CN101606066A

CN101606066A - 乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法

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Publication number: CN101606066A
Application number: CNA2007800490795A
Authority: CN
Inventors: 松原直子; 菅又泰博; 草野修; 白田典子
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Current assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2009-12-16

Abstract

本发明的课题涉及对于在以往的HBs抗原分析方法中测定值低的检样和假阴性的检样可以更准确地测定HBs抗原的量。本发明的HBs抗原的分析方法中，使用与含有乙型肝炎病毒表面抗原的26～80号氨基酸残基的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针、和与含有98～156号氨基酸残基的第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，使用与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法、以及与乙型肝炎病毒表面抗原结合的单克隆抗体。根据本发明，使用与乙型肝炎病毒表面抗原(以下也称为HBs抗原)的第1膜内区肽结合的探针、以及与第2膜外区肽结合的探针、特别是单克隆抗体，测定HBs抗原，由此可准确地分析被检试样(以下也称为检样)中的HBs抗原。

背景技术

输血中使用的血液经常成为输血后感染的原因。乙型肝炎病毒(以下称为HBV)是输血后肝炎的病因病毒，通过手术时的输血等而被感染。因此，通过输血用血液的筛选来诊断血液有否感染HBV是极为重要的。诊断该HBV的感染的方法可广泛使用对HBs抗原进行检测和定量的HBs抗原的分析方法。

HBs抗原是具有感染性的HBV颗粒表面的主要构成外膜蛋白，含在包被含有HBV-DNA的核心颗粒的、来自肝细胞的脂质双层膜中。HBV感染者的血液中也存在没有核心颗粒、含有HBs抗原的不具感染性的小球形颗粒或管状颗粒。小球形颗粒最大量存在于血液中，相对于1～数个HBV颗粒，可以以约1000个的比例观察到。目前市售的HBs抗原检测试剂主要是检测在该小球形颗粒形态中的HBs抗原。

HBs抗原是由全长226个氨基酸残基形成的、4次贯穿脂质双层膜的膜蛋白。HBs抗原的跨膜结构模型尚未完全得到解析，Howard等人认为：HBs抗原由下述的区形成，即HBs抗原的N末端一侧的含有1～11号氨基酸残基的脂质双层的第1膜外(ER腔一侧)区、含有12～28号氨基酸残基的贯穿脂质双层膜的疏水性第1跨膜区、含有29～80号氨基酸残基的脂质双层的第1膜内区、含有81～97号氨基酸残基的疏水性第2跨膜区、含有98～156号氨基酸残基的亲水性第2膜外(ER腔)区、以及第157号以后的疏水性第3跨膜区、第2膜内区、第4跨膜区和第3膜外(ER腔)区(非专利文献1：图1)。

以往的HBs抗原的分析方法通常是使用与HBs抗原的共同抗原决定簇a结合的抗体的方法。共同抗原决定簇a位于存在于HBs抗原的第2膜外(ER腔)区、即病毒颗粒表面的第98号～第156号氨基酸残基中含有110～156号氨基酸残基的肽上。该共同抗原决定簇a含有复杂的高级结构，并且至少存在四个表位(非专利文献2)。

另一方面，使用与上述抗原决定簇a结合的抗体的HBs抗原分析方法无法检测在HBs抗原的a区具有氨基酸变异的HBV。因此，最近开发了使用与含有26～80号氨基酸残基的脂质双层的第1膜内区的肽结合的抗体的HBs抗原的分析方法(专利文献1)。

专利文献1：国际公开第2006/033368号小册子

非专利文献1：Howard等人.，“Viral Hepatitis and Liver Disease(ed byZuckerman AJ，Alan R)”(美国)Liss Inc，New York，1988年，1094～1101页

非专利文献2：冈本宏明“日本临床，分子肝炎病毒学基础·临床·预防下卷甲、乙、丁、戊型肝炎病毒篇”，1995年10月26日出版，212～222页

发明内容

发明所要解决的课题

在HBV急性感染患者中，在感染初期，HBs抗原为阳性，之后HBs抗体转为阳性，HBs抗原转为阴性。患者血液中的HBs抗体为阳性时，通过使用上述与共同抗原决定簇a结合的抗体的方法对HBs抗原进行分析时，明确了：患者的HBs抗体抑制了分析方法中使用的抗体与HBs抗原的结合，测定值降低。另外，使用与含有26～80号氨基酸残基的脂质双层的第1膜内区的肽结合的抗体进行HBs抗原的分析，采用该方法进行HBs抗原测定时，明确了：病毒即使存在于血液中也无法分析出来的假阴性检样。

本发明人等在这些以往的HBs抗原的分析方法中，对于测定值降低的检样和假阴性检样，为了准确地测定HBs抗原的量而进行了深入的研究，结果发现了一种HBs抗原的分析方法，该方法通过将识别HBs抗原特定区域肽的抗体组合，不会发生假阴性、可准确测定HBs抗原的量。

本发明根据上述认识而完成。

解决课题的方法

因此，本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，其特征在于：使用与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针、和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，使用与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针、和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

在本发明的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法的优选方式中，上述膜内捕捉探针所结合的表位与上述膜内检测探针所结合的表位不同，上述膜外捕捉探针所结合的表位与膜外检测探针所结合的表位不同。

在本发明的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法的另一优选方式中，上述膜内捕捉探针是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中含有51～60号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜外捕捉探针是与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中含有111～130号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜内检测探针是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中含有51～69号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜外检测探针是与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中含有98～156号的氨基酸序列的肽结合的探针。

本发明的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法的另一优选方式中，上述探针是单克隆抗体或其抗体片段，特别是膜内捕捉单克隆抗体是选自FERM BP-10117抗体、FERM BP-10702抗体、FERM BP-10700抗体和FERM BP-10698抗体的单克隆抗体，上述膜内检测单克隆抗体是选自FERM BP-10117抗体、FERM BP-10702抗体、FERMBP-10700抗体和FERM BP-10698抗体的单克隆抗体，上述膜外捕捉单克隆抗体是选自FERM BP-10699抗体、FERM BP-10703抗体、FERM BP-10701抗体和FERM BP-10697抗体的单克隆抗体，上述膜外检测单克隆抗体是选自FERM BP-10699抗体、FERM BP-10703抗体、FERM BP-10701抗体和FERM BP-10697抗体的单克隆抗体，上述膜内捕捉单克隆抗体和上述膜内检测单克隆抗体为不同的抗体，上述膜外捕捉单克隆抗体和上述膜外检测单克隆抗体为不同的抗体。

