WO2023143445A1 - 用于治疗hbv感染及相关疾病的表位肽及抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染治疗领域。具体而言，本发明涉及可用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白，针对此类表位肽的抗体(例如纳米抗体)。本发明的表位肽及抗体可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。

Description

用于治疗HBV感染及相关疾病的表位肽及抗体 技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染治疗领域。具体而言，本发明涉及可用于治疗乙型肝炎病毒感染的表位肽(或其变体)，包含此类表位肽(或其变体)以及载体蛋白的重组蛋白，针对此类表位肽的抗体(例如纳米抗体)。本发明的表位肽及抗体可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。
背景技术
HBV是DNA病毒，可导致一系列程度不同的肝脏疾病，其中慢性乙型肝炎(ChronichepatitisB,CHB)感染具有发展成严重肝病的巨大风险，包括肝硬化(Livercirrhosis,LC)和原发性肝细(Hepatocellularcarcinoma,HCC)。HBV是全世界的一个严重的公共卫生负担。
CHB患者的理想治疗终点是实现HBsAg血清学阴转(HBsAgloss)，然而由于病人体内高滴度的HBsAg导致他们产生免疫耐受，基于现有药物(干扰素或核苷/核苷酸类似物)进行的治疗难以实现理想治疗终点，因此，针对慢性HBV感染者发展创新的治疗药物和方法是迫切而必要的。
基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一，可包括主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)和被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)。主动免疫治疗则是指，通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等)，刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等)，从而达到抑制或清除HBV的目的。被动免疫治疗(以抗体为例)是指，向HBV感染者被动施用具治疗特性的抗体，并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞，或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞，从而起到治疗的效果。
然而，本领域已知慢性乙肝患者由于体内高水平的HBsAg往往产生针对HBV的免疫耗竭(耐受)进而使感染迁延不愈。清除血清HBsAg，恢复或激活机体HBV特异 性免疫，是功能治愈CHB的关键。
发明内容
尽管HBV病毒的各种蛋白上存在多个B细胞应答(抗体应答)表位，然而并非针对任意表位的抗体都能应用于HBV感染(特别是慢性HBV感染)的治疗。因此，发展能有效地治疗HBV感染的免疫治疗药物/方法的关键在于，鉴定能诱发有效清除体内病毒和被病毒感染的细胞的抗体应答的靶标(表位)，以及获得针对该靶标(表位)的抗体。本发明鉴定了此类靶标(表位)，并提供了针对此类表位肽/表位的抗体，特别是纳米抗体，纳米抗体结合了单克隆抗体与小分子药物的优势，能够透过血脑屏障，易于改造，易于开发和稳定生产，降低了生产的难度与成本。由本发明的表位肽或纳米抗体介导的免疫治疗有望成为CHB病人对抗HBV病毒持续感染的新策略。
表位肽
在一个方面，本发明提供了分离的表位肽或其变体，所述表位肽或其变体包含位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基；所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个，4个，或5个)氨基酸残基的突变(例如置换、添加或缺失)，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
本发明的表位肽的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：
1)与包含SEQ ID NOs:1-3所示的CDR1-3的纳米抗体(例如125s)特异性结合；
2)在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；
3)诱发有效清除受试者体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答、和/或诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)(任选地，在将所述表位肽与载体蛋白融合后)；和
4)预防和/或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些实施方案中，2)-4)任一项中所述的受试者是未感染HBV的受试者，或者可以是HBV感染者，例如慢性HBV感染者。在某些实施方案中，本发明的表位肽在与载体蛋白融合后具有1)-4)任一项所述的生物学功能。
在某些实施方案中，所述位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨 基酸残基。在某些实施方案中，其进一步包含第157位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:37所示)。
在某些实施方案中，所述位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:37所示)以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基。在某些实施方案中，其进一步包含第157位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位是构象表位，其由位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个非连续氨基酸残基组成，并且至少包含HBsAg蛋白的第163-165位。
在某些实施方案中，所述构象表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基。在某些实施方案中，其进一步包含第157位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述构象表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:37所示)。
在某些实施方案中，所述构象表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:37所示)以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基。在某些实施方案中，其进一步包含第157位氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述表位肽由HBsAg蛋白的至少5个(例如，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个)和/或至多80个(例如，至多75个，至多70个，至多65个，至多60个，至多55个，至多50个，至多45个，至多40个，至多35个，至多30个，至多25个，至多20个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述表位。
在某些实施方案中，所述表位肽由HBsAg蛋白的5-80个(例如，5-75个，5-70个，5-65个，5-60个，5-55个，5-50个，5-45个，5-40个，5-35个，5-30个，5-25个，5-20个；例如5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，23个，24个，25个，30个，35个，40 个，45个，50个，55个，60个，65个，70个，74个，75个或80个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述表位。
在某些实施方案中，所述表位肽至少包含HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基。在某些实施方案中，所述HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基如SEQ ID NOs:19、38-44任一项所示。
在某些实施方案中，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置163-165的位置中不包含突变。
在某些实施方案中，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置163-166的位置中不包含突变。
在某些实施方案中，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置162-167的位置中不包含突变。
在某些实施方案中，所述变体进一步在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置157的位置中不包含突变。
在某些实施方案中，所述变体进一步在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置171的位置中不包含突变。
在某些实施方案中，所述变体进一步在相应于HBsAg蛋白的如下位置的氨基酸位置中的一处或多处(例如1处，2处，或3处)不包含突变：158、160。
在某些实施方案中，所述变体在相应于HBsAg蛋白的如下位置的氨基酸位置中的一处或多处(例如1处，2处，3处，4处或5处)包含突变：161、162、167、168、169、170、172、173、174。
在某些实施方案中，所述突变是氨基酸置换，例如保守置换。
在某些实施方案中，所述氨基酸置换包括用丙氨酸置换所述位置的氨基酸。
在某些实施方案中，上述给出的氨基酸位置是指SEQ ID NO:36所示的序列中的位置，本领域技术人员熟知可通过对序列进行最优比对(即当序列进行比对以获得最高百分数同一性)，以获得所述变体中相应于上述氨基酸位置的位置。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体至少包含如下所示的氨基酸序列：AX1X2X3X4X5WEWAX6X7X8X9SX10X11X12(SEQ ID NO:51)；其中，
X1(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置158)为F或L；
X2(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置159)为A或G；
X3(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置160)为K或R；
X4(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置161)为任意天然氨基酸(例如Y、F或A)；
X5(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置162)为任意天然氨基酸(例如L或A)；
X6(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置167)为任意天然氨基酸(例如S或A)；
X7(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置168)为任意天然氨基酸(例如V或A)；
X8(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置169)为任意天然氨基酸(例如R、H或A)；
X9(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置170)为任意天然氨基酸(例如F或A)；
X10(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置172)为任意天然氨基酸(例如W或A)；
X11(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置173)为任意天然氨基酸(例如L或A)；
X12(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置174)为任意天然氨基酸(例如S或A)。
在某些实施方案中，X5为L，X6为S，X1-X4和X7-X12如上定义。
在某些实施方案中，X5为L，X6为S，X9为F，X10为W，X11为L，X12为S，X1-X4和X7-X8如上定义。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体至少包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NOs:19、38-44任一项所示的序列。
在某些实施方案中，所述HBsAg蛋白包含如SEQ ID NO:36所示的序列或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体包含SEQ ID NOs:16、19、22-35、38-44任一项所示的序列或由其组成。
重组蛋白
可以将本发明的表位肽或其变体与载体蛋白融合，以增强该表位肽或其变体的免疫原性，和/或维持所述表位肽或其变体中所包含的构象表位，使得其能够被机体的免疫系统识别，并诱发机体的免疫应答。
因此，在另一方面，本发明提供了一种重组蛋白，其包含如上所述的分离的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽或其变体可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。此外，任选地，所述表位肽或其变体通过接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或 多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。
