CN109641039A - 肽疫苗制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型重建组合物、药物组合物以及包括所述重建组合物的组合试剂盒。本发明还涉及使用所述药物组合物和/或药物组合物用作药剂的治疗方法。还提供了使用本发明的重建组合物的一种用于重建干燥的肽的方法和制备药物组合物的方法。

Description

肽疫苗制剂
技术领域
本发明属于医学和免疫学领域。特别地，它涉及用于重建(reconstitute)用于疫苗接种的肽的新型组合物。该组合物特别适用于基于药物肽的疫苗的制备，所述疫苗进一步包括基于油的佐剂。
发明背景
临床结果表明，成功的治疗性疫苗接种的时代已经到来。由HPV引起的癌变前(premalignant)病变显示出病变消退，并且已经建立了延长存活期的临床益处。基于合成长肽的疫苗是最理想的疫苗平台之一。用于治疗持续感染和癌症的肽疫苗或基于肽的疫苗已经被开发，优选靶向免疫系统以清除表达病毒抗原、癌抗原和/或新生抗原(neo-antigen)的细胞。本领域了解，基于肽的疫苗能够激发有效的细胞免疫应答(CD4+和CD8+T细胞应答)，靶向能清除抗原表达细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞。选择的抗原包括突变序列、选择的癌症睾丸抗原和病毒抗原(综述参见Melief等，2016Journal of ClinicalInvestigation，Vol 125(9)pages 3401-3412)。
基于肽的疫苗的挑战之一是提供物理上和化学上稳定的可注射溶液。这尤其是对包含多于一种肽和基于油的佐剂的基于肽的疫苗的一种挑战。可注射的疫苗溶液通常在给患者施用约1至3小时之前使用干的、大多为冻干肽作为起始材料现场制备。因此，需要允许干燥的肽快速重建的合适的重建组合物，所述干燥的肽随后能与基于油的佐剂容易地混合，从而得到给患者施用之前物理上和化学上稳定在室温储存至少2至3小时的乳剂。
发明详述
重建组合物
本发明提供了用于重建用于疫苗接种的肽的新型组合物。该重建组合物包含或由以下组成：约60-80％v/v包含有机酸的水溶液、约5-10％v/v丙二醇(CAS：57-55-6)、约10-20％v/v低级醇和约5-10％v/v非离子亲水性表面活性剂。
优选地，所述有机酸为弱有机酸，例如羧酸。弱有机酸在本文中应理解为具有介于-2和12之间的pKa(对数酸解离常数)的有机酸。优选地，所述弱有机酸具有1至10之间、或2至5之间或甚至3至4之间的pKa。所述弱有机酸可以是，但不限于任何选自由以下组成的组的羧酸：草酸(乙二酸)、柠檬酸(2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸)、苹果酸(2-羟基丁二酸)、碳酸(羟基甲酸)、苯甲酸(苯羧酸或苯基甲酸)、蚁酸(甲酸)、乳酸(2-羟基丙酸)、醋酸(乙酸)、酪酸(丁酸)、缬草酸(戊酸)、羊油酸(已酸)和初油酸(丙酸)。最优选地，所述有机酸是柠檬酸。
所述有机酸可以以范围在约0.008至0.25M、或约0.01至0.2M、或0.05至0.1M的浓度存在于所述水溶液。本发明的重建组合物包含60-80％、或65％-75％或67％-72％、或约70％的所述水溶液，所述水溶液优选具有范围在0.05至0.2M、0.006至0.16M、0.008至0.12M、0.03至0.08M、或优选0.04至0.6M的所述有机酸的终浓度。
低级醇在本文理解为具有与低级烷基或低级取代烷基的饱和碳原子键合的羟基官能团的有机化合物，其中低级烷基或低级取代烷基至多有6个碳原子并且优选具有结构CH3-(CH2)n-OH，其中n＝1、2、3、4或5。优选地，所述低级醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇，最优选的所述低级醇是乙醇。
所述非离子亲水性表面活性剂优选具有9至14之间，更优选地12至14之间的亲水亲油平衡值(HLB)。该表面活性剂可以是但不限于山梨聚糖的乙氧基化脂肪酸单-(特别是5个乙氧基)、二-或三-(特别是20个乙氧基)酯，其中所述脂肪酸优选选自由以下组成的组：油酸酯(例如乙氧基化山梨聚糖单油酸酯如吐温和/或乙氧基化山梨聚糖三油酸酯如吐温)、棕榈酸酯、硬脂酸酯(例如乙氧基化山梨聚糖三硬脂酸酯，如吐温)、异硬脂酸酯、月桂酸酯及其组合；乙氧基化脂肪醇(特别是5-10个乙氧基)(例如)、乙氧基化脂肪酸(特别是5-10个乙氧基)(例如Simulsol )、乙氧基化蓖麻油(特别是25-35个乙氧基)(例如ArlatoneArlatoneCremophor)及其组合。
在本发明组合物的一个实施例中，所述非离子亲水性表面活性剂：
a.是单、二或三酰甘油，优选乙氧基化三酰甘油，和/或
b.具有在9和14之间的亲水-亲脂平衡值(HLB)值。
使用公式HLB＝20(1-Is/Ia)计算所述HLB值，其中Is表示皂化指数或皂化值，并且Ia表示所述表面活性剂或所述表面活性剂混合物的酸指数或酸值。这两个指标，即皂化值和酸值，通过欧洲药典(版本8.8，分别是第2.5.6和2.5.1节)中描述的方法确定。
在优选的实施方式中，所述非离子亲水性表面活性剂是乙氧基化蓖麻油，更特别是聚乙二醇35氢化蓖麻油(polyoxyl 35hydrogenated castor oil)或聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(polyoxyethyleneglyceroltriricinoleate 35)(CAS no.61791-12-6)(例如Cremophor)，其是聚氧乙烯化甘油三酯的混合物，该混合物通过蓖麻油与环氧乙烷以1∶35的摩尔比反应得到。
优选地，本发明的重建组合物包含或由以下组成：约75％v/v在水中包含约0.1M柠檬酸水溶液的水溶液、约6.25％v/v丙二醇(CAS no.57-55-6)、约12.5％v/v乙醇和约6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS no.61791-12-6)。换句话说，所述重建组合物在水中包含或由以下组成：约0.075M柠檬酸、约6.25％v/v丙二醇(CAS no.57-55-6)、约12.5％v/v乙醇和约6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS no.61791-12-6)。
另一种优选的重建组合物是包含或由以下组成：约75％v/v在水中包含约0.1M柠檬酸的水溶液、约6.25％v/v丙二醇(CAS no.57-55-6)、约12.5％v/v乙醇、约6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS no.61791-12-6)和20μg/mL CpG ODN1826，或包含或由在水中的以下组成：约0.075M柠檬酸、约6.25％v/v丙二醇(CAS no.57-55-6)、约12.5％v/v乙醇、约6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS no.61791-12-6)和20μg/mL CpGODN1826。
所述重建组合物特别适合于重建如下文在标题药物组合物下所定义的储存肽(即优选具有15至100个氨基酸之间的长度)。本领域知晓重建上述长度的肽时形成稳定溶液的困难，特别是在不同肽的情况下，即具有不同氨基酸序列并因此具有不同化学性质并表现出物理上不同的肽。因此，很难在一种以及相同溶液中重建它们。除此之外，如果这些肽中的一种或多种包含半胱氨酸，则必须处理形成SS-桥的趋势。尽管疫苗肽中可能需要分子内二硫键以具有免疫原性，但是分子间二硫桥形成是不被希望的，因为它导致溶液的不稳定。
本发明人现已确定本发明的重建组合物特别适用于形成高度稳定的重建肽组合物，其中分子间二硫桥的量被最小化，而不损害所述重建肽的免疫原性。因此，本发明的重建组合物防止待如本文进一步定义的那样重建的所述肽的分子间二硫化物的形成，而不损害这些肽的免疫原性。
优选地，本发明的重建组合物是无菌和/或药物级或临床级组合物，适合于给对象(即哺乳动物物种或人)进行肠胃外施用。优选地，本发明的重建组合物使用GoodManufacturing Practice(GMP)制造，并具有欧洲药品管理局和食品和药品管理局定义的GMP质量。本发明的重建组合物可以包装于小瓶中。本发明还提供了一种小瓶，其包含一定体积的重建组合物，其适于重建本文进一步定义的单一药物剂量单位，或多个药物剂量单位，即适于重建2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的药物剂量单位的一定体积。优选地，所述小瓶储存在这样温度，在所述温度所述重建组合物稳定至少1个月、2个月、3个月、6个月或1年或甚至2年。优选地，所述温度在-25℃至25℃之间、或-23℃至-18℃之间、或0℃至10℃之间、或2℃至8℃之间、或在18℃至23℃之间。
优选地，存在于所述小瓶中的本发明的重建组合物的体积最多50mL，优选0.1至10mL之间，优选1至10mL之间，例如0.5、1、2、3、4、5或10mL，或之间的任何值。小瓶在本文应理解为能具有任何形状的容器。任选地，小瓶在本文中应理解为注射器。
药物组合物
本发明的重建组合物特别适用于重建肽以制备药剂或药物组合物。这种药物组合物可以是疫苗，优选肽疫苗。“疫苗”在本文中应理解为包含抗原性化合物的组合物，其任选地与进一步的免疫刺激化合物互补，用于产生免疫力以预防和/或治疗疾病，例如与持续感染和/或化生(metaplasia)和/或发育异常(dysplasia)和/或瘤形成(neoplasia)相关的病症。“基于肽的疫苗”或“肽疫苗”(这些术语在本文中可互换使用)在本文中应理解为其中肽构成活性成分(即所述抗原性化合物)的疫苗。优选地，此类肽是合成的长肽。更优选地，包含能够诱导CD4+和/或CD8+T细胞应答的人白细胞抗原(HLA)表位。
因此，提供的是包含在本发明的重建组合物中重建的肽的药物组合物。优选地，本发明的药物组合物是疫苗，优选基于肽的疫苗。这种基于肽的疫苗可用于治疗持续感染、癌前病症和癌症，优选激活细胞免疫系统以清除感染的细胞、癌前细胞和/或癌细胞，所述细胞表达病毒抗原、肿瘤相关的抗原如癌睾丸抗原和/或肿瘤特异性抗原如致癌或非致癌病毒抗原和/或由DNA突变产生的新生抗原。
所述药物组合物优选用于并因此配制成适合用于给对象(优选人或动物对象)施用。优选地，所述施用是肠胃外的，例如静脉内、皮下、肌肉内、真皮内、皮内和/或瘤内施用，即通过注射。
本发明人发现，包含重建的肽的所述重建组合物特别适合与基于油的佐剂混合，产生化学上和物理上稳定的肽疫苗溶液。
“化学上稳定”在本文中在肽溶液和/或肽疫苗组合物的上下文提及，并且在本文中应理解为包含不会化学上降解或分解至不能接受的程度的肽的溶液或组合物，所述降解或分解例如由于分子内或分子间二硫桥的形成；即，在室温下将所述溶液或组合物储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后，所述溶液和/或组合物中未降解的、未分解的和/或未反应的肽的量与其初始相比至少为以重量计的90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％。能使用本领域已知的任何合适的技术评估化学稳定性，例如使用本文示例的UPLC/MS。当使用UPLC/MS时，如果在室温下储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后出现的新峰总％面积与其初始相比最多为20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％，则定义溶液/组合物是化学上稳定的，其中新峰理解为当在相同条件下测量时，所述储存溶液的UPLC色谱图上的，未在初始UPLC色谱图上鉴定的峰(“初始”在本文中理解为制备后直接的新鲜制备的溶液)。优选地，在室温下储存3小时后出现的新峰总％面积，在相同条件下测量时，与其初始相比为至多20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％、优选至多10％。
“物理上稳定”在本文中在肽溶液和/或肽疫苗组合物的上下文提及，并且在本文中应理解为包含不沉淀或再分散的肽的溶液或组合物。能使用本领域已知的任何合适的技术评估物理稳定性，例如通过目视检查或通过使用如本文示例的Malvern Mastersizer的颗粒分布，其中平均粒度以D(0.5)表示。当如本文举例说明使用Malvern Mastersizer评估物理稳定性时，如果在室温下储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后，与其初始(即制备后直接的新鲜制备的溶液)相比，平均D(0.5)增加至多50％、40％、30％、20％、10％或5％，则定义溶液/组合物为物理上稳定。优选地，如果在室温下储存3小时后，与其初始相比，平均D(0.5)增加至多50％、40％、30％、20％、10％或5％，优选至多20％，则溶液/组合物定义为物理上稳定。
优选地，本发明的药物组合物进一步包含佐剂。术语“佐剂”在本文中指具有免疫增强作用并被添加到抗原性物质或与抗原性物质共同配制的物质，从而当施用至对象时增强、诱导、引发和/或调节针对所述抗原性物质的免疫应答。基于油的佐剂能用于形成乳剂(例如油包水或水包油乳剂)，并且在本领域中被认为可增强和指导免疫应答。在治疗性疫苗中存在这种佐剂是非常有益的。因此，本发明还提供了一种包括或由以下组成的药物组合物或药剂：本发明的重建组合物、重建的肽与基于油的佐剂，更具体地说，本发明提供了一种包含以下的药物组合物：约40-60％v/v的本发明重建组合物和约40-60％v/v的基于油的佐剂中的约0.5-10mg/mL肽。