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原的分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含抗体固相载体和试剂，该抗体固相载体含有与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，该试剂含有与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

本发明进一步涉及国际保藏号为FERM BP-10702的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10698的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERMBP-10699的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10703的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10701的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10700的小鼠杂交瘤或国际保藏号为FERM BP-10697的小鼠杂交瘤。

本发明进一步涉及国际保藏号为FERM BP-10702的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10698的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERMBP-10699的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10703的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10701的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10700的小鼠杂交瘤或国际保藏号为FERM BP-10697的小鼠杂交瘤、以及由这些杂交瘤产生的单克隆抗体。

本发明进一步涉及乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，该分析方法包含以下步骤：使与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针、和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针、被检试样、以及与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针接触的接触步骤；以及检测检测探针的信号的检测步骤。

本说明书中的“分析”包含判定是否存在分析对象化合物的“检测”和确定分析对象化合物的存在量的“定量”这两者。

本发明的“乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法”可作为“乙型肝炎病毒的诊断方法”使用。

发明效果

根据本发明，可以对在以往的HBs抗原的分析方法中为假阴性的检样的HBs抗原进行分析。还可以准确地分析在以往的抗原的分析方法中测定值低的检样的HBs抗原的量。

附图说明

图1是HBs抗原的跨膜模型的模式图。

具体实施方式

本发明的HBs抗原的分析方法是使用与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针、以及与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，使用与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

通过本发明的HBs抗原分析方法测定的HBs抗原是4次贯穿脂质双层膜的、由226个氨基酸残基形成的膜蛋白。已知HBV有几种基因型，例如有基因型A、B、C、D、E、F和G，根据该基因型，HBs抗原的氨基酸序列不同。根据病毒株的不同，还已知有基因变异，特别是在HBV颗粒的脂质双层膜的膜外110～156号区域的氨基酸序列中有很多变异。通过本发明的HBs抗原的分析方法测定的HBs抗原可以以这些具有异质性氨基酸序列的HBs抗原作为测定对象，通过本发明的分析方法对它们进行测定。

图1表示由Howard等人提倡的HBs抗原的跨膜结构模型。第1膜内区肽例如相当于Howard等人提倡的HBs抗原的跨膜结构模型中含有29～80号氨基酸残基的脂质双层的第1膜内区，但并不特定为HBs抗原的29～80号氨基酸编号，氨基酸编号因HBs抗原的氨基酸的变异、缺失和/或插入而不同。另外，第2膜外区肽例如相当于跨膜结构模型中含有98～156号氨基酸残基的亲水性第2膜外(ER腔)区，但并特定为HBs抗原的98～156号氨基酸编号，氨基酸编号由于HBs抗原的氨基酸变异、缺失和/或插入而不同。

第1膜内区肽优选为含有HBs抗原的第26～80号氨基酸残基的、存在于HBV颗粒的脂质双层内侧的亲水性肽。其标准的氨基酸序列是SEQ ID NO：1的26～80号氨基酸序列。但是，本说明书中的第1膜内区肽只要是HBs抗原的自N末端一侧的第1次存在于脂质双层内侧的肽即可，并不限于含有HBs抗原的SEQ ID NO：1的26～80号氨基酸序列的肽，例如也可以包含自N末端一侧的、氨基酸编号不同的肽、或含有在SEQ ID NO：1的26～80号氨基酸序列的一或多处有一或多个氨基酸置换(变异)、缺失和/或插入所得的氨基酸序列的肽。

第2膜外区肽优选为含有HBs抗原的98～156号氨基酸残基的、存在于HBV颗粒的脂质双层膜外侧的ER腔的亲水性肽。其标准的氨基酸序列是SEQ ID NO：1的98～156号氨基酸序列。不过，本说明书中第2膜外区的肽只要是自HBs抗原的N末端一侧第2次存在于脂质双层的外侧(腔侧)的肽即可，并不限于含有HBs抗原的SEQ ID NO：1的98～156号氨基酸序列的肽，例如也可包含自N末端一侧的、氨基酸编号不同的肽、或在SEQ ID NO：1的98～156号氨基酸序列的一或多处有一或多个氨基酸置换(变异)、缺失和/或插入所得的氨基酸序列的肽。

可在本发明中使用的膜内捕捉探针和膜内检测探针只要是可识别、并结合上述第1膜内区肽的探针即可，没有特别限定，例如也包含与含有SEQ ID NO：1的26～80号氨基酸序列的肽结合的探针、以及与含有在SEQ ID NO：1的26～80号氨基酸序列的一或多处有一或多个氨基酸置换(变异)、缺失和/或插入所得的氨基酸序列的肽结合的探针。更具体地说，包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸中含有31～50号氨基酸序列的肽、含有51～60号氨基酸序列的肽、含有51～69号氨基酸序列的肽、含有51～70号氨基酸序列的肽、含有21～40号氨基酸序列的肽、含有71～90号氨基酸序列的肽、以及含有61～80号氨基酸序列的肽、或这些肽的一部分氨基酸被置换而成的肽等结合的探针。

可在本发明中使用的膜外捕捉探针和膜外检测探针只要是可认别、并结合上述第2膜外区的肽的探针即可，没有特别限定，例如也包含与SEQ ID NO：1的含有98～156号氨基酸序列的肽结合的探针、以及与含有在SEQ ID NO：1的98～156号氨基酸序列的一或多处有一或多个氨基酸置换(变异)、缺失和/或插入所得的氨基酸序列的肽结合的探针。更具体地说，包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中含有121～130号氨基酸序列的肽、含有151～170号氨基酸序列的肽、含有111～130号氨基酸序列的肽、含有121～140号氨基酸序列的肽、含有98～156号氨基酸序列的肽、或这些肽的一部分氨基酸被置换而成的肽等结合的探针。并且，膜外捕捉探针所结合的表位也包含含复杂的高级结构的结构表位，例如共同抗原决定簇a。因此，也存在一种表位，该表位无法由只含有SEQ ID NO：1的98～156号的氨基酸序列的部分肽形成、而由比其部分肽长的肽、例如为全长HBs抗原的含有226个氨基酸残基的全长肽形成。可在本发明中使用的膜外捕捉探针和膜外检测探针包含例如可与由比SEQ ID NO：1的氨基酸中只含有98～156号氨基酸序列的部分肽更长的肽形成、存在于含有98～156号氨基酸序列的区的结构表位(以下称为“第2膜外区的区结构表位”)结合的探针。