在某些实施方案中，所述重组蛋白的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：1)与包含SEQ ID NOs:1-3所示的CDR1-3的纳米抗体(例如125s)特异性结合；2)在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平；3)诱发有效清除受试者体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答、和/或诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)；和4)预防和/或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些实施方案中，所述载体蛋白选自免疫球蛋白Fc结构域，例如IgG Fc结构域(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体任选地通过接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接至免疫球蛋白Fc结构域的N末端或C末端(例如N末端)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含如SEQ ID NO:14所示的序列。
在某些实施方案中，所述载体蛋白选自能够自组装形成纳米颗粒的蛋白，由此所述重组蛋白能够形成抗原纳米粒子。抗原纳米粒子是呈递多个拷贝的抗原(例如本发明的表位肽或其变体)的多肽的组装，其导致多结合位点(亲合力)并且可以提供改进的抗原稳定性和免疫原性。制备自组装蛋白纳米粒子和其用于疫苗中的用途是本领域技术人员熟知的，作为非限制性实例，自组装纳米粒子可以基于铁蛋白(Ferritin)、Encapsulin或Lumazine synthase(LS)。
在某些实施方案中，所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白是铁蛋白(ferritin)，例如鼠铁蛋白。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体通过肽键或异肽键连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变体通过异肽键连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)。
在某些实施方案中，所述异肽键由蛋白质-蛋白质结合对形成。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对由第一成员(例如第一肽标签)和第二成员(例如第二肽标签)组成，其中所述第一成员和第二成员由异肽键结合，并 且，所述第一成员任选地通过第一接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接于所述表位肽或其变体的N末端或C末端以形成第一蛋白，所述第二成员任选地通过第二接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接于所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)以形成第二蛋白。
在某些实施方案中，所述第一蛋白和/或第二蛋白可进一步(例如在其N末端或C末端)包含蛋白标签。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对选自：(i)SpyTag:SpyCatcher对，(ii)SpyTag:KTag对，(iii)Isopeptag:pilin-C对，(iv)SnoopTag或SnoopTagJr:SnoopCatcher对，(v)SpyTag002:SpyCatcher002对，(vi)RrgATag、RrgATag2或DogTag:RrgACatcher对，(vii)IsopepTag-N:Pilin-N对，(viii)PsCsTag:PsCsCatcher对。
在某些实施方案中，所述蛋白质-蛋白质结合对是SpyTag:SpyCatcher对；例如，所述SpyTag包含如SEQ ID NO:46所示的序列；例如，所述SpyCatcher包含如SEQ ID NO:47或48所示的序列。
在某些实施方案中，本发明的重组蛋白由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：
所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及SpyTag:SpyCatcher对的第一成员，所述第一成员任选地通过第一接头与所述表位肽或其变体连接(例如连接至所述表位肽或其变体的N端或C端)；
所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及SpyTag:SpyCatcher对的第二成员，所述第二成员任选地通过第二接头与所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白连接(例如连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N端)。
在某些实施方案中，所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及SpyCatcher或其活性片段(例如N端截短体)，所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及SpyTag。
在某些实施方案中，所述第一蛋白包含SEQ ID NO:49所示的序列，所述第二蛋白包含SEQ ID NO:50所示的序列。
表位肽及重组蛋白的制备
在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的表位肽或其变体。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的重组蛋白。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码的重组蛋白由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及蛋白质-蛋白质结合对的第一成员；所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员。在此类实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列以及编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列存在于相同或不同的分离的核酸分子上。
在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的表位肽或其变体或本发明的重组蛋白。
在某些实施方案中，所述载体编码本发明的表位肽或其变体。
在某些实施方案中，所述载体编码本发明的重组蛋白。
在某些实施方案中，所述载体编码的重组蛋白由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及蛋白质-蛋白质结合对的第一成员；所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及所述蛋白质-蛋白质结合对的第二成员。在此类实施方案中，所述载体包含编码所述第一蛋白的第一核苷酸序列以及编码所述第二蛋白的第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列存在于相同或不同的载体上。
在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如HEK293细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是微生物，例如细菌细胞或真菌细胞。
在另一个方面，还提供了制备本发明的表位肽或其变体或重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的表位肽 或其变体或重组蛋白。
多聚体
在另一方面，本发明提供了包含多个单体的多聚体，其中，各单体各自独立地选自本发明的重组蛋白。
在某些实施方案中，所述多聚体是二聚体、三聚体或四聚体。
在某些实施方案中，所述各单体彼此相同。
在某些实施方案中，所述各单体彼此相同，并且选自包含本发明的表位肽或其变体以及免疫球蛋白Fc结构域作为载体蛋白的重组蛋白。
在某些实施方案中，所述多聚体的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：1)与包含SEQ ID NOs:1-3所示的CDR1-3的纳米抗体(例如125s)特异性结合；2)在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平；3)诱发有效清除受试者体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答、和/或诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)；和4)预防和/或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
粒子(particle)
在另一方面，本发明提供了粒子(particle)，在其表面上展示本发明的分离的表位肽或其变体。
在某些实施方案中，所述粒子是纳米粒子，病毒样颗粒(VLP)或核心样颗粒(CLP)。
在某些实施方案中，所述粒子包含本发明的重组蛋白或多聚体，或由其组成。
在某些实施方案中，所述粒子是由包含本发明的表位肽或其变体以及能够自组装形成纳米颗粒的蛋白作为载体蛋白的重组蛋白形成的纳米粒子。
在某些实施方案中，所述粒子的生物学功能包括但不限于选自下列的一种或多种：1)与包含SEQ ID NOs:1-3所示的CDR1-3的纳米抗体(例如125s)特异性结合；2)在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平；3)诱发有效清除受试者体内的HBV和被HBV感染的细胞的抗体应答、和/或诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)；和4)预防和/或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
表位肽的应用
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、多聚体或粒子。
在某些实施方案中，所述药物组合物是疫苗。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含佐剂。用于共同施用或包含在本发明的药物组合物中的佐剂优选地应该是在人体中潜在安全、良好耐受和有效的佐剂。这样的佐剂是本领域技术人员熟知的。
在某些实施方案中，所述药物组合物是蛋白疫苗，其包含如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体或粒子。在某些实施方案中，所述蛋白疫苗包含一个或多个本发明的表位肽或其变体，且这些表位肽或其变体可以是单独的或串联的、修饰的或未经修饰的、偶联至其他蛋白的或不偶联至其他蛋白的。
在某些实施方案中，所述药物组合物是核酸疫苗，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。在某些实施方案中，所述核酸疫苗包含DNA或RNA。在此类实施方案中，所述DNA或RNA可以是裸露的或可以包裹于具有传递或/和保护功能的外壳内。在某些实施方案中，所述外壳可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等的外壳，也可以是采用化学方法合成的能行使相似功能的其他材料。
如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或药物组合物可以通过 本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。
如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或药物组合物应以有效剂量施用。可根据待治疗或预防的特定疾病或病症、严重程度、对象的年龄以及特定对象的其他个人属性(例如，对象健康的一般状态和对象免疫系统的稳健性)来确定合适的量。有效剂量的确定还通过动物模型研究引导，随后进行人体临床试验，并且通过显著降低对象中目标疾病症状或病症的发生或严重性的施用方案来指导。
在另一方面，本发明提供了如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、多聚体、粒子、或药物组合物在制备制剂中的用途，所述制剂用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)、和/或预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些实施方案中，所述制剂是疫苗。
在某些实施方案中，所述制剂是蛋白疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体或粒子在制备蛋白疫苗中的用途，所述蛋白疫苗用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)、和/或预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些实施方案中，所述制剂是核酸疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了如上所述的核酸分子或载体在制备核酸疫苗中的用途，所述核酸疫苗用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)、和/或预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
在某些实施方案中，所述受试者是未感染HBV的受试者。在某些实施方案中，所述受试者是已感染HBV的受试者，例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者。