基于油的佐剂可以是本领域已知的任何矿物质或非矿物质的基于油的佐剂。优选地，所述基于油的佐剂是基于矿物油的佐剂。基于油的佐剂的非限制性实例是基于生物的油佐剂(基于植物油/鱼油等)、基于角鲨烯的佐剂(例如MF59)、兴泰克佐剂制剂(SAF；Lidgate，Deborah M，Preparation of the Syntex Adjuvant Formulation(SAF，SAF-m，and SAF-1)，In：Vaccine Adjuvants，Volume 42of the series Methods in MolecularMedicineTM p229-237，ISSN1543-1894)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基于花生油的佐剂(例如佐剂65)、Lipovant(Byars，N.E.，Allison，A.C.，1990.Immunologicadjuvants：general properties，advantages，and limitations.In：Zola，H.(Ed.)，Laboratory Methods in Immunology.p39-51)、ASO4(A.Tagliabue，R.Rappuoli Vaccineadjuvants：the dream becomes real Hum.Vaccine，4(5)，2008，p347-349)、Montanide佐剂，其基于纯化的角鲨烯和用高度纯化的甘露醇单油酸酯乳化的角鲨烯(例如MontanideISA 25VG、28VG、35VG、50V、50V2、51VG、61VG、70VG、70M VG、71VG、720VG、760VG、763AVG、775VG、780VG、201VG、206VG、207VG)。优选地，所述基于油的佐剂是基于矿物油的佐剂。更优选地，基于油的佐剂是Montanide ISA 51VG(Seppic)，其是Drakeol VR和甘露醇单油酸酯的混合物。
优选地，所述药物组合物包含或由以下组成：构成药物剂量单位的量的肽。药物剂量单位在本文中定义为在给定时间点施加于对象的活性成分的量(即基于肽的疫苗中肽的总量)。药物剂量单位可以以单个体积施加于对象(即单个注射)，或者可以以2、3、4、5个或更多个分开的体积或注射施加，所述体积或注射优选地施加于身体的不同位置，例如在右肢和左肢。以分开的体积施加单个药物剂量单位的原因可以是多重的，例如避免负面副作用、避免抗原竞争和/或组合物分析考虑。本文应理解，药物剂量的分开的体积可在组成上不同，即可包含不同种类或组合的活性成分和/或佐剂。应理解，对于整个药物剂量单位内的所有活性成分(抗原性肽)，使用单一重建组合物，因为作为本发明的益处之一，本发明的重建组合物适于重建以及随后使用基于油的佐剂乳化不同肽混合物。单一的重建组合物，并优选单一的基于油的佐剂，使人类在重建和乳化中失败的可能性最小化。
包括总药物剂量或者在大体相同的时间点施加多次注射的情况下总药物剂量的一部分的单次注射体积或注射(即，在特定时间点在一个位置上施加的体积)，可以在100μL和2mL之间、或者在100μL和1mL之间。所述单次注射体积可以是100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL、1.6mL、1.7mL、1.8mL、1.9mL、2mL、3mL或其间的任何值。
药物剂量单位可以是有效量或有效量的一部分。“有效量”在本文中应理解为相对于未治疗患者预防和/或减轻疾病症状(例如，慢性感染、癌前病症和/或癌症)所需的活性成分的量或剂量。用于实施本发明以预防和/或治疗处理疾病或病症的活性化合物的有效量根据施用方式、对象的年龄、体重和一般健康而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这个量称为“有效”量。该有效量也可以是能够在待治疗的对象中诱导有效的细胞T细胞应答(或更优选是有效的全身性细胞T细胞应答)的量。
优选地，药物剂量单位，或在给定时间点施加(在特定时间点以单次或多次注射)于对象的肽的总量，包含肽的量的范围在0.1μg至20mg，例如约0.1μg、0.5μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg、15mg或约20mg或其间的任何值。药物剂量单位的优选范围为0.1μg至20mg、1μg至10mg、10μg至5mg、0.5mg至2mg、0.5mg至10mg或1mg至5mg或2至4mg。
优选地，所述药物组合物包含或由以下组成：在40-60％v/v的上述定义的重建组合物和40-60％v/v的基于油的佐剂中的约1-2mg/mL肽。所述药物组合物可包含或由以下组成：约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、56％、57％、58％、59％或60％v/v的基于油的佐剂。优选地，所述药物组合物包含或由以下组成：约50％v/v的上述定义的重建组合物和约50％v/v的基于油的佐剂(优选Montanide ISA 51VG(Seppic))中的约1-2mg/mL肽。换句话说，优选地，所述药物组合物包含或由以下组成：在水中的约1-2mg/mL肽、0.038M柠檬酸、约3.13％v/v丙二醇(CAS no.57-55-6)、约6.25％v/v乙醇、约3.13％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS no.61791-12-6)和约50％的基于油的佐剂，优选Montanide ISA 51VG(Seppic)。
本发明的药物组合物可能包含一种或多种进一步的免疫应答刺激化合物或佐剂。有利地，根据本发明的药剂可另外包含一种或多种合成的佐剂。这种进一步免疫应答刺激化合物或佐剂可以(i)在重建所述肽并且任选地以如上定义的基于油的佐剂乳化之后，混合到本发明的药物组合物中，(ii)可以是如上定义的本发明的重建组合物的一部分，(iii)可以与待重建的肽物理性地连接，或者(iv)可以分别施用至待治疗的对象，哺乳动物或人。在此应理解，当免疫应答刺激化合物与根据本发明的药剂混合时，将所述化合物描述为佐剂；当分开施用时，所述化合物描述为免疫调节剂或免疫调节物，这些术语在本文中可互换使用。特别优选的是已知通过Toll样受体和/或通过RIG-I(视黄酸-诱导型基因-1)蛋白和/或通过内皮素受体起作用的佐剂。能够激活先天免疫系统的免疫修饰化合物能通过Toll样受体(TLR)(包括TLR1-10)特别好地被激活。能够激活TLR受体的化合物及其修饰和衍生物在本领域中有很好的记载。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2另外可以被以下激活：革兰氏阳性细菌糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或来自宿主的热休克蛋白、和分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖。TLR3可以被dsRNA(特别是病毒来源的)或者被化学化合物poly(I:C)激活。TLR4可以被以下激活：革兰氏阴性LPS、LTA、来自宿主或来自细菌来源的热休克蛋白、病毒外壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖的透明质酸和纤连蛋白。TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可被分枝杆菌脂蛋白和B族链球菌热不稳定可溶性因子(group B Streptococcus heat labile soluble factor，GBS-F)或葡萄球菌调控蛋白激活。TLR7可以被咪唑喹啉激活，例如咪喹莫特、瑞喹莫德和衍生物咪喹莫特或瑞喹莫德(例如3M-052)。TLR9可以被未甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物激活。特别地，TLR3、TLR7和TLR9在介导针对病毒感染的先天免疫应答中起重要作用，并且能够激活这些受体的化合物特别优选在根据本发明的组合物或药剂中。特别优选的佐剂包括但不限于，包含以下的合成地产生的化合物：dsRNA、poly(I:C)、poly I:CLC、触发TLR3和TLR9受体的未甲基化CpG DNA、IC31、TLR 9激动剂、IMSAVAC、TLR 4激动剂、Montanide ISA-51、Montanide ISA 720(由Seppic，France生产的佐剂)。已知RIG-1蛋白被像TLR3一样的dsRNA激活(Kato et al，(2005) Immunity，1：19-28)。特别优选的TLR配体是pam3cys和/或其衍生物，优选pam3cys脂肽或其变体或衍生物，优选如WO2013051936A1中所述，更优选U-Pam12或U-Pam14或进一步优选的佐剂是环状二核苷酸(CDN)、胞壁酰二肽(MDP)和poly-ICLC。在优选的实施方案中，本发明的佐剂是非天然存在的佐剂，例如WO2013051936A1中描述的pam3cys脂肽衍生物、Poly-ICLC、咪唑喹啉如咪喹莫特、瑞喹莫德或其衍生物、具有非天然存在的序列的CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)，和包含非天然存在的氨基酸的基于肽的佐剂(例如胞壁酰二肽(MDP)或破伤风类毒素肽)。进一步优选的是选自由以下组成的组的佐剂：1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、ImuFact EV1P321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA50V、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel.RTM、载体系统、PLGA微粒、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、Pam3Cys-GDPKHPKSF、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Aquila’sQS21刺激子、黄酮乙酸(vadimezan)、AsA404(DMXAA)、STING(IFN基因刺激物)激动剂(例如c-di-GMP VacciGradeTM)、PCI、NKT(天然杀伤T细胞)激动剂(例如α-半乳糖基神经酰胺或α-GalCer、(Curevac)、视黄酸诱导蛋白I配体(例如3pRNA或5′-三磷酸RNA)。
如上所述，佐剂可以与所述待重建的肽物理性地连接。佐剂和共刺激化合物或官能团与如下文所定义的抗原性肽的物理连接通过以下提供增强的免疫应答：通过对抗原呈递细胞(特别是树突细胞)改善的靶向，所述抗原呈递细胞内化、代谢和展示抗原，并通过同时刺激这些细胞来上调多种共刺激分子的表达，从而成为有效的T细胞应答诱导和增强细胞。另一种优选的免疫修饰化合物是内皮素受体抑制剂，例如BQ-788(Buckanovich RJ etal.，(2008)Nature Medicine 14：28；IshikawaK，(1994)PNAS 91：4892)，和/或其衍生物。BQ-788是N-顺式-2，6-二甲基哌啶基羰基-L-γ-甲基亮氨酰-D-1-甲氧基羰基色氨酰-D-正亮氨酸。另一种优选的免疫应答刺激化合物或佐剂是干扰素α(IFNα)，更优选聚乙二醇化的干扰素α。此外，优选使用抗原呈递细胞(共)刺激分子(如WO99/61065和WO03/084999中所述)与本发明的肽和组合物组合。特别地，优选使用4-1BB和/或CD40配体、激动性抗体、OX40配体、CD27配体或其功能片段及其衍生物以及具有相似激动活性的合成化合物单独地或与本发明的肽组合给待治疗的对象施用，从而进一步刺激所述对象中最佳免疫应答的增加。
待在本发明的重建组合物中重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽，优选具有约15至约100个氨基酸的长度。优选地，所述待重建的肽长度为15-100个氨基酸，或长度为15-95个氨基酸、或15-90个氨基酸、或15-85个氨基酸、或15-70个氨基酸、或15-65个氨基酸、或15-60个氨基酸、或15-55个氨基酸、或15-50个氨基酸、或15-45个氨基酸、或15-40个氨基酸、或17-39个氨基酸、或19-43个氨基酸酸、或22-40个氨基酸、或22-45个氨基酸、或28-40个氨基酸或30-39个氨基酸。优选地，所述待重建的肽至多为100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、或30个氨基酸。优选地，所述待重建的肽至少为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。优选地，所述待重建的肽至少为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸且不超过100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个氨基酸，或这些下限和上限的任何组合。