可在本发明中使用的探针只要是可以与第1膜内区肽、第2膜外区肽或第2膜外区的区结构表位结合的分子即可，没有特别限定。例如可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、受体或结构类似物等，优选单克隆抗体或其抗体片段。

单克隆抗体的抗体片段只要是含有可与第1膜内区肽、第2膜外区肽或第2膜外区的区结构表位结合的抗原结合区的抗体片段即可，没有特别限定，例如可以是Fab、Fab’、F(ab’)₂或Fv等。这些抗体片段例如可按照常规方法，通过蛋白质分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)消化本发明的单克隆抗体，接着通过常规的蛋白质分离纯化方法进行纯化来获得。

以下，对于使用抗体特别是单克隆抗体作为探针的方式进行说明，使用其它探针同样也可实施本发明的HBs抗原的分析方法。

HBs抗原的分析方法的测定原理只要是使用捕捉抗体和检测抗体检测HBs抗原的方法即可，没有特别限定，优选夹心法。夹心法可以是作为两步法的正向夹心法、反向夹心法、以及一步法。

HBs抗原的分析方法可包含以下步骤：使与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉抗体和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉抗体、被检试样、以及与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测抗体和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测抗体接触的接触步骤；以及检测检测抗体的信号的检测步骤。

上述接触步骤可以分成使与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉抗体和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉抗体以及被检试样接触的第1接触步骤；以及使在第1接触步骤中形成的抗原抗体复合物和与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测抗体以及与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测抗体接触的第2接触步骤来进行。

更具体地说，正向夹心法可如下进行。首先，在微量板或珠等不溶性载体上固定与HBs抗原结合的捕捉抗体。接着，为了防止与捕捉抗体或不溶性载体的非特异性吸附，用适当的封闭剂(例如牛血清白蛋白或明胶等)进行不溶性载体的封闭。将要测定的含有HBs抗原的被检试样与一次反应液一起添加到固定有捕捉抗体的板或珠上，使捕捉抗体与HBs抗原接触并结合(一次反应步骤)。然后，将未与捕捉抗体结合的抗原或夹杂物用适当的清洗液(例如含有表面活性剂的磷酸缓冲液)清洗。接着，添加识别被捕捉的HBs抗原的抗体和辣根过氧化物酶(HRP)等结合有酶的标记抗体，使标记抗体与被捕捉的抗原结合(二次反应步骤)。通过该反应，可以在微量板等载体上形成捕捉抗体-抗原-标记抗体的免疫复合物。用清洗液清洗未结合的标记抗体，添加标记抗体的酶的显色底物或发光底物，通过酶与底物反应来检测信号。

本发明的HBs抗原分析方法中使用的捕捉抗体是指捕捉被检试样中的HBs抗原的抗体，是在上述使用不溶性载体的夹心法中固定在不溶性载体上的固相抗体。该捕捉抗体可以将与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉抗体、和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉抗体组合使用。除该两种抗体之外，还可以进一步追加其它抗体用作捕捉抗体。

本发明的HBs抗原的分析方法中使用的检测抗体是指检测被捕捉抗体所捕捉的、被检试样中的HBs抗原的抗体，是在上述的使用不溶性载体的夹心法中用酶等标记的标记抗体。该检测抗体可以将与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测抗体、以及与第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测抗体组合使用。除该两种抗体之外，还可以进一步追加其它抗体用作检测抗体。

与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的膜内捕捉抗体和膜内检测抗体优选它们所结合的表位不同。“表位不同”是指表位不完全一致。例如，两种抗体为相同的单克隆抗体时、或两种抗体为在表位抑制试验中被完全抑制的抗体时，两种抗体的表位完全一致。膜内捕捉抗体表位与膜内检测抗体的表位部分重复时，在很多情况下可以在本发明的HBs抗原的分析方法中使用。

与含有乙型肝炎病毒表面抗原的98～156号氨基酸残基的第2膜外区肽结合的膜外捕捉抗体和膜外检测抗体也优选它们所结合的表位不同。“表位不同”是指表位不完全一致。例如，两种抗体为相同的单克隆抗体时、或两种抗体为表位抑制试验中被完全抑制的抗体时，两种抗体的表位完全一致。膜内捕捉抗体表位与膜内检测抗体的表位部分重复时，在很多情况下可以在本发明的HBs抗原的分析方法中使用。

本发明的探针、特别是单克隆抗体或其抗体片段所识别的表位包含由连续的氨基酸残基构成的连续表位、以及由HBs抗原的片状结构或螺旋结构形成的不连续的氨基酸的组合所构成的结构表位(不连续表位)。

识别抗体的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和萤光素酶等。除酶以外，还可以使用吖啶鎓衍生物等发光物质、铕等荧光物质、I¹²⁵等放射性物质等作为标记物。可以结合标记物适当选择底物或诱导发光的物质。

本发明的标记抗体进一步包含结合有半抗原或低分子量的肽、凝集素等可用作抗原抗体反应的信号检测的物质作为检测标志的抗体。半抗原包含生物素、二硝基苯基(DNP)、FITC等。例如，使生物素与抗体结合、制备探针复合物时，在与生物素具有亲和性的抗生物素蛋白上标记HRP等酶、荧光素等荧光物质或吖啶鎓衍生物等发光物质，使之与探针复合物反应，通过检测显色、荧光、发光等来检测信号。

对抗体的标记方法没有特别限定，可以使用以往公知的方法，例如包含用酶等标记物直接标记抗体的方法、使抗体和酶等标记物与葡聚糖等高分子化合物结合的方法、使标记抗体与葡聚糖等高分子化合物结合的方法等。

本发明的抗体包含动物的多克隆抗体和人或小鼠的单克隆抗体，为了获得抗体而免疫动物的方法、以及为了获得产生单克隆抗体的杂交瘤的方法除了使用HBs抗原或HBs抗原的部分肽作为免疫原之外，均可通过公知的方法来实施，例如可按照续生化学实验讲座(日本生化学会编)、或免疫生化学研究法(日本生化学会编)所述的方法来进行。免疫用的HBs抗原可以使用病毒颗粒或从病毒颗粒中纯化HBs抗原使用。另外，HBs抗原、第1膜内区肽和第2膜外区肽例如可如下获得：通过基因重组使这些抗原在大肠杆菌中表达，通过纯化而获得。并且HBs抗原的部分肽可通过化学合成来制备，例如可通过Fmoc固相合成法、Boc固相合成法来合成。合成的肽可通过HPLC等公知的方法进行纯化，还可以使末端的氨基酸为半胱氨酸、利用其SH基使肽与载体蛋白结合，作为免疫原使用。