在另一方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答、和/或预防和/或治疗受试 者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、多聚体、粒子、或药物组合物。在某些实施方案中，所述受试者是未感染HBV的受试者。在某些实施方案中，所述受试者是已感染HBV的受试者，例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者。
对于预防性应用，如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、多聚体、粒子、或药物组合物在出现任何症状之前，例如在感染之前提供。预防性施用用于预防或改善任何后续感染，以在暴露或怀疑暴露于病毒之后或在实际开始感染之后减弱感染和/或相关疾病症状的预期严重性、持续时间或程度。在一些实施方案中，待治疗的对象可以是有发生HBV感染风险的对象，例如由于暴露于或可能暴露于HBV。
对于治疗应用，如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、多聚体、粒子、或药物组合物在疾病或感染的症状发作时或之后施用，例如在HBV感染的症状发生之后或在诊断出HBV感染之后提供。在一些实施方案中，待治疗的对象也可以是已感染HBV的受试者，例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者。
在某些实施方案中，向所述受试者施用蛋白疫苗，其包含如上所述的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体或粒子。
在某些实施方案中，向所述受试者施用核酸疫苗，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。
纳米抗体及其衍生物
在另一个方面，本发明提供了特异性结合HBsAg的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体通常由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4，所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合HBsAg的能力。在一些实施方案中，本发明所述的纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段特异性结合如上所述的表位肽或其变体或其所包含的表位、重组蛋白、多聚体或粒子。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：1 或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：2与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段还包含：序列为SEQ ID NO：4或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1，序列为SEQ ID NO：5或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2，序列为SEQ ID NO：6或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3，序列为SEQ ID NO：7或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。在某些实施方案中，所述置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化VHH，即其中一或多个骨架区已基本上由人类骨架区替换的VHH。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：源自IGHV3-23*04胚系基因序列的FR1～FR3以及源自IGHJ5*02胚系基因序列的FR4，所述FR1～FR4任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：9或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1，序列为SEQ ID NO：10或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2，序列为SEQ ID NO：11或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3，序列为SEQ ID NO：12或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：13所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。在某些实施方案中，所述置换是保守置换。
在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平，和/或激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。在某些实施方案中，所述HBV包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J基因型。HBV的基因型可参见NCBI生物分类数据库(Taxonomy)，登录号为txid10407。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对HBsAg的结合。因此，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，另外的功能多肽(例如Fc结构域)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
因此，在另一个方面，本发明还提供了包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段以及另外的多肽的多肽构建体，所述多肽构建体能够特异性结合HBsAg。
在某些实施方案中，所述多肽构建体包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域。
在本文中，所述Fc结构域也称为Fc区，是指包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在一些实施方案中，Fc结构域包含铰链、CH2和CH3。当Fc结构域包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc结构域可为任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域是天然Fc区，其包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。例如，所述Fc结构域可以是天然序列人类IgG1Fc区、天然序列人类IgG2Fc区、天然序列人类IgG3Fc区或天然序列人类IgG4Fc区。天然Fc区可具有效应子功能。示例性“效应子功能”包括与Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。可以通过将天然Fc区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。
因此，在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域也可以是变异Fc区，其与天然Fc区相比可以包含一个或多个(例如1-10个，例如1-5个)氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的C端。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是人免疫球蛋白Fc结构域，例如人IgG的Fc结构域(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含包含SEQ ID NO：14所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4 个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。在某些实施方案中，所述置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是鼠免疫球蛋白Fc结构域，例如鼠IgG的Fc结构域(例如鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含包含SEQ ID NO：15所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。在某些实施方案中，所述置换是保守置换。
在另一个方面，本发明还提供了包含本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体以及偶联部分的缀合物。
在某些实施方案中，所述偶联部分是可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体，以降低潜在的位阻。
在某些实施方案中，所述偶联部分是治疗剂。
抗体及其衍生物的制备
本发明的抗体或多肽构建体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体或多肽构建 体的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体或多肽构建体。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如HEK293。在某些实施方案中，所述宿主细胞是微生物，例如细菌细胞或真菌细胞。
在另一个方面，提供了制备本发明的纳米抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。
抗体的治疗应用
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体可以与另外的药学活性剂联用。因此，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂，例如用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或根据本发明的药物组合物。
在上述任一方面中，所述受试者可以是未感染HBV的受试者，或者所述受试者是已感染HBV的受试者，例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者。
在上述任一方面中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或药物组合物所涉及的HBV包括但不限于A、B、C、D、E、F、G、H、I、J基因型。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或者本发明的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体可通过本领域已知的多种方法给药。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些的实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体通过静脉输注或注射给予。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或者本发明的药物组合物可以配制成多种剂型，例如液体、半固体和固体剂型，例如溶液剂(例如注射剂)、分散剂或悬浮剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、糖浆剂、粉剂、脂质体、胶囊剂和栓剂。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
例如，一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
此外，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明所提供的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。在某些实施方案中，将本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体与其它抗病毒试剂联合使用，以预防和或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病。本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体可以和此类抗病毒试剂同时、分开或连续给药。此类抗病毒试剂包括但不限于，干扰素类药物、利巴韦林、金刚烷、IL-2、L-12等。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
抗体的检测应用
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或缀合物能够特异性结合HBsAg，从而可用于检测HBsAg在样品中的存在或其水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括：使用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或缀合物。在一些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体还包括可检测的标记。在另一些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结 合片段或多肽构建体或缀合物接触；(2)检测抗原-抗体复合物的形成或检测所述复合物的量。所述复合物的形成表明存在HBsAg蛋白和/或HBV。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或缀合物来检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体还包括可检测的标记。在另一些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。
