortiguadora Tris 20mM pH7.5, NaCl 150mM, SDS 1 ,5%, DTT l OmM. Las proteínas se eluyen con la misma solución amortiguadora.
Después de eso, las proteínas se cargan en 1 mL/min en filtración de gel Superdex 200 (Amersham Bioscience) equilibrado con solución amortiguadora Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1 ,5%, DTT l OmM. Las proteínas se eluyen con la misma solución amortiguadora.
Eliminación de endotoxinas:
La purificación se realiza con columna Acticlean (Amersham Bioscience, 8mL dé resina). El grupo se carga en 1 mL/min en la resina después de equilibrio con una solución amortiguadora Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1 ,5%, DTT l OmM. Las proteínas se eluyen con la misma solución amortiguadora.
Controles de calidad del lote
- Espectroscopia de masas MALDI-TOFF: no puede usarse debido al
SDS.
- Procesamiento por secuencia de Terminal N: ALPYXTFLFT
- Ensayo de endotoxinas: < 5 UE/mL
Características del lote:
Solubilidad aparente: 100%
Pureza: > 90 %
Concentración: 0,05 mg/ml
Almacenamiento: -80°C
Cantidad: 1 ,5 mg
Solución amortiguadora: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, SDS 1 ,5%, DTT lOmM
EJEMPLO 3 : Evidencia in vitro de la actividad de enlace del ligando específica para antígeno MSRV ENV:
I- Objetivo
Hemos evaluado la afinidad del ligando para el anti-ligando recombinante bajo la forma de una proteína recombinante ScFv de secuencias VH+VL clonadas, o bajo la forma de un fragmento Fab desdoblado del GNbACl de murino original (que contiene cadenas VH+VL desdobladas desprovistas de la función y estructura del anticuerpo de murino) por técnicas de inmunoensayo (ELISA). Este ligando se comparó con el GNbAC l de murino original, y con los constructos moleculares que insertan el ligando en cadenas constantes IgGl o IgG4 humano y secuencias apropiadas para su uso como vectores farmacológicos.
II- Material y métodos
a Clonación VH y VL:
Clonación y procesamiento por secuencia de nucleótido de región variable GNb AC 1 de cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH)
Los Poly(A+) ARN se extrajeron y purificaron de 5x107 células de hibridoma que producen anticuerpo GNb AC 1 usando un kit de purificación mARN (Amersham Bioscience) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó desde 800 ng mARN usando un kit RT-PCR (Amersham Bioscience) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Las secuencias del gen de región variable que codifica el ADNc de cadenas ligeras (VL) y pesadas (VH) se obtuvieron usando la amplificación rápida del método de extremos ADNc (RACE), como se describe previamente (Ruberti et al., 1994, The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V región primers fail. J. Immunol. Methods 173, 33-39). El cebador delantero fue el siguiente: aléro RACE, (SEQ ID No. 21). Los cebadores traseros fueron los siguientes: CL_Alal 30_retour (SEQ ID No. 25) para amplificación VL, y CHl_Pro l 19_retour (SEQ ID No. 26) para amplificación VH, con el código de letras R = A/G, K = G/T, H = A/T/C.
Los cebadores traseros CL_Alal 30_retour y CHl_Prol l 9_retour, se deducen de secuencias de consenso publicadas por Kabat et al. (1991, Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD), son específicos de extremidades de terminal N de dominio kappa/CL de ratón y dominio IgG/CHl, respectivamente.
Los productos PCR se obtuvieron usando la polimerasa ADN Taq y directamente ligados en el vector pCR®2.1-TOPO® usando un kit de clonación TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ADN clonados se determinaron al procesar por secuencia en secuenciador automático ABI310 usando un Kit de Reacción Listo para
Procesamiento por Secuencia del Ciclo Terminador del Pigmento (Applied Biosystems).
b) Construcción y expresión ScFv:
El ScFV se obtuvo de acuerdo con técnicas descritas en "Mallano A, et al. 2008, Generation and characterization of a human single-chain fragment variable (scFv) antibody against cytosine deaminase from Yeast. M. BMC Biotechnol. Sep 10;8 :68".
c) Fab de anticuerpo GNb AC 1
El Fab se obtuvo de acuerdo con técnicas descritas en "Lefranc G , Lefranc M P . Antibody engineering and perspectives in therapy.Biochimie. 1990 Sep;72(9):639-51. »
II-l Material
H-l a Anticuerpos monoclonales
El ligando, constructos moleculares IgG humanos o GNbACl se produjeron y purificaron en las siguientes concentraciones:
Tabla 1 : Concentración del ligando diferente, ScFV, Fab y anticuerpos
Nombre Concentración
GNbACl 5.91/ml
Ligando en IgGl humano lmg/ml
Ligando en IgG4 humano 2mg/ml
Fab de murino lmg/ml
ScFv recombinante lmg/ml
H-lb Proteínas recombinantes
Tanto la proteína ENV completa MSRV (ENV-T) y las proteínas recombinantes del fragmento de dominio de superficie (ENV-SU), se produjeron por el Experto de Proteína en E. coli y purificaron además como se describe en el ejemplo 2.
Tabla 2: Concentración de las proteínas recombinantes
II-lc ELISA de intercalado
- Los micropozos se recubrieron con 100 µ? por pozo de un anticuerpo de captura anti-ENV (3 C1 D5, proporcionado por bioMérieux) diluido en
Bicarbonato de sodio 50mM, pH 9.6. Se sella la placa y una noche a 4°C.
- Los micropozos se lavaron 3 veces con 250µ1 por pozo de PBST 0.05% (Solución salina amortiguada de fosfato con 0.05% de Tween20; Sigma P7949). Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 200µ1 por pozo de PBST 0.05% + leche al 5% se agregaron. Las placas se sellaron e incubaron 1 hora a AT bajo agitación ligera.
- Los micropozos se lavaron 3 veces con 250microl por pozo de PBST 0.05%. Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- Los micropozos se incubaron con ? ??µ? por pozo de antígeno ENV (ENV-T o ENV-SU) diluidos en PB ST 0.05%. Las placas se sellaron e incubaron 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación ligera.
- Los micropozos se lavaron 3 veces con 250µ1 por pozo de PBST 0.05%. Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 100 µ? por pozo de anticuerpo detección (GNbAC l o ScFv de fragmento recombinante) diluido en PBST 0.05% + leche al 5% se agregaron. Las placas se sellaron e incubaron 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación ligera. El GNbAC l fue peroxidasa etiquetada y S cFv biotina etiquetada por Squarix, Alemania.
- Los micropozos se lavaron 4 veces con 250 µ? por pozo de PB ST 0.05%. Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 100 µ? por pozo de solución de sustrato (1 comprimido de o- Fenilendiamina (OPD) diluido en 10ml de Solución amortiguadora de Citrato de Fosfato 0.05M pH5 + ? ?µ? H202 30% (prepara al último
momento) se agregaron. Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- 50 µ? por pozo de solución de paro H2S04 2N se agregaron.
- La absorbancia se leyó en 490nm dentro de 30 minutos de reacción de paro.
II- I d ELISA directa en microplacas recubiertas con antígeno ENV ÍENV-T o ENV-SU como se describen anteriormente)
- Los micropozos se recubrieron con ? ??µ? por pozo de antígeno ENV diluido en Bicarbonato de sodio 50mM, pH 9.6. Las placas se sellaron e incubaron 2 horas a 37°C bajo agitación ligera.
- Los micropozos se lavaron 4 veces con 250 µ? por pozo de PBS (Solución salina amortiguada de fosfato). Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 100 µ? por pozo de anticuerpo detección de acuerdo con la presente invención (GNbACl o su fragmento Fab) diluido en PBS + BSA 1 % (PBS con 1 % de Albúmina de Suero de Bovino) se agregaron. Las placas se sellaron e incubaron 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación ligera.
- Los micropozos se lavaron 4 veces con 250 µ? por pozo de PBS.
Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 100 µ? por pozo de anticuerpo de detección secundario diluido en PBS + BSA 1 % (anti IgG Jackson - diluido 1 /250; cualquier, IgG anti
humano perox Jackson 1 15-035- 146 o, IgG anti ratón perox Jackson U SOS 5-062, en suficiencia con' el anticuerpo primario) se agregaron. Las placas se sellaron e incubaron 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación ligera.
- Los micropozos se lavaron 6 veces con 250 µ? por pozo de PBS. Después de lo último, las placas se invirtieron y ensuciaron en papel absorbente para remover cualquier solución amortiguadora residual.
- 100 µ? por pozo de solución de sustrato (1 comprimido de o- Fenilendiamina (OPD) diluido en 10ml de Solución amortiguadora de Citrato de Fosfato 0.05M pH5 + ? ?µ? H202 30%, preparada al último momento) se agregaron. Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- 50 µ? por pozo de solución de paro H2S04 2N se agregaron
- La absorbancia se leyó en 490nm dentro de 30 minutos de la reacción de paro.
III- Resultados
1- 1 ELISA de intercalado: IgGl de murino (GNbACl ) y ScFv
3C1D5 lote 3C1 D5 lote
060405CS02 060405CS02
IgGI GNbAC I ScFvbiotina
peroxidasa
Etiquetado Etiquetado
Env SU 0,5 µg/ml 2.695 1.289
Env SU 0,1 µg/ml 1.036 0.656
Env SU 0,02 µg/ml 0.294 0.455
PBST 0,05% 0.101 0.41 1
Env T 0,5 µg/ml 1.807 1.085
Env T 0,1 µ /??1 0.862 0.594
Env T 0,02 µ§/??1 0.215 0.443
PBST 0,05% 0.143 0.420
Tabla 3: Concentraciones de anticuerpo recubierto contra
Peroxidasa o Ligando de detección de Biotina para cada concentración de
antígeno o solución amortiguadora de control. Los resultados corresponden
a densidades ópticas medidas. PBST: Solución salina amortiguada de
fosfato con Tween 20 al 0. 05%
Los resultados con el ELISA realizados en paralelo con el ScFv y el GNbACl original se presentan con condiciones diferentes en la Figura 3. La
concentración del anticuerpo de recubrimiento y ligando de detección fue 5µg/ml cada una; la dilución del conjugado de estreptavidina-peroxidasa fue
1/2000.
Se analizaron GNbACl y el ScFv recombinante como ligandos de detección en un ELISA de intercalado contra el ENV-SU y proteínas recombinantes ENV-T. Como podemos ver en la Figura 3, en la misma
concentración, el MAb y el ScFv son capaces de detectar las proteínas ENV, con un OD sobre una mitad del IgG para el ScFv, cuando el IgG es divalente y el ScFv es monovalente. Por lo tanto, relativamente al número de sitio de enlace por molécula, el ligando aislado ha proporcionado mejores resultados que el IgG de murino completo. De esta manera, las funciones del anticuerpo no son necesarias y tales resultados mejorados con el ligando aislado son inesperados.
III-2 ELISA directo: GNb Acl y Fab
Tabla 4: Concentraciones de anticuerpo recubierto contra ligandos de detección etiquetados peroxidasa (etiquetado directo) para cada concentración de antígeno o solución amortiguadora de control. Los resultados corresponden a densidades ópticas medidas. NA: Medición No Aplicable (solución de problemas técnicos).
Se analizaron el IgGl de murino y su fragmento Fab como ligando de detección en un ELISA de intercalado contra la proteína recombinante ENV-T. Como podemos apreciar en la Figura 4, en la misma concentración, el Fab monovalente detecta la proteína ENV con una densidad óptica superior o igual al IgG divalente. De nuevo aquí, apreciamos que el ligando aislado de manera sorpresiva proporciona mejores resultados que el IgG completo.
Podemos de esta manera concluir que, repetidamente, las funciones del anticuerpo no fueron necesarias y que el ligando por sí mismo es más eficiente que el IgG de murino "natural".
EJEMPLO 4 : Diseño, construcción y análisis in vitro de constructos moleculares con cadenas constantes IgGl e lgG4 humanas y ligando.
Después de haber evidenciado el desempeño mejorado no esperado del ligando aislado que comprende sitios de enlace monovalentes con ya sea secuencias VH y VL naturales (Fab) o recombinantes (scF'v) en detección de inmunoensayo del antígeno objetivo, hemos diseñado y construido secuencias recombinantes para la producción de moléculas de IgGl o IgG4 humanas quiméricas que comprenden las secuencias de ligando (VH+VL). De esta manera, hemos producido anticuerpos completos como vectores moleculares para el ligando y evaluados por inmunoensayos en comparación con el IgG de murino original.
Con objeto de producir estos vectores de anticuerpo recombinantes con el ligando insertado, los clones se adaptaron por su expresión en células CHO y los anticuerpos se produjeron y purificaron por "Polymmun", Viena, Austria. Las condiciones técnicas para las producciones de estos anticuerpos con vectores apropiados se resumen a continuación:
Estabilización de las Líneas Celulares CHO Recombinantes GNbAC l_IgGl y GNbACl_IgG4
Esta sección describe la fuente de genes del anticuerpo monoclonal recombinante GNb AC 1 expresado recombinantemente como IgGl e IgG4 humano/de ratón quimérico, por lo cual las regiones constantes son humanas y las regiones variables son las secuencias VH y VL originales como se describe en la SEQ ID No.8 y SEQ ID No.7 respectivamente.
Plásmidos de expresión
Cadenas ligeras (LC) GNb AC1 IgGl quiméricas
Básicamente, este plásmido de expresión es el pClneo (Promega) comercialmente disponible, que se usó en la primera etapa para insertar el codón optimizado (optimización del uso de codón para expresión en células CHO, diseñado por GENEART, también incluyendo optimización de la estructura de mARN) estructura de cadena ligera kappa humana incluyendo una señal kappa de inmunoglobulina procesada por secuencia y la región constante c-kappa humana con sitios de restricción intermedios para insertar cualquier cadena ligera variable. De acuerdo con la secuencia primaria de VL (SEQ ID No. 7) un inserto de nucleótido sintético se sintetizó en GENEART AG (Regensburg, Alemania) incluyendo sitios de restricción en el extremo 3' de la secuencia de señal y en el sitio 5 ' de la región de cadena ligera kappa para insertar la región variable optimizada -codones VL- (SEQ ID No.27) en el vector de expresión eucariótico abierto BsiWI y AccIII que porta la estructura de cadena ligera kappa humana optimizada por codón -codones IgGI L- bajo control del promotor CMV. Adicionalmente, el vector contiene la neomicina fosfotransferasa para selección de células CHO con G418. La SEQ ID No. 28 indica la secuencia de nucleótido del constructo asociado con "codones IgGI L y codones VL" optimizados usados para expresión en células CHO..
Cadenas pesadas (HC) GNb AC1 IgGl quiméricas
El vector de clonación para generación del vector de expresión eucariótico GNb AC 1 IgGl consiste de dos casetes de expresión eucarióticos con regiones reguladoras idénticas. Este vector ya contiene un codón optimizado (optimización del uso de codón para expresión en células CHO, diseñado por GENEART, también incluyendo optimización de la estructura mARN) la estructura IgG l humana incluyendo la región de señal de una cadena pesada de inmuno globulina y la región constante IgG l
humana con sitios de restricción intermedios para insertar cualquier región de cadena pesada variable.
La información para la secuencia de aminoácido de la región variable (VH) del anticuerpo monoclonal de ratón GNb ACl se presenta en la SEQ ID No. 8. De acuerdo con tal secuencia primaria un inserto de nucleótido sintético se sintetizó en GENEART incluyendo sitios de restricción (en el extremo 3' de la secuencia de señal y en el sitio 5 ' de la región CH1 de cadena gamma, para insertar la región pesada variable optimizada (SEQ ID No.29) -codones VH- en el vector de expresión eucariótico abierto Agel y Nhel que porta la estructura IgGl humana optimizada por codón bajo control, del promotor SV40. Adicionalmente, el vector contiene la dihidrofolato reductasa de ratón como el segundo cásete de expresión para uso como marcador de selección/amplificación en cultivo celular de animal. La SEQ ID No. 30 representa la secuencia de nucleótido del constructo asociado con codones de estructura IgGl H humanos optimizados y codones VH optimizados" usados para expresión en células CHO.
Cadena pesada (HC) GNb AC l lgG4 quimérica
El vector de clonación para generación del vector de expresión eucariótico GNb AC l lgG4 consiste de dos casetes de expresión con las regiones reguladoras idénticas y es el mismo como para el constructo IgGl .
Sin embargo, ya que no estuvo disponible la región constante IgG4 humana la cadena pesada completa incluyendo la secuencia de señal, la región pesada variable (VH) GNb AC l de ratón y la región constante IgG4 humana se sintetizó por GENEART.
La SEQ ID No. 3 1 muestra la secuencia de nucleótido de la región de codificación de la cadena pesada optimizada por GNb AC l IgG4 quimérica (codones IgG4H). Posteriormente, el inserto se introdujo en el vector de expresión eucariótico abierto Notl y SacII que resulta en el constructo, se muestra en la SEQ ID No. 32, que asocia los codones IgG4H optimizados y los codones VH optimizados usados para la expresión en células CHO .
Todos los plásmidos se clonaron en GENEART y posteriormente se transformaron en cepa E. coli TOP 10. Las bacterias recombinantes se propagaron en 50 mi de LB/Amp-medio y los plásmidos se aislaron con el Promega PureYield™ Plasmid Midiprep Systems. El rendimiento y pureza de los plásmidos se controlaron fotométricamente con y el cociente de densidad óptica en 260 nm y 280 nm, determinado para ser al menos 1 .5.
ESTABLECIMIENTO DE LAS LINEAS CELULARES CHO RECOMBINANTES GNB AC 1_IGG1 Y GNB AC 1 IGG4
Procedimiento de transfección
Las Células de Ovario de Hámster Chino deficientes de dihidrofolato reductasa (referidas como CHO dhfr-, ATCC no. CRL 9096) se eligieron
como la línea celular precursora para la generación de la línea de expresión final. Estas células - originadas de la Colección de Cultivo Tipo Americana (ATCC, por sus siglas en inglés) - se propagaron en "medio de cultivo" que consiste de DMEM complementado con L-glutamina 4 mM, hipoxantina 0.1 mM, timidina 0.016 mM (HT), 0.25 g/1 peptona de soya, F-68 Plurónico al 0.1 % y complemento libre de proteína (Polymun Scientific) con una relación dividida 1 :6 dos veces a la semana.
Las 5 x 106 células se lavan una vez con medio basal y se vuelven a suspender en 10 mi de medio completo se usaron para transfección. Los poliplexos se formaron por incubación de 900 µ? de polietilenimina (1 mg/ml de PEI lineal, MW: 25,000, Polysciences Inc.) con 12 µg HC y 12 µg de plásmido LC en un volumen total de 2 mi durante 30 minutos a TA. La interacción de los poliplexos con células CHO en 12 mi duró cuatro horas antes de la centrifugación a 170 g, descartando el sobrenadante y volviendo a suspender las células en "medio de cultivo". Después de 24 horas, el medio completo se reemplazó por 50 mi de medio de selección compuesto de DMEM complementado con L-glutamina 4 mM, 0.25 g/1 peptona de soya, F-68 plurónico al 0.1 %, complemento libre de proteína (Polymun Scientific) y 0.5 µg ml G418. 100 µ? de la suspensión celular se sembraron por pozo en cinco placas de 96 pozos. 4 experimentos de transfección ("codones IgGlH + codones VH" construidos co-transfectados con "codones IgGI L + codones VL" para GNbACl -IgGl quimérico; "codones IgG4H + codones VH"
construidos co-transfectados con "codones IgGIL + codones VL" para GNbAC l -IgG4 quimérico) generan un total de 20x placas de 96 pozos (correspondientes a 1920 pozos) por subtipo IgG.
Después de 10 hasta 14 días, los clones formados se alimentaron con 100 µ? de "medio de amplificación" que consiste de 0.048 µ? MTX en medio de selección. Los clones crecidos se alimentaron con otros 100 µ? de medio de amplificación de nuevo contienen 0.048 µ? MTX y posteriormente se analizan en un ELISA de intercalado doble. El ELISA usa suero policlonal específico gamma anti humano para recubrimiento y anticuerpo policlonal acoplado HRP de cadena kappa anti humano para detección.
Los clones productores superiores seleccionados se adaptaron hasta 0.19 µ? MTX en medio de selección.
La Tabla 5 describe la selección para mejores productores de GNb ACl IgGl y GNb AC l IgG4 en 0.096 y 0.19 µ? MTX en matraces T25 Roux y recipientes Spinner.
En el caso de GNb ACl_IgGl hemos decidido para el clon 6B6 y en el caso de GNb AC l_IgG4 hemos decidido para el clon 7C1. En el caso de crioconservación GNb AC l IgGl de tres clones, GNb ACl_IgGl_6B6, GNb ACl_IgGl_8H2 y GNb ACl_IgGl_l 8A8 y en el caso de crioconservación GNb AC l -IgG4 de dos clones, GNb ACl_IgG4_6Cl y GNb ACl_IgG4_7C l se hizo. El mejor clon se subclonó al limitar el método de dilución como, por ejemplo, se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera Edición) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cáncer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, Cold Spring Harbour Laboratory Books".
Subclonación de mejores transfectantes producidos GNb ACl_IgGl_6B6 y GNb ACl_IgG4_7Cl
La subclonación se realizó en placas de 96 pozos con 90, 30 y 10 células por pozo en medio de amplificación con, en el caso de GNb ACl_IgGl_6B6: 0.19 µ? de Metotrexato (Sigma, MTX) y 50% de GNb ACl_IgGl_6B6 sobrenadante de cultivo 0.2 µ?? filtrado, en el caso de GNb ACl_IgG4_7C l : 0.19 µ? MTX y 50% de GNb ACl_IgG4_7Cl sobrenadante de cultivo 0.2 µ?? filtrado. Los pozos crecidos se adaptaron hasta 0.38 µ? MTX en placas de 96 pozos, analizaron por ELISA y propagaron en matraces T25 para cribado adicional y adaptación hasta 0.77 µ? MTX.
La Tabla 6 describe la selección para mejores productores de GNb ACl IgGl_6B6 - y GNb ACl IgG4_7Cl - subclones en 0.77 µ? MTX en matraces T25 Roux y recipientes Spinner.
El mejor productor en el caso de GNb ACl_IgGl_6B6 se clonó GNb
AC l_IgGl_6B6_10E4 y en el caso de GNb ACl_IgG4_7Cl clon GNb
AC l_IgG4_7Cl_15B7. Estos dos clones se eligieron para desarrollo de línea celular adicional.
Se hizo la crioconservación de dos clones GNb AC l -IgGl : GNb AC 1-IgGl_6B6_lD l , GNb ACl_IgGl_6B6_10E4 y dos clones GNb ACl -IgG4: GNb ACl-IgG4_7Cl_3El l , GNbAC l -IgG4_7Cl_15B7.
Subclonación de mejores subclones producidos GNb AC 1-IgGl_6B6_10E4 y GNb ACl -IgG4_7C l_15B7
Un procedimiento de subclonación final se realizó de nuevo en placas de 96 pozos con 90, 30 y 10 células por pozo en medio de amplificación en el caso de GNb AC l_IgGl_6B6_10E4 con 0,77 µ? MTX y 50% de GNb ACl_IgGl_6B6_10E4 sobrenadante de cultivo 0.2 µ?? filtrado, en el caso de GNb ACl_IgG4_7C l_15B7 con 0.77 µ? MTX y 50% de GNb ACl_IgG4_7Cl_15B7 sobrenadante de cultivo 0.2 µ?? filtrado. Los pozos crecidos se analizaron por ELISA, los mejores productores se propagaron a matraces T25 y matraces spinner (Spl25) para cribado adicional.