使用HBs抗原、第1膜内区肽和第2膜外区肽作为免疫原，免疫动物，由此可获得本发明的抗体。对免疫中使用的动物没有特别限定，可以使用绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、牛、马等。将HBs抗原、第1膜内区肽和第2膜外区肽例如与等量的弗氏完全佐剂或Titer-max gold(Titer Max公司)乳化混合，给予兔的皮下或小鼠的腹腔内。之后以1～2周的间隔进行同样的免疫操作。从这样免疫的动物中采血，制成血清或血浆，由此可制备本发明的抗体。

产生本发明的单克隆抗体的本发明的杂交瘤可由上述的进行了免疫操作的动物中获得。例如在对小鼠进行了多次免疫操作的2周后，经尾静脉接种溶解于磷酸缓冲生理盐水(PBS)等中的HBs抗原、第1膜内区肽和第2膜外区肽。2～3天后，从小鼠中无菌摘除含有产生抗体的淋巴细胞的脾脏。将该淋巴细胞例如与骨髓瘤细胞进行细胞融合，可以建立产生单克隆抗体的杂交瘤。

细胞融合例如可在聚乙二醇的存在下、通过使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合来进行。骨髓瘤细胞例如可使用具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失或胸苷激酶缺失等标志物的公知的细胞。具体来说，例如有p3·NS-1/1·Ag4.1或SP2/0-Ag14等细胞。融合的细胞可使用选择培养基例如HAT培养基，通过使未融合的细胞死亡来选择。

接着，对增殖的杂交瘤是否在培养上清中产生抗体进行筛选。筛选是使用固相酶联免疫测定法(ELISA法)等，通过测定针对HBs抗原、第1膜内区肽和第2膜外区肽的特异性抗体的产生来实施。选择分泌目标抗体的杂交瘤的克隆，进一步通过极限稀释法反复进行亚克隆，由此可保证单克隆抗体的克隆性。这样，可以选择产生本发明的抗体的杂交瘤，产生本发明的抗体的杂交瘤细胞株HBs121[国际保藏号FERM BP-10697]、HBs123[国际保藏号FERM BP-10698]、HBs136[国际保藏号FERM BP-10699]、HBs163[国际保藏号FERM BP-10700]、HBs605C3[国际保藏号FERM BP-10701]、SF111[国际保藏号FERMBP-10702]、SF124CS[国际保藏号FERM BP-10703]于2006年10月12日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。杂交瘤细胞株6G6[国际保藏号FERM BP-10117]于2004年9月9日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。

本说明书中，由杂交瘤细胞株产生的抗体以在该杂交瘤细胞株的名称或国际保藏号上附有“抗体”的名称表示。例如由杂交瘤细胞株HBs121产生的抗体称为“HBs121抗体”或“FERM BP-10697抗体”。

本发明的杂交瘤可以在公知的任意的培养基、例如RPMI1640中继代培养。本发明的单克隆抗体可通过培养该杂交瘤来制备，例如在RPMI1640培养基中加入10％胎牛血清、在5％CO₂存在下、在37℃下培养，由此可以在培养上清中产生抗体。另外，在用降植烷前处理的小鼠的腹腔内接种杂交瘤，10～20天后回收腹水，由此可以在腹水中产生抗体。本发明的抗体可通过公知的方法进行纯化，例如可通过使用蛋白G或蛋白A柱的纯化法、使用结合有HBs抗原的亲和柱的方法、或使用离子交换柱的方法等进行纯化。

所得单克隆抗体的识别的表位可以使用制备的重组抗原、第1膜内区肽、第2膜外区肽或化学合成的10～20个氨基酸左右的合成肽，通过固相酶联免疫测定法(ELISA法)，由来自HBs抗原的序列确定。由本发明的各杂交瘤产生的单克隆抗体的表位根据基因型不同的HBs抗原的氨基酸序列，每10个残基重叠，通过对化学合成的含有20个氨基酸残基的肽的反应性来确定。HBs121抗体是与基因型C和D的含有151～170号氨基酸残基的肽结合、不与基因型A和B的含有151～170号氨基酸残基的肽结合的抗体。HBs123抗体是与基因型A～D的含有30～50号氨基酸残基的肽结合的抗体。HBs136抗体是与基因型A、C和D的含有111～130号氨基酸残基的肽结合的抗体。HBs163抗体是与基因型A～D的含有31～50号氨基酸残基的肽结合的抗体。SF111抗体是与基因型A、B和C的含有51～69号氨基酸残基的肽结合的抗体。而HBs605C3抗体和SF124CS抗体均不与含有20个氨基酸残基的肽结合。HBs605C3抗体和SF124CS抗体与含有1～226号氨基酸残基的HBs抗原结合、也与含有98～156号氨基酸残基的肽结合，因此是识别乙型肝炎病毒表面抗原的结构表位、例如共同抗原决定簇a的抗体。另外，在后述实施例中使用的6G6抗体是与含有51～60号氨基酸残基的肽结合的抗体，具体是与HBs抗原的含有41～60号氨基酸残基的肽、以及含有51～70号氨基酸残基的肽结合。

本发明的通过夹心法进行的HBs抗原的分析试剂盒可以含有不溶性载体(例如96孔板或珠)和HBs抗原的分析试剂，其中，不溶性载体上固定有与HBs抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针、以及与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针；所述HBs抗原的分析试剂含有与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针、以及与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。HBs抗原的分析试剂可以以溶液的状态提供，也可以以冻干粉末状态提供。本发明的HBs抗原的分析试剂盒可含有乙型肝炎病毒抗原、其它抗乙型肝炎病毒抗体、使用说明书等。