待在本发明的重建组合物中重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽，可以是衍生自蛋白抗原的肽。“蛋白抗原”在本文中应理解为包含能够在宿主动物或人中诱导免疫应答的抗原性区域的蛋白或多肽。由感染的细胞、癌前细胞和/或癌细胞特异性表达的蛋白抗原是治疗性疫苗的合适靶标。这些蛋白抗原可以是病毒或非病毒抗原。作为预防性和治疗性疫苗靶标的病毒抗原的实例是衍生自以下的抗原：爱泼斯坦巴尔(Epstein Bar)病毒诱导的淋巴瘤(EBV)、人类嗜T淋巴细胞病毒I(Human T lymphotrophic virus I)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉疱疹病毒(Kaposi sarcoma herpesvirus，KSHV)、丙型肝炎病毒(HVC)、KSV和默克尔细胞癌病毒(Merkel cell carcinomavirus)。病毒蛋白抗原的非限制性实例是来自EBV的蛋白抗原，例如LMP1或晚膜蛋白1(例如UniprotKB P03230)和LMP2或晚膜蛋白2(例如UniprotKB P13285)；来自人类嗜T淋巴蛋白病毒I的蛋白抗原，例如，Tax蛋白(例如UniprotKB P14079；P0C213；P03409)；来自HBV(例如基因型A、B、C或D)的蛋白抗原，例如，蛋白HBsAg(例如UniprotKB Q773S4)、X-蛋白(例如UniprotKB Q8V1H6)大包膜蛋白(Large envelope protein)(例如UniprotKB P03138)和衣壳蛋白(例如UniprotKB P03147)；来自HCV的蛋白抗原，例如基因组多蛋白(例如UniprotKBP26663；Q99IB8；A3EZI9)和HCV蛋白(例如UniprotKBQ99398)；来自HPV(例如致癌基因型6、11、16或18)的蛋白抗原，例如来自KSHV的E6癌蛋白(例如UniprotKB P03126；P06463)和E7癌蛋白(例如UniprotKB P03129；P06788)；来自KSHV的蛋白抗原，例如蛋白ORF36(例如UniprotKB F5HGH5)、核心基因UL42家族蛋白(例如UniprotKB Q77ZG5)、病毒体终切蛋白UL31同系物(Virion egress protein UL31 homolog)(例如UniprotKB F5H982)、三联衣壳蛋白VP19C同系物(例如UniprotKB F5H8Y5)、病毒巨噬细胞炎性蛋白2(例如UniprotKBQ98157)、mRNA输出因子ICP27同系物(例如UniprotKB Q2HR75)、ORF52(例如UniprotKBF5HBL8)、病毒IRF4样蛋白(例如UniprotKB Q2HR73)、Bcl-2(例如UniprotKB Q76RI8)、大型被毛蛋白deneddylase(例如UniprotKB Q2HR64)、V-周期素(例如UniprotKB O40946)、VIRF-1(例如UniprotKB F5HF68)和E3泛素蛋白连接酶MIR1(例如UniprotKB P90495)和抗原蛋白默克尔细胞癌病毒，例如大T蛋白(例如UniprotKB E2IPT4；K4P159)，例如小T蛋白(例如UniprotKB B6DVX0；B6DVX6)。
作为预防性和治疗性疫苗的合适靶标的非病毒抗原可以是肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原。肿瘤特异性抗原是仅由肿瘤细胞而不是任何其他细胞表达的抗原，并且通常是突变的蛋白，例如KrasG12D和突变体P53，或由于DNA突变和故障的DNA修复机制而生成的新生抗原。肿瘤相关抗原是存在于肿瘤细胞和正常细胞中的内源性抗原，但其表达或细胞定位是失调的，例如HER-2/neu受体。可以用于治疗性疫苗的靶标的此类非病毒抗原的非限制性实例是Her-2/neu(或ErbB-2，人表皮生长因子受体2(例如UniprotKB P04626)；WT-1或Wilms肿瘤蛋白(例如UniprotKB P19544)；NY-ESO-1或癌/睾丸抗原1(例如UniprotKBP78358)；MAGE-A3或黑素瘤相关抗原A3(例如UniprotKB P43357)；BAGE或B黑素瘤抗原(例如UniProtKB Q13072)；CEA或癌胚抗原(例如UniProtKB Q13984)；AFP或α-甲胎蛋白(例如UniProtKB P02771)；XAGE-1B或X抗原家族成员1(例如UniProtKB Q9HD64)；存活素或BIRC5，含杆状病毒IAP重复蛋白5(例如UniprotKB O15392)；P53(例如UniprotKB P04637)；h-TERT或端粒酶逆转录酶(例如UniprotKB O14746)；间皮素(例如UniProtKB H3BR90)；PRAME或优先表达在肿瘤中的黑素瘤抗原(例如UniprotKB P78395)；MUC-1或粘蛋白-1(例如UniprotKB P15941)；Mart-1/Melan-A或T细胞识别黑素瘤抗原1(例如UniprotKBQ16655)；GP-100或黑素细胞蛋白PMEL(例如UniprotKB P40967)；酪氨酸酶(例如UniprotKBU3M8N0)；酪氨酸酶相关蛋白1(例如UniprotKB P17643)；酪氨酸酶相关蛋白2(例如UniprotKB O75767)；PAP或PAPOLA，Poly(A)聚合酶α(例如UniprotKB P51003)；PSA或前列腺特异性抗原(例如UniprotKB P07288)；PSMA或前列腺特异性膜抗原，或谷氨酸羧肽酶2(例如UniprotKB Q04609)。
用于肽疫苗的优选肿瘤特异性抗原靶标是病毒致癌基因和新生抗原。“新生抗原”在本文中应理解为肿瘤抗原，其产生自改变基因组编码蛋白的氨基酸序列的肿瘤特异性突变。新生抗原能通过全基因组测序来识别，所述测序阐明全部或几乎全部突变的新生抗原，其独特地存在于个体患者的癌症(或瘤形成或肿瘤)中。可以分析该突变的新生抗原的集合以鉴定一个特定的、优化的突变的新表位的子集，用作用于开发治疗病人癌症的个性化癌症疫苗的抗原来源。鉴别这类新生抗原的方法在WO2014/168874中作了描述，并其通过引用并入本文。
从抗原蛋白“衍生”的肽在本文中应理解为包含选自所述抗原蛋白的连续氨基酸序列，其可以通过缺失或取代一个或多个氨基酸、通过在N和/或C末端延伸额外氨基酸或官能团来修饰，所述修饰可改善生物利用度、靶向T细胞、或包含或释放提供佐剂或(共)刺激功能的免疫调节物质。
待重建的和/或包含于所述药物组合物中的所述肽，可包含或由非天然存在的序列组成，这是由于以下的结果：非天然长度的合成、或者包含不源自衍生所述肽的所述蛋白抗原的另外的氨基酸、和/或包含修饰的氨基酸和/或非自然存在的氨基酸和/或共价连接的官能团，如氟化基团、氟碳基团、人toll样受体配体和/或激动剂、寡核苷酸共轭物、PSA、糖链或聚糖、pam3cys和/或其衍生物(优选如WO2013051936A1所述)、CpG寡核苷酸(CpG-ODN)、环状二核苷酸(CDN)、DC脉冲盒(DC pulse cassette)、破伤风毒素衍生肽、人HMGB1衍生肽；如上所述在所述肽内或附加于所述肽。本发明的肽可包含2-氨基异丁酸(Abu，半胱氨酸的等排物)。本发明的肽的半胱氨酸可以被Abu取代。
优选地，待重建的或包含于本发明的药物组合物中的肽是分离的肽，其中“分离”不反映所述肽被纯化的程度，但表明所述肽已从其自然环境中移除(即已经受到人工操纵)，并可以是重组产生的肽或合成产生的肽。
对于医学目的使用相对短的肽是高度优选的，因为这些肽能在体外有效地合成，这对于大于约100(即95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105)个氨基酸的天然蛋白是不可能或不经济的。肽的化学合成是常规实践，并且本领域技术人员已知多种合适的方法。肽的化学合成还克服了与重组产生完整蛋白相关的问题，即难以标准化并且需要大量纯化和质量控制措施。长度超过人白细胞抗原(HLA)I类和II类表位长度的肽(例如具有在本文指定的待重建的或包含于本发明的药物组合物中的肽的长度)特别有利于用作疫苗组分，因为它们足够大以被专职抗原呈递细胞(APC)(特别是树突细胞(DC))接纳(如WO02/070006中所解释的)，并且在所含有的HLA I类呈递和HLA II类呈递表位的细胞表面呈递发生之前在DC中加工。因此，通过非抗原呈递细胞上系统呈递最小HLA I类呈递表位的不利的T细胞耐受诱导(如Toes等，Proc NatlAcad Sci(1996)USA93(15)：7855，和Toes等，Immunol(1996)156(10)：3911所示)通过施加超过人类白细胞抗原(HLA)I类和II类表位长度的肽而被阻止(如Zwaveling等，J.Immunol.(2002)169：350-358所示)。与用具有在本文指定的待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽长度的肽进行疫苗接种相比，用全长蛋白进行治疗性疫苗接种可能不那么有效(Rosalia等，Eur.J Immunol(2013)43：2554-2565)。
待重建的和/或包含在在本发明的药物组合物中的肽优选长度为约15至约100个氨基酸的肽，在本文中也称为长肽，其均超过人类白细胞抗原(HLA)I类和II类呈递表位的长度，并且其自身或混合诱导组合的CD4+和CD8+T细胞应答，该应答在治疗上是成功的并且在高百分比的患者中诱导治愈。优选地，本发明的长肽是合成肽，在本文中称为合成长肽(SLP)。
“CTL表位”在本文中理解为多肽抗原的线性片段，其通过蛋白酶体介导的蛋白分解切割从源蛋白释放出来，并随后由抗原呈递细胞(APC)(优选人抗原呈递细胞)的细胞表面上的HLA I类分子呈递。本发明的CTL表位优选能够激活CD8+T细胞应答。CTL表位通常包含至少8个至多12个、或例外地至多13个或14个氨基酸。优选地，CTL表位由8-14个氨基酸组成，即具有至少8个至多14个氨基酸的长度。
“Th细胞表位”在本文中应理解为被HLAII类分子识别的线性肽片段。Th细胞表位能够诱导CD4+T细胞应答。HLA II类限制性CD4+T辅助细胞(Th细胞)表位通常包含15至多20个，或例外地甚至更多的氨基酸。优选地，HLAII类限制性T辅助细胞表位包含10-20或10-15个氨基酸。
最优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽的Th细胞表位能够激活CD4+T辅助记忆和/或CD4+T辅助效应器应答，即激活CD45RO阳性CD4+T辅助细胞。通过由DC的CD40触发的“杀伤许可”信号的功效(Lanzavecchia(1998)Nature，393：413)，这将导致更强大的CD8+效应器和记忆细胞毒性T细胞应答。在另一种情况下，激活的CD4+T辅助细胞可以激活免疫系统的非HLA限制性杀伤细胞。
在本发明的上下文中，“包含来自蛋白抗原的至多100个连续氨基酸的肽”是指源自所述蛋白抗原并存在于如本文所定义的肽中的连续氨基酸的数目是100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个氨基酸或更少。在本发明的上下文中，“包含来自蛋白抗原的至少15个连续氨基酸的肽”是指源自所述蛋白抗原并存在于如本文所定义的肽中的连续氨基酸的数目是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多个氨基酸。在本发明的上下文中，“包含来自蛋白抗原的15-100个连续氨基酸的肽”是指源自所述蛋白抗原并存在于如本文所定义的肽中的连续氨基酸的数目是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸且不超过100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个氨基酸。更优选地，包含在待重建的肽中来自所述蛋白抗原的连续氨基酸序列的长度为15-100个氨基酸、或优选15-95个氨基酸、或15-90个氨基酸、或15-85个氨基酸、或15-70个氨基酸、或15-25个氨基酸、或15-60个氨基酸、或15-55个氨基酸、或15-50个氨基酸、甚至更优选15-45个氨基酸、甚至更优选15-40个氨基酸、甚至更优选17-39个、甚至更优选19-43个氨基酸、甚至更优选22-40个氨基酸、甚至更优选28-40个、并甚至更优选30-39个氨基酸。
优选地，根据本发明的药物组合物不包含以下两种特性均满足的任何肽：
a.碱性氨基酸残基的百分比等于酸性氨基酸残基的百分比，和
b.疏水性氨基酸残基的百分比为48％或更高。
出于该实施方案的目的，氨基酸残基被分类为“酸性”、“碱性”、“疏水性”或“中性”，如下：
氨基酸 分类
Asp 酸性
Glu 酸性
Arg 碱性
Lys 碱性
His 碱性
Ala 疏水性
Phe 疏水性
Leu 疏水性
Ile 疏水性
Val 疏水性
Tyr 疏水性
Trp 疏水性
Cys 中性
Gly 中性
Met 中性
Pro 中性
Asn 中性
Gln 中性
Ser 中性
Thr 中性
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽优选是抗原性肽。“抗原性肽”在本文中应理解为(高度)免疫原性并且当作为疫苗组合物施用于对象，优选人或动物对象时，能够诱导有效的组合的抗原指导的CD4+T辅助和CD8+细胞毒性T细胞应答。使用体外或离体测定或通过进行本领域所理解的体内试验以建立免疫原性，所述肽可被预测为免疫原性和/或可被证明为免疫原性。优选地，所述肽能有效地用于预防、部分清除和/或治疗或完全清除对象中的抗原相关疾病或病症，优选通过以下可检测：
-通过Elispot测定或通过CD4+或CD8+T细胞的四聚体染色确定的外周血中或组织中免疫系统的激活或诱导和/或抗原特异性激活的CD4+和/或CD8+T细胞的增加，或通过在治疗至少一周后流式细胞术中CD4+和CD8+T细胞的细胞内细胞因子染色确定的这些T细胞产生的细胞因子的增加；和/或
-抗原相关感染的扩散的抑制或抗原表达细胞的可检测的减少或抗原表达细胞的细胞存活能力的降低；和/或
-抗原表达细胞的细胞死亡的诱导或增加的诱导；和/或
-抑制或阻止抗原表达细胞的增加。