La Tabla 7 describe la selección para mejores productores de GNb ACl IgGl_6B6_10E4 - y GNb ACl IgG4_7C l_15B7 - subclones en 0.77 µ? MTX en matraces T25 Roux y matraces spinner.
En el caso de GNb ACl_IgGl dos clones GNb
ACl_IgGl_6B6_10E4_18C7 y GNb AC l_IgGl_6B6_10E4_18D12, en el caso de GNb ACl_IgG4 dos clones GNb ACl_IgG4_7Cl_15B7_3E4 y GNb
AC l_IgG4_7C l__15B7_5G 10 se crioconservaron después de los cultivos
spinner.
Tabla 5: Pozos seleccionados después de la transfeccion y adaptación a
niveles diferentes de MTX
GNb ACl -IgGl : 0.096 µ? MTX:
Conteo celular Titulación Titulación específica
Días
E+05c/ml µg/ml pg/c*d£
En T25:
6B6 6.9 14.2 4 5.2
8H2 5.6 4.0 3 2.3
18A8 3.8 3.3 3 2.9
ln Sp125
6B6 2.6 11.5 4 1.3
8H2 5.0 3.5 3 3.1
18A8 4.2 4.0 3 2.4
£: picogramo por célula y día.
Después de la adaptación hasta 0.19 µ? MTX:
Conteo celular Titulación Titulación específica
Días
E+05c/ml µg/ml pg/c*d£
En T25:
6B6 5.3 7.4 3 4.7
8H2 4.2 4.0 3 3.2
18A8 5.5 3.4 3 2.0
: Picogramo/célula
GNb AC l -IgG4: 0.096 µ? MTX:
Conteo celular Titulación Titulación específica
Días
E+05c/ml µ^??? [pg/c*d]
En T25: ¦
61C 4.1 9.6 3 7.9
7C1 2.3 3.7 3 5.4
En Spl25:
6C1 5.5 14.3 3 8.6
7C1 4.5 10.9 3 8.2
Después de la adaptación hasta 0.19 µ? MTX:
Conteo celular Titulación específica
Titulación Días
E+05c/ml µ§/p? [pg/c*d]
En T25:
6C1 3.6 11.8 3 10.8
7C1 4.7 12.5 3 8.8
Tabla 6: Subclones seleccionados después de la primera subclonación en
0.77 µ? MTX GNbAC l -IgGl :
Conteo celular Titulación específica
Titulación Días
E+05c/ml g/ml [pg/c*d]
En T25:
GNb AC1- 4.8 23.4 4 12.1 lgG1_6B6_1 D1
GNb AC1- 3.4 11.9 3 11.8 lgG1_6B6-10E4
En Spl25:
GNb AC1- 4.0 12.9 3 10.8 lgG1_6B6_1 D1
GNb AC1- 3.5 10.9 3 10.4 lgG1_6B6-10E4
GNbAC l -IgG4:
Tabla 7: Subclones seleccionados después de la segunda (fina' subclonación en 0.77 µ? MTX:
GNb AC l-IgGl :
GNb AC1- Conteo celular Titulación Titulación específica
Días
lgG1_6B6_10E4_... E+05c/ml [pg/c*d]
En T25:
18C7 7.2 18.5 4 6.4
18D12 9.6 18.4 4 . 4.8
En Spl25:
18C7 (160608) 4.1 21.6 4 13.3
18D12 (160608) 4.0 15.0 4 9.5
18C7 (190608) 6.2 20.9 3 11.3
18D12 (190608) 6.5 15.7 3 8.1
18C7 (230608) 4.7 20.9 4 11.1
18D12 (230608) 5.3 18.6 4 8.7
18C7 (260608) 2.7 11.2 3 13.8
18D12 (260608) 3.5 10.6 3 10.1
GNb ACl -IgG4:
Los vectores de anticuerpo IgGl e IgG4 recombinantes de esta manera se produjeron con Ligando insertado que comprende las seis secuencias CDR como se describe en el ejemplo 1. Estos vectores que comprenden las seis CDRs se analizan en el siguiente ejemplo, con objeto de determinar la influencia positiva y negativa de los vectores y, de esta manera proponer una selección y/o un uso adecuado para cada uno de ellos.
EJEMPLO 5 : Estudio del ligando y de sus constructos quiméricos IgGl e IgG4 humanos, contra el IgGl de murino humano : afinidad in vitro.
El material y métodos fueron los mismos como se describe en los ejemplos 3 y 4.
5.a. ELISA con concentraciones diferentes de Proteína completa
MSRV-ENV TENV-T
Tabla 8: Densidades ópticas (OD) medidas por ELISA con ligandos diferentes (1 microgramo) o control irrelevante (2G5E12) en concentraciones diferentes (columna izquierda, en microgramos) de anti-ligando (ENV-T) recubierto en pozos de placa de microtitulación. El enlace se revela con anticuerpo anti-Ig etiquetado peroxidasa (1/250; Jackson-EUA) y reacción de sustrato de peroxidasa. El valor promedio de todo las OD del control irrelevante es 0.1004 y su desviación estándar (SD) es 0.0205, por lo tanto un valor de corte puede determinarse, a continuación los valores que no son específicos con 99% de intervalo de confidencia: promedio + 3 *SD = 0.1618. Todos los valores presentes con constructos GNb A Cl son por lo tanto importantes de un enlace específico a la proteína objetivo.
Se analizaron el GNbACl de anticuerpo y el IgG l e IgG4 de versión quimérica como anticuerpos de detección en un ELISA de intercalado contra la proteína recombinante ENV. Como podemos apreciar en la Figura 5 y Tabla 8, en la misma concentración, los MAbs quiméricos y de murino son capaces de detectar concentraciones presentes de proteínas ENV, con cinética similar. La especificidad y afinidad relativa de los nuevos constructos (ligando en un vector humano) de esta manera se mantienen y, tanto los constructos IgGl como IgG4 humanos con el ligando han proporcionado anticuerpos quiméricos humanos capaces de detectar picogramos de la proteína ENV recombinante. Esto es sorprendentemente bueno y confirma la optimización alcanzada a lo largo de su diseño completo, construcción y condiciones de expresión. También valida la selección de una estructura de ligando robusto y estable, como se describe en el ejemplo 1.
Además, esta experiencia proporciona un medio para identificar las moléculas equivalentes al ligando a través de la importancia de su enlace entre y el anti-ligando original (ENV), como se evidencia aquí con el ligando (GNb AC 1) contra un ligando "no enlazado" irrelevante (2G5E12):
El antígeno Env-T se recubre en pozos de placa ELISA de microtitulación con diluciones en serie en el intervalo desde 1 pg/ml hasta alrededor de 0.01 µg/ml.
El ligando de referencia (GNbACl ) y un ligando irrelevante (2G5E12) se prueban en 1 µg/ml y se revelan con un anticuerpo secundario (aquí, anticuerpo secundario etiquetado peroxidasa anti-IgG de Jackson Ltd, EUA, diluido 1/250, de aquí en adelante referenciado como IgG anti ratón (H+L) Jackson o IgG anti humano; Jackson, EUA).
La curva con el ligando de referencia muestra saturación de señal (densidad óptica superior o igual a 3) en la concentración ENV más alta y progresivamente disminuye a una densidad óptica de alrededor de 1.0-0.5, de esta manera evidencia una curva de respuesta a la dosis típica de la actividad de enlace específica (arriba del valor de corte estadístico calculado de 0.1618 ; ver Tabla 8). En paralelo, la molécula irrelevante (2G5E12), no muestra curva de respuesta a la dosis (curva promedio plana) y oscila entre una densidad óptica de 0.1 y 0.05 en cualquier concentración ENV, debajo del valor de corte estadístico calculado de 0.1618 (Tabla 8).
De esta manera, cualquier molécula equivalente al ligando puede de esta manera evidenciarse por ya sea,
1) La existencia de una curva de una respuesta de dosis en esta prueba, con las condiciones del ejemplo presente, como se muestra en el párrafo 5a, y
2) La ausencia de una curva plana, que oscila debajo de un corte estadístico calculado (Promedio + tres desviaciones estándares) de valores de densidad ópticos obtenidos con un anticuerpo irrelevante (Cf. 2G5E12 en la Tabla 8), comparado con valores arriba del corte obtenido con referencia a GNbACl para una concentración ENV de 0.01 microgramos (ver Tabla 8); o,
3) La existencia de una curva de respuesta de dosis en una prueba como se describe a continuación con diluciones en serie del ligando y una concentración de anti-ligando fija, en el párrafo 5b (Tabla 9), y
4) La ausencia de una curva plana, que oscila debajo de un corte estadístico calculado (Promedio + tres desviaciones estándares) de valores de densidad ópticos obtenidos con un anticuerpo irrelevante (Cf. 2G5E12 en la Tabla 9), comparados con los valores arriba del corte obtenido con GNbACl de referencia correspondiente a una concentración de 0.01 microgramos/ml, en las mismas condiciones como se describe en el párrafo 5b (ver Tabla 9).
5.b ELISA con concentración de MAbs diferentes
IgG anti-ratón (H+L) Jackson 1/250 IgG anti humano Jackson
1/250
ConcenGNbACl 2G5E1 GNbAC GNbAC Soluáón. 2G5E12 GNbACI- GNbAC tración de murino 2 1-lgG1 1-lgC4 amortiguado- lgG1 1-IgC4 rade control
1 2.065 0.077 0.738 0.753 0.05 0.046 1.78 1.696
0.5 1.926 0.085 0.586 0.43 0.047 0.056 1.724 1.741
0.25 2.149 0.069 0.365 0.374 0.046 0.049 1.535 1.499
0.125 2.029 0.071 0.221 0.238 0.048 0.046 1.544 1.248
0.0625 1.965 0.074 0.221 0.189 0.047 0.045 1.205 1.154
0.03125 1.728 0.074 0.171 0.156 0.047 0.047 0.906 0.929
0.0156 1.681 0.066 0.093 0.105 0.051 0.048 0.55 0.511
0.0078 0.964 0.072 0.073 0.087 0.061 0.073 0.276 0.372
Tabla 9 : Densidades ópticas medidas por ELISA con diluciones en serie del ligando y una concentración anti-ligando fija. (ENV- T; O. Olmicrogramos) recubierta en pozos de placa de microtitulación. El enlace se revela con anticuerpo anti-IgG etiquetada peroxidasa (1/250; Jackson-EUA) y reacción de sustrato de peroxidasa.
Con la detección de anticuerpo secundario anti-ratón, el valor promedio de toda la OD del control irrelevante es 0.0735 y su desviación estándar (SD) es 0.0057, por lo tanto un valor de corte puede determinar, debajo de los valores que no son específicos con 99% de intervalo de confidencia: promedio + 3*SD = 0.0907. Todos los valores presentados con GNb AC1 de murino correspondiente por lo tanto son importantes de un enlace específico a la proteína objetivo.
Con la detección de anticuerpo secundario anti-humano, el valor promedio de toda la OD del control irrelevante es 0.0513 y su desviación estándar (SD) es 0.0094, por lo tanto un valor de corte puede determinarse, debajo de los valores que no son específicos con 99% de intervalo de confidencia: promedio + 3 *SD = 0.0796. Todos los valores presentados con constructos quiméricos GNb AC1 por lo tanto son importantes de un enlace específico a la proteína objetivo.
En la Figura 6, podemos apreciar que tanto GNbACl de anticuerpo IgG de murino como IgGl e IgG4 de versiones quiméricas son eficientes como anticuerpos de detección en un ELISA de intercalado contra la proteína recombinante ENV-T, con cantidades tan bajas como pocos nanogramos de IgG purificado para detectar menos de pocos nanogramos de proteína ENV.
Además, ya que el IgG anti-humano o de ratón no reacciona cruzado con ya sea el anticuerpo de murino original o los constructos quiméricos con las estructuras IgGl o IgG4 humanas, el ligando insertado (VH+VL) no ha creado cualquier modificación no deseada y no se detecta en los constructos humanos, en estas condiciones.
5c: Afinidad del GNbACl para ENV-T
Tabla 10: Determinación de la afinidad de enlace del ligando insertado en
vectores de anticuerpo IgG4 e IgGl (las unidades se indican en la tabla)
5.d: Punto isoeléctrico GNbACl
El punto isoeléctrico GNbAC l se determinó de acuerdo con técnicas descritas en « Fractionation of complex protein mixtures by liquid-phase isoelectric focusing. Hey J, Posch A, Cohén A, Liu N, Harbers A. Methods Mol Biol. 2008;424:225-39. ».
El punto isoeléctrico de las construcciones IgGl (pl 8.3) e IgG4 (pl 7.53) son muy útiles y determinarán la estabilidad y condiciones de almacenamiento para un uso terapéutico. El pl neutro del IgG4 es de esta manera mejor para la formulación de un MAb terapéutico que puede ser como un tratamiento crónico con inyecciones regularmente repetidas. De esta manera, el IgG4 es un constructo favorecido de este punto.
EJEMPLO 6: Estudio del ligando y de sus constructos IgGl e IgG4 humano, contra GNbACl : actividad inhibidora en citoquinas pro-inflamatorias en cultivos celulares mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).
Materiales y Métodos:
Medio de cultivo
Los PBMCs se cultivaron en RPMI Glutamax (Gibco) + FBS al 10% (Biowest SI 810 Suramérica) + 1 % de aminoácidos no esenciales + piruvato al 1 % + penicilina - estreptomicina al 1 %, a 37°C bajo 6.5% C02.
Preparación de PBMCs de capas leucocíticas
Las capas leucocíticas se proporcionan por el HUG.
La sangre, diluida con PBS-FBS 2% (4ml + 31 mi), es coloca suavemente en 15ml de Ficoll y se centrifuga en 2850rpm (1650g) / 20min / temperatura ambiente / sin interrupción.
Los PBMCs luego se recolectan cuidadosamente y lavan 3 veces con PBS-SVF 2% y centrifugan en 1500rpm / l Omin.
Las células luego se cuentan y congelan en SVF 90% + DMSO 10%.
Preparación de PBMCs de células congeladas
- Los PBMCs mantenidos a -80°C se descongelan a 37°C, se lavan 3 veces con el medio y centrifugan en 1500 rpm / l Omin.
- Las células luego se cuentan y diluyen a una concentración de usualmente lxl O6 células/ml.
Prueba de inhibición
- La_.mezcla ENV + MAbs se prepara antes de que los PBMCs se descongelen. Los MAbs (Relación elegida con ENV) + ENV (concentración elegida) se mezclan en cada pozo de placas de 48 pozos, en 100 ul de medio e incuban 1 hora a +4°C.
- Los PBMCs luego se agregan en cada pozo, para una concentración final de 1 xl O6 células/ml (0.5ml ó 1 mi final por pozo).
- Las células se incuban 24, 48 ó 72 horas a 37°C, C02 al 5%.
Los sobrenadantes se recolectan por centrifugación a 1400rpm/10min/TA y se mantienen a -20°C.
II-2d Dosificación de citoquinas
Las citoquinas se do sifican con conjuntos de BD Pharmingen ELISA, para IL-6, IL- 12p40, TNF-a e IFN-?. El protocolo del proveedor se siguió.
Tabla 11: Dosificación de citoquina en sobrenadantes de cultivo
PBMC diferente (células Mononucleares de Sangre Periférica) con o sin ligandos diferentes.
Hemos probado con pruebas celulares en PBMCs el potencial de nuestros anticuerpos o S cFv para inhibir la interacción entre la proteína ENV y las células (por medio del receptor TLR4), y de esta manera la producción de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-6 (inmunidad innata) e IFN-? (inmunidad mediada por T-linfocito). Las moléculas diferentes se probaron en la misma relación (mol/mol) con la proteína (25/1) así que podemos comparar su desempeño.
Como puede observarse en la Figura 7 y Tabla 1 1 , todas las moléculas de ligando, ya sean de origen murino o recombinante (construcciones scFv o IgGl e IgG4 con el ligando), tienen y mantienen sus propiedades inhibidoras, como se representa por la reducción de citoquinas pro-inflamatorias (IL-6) producidas por los PBMCs.
Sin embargo, puede observarse que GNb AC1 e IgG4 humano recombinante con ligando insertado, son eficientes en la activación del linfocito (ambos reduciendo la producción de Interferón-gamma), mientras que scFV (más probablemente debido a que es monovalente, aquí) y constructo humano IgGl fueron mucho menos eficientes en inhibición de interferón gamma. Aquí, el hecho de que la región IgGl Fe humana tiene efectos proactivos en células inmunitarias humanas, claramente indica que esta propiedad puede contrapesar los efectos inhibidores del ligando en este tipo de activación de linfocito por ENV. Con el mismo ligando en el vector IgG4 humano (que no es inmunológicamente proactivo), exhibe el efecto inhibidor del ligando divalente como en el IgG de murino original.
Por esta razón, en cuanto a lo que se expone en la sección del ejemplo 5.d, IgG4 debe ser un constructo preferido cuando las funciones inmunitarias de los anticuerpos debe evitarse. Como se revela para ser el caso aquí, las funciones del anticuerpo no son necesarias para el efecto inhibidor (dado que un ligando divalente se produce, como scFV monovalente tiene pobre eficiencia) pero también revela daño al efecto inhibidor del ligando.
Con respecto al efecto en la producción IL-6 (de monocito/macrófagos y, posiblemente también, B-linfocitos) IgGl e IgG4 revelan más bien inhibición equivalente y buena, que difiere de lo que se observó con Interferón-gamma. De manera interesante, el scFv monovalente exhibe menos pero importante inhibición de esta citoquina "de inmunidad innata". De esta manera, ciertas activaciones inmunitarias son bien inhibidas por tanto vectores humanos IgGl como IgG4 con el ligando, pero IgG4 exhibe inhibición única de tanto células de inmunidad innata (resultados de IL-6) como células inmunidad adquirida (resultados de IFN-gamma) de PBMC humano. De manera interesante, el vector IgGl sin embargo proporciona inhibición más fuerte de las citoquinas pro-inflamatorias de inmunidad innata (representadas aquí por el ejemplo de IL-6) y dispara algunos clones de célula T (como se refleja por dosificaciones de Interferón gamma), que pueden revelarse en ciertos mecanismos de defensa anti-víricos útiles.
De esta manera confirmamos la alta afinidad y actividad biológica del ligando, en una forma de suministro farmacéutico que consiste de vectores anticuerpo humanos con afinidades y especificidades de enlace comunes, pero diverge de efectos inmunitarios dependiendo de su isotipo.
EJEMPLO 7: Identificación molecular del sitio de enlace del ligando en la proteína ENV objetivo (secuencia de enlace anti-ligando)
El mapeo de epítopo del IgGl/kappa de murino original (GNb AC1) se ha alcanzado por Pepscan BV., Los Países Bajos.
De estos resultados, la secuencia de aminoácido del sitio de enlace del ligando se identifica para incluirse dentro de la secuencia establecida en SEQ ID No. 20.
Incluido en la secuencia de arriba, el mejor epítopo objetivo consiste en la parte de terminal C del dominio SU desdoblado (ENVl) en la proteína ENV completa (ENV-T) y corresponde más particularmente a la siguiente secuencia selecciona de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 32.
Esta secuencia anti-ligando (y su secuencia seleccionada) no está exclusivamente, pero tampoco, comprendida dentro de la secuencia de aminoácido primaria de proteína de envolvente MSRV (ENV) como se describe en ejemplo 2.
Sin embargo, se conoce del experto en la técnica, que los aminoácidos pueden sustituirse por su equivalente funcional y, aquí, pueden proporcionar un sitio de enlace similar con una secuencia diferente. Además, los mimotopos "MSRV ENV" se han descrito, que pueden enlazar eficientemente a anticuerpos específicos (Jolivet-Reynaud, C, H. Perron, et al. 1999. "Specificities of múltiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93 ;3 : 283 -93.) .
EJEMPLO 8 : Evidencia de la presencia del antígeno obj etivo MSRV-ENV en pacientes con enfermedades asociadas con MSRV: Ej emplos de enfermedades asociadas o síndromes patológicos en Esclerosis Múltiple, Síndrome (neurológico) Aislado Clínicamente -CIS-, Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica -CIDP-, Esquizofrenia, y Epilepsia.
8a. Esclerosis múltiple, Síndromes Clínicamente Aislados y Polineuropatías:
Materiales y Métodos
Inmunodosificacion de Antigenemia ENV
Recolección de suero preliminar:
El estudio se aprobó por los comités éticos de los Hospitales Universitarios de Creteil y Grenoble, Francia. Los pacientes neurológicos se incluyeron de ambos centros. Todos los pacientes han dado su consentimiento informado por escrito antes de la inclusión. Los donadores de sangre saludables se reclutaron de los centros de transfusión de Grenoble y Montpellier. No se obtuvieron controles neurológicos de Grenoble. Los datos clínicos en pacientes se indican en los Resultados. Las alícuotas de muestra de suero de pacientes con MS y controles saludables se codificaron y enviaron a un laboratorio independiente para prueba de ciego con ApoH ELISA usando condiciones de lectura colorimétrica.
Recolección de suero del centro múltiple Europeo:
El estudio se aprobó por los comités éticos de la facultad de medicina, Universidad de Würzburg en Alemania, de la Universidad de Sassari, del Hospital de Don Gnocchi de Milán en Italia, del Hospital de la Universidad Marseille en Francia y de la Universidad de Pamplona en España. 74 pacientes con MS definitiva de acuerdo con el criterio McDonald (McDonald, Compston et al. 2001) y 14 pacientes con síndromes clínicamente aislados (CIS) se incluyeron. Los datos del tratamiento y clínicos correspondientes se presentan en la Tabla 12 a continuación. (McDonald, Compston et al. 2001). En el caso de recaída de MS, las muestras de sangre se sacaron antes del inicio del tratamiento de esteroides. Las alícuotas de muestra de suero de pacientes con MS y controles saludables se codificaron y enviaron a un laboratorio independiente para prueba de ciego con ApoH ELISA usando condiciones de lectura luminométricas.
Recolección de muestra: Un tubo (7ml de tubo seco B&D) de sangre se recolectó. Las muestras se trataron dentro de 2 horas después de la recolección. Después de la coagulación de la sangre se centrifugaron durante 10 min en 2800g a 14°C. El suero luego se recolectó y formó en alícuotas en 250µL en tubos Eppendorf. Las alícuotas se almacenaron congeladas a -20°C.
Inmunoensayo ApoH-ELISA.