实施例

以下给出实施例和比较例，对本发明进行具体地说明，它们均不限定本发明的范围。

实施例1产生单克隆抗体的杂交瘤的建立

(A)HBs抗原

将编码HBs抗原的含有26～80号的肽的DNA片段导入到作为表达载体的pATtrpE载体中。使所得pATtrpE-HBs(26～80)在大肠杆菌HB101株中表达，回收菌体。将表达抗原用凝胶过滤和离子交换柱纯化，获得TrpE-HBs(26～80)抗原。将该TrpE-HBs(26～80)抗原、购入的rHBsAg(Yeast，Advanced Chemical公司)和rHBsAg(CHO，anapure公司)用作免疫和通过ELISA法进行的小鼠抗体滴度的测定和筛选。

(B)免疫

将TrpE-HBs(26～80)抗原、rHBsAg(Yeast)或rHBsAg(CHO)的抗原溶液(2mg/mL)与等量的Tirter-Max Gold(Tirter Max USA公司)混合至乳化的状态，将0.1mL该混合液注射到4～6周龄雌性Balb/c小鼠的腹腔内或足垫，由此进行免疫(第一次免疫)。每隔1周，将按照同样的方法制备的0.1mL混合液腹腔内给予，进行两次免疫(第二和第三次免疫)。进行第二和第三次、根据情况还进行第四或第五次免疫，一周后由小鼠采血，按照后述(C)的方法测定抗体滴度。对于抗体滴度升高的小鼠，将TrpE-HBs(26～80)抗原、rHBsAg(Yeast)、或rHBsAg(CHO)的抗原溶液(0.1mg/mL)用等量PBS稀释，将0.1mL该稀释液进行小鼠的静脉内给予(最终免疫)。最终免疫3天后，由小鼠中无菌摘除脾脏或腹股沟淋巴结，用于以下的(D)的细胞融合步骤。

(C)通过ELISA法测定抗体滴度

分别向ELISA用96孔板(Nunc公司)中分注各100μL TrpE-HBs(26～80)抗原、rHBsAg(Yeast)抗原或rHBsAg(CHO)抗原(1μg/mL)，在4℃下放置过夜。接着，将该板的各孔用含有0.5％钠酪蛋白和2％蔗糖的磷酸缓冲生理盐水(PBS)封闭30分钟。除去该封闭液后，将上述步骤(B)中所得的血清用含有0.1％钠酪蛋白、1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.01％吐温20的PBS由1,000倍稀释至1,000,000倍，将100μL添加到孔中。在室温下放置60分钟，然后用0.05％吐温20/PBS(以下称为PBST)清洗三次。接着，加入100μL(0.08μg/mL)辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠IgG抗体(山羊，Jackson公司)，在室温下放置1小时，然后再次用PBST清洗四次。向各孔中加入100μLOPD底物溶液[含有2.2mM邻苯二胺、0.03％过氧化氢水的0.075M柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)]，在25℃下反应30分钟，向各孔中加入100μL 1M硫酸，测定各孔的492nm下的吸光度。

(D)细胞融合

将无菌摘除的小鼠的脾脏或腹股沟淋巴结加入到含8mLRPMI1640培养基的培养皿中。使脾脏细胞流出，然后将该脾脏或腹股沟淋巴结细胞的悬浮液过筛，收集到50mL离心管中，加入32mLRPMI1640培养基，悬浮，然后以150×g的速度离心5分钟。吸引上清后悬浮于40mL RPMI培养基中，以150×g的速度离心5分钟。将该操作进行两次。将这样得到的细胞颗粒用40mL RPMI1640培养基再悬浮，测定脾细胞或淋巴结细胞的细胞数。

另一方面，向预先在50mL管中培养的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14[理化学研究所基因库](约2×10⁷个细胞)中加入约1×10⁸个上述脾脏或淋巴结细胞，在RPMI1640培养基中充分混合，进行离心(150×g，5分钟)。吸引该上清，将颗粒充分搅散，滴加1mL在37℃下保温的50％聚乙二醇(PEG)4000溶液，将离心管用手平稳地旋转1分钟，由此将PEG溶液与细胞颗粒混合。接着，加入9mL 37℃保温的RPMI1640培养基，将管平稳地旋转。然后进行离心(150×g，5分钟)，除去上清，然后将细胞颗粒悬浮于50mL含有10％胎牛血清、和5％ブヨイクロ一ン(人IL-6，大日本制药)的HAT培养基(在RPMI1640培养基中添加4×10^-7M氨基喋呤、1.6×10^-5M胸苷以及1×10^-4M次黄嘌呤)。将该细胞悬浮液分别以100μL分注到96孔细胞培养板的各孔中，在含有5％二氧化碳的37℃的二氧化碳培养器中开始培养。培养过程中，间隔2～3天除去约100μL各孔的培养基，重新加入100μL新的上述HAT培养基，选择在HAT培养基中增殖的杂交瘤。约第10天，进行以下杂交瘤的筛选。

(E)杂交瘤的筛选

使用100μL杂交瘤的培养上清代替血清试样，除此之外重复进行上述步骤(C)的利用ELISA法进行的抗体滴度的测定，进行杂交瘤的筛选。将确认产生抗体的孔中的各杂交瘤通过极限稀释法进行克隆。10天后同样进行ELISA法，筛选产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤的克隆。结果，建立了杂交瘤细胞株HBs121[国际保藏号FERMBP-10697]、HBs123[国际保藏号FERM BP-10698]、HBs136[国际保藏号FERM BP-10699]、HBs163[国际保藏号FERM BP-10700]、HBs605C3[国际保藏号FERM BP-10701]、SF111[国际保藏号FERMBP-10702]、SF124CS[国际保藏号FERM BP-10703]的杂交瘤细胞株。各杂交瘤于2006年10月12日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。