在优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物包含肽的组合，其中所述肽的组合涵盖至少70％、80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的HLA I类分子，所述HLAI类分子是由在待治疗的人类对象的群体中占主导的HLA等位基因编码的。HLA等位基因在待治疗的人类对象的群体中是占主导的。在根据本发明的肽中优选的HLA I类表位是能够与如下结合的表位：HLA-A0101；HLA-A0201；HLA-A0206；HLA-A0301；HLA-A1101；HLAA2301；HLA-A2402；HLA-A2501；HLA-A2601；HLA-A2902；HLA-A3001；HLAA3002；HLA-A3101；HLA-A3201；HLA-A3303；HLA-A6801；HLA-A6802；HLAA7401；HLA-B0702；HLA-B0801；HLA-B1301；HLA-B1302；HLA-B1402；HLAB1501；HLA-B1502；HLA-B1525；HLA-B1801；HLA-B2702；HLA-B2705；HLAB3501；HLA-B3503；HLA-B3701；HLA-B3801；HLA-B3901；HLA-B4001；HLAB4002；HLA-B4402；HLA-B4403；HLA-B4601；HLA-B4801；HLA-B4901；HLAB5001；HLA-B5101；HLA-B5201；HLA-B5301；HLA-B5501；HLA-B5601；HLAB5701；HLA-B5801和HLA-B5802。在优选的实施方案中，本发明的肽涵盖至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的HLAI类分子，所述HLAI类分子是由在待治疗的人类对象的群体中占主导的HLA等位基因编码的，其中“涵盖HLA I类分子”在本文中理解为包含对所述HLA I类分子显示结合亲和力的CTL表位，优选中等结合亲和力，更优选高结合亲和力。优选地，本发明的肽涵盖至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的HLA I类分子组，所述HLA I类分子组由以下组成：HLA-A0101；HLA-A0201；HLA-A0206；HLA-A0301；HLA-A1101；HLA-A2301；HLA-A2402；HLA-A2501；HLA-A2601；HLA-A2902；HLA-A3001；HLA-A3002；HLA-A3101；HLA-A3201；HLA-A3303；HLA-A6801；HLA-A6802；HLA-A7401；HLA-B0702；HLA-B0801；HLA-B1301；HLA-B1302；HLA-B1402；HLA-B1501；HLA-B1502；HLA-B1525；HLA-B1801；HLA-B2702；HLA-B2705；HLA-B3501；HLA-B3503；HLA-B3701；HLA-B3801；HLA-B3901；HLA-B4001；HLA-B4002；HLA-B4402；HLA-B4403；HLA-B4601；HLA-B4801；HLA-B4901；HLA-B5001；HLA-B5101；HLA-B5201；HLA-B5301；HLA-B5501；HLA-B5601；HLA-B5701；HLA-B5801和HLA-B5802。
所述重建组合物能用于重建单一类型的肽(即全部具有基本相同或相同的氨基酸序列)或用于具有不同氨基酸序列的不同肽的混合物。本发明的药物组合物优选包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和多达33种不同的肽。“不同的肽”在本文中应理解为具有不同的氨基酸序列，优选具有小于60％、50％、40％，或优选小于30％的序列同一性，在其整个长度上确定。待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的不同的肽可以是具有如上文所定义的长度的肽，其一起与衍生这些肽的蛋白抗原的全氨基酸序列重叠。然而，在某些情况下，用跨越全长蛋白抗原的全套重叠(合成性)长肽进行免疫是不可行的，并且需要进行选择。为了缩小疫苗中肽的数量，优先选择最具免疫原性的长肽，并合并能被最高百分比的患者识别的那些。
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽中至少一种可具有至少一个能在分子间二硫桥连的半胱氨酸残基，或者可具有至少两个能在分子内或分子间二硫桥连的半胱氨酸残基。优选地，根据本发明的疫苗组合物包含肽的组合，其中所述肽的组合涵盖至少70％、80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的HLA I类分子，所述HLA I类分子是由HLA等位基因编码的，所述等位基因在如上定义的待治疗的人类对象的群体中占主导。
在本发明的重建组合物中待重建的肽的量优选是如上文所定义的药物剂量单位和/或以单个体积注射的量。
干燥的肽可以是无其他成分的肽，但也可以包含缓冲组分(例如三氟乙酸(TFA))、盐(例如钠、钾或磷酸盐(例如NaCl、KCl和NaPO4))。其他成分的量优选小于待重建的干燥肽总重量的30％、更优选小于25％。待重建的干燥肽可以为物理干燥状态，所述状态能通过例如但不限于旋转蒸发、冻干(冷冻干燥)和喷雾干燥的工艺获得。
从中衍生出待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽的优选的蛋白抗原在下文定义。
HPV衍生的肽
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽可以是衍生自早期HPV抗原蛋白E2、E6或E7的肽(肽的混合物)。优选地，连续氨基酸序列选自来自高危HPV血清型的HPVE6和E7蛋白的全长氨基酸序列，所述血清型例如血清型16、18、31、33或45，更优选来自HPV E6和E7血清型16、18、31或33的氨基酸序列，最优选来自血清型16或18，其中16是最优选的。HPV血清型16E2(UniProtKB-P03120)、E6(UniProtKB-P03126)和E7(UniProtKB-P03129)蛋白的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：14-16。HPV血清型18E2(UniProtKB-P06790)、E6(UniProtKB-P06463)和E7(UniProtKB-P06788)蛋白的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：17-19。
优选的待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中并衍生自HPV E6和E7蛋白的肽和肽混合物如WO00/75336A2中所定义。优选的肽是包含或由以下组成的肽：SEQ ID NO：20-26中任一个所示的免疫原性区域内的连续序列。
优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的一种或多种肽包含选自SEQ ID NO：27-67所示的组的CTL表位。
优选的待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中并衍生自HPV E2、E6和E7蛋白的肽和肽混合物如WO2002/070006A2和WO2002/090382中所定义，其通过引用并入本文。优选的肽是包含或由以下HPV免疫原性区域内的连续序列组成的肽：E2(31-120)，E2(151-195)，E2(271-365)，E6(81 158)，E7(31-77)，优选是HPV16血清型的并在本文中分别由SEQID NO：68-72定义。
优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的一种或多种肽包含选自如下的Th表位：DR1/E2351-365、DR2/E2316-330、DR2/E2346-355、DR4/E251-70、E261-76、DQ6/E2311-325、DR15/E750-62、DR3/E743-77、DQ2/E735-50和DR1/E6127-142(在本文分别由SEQ ID NO：73-82表示)。
优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽包含至少一个T细胞表位，所述表位被浸润宫颈肿瘤病变的T细胞或被位于盆腔区域的淋巴结中或从盆腔区域的淋巴结分离出来的从宫颈肿瘤病变中引流的T细胞识别。优选地，所述T细胞表位存在于包含转移性肿瘤细胞的引流淋巴结中或从其分离出来。这些表位公开在例如WO2008/147187A1、US20060182762A1、WO2006013336A1、WO2009148230A2、WO2009148229A2、WO2002044384A2中，其通过引用并入本文。
在待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的优选肽中，所述连续氨基酸序列包括表位，所述表位选自由以下连续氨基酸序列组成的组，所述连续氨基酸序列选自由SEQ ID NO：83-104表示的氨基酸序列组成的组，其已经证明是被浸润宫颈肿瘤病变的T细胞或被来自引流淋巴结的T细胞识别的T细胞表位。
包含在待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽中的优选II类CD4+Th细胞表位选自由以下连续氨基酸序列组成的组，所述连续氨基酸序列选自由SEQ ID NO：83-99表示的氨基酸序列组成的组。
包含在待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽中的优选的I类CD8+CTL细胞表位选自由以下连续氨基酸序列组成的组，所述连续氨基酸序列选自由SEQ ID NO：85、82、100-104表示的氨基酸序列组成的组。
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的优选肽包含或由连续氨基酸序列组成，所述连续氨基酸序列选自由SEQ ID NO：1-13表示的氨基酸序列组成的组。
待重建的和/或包含在本发明的疫苗组合物中的优选的肽混合物是以下的肽混合物：具有至少1、2、3、4或5种肽，所述肽包含或由选自SEQ ID NO：1-5的序列组成；具有至少1、2、3、4、5或6种肽，所述肽包含或由连续氨基酸序列组成，所述连续氨基酸序列选自由SEQID NO：1-6表示的氨基酸序列组成的组；和具有至少1、2、3、4、5、6或7种肽，所述肽包含或由连续氨基酸序列组成，所述连续氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7-13代表的氨基酸序列的组。优选地，药物组合物包含具有序列SEQ ID NO：1-5或SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：7-13的肽的混合物。优选地，混合物中的不同肽以基本相等的比例存在于药物组合物中。
HBV衍生的肽
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽可以是衍生自多种基因型的肽(的混合物)，例如，来自HBV-A蛋白、HBV聚合酶(UniProtKB-P03159)、HBV核心蛋白(UniProtKB-P0C625)、HBV X蛋白和HBV表面大蛋白(UniProtKB-P03141)，这些肽在本文中由SEQ ID NO：105-108表示。优选的肽、肽的混和这些肽中存在的表位已公开在如WO2015/187009、WO2014/102540A1、WO93/03753、WO95/03777、US2010/0068228A1、US2009/0311283A1中公开，其通过引用并入本文。
优选地，一种或多种待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：109-146组成的组的氨基酸序列。
优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：109、113、118、121、122、126、129、132、133、134、135、138和142组成的组的肽，更优选选自由SEQ ID NO：109、113、118、121、122、126、129、132、133、135、138和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ ID NO：113、118、121、122、126、129、132、133、134、135和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ ID NO：113、118、121、122、126、129、132、133、135和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ ID NO：118、121、129、132、133和142组成的组的肽，最优选选自由SEQ ID NO：133、142和121组成的组的肽。优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的一种或多种肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：109、118、121、122、126、129、132-135组成的组的肽。优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的一种或多种肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：122、129和133组成的组的肽。