在另一个方面，提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或缀合物在制备用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV的检测试剂中的用途。
在上述任一方面中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体或缀合物所涉及的HBV包括但不限于A、B、C、D、E、F、G、H、I、J基因型。
识别表位肽的抗体及其应用
在另一方面，本发明提供了能够特异性结合本发明的表位肽或其变体或其所包含的表位、重组蛋白、多聚体或粒子的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与本发明提供的上述纳米抗体(例如125s)竞争性结合HBsAg蛋白。所述竞争性结合是指能够阻断本发明提供的纳米抗体(例如125s)与HBsAg蛋白的结合的至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％。所述竞争性结合可以通过竞争性结合试验测定。
竞争性结合试验是本领域技术人员熟知的，竞争性结合试验是通过未知物抑制标记的已知抗原和其特异性抗体结合的能力来检测和定量未知物的免疫学试验，也称为竞争性抑制试验。一个示例性的方法包括：先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经标记的已知单抗(如本发明提供的纳米抗体)共同加入上述预包被后的微孔板中进行孵育，然后在洗涤后测定在不同稀释度的待测抗体下，已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱，结合到板上的已知抗体就越少。例如，将抗原预包被在96孔微孔板上，并利用放射性免疫试验、酶免疫试验如ELISA、或荧光免疫试验测定待测单抗阻断经标记的已知单抗的能力。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、纳米抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
在另一方面，本发明提供了用于产生抗体的方法，所述抗体特异性结合本发明的表位肽或其变体或其所包含的表位，所述方法包括使用本发明的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或编码所述表位肽或其变体或重组蛋白的多核苷酸。
在某些实施方案中，所述方法包括：使用所述表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子、或多核苷酸免疫动物；并从经免疫的动物中筛选和产生目标抗体。
在某些实施方案中，所述方法还包括人源化过程。
在某些实施方案中，所述人源化过程包括将从动物产生的抗体的CDR序列移植至人抗体的FR框架区。
在某些实施方案中，所述人源化过程包括使用转基因动物(例如转基因小鼠)，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。
在某些实施方案中，所述方法包括使用展示技术。在某些实施方案中，所述展示技术选自噬菌体展示、细菌展示、酵母展示或核糖体展示。在某些实施方案中，用于所述展示技术的文库被设计成具有来自人抗体的序列。
在某些实施方案中，所述方法还包括使用本发明的表位肽或其变体、重组蛋白、多聚体、粒子来筛选与目标表位特异性结合的抗体。
在另一个方面，本发明还提供了包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的分离的核酸分子、载体或宿主细胞。在另一个方面，本发明提供了包含上述抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的上述抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物。本发明还涉及上述抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢 性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“HBsAg”是指，乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原主蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：ADC29595.1)。
如本文中所使用的，当提及HBsAg的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：36所示的序列来进行描述。例如，表述“HBsAg的第157-174位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：36所示的多肽的第157-174位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBsAg的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBsAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBsAg”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：36所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBsAg的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：36的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBsAg的第157-174位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：36的第157-174位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“表位”是指能够被识别并且被特定抗体特异性结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成，分别称为线性表位或构象表位。从连续氨基酸形成的表位典型地在蛋白变性时保留，而由三级折叠形成的表位典型地在蛋白变性时丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下， 可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。任选地，所述载体蛋白能够形成多聚体或自组装形成粒子。任选地，可以在表位肽与载体蛋白之间使用接头以促进二者各自的折叠。
如本文中所使用的，术语“蛋白质-蛋白质结合对”包含两种蛋白质(例如第一成员(例如第一多肽)和第二同源成员(例如第二多肽))，其在实现或促进异肽键形成的条件下相互作用以形成共价异肽键，其中术语“同源”是指在一起起作用，即在一起反应以形成异肽键的组分。因此，在实现或促进异肽键形成的条件下有效地在一起反应以形成异肽键的两种蛋白质还可称为“互补”肽连接子对。能够相互作用以形成共价异肽键的特异性结合对综述于Veggiani G,Zakeri B,Howarth M.Superglue from bacteria:unbreakable bridges for protein nanotechnology.Trends Biotechnol.2014；32(10):506-512.中，非限制性实例包括，SpyTag:SpyCatcher、SpyTag002:SpyCatcher002、SpyTag:KTag、isopeptag:pilinC、SnoopTag:SnoopCatcher等。
术语“异肽键”是指羧基或甲酰胺基与氨基之间的酰胺键，所述基团中的至少一个不衍生自蛋白质主链，或另一种观点，不是蛋白质主链的一部分。异肽键可形成于单一蛋白质内或可出现于两个肽或肽与蛋白质之间。因此，异肽键可分子内地形成于单一蛋白质内，或分子间，即形成于两个肽/蛋白质分子之间，例如两个肽连接子之间。通常，异肽键可出现于赖氨酸残基与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸残基或蛋白质或肽链的末端羧基之间，或可出现于蛋白质或肽链的α-氨基末端与天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸之间。
SpyTag:SpyCatcher系统描述于美国专利第9,547,003号和Zakeri等人.Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein,through engineering a bacterial adhesin.Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(12):E690-E697(其以全文引用的方式并入本文中)，且衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2域。衍生自CnaB2域的另一特异性结合对为SpyTag:KTag，其在SpyLigase存在下形成异肽键，可参见Fierer JO,Veggiani G,Howarth M.SpyLigase peptide-peptide ligation polymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture.Proc Natl Acad Sci U S A.2014；111(13):E1176-E1181，其以全文引用的方式并入本文中。 SpyTag002:SpyCatcher002系统描述于Keeble AH等人.Evolving Accelerated Amidation by SpyTag/SpyCatcher to Analyze Membrane Dynamics.Angew Chem Int Ed Engl.2017；56(52):16521-16525.中，其以全文引用的方式并入本文中。
SnoopTag:SnoopCatcher系统描述于Veggiani G,Nakamura T,Brenner MD,et al.Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.Proc Natl Acad Sci U S A.2016；113(5):1202-1207.中，其以全文引用的方式并入本文中。RrgA的D4Ig样域(与肺炎链球菌粘附)被分离以形成SnoopTag和SnoopCatcher。
isopeptag:pilin-C特异性结合对衍生自来自酿脓链球菌的主要菌毛蛋白蛋白Spy0128，可参见Zakeri B,Howarth M.Spontaneous intermolecular amide bond formation between side chains for irreversible peptide targeting.J Am Chem Soc.2010；132(13):4526-4527.，其以全文引用的方式并入本文中。
在本文中，术语“抗体”以最广泛的含义使用。“抗体”包括基本的四链抗体(four-chain antibody)、重链抗体、纳米抗体或单域抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性或多特异性抗体等，以及具有所需要的生物活性的抗体片段(例如抗原结合片段)。基本的四链抗体通常是指由两对多肽链组成的免疫球蛋白分子，每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受 任何特定的产生抗体的方法限制。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在典型的four-chain抗体中，在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(Camelid heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variable domain of heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”也称为“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”，两者可互换使用，其是指由抗体中单个可变结构域(例如 重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体结合了单克隆抗体与小分子药物的优势，能够透过血脑屏障，易于改造，易于开发和稳定生产，降低了生产的难度与成本。
如本文中所使用的，术语“Fc结构域”或“Fc区”意指，包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。由Fc区介导的“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc区可为任何抗体重链恒定区同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