通过使用来自HBs抗原的20个氨基酸残基的肽的ELISA法确定由本发明的各杂交瘤产生的单克隆抗体的表位。根据基因型不同的HBs抗原的氨基酸序列，化学合成分别有10个残基重叠的、含有20个氨基酸残基或19个氨基酸残基的肽，作为ELISA法的抗原使用。在表位确定中使用的肽如表1所示。含有HBs抗原的1～20号氨基酸残基的肽使用PepHBS1AD(SEQ ID NO：2)、PepHBS1B(SEQ ID NO：3)、PepHBS1C2(SEQ ID NO：4)、和PepHBS1C(SEQ ID NO：5)，含有11～30号氨基酸残基的肽使用PepHBS2ACD(SEQ ID NO：6)、PepHBS2B(SEQ ID NO：7)，含有21～40号氨基酸残基的肽使用PepHBS3ACD(SEQ ID NO：8)，含有31～50号氨基酸残基的肽使用PepHBS4A(SEQ ID NO：9)、PepHBS4B(SEQ ID NO：10)、PepHBS4C(SEQ ID NO：11)、和PepHBS4D(SEQ ID NO：12)，含有41～60号氨基酸残基的肽使用PepHBS5A(SEQ ID NO：13)、PepHBS5B(SEQ IDNO：14)、PepHBS5C(SEQ ID NO：15)、和PepHBS5D(SEQ ID NO：16)，含有51～69号氨基酸残基的肽使用PepHBS6AC(SEQ ID NO：17)、和PepHBS6B(SEQ ID NO：18)，含有61～80号氨基酸残基的肽使用PepHBS7AC(SEQ ID NO：19)、和PepHBS7D(SEQ ID NO：20)，含有71～90号氨基酸残基的肽使用PepHBS8ACD(SEQ ID NO：21)、和PepHBS8B(SEQ ID NO：22)，含有81～100号氨基酸残基的肽使用PepHBS9ACD(SEQ ID NO：23)，含有91～110号氨基酸残基的肽使用PepHBS10C(SEQ ID NO：24)，含有101～119号氨基酸残基的肽使用PepHBS11A(SEQ ID NO：25)、PepHBS11BD(SEQ ID NO：26)、和PepHBS11C(SEQ ID NO：27)，含有111～130号氨基酸残基的肽使用PepHBS12A(SEQ ID NO：28)、PepHBS12C(SEQ ID NO：29)、PepHBS12D1(SEQ ID NO：30)、和PepHBS12D2(SEQ ID NO：31)，含有121～140号氨基酸残基的肽使用PepHBS13A(SEQ ID NO：32)、PepHBS13B(SEQ ID NO：33)、PepHBS13C(SEQ ID NO：34)、PepHBS13D1(SEQ ID NO：35)、和PepHBS13D2(SEQ ID NO：36)，含有131～150号氨基酸残基的肽使用PepHBS14A(SEQ ID NO：37)、和PepHBS14C(SEQ ID NO：38)，含有141～160号氨基酸残基的肽使用PepHBS15C(SEQ ID NO：39)，含有151～170号氨基酸残基的肽使用PepHBS16AB(SEQ ID NO：40)、PepHBS16C2(SEQ ID NO：41)、PepHBS16C(SEQ ID NO：42)、和PepHBS16D(SEQ ID NO：43)，含有161～180号氨基酸残基的肽使用PepHBS17C(SEQ ID NO：44)、和PepHBS17D(SEQ ID NO：45)，含有171～190号氨基酸残基的肽使用PepHBS18ABD(SEQ ID NO：46)、和PepHBS18C(SEQ ID NO：47)，含有181～200号氨基酸残基的肽使用PepHBS19A(SEQ ID NO：48)、和PepHBS19C(SEQ ID NO：49)，含有191～210号氨基酸残基的肽使用PepHBS20A(SEQ ID NO：50)、和PepHBS20B(SEQ ID NO：51)、和PepHBS20C(SEQ ID NO：52)，含有201～220号氨基酸残基的肽使用PepHBS21A(SEQ ID NO：53)、PepHBS21B(SEQ ID NO：54)、PepHBS21C(SEQ ID NO：55)、和PepHBS21D(SEQ ID NO：56)，含有211～226号氨基酸残基的肽使用PepHBS22D(SEQ ID NO：57)。各肽的末尾的A、B、C、D等文字表示该肽的氨基酸序列为代表性的基因型的氨基酸序列。AB文字表示该肽的氨基酸序列为基因型A和B共通的氨基酸序列。

表位分析结果，HBs121抗体与含有151～170号氨基酸残基的肽PepHBS16C2、PepHBS16C、和PepHBS16D结合，但不与PepHBS16AB结合。HBs123抗体与含有31～50号氨基酸残基的肽PepHBS4A、PepHBS4B、和PepHBS4C结合，但不与PepHBS4D结合。HBs136抗体与含有111～130号氨基酸残基的肽PepHBS12A、PepHBS12C、PepHBS12D1、和PepHBS12D2结合。HBs163抗体与含有31～50号氨基酸残基的肽PepHBS4A、PepHBS4B、和PepHBS4C结合，但不与PepHBS4D结合。SF111抗体与含有51～69号氨基酸残基的肽PepHBS6AC结合，但不与PepHBS6B结合。而HBs605C3抗体和SF124CS抗体与含有1～226号氨基酸残基的HBs抗原结合，但不与含有20个氨基酸的肽结合。

[表1]

实施例2建立的单克隆抗体的制备

(A)由培养上清制备单克隆抗体

将所建立的小鼠杂交瘤在无血清培养基(Hydridoma-SFM，GIBCO)中、在37℃下、在5％二氧化碳气氛中培养72～96小时。将培养液铺于重组蛋白A柱(GEヘルスケアバイオサイエンス公司)。将抗体用pH5.5的缓冲液从柱中洗脱，得到纯化的本发明的单克隆抗体。可以由500mL培养液中获得约10mg的抗体。

(B)由腹水中制备单克隆抗体

对于每只小鼠，向4～6周龄的Balb/c小鼠的腹腔内给予0.5mL降植烷，七天后，将增殖的各杂交瘤接种于腹腔内，每只小鼠接种约5×10⁶个细胞。由5只小鼠中获得约15mL的腹水，由2mL腹水获得约10mg的抗体。腹水中的单克隆抗体的纯化按照与上述的由培养上清中纯化同样的方法来进行。

实施例3单克隆抗体的HRP标记

抗体的HRP标记可使用Pierce公司制备的EZ-Link Plus ActivatedPeroxidase来进行。该方法是使抗体分子中的氨基上导入了醛基的HRP结合的方法。标记按照厂商提供的说明书进行实施。

实施例4

本实施例4中，夹心法的捕捉抗体是使用单独的膜内捕捉抗体、单独的膜外捕捉抗体、或膜内捕捉抗体与膜外捕捉抗体的组合，检测抗体使用单独的膜内检测抗体、单独的膜外检测抗体、或膜内检测抗体与膜外检测抗体的组合，测定HBV感染患者检样的HBs抗原。