Método colorimétrico: Las placas de microtitulación recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier, Francia) se cargaron con muestras de suero diluido en Tris-HCl 50mM pH 7.6; las placas se incubaron durante 1.5 h a 37°C; las placas luego se lavaron cuatro veces con PBS; el mAb anti-ENV de ratón purificado se diluyó con PBS que contiene BSA al 5% a una concentración de 10µg/ml y se agregó. Las placas se incubaron durante 1 h a 37°C y luego lavaron cuatro veces con PBS. El IgG anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidasa (H+L; Sigma) diluido 1 :5000 en PBS que contiene BSA al 5% se agregaron, las placas se incubaron durante 1 h a 37°C y luego se lavaron seis veces con PBS. La solución de sustrato OPD se agregó y las placas se incubaron durante 30 min en la oscuridad. La reacción de color se detuvo con H2S0 2N. La absorbancia se leyó en 490nm con un lector Tecan. El valor de corte estadístico (CO.) de esta prueba se determinó en serie de suero negativo de 50 donadores de sangre saludables (BD), con el promedio de triplicados de suero individual como el resultado de densidad óptica (OD). El CO de esta manera se calculó de series validadas estadísticamente de controles negativos, como su valor promedio más tres desviaciones estándares (A+3 SD; positividad de importancia p<0.01 ) y se confirmó experimentalmente en un panel de muestra negativas y positivas de referencia. El intervalo de confidencia para la determinación de la positividad con la prueba por lo tanto representa 99.9%.
Método luminométrico: Las muestras diluidas en Tris-HCI 50mM pH7.6 se cargaron en microplacas recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier, Francia). Las microplacas se incubaron 1 h 30 min a 37°C, lavaron cuatro veces con PBS. El mAb anti-ENV de ratón purificado (1 µg/ml en PBS-BSA 5%,) se agregaron, las microplacas se incubaron 1 h a 37°C y lavaron cuatro veces con PBS. El anticuerpo anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidasa (Jackson, diluido 1/2000 en PBS-BSA 5%) se agregó, las microplacas se incubaron 1 h a 37°C y lavaron seis veces con PBS. La solución del sustrato SuperSignal femto (Pierce) se agregó y leyó con un lector TECAN.
Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales (Mab) se desarrollaron por bioMerieux
(Marcy I'Etoile, Francia) después de inmunizar ratones con proteína de envolvente MSRV recombinante (ENV) expresada de regiones RT-PCR
clonadas amplificadas de viriones MSRV extra celular purificados. Después de la prueba de suero con ratones por ELISA con ENV, las células de bazo se fusionaron con la línea celular de mieloma no secretada Sp2/0-Agl4 con objeto de obtener hibridomas. Los clones específicos se seleccionaron al separar por exclusión su producción de anticuerpo en el mismo ensayo ELISA. De esta manera, alrededor de 40 Mab específicos de proteína MSRV/ENV se aislaron y alrededor de 28 Mab se seleccionaron además y se validó su especificidad de enlace. Usando la técnica ApoH-ELISA en suero humano, el mejor Mab de enlace fue 2A12A5.
Resultados
Inmunodosificación de proteína MSRV ENV en suero.
Hemos desarrollado un inmunoensayo de microplaca original, en el cual la fase de captura se libera en las propiedades particularmente eficientes de Apolipoproteína-H (ApoH) en enlace a proteínas microbianas cuando se asocia con estructuras envueltas y/o lípidos (Stefas et al., 1997; Stefas et al., 2001). La ApoH permite una primera interacción de baj a afinidad con regiones de aminoácido de la proteína por sí misma, que de manera secundaria activa una región alostérica provocando enlace tipo covalente del dominio de terminal C ApoH con dominios de enlace a la membrana o lípido. Por lo tanto, las proteínas envueltas víricas o partículas de virus pueden capturarse irreversiblemente y, después de las etapas de lavado eliminar la muestra original, los antígenos específicos pueden detectarse por la adición de un anticuerpo monoclonal que dirige un epítopo todavía expuesto después de la etapa de captura "ApoH".
Para validación técnica de la prueba, tanto virus MSRV, peletizados como purificados de sobrenadantes de cultivo de célula B con MS, de acuerdo con condiciones previamente descritas (Perron et al., 1997a; Perron et al., 1997b), y proteína de envolvente MSRV recombinante purificada (ENV), se probaron con diluciones en serie y Mab anti-MSRV ENV diferente. La comparación se hizo con virus bien conocidos, tales como virus de hepatitis C (HCV) y virus de hepatitis B (HBV), detectada por Mab específico correspondiente. Después de las pruebas adicionales con muestras de suero reales, Mab 2A12A5 se mostró para ser más eficiente para inmunodetección diagnostica después de la etapa de captura ApoH y se mantuvo para estudios posteriores.
Primer estudio ciego preliminar: Esclerosis múltiple -MS- y
Polineuropatía Desmielinizante Inflamatoria Crónica -CIDP.
Para una evaluación preliminar de este inmunoensayo en grupos diferentes de pacientes con varias enfermedades, primero analizamos el suero de 29 pacientes con MS, de 28 pacientes con otras enfermedades neurológicas, de 60 pacientes con enfermedades no neurológicas y de 50 donadores de sangre saludables (total de 167 muestras de suero). Los resultados se presentan en la Tabla 12, para MS y otras enfermedades neurológicas.
(a) Pacientes con Esclerosis Múltiple (N=29)
Paciente Forma clínica Duración (años) Relación (N=29)
1 RP 6 1.84
2 RP 1 1.64
3 RR 3 1.62
4 RR 4 1.54
5 nr 2 1.54
6 nr nr 1.35
7 nr nr 1.31
8 nr nr 1.37
9 8 8 1.11
10 19 19 1.19
1 1 2 2 1.12
12 nr nr 1.19
13 nr nr 1.12
14 nr nr 1.11
15 nr nr 1.06
16 1 1 1.21
17 5 5 1.18
18 7 7 1.18
19 1 1 1.06
20 4 4 1.09
21 3 3 1.18
22 4 4 1.28
23 2 2 1.03
24 26 26 0.95
25 22 22 0.99
26 4 4 0.90
27 22 22 0.70
28 14 14 0.96
29 18 18 0.92
(b) Pacientes con OND (N=20)
Paciente Tipo de enfermedad Relación OD/CO
1 Epilepsia 0.910
2 Polimiositis Crónica 0.940
3 Tumor cerebral primario 0.640
4 Ciática 0.940
5 Síndrome de Guillain-Barré 1.000
6 Apoplejía 0.840
7 Tumor cerebral primario 0.880
8 Atrofia multisistémica 0.88
9 Parálisis Facial 0.940
10 Síndrome de Guillain-Barré 1.000
1 1 Epilepsia 0.930
12 ALS 0.680
13 Síndrome de Guillain-Barré 0.830
14 Metástasis Cerebral (cáncer de 0.910
pulmón)
15 Enfermedad de Leigh 1.000
16 Epilepsia 0.800
17 Medular traumático 0.810
18 Absceso cerebral (Listeria) 0.930
19 Epilepsia 0.800
0 Apoplejía 0.960
(c) Pacientes con CIDP (N=8)
Paciente Relación con OD/CO
1 1.13
2 1.27
3 1.06
4 1.08
5 1.06
6 0.90
7 0.86
8 0.93
Tabla 12: Prueba de inmunodetección ENV para la identificación de enfermedades asociadas con MSRV o de sub-grupos asociados con MSRV de pacientes. Resultados APO-H ELISA en primer serie de suero - Pacientes con Esclerosis Múltiple (MS por sus siglas en inglés), Pacientes con otras enfermedades neurológicas (OND), pacientes con Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP por sus siglas en inglés) y Saludables Donadores de Sangre (BD por sus siglas en inglés). Las pruebas de ELISA con etapa de captura APO-H (Stefas et al., 1997) se realizaron con IgG monoclonal (2A12A5 por MSRV ENV), producidas y separadas por exclusión para especificidad por bioMerieux, Marcy L'Etoile, Francia. N= Número de pacientes, nr = No registrado, OD= Densidad óptica, P= progresiva, RP= Progresivo que Remite, RR= Recurrente que Remite. CO= Valor de corte que determina el valor límite debajo del cual el resultado de la prueba es negativo. Esto se determina de la serie de Saludables
Donadores de Sangre, como se muestra en el fondo con su valor promedio más tres veces su desviación estándar (99% intervalo de confianza). Relación ODZCO= OD dividida por el CO del experimento, que distingue resultados positivos (>1) y negativos (<1).
Los resultados igual a 1 se consideran como "no determinados" y muestras correspondientes, o muestra nueva de los mismos individuos, se debe probar nuevamente en un experimento separado para determinación. El valor de la Media (promedio) y la desviación estándar -d.e.- de todas las densidades ópticas se han determinado en cada grupo y sub-grupo de sujetos como se indica abajo:
BD (N=50): valor de la media 0.53, d.e. 0.16.
MS (N=29): valor medio de MS positivo (N=23) 1.27 d.e. 0.22, promedio de MS negativa (N=6) 0.90 d.e. 0.25, valor medio de MS total 1.20 d.e. 0.25.
OND (N=20): valor medio de OND negativo 0.88 d.e. 0.10. CIDP
(N=8): valor medio de CIDP positivo ( =5) 1.12 d.e. 0.09, promedio de CIDP negativo (N=3) 0.9 d.e. 0.03 , promedio de CIDP total 1.04 s.d. 0.13.
Se analizaron los sueros de 29 pacientes con MS de Francia (19 de Creteil, 10 de Grenoble) como una evaluación preliminar de este inmunoensayo en diferentes grupos de pacientes con diversas enfermedades. Los resultados en pacientes con MS se presentan en la Tabla 12a. Diez saludables donadores de sangre se usaron como estándares negativos para la determinación del límite de positividad (de corte o CO, valor de umbral bajo la cual no se detecta señal específica). De acuerdo con el valor de corte estadístico de estas series, 23 pacientes con MS tienen antigenemia MSRV-ENV significativamente positiva (OD media = 0.88), mientras que 6 se puede considerar como negativo, aunque bastante cerca del umbral (OD media de "MS negativa" = 0.62). De manera interesante, los casos de MS negativa fueron de larga duración de formas más benignas (#24, 25, 28) o se sometieron a protocolo de tratamiento de ciclofosfamida.
En paralelo, se analizaron los sueros de 28 pacientes con otras enfermedades neurológicas (OND) (12 de Creteil, 16 de Grenoble). Cinco pacientes tuvieron un resultado positivo, lo que representa alrededor de 18% de pacientes OND probados aquí. No obstante, todos los casos OND positivos tuvieron un diagnostico similar: Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), mientras que pacientes OND con otros diagnósticos fueron todos negativos (o "indeterminado" en el límite de corte como para un caso de síndrome Guillain-Barre agudo). Así, resultados de pacientes OND se presentan en la Tabla 12b como OND sin CIDP por separado de pacientes CIDP (Tabla 12c). Alrededor de la mitad de los casos de CIDP son positivos pero, dado los bajos números presentes, aquí no significa para analizar enfermedades neurológicas "inflamatorias" contra "no inflamatorias". Por otra parte, se ha probado en paralelo sueros de otras enfermedades neurológicas (ONND) tal como 15 pacientes con infección de virus de hepatitis B crónica así como 15 pacientes con infección de virus de hepatitis C crónica. Ninguna de estas 30 muestras se encontró que es positiva. Los sueros polireactivos de 30 pacientes con anti-ADN, factor anti-núcleo y anti-reumatoide, usualmente interfieren con numerosas pruebas serológicas, no rindieron ningún resultado positivo tampoco. Cincuenta sueros de saludables donadores de sangre también se probaron en paralelo. Ninguna se encontró que es positiva.
La comparación de los resultados del grupo MS con cualquier otro grupo muestra una diferencia importante, excepto para el sub-grupo CIDP. Los valores de densidad óptica de los grupos de MS completo y OND (que incluyen MS negativo y CIDP), cuando se compara con una prueba no paramétrica (normalmente prueba fallida), son muy significativamente diferentes (p = <0,001 ; prueba T de suma de rango de Mann-Whitney = 517,000). Cuando se compara el grupo MS completo con todos los casos CIDP, una diferencia estadística no se puede encontrar por más tiempo (p = 0,053 ; prueba T de suma de rango de Mann-Whitney = 99,000). No se evidenció cualquier diferencia importante entre valores OD de "MS positivo" y de "CIDP positivo" (P= 0,072; prueba T de suma de rango de Mann-Whitney = 42,000).
Serie de suero multi-céntrico Europea con pruebas ciegas: Esclerosis múltiple -MS- y Síndrome Clínicamente Aislado -CIS.
Con objeto de confirmar los primeros resultados con un panel más grande de pacientes con MS de áreas geográficas diferentes, se incluyeron los sueros dentro de una colaboración multicéntrica con departamentos neurológicos de diferentes países Europeos. En estas muestras, se usa una lectura luminométrica con objeto de mejorar la detección de señal y diferenciación con "ruido" de fondo no específico.
Después de evaluaciones internas de sueros con el método calorimétrico, la comparación con lectura de luminometría confirma aumento dé detección de señal y dinámicos. Por lo tanto, una muestra de sueros para ensayo cuadruplicado se hizo en pacientes con MS seleccionados aleatoriamente con todas las formas y duraciones de enfermedad, sobre todo con tratamiento específico en curso, pero qUe representa cada origen geográfico de la presente red clínica. Ellos se codificaron y enviaron para pruebas ciegas a un laboratorio centralizado (tecnologías APO-H, Montpellier, Francia). Los sueros no codificados (10 controles negativos y 10 con MS positiva) se enviaron para validación técnica para determinación del valor de corte. Además, 14 sueros de síndrome clínicamente aislado (CIS, episodio neurológico sencillo y formación de imagen adicional y/o anormalidades biológicas) se enviaron codificados y probaron en ciego dentro de esta serie. Esto fue una primera evaluación en CIS y se esperó para comprender una mayoría de primeros episodios de MS.
Los resultados se presentan en la Figura 8 (ApoH-ELISA resulta de sueros del estudio multicéntrico Europeo probados a ciegas en un laboratorio independiente). Ellos se expresan como la relación de unidades luminométricas (RLU) divididas por el valor de corte determinada dentro de los mismos experimentos, por lo tanto es comparable con la relación de las series previas (Cf. Tabla 9). En efecto, el intervalo de relaciones (1 hasta 6) aquí obtenido dentro de sueros de "MS positiva" con luminometría confirma la optimización técnica de dinámicos de señal comparados con colorimetría (1 hasta 2).
ApoH-ELISA resulta de sueros del estudio multicéntrico Europeo probado en ciego en un laboratorio independiente.
La técnica de lectura usada fue luminometría y los resultados se presentan en el eje Y como la relación de unidades luminométricas individuales (RLU) divididas por el Valor de Corte determinado en series de sueros negativos de referencia dentro del mismo experimento. Así, los valores >1 son positivos.
Los análisis estadísticos de luminometría APO-H ELISA resultan entre grupos dando los siguientes resultados (valores de prueba p Fisher): (i) que compara BD vs. MS general, BD vs. MS general + CIS, BD vs. RRMS, BD vs. PPMS, BD vs. SPMS, BD vs. CIS: p<0.001 ; (ii) que compara CIS vs. RRMS : p=0.759, CIS vs. PPMS : p=0.704, CIS vs. SPMS : p=0.749, RRMS vs. PPMS, SPMS : p=l , PPMS vs. SPMS : p=l .
En este caso, 54 de 74 casos con MS no seleccionados (73 %), originados de los diferentes países y regiones del estudio, tuvieron una antigenemia positiva para proteína MSRV ENV, pero ninguno de los 26 BD codificados (como para los 10 BD no codificados usados como muestras de referencia para el experimento). La presente diferencia entre MS y BD fue altamente significativa (Chi cuadrada: p<0,0001), pero "series no ciegas" separadas con números mayores (sobre un centenar) detecta pocos donadores de sangre saludables positivos o asintomáticos (4/103 ; no mostrado). De manera interesante, 9 de 14 CIS (alrededor de 64%) fueron positivos, pero con valores bajos.
Los valores de diferentes grupos (MS, BD, CIS) así como de diferentes sub-grupos representan diferentes formas de MS, progresiva primaria (PPMS), progresiva secundaria (SPMS) y remitente recurrente (RRMS) se compararon con la prueba de Fischer. Los resultados de los donadores de sangre saludables fueron significativamente diferentes de todas las combinaciones MS y CIS (constantemente p<0,001), mientras que la diferencia no significativa en la detección de antigenemia MSRV ENV se evidenció entre cualquier sub-grupo que representa cualquiera de las formas de evolución de enfermedad (CIS) posible o MS definido, o MS diferente (71 % fueron positivos en RRMS, 78% en PPMS, 70% en SPMS). No obstante, una tendencia ligera de heterogeneidad en sub-grupos CIS contra MS se ilustra por valores p más bajos: p=0.7 hasta 0.75, contra p=l entre formas MS, el último valor que revela distribución de resultado estadísticamente idéntica.
8b. Serie de enfermedades psiquiátricas : Esquizofrenia-SCZ.
Pacientes y Métodos
Pacientes y controles saludables
Pacientes, criterios de DSM-IV satisfactorio (American Psychiatric Association: Diagnostic and statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV; 1994) para esquizofrenia se seleccionaron aleatoriamente al final de una hospitalización para un episodio agudo en un departamento psiquiátrico afiliado a la universidad francesa. El trastorno neurológico, infección aguda o crónica, y serología positiva para Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV1 +2), Virus de Hepatitis B y C fueron criterios de exclusión. La distribución por edad y género en estos controles normales no fue estadísticamente diferente del presente grupos de pacientes. Los síntomas psicóticos se evaluaron con la versión francesa de los Signos y Síntomas de escala de enfermedad psicótica -S SPI-(Houenou et al. ,2007). Los síntomas de humor se evaluaron con la escala de clasificación de mania de Bech y Rafaelsen y la escala de clasificación de depresión de Montgomery y Asberg -MADRS-(Bech et al., 1978 ; Montgomery and Asberg, 1979). El protocolo se aprobó por comité de ética local. El consentimiento de informe firmado se obtuvo de todos los sujetos, después de completar la descripción del estudio por el psiquiatra a cargo de las evaluaciones clínicas de pacientes.
Recolección de suero
Un tubo (tubo seco de 7ml B&D) de sangre se trató dentro de 2 horas después de la colección: después de la coagulación se centrifugaron 10 minutos en 2800g y 14°C. El suero se recolectó, se formaron alícuotas en tubos de bajo enlace y almacenó a -80°C.
Inmunoensayo
Las pruebas ELISA con etapa de captura APO-H (Stefas et al., 1997) se realizaron con IgGs monoclonales (2A12A5, 6A2B2 para MSRV ENV y 2G5E12 para MSRV GAG), producidas y separadas por exclusión para especificidad por bioMerieux, Marcy L'Etoile, Francia.
? ??µ? por pozo de las muestras diluidas 1/10 en Tris-HCI 50mM pH7.6 se cargaron en microplacas recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier-Francia). Las microplacas se incubaron 2 horas a 37°C, se lavaron cuatro veces con 250 µ? de PBS por pozo. 100 µ? por pozo de anticuerpo primario (10 µg/ml en 2% PBS-BSA,) se agregaron, las microplacas se incubaron 1 hora a 37°C y se lavaron cuatro veces con 0.05% PBST más dos veces con PBS. 100 µ? por pozo de anticuerpo etiquetado con peroxidasa (antiratón Jackson, 1/250 en 2% PBS-BSA) se agregaron, las microplacas se incubaron 1 hora a 37°C y se lavaron como antes. 100 µ? de solución de
sustrato (OPD) por pozo se agregó, las microplacas se incubaron 30 minutos en la oscuridad y la reacción se detuvo con H2S04 2N (50µ1/????). La absorbancia se leyó a 490nm con un lector de Biotek.
Análisis Estadísticos:
Estos se realizaron con Software SigmaStat. La prueba no paramétrica, prueba de Suma de Rango Mann-Whitney se seleccionó para comparación de series de datos, ya que su distribución nunca equipó la distribución Normal (Prueba Normalmente fallida). La prueba de Chi-Cuadrada se usó para comparar la prevalencia de antigenemia positiva contra negativa en cada población, para cada antígeno y/o cada anticuerpo usado. El valor de corte para cada afección, en la que los resultados son, se calculó de serie estadística de controles negativos como su valor promedio más tres desviaciones estándar (M+3SD; importancia de positividad: p<0.01) y confirmó en muestras de referencia positiva y negativa.
Resultados
49 pacientes esquizofrénicos y 49 controles, emparejados por edad (33 +/- 6.5 años) y sexo (73% hombres, 27% mujeres), se han incluido. Ocho pacientes se incluyeron en la primera aparición de trastorno esquizofrénico, mientras que la mayoría (N = 41) tenía esquizofrenia crónica grave. Fueron eutímicos en la inclusión ambos para puntuaciones de depresión (MADRS media = 5.6 + 6.6) y para puntuación de maníaco (puntuación de Bech media = 4.8 + 4.5). Todos los pacientes excepto uno sin tratar, tomaron fármacos antipsicóticos (27% clásicos y 71 % antipsicóticos atípicos. Un tercio de los pacientes (N = 13) fueron resistentes al fármaco de acuerdo con los criterios de Kane (Kane 1996).
Para antígeno MSRV GAG, 49 controles y 49 pacientes esquizofrénicos se probaron. Para 30 controles MSRV ENV (debido a limitaciones técnicas) y 49 pacientes esquizofrénicos se probaron. Los resultados del inmuno ensayo se expresan como densidad óptica media obtenida en duplicados de suero dividido por el valor de corte, con objeto de hacer toda la serie comparable con valores normalizados (figura 22 y tabla 10).
47% (N = 23) y 43% (N=21) de sujetos esquizofrénicos tuvieron antigenemia MSRV ENV positiva, respectivamente con anticuerpos 2A12A5 y 6A2B2. 49% (N= 24) de pacientes esquizofrénicos tuvieron antigenemia MSRV GAG positiva, uno siendo positivo y uno de ellos "en el límite" para GAG solamente. La comparación con los controles saludables revela una diferencia importante en la prevalencia de positivos (prueba de Chi-cuadrada: p<0.001 para ambas detecciones ENV; p<0.0001 para GAG). Comparando valores ELISA en pacientes contra controles con Prueba de Suma de Rango de Mann-Whitney también confirma diferencias altamente significativas (p<0.001 ; Tabla 2). Entre los controles, un sujeto tuvo antigenemia significativamente positiva. De manera interesante, hubo una correlación positiva entre los resultados para proteína ENV y aquellas obtenidas para proteína GAG. La prueba de suma de rango de Mann-
Whitney que compara valores ELISA obtenidos con anti-ENV6A2B2 con aquellos obtenidos para anti-GAG 2G5E12 no revelan diferencia significativa (p = 0.744), como para anti-ENV-2A12A5 comparado con anti-GAG-2G5E12 (p = 0.290), y para anti-ENV-6A2B2 comparado con anti-ENV-2A12A5 (p = 0.159). Por lo tanto, estos anticuerpos detectan una expresión equivalente y/o paralela de antígenos MSRV:
Los valores ELISA de antigenemia "ENV" variaron entre los positivos, como se muestra en la Tabla 10 por las desviaciones estándar incrementadas (0.28 para anticuerpo 2A12A5, 0.48 para 6A2BA) comparadas con controles negativos (0.09 y 0.08 respectivamente). Esto confirma la detección de una producción dinámica de antígenos MSRV en ciertos pacientes con Esquizofrenia.