Fc结构域既可以包括天然Fc区，也可以包括变异Fc区。天然Fc区包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列，例如天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人类IgG2Fc区；天然序列人类IgG3Fc区；及天然序列人类IgG4Fc区，以及其天然存在的变异体。变异Fc区包含因至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区可具备相比于天然Fc区改变的效应子功能(例如Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。在某些实施方案中，人源化抗体的CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。在本申请中，供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的驼源抗体。为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物的CDR区插入人源框架序列。在纳米抗体的语境下，人源化抗体可指人源化VHH，即其中一或多个骨架区已基 本上由人类骨架区替换的VHH。在一些情形中，人类免疫球蛋白的某些骨架区(FR)由相应非人类残基替换。此外，人源化VHH可包含在初始VHH或人类骨架序列中均未发现、但被包括在内以进一步改进和优化VHH或含VHH的多肽的性能的残基。
如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于表示人源化抗体中非人源氨基酸残基的数量的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过下述来进行计算：人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的非人源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germline sequence)”。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数，或者使用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能够显著降低或完全抑制目标病毒的毒力 (例如，感染细胞的能力)的抗体或其抗原结合片段。通常而言，中和抗体能够识别并结合目标病毒，并且阻止目标病毒进入/感染受试者的细胞。本发明的抗体即是中和抗体。
然而，应当理解的是，在本申请中，抗体的中和病毒的能力并不直接等同于抗体的清除病毒的能力。如本文中所使用的，“中和病毒”是指，通过抑制目标病毒进入/感染受试者的细胞的过程，从而中和目标病毒的毒力(即，显著降低或完全抑制目标病毒的毒力)。如本文中所使用的，“清除病毒”是指，机体内的目标病毒(无论其是否感染了细胞)被从机体中消除，从而机体朝向未被病毒感染之前的状态转变(例如，病毒的血清学检测结果转变为阴性)。因此，在一般情况下，中和抗体并不一定具备清除病毒的能力。然而，在本申请中，发明人出人意料地发现，本发明的抗体不仅具有中和HBV的能力，而且具有清除病毒的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而具有重大的临床价值。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的 函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。此外，氨基酸残基还可以分成通过可选物理和功能特性限定的类别。例如，含醇基残基(S和T)，脂肪族残基(I、L、V和M)，环烯基相关残基(F、H、W和Y)，疏水性残基(A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y)，带负电的残基(D和E)，极性残基(C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T)，带正电的残基(H、K和R)，小残基(A、C、D、G、N、P、S、T和V)，极小残基(A、G和S)，涉及转角形成的残基(A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T)，柔性残基(Q、T、K、S、G、P、D、E和R)。鉴定氨基酸保守置换的方 法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，HBV感染或与HBV感染相关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。在本申请中，本发明的抗体具有中和HBV的能力，从而可用于预防/阻止未患病受试者或其细胞感染HBV。此外，本发明的抗体具有清除HBV的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而可用于治疗患病受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
有益效果
本领域已知慢性乙肝患者由于体内高水平的HBsAg往往产生针对HBV的免疫耗竭(耐受)进而使感染迁延不愈，而本发明的表位肽或纳米抗体能够激活受试者(例如慢性HBV感染者，或慢性乙肝患者)重新产生针对HBV的体液免疫应答，在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，并有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，本发明的表位肽或纳米抗体适用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，并且具备针对多种基因型HBV的广谱结合活性及广谱治疗活性。由本发明的表位肽或纳米抗体介导的免疫治疗有望成为CHB病人对抗HBV病毒持续感染的新策略。
附图说明
图1显示了125s与HBsAg的结合活性。结果显示，125s与HBsAg的具有良好的结合活性。
图2显示了125s在HepaRG细胞模型的中和活性。图2A-2B中左侧“125s”是指加入待测抗体的实验组，右侧“HBV”是指将待测抗体替换为PBS的对照组，对照组反映HepaAD38细胞未经中和抗体处理时的HbeAg(图2A)或HBsAg(图2B)分泌水平。其中图2A显示了随着125s抗体浓度增加，细胞上清中HBeAg的含量有明显降低；图2B显示随着125s抗体浓度增加，细胞上清中HBsAg的含量有明显降低；提示125s具有中和活性。
图3显示了125s与9种HBV基因型(A-H；J)的HBsAg颗粒均有结合活性,提示125s具有广谱结合活性。
图4显示了125s在HBV-AAV小鼠模型中的治疗效果。其中：
图4A显示了125s在AAV-adw血清型的小鼠模型中的10mg/kg剂量单针治疗后，血清中HBsAg滴度小于100IU/ml可以维持至少7day；
图4B显示了125s在AAV-ayw血清型的小鼠模型中的10mg/kg剂量单针治疗后，血清中HBsAg滴度小于100IU/ml可以维持至少7day。HBV-AAV小鼠的治疗效果提示125s具有长效HBsAg抑制且广谱治疗活性。
图5显示了125s在HBV转基因小鼠模型中以10mg/kg剂量单针治疗后，血清中HBsAg滴度迅速降低至100IU/ml以下，并可维持7day HBsAg抑制状态，治疗后day11-day14缓慢恢复至基线水平。HBV转基因小鼠的治疗效果提示125s具有长效HBsAg抑制的活性。
图6显示了125s与变性HBsAg的结合情况。
图7显示了125s在HBsAg上的识别表位。其中图7A显示了HBsAg胞外段融合蛋白展示形式的示意图。包括了HBsAg的胞外段(Surface,简称Sur)；HBsAg胞外段N端56个氨基酸(N56)；HBsAg胞外段主要亲水区部分(MHR)；HBsAg胞外段C端18个氨基酸(Cter)；HBsAg胞外段C端36个氨基酸(Loop2-Cter)；HBsAg胞外段MHR及Cter部分(MHR-Cter)。图7B显示了125s与6种HBsAg胞外段融合蛋(Sur；N56；MHR；Cter；Loop2-Cter；MHR-Cter)的结合活性，结果显示125s与HBsAg完整的胞外段(Sur)及与HBsAg胞外段C端18个氨基酸(Cter)有明显的结合反应活性，提示125s的主要结合位点位于HBsAg的C端。图7C显示了10种(A-J)HBV基因型的Cter区域(aa157-174)的保守性分析。图7D显示了125s与158-174位丙氨酸单点突变的HBsAg胞外段融合蛋白的结合活性。结果显示，当158位，160位，163-165位，171位发生单点突变后，125s与HBsAg胞外段融合蛋白的结合活性明显降低，提示125s的主要结合表位与158位，160位，163-165位，171位相关。
图8显示了125s的人源化抗体(h125s-26)分子及亲本125s纳米抗体与HBsAg的结合活性相当，提示125s的人源化抗体(h125s-26)分子人源化改造成功。
图9显示了人源化纳米抗体分子h125s-26单针注射后，小鼠血清中HBsAg实现了快速清除，提示125s纳米抗体人源化分子h125s-26具有体内治疗活性。
图10显示了Cter-Fc融合蛋白具有免疫原性。
图11显示了纯化后的spytag-鼠铁蛋白表现出了大小均一，结构、形态稳定的纳米颗粒结构。
图12显示了Spytag-鼠铁蛋白和Spycatcher-Cter可组装形成颗粒。 序列信息
本申请涉及的序列的描述提供于下表中。
表1：序列信息


具体实施方案
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应被视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：Anti-HBsAg的纳米抗体的制备
1.1免疫原的准备
免疫原为CHO表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，基因型B型，购自北京万泰生物药物股份有限公司)。取重组蛋白稀释至0.4mg/ml，与弗氏佐剂等体积混合，使其完全乳化。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂。
1.2纳米抗体噬菌体文库的构建及筛选
使用上述免疫原对健康成年羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫结束后抽取羊驼外周血，分离total RNA，经反转录和PCR扩增出VHH基因，再将VHH基因克隆至噬菌体 载体Pcgmt(实验室保留载体)上，转化至ER2738宿主细胞(购自Lucigen公司)中构建成噬菌体展示文库。随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，从噬菌体克隆中随机挑选96颗进行ELISA鉴定，其中阳性单克隆125s在噬菌体水平与HBsAg具有良好的结合能力。进一步，使用kabat等人描述的方法，确定了125s的序列。纳米抗体125s的互补决定区CDR1-CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:1-3所示，骨架区FR1-FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:4-7所示，纳米抗体125s的VHH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
1.3抗HBsAg的纳米抗体的真核表达
将纳米抗体125s的VHH结构域分别连接至人IgG1Fc片段(SEQ ID NO:14)或鼠IgG2Fc片段(SEQ ID NO:15)的N端，从而分别获得纳米抗体-Fc融合蛋白125shIgG1和125smIgG2。具体而言，将纳米抗体125s的VHH结构域基因克隆至ptt5hIgG1载体(包含SEQ ID NO:14所示的人Fc区)或125smIgG2载体(包含SEQ ID NO:15所示的鼠Fc区)上，然后将重组质粒与转染试剂PEI 1:2混合后，转染至HEK293F细胞；37℃，5％
CO2摇床培养箱中培养6天；随后收集细胞上清，采用Protein A进行纯化，并采用紫外分光测取浓度分装至1.5mL管中，存放于-80℃备用。
实施例2：纳米抗体125s与HBsAg的反应活性
将125shIgG1以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始3倍梯度稀释，共稀释12个梯度。以人源化抗体162(其详细描述于中国专利申请CN201610879693.5中)作为阳性对照，以无关抗体作为阴性对照。在HBsAg板中每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗人(GAH)IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的ELISA板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。结果显示125shIgG1具有HBsAg特异的结合活性(图1)。
实施例3:纳米抗体125s的中和活性测定
HepaAD38细胞是本实验室制备的、能够可控表达HBV的细胞。当需要扩增HepaAD38细胞而不表达HBV时，可在培养基中加入四环素，以抑制HBV的转录复 制。当需要表达HBV时，可使用不含四环素的培养基进行培养，以启动HBV的转录复制。将源于HepaAD38细胞的培养上清与分化的HepaRG细胞接触，经测定其培养上清含有HBV病毒，能够有效感染分化的HepaRG细胞。利用上述HepaRG/HBV感染模型，评估纳米抗体125s中和/阻断HBV感染(100MOI HBV感染滴度)的能力。
在用于感染细胞的病毒溶液中预先加入指定浓度的125shIgG1，然后将该病毒溶液用于感染HepaRG细胞。感染后第7天，取细胞培养上清，测定其中的HBeAg水平和HBsAg水平(HBV感染成功的重要指标)。检测方法如下：
将anti-HBeAg(或anti-HBsAg)单克隆抗体稀释于20mM PB7.4中，终浓度为2μg/ml。向96孔微孔板中加入稀释的anti-HBeAg(或anti-HBsAg)单克隆抗体，并于4℃孵育过夜。用PBST洗涤96孔微孔板1次，甩干。然后每孔加入200μL封闭液。加入100μl/孔的待检样品，并在37℃温育60min。用PBST洗涤96孔微孔板5次。加入辣根过氧化物酶标记的anti-HBeAg(或anti-HBsAg)抗体，并在37℃温育30min。上述过程中使用的试剂购自北京万泰生物药业股份有限公司。用PBST洗涤96微孔板5次。加入化学发光试剂显色。利用化学发光酶标仪读取数值。
实验结果示于图2A-2B中，显示125s具有良好的病毒中和活性。
实施例4:纳米125s与9种HBV基因型HBsAg颗粒的结合活性测定
使用实验室制备的A-H、J共9种HBV基因型HBsAg颗粒分别与纳米抗体125s进行结合ELISA检测。HBV的基因型可参见NCBI生物分类数据库(Taxonomy)，登录号为txid10407。具体检测方法如下：