使用6G6抗体作为膜内捕捉抗体、HBs136抗体作为膜外捕捉抗体、SF111抗体作为膜内检测抗体、SF124CS抗体作为膜外检测抗体。将100μL单独的6G6抗体、单独的HBs136抗体、6G6抗体与HBs136抗体的等量混合抗体以4μg/mL的浓度加入到96孔微量培养板(Costar2592)的各孔中，在4℃下温育过夜。用含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液pH7.3清洗两次，然后将350μL含有0.5％钠酪蛋白的10mM磷酸缓冲液加入到各孔中，在37℃下进行5小时的封闭。除去封闭液后，将25μL含有2％N月桂酰肌氨酸钠(NLS)(WAKO)的反应缓冲液(pH7.2)和75μL健康人检样或HBV阳性检样加入到各孔中，边搅拌边在室温下反应1小时。反应后，用含有0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液pH7.3(清洗液)清洗8次。接着，将辣根过氧化物酶标记的SF124CS抗体、SF111抗体或SF124CS抗体和SF111抗体的等量混合抗体用含有2％BSA、1％小鼠血清、0.2％TritonX-100的10mM磷酸缓冲液pH7.3稀释，向各孔中加入100μL，边搅拌边在室温下反应1小时。用清洗液清洗8次，将100μL底物溶液(邻苯二胺，SIGMA)加入到各孔中，在室温下温育30分钟，将100μL 2N硫酸加入到各孔中，中止反应。使用TOSOH的检测器，以波长620nm的吸光度作为对照，测定波长492nm的吸光度(O.D.)。结果如表2所示。健康人检样的结果用O.D.表示，HBV阳性检体用将其O.D.除以健康人的O.D.所得的信号/阴性(S/N)表示。S/N为1以下时表示为N.D.(未检测出)。表2中的捕捉抗体的Int是6G6抗体、Ext是HBs136抗体，检样抗体的Int是SF111抗体，Ext是SF124CS抗体。

在捕捉抗体只使用Int的HBs抗原分析方法中，无法测定HBV阳性检样4、5和6的HBs抗原。另外，在检测抗体只使用Int的HBs抗原检测法中，无法测定HBV阳性检样4、5和6的HBs抗原，HBV阳性检样10和12的HBs抗原测定值显著低。而捕捉抗体使用Ext以及检测抗体使用Ext、捕捉抗体使用Ext以及检测抗体使用Int+Ext、捕捉抗体使用Int+Ext和检测抗体使用Ext、或者捕捉抗体使用Int+Ext以及检测抗体使用Int+Ext时，无法测定所有的HBs阳性检样。

实施例5

本实施例5中，通过使用实施例4的捕捉抗体和检测抗体的组合抗体进行的HBs抗原的分析方法，测定HBs抗体阴性条件下和HBs抗体阳性条件下的HBs抗原。具体来说，在HBs抗原阳性的被检试样中添加抗体滴度高的HBs抗体阳性血浆，研究其影响。

使用6G6抗体作为膜内捕捉抗体、HBs136抗体作为膜外捕捉抗体、SF111抗体作为膜内检测抗体、SF124CS抗体作为膜外检测抗体。将100μL单独的6G6抗体、单独的HBs136抗体、6G6抗体与HBs136抗体的等量混合溶液以4μg/mL的浓度加入到96孔微量板(Costar2592)的各孔中，在4℃下温育过夜。用含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液pH7.3清洗两次，然后将350μL含有0.5％钠酪蛋白的10mM磷酸缓冲液加入到各孔中，在37℃下封闭5小时。除去封闭液后，向各孔中加入25μL含有2％NLS(WAKO)的反应缓冲液(pH7.2)、和75μL使用HBs抗体阴性或HBs抗体阳性的血浆稀释健康人检样或HBV阳性检样所得的稀释液，边搅拌边在室温下反应1小时。反应后，用含有0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液pH7.3(清洗液)清洗5次。接着，将辣根过氧化物酶标记的SF111抗体、SF124CS抗体或其等量混合抗体用含有2％BSA、1％小鼠血清、0.2％TritonX-100的10mM磷酸缓冲液pH7.3稀释，向各孔中添加100μL，边搅拌边在室温下反应1小时。用清洗液清洗5次，将100μL底物溶液(邻苯二胺，SIGMA)加入到各孔中，在室温下温育30分钟。将100μL 2N硫酸加入到各孔中，中止反应。使用TOSOH的检测器，以波长620nm的吸光度作为对照，测定波长492nm的吸光度。测定结果如表3所示。以用HBs抗体阴性血浆稀释的值为100％时，将用HBs抗体阳性血浆稀释的值的百分比用抑制率(％)表示。表3的捕捉抗体(1stAb)的Int是6G6抗体，Ext是HBs136抗体，检测抗体(2ndAb)的Int是SF111抗体，Ext是SF124CS抗体。

在捕捉抗体只使用Ext的HBs抗原的分析方法中，在HBV阳性检样1和8中，所有的测定值表示为63.5％以下，在HBV阳性检样3中，表示为44.2％以下。而捕捉抗体使用Int或Int+Ext的HBs抗原的分析方法中，HBV阳性检样1和8的全部测定值表示为72.3％以上，在HBV阳性检样3中表示为59.4％以上。由此显示，捕捉抗体使用Int或Int+Ext的HBs抗原的分析方法难以受到患者体内抗HBs抗体的影响。

将上述表2和表3的结果汇总于表4。表2中，将实施例4中的可测定全部检样的抗体的组合定为○。表3中，将实施例5中的对HBV阳性检样1的测定值表示为80％以上、对HBV阳性检样3的测定值表示为60％以上、对HBV阳性检样8的测定值表示为80％以上的抗体的组合定为○。

[表4]

如表4所示，可知捕捉抗体使用Int+Ext和检测抗体使用Int+Ext时，假阴性的发生降低，可以开发难以受到患者生物体内抗HBs抗体影响的HBs抗原的分析方法。

产业实用性

通过将本发明的HBs抗原的分析方法用于HBV感染的筛选，可以测定以往的方法中无法测定的、感染HBV的被检试样。另外，可以更准确地测定HBV感染患者的HBs抗原量，对于把握患者的病态有用。

以上按照特定的方式说明了本发明，本领域技术人员应了解的变形或改良均包含在本发明的范围内。

序列表

<110>株式会社先端生命科学研究所

<120>乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法

<130>ALS-793

<150>JP 2006-294906

<151>2006-10-30

<150>JP 2007-133539

<151>2007-05-18

<160>57

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>226

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>1

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

35 40 45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Ile Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