待重建的和/或包含在本发明的疫苗组合物中的优选的肽的混合物是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32以及多达33种不同的肽的肽混合物，所述不同的肽为由以下组成或包含以下的肽：选自由SEQ ID NO：109-146组成的组的肽，更优选选自由SEQ ID NO：109、113、118、121、122、126、129、132、133、134、135、138和142组成的组的肽，更优选选自由SEQ ID NO：109、113、118、121、122、126、129、132、133、135、138和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ IDNO：109、113、118、121、122、126、138和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ ID NO：113、118、121、122、126、129、132、133、134、135和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQID NO：113、118、121、122、126、129、132、133、135和142组成的组的肽，甚至更优选选自由SEQ ID NO：118、121、129、132、133和142组成的组的肽，最优选选自由SEQ ID NO：133、142和121组成的组的肽。进一步优选的是包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和至多33种不同的肽的组合物，所述不同的肽为由以下组成或包含以下的肽：选自由SEQ ID NO：109、118、121、122、126、129、132-135组成的组的肽，更优选选自由SEQ ID NO：121、129和133组成的组。进一步优选的待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的混合物为包含肽的混合物，所述肽包含或由以下组成：SEQ ID NO：121的肽，其组合包含或由以下组成的肽：SEQ ID NO：139、140、133、139、142、118、129中的至少一个；以及包含肽的混合物，所述肽包含或由以下组成：SEQ IDNO：133的肽，其组合包含或由以下组成的肽：SEQ ID NO：139、140、63、139、142、118、129中的至少一个。优选地，所述混合物中的所述不同的肽以基本相等的比例存在于所述药物组合物中。
PRAME-衍生的肽
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽可以是衍生自PRAME(UniProtKB-P78395)的肽(肽的混合物)，所述PRAME在本文中由SEQ ID NO：147表示。优选的肽、肽的混合物和这些肽中存在的表位已公开在例如WO2008/118017A2中，其通过引用并入本文。优选地，待重建的一种或多种肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：148-167所定义的氨基酸序列组成的组的肽。优选的待重建的和/或包含在本发明的疫苗组合物中的肽的混合物是选自SEQ ID NO：148-167中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽的混合物。
优选地，待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的一种或多种肽包含选自SEQ ID NO：168-169的Th表位。
p53衍生的肽
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽可以是衍生自P53(例如UniprotKB P04637)的肽(的混合物)，所述P53在本文中由SEQ ID NO：190表示。优选的肽、肽的混合物和这些肽中存在的表位已公开在例如WO2008/147186A2中，并通过引用并入本文。优选地，待重建的一种或多种肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：191-211所定义的氨基酸序列组成的组的肽，更优选选自由SEQ ID NO：191-204所定义的氨基酸序列组成的组的肽。
优选的待重建的和/或包含在本发明的疫苗组合物中的肽的混合物是选自SEQ IDNO：191-211的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽的混合物。
PSMA衍生的肽
待重建的和/或包含在本发明的药物组合物中的肽可以是衍生自PSMA(例如UniprotKB Q04609)的肽(的混合物)，所述PSMA在本文中由SEQ ID NO：212表示。优选的肽、肽的混合物和这些肽中存在的表位已公开在例如WO2013/006050A1中，并通过引用并入本文。优选地，待重建的一种或多种肽包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：213-232所定义的氨基酸序列组成的组的肽。
优选的待重建的和/或包含在本发明的疫苗组合物中的肽的混合物是选自SEQ IDNO：213-232的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肽的混合物。
在优选的抗原蛋白、待重建的肽和这些肽中的表位中还包含与本文定义的任何特异性抗原蛋白、肽和表位显示出基本相同性的抗原蛋白、肽和表位。序列相同性在本文定义为通过比较序列来确定的两个或多个氨基酸序列(多肽或蛋白)之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示由这些序列的字符串之间的匹配所确定的氨基酸序列之间的序列关联程度。根据两个序列的长度，通过使用全局或局部比对算法比对两个肽能确定序列的相同性。长度相似的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)来比对，该算法使序列在整个长度上最优地比对，而长度大部分不同的序列优选使用局部比对算法(例如SmithWaterman)来比对。当它们(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时)共享至少一定最小百分比的序列相同性(如下定义)时，序列可然后被称为“基本相同”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在其全部长度(全长)比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。当两个序列具有相似长度时，全局比对适合用于确定序列相同性。一般地，使用GAP默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于蛋白，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可以使用计算机程序确定序列比对和百分比序列相同性的分数，所述程序例如，GCGWisconsin Package，版本10.3，可获得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA，或使用开源软件，如EmbossWIN2.10.0版本中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(无论是“needle”还是“water”，默认GAP开放罚分为10.0，并且默认空位延伸罚分为0.5；默认的评分矩阵是针对蛋白的Blosum62)。当序列在总长度大部分不同时，优选局部比对(例如使用Smith Waterman算法的那些)。
或者，可以通过使用诸如FASTA，BLAST等算法搜索公共数据库来确定百分比相同性。因此，本发明的蛋白序列能进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，例如，识别其他家族成员或相关序列。能使用Altschul，等人.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTp和BLASTx程序(版本2.0)进行这样的搜索。能用BLASTx程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，能利用Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，能使用各个程序(例如BLASTx和BLASTp)的默认参数。参见National Center for Biotechnology Information的主页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。
与与其相关的本文定义的抗原蛋白、肽或表位表现出实质相同性的抗原蛋白、肽或表位，在本文理解为与本文中提到的任何一个特定序列，基于所述特定序列的全长(即，在其整个长度上或作为一个整体)，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的相同性。
医疗用途
提供一种预防或治疗持续性或慢性感染、癌前病症和/或癌症的方法。也就是说，提供了用于作为药剂的，优选用于预防或治疗持续性或慢性感染、癌前病症和/或癌症的如上文所定义的本发明的药物组合物。这种方法或用途包含以下步骤：将本发明药物组合物施用于需要这种预防和/或治疗的对象。需要预防和/或治疗的对象也可以指患者，并可以指动物，例如哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类、牛类、马类、犬类、羊类或猫类。
优选地，提供了如上文所定义的药物剂量单位。也如上文所述，该药物剂量单位可以以单次注射一次给予或在不同位置施用多个体积来给予。例如，药物剂量单位可以分成两次注射，每次施用在待治疗的对象的两条腿或臂中的一条。所述两次注射可包含相同或不同的肽的混合。例如，第一次注射可包含SEQ ID NO 1-5或SEQ ID NO：1-6，并且第二次注射可包含SEQ ID NO 7-13，其中两次注射均在单个时间点或基本上单个时间点施用，其中基本上单个时间点应理解为至多约15分钟内，优选最多2分钟内。
所述单次或多次注射的施用可以进行一次，或者可选地可以随后重复，例如但不限于每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每年一次、每两年一次、每五年一次、或每十年一次。
优选地，所述药物组合物以上述定义的有效量施用。优选地，本发明的药物组合物用于静脉内或皮下或肌肉内施用，尽管能设想其他施用途径，例如粘膜施用或真皮内(intradermal)和/或皮内(intracutaneous)施用或瘤内施用，例如通过注射。本发明的药物组合物可以单次施用来施用。可选地，如需要可以重复所述施用和/或可以依次施用不同的肽或肽的混合或包含不同肽或肽的混合的组合物，其中依次可以是按时间和/或位置。
优选地，所述药物组合物是疫苗组合物，所述疫苗组合物用于诱导对包含在肽中的至少一个表位的T细胞应答。优选地，所述疫苗用于预防、部分清除和/或治疗或完全清除对象中的与抗原相关的疾病或病症，例如，持续性感染、癌的(瘤形成)或癌前的疾病，优选通过以下检测：
-通过Elispot测定或通过CD4+或CD8+T细胞的四聚体染色确定的外周血中或组织中免疫系统的激活或诱导和/或抗原特异性激活的CD4+和/或CD8+T细胞的增加，或通过在治疗至少一周后，流式细胞术中CD4+和CD8+T细胞的细胞内细胞因子染色确定这些T细胞产生的细胞因子的增加；和/或
-抗原相关感染的扩散的抑制或抗原表达细胞的可检测的减少或抗原表达细胞的细胞存活能力的降低；和/或
-抗原表达细胞的细胞死亡的诱导或增加的诱导；和/或
-抑制或阻止抗原表达细胞的增加。
通过本发明的方法待预防的和/或治疗的癌症的实例包括但不限于宫颈上皮内瘤样形成(CIN)、外阴上皮内瘤形成(VIN)、阴道上皮内瘤形成(VaIN)、肛门上皮内瘤形成(AIN)、和阴茎上皮内瘤形成(PIN)、以及宫颈、外阴、阴道、肛门、阴茎、上呼吸消化道、和头和颈部的癌；肝癌、白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如霍奇金病、非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链性疾病和实体瘤如肉瘤和癌(如纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilm′s tumor)、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
本发明的方法可以是组合疗法的一部分，其可以作为分开的治疗或添加到本发明的药物组合物中提供。本发明的方法可以与以下联合：检查点控制阻断剂、靶向肿瘤选择的TNF受体家族成员的单克隆抗体(mAb)(例如CD40、4-1 BB/CD137、OX-40/CD134、和CD27)、免疫抑制细胞因子(例如IL-10、TGF-β和IL-6)和/或γC细胞因子(如IL-7、IL-15和IL-21或IL-2)、IDO(吲哚胺2，3-双加氧酶)抑制剂、沙利度胺和/或其衍生物、其他免疫调制剂(例如已知消耗免疫抑制性Treg和/或MDSC的化合物)、标准护理治疗，例如，化学疗法、放射疗法、手术、IFN-α调理、抗病毒疗法、抗菌疗法、UV疗法、抗炎疗法等。在治疗或预防癌前病症或癌症的情况下，所述基于肽的疫苗可以与放疗和/或化疗(例如用卡铂、紫杉醇、CarboTaxol(卡铂、紫杉醇的组合)和/或顺铂治疗)联合。例如，本发明的方法可以是化疗方案的一部分，其中化疗方案每三周施加一次。优选地，在化疗的第二或第三周期的两周后施用本发明的药物组合物的首次药物剂量单位。
重建方法
还提供了重建干燥的，优选冻干的肽的方法，包括以下后续步骤：
a)提供包含干燥的，优选冻干的肽的小瓶；
b)融解所述肽，优选约5-30分钟；
c)将本发明的重建组合物加入到含有所述肽的所述小瓶，优选不涡旋小瓶；
d)允许混合，优选混合约0.5-5分钟；和
e)涡旋直至获得澄清溶液，涡旋优选约1-3分钟。
优选地，步骤b)至e)在室温下进行。
进一步提供了一种制备药物组合物的方法，包括后续步骤：
(i)在第一注射器中收集通过如上定义的重建干燥的肽的方法可获得的重建的肽；
(ii)使用连接器将步骤(i)的所述第一注射器连接到包含基于油的佐剂的第二注射器上；
(iii)将所述第一注射器的内容物推入所述第二注射器再回推