分别将9种基因亚型的HBsAg颗粒以20mM PBS缓冲液进行稀释，终浓度为2μg/mL，向Elisa板中每孔加入100μL，置于37℃温箱反应60min。将Elisa板用PBST洗液洗涤1遍后，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h。将Elisa板用PBST洗液洗涤1遍后，加入稀释至终浓度0.1μg/mL的125s纳米抗体，每孔100uL，置于37℃温箱反应1h。将Elisa板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗人IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将Elisa板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的ELISA板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。结果显示125shIgG1具有广谱HBsAg特异的结合活性(图3)。
实施例5：纳米抗体125s在三种血清型HBV-AAV小鼠中的治疗效果
5.1 AAV-HBV小鼠建模方法
HBV-AAV病毒，包括HBV-adw血清型(HBV-B型，购自广州派真生物公司)；HBV-ayw血清型(HBV-D基因型，购自广州派真生物技术有限公司)。将上述病毒分别以10E11GC(基因组拷贝)/只的剂量以尾静脉注射的方式单针注入C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)体内，建模时长为30天。
5.2小鼠血清HBsAg检测方法
(1)反应板的制备：将小鼠单克隆抗体HBs-45E9(北京万泰生物药物股份有限公司)用20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH7.4)稀释到2μg/mL，在化学发光板中每孔添加100μL的包被液，并在2-8℃下包被16-24h，随后再37℃包被2h，用PBST洗涤液洗涤平板一次，甩干。洗涤后，在各孔中加入200μL的封闭液，并在37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板放入干燥间干燥，于2-8℃保存备用。
(2)样品稀释：将采集的小鼠血清用含20％NBS(新生牛血清)的PBS溶液，稀释成1:500用于后续的定量检测。
(3)样品变性处理：取15μL经上述稀释的血清样品与7.5μL变性缓冲液(15％SDS，溶于20mM PB7.4)充分混匀，并在37℃反应1h。随后，加入90μL的中和缓冲液(4％CHAPS，溶于20mMPB7.4)，充分混匀。
(4)样品反应：在反应板中加入100μL经上述变性处理的血清样品，37℃反应1h。随后用PBST洗涤反应板5次，甩干。
(5)酶标记物反应：向化学发光板中按100μL/孔，加入HBs-A6A7-HRP(北京万泰生物药物股份有限公司)反应液,并在37℃反应1h。随后用PBST洗涤平板5次，甩干。
(6)发光反应和测量：向化学发光板中加入发光液(100μL/孔)，并进行光强检测。
(7)小鼠血清样品中的HBsAg浓度的计算：使用标准品进行平行实验，根据标准品的测定结果绘制标准曲线。然后，将小鼠血清样品的光强测量值代入标准曲线，计算出待检血清样品中的HBsAg浓度。
5.3 AAV-HBV小鼠血清HBsAg检测
在AAV-HBV小鼠建模后第30天，通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠血，随后检测小鼠血清中HBsAg水平变化。小鼠按HBsAg滴度分层随机分组，每组5只。将125shIgG1以10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式分别注入HBV-adw血清型、adr 血清型、ayw血清型小鼠体内，并设置注射PBS的空白对照组。连续检测12天，通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠治疗后Day0，Day1，Day4，Day7，Day11的血，监测小鼠血清中的HBsAg水平。结果显示(图4A-4B)，相比于空白对照组，125shIgG1在HBV-adw血清型和HBV-ayw血清型小鼠中能够将HBsAg在100IU/ml的血清浓度范围维持了1周以上，展现了持久的治疗效果。上述结果说明125shIgG1具有广谱且持久的治疗效果。
实施例6：纳米抗体125s在HBV转基因小鼠中的病毒清除能力
本实施例考察125shIgG1在HBV转基因小鼠(赠自台湾大学陈培哲教授)中的病毒清除能力。该HBV转基因小鼠是本领域公知的模拟持续性HBV感染的模型小鼠，广泛应用于HBV相关基础研究或药物研发领域。该模型小鼠具有稳定的HBV复制水平、转录水平和病毒蛋白表达水平，并且其病毒学水平与免疫清除期和HBeAg阴性期的患者的血清水平相当。HBV转基因小鼠模型具有完好的免疫系统和对HBV的免疫耐受性，在一定程度上与HBV感染者相似。具体而言，将125shIgG1以10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式注入HBV转基因小鼠体内，每组5只HBV转基因小鼠。连续检测2周，通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠治疗后Day0，Day2，Day3，Day5，Day7,Day9,Day11,Day14的血。按照实施例5.2中的方法监测小鼠血清中的HBsAg水平。结果显示(图5)，单针注射后，小鼠体内HBsAg在100IU/ml的血清浓度范围维持了1周，14天后HBV转基因小鼠血清中的HBsAg返回至基线水平，125s单针治疗即可实现持久的病毒清除效果。
实施例7：纳米抗体125s识别的表位的鉴定
7.1纳米抗体125s与变性HBsAg的反应活性
将HBsAg进行变性处理：SDS 8mmol/L加入HBsAg样品，100℃金属浴煮沸10min。
反应板制备：分别将变性的HBsAg与正常的HBsAg蛋白用50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度分别为2μg/mL；在96孔ELISA板每孔中加入100μL，2～8℃包被16～24h后再37℃包被2h；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM  Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
抗体125s与变性HBsAg蛋白的反应性的Elisa检测：
将125shIgG1以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始3倍梯度稀释，共稀释12个梯度。以人源化抗体162(其详细描述于中国专利申请CN201610879693.5中)作为阳性对照。在HBsAg板中每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗人(GAH)IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的ELISA板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。
结果如图6所示，结果显示125s可以与正常HBsAg结合，但不与变性的HBsAg结合。
7.2构建pTT5hIgG1-HBsAg克隆
将HBV的B亚型病毒表面HBsAg的不同长度胞外段的核苷酸序列构建到pTT5hIgG1载体上，构建了一系列融合蛋白，在所述融合蛋白中，所述胞外段序列通过接头(G4S)5连接至hIgG1-Fc的N端。将表2中所列的6段不同长度的HBsAg胞外段的基因序列分别构建到pTT5hIgG1载体上，从而获得了6个FC融合蛋白(pTT5hIgG1-S1,S2,S3,S4,S5,S6)。
表2：用pTT5hIgG1展示的HBsAg胞外段
名称 胞外段位置 SEQ ID NO:
S1(Surface) HBsAg-aa101-aa174 16
S2(N56) HBsAg-aa101-aa156 17
S3(MHR) HBsAg-aa118-aa156 18
S4(Cter) HBsAg-aa157-aa174 19
S5(Loop2-Cter) HBsAg-aa139-aa174 20
S6(MHR-Cter) HBsAg-aa118-aa174 21
7.3表达并纯化pTT5hIgG1-S融合蛋白
利用293F细胞表达pTT5hIgG1-S1,S2,S3,S4,S5,S6融合蛋白。准备活率高于95％的293F细胞，以4×106/mL的密度取200ml接种于1L细胞培养瓶中。取0.6mg质粒,与1.2mgPEI混合，剧烈震荡8s后静置8min，将混合物加入400ml细胞中。4h后补充200mL Freestyle培养基，置于5％CO2培养箱37℃表达7天。收集细胞上清， 10000rpm离心30min。取上清并进行后续的纯化，纯化方法如实施例1所述。
7.4评价抗体125s与6种融合蛋白的反应性
本实验以E6F6和129G1作为内参抗体，E6F6(识别表位在sa)和129G1(识别表位在Se)可参见Zhang TY等.Prolonged suppression of HBV in mice by a novel antibody that targets a unique epitope on hepatitis B surface antigen.Gut.2016 Apr；65(4):658-71.doi:10.1136/gutjnl-2014-308964。
反应板的制备：分别将HBsAg胞外段的6种融合蛋白HBsAg用50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为1μg/mL在96孔ELISA板每孔中加入100μL，2～8℃包被16～24h后再37℃包被2h；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
抗体125s与各融合蛋白的反应性的Elisa检测：
将125smIgG2以20mM PBS缓冲液稀释至1ug/ml，内参抗体E6F6和129G1处理方式同125smIgG2。取已包被pTT5hIgG1-S1,S2,S3,S4,S5,S6融合蛋白的Elisa板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将酶标板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。125s与pTT5hIgG1-S1,S2,S3,S4,S5,S6融合蛋白的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。
抗体125s所识别的表位的分析：
Elisa检测结果显示(图7B)，125smIgG2与展示胞外段S1、S4、S5、S6的融合蛋白具有良好反应性，而与展示胞外段S2、S3的融合蛋白反应弱。这些胞外段的序列分析显示，胞外段S1、S4、S5、S6的共同特征是包含不完整的HBsAg aa157-174；胞外段S2、S3的共同特征是包含不完整的HBsAg aa118-156，但不包含aa157-174。Elisa结果还显示，融合蛋白pTT5hIgG1-S1、pTT5hIgG1-S4与抗体的反应活性高于其他融合蛋白，融合蛋白pTT5hIgG1-S5、pTT5hIgG1-S6与抗体的反应活性高于pTT5hIgG1-S2、pTT5hIgG1-S3。因此，可确定125s可以识别表位为aa157-174，即 AFAKYLWEWASVRFSWLS。此外，由于S4的序列比S1更短，因此，S4被认为是优选的核心表位。
7.5评价抗体125s与不同基因型Cter区域(aa157-174)的反应性
10种(A-J)HBV基因型的Cter区域(aa157-174)的保守性分析如图7C所示，红框为aa162-167，其在不同基因型中100％保守，提示其可能包含纳米抗体125s主要的核心表位。
实施例8：抗体125s与胞外段S1氨基酸突变的敏感性分析
8.1构建pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变克隆
由于125s与pTT5hIgG1-S1的结合活性良好，因此对pTT5hIgG1-S1进行了氨基酸单点突变，共制备了14种突变体融合蛋白，这14种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NOs:22-35所示。
8.2表达并纯化pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白
利用293F细胞表达上述单点突变融合蛋白。置于5％CO2培养箱37℃表达7天。收集细胞上清并纯化。
8.3 125s与pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白的反应性
8.3.1反应板的制备
按照实施案例7.3.1节中的方法制备反应板，包被抗原为pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白。
8.3.2 125s与pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白的Elisa检测
将125smIgG2以20mM PBS缓冲液稀释至1ug/mL。取已包被pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白的Elisa板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将酶标板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。125s与pTT5hIgG1-S1氨基酸单点突变融合蛋白的反应性判定：根据反应后的读值进行判定，并对读值进行归一化(即“125s与表位的响应值”与“E6F6与表位的响应值”的比值)，其中已知E6F6与所展示的表位的反应性只与表位包被浓度有关，因为E6F6的表位不在Cter上，所以158-174进行突变不会影响E6F6的反应 性。
结果如图7D所示，当163-165位发生单点突变后，125s与HBsAg胞外段融合蛋白的结合活性明显降低，表明其为核心表位；当158位，160位，171位发生单点突变后，125s与HBsAg胞外段融合蛋白的结合活性有一定程度下降；第161、162、167-170、172-174位突变并不会明显影响结合活性，表明其不是核心结合位点。