TABLA 13 : Dosis de cápsida MSRV (GAG) y de envolvente (ENV) en el suero de pacientes (SCZ) esquizofrénicos y controles
MSRV ENV MSRV GAG
Anticuerpo 2A12A5 Anticuerpo 6A2B2 Anticuerpo 2G5E12
Número de SCZ Controles SCZ Controles SCZ Controles positivos por
Sueros en 23/49 1/30 21/49 0/30 24/49 2/49
Poblaciones
probadas
46,94% 3,33% 42,86% 0,00% 48,98% 4,08%
Número de CHI2=16,73 CHI2=17,51 CHI2=25,34
Positivos en SCZ (P<0,001) (P<0,001) (P<0,001) contra BD:
Prueba Chi-Cuadrada - Desviación Positivo Neg. Positivo Neg. Positiv Neg. estándar: sueros SCZ controles SCZ controles o controles
SCZ 0,28 0,09 0,48 0,08 SCZ 0,15 positivos/sueros 0,47
de controles
negativos
Número de T=603,000 T=638,000 T=1451,500 positivos en SCZ (P=<0,001) (P=<0,001) (P=<0,001) contra Prueba de
Suma de Rango
de Mann-WhitneyBD
SCZ: Pacientes Esquizofrénicos; BD: Sangre
La relación de prueba (ELISA) de inmunoensayo (eje Y) es la densidad óptica promedio medida en pozos duplicados del mismo suero dividido por el valor de corte de la serie correspondiente (Cf. Materials and
Methods). El antígeno ENV se dosifica con cualquier anticuerpo monoclonal 2A12A5 o anticuerpo monoclonal 6A2B2 y GAG es antígeno dosificado con monoclonal anticuerpo 2G5E12 como se indica en las columnas respectivas con valores trazados.
En la Figura 9, el valor promedio e intervalos de confianza (0,01 y
0,001) se representan por barras y recuadros, y la distribución de valores
máximos y mínimos para cada antígeno y anticuerpo (indicado en la parte superior de cada columna) se representan por puntos. La serie de valores de pacientes con Esquizofrenia se indica como "SCZ" en el fondo de trazados correspondientes, y aquellos de saludables donadores de sangre se etiquetan "Controles" (Fondo/eje X).
8c. Otras Enfermedades Neurológicas : Epilepsia.
Las pruebas ELISA se realizaron como se describe anteriormente
(8b). Los pacientes con Epilepsia y controles normales se probaron en paralelo por la presencia de proteína MSRV-ENV en sus sueros. Los resultados se presentan en la Figura 10.
Cada barra vertical representa la OD media de resultados duplicados del suero de un paciente sencillo con epilepsia (38 de la izquierda) o control (24 de la derecha).
La barra horizontal negra representa el valor de corte de la prueba, por encima del cual la señal detectada es específica de presencia de antígeno en suero. Esto se determina por el promedio de resultados de los saludables donadores de sangre (controles) más tres veces su desviación estándar.
Por lo tanto, aquí, hemos detectado un sub-grupo de 8 pacientes con Epilepsia asociada con MSRV-ENV, que puede simplemente corresponder a un subgrupo con esta etiología particular entre otros casos con una causa etiológica diferente. Solamente Epilepsia positiva MSRV es relevante para el tratamiento con Ligando anti-ENV en, por ejemplo vectores de anticuerpo.
8d: Pacientes con Psoriasis.
Se conoce de hace mucho tiempo que los pacientes con Psoriasis expresan retrovirus similares (Iversen, O.J. (1990), "The expression of retrovirus-like particles in psoriasis." J Invest Dermatol 95(5 Suppl): 41 S-43SJ Bjerke, J. R., G. Haukenes, et al. (1983), "Activated T lymphocytes, interferon, and retrovirus-like particles in psoriatic lesions." Arch Dermatol 1 19(12): 955-6). Por lo tanto, su relevancia para los presentes vectores terapéuticos que comprenden el ligando es obvia para el experto en la técnica.
EJEMPLO 9: Eficiencia in vivo de vectores farmacéuticos que comprenden el ligando y retienen la afinidad de ligando con características de actividad, contra GNbACl. Evidencia in vivo de efectos anti-inflamatorios, irimunoprotectores y neuroprotectores del ligando, suministrados bajo la forma de un Ligando vectorizado con un compuesto de vector farmacológico apropiado: Ejemplo de efecto terapéutico en modelos animales con neuro-inflamación, desmielinización y/o degeneración neuronal.
Materiales y Métodos:
EAE inducido por MSRV/ENV en modelo de ratón SCID humanizados (huSCID).
Los ratones SCID de 6 hasta 8 semanas de edad libres de patógeno se adquirieron de Charles River, Francia. La humanización de ratones se alcanzó usando PBMCs de saludables donadores de sangre (Etablissement
Francais du Sang, Lyon, Francia), de acuerdo con el protocolo previamente descrito (Firouzi et al., 2003). En particular, los ratones se irradiaron con gamma y anticuerpo anti-NK recibido antes de la humanización con 50x106 PBMCs humanos por inyección intraperitoneal (i.p.). La calidad de humanización se controló luego por detección específica de inmuno globulina humana en suero de ratón. Cuando más de un donador por cada serie es necesario, todos los sub-grupos huSCID se hicieron comparables con la misma proporción de ratones humanizados con cada donación de sangre.
Un retraso de 2 semanas antes de la inclusión en el protocolo EAE
(antes de la primera inyección con antígeno de mielina) fue necesario. Luego, los grupos de ratones se inyectaron ya sea con proteína básica de mielina (MBP) y Adyuvante de Freund incompleto (IFA, que comprende diluyentes solamente) para grupos de "control simulado", o inyectados con MBP y proteína MSRV ENV libre de endotoxina purificada homogeneizada en diluyentes IFA para EAE "inducido por ENV". Cuando la actividad de enfermedad se vigiló clínicamente y por MRI para haber causado lesiones y progreso de déficits clínicos, el efecto de un anti-ENV seleccionado. Los ligandos comparados con el anticuerpo monoclonal de murino original (GNb_ACl), se estudio con inyección en ratones enfermos (MBP-EAE inducido por ENV en ratones huSCID).
Para la inducción o "inducción simulada" de animales EAE se inyectaron primero s.c. en el cuello el día 0, ya sea con 50µ§ de MBP humano + 15(^g de péptido MBP (péptido MBP 87-99) + 2(^g de proteína ENV recombinante + IFA (grupo ENV) o con 50 g de MBP humano + 15(^g de péptido MBP (péptido MBP 87-99) + IFA solamente (grupo control). 200ng de toxina de pertusis (PTX) por animal fue también i.p. 2 días después en todos los grupos. Una segunda inyección por la vía intraperitoneal (i.p.) de los mismos componentes en la misma dosis (incluyendo el péptido MBP y proteína completa MBP humana), que corresponde a la descripción previa para cada grupo, se realizó el día indicado (Tabla 1 1). Se realizó también por inyección similar de 200 ng por animal de PTX. La tercera y última inyección de los mismos inmunógenos se hizo s.c. en el lado opuesto del cuello en el día indicado (Tabla 14), realizado por inyección similar de PTX.
Grupos Descripción Inyectado Componentes MAh Evaluación clínica
- FA V (20 (100µ§ Puntuación MRI en días) clínica (días)
1 Ratones X X diaria 17;24;31;
Control 43;50
2 Ratones X X 19;35 diaria 17;24;31;
Control 43;50
3 Ratones X X X diaria 17;24;31;
EAE 43;50
4 Ratones X X X 35 diaria 17;24;31; EAE 43;50
5 Ratones X X X 19;35 diaria 17;24;31;
EAE 43;50
Tabla 14 : Serie pre-clínica de evaluación de tratamiento de anticuerpo: descripción de los diferentes grupos y protocolos para "MBP-EAE" control e inducidos por ENV en ratones Hu-SCID.
Para el seguimiento, los animales se pesaron 5 días por semana y anotaron clínicamente. La puntuación clínica se hizo de acuerdo con el siguiente criterio: 0 = sin señales; 1 = parálisis de cola o hiper-reflexia de extremidades posteriores o debilidad de extremidad posterior unilateral; 2 = debilidad de extremidad anterior o extremidad posterior bilateral; 3 = más parálisis unilateral o mayor déficit; 4 = parálisis de extremidad anterior y extremidad posterior completa; 5 = más parálisis parcial o mayor déficit de extremidades opuestas; 6 = moribundos o muertos.
La duración total de los experimentos Hu-SCID no exceden dos meses, con la excepción de los estudios de supervivencia que implican el mAb tratado y ratones de control (cuatro meses).
MRI y análisis Inmunohistoquímico (Las imágenes no se muestran en el presente ejemplo) :
Los animales se monitorearon por análisis ponderado MRI T2 e histología postmortem, que confirman tanto los tipos de lesiones con
inflamación y diesmielinización en el sistema nervioso central, así como notable mejora de formación de imagen (MRI) de patrones inflamatorios en ratones tratados con mejoría clínica.
Resultados :
Los ratones SCID con sistema linfoide humano (injertados como se indicó anteriormente) proporcionan animales híbridos con un sistema inmunitario humano funcional. Estos animales han recibido tres inyecciones de proteína MSRV ENV emulsificada con MBP en diluyentes aceitosos (IFA), en días indicados por las flechas azules. Cuando los animales han elevado puntuaciones clínicas con neuroinflamación en curso visualizada por MRI (EAE), que fueron inyectados con una dosis sencilla (10 µg intraperitonealmente) del anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1 , indicado como mulgG en la figura 10) o de uno del IgGI humano o constructos de lgG4 con el ligando (indicado como hulgGI y hulgG4 en la Figura 1 1). Un grupo se mantuvo no tratado, con objeto de comparar con animales tratados y el grupo de "control simulado" inyectado con MBP en IFA sin ENV se mantuvieron saludables, pero recibieron una inyección del anticuerpo de murino original (GNbACl) en el mismo día como los animales enfermos tratados.
Como se puede ver de los resultados ilustrados en las Figuras 1 1 y 12, todos los ratones no tratados murieron después de 30 días y tuvieron progresión clínica severa después de la última de las tres inyecciones con proteína MSRV ENV. Diversas lesiones se vieron por histología e inmunohistología, que evidencia la desmielinización, infiltración celular linfoide, . enfermedad neuronal, ruptura de barrera hematoencefálica y astrogliosis. De manera interesante, en Esclerosis Múltiple, la ruptura de barrera hematoencefálica también es un sello de lesiones CNS activas.
Así, el anticuerpo de murino o el IgGI o 4 humano quimérico que comprende el ligando que dirige ENV, podría difundir a partir de inyección intraperitoneal al cuerpo completo y, en particular, a las lesiones CNS activas en animales enfermos.
Sorprendentemente, las curvas de sobrevivencia muestran 100% de supervivencia en animales tratados con ya sea anticuerpos quiméricos IgGI o lgG4 contra 0% en los no tratados el día 35. Sorprendentemente, el lgGl/kapa de murino original (GNbACl) tiene menos eficiencia cuando se inyecta a la misma dosis, ya que un animal muere en el día 28. Además, las curvas clínicas en la figura 1 1 muestran una mejora muy buena y duradera en animales tratados con constructos IgGI o 4 humanos, pero solamente estabilización o leve mejoría en animales tratados con el anticuerpo de murino original.
Una mejora tan notable de animales tratados con Ligando en vectores
IgGI o lgG4 humanos, también se evidenció por seguimiento de MRI, comparado con controles no tratados.
Por lo tanto, la eficiencia clínica del IgGl o 4 quimérico humano se confirma en modelos animales que muestran neuroinflamación, desmielinización, enfermedad neuronal, ruptura de barrera hematoencefálica y astrogliosis en el Sistema Nervioso Central (CNS; Cf. Hu-SCID y C57/bl6 modelos inyectados con proteína MSRV ENV). Sorprendentemente, la eficiencia se mejora, comparado con el IgG de murino original que contiene el mismo Ligando (cadenas VH+VL).
Por lo tanto, la eficacia terapéutica en el presente modelo animal de neuroinflamación se hace obvia para otras aplicaciones en enfermedades asociadas MSRV- o síndromes, como se define en el texto de la presente invención.
Además el "Efecto de ligando" inesperado de una composición mínima o construcción que comprende los 6 CDRs definidos en el ejemplo 1 , hace esto posibe para usar el ligando de forma total independientemente de funciones de anticuerpo, pero también para variar y elegir los valores agregados e intereses relativos de diferentes vectores (no exclusivamente en relación con isotipos IgG) para cada aplicación terapéutica posible.
EJEMPLO 10 : Proteína MSRV- ENV se detecta con gran intensidad en ciertas células de biopsias en pacientes con tumor sólido o de biopsias en pacientes con trastornos linfoproliferativos o cánceres linfoides.
Materiales y Métodos:
- Anticuerpo de prueba
GNb AC 1 , 1.0 mi, concentración: 5.918 mg/ml
- Anticuerpo de Control Negativo
Proteína IgGI kapa de Mieloma de ratón (MOPC-21 , Sigma), 1.0 mi, concentración: 1 .0 mg/ml
Este anticuerpo se usó al mismo tiempo con el anticuerpo de prueba.
- Proteína de inhibición
ENV-T (MSRV ENV, GeNeuro SA), 10 mi (10 x 1 mi viales), Concentración: 0.05 mg/ml
Este anti-ligando se usó al mismo tiempo con el anticuerpo de prueba. - Muestras de Tejido Humano
Los tejidos humanos éticamente recolectados con el completo consentimiento del paciente se obtuvieron de una fuente externa.
Todos los tejidos se sometieron a pruebas de antogenicidad. Una sección manchada de IHC de una proteína comúnmente expresada; S I 00, CD45, desmina, citoqueratina o vimentina asociada con cada tejido se probó antes de considerar los tejidos aceptables para usar en este estudio.
- Validación de Ensayo
Los parámetros investigados incluyen:
1. Comparación de tinción en el tejido de control positivo usando formalina amortiguada neutral, paraformaldehldo y fijación de acetona. 2. El uso de un método de detección de inmunotinción apropiado.
3. Óptima determinación de título del anticuerpo de prueba, desde 0 a 5.0 µ^/??? se investigó (el anticuerpo de control isotipo se ejecutó en las mismas concentraciones).
4. La especificidad de la tinción se validó por omisión del anticuerpo de prueba que se sustituye con solución amortiguadora. Además los sitios de enlace antigénicos de MSRV se bloquearon usando proteína ENV-T antes de la incubación del tejido.
5. Cualquier bloqueo necesario de materiales endógenos que podrían interferir con señal de antígeno objetivo se empleó.
- Método de Tinción lnmunohistoquímica (IHC)
Como un resultado de los descubrimientos de la fase de validación cada una de las muestras de tejido se separaron por exclusión simultáneamente de la siguiente manera:
· GNbACl omitido del procedimiento de tinción
• MOPC-21 anticuerpo a 1.0 µg ml
• GNbACl a 0.25, 1.0 y 3.0 µg/ml
Cada muestra de tejido se evaluó usando un microscopio de luz. El sistema de puntuación identifica tejido y tipo de célula y refleja subjetivamente la intensidad de esa tinción.
Toda la tinción en los tejidos tratados con ya sea el anticuerpo de control negativo o sin anticuerpo, y que no delinea específicamente células individuales, se supusieron que son no específicos. La tinción no específica se registro para tejidos tratados con el anticuerpo de prueba cuando la tinción inmunohistoquímica en estos tejidos fue similar en intensidad y distribución a tejidos que no se trataron con el anticuerpo de prueba y donde las células individuales no se delimitaron específicamente.
La tinción positiva se registró al nombrar la estructura de tejido o tipos de células y luego indicar la intensidad como sigue:
0 Negativo
+ Leve
++ Moderado
+++ Marcado
La frecuencia de tinción identificada en cada tipo de célula se indicó como sigue:
<10% Poca
1 1 -40% Varias
41 -75% Muchas
>76% Mayoría
Si una sección no se consideró adecuada para la evaluación sin datos se incluyó para ello en la tabla de resultados hasta que, siempre que sea posible, la tinción se repitió.
Hubo menos tinción de membrana en 0.25 µg/ml comparado con las otras diluciones probadas.
El tejido hepático se incluyó como una comparación entre un control positivo conocido y un tejido que no se identificó inicialmente como que es positivo.
No se identificó tinción significativa en la solución amortiguadora negativa control o isotipo. La tinción positiva comparada con los tejidos teñidos positivamente se eliminó virtualmente cuando ENV-T se reaccionó con anticuerpo GNbACl anti-MSRV/ENV.
Para el trabajo futuro de cribado la prueba Mab, GNb AC1, se usó en 1.00 µg.mr"1 como la concentración óptima, con 3.00 µg.mG1 como un paso por arriba de ese y 0.25 µg.m I como la concentración baja.
Como un resultado de los descubrimientos de la validación, el siguiente procedimiento de tinción IHC se adoptó para la cribado del tejido humano normal congelado.
Procedimiento Tiempo
Tejido secado por aire N/A
secciones
Fijado en acetona y secado al aire 10 minutos aprox.
Lavar en agua de la llave N/A
Peróxido de hidrógeno al 0.3 % en metanol Aprox. 10 mins.
Lavar en agua de la llave Aprox. 5 mins.
Lavar en PBS Aprox .5 mins.
Incubar con anticuerpo monoclonal Durante la noche a 2-8°C
GNb AC1 a 0.25, 1.0 y 3.0 µg/ml y
con el isotipo control en 1 .0 µg/ml.
También omitir primaria de procedimiento
De tinción e inhibir con ENV-T en 10 µg/ml
con GNb AC1 en 1.0 µg/ml
Lavar en PBS Aprox. 5 mins.
Incubar con EnVision/HRP Aprox. 30 mins. Lavar en PBS X2 Aprox. 5 mins. cada uno
Tratar con sustrato de enzima DAB Aprox. 5 mins.
Lavar en agua de la llave Aprox. 5 mins.
Contratinción en Haematoxilina Mayers Aprox. 15 segs.
Lavar en agua de la llave Como se requiera
Deshidratar, aclarar y montar Como se requiera
Resultados:
-Cáncer de mama.
Microscópico
Conclusiones ENV-T Isotipo Anticuerpo concentración ug/ml
10.00 1.00 0.00 0.25 1.00 3.00
Mama Epitelio 0 0 0 Pocos Varios Pocos
Ductal/
Granular
(mamario) Citoplásmico/ + +
Membrana
Contenidos Varios Pocos Luminales
+
(carcinoma Superficie Varios Muchos in situ) Luminal
++ ++
Vaso Muchos Pocos sanguíneo- Endotelio
Citoplásmico/ ++ + Membrana
Epitelio Pocos Muchos
Ductal/
glandular
Citoplásmico/ + +
Membrana
Contenidos 0 Varios Varios Varios Varios Varios Luminales
+ + + ++
(adeno- Superficie Pocos Muchos carcinoma Luminal
de mama) +
Vasos- Varios Muchos Endotelio
Citoplásmico/
Membrana
Epitelio Pocos Varios
Ductal/
granular
Citoplásmico/
Membrana
Contenidos
Luminales
(adeno- Superficie Varios La carcinoma Luminal Mayoría de mama) + ++
Vasos- Varios Varios Endotelio
Citoplásmico/ +
Membrana
Tabla 15: Resultados obtenidos con tejidos de carcinoma de pecho de diferentes individuos.
INTENSIDAD Negativa 0 Leve + Moderada ++ Marcada +++ FRECUENCIA Pocos Varios Muchos La mayoría
Por lo tanto se puede evidenciar que MSRV ENV se expresa altamente en células epiteliales ductal/granular y en células endoteliales de vasos sanguíneos circundantes en 3/3 tumores mamarios de pecho probados con GnbAC l específico. Por lo tanto, de acuerdo a la noción de
" enfermedades asociadas a MSRV", ahora es evidente que el carcinoma de
cáncer de pecho es una de estas enfermedades humanas.
Cáncer Linfoide y trastornos linfoproliferativos:
Concentración de anticuerpo ug/ml
Microscópico ENV-T Isotipo GNb AC1
Conclusiones
10.00 1.00 0.00 0.25 1.00 3.00
Amígdala Membrana de 0 0 0 Varios Muchos Varios
Citoplasma ¦++ -H- Linfoide
Membrana de 0 Pocos Muchos Muchos Citoplasma de ++
vasos
endoteliales
++ +++
(hiperplasia
folicular) Membrana de Muchos La La citoplasma mayoría mayoría linfoide ¦++ -H- -H- Membrana de 0 Pocos Muchos Muchos citoplasma de ++
vasos
endoteliales
++
(hiperplasia
fohcular) Células Muchos 0 NI NI NI blancas en
vasos de
membrana de
citoplasma
++
Tabla 16 : Resultados obtenidos con tejidos linfoides hiperplásicos de
diferentes individuos.
INTENSIDAD Negativa 0 Leve + Moderada ++ Marcada +++;
FRECUENCIA Pocos Varios Muchos La mayoría; NP : No es Practicable
Por lo tanto se puede evidenciar que MSRV ENV se expresa altamente en células linfoides y en células endoteliales de vasos sanguíneos
circundantes en 2/2 biopsias de amígdalas con hiperplasia marcada de
pacientes con trastorno linfoproliferativo, cuando se prueba con GNbAC l .
Por lo tanto, de acuerdo con la noción de "enfermedades asociadas a
MSRV", ahora es evidente que los trastornos linfoproliferativos, incluyendo cánceres de célula linfoide, se encuentran entre estas enfermedades humanas.
- Cáncer Renal
Concentración de anticuerpo
microg/ml
Conclusiones E V-T Isotipo GNb AC1
microscópicas
10.00 1.00 0.00 0.25 1.00 3.00
Citoplasmico 0 0 0 Pocos Pocos Muchos de superficie + +
de lumen de
túbulo/
Membrana
Membrana 0 0 0 0 0 0
Mesangial
Glomerular/
Citoplasma
(cáncer de
riñon) Endotelio de 0 0 0 Pocos Pocos NI curvas de
vasos
glomeralares/
Citoplasma
Moldes de Muchos La tabulo mayoría
+
Pocos Varios Varios
+ ++ ++
Membrana Pocos Pocos Pocos mesangiales +++
glomerular/
Citoplasma
(carcinoma Capsula de Varios Varios celular Bowmen
renal) +++ +++
Endotelio de Muchos La curvas de mayoría vaso +++ +++ glomerular/
Citoplasma
Cilindros de Pocos Pocos Pocos túbulo
+ + +
Tabla 17: Resultados obtenidos con tejidos de carcinoma renal de diferentes individuos.
INTENSIDAD Negativa 0 Leve + Moderada ++ Marcada +++; FRECUENCIA Pocos Varios Muchos La mayoría; NP: No Practicable
A pesar de la tinción de fondo de luz en un tipo de célula (diferente en cada caso), el análisis fue practicable y por lo tanto se puede evidenciar que MSRV ENV se expresa altamente en células renales y en células endoteliales de vasos sanguíneos circundantes en 2/2 biopsias renales de pacientes con carcinoma renal, cuando se prueba con anticuerpo ENV anti-MSRV específico (GNbAC l).
Por lo tanto, de acuerdo con la noción de "enfermedades asociadas a MSRV", ahora es evidente que los cánceres hepáticos, son una de estas enfermedades humanas.