(iv)在约10-50秒内重复步骤(iii)总共约10-50次。
优选地，步骤(i)至(iv)在室温下进行。
在用于重建干燥的肽的方法中的步骤e)中获得的所述澄清溶液本文中应理解为包含重建的肽的重建组合物，其能用作起始材料，即在用于制备药物组合物的方法的步骤(i)中作为“重建的肽”。
优选地，所述小瓶中所述干燥，优选冻干的肽，并且用作重建干燥的肽的方法的步骤a)的起始材料，是如上文定义的肽，即作为待重建的肽和/或包含在本发明的药物组合物中的肽。优选地，所述小瓶包含在预防和/或治疗方法中以单个体积注射的量的肽，优选如本文所定义的治疗和/或预防方法，即单个药物剂量单位，或如果在基本相同的时间点在所述对象身体的不同部位进行多次注射，则为所述量的部分。可选地，步骤a)中所述小瓶中干燥的肽的量超过在所述方法中以单个体积注射的量。例如，所述小瓶内的肽的量可以是以单个体积注射的量的两倍。在后一种情况下，在制备药物组合物(如本发明的药物组合物)的方法中，可以将重建的体积的一半量与一定量的基于油的佐剂混合，以便最终得到用于在治疗或预防的方法中注射的单一体积的药物组合物，或者，可选地，可以将重建的体积的总量与一定量的基于油的佐剂混合，以便最终得到两个体积的用于注射的药物组合物。
优选地，在重建肽的方法的步骤b)中的所述肽在室温下融解约5-30分钟、或10-30分钟，例如5、10、15、20、25或30分钟，或之间的任何值。
优选地，在重建肽的方法的步骤d)中的所述混合是在室温下基本上不涡旋或搅拌所述小瓶优选约0.5-2分钟，例如0.5、1、1.5或2分钟。换言之，优选地允许步骤d)中的所述肽在静置时与所述重建组合物混合。
通过涡旋直到获得澄清溶液进行重建肽的方法的步骤e)中的涡旋。如所指出的，优选进行约1-3分钟。然而，对于某些肽，需要更长或更短的涡旋时间。然而，应该优选在20分钟内获得澄清溶液。因此，所述涡旋可以在1至20分钟、1至10分钟、1至5分钟或1至3分钟的范围内进行，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20分钟，或其间的任何值，优选直到目测获得澄清溶液。
用于重建肽的方法的步骤c)的所述重建组合物和用于制备药物组合物的方法的步骤(ii)的所述基于油的佐剂如本文前面所定义。优选地，步骤c)中的重建组合物的量为约0.5和2mL的范围内，优选1mL。优选地，步骤(i)中重建的肽的量是在步骤e)之后，即在步骤e)之后获得的澄清溶液中，获得的重建的肽的量。然而，如上所述，可选择地使用更少量。优选地，在步骤(ii)至(iv)中将该重建组合物的体积与基于油的佐剂以约2∶1至约1∶2的比例混合，例如2∶1、1.9∶1、1.8∶1、1.7∶1、1.6∶1、1.5∶1、1.4∶1、1.1∶1、1∶1、1∶1.9、1∶1.8、1∶1.7、1∶1.6、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2或1∶1.1，优选1∶1的重建组合物：基于油的佐剂。
(ii)中的连接器可以是本领域中适合的任何连接器，以连接两个注射器使得允许在这两个注射器之间交换流体，例如但不限于T和I连接器。重复(iv)可约10-50次，例如但不限于10、15、20、25、30、45、50次，或其间的任何值。
组合试剂盒
此外，提供了组合试剂盒(kit of parts)，包括：
1.第一小瓶，含有干燥的，优选冻干的肽，其中优选所述肽是如上文定义的肽；
2.第二小瓶，含有本发明的重建组合物；并且，任选地，
3.第三小瓶，含有基于油的佐剂，优选如上文所定义。
优选地，所有组分，即干燥的肽，重建组合物和基于油的佐剂，是无菌的和/或药物级的或临床级的。优选地，这些组分使用Good manufacturing practice(GMP)制造并具有欧洲药品管理局和食品和药品管理局所定义的GMP质量。
优选地，所述第一小瓶储存在一定温度下使所述重建组合物至少1个月、2个月、3个月、6个月或1年或甚至2年是稳定的。优选地，所述温度在-25℃至25℃之间、或在-23℃至-18℃之间、或在0℃至10℃之间、或在2℃至8℃之间、或在18℃至23℃之间。优选地，所述第二小瓶储存在一定温度下使所述重建组合物至少1个月、2个月、3个月、6个月或1年或甚至2年是稳定的。优选地，所述温度在-25℃至25℃之间、或在-23℃至-18℃之间、或在0℃至10℃之间、或在2℃至8℃之间、或在18℃至23℃之间...优选地，所述第三小瓶储存在一定温度下使所述重建组合物至少1个月、2个月、3个月、6个月或1年或甚至2年是稳定的。优选地，所述温度在-25℃至25℃之间、或在-23℃至-18℃之间、或在0℃至10℃之间、或在2℃至8℃之间、或在18℃至23℃之间。优选地，所述第一、第二和第三小瓶以相同的温度储存。
任选地，所述组合试剂盒进一步包括描述重建如上文定义的干燥的肽的方法、储存条件、制备如上文定义的药物组合物的方法的手册和/或储存第一、第二和/或第三小瓶的手册。另外，所述组合试剂盒可包括管理待制备的药物组合物的手册。优选地，第一、第二和/或第三小瓶的体积为至多50mL、优选0.1至10mL之间、优选1至10mL之间，例如0.5、1、2、3、4、5或10mL，或其间的任何值。小瓶在此理解为能具有任何形状的容器。任选地，小瓶在本文中应理解为注射器。任选地，所述第一小瓶能通过主动操作过程以连接器连接到所述第二小瓶，以允许所述重建组合物接触和溶解所述肽。任选地，所述第二小瓶能随后连接到所述第三小瓶，以允许包含所述肽的所述重建组合物与所述基于油的佐剂混合。任选地，所述组合试剂盒进一步包括一个或多个连接器(例如T-连接器)，和/或注射装置(例如针头)。优选地，第一文件中的肽的量，第二文件中的重建组合物的量和/或第三文件中基于油的佐剂的量都如在重建肽的方法中和/或本文前面定义的制备药物组合物的方法中定义。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其连词以其非限制性含义使用，以表示包括该词后面的内容，但不排除未具体提及的内容。另外，通过不定冠词“一个”对元素的引用不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“一个”通常意味着“至少一个”。
当与数值(例如约10)结合使用时，词语“约”或“近似”优选地表示该值可以是该值的给定值(10)或多或少浮动0.1％。
本文提供的序列信息不应狭窄地解释为需要包含错误识别的碱基。本领域技术人员能够识别这些错误识别的碱基并且知道如何校正这些错误。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均通过引用完整地并入本文。
附图简述
图1：在三种不同溶剂混合物中溶解后2小时并在室温下储存的DP-6P(包含由SEQID NO：1-6代表的SLP)的UPLC色谱图。A)DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μL聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)；B)溶于20％v/v DMSO/水中的DP-6P(2.40mg总肽)；C)溶于含10mM二硫苏糖醇(DTT)的20％v/vDMSO/水中的DP-6P(2.40mg总肽)。
图2：在两种不同溶剂混合物中和在溶解后两个时间点(t＝0和t＝2h)的DP-6P(包含由SEQ ID NO：1-6表示的SLP)的UPLC色谱图。两种溶剂混合物均含有丙二醇、乙醇、水和稳定剂或还原剂。A)t＝0时，DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：600μL水、267μL丙二醇、133μL乙醇和1mg/mL抗坏血酸B)在t＝2h，DP-6P(2.40mg总肽)溶解于以下的混合物：600μLWFI、267μL丙二醇、133μL乙醇和1mg/mL抗坏血酸；C)在t＝0时，将DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophorEL；D)在t＝2h，将DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL。
图3：两种不同溶剂混合物中DP-6P(包含SEQ ID NO：1-6所示的SLP)的UPLC色谱图。所有溶剂混合物每mL含有：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和吐温20或Cremophor EL(62.5μL)。A)在t＝0时DP-6P(2.40mg总肽)溶解于包含吐温20的溶剂混合物中；B)在t＝2h时DP-6P(2.40mg总肽)溶解于包含吐温20的溶剂混合物中；C)在t＝0时DP-6P(2.40mg总肽)溶解于包含Cremophor EL的溶剂混合物中；D)在t＝2hDP-6P(2.40mg总肽)溶解于包含Cremophor EL的溶剂混合物中。
图4：用Montanide ISA 51 VG重建和乳化后的DP-6P(包含由SEQ ID NO：1-6代表的SLP)和DP-7P(包含由SEQ ID NO：7-13代表的SLP)的UPLC色谱图。用于重建的溶剂混合物每mL包含：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和Cremophor EL(62.5μL)。在分析之前，通过加入过量的溶剂混合液并通过离心强制分离相从乳剂中提取肽。A)在t＝0时(在疫苗制备和提取后立即)DP-6P(2.4mg总肽)溶解于包含Cremophor EL的1mL溶剂混合物中；B)在t＝2h(储存疫苗产品2小时后，然后提取)DP-6P(2.4mg总肽)溶解于1mL包含Cremophor EL的溶剂混合物中。C)在t＝0时(在疫苗制备和提取后立即)DP-7P(2.8mg总肽)溶解于1mL包含Cremophor EL的溶剂混合物中；D)t＝2h时(储存疫苗产品2小时后，然后提取)DP-7P(2.8mg总肽)溶解于1mL包含Cremophor EL的溶剂混合物中。
图5：使用两种不同浓度的柠檬酸的DP-6P乳剂之间的粒度分布比较(叠加)。将DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：750μL水中的0.05M或0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL，并随后用1mL Montanide ISA51VG乳化。
图6：DP-6P乳剂(包含由SEQ ID NO：1-6表示的SLP)之间的粒度分布比较(叠加)。将DP-6P(2.40mg总肽)溶于以下的混合物：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL，随后用1mL Montanide ISA51VG乳化。A)在t＝0时的三次独立(重复)制备(prep1、prep2和prep3)，表明乳化方法的稳健性。B)在t＝0(preplt0h和preplt2h)和t＝2h(prep2t0h和prep2t2h)的两次独立(重复)制备，证明乳化方法的稳健性以及乳剂在室温下至少2小时的使用中的物理稳定性。
图7：TC-1肿瘤实验的时间表。
图8：用以下疫苗接种小鼠中的TC-1肿瘤的发展：(A)仅以Montanide 1∶1乳化40％v/v DMSO/WFI(DMSO)，(B)仅以Montanidel：1乳化重建(Rec.)组合物(750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL)(Rec.composition)或用(C)由SEQID NO：6表示的SLP和CpG ODN1826溶解于以Montanide 1∶1乳化的40％v/v DMSO/WFI(DMSO+SLP)或(D)由SEQ ID NO：6代表的SLP和CpG ODN1826溶解于以Montanide1∶1乳化的重建(Rec.)组合物中(750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophorEL)(Rec.composition+SLP)。
图9：以下的Kaplan-Meier图(存活曲线)(A)和诱导的Db-RAYNIVTF(四聚体)阳性CD8+T细胞百分比(B)：第一组以TC-1肿瘤挑战的小鼠，并随后以仅以Montanide 1：1乳化40％v/v DMSO/WFI(DMSO)疫苗接种，第二组以TC-1肿瘤挑战的小鼠，并随后以仅以Montanide1：1乳化重建(Rec.)组合物(750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL)(Rec.composition)疫苗接种，第三组以TC-1肿瘤挑战的小鼠，并随后以由SEQ ID NO：6表示的SLP和CpG ODN1826溶解于以Montanide 1：1乳化的40％v/vDMSO/WFI(DMSO+SLP)疫苗接种，以及第四组以TC-1肿瘤挑战的小鼠，并随后以由SEQ IDNO：6代表的SLP和CpG ODN1826溶解于以Montanide 1∶1乳化的重建(Rec.)组合物中(750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophorEL)(Rec.composition+SLP)疫苗接种。星号表示显著性差异(非配对t检验，p＝0.022)；ns表示无显著差异(p＝0.21)。
图10：P53DP-5P(包含由SEQ ID NO：191、193、194、201和203表示的SLP)的UPLC色谱图。用每mL含有以下的溶剂混合物重建P53DP-5P：750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和Cremophor EL(62.5μL)。在分析之前，通过加入过量的溶剂混合物并通过离心强制分离相从最终产物乳剂中提取肽。A)在t＝0时(即疫苗制备和提取后立即)，P53DP-5P(2.0mg总肽)溶解于1mL包含有Cremophor EL的溶剂混合物中；B)在t＝2时(储存疫苗产品2小时后，然后提取)，P53DP-5P(2.0mg总肽)溶解于1mL包含Cremophor EL的溶剂混合物中。