实施例9：125s人源化抗体的制备
9.1纳米抗体125s的人源化设计
根据CDR移植的方法进行驼源纳米抗体125s的人源化设计。通过IMGT搜索基因数据库，首先找出与羊驼抗体125s VHH区同源性最高的人胚系基因可变区序列。经同源性分析，确定IGHV3-23*04胚系基因序列作为人源化抗体的重链改造模板。同时由于胚系基因不包含改造部分所需的FR4，因此FR4部分需要单独比对，最终确定IGHJ5*02胚系基因序列作为人源化抗体重链FR4的改造模板。将羊驼抗体125s VHH的CDR区移植到人源模板的FR框架上，同时将羊驼抗体与人胚系基因的FR区进行序列比对，对差异氨基酸进行选择性的回复突变，最终设计出1条人源化重链，获得1株人源化抗体，命名为h125s-26，其VHH序列如SEQ ID NO:13所示。
9.2人源化抗体的制备
将人源化抗体的可变区序列连接至人IgG1Fc片段(SEQ ID NO:14)的N端，从而获得纳米抗体-Fc融合蛋白h125s-26-hIgG1。具体而言，将人源化抗体的可变区序列构建到pTT5-hIgG1载体(包含SEQ ID NO:14所示的人Fc区)。本实验采用基因合成的方式，合成后测序分析(上海生物工程股份有限公司)。利用无内毒素质粒大提试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)大量提取基因合成的质粒。利用293F细胞表达125s人源化抗体。取上清并进行后续的纯化，纯化方法如实施例1.3所述。
实施例10：125s人源化抗体对HBsAg的ELISA结合活性
取实施例9中获得的125s人源化抗体h125s-26-hIgG1，以SD-1缓冲液从20ug/mL为起始浓度开始梯度稀释，共稀释8个梯度。ELISA检测方法同实施例2所述。结果显示人源化抗体h125s-26-hIgG1和125s-hIgG1结合HBsAg蛋白的EC50分别为27.77ng/mL和25.49ng/mL。结果如图8所示，人源化h125s-26-hIgG1维持了与125s-hFc相当的对HBsAg的结合活性。
实施例11：125s人源化抗体在HBV-AAV小鼠中的病毒清除能力
将h125s-26-hIgG1和125s-hIgG1分别以5mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式注入HBV-AAV小鼠(HBV-adw血清型)体内。每组5只HBV转基因小鼠。连续检测17天，通过眼眶后静脉丛取血的方式采集小鼠治疗后Day0，2h，Day1，Day3，Day5，Day7，Day10，Day12，Day14，Day17的血。按照实施例5.2中的方法监测小鼠血清中的HBsAg水平。结果如图9所示，单针注射后，h125s-26-hIgG1和对照抗体125s-hIgG1均具有较优的HBsAg清除效果。两株抗体前10天治疗效果相当，10天后125s-hFc治疗的小鼠HBsAg滴度快速反弹，在第14天恢复至基线水平。相比之下，人源化抗体h125s-26治疗组小鼠HBsAg滴度反弹缓慢，在第17天HBsAg滴度仍未恢复至基线水平。提示人源化分子h125s-26在AAV/HBV小鼠模型中具有更优的抗原清除能力和持久的抗原抑制效果，人源化改造成功。
实施例12：表位肽-Fc融合蛋白的免疫原性评价
本实施例考察包含S4(aa157-aa174)的HBsAg胞外段系列多肽与人IgG1-Fc区的融合蛋白在BALB/C小鼠中的免疫原性。简言之，分别制备上述系列多肽与人IgG1-Fc区(SEQ ID NO:14)的重组蛋白，使用该重组蛋白免疫BALB/C小鼠，并制作杂交瘤细胞。之后检测杂交瘤细胞(1B2,1H2,1F12,2B6,7C4,9G1,10D3)分泌上清中的Anti-HBs抗体滴度。结果如图10所示，在用重组蛋白进行免疫治疗的组中，小鼠血清可检出抗HBsAg抗体。提示HBsAg胞外段的Cter区段具有免疫原性。
实施例13：SpyTag-鼠铁蛋白颗粒和SpyCatcher-Cter蛋白的构建和表达
B11-SpyTag-铁蛋白表达载体的构建根据鼠铁蛋白的序列(NCBI蛋白名称：NP_034369.1)并对其核酸序列进行HEK293宿主密码子优化，在SpyTag片段和铁蛋白片段之间加入3个G4S连接。类似的，在B11原核表达载体上插入了SpyCatcher片段和Cter片段(SEQ ID NO:19)，两个片段用3个G4S连接。基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成，并插入His tag用于纯化，最终得到基因B11-SpyTag-鼠铁蛋白-his和B11-SpyCatcher-Cter-his。其中，SpyTag-鼠铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，SpyCatcher-Cter的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
B11-SpyTag-鼠铁蛋白的表达与纯化：
将基因转化至BL21感受态后，使用IPTG 37℃诱导表达。超声破碎细胞后，收集细胞上清并70℃水浴热处理10min，经硫铵沉淀处理后，使用凝胶色谱柱进行纯化，样品置于4℃保存。透射电镜结果(图11)表示纯化后SpyTag-鼠铁蛋白为大小均一，结构、形态稳定的纳米颗粒结构，直径在20nm左右。
B11-SpyCatcher-Cter的表达与纯化：
将基因转化至BL21感受态后，使用IPTG 37℃诱导表达。超声破碎菌体取上清，经过Ni-Agarose自装柱，用咪唑洗脱SpyCatcher-Cter蛋白。
实施例14：SpyTag-鼠铁蛋白和SpyCatcher-Cter的组装
将SpyTag-铁蛋白和SpyCatcher-Cter按摩尔比例1:1混合，4℃上下颠倒混匀过夜。经过SpyTag-铁蛋白和SC-Cter的混合，浓缩管的过滤和Superose6Increase凝胶过滤柱的纯化，得到高纯度的铁蛋白-Cter纳米疫苗。透射电镜结果(图12)显示铁蛋白-Cter纳米颗粒的表面呈现突起的结构，表明SpyTag-鼠铁蛋白和SpyCatcher-Cter组装成功，显示了其作为疫苗的潜力。
尽管上文中详细描述了本发明的某些具体实施方案，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对其中的细节进行各种修改和替换而不偏离本发明的精神和主旨，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的范围仅由所附的权利要求及其任何等同方案限定。

Claims (38)

  1. 特异性结合HBsAg的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：1或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：2与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3。
  2. 权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
  3. 权利要求1所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化的；
    例如，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变；
    例如，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NOs:9-12所示的FR1～FR4。
  4. 权利要求3所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其中所述纳米抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：13所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失 或添加)的序列。
  5. 特异性结合HBsAg的多肽构建体，其包含权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域；
    例如，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端(例如C端)；
    例如，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)；
    例如，所述免疫球蛋白Fc结构域是人或鼠免疫球蛋白Fc结构域，例如人或鼠IgG的Fc结构域(例如人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)；
    例如，所述免疫球蛋白Fc结构域包含包含SEQ ID NO：14或15所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
  6. 分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的多肽构建体。
  7. 载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
  8. 宿主细胞，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子或权利要求7所述的载体。
  9. 制备权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的多肽构建体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体。
  10. 药物组合物，其含有权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的多肽构建体、权利要求6所述的分离的核酸分子、权利要求7所述的 载体或权利要求8所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
  11. 权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的多肽构建体、权利要求6所述的分离的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主细胞、或权利要求10所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答。
  12. 一种方法，其用于预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，和/或用于激活受试者(例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者)针对HBV的体液免疫应答，其中，所述方法包括：向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的多肽构建体、权利要求6所述的分离的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主细胞、或权利要求10所述的药物组合物。
  13. 缀合物，其包含权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的多肽构建体，以及可检测的标记；
    例如，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
  14. 权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的多肽构建体、或权利要求13所述的缀合物，在制备用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平或用于诊断受试者是否感染了HBV的检测试剂中的用途。
  15. 分离的表位肽或其变体，其中，所述表位肽或其变体包含位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的表位，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨 基酸残基；所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如，1个，2个，3个，4个，或5个)氨基酸残基的突变(例如置换、添加或缺失)，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基。
  16. 权利要求15所述的表位肽或其变体，其中，所述表位是构象表位，其由位于HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基内的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个非连续氨基酸残基组成，并且至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-165位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基；
    例如，所述表位至少包含HBsAg蛋白的第163-166位氨基酸残基以及第158位、第160位和第171位氨基酸残基。
  17. 权利要求15或16所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽由HBsAg蛋白的至少5个(例如，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个)和/或至多80个(例如，至多75个，至多70个，至多65个，至多60个，至多55个，至多50个，至多45个，至多40个，至多35个，至多30个，至多25个，至多20个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述表位；
    例如，所述表位肽由HBsAg蛋白的5-80个(例如，5-75个，5-70个，5-65个，5-60个，5-55个，5-50个，5-45个，5-40个，5-35个，5-30个，5-25个，5-20个；例如5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，23个，24个，25个，30个，35个，40个，45个，50个，55个，60个，65个，70个，74个，75个或80个)连续氨基酸残基组成，并且包含所述 表位。