100 105 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

130 135 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

195 200 205

Val Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile

225

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>2

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe

20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>3

Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe

20

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>4

Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe

20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>5

Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe

20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>6

Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Pro Gln

20

<210>7

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>7

Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu

1 5 10 15

Thr Ile Pro Gln

20

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>8

Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp

1 5 10 15

Thr Ser Leu Asn

20

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>9

Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly

20

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>10

Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly

20

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>11

Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro

1 5 10 15

Thr Cys Pro Gly

20

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>12

Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr

1 5 10 15

Val Cys Leu Gly

20

<210>13

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>13

Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Asn His

20

<210>14

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>14

Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln

1 5 10 15

Ile Ser Ser His

20

<210>15

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>15

Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Asn His

20

<210>16

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>16

Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro

1 5 10 15

Thr Ser Asn His

20

<210>17

<211>19

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>17

Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro

1 5 10 15

Pro Ile Cys

<210>18

<211>19

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>18

Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro

1 5 10 15

Pro Ile Cys

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>19

Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys

1 5 10 15

Leu Arg Arg Phe

20

<210>20

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>20

Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys

1 5 10 15

Leu Arg Arg Phe

20

<210>21

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>21

Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Cys

20

<210>22

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>22

Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Cys Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Cys

20

<210>23

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>23

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Ile Val

1 5 10 15

Leu Leu Asp Tyr

20

<210>24

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>24

Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val

1 5 10 15

Cys Pro Leu Leu

20

<210>25

<211>19

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>25

Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr

1 5 10 15

Ser Thr Gly

<210>26

<211>19

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>26

Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr

1 5 10 15

Ser Thr Gly

<210>27

<211>19

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>27

Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr

1 5 10 15

Ser Thr Gly

<210>28

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>28

Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly

20

<210>29

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>29

Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly

20

<210>30

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>30

Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly

20

<210>31

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>31

Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr

1 5 10 15

Thr Ala Gln Gly

20

<210>32

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>32

Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser

1 5 10 15

Cys Cys Cys Thr

20

<210>33

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>33

Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser

1 5 10 15

Cys Cys Cys Thr

20

<210>34

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>34

Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser

1 5 10 15

Cys Cys Cys Thr

20

<210>35

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>35

Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser

1 5 10 15

Cys Cys Cys Thr

20

<210>36

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>36

Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser

1 5 10 15

Cys Cys Cys Thr

20

<210>37

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>37

Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn

1 5 10 15

Cys Thr Cys Ile

20

<210>38

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>38

Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn

1 5 10 15

Cys Thr Cys Ile

20

<210>39

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>39

Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp

1 5 10 15

Ala Phe Ala Arg

20

<210>40

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>40

Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Phe

20

<210>41

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>41

Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Phe

20

<210>42

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>42

Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Phe

20

<210>43

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>43

Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala

1 5 10 15

Ser Ala Arg Phe

20

<210>44

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>44

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Val Pro Phe Val

20

<210>45

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>45

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Val Pro Phe Val

20

<210>46

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>46

Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu

1 5 10 15

Ser Pro Thr Val

20

<210>47

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>47

Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ser Pro Thr Val

20

<210>48

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>48

Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp

1 5 10 15

Met Met Trp Tyr

20

<210>49

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>49

Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp

1 5 10 15

Met Met Trp Tyr

20

<210>50

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>50

Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr

1 5 10 15

Ser Ile Val Ser

20

<210>51

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>51

Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser Leu Tyr

1 5 10 15

Asn Ile Leu Ser

20

<210>52

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>52

Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr

1 5 10 15

Asn Ile Leu Ser

20

<210>53

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>53

Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ile Phe Phe

20

<210>54

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>54

Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ile Phe Phe

20

<210>55

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>55

Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ile Phe Phe

20

<210>56

<211>20

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>56

Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Pro Ile Phe Phe

20

<210>57

<211>16

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>57

Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile

1 5 10 15

Claims

1.乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，其特征在于：使用与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，使用与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

2.权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，上述膜内捕捉探针所结合的表位与上述膜内检测探针所结合的表位不同，上述膜外捕捉探针所结合的表位与上述膜外检测探针所结合的表位不同。

3.权利要求1或2所述的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，其中，上述膜内捕捉探针是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中含有51～60号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜外捕捉探针是与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中含有111～130号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜内检测探针是与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中含有51～69号氨基酸序列的肽结合的探针，上述膜外检测探针是与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中含有98～156号氨基酸序列的肽结合的探针。

4.权利要求1～3中任一项所述的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，其中，上述探针是单克隆抗体或其抗体片段。

5.权利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原的分析方法，其中，上述膜内捕捉单克隆抗体是选自FERM BP-10117抗体、FERMBP-10702抗体、FERM BP-10700抗体和FERM BP-10698抗体的单克隆抗体，上述膜内检测单克隆抗体是选自FERM BP-10117抗体、FERM BP-10702抗体、FERM BP-10700抗体和FERM BP-10698抗体的单克隆抗体，上述膜外捕捉单克隆抗体是选自FERM BP-10699抗体、FERM BP-10703抗体、FERM BP-10701抗体和FERM BP-10697抗体的单克隆抗体，上述膜外检测单克隆抗体是选自FERM BP-10699抗体、FERM BP-10703抗体、FERM BP-10701抗体和FERM BP-10697抗体的单克隆抗体，上述膜内捕捉单克隆抗体和上述膜内检测单克隆抗体为不同的抗体，上述膜外捕捉单克隆抗体和上述膜外检测单克隆抗体为不同的抗体。

6.乙型肝炎病毒表面抗原的分析试剂盒，其特征在于：该分析试剂盒含有抗体固相载体和试剂，所述抗体固相载体含有与乙型肝炎病毒表面抗原的第1膜内区肽结合的至少一种膜内捕捉探针和与第2膜外区肽结合的至少一种膜外捕捉探针作为捕捉探针，所述试剂含有与上述第1膜内区肽结合的至少一种膜内检测探针和与上述第2膜外区肽结合的至少一种膜外检测探针作为检测探针。

7.国际保藏号为FERM BP-10702的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10698的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10699的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10703的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10701的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10700的小鼠杂交瘤或国际保藏号为FERM BP-10697的小鼠杂交瘤。

8.单克隆抗体，其为由杂交瘤产生的单克隆抗体，所述杂交瘤选自国际保藏号为FERM BP-10702的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10698的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10699的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10703的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10701的小鼠杂交瘤、国际保藏号为FERM BP-10700的小鼠杂交瘤和国际保藏号为FERM BP-10697的小鼠杂交瘤。