Los párrafos correspondientes de visualización de microscopía de luz de
secciones de tejido teñidas con ya sea anticuerpo anti-ENV específico (GNb AC1) o anticuerpo de control irrelevante (MOPC-21) han confirmado las
conclusiones presentadas en las Tablas 15-17, para Cánceres hepáticos para Cánceres linfoides o trastornos linfoproliferativos y para Cáncer de Mama
EJEMPLO 11 ; A. Proteínas MSRV ENV y GAG se detectan con niveles significativos y concordantes en el suero de ciertos casos agudos que desarrollan diabetes:
Los sueros de pacientes con diabetes dependiente de insulina aguda se recolectaron de forma anónima de volúmenes restantes después de pruebas de rutina para diagnóstico y propósitos de seguimiento. Los sueros de saludables donadores de sangre se obtuvieron de organización de banco de sangre habilitada.
Los sueros se probaron de acuerdo a la técnica de inmunodetección usando placas de captura APO-H y detección de ligando específico, como se describió previamente en ejemplos de la presente invención.
La tabla de abajo proporciona la densidad óptica media en pruebas por triplicado, medida a partir de suero de pacientes con diabetes aguda (Diab.) y de donadores de sangre representativos (BD).
Se usaron ligandos de anticuerpo monoclonal de murino anti-MSRV: - Un anti-Envolvente (ENV) GNbAC l (Geneuro, Suiza).
- Un anti-Matrix y poliproteína de Cápsida (GAG): 2G5E12
(bioMerieux Francia).
El enlace específico de estos anticuerpos se reveló por un anticuerpo anti-ratón secundario (Jackson, USA, ref. 1 15-035-146). Las diluciones o concentraciones usadas se indican en la tabla de abajo.
Los resultados son significativos cuando la relación (P/N) de la densidad óptica media dividida por el valor de corte (determinados del valor medio de controles saludables más dos desviaciones estándar -SD- de la serie correspondiente) son mayores que uno.
Tales valores están en negritas y caracteres más grandes en las filas
P/N 2.
Por lo tanto se puede evidenciar que diez de los dieciocho pacientes tienen antigenemia significativa por al menos proteína ENV, detectada por el anticuerpo monoclonal de murino de Ligando. Todos los pacientes "MSRV-positivos" se detectan por los dos anticuerpos y tienen resultados significativos para ambas proteínas GAG y ENV.
Tales resultados con detección coincidente de dos diferentes anticuerpos monoclonales que dirigen dos diferentes epítopos que representan dos diferentes proteínas MSRV (ENV y GAG), son obviamente significativos y valido en términos de asociación con MSRV como se describe en otra parte en la presente invención, para la determinación de enfermedades asociadas con MSRV.
Por lo tanto, diabetes Tipo I u otra asociada con inflamación comprende un sub-grupo de pacientes cuya patogénesis de enfermedad se puede causar por los efectos pro-inflamatorios e inmunopatogénicos de proteína MSRV ENV.
Tabla 18: Resultados de antigenemia APOH-ELISA en pacientes con diabetes (Diab.) comparado con donadores saludables (BD). Comentarios detallados Cf. En el texto del ejemplo.
P/N 2=relación de densidad óptica calculada como el resultado de la muestra dividido por el valor de Corte. El último se determina con donadores saludables como la media de grupo saludable + dos veces su desviación estándar.
EJEMPLO 12: Descubrimiento inesperado de un modelo de animal apropiado para Diabetes inducida por ENV.
1. Introducción
El modelo de ratón muíante espontáneo (NOD-SCID) SCID diabético no obeso tiene la mutación SCID transferida en un historial NOD susceptible a diabetes. Sorprendentemente, los experimentos preliminares conducidos por el Solicitante revelan que la inmunización primaria de ratones NOD-SCID humanizados con proteína ENV (25 µg) y MBP murino (proteína y péptido) llevan sistemáticamente a una muerte rápida de todos los animales probados, mientras que todos los ratones SCID humanizados que han recibido los mismos inmunogenes sin la proteína ENV (Controles simulados) sobrevivieron. En una primera etapa, se evaluaron los efectos perjudiciales de proteína ENV en los ratones NOD-SCID en una forma de respuesta de dosis usando vigilancia clínica combinada con un enfoque histológico. En una segunda etapa, se evaluó los efectos benéficos de su ligando lgG4 quimérico en prevenir el daño inducido por proteína ENV.
2. Evaluación de los efectos perjudiciales de proteína ENV en ratones NOD-SCID
a. Materiales y Métodos
a.l. Animales
Seis ratones SCID libres de patógenos (6 hasta 8 semanas de edad) se adquirieron de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por j aula en un ciclo de oscuridad de luz estándar con acceso ad libitum a alimento y agua y se tranquilizaron por un periodo de 8 días de aclimatación. S e tuvo especial cuidado para asegurar condiciones de aloj amiento muy limpias. Particularmente, los animales se aloj aron en jaulas especiales equipadas con tapa de filtro.
a.2. Humanización de ratones NOD-SCID
Con objeto de obtener ratones NOD-SCID, desprovistos de sistema inmunitario linfoide, con un sistema inmunitario humano injertado, los ratones se humanizan con células mononucleares periféricas humanas ofreciendo así el potencial para estudiar el papel funcional del sistema inmunitario humano en modelos animales inmunopatogénicos. Esto proporciona resultados mucho más cercanos a la situación humana real en términos de inmunopatología t respuesta a proteínas patogénicas humanas, tal como MSRV-ENV. La humanización de ratones se alcanzó de acuerdo al protocolo previamente descrito by Firouzi et al., 2003 excepto que los animales no se irradiaron con rayos gama y no se trataron con ligando anti-NK ya que ratones NOD-SCID se empobrecieron espontáneamente de las células NK. La sangre (capa de leuco-plaqueta, 45- 50 mi) de 2 controles saludables se obtuvo del centro de transfusión sanguínea (EFS) en Lyon. La calidad y seguridad de sangre se garantizó por análisis inmunológico y hematológico . Todos los procedimientos experimentales se realizaron bajo un fluj o de aire laminar y usando guantes estériles. Las Células
mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) se obtuvieron por un método de separación de densidad de gradiente Ficoll y se administraron a NOD-SCID por una inyección i.p. (células 50.106). Ya uqe la sangre de dos diferentes donadores se usó para inmunizar todos los animales, la misma proporción de ratones se humanizó con cada donador de sangre. Aquí se puede confirmar ya, que no hay diferencia entre los animales injertados con cualquier donador se vio en todos los experimentos futuros, como se describe a continuación.
3. Evaluación de los efectos perjudiciales de proteína ENV en los ratones NOD-SCID
Inyecciones de proteína ENV
En el día 0 (PO), los ratones recibieron una inyección intra peritoneal (i.p.) sencilla (0.5 mi) de proteína ENV (PXTherapeutics, Francia) con las siguientes dosis: 0.1 , 1.5, 10, y 20 µg. La proteína ENV se diluyó en Solución Salina Amortiguada con Fosfato estéril (PBS) (Lonza, Francia). Un ratón recibió inyección con PBS solo.
Para evitar cualquier disminución en concentración de proteína ENV y bioactividad, una segunda inyección de proteína ENV emulsificada en 0.5 mi de adyuvante de Freund incompleto (Sigma, Francia) se alcanzó en P7. Cada ratón recibió una inyección subcutánea sencilla en el cuello. Las dosis de proteína ENV usada para cada ratón fueron las mismas como para la primera inyección en PO.
Una tercera inyección s.c. de proteína ENV emulsificada en diluyente de aceite mineral - "IFA"- (0.5 mi) se realizó en el cuello en P 14. El mismo día, los ratones recibieron una inyección i.p. de 200 ng (0.5 mi) de toxina de pertusis -"PTX"- (Wako, Germany) por animal para abrir transitoriamente ' la barrera hematoencefálica para el paso de células inmunitarias extra-CNS.
Evaluación clínica
El estado de salud general (aspecto del pelaje, marcha en la jaula de alojamiento, postura) y el peso de animales se monitorearon 5 días por semana durante desde P 14 hasta P37.
Examen histológico
El cerebro y los órganos internos de todos los animales muertos se removieron y conservaron en formol (10%) para examen histológico posterior.
b. Resultados
1. Vigilancia clínica
Durante los primeros días después de la inyección de proteína ENV emulsificada en IFA y PTX, todos los ratones que han recibido las dosis más altas de proteína ENV exhibida en una disminución de epeso corporal (ver la Figura 13) asociada con un fuerte empeoramiento de su estado de salud general como se indica por una baja actividad en la jaula de alojamiento y comportamiento de postración. Finalmente, todos estos
ratones murieron dentro de los cuatro días después de la última inyección. De manera interesante, los ratones inyectados con dosis bajas de proteína ENV muestran un ligero incremento en el peso corporal asociado con un buen estado de salud general a pesar de una emergencia gradual de pelaje erizado suave en los dos ratones restantes inyectados con las dosis bajas de proteína ENV.
Durante la semana después de la última inyección, el peso corporal de ratones sobrevivientes se estabiliza o ligeramente disminuye (ver la Figura 13), pero su estado de salud general se mantuvo sin cambios. Durante la segunda semana después de la última inyección, los ratones sobrevivientes continuaron el aumento de peso (ver la Figura 13) y su estado de salud general estabilizado.
2. Examen histológico
OBJETIVOS DEL ESTUDIO
Estudio histopatológico de páncreas de ratones NOD M4, M5 y M6 MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras de tejido pancreático, fijado en formalina, se han recibido.
Las muestras de tejido se han incorporado en parafina, cortado en secciones de 5µ?? de espesor.
Secciones de tejido se han manchado con hematoxilo en eosina-azafrán y examinaron con un microscopio de luz. Las imágenes enumeradas representativas se han tomado
RESULTADOS
Páncreas M4: la arquitectura general del páncreas se conserva. Las lesiones inflamatorias focales se presentan: forman pequeños infiltrados, de composición polimórfica, con una distribución predominantemente perivascular y periductular. No hay alteración significativa del páncreas exocrino. Las lesiones de los islotes endocrinos se observan: las células inflamatorias se presentan a lo largo de sus células periféricas y apoptóticas endocrinas son visible.
Páncreas M5: La pancreatitis está presente. Grandes infiltrados inflamatorios se presentan dentro del páncreas exocrino y se asocian con necrosis celular acinar focal. La necrosis fibrinoide está presente algunas veces.
Páncreas M6:
Diversas lesiones están presentes. Grandes áreas, confluentes de necrosis están presentes en el páncreas y resultan en la necrosis completa de un gran número de células acinares. Además, las lesiones inflamatorias también implican el tejido adiposo peripancreático, con foci de citoesteatonecrosis. El aspecto histológico es típico de pancreatitis necrotizante, aguda.
En resumen:
- Lesiones inflamatorias focales y leves en páncreas de M4.
- Pancreatitis aguda de intensidad moderada en páncreas de M5.
- Pancreatitis necrotizante aguda severa en páncreas de M6.A
c. Discusión
En general, sus resultados sugieren que la inyección de proteína ENV es letal en ratones NOD-SCID solamente para dosis mayores que 5 µg. Ya que los animales inyectados con dosis altas de proteína ENV exhiben un deterioro de su estado de salud general antes de la inyección de PTX, es poco probable que los principales daños del SNC podrían explicar los efectos perjudiciales de proteína ENV observada en ratones NOD-SCID. Es más probable que la proteína ENV ha provocado mayor disfunción en uno o varios de otros órganos que llevan a la muerte de los animales. Ya que los ratones NOD-SCID llevan antecedentes susceptibles a diabetes, el estado histológico del páncreas de animales muertos como se presentó arriba, es altamente sugestivo de inflamación de páncreas inducida por ENV. De manera interesante, la dosis letal mínima induce lesiones en islotes beta y páncreas endocrino solamente, lo que claramente corresponde a lesiones de diabetes y es suficiente para explicar la muerte de los ratones a esta dosis, en la ausencia de células que secretan insulina eliminada por inflamación inducida por ENV.
Con dosis más altas, parece que estamos probablemente más allá de las dosis relativas / peso que se podría encontrar en diabetes humana y que los niveles tan altos de ENV inducen mucho más grande inflamación que gana el Páncreas completo, incluyendo la parte exocrina, en pancreatitis necrotizante aguda. No obstante, estas observaciones son relevantes para Pancreatitis, que aquí se demuestra que se producen cuando las dosis mayores de proteínas MSRV-ENV se inyectan.
4: Vigilancia de glicemia después de repetir las inyecciones de proteína ENV en ratones NOD-SCID
A. Introducción
En un experimento previo, hemos demostrado que las inyecciones subcutáneas repetidas de 5 µg de proteína ENV en ratones NOD-SCID humanizados pueden llevar a la muerte del grupo de animal correspondiente que se puede ligar a una destrucción de células ß de isleta pancreática aguda. Para prevenir la interpretación ambigua de evolución de cinéticos de glicemia en condiciones que causan muerte súbita de animales, en el presente estudio hemos usado inyecciones repetidas de dosis subletales de proteína ENV para el estudio de la glicemia de ratones NOD-SCID humanizados.
B. Materiales y Métodos
1. Animales
ver anterior 2.a.1
2. Humanización de ratones NOD-SCID
ver anterior 2. a.2
3. Inyecciones de proteína ENV
En este estudio, los ratones se inyectaron una vez por semana (PO, P9, P 16 y P23) durante 4 semanas. Para cada punto de tiempo, dos ratones recibidas una inyección de cuello subcutánea de 2.5 µg de proteína ENV (PXTherapeutics, Francia) emulsificada en 0.5 mi de adyuvante de Freund incompleto (Sigma, Francia). Los dos ratones restantes (ratones de control) recibieron una inyección de cuello subcutánea de 0.5 mi de adyuvante de Freund incompleto.
4. Medición de Glicemia
En PO y P30, muestras sanguíneas se colectaron de la vena de cola lateral en animales conscientes. Las concentraciones de glucosa en la sangre se evaluaron usando un lector de glicemia (Optium Xceed, Abbott, Francia).
C. Resultados
Como se espera con las dosis sub-letales, los ratones que han recibido cuatro inyecciones de proteína ENV se aliviaron después de la cuarta inyección a pesar de la aparición progresiva de pelaje erizado suave como se describió previamente.
En la PO (Día de la primera inyección de ENV o de solución simulada en controles), ninguna diferencia obvia se podría detectar entre ratones control e inyectados con ENV. De manera interesante, en P30, la concentración de glucosa en la sangre (Glicemia) de ratones inyectados con ENV se encontró que se incremento comparado con ratones de control, mientras que la de ratones de control no fue diferente de sus valores previos en PO (Figura 14).
Esta variación de glicemia en animales tratados con ENV revela muy importante de una evolución hacia hiperglicemia en animales inyectados con ENV, que es un sello de la diabetes humana y corrobora hallazgos histopatológicos previos. Por lo tanto, estos resultados validan además sus condiciones experimentales como un modelo pre-clínico relevante para estudiar fármacos terapeúticos dirigidos a ENV en diabetes.
EJEMPLO 13: Evidencia de un efecto terapéutico del ligando GNb ACl, bajo la forma de un ligando lgG4 quimérico, en la prevención de la aparición de enfermedad relacionada con diabetes en un modelo de animal apropiado.
1. Materiales y Métodos
a.l. Animales
Este estudio se llevó a cabo en los dos ratones sobrevivientes inyectados con dosis baja de proteína ENV (0.1 y 1 µg) usada en el experimento previo.
2. Procedimientos experimentales
Debido a que la repetida inyección de 5 µg de proteína ENV se ha demostrado que lleva a una muerte rápida del ratón, se usó esta dosis de enfrentamiento para la evaluación de los efectos benéficos de su ligando. Como se describe en el experimento previo, los ratones recibieron tres inyecciones s.c. de proteína ENV emulsificada en IFA (0.5 mi) en el cuello a P50, P57 y P64. Para cada punto de tiempo, los ratones recibieron el mismo día una inyección i.p. sencilla (0.5 mi) de 1 00 µg de ligando quimérico GNb AC l IgG4. El estado clínico y el peso de cada ratón se monitorearon 5 días por semana desde P50 hasta P8 1 .
3. Resultados
La observación de los animales tratados hasta 120 días de seguimiento claramente indica que estos animales tuvieron una supervivencia a largo plazo . Así, la inyección GNbAC l les ha protegido y les hizo sobrevivir a las dosis mortales de MSRV-ENV inyectadas tres veces sucesivas.
Durante este periodo de seguimiento, su estado de salud general se mantiene bueno y continua aumentando de peso, en el rango fisiológico (no se observó obesidad) .
Se puede concluir que, en este modelo animal que corrobora las lesiones de diabetes y además, lo que puede llevar a Pancreatitis que el ligando GNb ACl lgG4 ha sido eficiente contra las dosis saludables de MSRV ENV y tiene efectos terapéuticos de interés en enfermedades tales como diabetes o pancreatitis asociada con inflamación y expresión MSRV ENV o antigenemia.
EJEMPLO 14: Diseño, construcción y análisis in vitro de un 5 anticuerpo humanizado GNb ACl con cadenas de isotipo IgG4 que comprenden 6 secuencias de aminoácidos CDR del ligando, con (i) optimizaciones de primera etapa para la inserción en las cadenas variables IgG4 humanizadas, (ii) la selección de la mejor combinación de secuencias CDR para la actividad de enlace objetivo óptima (ENVI O proteína) en el vector IgG4, y (iii) selección de optimizaciones para expresión estable IgG4 en células CHO.
A. Diseño de constructos moleculares, producción y selección de los constructos, para obtener un vector de anticuerpo IgG4 humanizado y estabilizado con el ligando
15 1. Análisis de regiones Fv de anticuerpo anti-ENV de murino GNb
ACl
Para encontrar estructuras humanas apropiadas para humanización de anticuerpo de murino GNb ACl , secuencias de aminoácidos de regiones Fv de cadena pesada y ligera GNb AC l se alinearon con base de datos de genes 0 de línea germinal de anticuerpo humano de Panorama Research Institute (1230 Bordeaux Drive, Sunnyvale, California 94089, EUA). Los aciertos superiores de los genes de línea germinal V humanos se identificaron como candidatos de gen V humano.
De la base de datos buscada, los genes VH1-46 y VH1 -69 humanos se identificaron para tener las secuencias más cercanas a la cadena pesada GNb AC1 de murino. Por lo tanto se ha seleccionado VH1-69 como estructuras humanas para humanización. Usando la misma base de datos, se ha identificado la secuencia JH4 humana para usarse para estructura 4 en la cadena pesada humanizada.
Para la cadena ligera de anticuerpo, VK1 -5, VK3-1 1 , VK1-33, VK1-39 muestra alta homología con la cadena ligera de anticuerpo de murino. Por lo tanto se ha elegido a VKl-39 para la humanización de la cadena ligera. Usando el mismo método, se ha identificado JK4 para construcción de la estructura 4 de la cadena ligera de anticuerpo humano.
Para definir las regiones CDR apropiadas para injertarse en la cadena VH humana del anticuerpo humanizado, se ha re-evaluado una delineación adaptada y optimizada de estas regiones CDR con la cadena pesada variable de anticuerpo de murino original. De esta manera se ha usado una combinación de Definición Kabat y Definición Chotia (Johnson G, Wu TT. Kabat Datábase and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001 ; 29: 205-6. y Chothia C, Gelfand I, Kister A. Structural determinante in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol 1998; 278: 457-79), como la Definición Preferida. En resumen, la definición Chothia privilegia la variabilidad de conformación mientras que la definición Kabat privilegia la variabilidad de secuencia. Las regiones CDR de la cadena pesada de anticuerpo de murino GNb AC1 se muestran en la Figura 15 (SEQ ID No. 33 , 34 y 35), con la selección de las regiones preferidas para inserción funcional en la cadena Pesada Variable IgG4 humana (VH) de acuerdo con la definición preferida previamente descrita.
Para definir las regiones CDR apropiadas para integrarse en la cadena VL humana del anticuerpo humanizado, también se re-evalúa una delineación optimizada y adaptada de estas regiones CDR con la cadena ligera variable de anticuerpo de murino original. Se ha usado una combinación de Definición Kabat (Johnson G, Wu TT. Kabat Datábase and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001 ; 29 : 205-6) y Definición Contact (Panorama Research Institute, CA, EUA). Después de la evaluación para la cadena ligera de anticuerpo de murino, se ha usado las definiciones Kabat como la Definición Preferida para definir las regiones CDR. Las regiones CDR seleccionadas para la cadena ligera de anticuerpo se muestran en la Figura 16 (SEQ ID 36, y SEQ ID 38).
2. Región variable de cadena pesada humanizada
Con base en los CDRs de anticuerpo murino y gen VH1 -69 de línea germinal humano, se diseñaron siete secuencias VH para humanización de la cadena pesada GNb AC 1. Se designaron como Hl , H2, H3, H4, H4A,
H4B, y H4C. Los fragmentos de ADN de estas regiones V se sintetizaron y fusionaron al 5' de un ADNc de región constante IgG4 humana para crear 7 cadenas pesadas IgG4 de longitud completa. Las cadenas pesadas IgG4 de longitud completa se insertaron en una columna de plásmido pCMV cadena abajo de un promotor CMV (Ref. ejemplo 4). Los clones que contienen los insertos de cadena pesada correctos se identificaron por digestión de enzima de restricción y sus secuencias de ADN se confirmaron en consecuencia por análisis de procesado de secuencia y corresponden respectivamente a SEQ ID No. 39 hasta SEQ ID No. 45.
3. Regiones variables de cadena ligera humanizadas
Con base en los CDRs de cadena ligera de anticuerpo de murino y gen VK1 -39 de línea germinal humano, se diseñaron y sintetizaron tres secuencias VL humanizadas. Estas secuencias se designaron como VK1 , VK2, y VK3. Los tres fragmentos de ADN VK se fusionaron a la región constante kappa en una columna de plásmido pTT5 que contiene la secuencia de cadena kappa humana. Cada estructura de lectura abierta de cadena ligera se conduce por un promotor CMV. Con objeto de incrementar la expresión del gen, la secuencia de cadena ligera kappa también incluye un intrón en la unión de las regiones constantes de cadena ligera y VL. Los clones de plásmido con insertos correctos se identificaron por digestiones de enzima de restricción y sus secuencias se confirmaron por análisis de procesado por secuencia de ADN que corresponden respectivamente a las SEQ ID No. 46 hasta SEQ ID No. 48.
4. Expresión de variantes de anticuerpos humanizadas.
Para expresar anticuerpos, los plásmidos de siete cadenas pesadas y tres cadenas ligeras se purificaron usando un kit de purificación Maxi de ADN plásmido (Qiagen). Además, los plásmidos para cadena pesada GNb AC1 lgG4 quimérica y cadena ligera kappa GNb AC1 (proporcionadas por GeNeuro) se purificaron usando el mismo kit. Se cultivaron células de ovario de hámster chino (CHO) en medio libre de suero (Invitrogen) en placas de 6 pozos y se cotransfecta con varias combinaciones de plásmidos de cadena pesada y ligera a una relación de ADN 1 : 1. Se llevaron a cabo transfecciones usando el reactivo de transfección Max de estilo libre de Invitrogen. Se realizaron un total de 32 transfecciones, que incluyen las combinaciones de 8 cadenas pesadas (7 cadenas pesadas humanizadas más una cadena pesada quimérica) y cuatro cadenas ligeras (3 cadenas ligeras humanizadas más una cadena ligera quimérica). El día 3 después de la transfección, se cosecharon los sobrenadantes de cultivo celular. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo en los sobrenadantes por un ensayo ELISA IgG4 humano en el cual el anticuerpo GNb ACI IgG4 quimérico (suministrado por GeNeuro) se usó para generar una curva estándar.