实施例
实施例1
引言
该研究的目的是找到一种适合于涉及肽药物产品HPV-DP-6P和HPV-DP-7P的溶解的多性肽HPV疫苗产品的重建方法，之后用Montanide ISA51VG乳化。先前的研究表明，在DMSO/WFI制剂中，含有一个或多个半胱氨酸残基的肽具有形成二硫化物的强烈倾向。为了改善药物产品的化学稳定性并防止肽的二硫化物形成，开发了一种新的无DMSO的重建溶液，用于重建两种药物产品。这种新的重建溶液应该能够溶解药物产品并产生以MontanideISA51VG的稳定的乳剂。二硫化物形成应该是最小的。
该研究包括四个级别的分析：
1.筛选合适的溶剂组合以重建药物产品，通过目测监测肽的溶解。
2.监测以Montanide的药物产品乳剂的乳剂稳定性。通过目测和通过分析乳滴的粒度来评估稳定性。
3.分析在级别1和2成功的溶剂中重建后药物产品的化学稳定性。
4.使用在级别1、2和3成功的溶剂分析重建和乳化后药物产品的化学稳定性。为此目的，将肽溶解、以Montanide ISA 51 VG乳化，然后从乳剂中提取和肽组合物的分析。
材料
使用以下冻干的肽组合物：包含在本文中由SEQ ID NO：1-5表示的肽的DP-5P，每小瓶0.40mg每种肽(每小瓶的蛋白总量为2.00mg)以相等净重和每瓶0.56mg TFA混合；包含本文中由SEQ ID NO：1-6表示的肽的DP-6P，每小瓶0.40mg每种肽(每小瓶的蛋白总量为2.40mg)以相等净重和每瓶0.67mg TFA混合；以及包含在本文中由SEQ ID NO：7-13表示的肽的DP-7P，每小瓶0.40mg每种肽(每小瓶的蛋白总量为2.80mg)以相等净重和每瓶0.96mgTFA混合。
使用以下化学品：Cremophor EL(Sigma Aldrich，Kolliphor EL，C5135)；丙二醇或PG(≥99.5％，Sigma Aldrich，W294004)乙醇或EtOH(Absolute，VWRPh Eur，BP，USP.Article#1.00986.1000)；柠檬酸或CA(≥99％，Sigma Aldrich C1909)；MilliQ水(来自EQP-063)；无菌Montanide ISA 51VG(SEPPIC，batch#14V011)。
使用以下设备：注射器推入装置(Discofix-3T-connector，B.Braun)；耐DMSO注射器(2mL NORM-JECT Luer Lock，Henke Sass Wolf)；Waters UPLC/MS系统；Ma1vemMastersizer 2000；Protein Simple MFI 5200flowcell。
方法
溶解
将它们加入到冻干的药物产品前，通过混合有机溶剂和水溶剂来制备重建组合物。将1mL多种重建组合物加入药物产品中，并允许混合物静置5分钟，同时打旋溶液数次。通过目测评估物理稳定性。使用UPLC/MS评估化学稳定性(参见下面的药物产品溶液的化学稳定性)。
以Montanide乳化
形成视觉上澄清的药物产品溶液的溶剂组合用于以Montanide ISA51 VG的乳化实验中。除非另有说明，根据表1中的方案进行重建和乳化。这里指明，注射器A和B的内容物的混合以不同方式进行。表3中对程序的这些改动在表4和表5的结果部分中指出。
表1：药物产品(DP)的重建和乳化。
用于测试乳剂稳定性的激光衍射实验
通过目测和通过使用Malvern Mastersizer 2000分析粒度分布来监测乳剂稳定性。
对于粒度分析，以水或以水溶液中的0.01M柠檬酸进行乳剂的稀释，以获得所需的遮蔽程度。使用搅拌器以1750rpm的速度将Montanide与包含重建的DP的重建组合物混合，并施加1.46的折射率。基于体积的分布，粒度分布以D(0.5)和D(0.9)表示。
用于测试乳剂稳定性的微流成像(MFI)
使用微流成像作为粒度分析的第二技术用于评估乳剂稳定性。在分析之前，通过将一滴乳剂加到10mL 0.01M柠檬酸水溶液中并混合至匀质，然后将该溶液用水以1∶100稀释来制备乳剂的稀释液。在一次运行中持续0.68分钟或每次百万粒子，在0.20mL的清理体积中测量样品。结果以等效圆直径(ECD)表示。
药物产品溶液的化学稳定性
对于显示完全溶解且乳剂稳定性>2小时的样品，用在联接使用WatersAcquity柱(类型：BEH130，C18，1.7μm，2.1x 150mm)的Waters TQD质谱仪的WatersAcquityUPLC系统上的UPLC/MS，监测药物产品溶液的化学稳定性(无额外稀释)。以Masslynx 4.1软件进行数据处理。在220nm下进行UV检测，并且流动相为水中的0.05％TFA和1％ACN(缓冲液A)和ACN中的0.05％TFA(缓冲液B)，流速为0.3mL/min。柱温为65℃，并且自动进样器温度为5℃。使用5μL的注射体积，并应用表2的梯度曲线。
在梯度的总长过程中进行UV检测，并且在阳性模式下从2-30分钟进行质谱分析。
为了分析药物产品溶液的化学稳定性，至少在溶解后2小时，在多个时间点分析样品。
表2：UPLC/MS的梯度曲线。
HPV-DP-6P和HPV-DP-7P疫苗乳剂在使用中的化学稳定性
对于显示完全溶解、乳剂稳定性>2小时、并且药物产品溶液(无额外稀释)的化学稳定性>2小时的样品，以UPLC/MS监测以Montanide ISA 51VG的疫苗乳剂在使用中的化学稳定性。为了分析重建和乳化的药物产品的化学稳定性，至少在溶解后2小时在多个时间点分析样品。使用额外的样品制备步骤从疫苗乳剂中提取肽，根据上述用于药物产品溶液的化学稳定性的方法进行UPLC/MS分析。对于乳化的产品的样品制备，应用以下步骤：
-取300μL重建溶液，并加其于15mL Greiner管中
-加入100μL庚烷
-加入200μL药物产品乳剂。上下吸移溶液三次。
-将混合物涡旋30秒
-以4400rpm离心混合物5分钟以获得两相系统
-使用20-200μL移液器，从底层取100μL样品，并转移至全回收UPLC小瓶。
-根据描述的用于药物产品溶液的化学稳定性的方法用UPLC/UV/MS分析。
结果
用于重建和乳化的溶剂筛选
筛选溶剂以确定包括水性和有机部分的重建组合物，所述组合物适合于重建冻干的肽，并形成化学和物理稳定的以Montanide的乳剂。以下所有实验均用DP-6P进行。使用DP-5P和DP-7P验证实验，但由于数据具有高度可比性，此处仅显示DP-6P的数据。通过目测评估该筛选中重建蛋白和乳剂的物理稳定性。
作为有机部分，测试了各种各样的有机溶剂。当与WFI(注射用水)混合时，唯一能够完全溶解DP-6P的单一有机溶剂是NMP(表3)。然而，当使用NMP/WFI作为重建组合物时，不能获得以Montanide的稳定乳剂。使用盐水代替WFI略微改善了乳剂的稳定性，但仍然不能以可重复的方式获得稳定性≥2h的乳剂。
表3：DP-6P溶解的溶剂筛选。
水溶液 有机1 肽溶解度 乳化稳定性
600μLWFI 400μL甘油 颗粒 NA
600μLWFI 400μL PG 澄清粘性溶液 NA
600μLWFI 400μLEtOH 颗粒 NA
WFI 100-20％DMF 颗粒 NA
800μLWFI 200μLNMP 澄清溶液 匀质＜1h
800μL WFI，0.9％NaCl 200μLNMP 澄清溶液 匀质＜2h
重建中的有机溶剂混合物
没有鉴定出与WFI组合使DP-6P完全溶解的单一有机溶剂。因此，在重建组合物中筛选丙二醇和其他溶剂的组合作为有机部分。通过目测评估物理稳定性。使用UPLC/MS评估化学稳定性。
尽管仍未观察到DP-6P的完全溶解，但鉴定的用于溶解DP-6P的最可选的溶剂组合是与WFI一起作乳化剂的乙醇、丙二醇和Cremophor EL的混合物(图1)。
为了在限制二硫化物形成同时进一步改善溶解过程，评估了向溶剂混合物(乙醇、丙二醇、Cremophor EL和WFI的混合物)和肽溶液中加入几种抗氧化剂和还原剂的效果。用UPLC/MS分析化学稳定性以监测二硫化物形成的程度。添加DTT(与肽相比为35摩尔当量)或抗坏血酸(WFI中的0.1-1％溶液)不会使二硫化物形成减少，而向溶剂混合物中添加0.05-0.1M水性柠檬酸溶液，使DP-6P的溶解度改善以及在药物溶解后2小时，每二硫化物的有限二硫化物形成面积％值≤1％。由于肽溶解性差，pH3以及浓度0.05-0.1M的柠檬酸盐缓冲液不能用于乳化(数据未显示)。图2显示了DP在以下两种混合物中重建的化学稳定性(t＝0和t＝2h)：水中的1mg/ml抗坏血酸、丙二醇和乙醇的混合物，对比水中的0.1M柠檬酸、丙二醇、乙醇和Cremophor EL的混合物。
重建后和随后的乳化后测试重建组合物
不太优选在疫苗制剂中Cremophor EL作为乳化剂，因为有报道在较高剂量下有副作用。然而，吐温80、环糊精和Triton X作为Cremophor EL的替代物的溶解和乳化性能都不足(数据未显示)。用丙二醇、乙醇、WFI中的柠檬酸和2％吐温20的组合经目测获得了有希望的结果。表4为乳化实验结果的总结，显示包含丙二醇和乙醇与Cremophor EL或吐温20组合的乳剂结果是最稳定的乳剂。然而，看来DP-6P和DP-7P溶液的化学稳定性在存在吐温20代替Cremophor EL中显著更差，即在药物产品溶解后2小时每二硫化物的面积％值超过5％(DP-6P的UPLC色谱图见图3；DP-5P和DP-7P的结果高度相似(数据未显示)。
总之，从表4和图3中呈现的数据能得出结论，基于产品的物理和化学稳定性，Cremophor EL优选与Montanide一起作为DP-6P乳剂的乳化剂。
为了证明药物产品在溶液中化学稳定性获得的结果能译为为药物产品在疫苗乳剂中的使用中的化学稳定性，研究了DP-6P和DP-7P疫苗乳剂的使用中的稳定性，并且结果示于图4A、B、C和D。这些结果证实，在乳化步骤之后，保留了药物产品在疫苗制剂中的化学稳定性。
表4：以预混合的有机和水溶剂(1mL)筛选溶剂。
乳化中为了稳健的微调
肽溶解度和乳剂稳定性
进行随后的一系列实验，其中改变PG/EtOH/Cremophor EL的比例，测试两种不同浓度的柠檬酸溶液，应用不同的乳化方法并改变混合物中有机vs水性组分的比例。通常，通过将它们加入冻干的药物产品之前混合有机和水性溶剂来制备1mL重建组合物。随后，通过使用表5和6中所示的不同混合步骤和/或连接器将1mL Montanide加入1mL水性肽溶液中来制备乳剂。
表5：使用不同重建组合物的乳化方法的变化：
A＝800μL0.05M柠檬酸和200μLPG/EtOH/Cremophor EL(1：1：2)；
B＝800uL0.05M柠檬酸和200μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)；
C＝750μL0.1M柠檬酸和250μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)；
D＝750μL0.1M柠檬酸和250μLPG/EtOH/Cremophor EL(1：2：1)；和，
E＝700μL0.1M柠檬酸和300μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)。
*慢循环：每循环2秒。快循环：每个循环1秒。
更详细的肽乳剂稳定性：通过激光衍射的PSD分析
对于五种不同的重建组合物，使用Malvem Mastersizer 2000，用激光衍射分析不同乳化方法对粒度的影响。对于所有样品，先通过混合有机和水性溶剂制备1mL重建组合物，然后将它们加入到冻干的药品中。随后，将1mL Montanide加到1mL水性肽溶液中来制备乳剂。有机和水相的混合以三种不同的方式进行：
-使用T-连接器过程并进行表6中所示的混合循环；
-使用I-连接器并进行表6中所示的混合循环；或，
-向含有重建组合物中的肽溶液的小瓶中加入1mL Montanide，并在30秒内涡旋混合物。
表6中给出了结果的汇总。给出了D(0.5)的近似值(基于体积的分布)。
表6：使用不同重建组合物的乳化肽制剂特征和平均D(0.5)值：
A＝600μL0.1M柠檬酸和400μLPG/EtOH/CremophorEL(5：4：2)；
B＝750μL0.1M柠檬酸和250μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)；
C＝750μL0.1M柠檬酸和250μLPG/EtOH/Cremophor EL(1：2：1)；
D＝775μL0.1M柠檬酸和225μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)；和，
E＝800μL0.1M柠檬酸和200μLPG/EtOH/Cremophor EL(2：1：1)。
*观察到在WFI中稀释或在0.01M柠檬酸溶液中稀释的分析中PSD的变化
从表5和表6均看来用不同的混合方法和/或不同类型的连接器之间没有观察到乳剂稳定性的差异。然而，涡旋混合物代替使用连接器使得乳剂中具有更大的粒度，这对稳定性不太有利。通常，具有较小粒度的乳剂更稳定。
此外，通过增加有机部分(混合物)在重建组合物总体积中的百分比来改善乳剂稳定性。然而，此处测试的有机内容物的最高体积(300-400μL)导致药物产品的溶解度降低。因此，有机内容物的最佳为每mL(约250μL)重建组合物200至300μL。此外，柠檬酸溶液的浓度(0.05或0.1M)的变化似乎不影响乳剂稳定性，而当使用0.1M柠檬酸溶液时，获得稍微更好的DP-6P溶解性。
使用微流成像的粒度分析