  18. 权利要求15-17任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽至少包含HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基；
    例如，所述HBsAg蛋白的第157-174位氨基酸残基如SEQ ID NOs:19、38-44任一项所示。
  19. 权利要求15-18任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置163-165的位置中不包含突变；
    例如，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置163-166的位置中不包含突变；
    例如，所述变体在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置162-167的位置中不包含突变；
    例如，所述变体进一步在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置157的位置中不包含突变；
    例如，所述变体进一步在对应于HBsAg蛋白的氨基酸位置171的位置中不包含突变；
    例如，所述变体进一步在相应于HBsAg蛋白的如下位置的氨基酸位置中的一处或多处(例如1处，2处，或3处)不包含突变：158、160。
  20. 权利要求15-19任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述变体在相应于HBsAg蛋白的如下位置的氨基酸位置中的一处或多处(例如1处，2处，3处，4处或5处)包含突变：161、162、167、168、169、170、172、173、174；
    例如，所述突变是氨基酸置换，例如保守置换；
    例如，所述氨基酸置换包括用丙氨酸置换所述位置的氨基酸。
  21. 权利要求15-20任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽或其变体至少包含如下所示的氨基酸序列：AX1X2X3X4X5WEWAX6X7X8X9SX10X11X12(SEQ ID NO:51)；其中，
    X1(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置158)为F或L；
    X2(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置159)为A或G；
    X3(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置160)为K或R；
    X4(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置161)为任意天然氨基酸(例如Y、F或A)；
    X5(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置162)为任意天然氨基酸(例如L或A)；
    X6(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置167)为任意天然氨基酸(例如S或A)；
    X7(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置168)为任意天然氨基酸(例如V或A)；
    X8(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置169)为任意天然氨基酸(例如R、H或A)；
    X9(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置170)为任意天然氨基酸(例如F或A)；
    X10(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置172)为任意天然氨基酸(例如W或A)；
    X11(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置173)为任意天然氨基酸(例如L或A)；
    X12(相应于HBsAg蛋白的氨基酸位置174)为任意天然氨基酸(例如S或A)；
    例如，X5为L，X6为S；例如，X9为F，X10为W，X11为L，X12为S；
    例如，所述表位肽或其变体至少包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NOs:19、38-44任一项所示的序列。
  22. 权利要求15-21任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述HBsAg蛋白包含如SEQ ID NO:36所示的序列或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
  23. 权利要求15-22任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽或其变体包含SEQ ID NOs:16、19、22-35、38-44任一项所示的序列或由其组成。
  24. 重组蛋白，其包含权利要求15-23任一项所述的分离的表位肽或其变体，以及载体蛋白，并且所述重组蛋白不是天然存在的蛋白或其片段；
    例如，所述表位肽或其变体任选地通过接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)与载体蛋白相连接。
  25. 权利要求24所述的重组蛋白，其中，所述载体蛋白选自免疫球蛋白Fc结构域，例如IgG Fc结构域(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域)；
    例如，所述表位肽或其变体任选地通过接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接至免疫球蛋白Fc结构域的N末端 或C末端(例如N末端)；
    例如，所述免疫球蛋白Fc结构域包含如SEQ ID NO:14所示的序列。
  26. 权利要求24所述的重组蛋白，其中，所述载体蛋白选自能够自组装形成纳米颗粒的蛋白；
    例如，所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白是铁蛋白(ferritin)，例如鼠铁蛋白；
    例如，所述表位肽或其变体通过肽键或异肽键连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)。
  27. 权利要求26所述的重组蛋白，其中，所述表位肽或其变体通过异肽键连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)；
    例如，所述异肽键由蛋白质-蛋白质结合对形成；
    例如，所述蛋白质-蛋白质结合对由第一成员(例如第一肽标签)和第二成员(例如第二肽标签)组成，其中所述第一成员和第二成员由异肽键结合，并且，所述第一成员任选地通过第一接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接于所述表位肽或其变体的N末端或C末端以形成第一蛋白，所述第二成员任选地通过第二接头(例如刚性或柔性接头，如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接于所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N末端或C末端(例如N末端)以形成第二蛋白；
    例如，所述第一蛋白和/或第二蛋白可进一步(例如在其N末端或C末端)包含蛋白标签；
    例如，所述蛋白质-蛋白质结合对选自：(i)SpyTag:SpyCatcher对，(ii)SpyTag:KTag对，(iii)Isopeptag:pilin-C对，(iv)SnoopTag或SnoopTagJr:SnoopCatcher对，(v)SpyTag002:SpyCatcher002对，(vi)RrgATag、RrgATag2或DogTag:RrgACatcher对，(vii)IsopepTag-N:Pilin-N对，(viii)PsCsTag:PsCsCatcher对；
    例如，所述蛋白质-蛋白质结合对是SpyTag:SpyCatcher对；例如，所述SpyTag包含如SEQ ID NO:46所示的序列；例如，所述SpyCatcher包含如SEQ ID NO:47或48所示的序列。
  28. 权利要求27所述的重组蛋白，其由第一蛋白和第二蛋白通过异肽键连接形成，其中：
    所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及SpyTag:SpyCatcher对的第一成员，所述第一成员任选地通过第一接头与所述表位肽或其变体连接(例如连接至所述表位肽或其变体的N端或C端)；
    所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及SpyTag:SpyCatcher对的第二成员，所述第二成员任选地通过第二接头与所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白连接(例如连接至所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白的N端)；
    例如，所述第一蛋白包含所述表位肽或其变体以及SpyCatcher或其活性片段(例如N端截短体)，所述第二蛋白包含所述能够自组装形成纳米颗粒的蛋白以及SpyTag；
    例如，所述第一蛋白包含SEQ ID NO:49所示的序列，所述第二蛋白包含SEQ ID NO:50所示的序列。
  29. 分离的核酸分子，其包含编码权利要求15-23任一项所述的表位肽或其变体，或权利要求24-28任一项所述的重组蛋白的核苷酸序列。
  30. 载体，其包含权利要求29所述的分离的核酸分子。
  31. 宿主细胞，其包含权利要求29的分离的核酸分子或权利要求30的载体。
  32. 制备权利要求15-23任一项的表位肽或其变体或者权利要求24-28任一项的重组蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下培养权利要求31的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述表位肽或其变体或者重组蛋白。
  33. 包含多个单体的多聚体，其中，各单体各自独立地选自权利要求24-28任一项所述的重组蛋白；
    例如，所述多聚体是二聚体、三聚体或四聚体；
    例如，所述各单体彼此相同；
    例如，所述各单体彼此相同，并且选自权利要求25所述的重组蛋白。
  34. 粒子(particle)，在其表面上展示权利要求15-23任一项所述的分离的表位肽或其变体；
    例如，所述粒子是纳米粒子，病毒样颗粒(VLP)或核心样颗粒(CLP)；
    例如，所述粒子包含权利要求24-28任一项所述的重组蛋白或权利要求33所述的多聚体，或由其组成。
  35. 药物组合物，其包含权利要求15-23任一项的表位肽或其变体、权利要求24-28任一项的重组蛋白、权利要求29的分离的核酸分子、权利要求30的载体、权利要求31所述的宿主细胞、权利要求33所述的多聚体或权利要求34所述的粒子；
    例如，所述药物组合物是疫苗，例如蛋白疫苗或核酸疫苗；
    例如，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如佐剂)。
  36. 权利要求15-23任一项的表位肽或其变体、权利要求24-28任一项的重组蛋白、权利要求29的分离的核酸分子、权利要求30的载体、权利要求31所述的宿主细胞、权利要求33所述的多聚体、权利要求34所述的粒子、或权利要求35所述的药物组合物在制备制剂中的用途，所述制剂用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)、和/或预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)；
    例如，所述制剂是疫苗，例如蛋白疫苗或核酸疫苗；
    例如，所述受试者是未感染HBV的受试者或已感染HBV的受试者，例如慢性HBV感染者或慢性乙肝患者。
  37. 用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平、在受试者(例如人)中诱导针对HBV的免疫应答(例如体液免疫应答)、和/或预防和/或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的方法，其中，所述方法包括：向有此需要的受试者施用有效量的权利要求15-23任一项的表位肽或其变体、权利要求24-28任一项的重组蛋白、权利要求29的分离的核酸分子、权利要求30的载体、权利要求31所述的宿主细胞、权利要求33所述的多聚体、权利要求34所述的粒子、或权利要求35所述的药物组合物。
  38. 抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合权利要求15-23任一项所述的表位肽或其变体或其所包含的表位、权利要求24-28任一项的重组蛋白、权利要求33所述的多聚体或权利要求34所述的粒子；
    例如，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、纳米抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体；
    例如，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1-4任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段竞争性结合HBsAg蛋白。
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