5. Cribado preliminar de variantes de anticuerpo humanizado
Para evaluar variantes de anticuerpo humanizado, se ha usado el anticuerpo quimérico generado de la co transfección de cadenas pesada quimérica y ligera quimérica en células CHO como un control benchmark/positivo para actividad de enlace a la proteína ENV. Ya que el anticuerpo GNb AC1 quimérico y todas las variantes de anticuerpo humanizado están en formato IgG4, un ensayo de enlace basado en ELISA con proteína MSRV ENV inmovilizada puede usarse convenientemente para evaluar las actividades de enlace de anticuerpo relativas. En este ensayo, se cubrieron placas ELISA con proteína ENV recombinante purificada (proporcionada por GeNeuro) a 1 µg/ml. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y se aplicaron anticuerpos anti-ENV con varias diluciones a los pozos. Los anticuerpos enlazados se detectaron por un anticuerpo IgG Fe antihumano secundario conjugado con HRP, seguido por el desarrollo de color con substracción de HRP (KPL). Usando este ensayo, se ha mostrado que el anticuerpo anti-ENV IgG4 quimérico tiene muy buena actividad de enlace para ENV inmovilizada (Figura 17).
Usando el mismo ensayo de enlace, se han evaluado los sobrenadantes cosechados de cultivo CHO que se transfectaron con varias combinaciones de secuencias ligera y pesada humanizadas. Se establecieron dos criterios para determinar el mejor anticuerpo:
- el anticuerpo humanizado deberá tener actividades de enlace cercanas al anticuerpo GNb ACl quimérico;
- anticuerpo humanizado deberá tener un nivel de expresión razonable, es decir > 100 ng/ml, en los sobrenadantes después de la co-transfección de plásmidos de cadena pesada y ligera.
Con base en estos criterios de selección, H2A/K3 se seleccionó como el mejor anticuerpo por su mejor actividad de enlace (Figura 18) y expresión (>1 ug/ml en placa de 6 pozos). H4A/K3 fue el segundo mejor anticuerpo, ya que su actividad de enlace a la proteína ENV es menor que H2A/K3 (Figura 19). El tercer anticuerpo, H1/VK3 tiene mejor actividad de enlace, pero es pobre en expresión de anticuerpo (<10ng/ml en placa de 6 pozos) (datos no mostrados). Con base en esta cribado preliminar, se ha decidido enfocarse en H2/VK3 en una evaluación adicional.
6. Evaluación adicional de H2/VK3
Después del cribado preliminar, se ha comparado H2/VK3 con el anticuerpo anti-ENV IgG4 quimérico en el ensayo de enlace usando concentraciones de anticuerpo normalizadas. La concentración de anticuerpo H2/VK3 en sobrenadante se midió cuidadosamente con el IgG4 ELISA propio usando el anticuerpo GNb AC l quimérico purificado como un estándar. El anticuerpo H2/VK3 en sobrenadantes y anticuerpo GNb ACl IgG4 quimérico purificado se diluyeron a las mismas concentraciones y compara en el ensayo ELISA enlazado a ENV. El ensayo muestra que el anticuerpo H2/VK3 humanizado tiene actividad de enlace ENV casi idéntica como la proteína IgG4 anti-ENV quimérica (Figura 20).
A continuación, se hace el escalamiento de la expresión de H2/VK3 de manera que una cantidad suficiente de anticuerpo H2A/K3 pudiera purificarse. Los plásmidos pCMV H2 y pTT5 VK3 se prepararon usando el kit de purificación maxi de plásmido (Qiagen). Las células CHO se cultivaron en medio CHO libre de suero y transfectan con dos plásmidos usando reactivo de transfección Invitrogen Freestyle Max. Cinco días después de la transducción, se cosecharon los sobrenadantes de cultivo celular y centrifugaron a 3400 rpm por 15 minutos. Los sobrenadantes se pasaron entonces a través de una columna de proteína A (GE), se lavaron con PBS y eluyeron con solución amortiguadora de elución pH 3.5. Se agruparon las fracciones que contienen proteína y se concentraron hasta un volumen apropiado por columnas de espiral Amicon con un peso molecular cortado de 10 kD. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo por IgG4 ELISA humano y derivaron por ensayo de proteína Bradford (Bio-Rad). El anticuerpo H2A/K3 purificado se revisó en gel SDS-PAGE no reducido y una banda sencilla a un peso molecular de alrededor de 150 kD (Figura 21).
Finalmente, la H2/VK3 purificada se comparó con el anticuerpo GNb
AC1 quimérico purificado en el ensayo enlazado a ENV. Los resultados muestran que la H2A/K3 purificada tiene una actividad de enlace casi idéntica al anticuerpo quimérico purificado (Figura 22). Con base en estos datos, se ha concluido que H2/VK3 cubre los criterios del solicitante y se seleccionó como anticuerpo GNb AC 1 humanizado. Dando los datos de actividad de enlace previos (Figuras 3-6 y 8) las 6 secuencias CDR necesarias para mantener la actividad de Ligando dentro del anticuerpo humanizado se insertaron en las secuencias de aminoácido de las cadenas H2 y VK3 del vector de anticuerpo IGG4 humanizados seleccionados (Figura 22) y se establecen en SEQ ID No. 49 hasta SEQ ID No. 54.
Estos se han optimizado por selección y mutación de las secuencias CDR analizadas en las cadenas VH y VL de murino, que se eligieron primero para inserción adecuada dentro de los constructos VH humano y VL humano primarios (SEQ ID 33-38). Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada H2 humanizada y cadena ligera VK3 seleccionadas (para el constructo IgG4 humanizado seleccionado) y sus residuos de murino restantes también se muestran en la Figura 23.
Se ha producido 1 mg de constructo de anticuerpo humanizado completo H2/VK3 de células CHO por co-transfección de plásmidos pCMV H2 y pTT5 VK3 en medio CHO libre de suero y este anticuerpo H2A/K3 se purificó por una columna de Proteína A.
7. Generación de anti-ENV mAb humanizado con mutación S241P
Los anticuerpos IgG4 algunas veces se encuentran que son funcionalmente monovalentes in vivo. Estudios recientes han aclarado que esto se debe al intercambio in vivo de medias moléculas IgG (una cadena P más una L) entre moléculas IgG4. Este proceso resulta en anticuerpos biespecíficos que en la mayoría de las situaciones se comportará como anticuerpos funcionalmente monovalentes (Aalberse and Schuurman 2002, IgG4 breaking the rules, Immunology. 2002, 105 :9-19). Esto es causado mayormente por la inestabilidad de los puentes de disulfuro intercadenas debido a cambios de P a S en la posición 241 del residuo (región de articulación) y posiblemente reducirá la potencia y especificidad del anticuerpo. Con objeto de evitar este problema, se ha realizado una evaluación de proteína 3D de posible sustitución de aminoácido (usando software tales como aquellos disponibles en www.NCBI-ENTREZ con, por ejemplo, observador de proteína Cn3D, o tal como M CLC Main Workbench, compañía CLC Bio, Aarhus, Dinamarca, o aquellos desarrollados en Panorama Research Institute, CA, EUA). De esta manera se ha concebido que una modificación original de la secuencia de nucleótido primaria que consiste de reemplazar el residuo de Serina (S) existente en la posición 241 por un residuo de Prolina (P), de la secuencia de nucleótido optimizada que se codifica dentro del constructo de nucleótido, fue una solución a una inestabilidad eventual del vector de anticuerpo IgG4 con el ligando. Por lo tanto, la mutagénesis dirigida al sitio se realizó y el producto PCR se clonó en el plásmido pCMV, designado como H2 S241 P. La secuencia de ADN de la cadena pesada H2 se confirmó por análisis de procesado de secuencia.
Esta optimización se combina ahora con la modificación de la secuencia de cadena ligera kappa con la inclusión de un intrón en la unión de regiones constantes de cadena ligera y VL, como ya se menciona arriba, para incrementar la expresión de genes.
Esta combinación original de secuencias optimizadas de clones previamente seleccionados por mutaciones o inserciones de nucleótido con influencia en la estructura de aminoácido primario o en la velocidad de producción del producto final se muestra en la Figura 24, en las cuales las secuencias correspondientes al producto de anticuerpo IgG4 con la composición de aminoácido y su estructura inherente proporcionan un vector optimizado, estable y altamente expresado para el ligando de la presente, que conserva sus propiedades de enlace funcional para el antígeno de proteína ENV. Esto muestra las secuencias finales de la cadena pesada H2 S241 P de anticuerpo humanizado anti-ENV, con su secuencia codificada (SEQ ID 55) y su secuencia de aminoácidos (SEQ ID 56). También se muestra las secuencias finales de la cadena ligera VK3 del anticuerpo humanizado anti-ENV con su secuencia de nucleótido codificada (SEQ ID 57), en la cual el intrón está subrayado: (SEQ ID 58). La secuencia de nucleótido empalma la cadena ligera V 3 sin intrones que sigan (SEQ ID 59). Al final se muestra la secuencia de aminoácido codificada correspondiente a la cadena ligera VK3 finalmente optimizada (SEQ ID 60).
Finalmente se ha producido 2 mg de la versión final del anticuerpo humanizado con mutación S241P de células CHO. Los plásmidos pCMV H2 S241 P y pTT5 VK3 se purificaron por el kit Maxi de ADN de plásmido Qiagen. Las células CHO se cultivaron en medio CHO libre de suero y transfectaron con los plásmidos pCMV H2 S241 P y pTT5 VK3 usando el reactivo Max de transfección de estilo libre (Invitrogen). Después de 5 días, los sobrenadantes de cultivo celular se cosecharon y centrifugaron a 3400 rpm por 15 minutos. La proteína de anticuerpo se purificó usando la columna de proteína A (GE).
B. Secuencia de aminoácido y nucleótido optimizada para expresión de célula CHO de Vectores de anticuerpo IgG4 quiméricos y humanizados con el ligando
Bl. Proteína y secuencias de nucleótido optimizadas por codón (para expresión de célula CHO) de la versión quimérica y humanizada de anticuerpo mAb GNb AC1
Bl.l GNb AC1 Quimérica
La secuencia correspondiente a la proteína madura chGNb AC1 IgG4 es establecida en SEQID 61.
La secuencia correspondiente a la proteína madura chGNb AC1 LC es establecida en SEQ ID 62.
B1.2 GNb AC1 Humanizada
La secuencia correspondiente de la proteína huGNb AC1 IgG4 madura es establecida en SEQ ID 63.
La secuencia correspondiente de la proteína huGNb AC1 LC madura es establecida en SEQ ID 64.
B2. Las secuencias de nucleótido de la cadena ligera y pesada humanizada de GNb AC1 incluyen secuencias de plásmido.
L as secuencias de nucleótido de huGNb AC1 LC son establecidas en
SEQ ID 65.
Las secuencias de nucleótido de huGNb AC1 IgG4HC son establecidas en SEQ ID 67.
C. Análisis complementario in vitro de la actividad de enlace del ligando IgG4 humanizado seleccionado (vector de anticuerpo IgG4 humanizado optimizado por codón y estabilizado).
Cl. Análisis de enlace de anticuerpo bioquímico.
Protocolo: Incubación 2h a 37°C ENV en solución amortiguadora de bicarbonato 50mM pH9.6 - Detección con anticuerpos diluidos en PBS BSA 1 % por 1 h a temperatura ambiente - Detección con anticuerpo anti humano y anti ratón secundarios etiquetados con peroxidasa respectivamente (ref 1 15-035-146 y ref 109-035-088, Jackson, EUA) diluidos 1/1000 en PBS BSA 1% e incubados por 1 h a temperatura ambiente. Se hace la revelación al agregar sustrato OPD y leer la densidad óptica con un espectofotómetro después de 30min (Se realizaron etapas de lavado con PBS entre cada etapa).
Tabla 19: Cinética de enlace que responde a la dosis de anticuerpo GNb AC1 humanizado con una proteína objetivo, MSRV-ENV.
Estos resultados muestran claramente que el anticuerpo IgG4 humanizado, en dos experimentos, tiene cinética que responden a la dosis reproducible con ya sea diluciones en serie objetivo y anticuerpo de proteína ENV fijas (parte superior de la tabla) o diluciones de concentración de anticuerpo y de proteína objetivo fijas (parte inferior de la Tabla). Estas son equivalentes a las del mismo isotipo de anticuerpo quimérico, pero mucho mejores que el anticuerpo GNb AC1 original, aunque no se aprecian cinéticos de enlace importantes para el anticuerpo de control irrelevante (2G5E12).
C2. PRUEBA DE REACTIVIDAD PBMC
MATERIALES Y MÉTODOS : Ver ejemplo 6.
Tabla 20: Inhibición de citoquinas pro-inflamatorias ?-6 e IFN-y en cultivos PBMC con proteína MSR V ENV, por ligando GNb A C1 insertados en vectores de anticuerpo IgG4 tanto humanizados como quiméricos. NB. La señal de respaldo sin ENV se muestra enseguida (Sin ENV) y la inducción positiva de control por LPS bacteriana se muestra al fondo.
Estos resultados ponen en evidencia una inhibición importante de:
(i) Inducción de interleucina 6 (IL-6) por picos de proteína MSRV ENV a 24h en cultivos de célula mononuclear de sangre periférica (con proteína ENV completa, ENV-T, usada a 0.1 microg/lm) se inhibe significativamente en presencia de anticuerpos tanto humanizados como quiméricos.
(ii) inducción de interferon gamma (IFN-?) por picos de proteína MSRV ENV a 72h en cultivos de célula mononuclear de sangre periférica (con fragmento de superficie de proteína ENV, ENV-SU, usado a 0.5 microg/lm) se inhibe fuertemente en presencia del anticuerpo humanizado, pero no en presencia del anticuerpo quimérico. Esto, de esta manera, pone en evidencia el efecto mejorado del anticuerpo humanizado en activación de célula T, comparado con el anticuerpo quimerizado. En el último vector quimérico, las cadenas VH y VL de murino restantes puede producir activación inmunitaria adversa a través del reconocimiento de célula T humana de xenoantígenos (cadenas de proteína de murino injertadas en la estructura). Esto no ocurre con el vector IgG4 humanizado seleccionado del ligando enlazado a proteínas ENV. Esta diferencia no se aprecia con IL-6 a 24h, ya que esto no implica el reconocimiento de antígeno específico (inmunidad adquirida con linfocitos T) sino sólo la activación inmunitaria innata, bloqueada por el ligando cuando se enlaza a proteínas ENV inmunopetogénicas objetivo.
EJEMPLO 15: Las proteínas de envolvente HERV-W del cromosoma 7q (Sincitina) y partículas MSRV ambas inducen respuestas pro-inflamatorias en células inmunitarias y astrocitos que se inhiben por el anticuerpo GNb AC1 anti-MSRV-ENV y su constructo IgG4 quimérico con el ligando.
Una relación entre las características inmunopatogénicas en humanos y el efecto biológico de estas proteínas ENV se ha presentado. Debido a que las secuencias de MSRV-ENV y Sincitina comparten más del 81 % de identidad de secuencia (Mallet, Bouton et al. 2004; Mameli, Astone et al. 2007), se ha investigado si estas dos proteínas hermanas podrían exhibir efectos pro-inflamatorios similares. Ya que los estudios previos en células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs) y astrocitos cerebrales han mostrado reactividad a ya sea MSRV-ENV o Sincitina respectivamente, se han realizado análisis en paralelo en ambos tipos de células.
Métodos
Preparación y aislado de proteínas
Ver Ejemplo 2
Aislado y preparación de células
Se aislaron PBMCs humanos de cubiertas de capas leuco-plaquetarias de donadores saludables (Centro de Transfusión - HUG - Ginebra) por centrifugación de gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque.
Se ordenaron astrocitos humanos de InVivogen.
Estimulación celular
Se, colocaron PBMCs en placas de 24 o 48 pozos a una concentración de lxl 06/pozo en 1 mi de medio que consiste de RPMI Glutamax 1640 (Invitrogen) complementado con aminoácido no esenciales al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, sodio-piruvato al 1 % y FCS inactivado por calor al 10% (BioWest). Las células se incubaron a 37°C en C02 al 5% en atmósfera humidificada por 24, 48 o 72h.
Para experimentos de cultivo celular, Sincitina, MSRV-ENV y LPS se incubaron previamente en 100 µ? de medio con los anticuerpos dirigidos contra ENV (IgG de ratón monoclonal GNb ACl , GeNeuro) por 1 h a 4° antes de agregarse a las células.
Ensayos de producción de citoquinas
Los sobrenadantes de cultivo se cosecharon a 24, 48 o 72h y almacenaron a -20°C antes de la evaluación de producción de citoquina por ELISA. El kit OptEIA ELISA de BD Bioscience para detección de citoquinas humanas se llevó a cabo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
MSRV-ENV y Sincitina son dos proteínas relacionadas con HERV-W
Con objeto de comparar proteínas biológicas asociadas con las proteínas de envolvente Sincitina HERV-W (Número de acceso NCBI AF072056.2) al de MSRV-ENV (Número de acceso NCBI AF331500.1), se ha expresado y producido las dos proteínas bajo condiciones similares para el estudio actual (Condiciones descritas en el Ejemplo 2).
Para dirigir y comparar los efectos biológicos de las dos proteínas relacionadas HERV-W, se ha estudiado su efecto en la inducción de citoquinas pro-inflamatorias. Se ha encontrado que la estimulación con proteínas relacionadas con HERV-W ENV sobreregula fuertemente las respuestas de astrocito de interleucina 6 (IL-6) pro-inflamatorias. De forma más importante, esta estimulación no se afectó por un anticuerpo irrelevante (sin enlace a cualquier ENV), pero se inhibió fuertemente por anticuerpo de murino GNb ACl y por IgG4 quimérico humano GNb ACl , que demuestra claramente que el ligando del solicitante en cualquiera de sus formar de vector de anticuerpo inhibe los efectos pro-inflamatorios de variantes relacionadas con HERV-W ENV, y no sólo de MSRV-ENV.
En la Figura 24, un ejemplo de este efecto biológico análogo se revela por la dosificación de liberación de IL-6 en el sobrenadante de cultivo en presencia de cada proteína relacionada con HERV-W ENV. Este es un efecto específico, ya que también se inhibe por el ligando GNb ACl , en la forma de anticuerpos quiméricos IgG4 o de murino. Por ello, una eficiencia de inhibición similar del ligando en proteínas relacionadas HERV-W ENV diferentes también se pone en evidencia.
Además de células de astrocito, que están involucradas en las lesiones e inflamación cerebrales locales, se ha mostrado que los efectos inmunitarios sistémicos de tanto MSRV-ENV como Sincitina, que estimula la producción de citoquinas proinflamatorias en cultivos de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC, es decir, linfocitos y monocitos).
En la Figura 25, un ejemplo de este efecto biológico análogo en
PBMC se valida por la detección de IL12 P40 (característico de una respuesta inmunitaria innata) y se confirma por la misma dosificación de liberación de IL-6 en el sobrenadante de cultivo para ambas proteínas relacionadas con HERV-W ENV. Además, como por el experimento con Astrocitos, esta liberación de IL-6 también se inhibe específicamente por el ligando GNb AC1 , en la forma de anticuerpos quiméricos IgG4 o de murino.
Ejemplo 16: El Ligando GNb AC1 y el anticuerpo IgG4 GNb AC1 humano-quimérico recombínante y el anticuerpo IgG4 humanizado que comprende el ligando enlazado a las proteínas tanto MSRV-ENV como HERV-W ENV 7q /Sincitina con glicosilaciones de célula humana.
1. Materiales y Métodos:
a. La proteína recombinante bacteriana ENV se obtuvo como se describe en el ejemplo 2.
b. La proteína MSRV ENV glicosilada humana se produjo para Geneuro, por P'X therapeutics, Grenoble, Francia, de acuerdo con el siguiente procedimiento: proteína análoga HERV-W-ENV, llamada Sincitina, se produjo con el mismo protocolo.
Proceso de producción de proteína purificada glicosilada ENV de expresión de célula humana.
Transfección:
Se sembraron células HEK-Estilo libre a 106células/mL y transfectaron con Env-MSRV_pMCMVHE/l usando reactivo de transfección 293Fectina.
Cosechado y lisis:
Tres días después de la transfección, las células se cosecharon y centrifugaron. Se resuspendieron los peletizados celulares en solución amortiguadora de lisis (PBS complementado con anti-proteasas) y se realizó la disrupción celular por sonicación.
Solubilización:
Después de la centrifugación, el peletizado se volvió a suspender en solución amortiguadora de solubilización (Tris 50mM pH8, NaCl lOOmM, Urea 2M, FOS-Colina 10 al 2%) y se solubiliza durante la noche a +4°C bajo agitación.
Dilución antes de la purificación:
Al día siguiente, la proteína solubilizada se diluyó 4 veces en solución amortiguadora (Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM) y se homogeniza antes de la purificación.
Agrupado 1 Método de purificación de etiqueta EnvMSRV His: Cromatografía de afinidad en sefarosa Ni
La cromatografía de afinidad en sefarosa Ni (GE Heathcare, 4ml) se realiza para purificar el Env-MSRV etiquetado con His.
Solución amortiguadora de equilibrio: Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-Colina 10 al 0.5%, Urea 0.5M.
Solución amortiguadora de elución: Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-Colinal O al 0.5%, Urea 0.5M, Imidazol 1M.
Etapa de elución: gradiente en 30CV desde 0% hasta 100% de solución amortiguadora de elución. Concentración de agrupado: 7 veces usando Amicon corte a 30kDa
Agrupado 2 Método de Purificación de etiqueta EnvMSRV His: Cromatografía de afinidad en sefarosa Ni
Esta segunda cromatografía de afinidad se realizó usando el flujo de movimiento de la primera como el material de partida = Carga, diluida hasta Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-ColinalO al 0.2%, Urea 0.5M
Solución amortiguadora de equilibrio: Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-Colinal O al 0.2%, Urea 0.5M.
Solución amortiguadora de elución: Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-Colinal O al 0.2%, Urea 0.5M, Imidazol 1M,
Etapa de elución: gradiente en 30CV desde 0% hasta 100% de solución amortiguadora de elución.
Control de calidad:
El análisis de control de calidad SDS-PAGE se siguió por teñido con azul Coomassie y análisis Western-Blot usando anticuerpo de murino GNb AC 1. El procesado por secuencia de terminal N confirma la identidad de la proteína purificada.
Diálisis y congelado de lotes
Dos lotes Env-MSRV se dializaron contra Tris 50mM pH8, NaCl l OOmM, FOS-Colinal O al 0.5% ó 0.2% antes de la adición de 10% de glicerol y se congela en nitrógeno líquido.
c. Detección de enlace específico con prueba ELISA
Todas las preparaciones ENV se diluyeron en solución amortiguadora CaC02 50mM pH9.6; se incubaron en pozos de Microplacas Elisa por 2h 37°C, para cubierta de la proteína en las microplacas ELSA. No obstante, debido a la relación de producción inferior, la concentración de Sincitina cubierta fue inferior a la de MSRV-ENV.
Los anticuerpos de detección se diluyeron en PBS BSA 1 % y se incubaron 1 h a temperatura ambiente en pozos de microplaca por triplicado. El anticuerpo secundario anti-ratón etiquetado con peroxidasa para murino monoclonal (ref 1 15-035- 14 y anticuerpo secundario anti-humano para recombinantes humanizados y humano-quimérico (ref 1 15-035-088) se diluyeron 1/1000 en solución amortiguadora PBS BSA al 1 % e incubaron 1 h a temperatura ambiente. La revelación OPD para peroxidasa se realizó por 30min seguido por lectura de densidad óptica a 490 nm. Se realizaron lavados entre cada etapa de incubación con 4, 4 y 6 ciclos de lavado, respectivamente.
2. Resultados:
Como puede apreciarse de la Figura 26 abajo, las preparaciones de proteína purificada humana-glicosilada de MSRV-ENV se detectaron fácilmente por todos los tipos de anticuerpo con el Ligando (murino, quimérico y humanizado), proporcionando una buena señal en mediciones de densidad óptica luminométrica. De forma interesante, en las condiciones ELISA actuales, sólo el ligando GNb AC 1 del anticuerpo humanizado proporciona un buen reconocimiento de Sincitina glicosilada humana, mientras que, a esta concentración de recubrimiento, los anticuerpos de murino y quiméricos proporcionan señales bajas con Sincitina.
Estos resultados muestran claramente que el ligando de la presente invención, que su vector molecular usado para enlazarse al epítopo objetivo (anticuerpo IgG4 humanizado o IgG4 quimérico, murino), se encuentra que se enlaza eficientemente a todas las formas de las proteínas objetivo que comprenden el epítopo, es decir proteínas ENV glicosiladas tanto bacterianas como humanas y, particularmente con el anticuerpo humanizado, ambas proteínas relacionadas con HERV-W, proteína MSRV-ENV y HERV-W 7q ENV, también llamada Sincitina.
De esta manera, el ligando terapéutico no se enlaza a las formas glicosiladas humanas de la proteína ENV objetivo.
EJEMPLO 17: Análisis in vivo de Anticuerpo quimérico GNb AC1 con isotipo IgG4 con efecto terapéutico en un modelo animal de anormalidades de comportamiento esquizofrénico inducido por MSRV ENV.
I. Introducción
En el Ejemplo 8, se ha demostrado la presencia de proteína MSRV-ENV en el suero de pacientes con esquizofrenia. Este resultado fundamenta la necesidad de explorar la relación entre la presencia de la proteína ENV y la emergencia de alteraciones cerebrales y déficits de comportamiento en modelos de animal adecuado. Las teorías de neurodesarrollo de la esquizofrenia postulan que la enfermedad es el resultado de comportamiento de un largo factor primario antes de que la enfermedad se manifieste clínicamente (Weinberger and Lipska, 1995; Lewis and Levitt, 2002). De esta manera, esta característica fisiopatológica se ha tomado en cuenta en el diseño de modelos animales apropiados que imitan los trastornos relacionados con esquizofrenia.
II. Experimento 1 : Efecto del anticuerpo quimérico IgG4 en el comportamiento y alteraciones anatómicas seguidas de inyección intracerebroventricular unilateral repetida de proteína ENV en ratas que han recibido un cubado inmunitario inducido por ENV en la adultez temprana.
A. Materiales y Métodos
1. Animales
Ratas Sprague-Dawley machos (6 hasta 8 semanas de edad) (n=8) se adquirieron de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por jaula en un ciclo de luz-oscuridad estándar con acceso ad libitum a comida y agua y estuvieron sin perturbación por un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen con la Directriz del Consulado de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directriz del Consulado Nacional de 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales usados y su padecimiento.
2. Cebado inmunitario inducido por ENV
El primer día, llamado "punto 0" (0O), las ratas se asignaron aleatoriamente a un grupo de inyección simulada (n=2) con inyección de Solución salina amortiguada en fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y el grupo inyectado con ENV (n=6) con inyección de 250 ng de proteína ENV recombinante (His-ENVT-081206-1 , PXTherapeutics, Francia) disuelto en PBS. Cada rata se anestesió por administración i.p. de una solución mezclada de xilazina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon, Francia) y cetamina 80mg/kg (Imalgene®, Alcyon, Francia). El pelo se cortó de un área que se extiende desde entre las orejas hasta apenas antes de los ojos. Se insertaron tapones en las orejas y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con una barra incisiva superior 5 mm arriba de la línea intra-aural. El área del cuero cabelludo cortada se mojó con una solución antiséptica basada en clorohexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión desde entre las orejas hasta un punto entre los ojos. La piel se retiró con fórceps y el tejido subyacente, incluyendo el periostio, se removió para exponer un área de cráneo seco, limpio (aproximadamente 15 x 18 mm).
La cánula plástica (d.ext. = 0.457 mm e d.int. = 0.267 mm) (Plástic One, EUA) se dirigió para implantarse en el ventrículo lateral derecho. La cánula se montó en el aparato esterotáxico, la punta "enfocada" en el bregma. Se taladró un orificio a través del cráneo sobre el ventrículo lateral (antero-posterior, 0.92 mm; medio-lateral, ± 1.7 mm con relación al
bregma). El punto de la cánula se colocó sobre el orificio central de manera que la punta estuvo aún con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3.5 mm a través de la corteza cerebral en el ventrículo lateral.
Para cada rata, la inyección de PBS solo o con proteína ENV se alcanzó por medio de un inyector de acero inoxidable, colocado en y protegido 0.5 mm debajo de la punta de la cánula. El inyector fue conectado por tubería flexible de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para despachar manualmente soluciones durante un periodo de 3 min. El inyector se retiró 3 min después de completar la eyección para prevenir el flujo de PBS o proteína ENV a lo largo de la pista del inyector.
La herida fue cerrada al usar sutura quirúrgica en un sujetador de aguja. Los animales se dejaron recuperar en una jaula individual por un periodo de 2 días. Luego, los animales se pusieron de forma aleatoria tres por jaula y se mantuvieron sin perturbación hasta los experimentos posteriores.
3. Inyección intracerebroventricular unilateral repetida de proteína ENV después de un periodo de latencia
Ocho meses más tarde, se implantaron inyecciones intracerebroventriculares (icv) repetidas que permiten cánula cranial en todas las ratas.
El día de la cirugía (P0), cada rata se anestesió por administración i.p. de una solución mezclada de xilazina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon,
Francia) y cetamina 80mg/kg (Imalgene®, Alcyon, Francia). El pelo se cortó de un área que se extiende desde entre las orej as hasta apenas antes de los ojos. Se insertaron tapones en las orej as y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con una barra incisiva superior 5 mm arriba de la línea intra-aural. El área del cuero cabelludo cortada se moj ó con una solución antiséptica basada en clorohexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión desde entre las orej as hasta un punto entre los ojos. La piel se retiró con fórceps y el tejido subyacente, incluyendo el periostio, se removió para exponer un área de cráneo seco, limpio (aproximadamente 15 x 1 8 mm.). Se taladraron tres orificios, dos aproximadamente 7 mm antes del bregma en los lados tanto derecho como izquierdo del cráneo y el tercero 7 mm posterior al bregma. Tornillos de nylon (diámetro = 0.50 mm) (Plástic One, EUA) se enroscaron para ajustarse firmemente en los orificios para servir como anclas para el cemento dental. Se tomó cuidado para conservar la dura en estos procedimientos. La cánula plástica (d.ext.
0.457 mm e d.int. = 0.267 mm) (Plástic One, EUA) se dirigió para implantarse en el ventrículo lateral derecho. La cánula se montó en el aparato esterotáxico, la punta "enfocada" en el bregma y un punto marcado 0.92 mm posterior y 1.7 mm lateral a la marca cero. Se hizo un orificio con un taladro en este sitio marcado. El punto de la cánula se colocó sobre el orificio central de manera que la punta estuvo aún con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3.5 mm a través de la corteza cerebral en el
ventrículo lateral derecho. Con la cánula mantenida en el portatubos del instrumento esterotáxico, una cantidad pequeña de masilla dental (Paladur®, Heraeus Kulzer, Francia) se construyó alrededor de la cánula y los tornillos anclados. La herida fue cerrada al usar sutura quirúrgica en un sujetador de aguja. La aguja montada se retiró cuando el material dental fraguó y el animal se permitió que se removiera del aparato esterotáxico.
Las inyecciones de PBS o proteína ENV se realizaron el mismo día (PO) y 25 días (P25) después del implante de cánula craneal.
Para cada punto de tiempo, PBS solo o 250 ng de proteína ENV recombinante (His-ENVT-081206-1 , PXTherapeutics, Francia) se administró por medio de un inyector de acero inoxidable, colocado en y protegido 0.5 mm debajo de la punta de la cánula. El inyector fue conectado por tubería flexible de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para despachar manualmente soluciones (3 µ?) durante un periodo de 3 min. El inyector se retiró 3 min después de completar la eyección para prevenir el flujo de PBS o proteína ENV a lo largo de la pista del inyector.
4. Administración sistémica del anticuerpo quimérico IgG4
El día después de la segunda retirada de proteína ENV (P26), las ratas inyectadas con ENV se seleccionaron aleatoriamente para recibir una inyección intraperitoneal (i.p.) sencilla de PBS (n=3) o 100 µg del anticuerpo quimérico IgG4 diluido en PBS (n=3).
5. Formación de imagen por resonancia magnética in vivo (MRI) La morfología cerebral de ratas se examinó en P 12 y P37 por MRI in vivo. Las ratas se anestesiaron primero con un sistema aprobado (TEM Sega, Francia) usando inhalación de isoflurano al 3% con un flujo de 0.6 1/min aire con oxígeno al 30%. Después de la inducción, se mantuvo la anestesia con gas de isoflurano a 1.5 hasta 2% y 0.6 1/min de flujo. La temperatura corporal se controló y mantuvo a 37±1 °C usando una almohadilla de calentamiento de agua circulante. Se vigiló la velocidad de respiración a través del experimento. Las ratas se colocaron en una posición decúbito en un lecho plástico (Bruker Biospec Animal Handling Systems, Alemania) equipado con fijación estereotáxica (barra en dientes y sujetadores en orejas). Se colocó entonces un catéter intravenoso calibre 22 en la vena de la cola de ratas para inyecciones posteriores.
Se realizó el barrido en un sistema Bruker 7T Biospec (Bruker, Alemania) equipado con 400mT/m de ajuste de gradiente, usando una bobina de cuerpo de transmisión (d.ext. = 1 12 mm e d.int. = 72 mm) y se usa una bonina de superficie de 25 mm de diámetro para recepción de señal. Un ecolocalizador de gradiente rápido con tres orientaciones ortogonales y un campo de 5 cm de vista se usan primero para identificar regiones cerebrales y permite el cálculo de las coordenadas espaciales fijadas para barridos posteriores. Se realizaron dos adquisiciones rápidas con secuencias de aumento de relajación (RARE) en el plano axial. Se adquieren las
primera imágenes ponderadas T2 con procesado en secuencia de pulso eco-circuito usando un tiempo de repetición (TR) de 4200 ms, un eco sencillo con tiempo de eco (TE) de 36 ms, un ancho de banda de receptor 35714 Hz y un tiempo de barrido de 4 min. Se adquiere las segundas imágenes ponderadas T2 con procesado por secuencia de pulso eco-rizo usando un TR de 3000 ms, dos ecos con un TE de 17 ms y 51 ms, un ancho de banda de receptor de 55555 Hz y tiempo de barrido de 5 min. Para ambas secuencias, un total de 30 rebanadas (800 µp? de grueso) se adquirieron con un campo de visión de 2.56 cm y un tamaño de matriz de adquisición de 256 x 256 que resulta en una resolución en plano de 100 x 100 µp?.
Para evaluar las barreras cerebromeningales y cerebroventriculares en ratas inyectadas con proteína ENV, se usó el método MRI aumentado con gadolinio. Se adquirieron imágenes ponderadas TI de precontraste coronales con secuencias de disparo de ángulo bajo rápido (FLASH) y tiempo de repetición/tiempo de eco = 2.2/1.4 ms. Un total de 30 rebanadas (800 µ?? de grueso) se adquirió con un campo de visión de 2.56 cm y un tamaño de matriz de adquisición de 256 x 192 lo que resulta en una resolución en plano de 100 x 133 µp?. Después, los animales reciben una inyección en bolo de gadolinio 0.5 M (Dotarem®, Guerbet, Francia) (1 mL/kg de peso corporal). El barrido TI postconstraste se realizó 10 min después de la administración de gadolinio en las mismas condiciones como se describe anteriormente.
6. Análisis del comportamiento .
A P 15 y P40, las ratas se probaron para actividad locomotora usando un aparato de barrido digital automatizado ligado a una computadora PC (Imetronic, Pessac, Francia). La actividad locomotora se vigiló en una jaula de prueba de fotocelda equipada con una configuración de cuatro haz infrarrojo horizontal paralelo (dos al frente y dos atrás) colocados 0.7 cm arriba del piso para medir actividad horizontal. El número de ruptura de haz se registró automáticamente. La actividad horizontal se expresó en término de los cruces de jaulas (es decir rupturas consecutivas en cada lado de la jaula). El número de cruces de jaula se registró continuamente y se acumula sobre intervalos de 10-min.
Para todas las ratas, la actividad locomotora se evaluó en condiciones de tensión media (es decir, después de la exposición a un ambiente nuevo o después de inyección de solución salina i.p.) y en una estimulación con anfetamina. Todas estas pruebas se realizaron durante la fase inactiva (periodo de luz). Para la prueba de novedad, las ratas se removieron de sus jaulas de hogar y colocan en una jaula de fotocelda individual y la actividad locomotora se midió por 1 h. Luego, las ratas reciben una inyección de solución salina (1 mL/kg, i.p.) y su actividad locomotora se vigiló por una hora adicional. Finalmente, los animales se inyectaron con D-anfetamina (sulfato 1.5 mg/kg, i.p., Sigma Aldrich, A-5880, lote 90K3354) y su actividad se registró por dos horas adicionales.
B. Resultados
1. Formación de imagen por resonancia magnética in vivo
a) Después de la primer inyección de retirada de proteína ENV
En P 12, el análisis cualitativo de imágenes ponderadas T2 de la mayoría de los animales revela hiperseñales grandes que corresponden a los ventrículos laterales. Comparado con imágenes MRI clásicas de cerebros de rata sin experimentación, el alargado de estas hiperseñales que se aprecia en el estudio actual sugiere un hinchado de los ventrículos laterales en los animales correspondientes. Además, una expansión más fuerte del ventrículo lateral derecho (es decir el inyectado) que se observa en animales tanto inyectados con ENV como simulados. La extensión de hiperseñales que corresponden a los ventrículos laterales observadas en animales inyectados con proteína ENV fueron diferentes aq aquellas de animales inyectados con PBS lo que sugiere que la proteína ENV dispara el proceso neuroinflamatorio.
Las comparaciones de imágenes ponderadas TI adquiridas antes y después de inyección de gadolinio revela diferencias en animales inyectados ya sea con PBS o proteína ENV. Estos resultados sugieren que las barreras cerebromenigeales y cerebroventriculares pueden alterarse 12 días después de la inyección intracerebroventicular (icv) de proteína ENV. b) Después de la segunda inyección de retirada de proteína ENV
Como se describe después de la inyección de retirada de la proteína ENV, el análisis cualitativo de imágenes ponderadas T2 obtenido después de la segunda inyección de retirada (P37) revela hiperseñales grandes que corresponden a los ventrículos laterales en la mayoría de animales. En ratas simuladas, no se ha detectado ninguna hiperseñal importante (tomando en cuenta el incremento de señal más allá de la señal de respaldo normal del fluido cerebroespinal que se visualiza normalmente por MRI dentro de los ventrículos cerebrales), que corresponden a los ventrículos laterales entre los dos puntos de tiempo. Notablemente, las ratas inyectadas con ENV exhiben un alargado fuerte de estas hiperseñales después de la segunda inyección. Aún de forma más importante, las hiperseñales podrían extenderse a estructuras circundantes, particularmente el hipocampo. Las imágenes MR obtenidas en las ratas inyectadas con ENV tratadas con el anticuerpo quimérico IgG4 revelan alargado fuerte de las hiperseñales que corresponden a los ventrículos laterales.
De manera interesante, la extensión de estas hiperseñales ponderadas T2 en estructuras circundantes como el hipocampo se limitó en las ratas inyectadas con ENV tratadas con el anticuerpo quimérico IgG4. Ya que el anticuerpo se inyectó en la periferia del sistema nervioso central -CNS-(intraperitonealmente) este último punto resalta los hechos de que:
1 - los efectos pro-inflamatorios inmediatos en ventrículos cerebrales se relaciona exclusivamente al protocolo particular usado para el modelo animal actual, que implica una inyección icv directa de la proteína MSRV ENV, no se inhiben inmediatamente por el ligando de anticuerpo quimérico IgG4 inyectado más de 24h después de la inyección icv de ENV y, de esta manera, después del inicio de la inflamación del ventrículo local. Deberá precisarse que la inflamación del ventrículo local no es una característica principal de la patogénesis en la psicosis y más probablemente no involucra problemas de neurocomportamiento en el modelo actual. Esta inflamación local post-icv inmediata, puede considerarse de esta manera como un efecto colateral del modelo actual.
2- las características relevantes conocidas para asociarse con expresión de psicosis, tal como involucramiento patogénico del hipocampo, se inhibe aquí en ratas inyectadas con el ligando terapéutico de la presente invención, bajo la forma del anticuerpo IgG4 humano-quimérico inyectado después de inyección icv de ENV, en distancia del CNS y en la periferia del CNS. Aquí hay evidencia por la inhibición de la extensión de hiperseñales, observada por MRI, desde ventrículos hasta la región cerebral crítica del hipocampo.
Las comparaciones de imágenes ponderadas TI adquiridas antes y después de inyección de gadolinio no revelan ninguna de las diferencias aparentes en todos los grupos. Estos resultados sugieren que las barreras cerebromeningeales y cerebroventriculares no se aprecia que se altera además después de la segunda inyección de retirada de proteína ENV.
En este primer conjunto de experimento, se ha mostrado por primera vez que dos inyecciones de retirada icv de proteína ENV pueden llevar a un proceso neuroinflamatorio en áreas ventriculares y del hipocampo en ratas que han recibido un Cebado inmunitario inducido por ENV en la adultez temprana. Notablemente, las disfunciones anatómicas y funcionales del hipocampo son consistentes con estudios MRI reportados en pacientes esquizofrénicos con disminución cognitiva de larga duración asociada con pérdida de neuronas y alargado ventricular (Bornstein et al., 1992). De manera interesante, el daño del hipocampo inducido por inyecciones de retirada repetida de proteína ENV se inhibió por la administración del anticuerpo IgG4 quimérico humano, después de la inducción de patogénesis inducida por ENV, que es consistente con un efecto terapéutico del ligando cuando se administra bajo la formulación de este anticuerpo quimérico en un modelo pre-clínico de Esquizofrenia.
III. Experimento 2: Evaluación de disfunciones de neurocomportamiento que sigue a una inyección bilateral sencilla de proteína ENV en el hipocampo o los ventrículos laterales de rata
A. Materiales y Métodos
1. Animales
Ratas Sprague-Dawley machos (6 hasta 8 semanas de edad) (n=6) se adquirieron de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por jaula en un ciclo de luz-oscuridad estándar con acceso ad libitum a comida y agua y estuvieron sin perturbación por un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen con la Directriz del Consulado de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directriz del Consulado Nacional de 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales usados y su padecimiento.
2. Inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo o en los ventrículos laterales
El día de la cirugía (PO), las ratas se asignaron aleatoriamente a un grupo de imitación (n=2) con inyección de PBS (Lonza, Francia) y dos grupos de prueba con icv (ratas ENV-icv, n=2) o intra-hipocampo (ratas ENV-hipp, n=2) inyección de 250 ng de proteína ENV recombinante
(ENVT, lote 081206-1 , PX'Therapeutics, Grenoble, Francia) disuelto en
PBS.
Cada rata se anestesió por administración i.p. de una solución mezclada de xilazina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon, Francia) y cetamina 80mg/kg (Imalgene®, Alcyon, Francia).
El pelo se cortó de un área que se extiende desde entre las orejas hasta apenas antes de los ojos. Se insertaron tapones en las orej as y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con una barra incisiva superior 5 mm arriba de la línea intra-aural. El área del cuero cabelludo cortada se mojó con una solución antiséptica basada en clorohexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión desde entre las orejas hasta un punto entre los ojos. La piel se retiró con fórceps y el tejido subyacente, incluyendo el periostio, se removió para exponer un área de cráneo seco, limpio (aproximadamente 15 18 mm).
La cánula plástica (d.ext. = 0.457 mm e d.int. = 0.267 mm) (Plástic One, EUA) se dirigió para implantarse bilateralmente en el ventrículo lateral o en el hipocampo. La cánula se montó en el aparato esterotáxico, la punta "enfocada" en el bregma. Se taladraron orificios bilateralmente a través del cráneo sobre el ventrículo lateral (antero-posterior, 0.92 mm; medio-lateral, ± 1.7 mm con relación al bregma) o el hipocampo (antero-posterior, 4.8 mm; medio-lateral, ± 5.0 mm con relación al bregma). El punto de la cánula se colocó sobre los orificios centrales de manera que la punta estuvo aún con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3.5 mm a través de la corteza cerebral en el ventrículo lateral o 7.5 mm en el hipocampo.
Para cada rata, la inyección de PBS solo o con proteína ENV se alcanzó por medio de un inyector de acero inoxidable, colocado en y protegido 0.5 mm debajo de la punta de la cánula. El inyector fue conectado por tubería flexible de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para despachar manualmente soluciones durante un periodo de 3 min. El inyector se retiró 3 min después de completar la eyección para prevenir el flujo de PBS o proteína ENV a lo largo de la pista del inyector.
La herida fue cerrada al usar sutura quirúrgica en un sujetador de aguja. Los animales se dejaron recuperar en una jaula individual por un periodo de 2 días. Luego, los animales se pusieron de forma aleatoria tres por jaula y se mantuvieron sin perturbación hasta los experimentos posteriores.
3. Análisis del comportamiento
La respuesta locomotora de ratas se probó en condiciones de tensión media en un campo abierto usando tres paradigmas: novedad, inyección de solución salina y tensión contenida. La respuesta locomotora a novedad se probó a P5, P6, P7, P l l y P 12, mientras que la actividad locomotora después de inyección de solución salina y tensión contenida se probó una vez en P l l y P 13 , respectivamente.
El aparato de campo abierto consiste de una caja cuadrática (80x75cmx40 cm) hecha de madera, que se iluminó débilmente. El piso del campo abierto se dividió en nueve zonas cuadradas de tamaño idéntico. Para prueba de novedad, las ratas se colocaron individualmente en el centro del campo abierto, y se permite que exploren el campo por 5min. Las ratas se permitieron entonces que regresaran a sus jaulas. Se limpió la arena con una solución salina entre animales. Para la prueba de inyección de solución salina a P l l, las ratas reciben una inyección de solución salina (1 mL/kg, i.p.) y se colocaron inmediatamente en el centro del campo abierto y se permite que exploren el campo por 5min. Para la prueba de tensión contenida, los animales se detienen a través de inmovilización por 15 min en un tubo de Plexiglás (5.5cm x 21 cm) y se colocaron inmediatamente en el centro del campo abierto y permiten explorar el campo por 5 min.
Para todas las pruebas, el comportamiento de cada animal se observó por el experimentador. La actividad motora horizontal general se cuantificó como el número de líneas cruzadas durante el periodo de 5min. Adicionalmente, el número de parados (se elevan en las patas traseras con las patas delanteras en el aire o contra la pared) se registró como sigue: 0 = ausente, 1 = algo, 2 = moderado, 3 = alto, 4 = muy alto.
B. Resultados
1. Respuesta locomotora a novedad
Para todos los puntos de tiempo, después de la exposición a novedad, todas las ratas exhiben un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5-min.
Los resultados generales de la prueba de novedad sobre los diferentes puntos de tiempo experimentales se presentan en la Figura 27. En todos los animales inyectados con ENV, el incremento en la actividad locomotora horizontal no se presentó tempranamente después de la inyección (P5) pero emerge gradualmente con el tiempo, particularmente en ratas inyectadas en el hipocampo (ratas ENV-hipp) (Figura 27A). De manera interesante, sólo la rata ENV-hipp exhibe actividad horizontal exacerbada persistente en P12. Adicionalmente, la actividad locomotora vertical incrementada se detectó tan pronto como P5 y P6 en ratas ENV-hipp, mientras que no se reportó diferencia con el animal de imitación en ratas ENV-icv en los mismos puntos de tiempo.
2. Actividad locomotora después de inyección de solución salina Después de la exposición a inyección de solución salina, todas las ratas exhiben un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5-min.
Sólo las ratas ENV-hipp exhiben un incremento claro en actividad locomotora horizontal comparado con el animal de imitación (Figura 28A), mientras que la actividad locomotora vertical de todos los grupos fue similar (Figura 28B).
3. Actividad locomotora después de tensión contenida
Después de la exposición a tensión contenida, todas las ratas exhiben un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5-min. Para actividad tanto horizontal como vertical, las ratas ENV-hipp exhiben actividad locomotora más alta
comparada con animales de imitación, mientras que no podría detectarse diferencia clara entre ratas de imitación y ENV-icv (Figura 29).
En esta segunda serie de experimentos, se ha mostrado que una inyección bilateral sencilla de proteína ENV en los ventrículos laterales o en el hipocampo podría llevar a una exacerbación de la sensibilidad a condiciones de tensión media. Además, las alteraciones del comportamiento se mostraron para ser significativamente más severas y persistentes en ratas ENV-Hipp. Además, una respuesta locomotora aberrante a la estimulación de tensión contenida sólo se observó en ratas ENV-Hipp. Las ratas con inyección en hipocampo bilateral de proteína ENV proporcionan un modelo relevante, más que el modelo inyectado con icv, con objeto de estudiar tratamientos para esquizofrenia en un modelo pre-clínico.
Por lo tanto se ha evaluado además el efecto terapéutico del ligando IgG4 humano-quimérico en este modelo optimizado.
IV. Evaluación del efecto terapéutico del lifiando IgG4 quimérico en síntomas psicóticos de neurocomportamiento después de invección bilateral sencilla de proteína ENV en el hipocampo de ratas.
A. Materiales y Métodos
1. Animales
Igual como en la parte III del ejemplo actual.
2. Inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo o en los ventrículos laterales
Igual como en la parte III del ejemplo actual, con inyección adicional de anticuerpo en ciertos animales como se describe a continuación.
Para cada rata, la inyección de cada solución (PBS, ENV e IgG4) se alcanzó por medio de un inyector de acero inoxidable, colocado en y protegido 0.5 mm debajo de la punta de la cánula. El inyector fue conectado por tubería flexible de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para despachar manualmente soluciones durante un periodo de 3 min. El inyector se retiró 3 min después de completar la eyección para prevenir el flujo de PBS o proteína ENV a lo largo de la pista del inyector. Para las ratas ENV tratadas con IgG4, 2 µ¾ del anticuerpo se fusionó 10 minutos después de la inyección de proteína ENV en ambos hemisferios en las mismas coordenadas. La herida fue cerrada al usar sutura quirúrgica en un sujetador de aguja. Los animales se dejaron recuperar en una jaula individual por un periodo de 2 días. Luego, los animales se pusieron de forma aleatoria tres por jaula y se mantuvieron sin perturbación hasta los experimentos posteriores.
3. Resultados
Estos resultados proporcionan una reproducción del experimento previo con inyección estereotáxica en el hipocampo de la proteína ENV con una exacerbación de la sensibilidad a condiciones de tensión media, como en el ejemplo ilustrado debajo para P 12 en la Figura 31 A.
Sorprendentemente y no apreciado en el experimento previo que detiene el animal hasta después de 12 días (P 12), las alteraciones del comportamiento de ratas ENV+ (no tratadas) se mostraron que tienen una evolución importante desde hiper-reactividad hasta tensión media observada todavía a P 12, hasta hipo-reactividad (congelado) como se observa en este grupo a P32 (representado por la barra media en los histogramas de la Figura 30A). además de estos resultados adicionales en el efecto terapéutico del ligando IgG4 el día 32, esta observación es completamente interesante ya que reproduce las características clave de esta evolución clínica natural del sub-tipo de esquizofrenia humana identificada para correlacionarse con la presencia de antigenemia ENV elevada y CRP en sangre (como es evidente en el ejemplo 8): la aparición de una "fase sintomática negativa" (hipo-reactividad a la tensión por el modelo animal presente) asociado con disminución cognitiva y pérdida de neuronas, después de la fase temprana caracterizada por síntomas positivos (hiper reactividad a la tensión por el modelo animal actual).
Efectivamente, este es típicamente un efecto tardío asociado con pérdida de neuronas y también puede ponerse en evidencia por alargado véntricular cerebral, como en las observaciones MRI realizadas durante el estudio actual de cerebros de rata tomados 9 meses después de la inyección icv ERNV primaria. De forma interesante de nuevo y aunque esto no se cuantifica objetivamente por pruebas de comportamiento apropiadas como en el experimento actual, estas ratas evolucionan progresivamente hacia hipo-respuesta marcada durante esta retraso largo; esto podría entonces observarse subjetivamente pero constantemente.
Aquí, con pruebas cuantitativas y apropiadas, este cambio desde "síntomas positivos" a "síntomas negativos" se confirma por la segunda prueba con tensión contenida en P32 (Figura 30B) de animales inyectados con proteína ENV en el hipocampo, contra controles de IMITACIÓN. De esta manera esto enfatiza la importancia y trascendencia del efecto terapéutico ahora reportado en animales similares tratados con el ligando IgG4, después de la inyección de proteína MSRV ENV paralela.
Como se aprecia en la Figura 31 A, los animales "ENV+" tratados con IgG4 no desarrollan esta disminución cognitiva con la aparición de esta hipo-reactividad de comportamiento ("congelado") en P32, y podría no diferenciarse del control de IMITACIÓN en este punto de tiempo (como se ilustra por las barras de error traslapadas en los histogramas), mientras que esta diferencia fue importante con animales no tratados (sin traslape de barras de error en los histogramas). Nuevamente, una segunda prueba de comportamiento después de tensión contenida, ha reproducido esta diferencia entre las ratas "ENV+" tratadas con ligando IgG4 y los animales no tratados con una diferencia aún mayor en los resultados entre los dos grupos: mientras los animales "ENV+" no tratados tienen una actividad significativamente reducida por casi la mitad comparado con animales tratados, los últimos tienen resultados indistinguibles de los controles de IMITACIÓN (Figura 3 I B).
De esta manera, ya que el sub-tipo de esquizofrenia con niveles en suero de CRP elevados se identifica para asociarse con MSRV en el ejemplo 8 y se caracteriza por esta última fase de "sintomatología negativa" asociada con disminución cognitiva y pérdida de neuronas, la evidencia de un efecto terapéutico benéfico en un modelo pre-clínico del tratamiento con el ligando IgG4 es evidencia inesperada de tal sintomatología dramática; esto, después de que la inyección de MSRV ENV ha iniciado un proceso patogénico en este modelo, confirma un mero efecto terapéutico del ligando de la presente invención en tales formas de esquizofrenia (Dickerson, F., C. Stallings, et al. 2007).
EJEMPLO 18: Análisis in vivo de Anticuerpo quimérico GNb AC1 con isotipo IgGl con efecto terapéutico en un modelo animal de cáncer, injertado con células de linfoma humanas.
I. Experimento 1 : Efecto del anticuerpo GNb AC1 quimérico IgGl en la migración de células de linfoma B humanas inyectadas subcutáneamente en ratones atímicos
A. Materiales y Métodos
1. Animales
Ratones atímicos (6 hasta 8 semanas de edad) (n=4) se adquirieron de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron en la misma jaula en un ciclo de luz-oscuridad estándar con acceso ad libitum a comida y agua y estuvieron sin perturbación por un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen con la Directriz del Consulado de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directriz del Consulado Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales usados y su padecimiento.
2. Cultivo celular
La línea celular Akata es una línea celular positiva de virus Epstein-Barr derivada de un paciente quien padece de linfoma de Burkitt. La línea celular se mantuvo en medio RPMI 1640 (Sigma, Francia) complementado con suero de bovino fetal al 10% (Gibco®, Invitrogen, Francia), 40 U de penicilina por mi y 50 µg de estreptomicina por mi a 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5%.
3. Inyección de células y administración de anticuerpos
En P0 (primer día), 15 x 107 células de linfoma se inyectaron subcutáneamente en ratones atímicos. Después de una espera de 6h, ds ratones de control reciben una inyección i.p. de solución salina amortiguada en fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y un ratón recibe una inyección i.p. del anticuerpo quimérico IgG l (100 µg/animal). El último ratón se trató similarmente con el mismo anticuerpo 72h después de la inyección de células de linfoma.
4. Examen histológico
En P 19, todos los ratones se sacrificaron por sobredosis de pentobarbital y se les aplicó la autopsia para evaluar la presencia de anormalidades anatomo-patológicas. S e capturaron fotografías con una cámara digital [modelo Coolpix S500 (es decir, 7 millones de pixeles), Nikon, Francia] y se transfiere desde la cámara a una computadora PC.
B. Resultados
Inesperadamente, no podrá detectarse masa de tejido subcutáneo visible (tumor) en ratones no tratados, mientras que ambos ratones tratados con IgGl muestran una masa localmente delineada en el sitio de inyección.
En la autopsia, se ha observado una fuerte esplenomegalia en ambos ratones de control, mientras que ambos ratones tratados con IgG l no muestran alteración macroscópica del bazo. Para estimar mejor el alargado del bazo, se calculó un índice esplénico como sigue: [(peso del bazo/peso corporal) x 100] . De manera interesante, los ratones atímicos no tratados exhiben un incremento de 2 veces la relación en peso del bazo/cuerpo comparado al de los ratones atímicos tratados con IgGl , como se muestra en la Figura 32. Además, un alargado hepático ligero también podría ser visible en ratones de control comparado con los ratones tratados con IgGl .
El examen macroscópico de otros órganos (corazón, pulmones, ríñones, cerebro, intestino y estómago) no revelan ninguna anormalidad mayor.
C. Discusión
En este primer experimento, se ha mostrado que la inyección subcutánea de células linfoblastoides en ratones atímicos puede llevar a la diseminación de células de linfom en órganos linfoides, como se pone en evidencia por una esplenomegalia fuerte, mientras que las células inyectadas in-situ parecen haber migrado casi todas. En ratones tratados con IgGl quiméricos, se ha reportado una ausencia de alargado del bazo asociado con la persistencia de la masa celular de linfoma inyectada localmente confinada in situ.
De acuerdo con los datos actuales el anticuerpo GNb AC1 quimérico IgGl debería prevenir la migración de células de linfoma a través de su efecto de ligando. Estos resultados son de esta manera un argumento convincente de que el anticuerpo quimérico IgGl qué comprende el ligando de la presente invención, puede ser una herramienta terapéutica útil en el tratamiento de tumores humanos positivos en ENV.
II. Experimento 2: Evidencia In Vivo de citotoxicidad celular contra un linfoma de célula B humana después de la inyección del ligando enlazado a MSRV-ENV en la forma de anticuerpo quimérico IgGl en un modelo de ratón SCID.
A. Materiales y Métodos
1. Animales
Ratones SCID hembras libres de patógenos (inmunodeficiencia combinada severa; desprovista de linfocitos T y B funcionales, con población NK reducida) (6 hasta 8 semanas de edad; n=5) se adquirieron de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron en la misma jaula en un ciclo de luz-oscuridad estándar con acceso ad libitum a comida y agua y estuvieron sin perturbación por un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen con la Directriz del Consulado de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directriz del Consulado Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét, Francia"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales usados y su padecimiento.
2. Cultivo de células
La línea celular de linfoma es una línea celular positiva al virus de Epstein-Barr Virus derivada de un paciente quien padeció de un linfoma de Burkitt. La línea celular Akata se mantuvo en medio RPMI 1640 (Sigma, Francia) complementada con suero bovino fetal al 10% (Gibco®, Invitrogen, Francia), 40 U de penicilina por mi y 50 µg de estreptomicina por mi a 37°C en una atmósfera humidificada al 5% de C02.
3. Inyección de células y la administración de anticuerpos
El primer día PO, 15 x 107 células linfoblastoides Akata (LC) se inyectaron por vía intraperitoneal en todos los ratones SCID. Después de un retraso de 24h, tres ratones de control recibieron una inyección i.p. de solución salina amortiguada de fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y dos ratones recibieron una inyección i.p. de 100 µg del anticuerpo quimérico, IgGl .
4. Examen histológico y conteo celular.
En P7, todos los ratones fueron sacrificados por una sobredosis de pentobarbital. Posteriormente, las células de lavado peritoneal fueron recolectadas en 5 mi de PBS. La determinación de la viabilidad de LC se basó en la tinción con colorante azul de tripano del fluido peritoneal. La LC y otras células de glóbulos blancos fueron observadas y contadas con microscopía de baja potencia. Células de linfoma de Burkitt humanas pudieron identificarse fácilmente por su morfología y confirmación de su especificidad se obtuvo por inmunocitoquímica efectuada con monoclonales de virus anti-Epstein-Barr, específico para proteínas expresadas de latencia, así como con monoclonales específicos para marcadores humanos de células B (no se muestran).
Se les aplicó también la autopsia a los ratones para evaluar la presencia de anormalidades anatomopatológicas. Particularmente, la alteración potencial esplénica fue estimada por ña relación de bazo/peso del cuerpo calculada como sigue: [(peso del bazo/peso corporal) x 100] .
B. Resultados
El examen macroscópico de todos los ratones no reveló la presencia de tumor palpable, lo cual fue consistente con la duración muy corta del estudio, justificada por la necesidad de atender la citotoxicidad dependiente de anticuerpos en un retraso corto después de la inyección de células de linfoma y, posteriormente, inyección de anticuerpos o de imitación. Sin embargo, la esplenomegalia se pudo detectar fácilmente en ambos ratones de control, mientras que ambos ratones tratados con IgGl no mostraron modificación macroscópica del bazo. Cómo en el experimento previo con la inyección subcutánea de las mismas células en ratones sin pelo, los ratones SCID sin tratar desplegaron un incremento de 2 veces de la relación de bazo/peso del cuerpo en comparación con aquella de ratones SCID tratados con IgGl (Figura 32). El examen macroscópico de otros órganos (corazón, pulmones, ríñones, cerebro, intestinos y estómago) no reveló ningunas anormalidades mayores.
El análisis del fluido peritoneal de ratones tratados con IgGl reveló una disminución en el número tanto de células de linfoma vivas como muertas en comparación con aquella de los ratones de control (Figura 33A). De manera más interesante, alrededor del 50% de células de linfoma recolectadas de la cavidad peritoneal de ratones tratados con Chimeric IgGl de GNb AC l quimérico fueron células muertas seis días después de la inyección del anticuerpo. En paralelo, un incremento en el número de otras células mononucleares de glóbulos blancos (principalmente células de macrófagos de origen monocítico y unas cuantas células NK, en ratones SCID) fue observado en ratones tratados con IgGl en comparación con los ratones de control (Figura 33B).
C. Discusión
En este segundo experimento, se ha observado que la inyección intraperitoneal de células de linfoma de Burkitt en ratones SCID puede inducir la esplenomegalia después de 7 días, consistentemente con los estudios previos en ratones sin pelo que muestra lo mismo después de 19 días. De manera interesante, los ratones tratados con IgGl no mostraron tal agrandamiento de bazo.
Además, el conjunto de (i) la disminución en el número de células de linfoma vivas recolectadas de la cavidad peritoneal, cuando se compara con los animales no tratados, de (ii) la proporción importante de células malignas vivas, y de (iii) el incremento en el número de otras células mononucleares de glóbulos blancos, es altamente indicativo de efecto citotóxico directo dependiente de los anticuerpos y/o mediado por células en las células de tumor. Este efecto refleja así (i) la especificiad del ligando que se enlaza a las células de tumor que expresan el epítopo objetivo en proteínas MSRV-ENV expuestas en células de tumor humanas como es evidente en el ejemplo 8 y (ii) los efectos inmunitarios humorales mediados por el isotipo de IgGl añadidos involucran la destrucción de células de
tumor. El último efecto puede estar mediado a través de, por ejemplo, la activación del complemento por sitios activos de IgGl y, por ejemplo, actividad tumoricida de macrófagos inducida a través de la interacción del receptor FC con GNb AC 1 IgGl enlazada al antígeno de MSRV-ENV de tumor.
Cualesquiera que sean los mecanismos implicados en los efectos de este anticuerpo quimérico IgGl , nuestros resultados demuestran una inhibición de la proliferación de la célula de linfoma en un modelo animal preclínico con células humanas de tumor, haciendo evidente así el potencial terapéutico del anticuerpo anti-ENV Ligando en el tratamiento de tales cánceres positivos al ENV.
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Claims (26)
1. Un ligando caracterizado porque comprende cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) establecidas en SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 o - cualquier secuencia que tenga ya sea el número de aminoácidos sustituidos dentro de dichas secuencias como se indica en lo siguiente, desde 0 a 3 en CDRl (SEQ ID No. l ), desde 0 a 2 en CDR2 (SEQ ID No.2), desde 0 a 2 en CDR3 (SEQ ID No.3), desde 0 a 1 en CDR4 (SEQ ID No.4), desde 0 a 4 en CDR5 (SEQ ID No.5), desde 0 a 2 en CDR6 (SEQ ID No.6), o - aminoácidos sustituidos con otros aminoácidos que tienen funciones y propiedades químicas equivalentes, dentro de las secuencias SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 6.
2. Un ligando caracterizado porque comprende: - una región variable de cadena ligera (VL) que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 o cualquier secuencia que tenga al menos 80% de identidad y más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias, y - una región variable de cadena pesada (VH) que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6 o cualquier secuencia que tenga al menos 80% de identidad y más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias.
3. Ligando caracterizado porque comprende: - una región variable de cadena ligera (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID No. 7, o cualquier secuencia que tenga al menos 75% de identidad, más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencia y - una región variable de cadena pesada (VH) que tiene las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID No. 8 o cualquier secuencia que tenga al menos 75% de identidad, más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencia.
4. El fragmento ScFV caracterizado porque comprende el ligando de la reivindicación 1 a 3.
5. El fragmento Fab caracterizado porque comprende el ligando de la reivindicación 1 a 3.
6. Un anticuerpo caracterizado porque comprende el ligando de la reivindicación 1 a 3.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6 caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, preparado por ingeniería o humanizado.
8. El anticuerpo de la reivindicación 6 o 7 caracterizado porque es una IgG.
9. El anticuerpo de la reivindicación 8 caracterizado porque es una IgGl o IgG4 humana.
10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el ligando de la reivindicación 1 a 3, el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9 como un ingrediente activo.
1 1. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende al menos una secuencia de longitud completa establecida en SEQ ID No. 13b, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
12. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 1 caracterizada porque comprende cada una de las secuencias establecidas en SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, y SEQ ID No. 18 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dicha secuencia o cualquier secuencia 100%» complementaria de la misma.
13. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende al menos una secuencia de longitud completa establecida en SEQ ID No. 10 o 12 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia 100 % complementaria de la misma.
14. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende al menos una secuencia de longitud completa establecida en SEQ ID No. 9 o 1 1 o cualquier secuencia que tenga al menos 70% y más preferiblemente 80% e incluso más preferiblemente 90% de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
15. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de cualquiera de la reivindicación 1 1 a 14.
16. Una célula hospedera transformada con un vector de conformidad con la reivindicación 15.
17. Un método para la producción del ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3 , el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9 caracterizado porque comprende la etapa de cultivar la célula hospedera de la reivindicación 16 bajo condiciones que permitan la síntesis del ligando, anticuerpo scFV, fragmento Fab o anticuerpo.
18. Un método de tratamiento caracterizado porque comprende administrar el ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3, el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9 o una forma farmacéuticamente aceptable del ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3, el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10.
19. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 18 caracterizado porque es para el tratamiento de una enfermedad asociada con MSR.V seleccionada del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome clínicamente aislado, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes, y más particularmente diabetes tipo 1.
20. Un método de tratamiento de enfermedades asociadas con MSRV de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 18 o 19 caracterizado porque comprende administrar la IgG4 o un anticuerpo IgGl de acuerdo con la reivindicación 9 como un tratamiento crónico con inyecciones regularmente repetidas.
21. Anti-ligando caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No. 20 o SEQ ID No. 32 o una secuencia que tiene al menos 75% identidad de secuencia a la secuencia establecida en SEQ ID No. 20 o SEQ ID No. 32 o cualquier secuencia 100% complementaria de la misma.
22. Un método de detección del anti-ligando en una muestra biológica, que usa el ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3, el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto la muestra con el ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3 , el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9, (b) detectar la presencia del anti-ligando en la muestra.
23. El método de detección del anti-ligando de conformidad con la reivindicación 22 caracterizado porque además comprende la etapa de: (c) poner en contacto la muestra con un ligando que enlaza específicamente al antígeno GAG.
24. Un kit de inmunoensayo para la detección del anti-ligando en una muestra biológica, dicho kit caracterizado porque comprende un ligando de conformidad con la reivindicación 1 a 3, el fragmento scFV de la reivindicación 4, el fragmento Fab de la reivindicación 5 o un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9, y reactivos para la detección de enlace específico del anti-ligando al ligando anterior, sCFv, fragmento Fab o antígeno.
25. El kit de inmunoensayo para la detección del anti-ligando de conformidad con la reivindicación 24 en una muestra biológica, dicho kit caracterizado porque comprende además un ligando que enlaza específicamente un antígeno GAG.
26. Uso del kit de inmunoensayo de conformidad con la reivindicación 24 o 25 en la detección de una enfermedad asociada con MSRV seleccionada del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome clínicamente aislado, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes, y más particularmente diabetes tipo 1.
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