为了更详细地研究柠檬酸浓度对乳剂稳定性和乳剂粒度的影响，使用以1mLMontanide乳化后产生最小粒径的溶剂(即具有有机相与水相的比例为1∶3的重建组合物，其中有机相含有PG、EtOH和Cremophor EL的比例为1∶2∶1的PG与EtOH与Cremophor EL (表6))比较另外的粒度分析实验。其中改变水相中柠檬酸的摩尔量(0.05和0.1M柠檬酸，即重建组合物中柠檬酸的最终浓度分别为0.038和0.075M柠檬酸)，进行直接比较实验。将DP-6P溶解在1mL这样的重建组合物中，然后使用T-连接器过程以1mL Montanide乳化并进行50个快混合循环。在这些实验中，分析了药物产品的溶解和粒度以及乳剂稳定性。作为读出，使用MFI 5200进行微流成像(MFI)，以便用相机可视化颗粒，从而能在视觉上研究不规则。柠檬酸重建组合物的0.05和0.1M柠檬酸的PSD比较显示在图5中。
从图5中能看出，柠檬酸溶液的浓度不影响乳剂的PSD。然而，当使用0.1M柠檬酸时，药物产品的溶解略好。图6显示了DP-6P乳剂的三种独立制剂(图6，图A)或在制备后两个不同时间点分析的两种独立制剂(图6、图B)的MFI结果，其中药物产品已经使用相同的溶剂组合(750μL 0.05M柠檬酸+250μLPG/EtOH/Cremophor EL1∶2∶1)重建。均获得了非常稳健的PSD结果。此外，乳剂均稳定至少2小时。
优选的重建溶剂和乳化方法在DP-6P和DP-7P上的应用
由于750μL柠檬酸溶液+250μLPG/EtOH/Cremophor EL1∶2∶1显示给出DP-6P乳剂的稳健PSD结果，并且使用0.1M柠檬酸使得药物产品有最佳溶解，该溶剂组合被广泛测试用于制备DP-6P和DP-7P乳剂中。
根据表1中的说明制备DP-6P和DP-7P乳剂。简言之，加入1mL重建组合物(750μL0.1M柠檬酸+250μLPG/EtOH/Cremophor EL 1∶2∶1)到冻干的药物产品，所得溶液使用T-连接器与1mL Montanide混合并施加50个快混合循环。MFI分析的PSD值以ECD(等效圆直径)给出，并给出基于数值的分布。应该注意的是，MFI和激光衍射是互补技术。因此，通过激光衍射和通过MFI获得的平均粒度值不能直接进行比较。
表7：DP-6P粒径D(0.5)值(μm)。
表8：DP-7P粒径D(0.5)值(μm)。
表7和8显示通过使用包含750μL0.1M柠檬酸+250μLPG/EtOH/Cremophor EL 1∶2∶1的重建组合物(即750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophorEL)能制备稳定至少3小时的DP-6P和DP-7P乳剂。
实施例2
引言
先前已经证明在携带已建立的TC-1肿瘤小鼠中SLP疫苗接种与CpG1826组合的治疗功效，所述肿瘤表达HPV16的致癌E6和E7蛋白(Zwaveling等，J.Immunol。(2002)169：350-358)。为了评估SLP是否在实施例1中鉴定的最佳制剂(750μL 0.1M柠檬酸+250μLPG/EtOH/Cremophor EL 1：2：1)中保留功能，我们对携带TC-1肿瘤的小鼠治疗地疫苗接种含有Db限制性CTL表位RAHYNIVTF(本文中由SEQ ID NO：67表示)的SLP，所述SLP在DMSO/WFI或新型重建组合物中重建。随后将所有疫苗在Montanide中乳化。监测肿瘤发展75天。在疫苗诱导的T细胞应答的峰值处，在血液中确定RAHYNIVTF特异性CD8+T细胞的百分比和表型。在DMSO/WFI和新的重建组合物中重建的SLP在诱导TC-1肿瘤消退中显示出相似的效力。以在新型溶液中重建的SLP疫苗接种的小鼠在血液中显示出更高百分比的RAHYNIVTF特异性CD8+T细胞。
材料
表9：在TC-1肿瘤实验期间应用的材料。
材料 原产地/供应商
C57BL/6雌性小鼠，6-8周龄 Harlan实验室
Montanide ISA VG51 Seppic；batch 2384535/U40740；exp 13FEB17
CpG ODN1826(5mg/ml) Invivogen；cat no tlrl-1826
DMSO Mylan；10t nr 140706；exp JUN2017
WFI Fresenius Kabi；W0054B03；exp 6MAR18
KLRG1-PeCy7 eBioscience；cat nr 25-5893-82
CD62L-Alexa780 eBioscience；cat nr 47-0621-82
CD44-Pacific Blue BioLegend；cat nr 103020
CD127-生物素 eBioscience；cat nr 13-1271-85
CD8a-Alexa700 eBioscience；cat nr 56-0081-82
CD3-V500 BD；cat nr 560771
链霉亲和素-Qdot605 ThermoFischer；cat nr Q10101MP
7-AAD存活能力染色 ThermoFisher，cat nrA1310；exp 22SEP16
Db-RAHYNIVTF四聚体 LUMC的产物
胰酶 Gibco(Life Technologies)cat nr 25200-056
遗传霉素(G418) Gibco(Life Technologies)cat nr 10131-027
BSA Roche Diagnostics；cat nr 10735078001
裂解缓冲液 LUMC Pharmacy
T-连接器Discofix C B Braun；16494C
NORM-JECT Luer-lock 2ml注射器 HSW；4010-000V0
NORM-JECT Luer-lock 1ml注射器 HSW；4010-200V0
BD Microlance 3；25G(0.5x16mm) BD；cat nr 300600
一次性用品 多种；LUMC
方法
疫苗制备
研究中包括以下组小鼠：
第1组：(n＝5)以MontanideVG51以1∶1乳化的40％v/v DMSO/WFI。
第2组：(n＝5)以Montanide ISAVG51以1∶1乳化的重建组合物(每毫升750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCermophorEL)。
第3组：(n＝10)以Montanide ISA VG51以1∶1乳化的溶于40％v/v DMSO/WFI中的SLP GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR和20μg CpG ODN1826/小鼠。
第4组：(n＝10)以Montanide ISAVG51以1∶1乳化的溶于重建组合物(每毫升750μL水中的0.1M柠檬酸、62.5μL丙二醇、125μL乙醇和62.5μLCremophor EL)的SLP GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(SEQ ID NO：6)和20μgCpGODN1826/小鼠。
对于第1组中的小鼠，通过混合400μL DMSO和600μL WFI并随后打旋来制备溶液。将溶液取入2mL Luer-Lock注射器(注射器A)中。在另一个2mL Luer-Lock注射器(注射器B)中，取1mLMontanide ISA VG51，然后将两个注射器连接到T-连接器上。来回广泛混合内容物产生乳剂。混合后，断开注射器并将25G针头放在含有乳剂的注射器上。每只小鼠左侧皮下注射100μL。
为第2组制备的疫苗以相同的方式制备，仅不同于使用重建组合物(750μL水中的0.1M柠檬酸和250μL PG/EtOH/Cremophor EL 1∶2∶1，即水中的0.075M柠檬酸、6.25％v/v丙二醇CAS no.57-55-6、12.5％v/v乙醇和6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35CASno.61791-12-6)代替DMSO和WFI。首先将含有1.5mg SLP(本文以SEQ ID NO：6(GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR)表示)的小瓶的内容物溶解于400μL DMSO中来制备第3组的疫苗。通过Fmoc固相肽合成(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，APracticalApproach，W.C.Chan，P.D.White Eds，Oxford Univ.Press 2000)产生SLP。然后，将520μLWFI和80μL CpG ODN1826(储液5mg/m1)加入到DMSO中的肽中。用2mL Luer-Lock注射器取该溶液后，在如第1组以Montanide ISA VG51乳化之后为相同的疫苗制备方案。第4组的疫苗制备与第3组的方案相同，仅在第一步中不同，其中将含有1.5mg SLP SEQ ID NO：6的小瓶的内容物溶解于920μL重建组合物中并加入80μL CpG ODN1826(储液5mg/m1)。
治疗性疫苗接种
表达HPV16的致癌E6和E7蛋白的TC-1肿瘤细胞在完全IMDM培养基中培养，补充有400μg/ml遗传霉素。在第0天，用胰蛋白酶收获TC-1细胞，并用PBS/0.1％BSA洗涤3次。收获后直接在40只雌性C57BL/6小鼠的右侧注射100，000个TC-1细胞。第8天，如疫苗制备部分所述，在所有小鼠左侧s.c.疫苗接种。在肿瘤挑战后长达75天，使用卡尺每周至少监测两次所有小鼠的肿瘤大小。该研究如图7所示进行。
测量血液中T细胞应答的强度
在疫苗接种后第9天，所有小鼠尾静脉抽取血液。将血液样品转移到96孔培养板中并以1600rpm离心5分钟。将血细胞沉淀悬浮在裂解缓冲液中直至观察到橙色来裂解红细胞。随后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，并用荧光抗体、上述材料部分中提到的Db-RAHYNIVTF-APC四聚体和7-AAD染色。在冰上孵育30分钟后，洗涤细胞并在Leiden大学医学中心(风湿病学部门)的BD LSRII流式细胞仪上分析。
结果
疫苗接种组之间的肿瘤发展相似
通过每周至少两次监测肿瘤大小，能为每只小鼠创建生长曲线。在图8中，显示了不同组的肿瘤发展。在用SLP 6和CpG1826疫苗接种的所有小鼠中观察到肿瘤消退。仅接受载体的对照组(DMSO/WFI和Montanide，或重建组合物和Montanide)中的肿瘤迅速生长。除了自然变异外，在两个SLP疫苗接种组之间没有观察到清晰的差异。关于Kaplan-Meier存活图，参见图9A，显示疫苗接种组之间没有差异。
疫苗诱导的四聚体阳性CD8+T细胞
图9B显示诱导的Db-RAYNIVTF(四聚体)阳性CD8+T细胞的百分比。第4组中的小鼠(重建组合物+SLP)显示四聚体阳性CD8+T细胞应答增强，表明在重建组合物中配制的SLP和CpG在引发鼠特异性CD8+T细胞方面比在DMSO/WFI和Montanide的乳剂中配制的SLP和CpG更有效。每组的平均百分比和标准偏差，请参阅表9。
使用非配对t检验确定显著差异，结果为第3和4组之间的p值为p＝0.022。
KLRG1和CD62L的表达表明在接种SLP6后有良好的抗肿瘤表达谱
Van Duikeren等人的一项研究(JImmunol，2012；189(7)：3397-403)旨在鉴定与诱导有效抗肿瘤应答相关的参数。通过鉴定此类生物标志物，能在具有肿瘤模型预后价值的非荷瘤小鼠中测试不同的疫苗组合物。作者发现一方面KLRG1的表达与CD62L表达的缺失和一方面有效的抗肿瘤免疫应答之间的相关性。我们使用流式细胞术确定疫苗接种后第9天疫苗接种的小鼠血液中表达KLRG1和表达CD62L的Db-RAHYNIVTF+CD8+T细胞的百分比。在第3组和第4组之间没有观察到RAHYNIVTF特异性KLRG1+CD62L-CD8+T细胞百分比的差异。没有检测到足够的RAHYNIVTF特异性CD8+T细胞来可靠地研究仅用载体疫苗接种的小鼠组(第1和2组)中KLRG1和CD62L的表达。每组的平均百分比和标准偏差参见表10。
表10：用SLP疫苗接种的小鼠的组中四聚体+CD8+T细胞的平均酚比和SD，以及四聚体+CD8+T细胞的CD62L和KLRG1的表达的平均值和百分比。*表示通过非配对t检验确定的第3组和第4组之间有显著性差异(p＜0.05)。
讨论
在溶于DMSO/WFI或重建组合物中的SLP 6疫苗接种的小鼠组之间没有观察到总体肿瘤发展的差异。我们确实观察到与溶解在DMSO/WFI中的SLP疫苗接种的小鼠组相比，用溶解在重建组合物中的SLP疫苗接种的小鼠中，特异性CD8+T细胞的诱导增强。
Montanide的辅佐特性归因于抗原贮库的形成、局部炎症和细胞死亡的诱导，这有利于抗原呈递细胞的成熟。溶解于重建组合物中的SLP疫苗接种的小鼠组中四聚体+CD8+T细胞的诱导增强表明该溶液与Montanide的组合构成具有有益抗原释放特性或抗原呈递细胞的局部刺激的乳剂。在用SLP疫苗接种的两组小鼠之间，KLRG1表达和CD62L缺失的有利情况相似。数据表明，与最初使用的重建组合物(DMSO/WFI)相比，本发明的重建组合物中重建的SLP维持其免疫原性能力。
实施例3
材料
使用以下冻干的肽组合物：
P53DP5P：包含本文中由SEQ ID NO：191，193，194，201和203表示的肽。
使用以下化学品：Cremophor EL(Sigma Aldrich.Kolliphor EL)；丙二醇(≥99.5％.Sigma Aldrich)；无水乙醇(Eur.BP.USP)；柠檬酸(≥99％.Sigma Aldrich)；MilliQ水；无菌Montanide ISA 51VG(SEPPIC.)
使用以下设备：注射器推入装置(Discofix-3T-连接器.B.Braun)；耐DMSO注射器2mL NORM-JECT Luer Lock.Henke Sass Wolf)；Waters UPLC/MS系统EQP-004；ProteinSimple MFI 5200
方法
如表1中所述进行疫苗乳剂和安慰剂乳剂的制备。
如实施例1中描述了包括从疫苗乳剂中提取肽的分析HPV-DP-6P和HPV-DP-7P疫苗乳剂的使用中的化学稳定性方法的部分所述，通过UPLC-MS进行化学稳定性分析，。
通过微流成像进行粒度分析。在分析之前，通过将10μL乳剂加入到10mL重建溶液中并混合至匀质，然后在重建溶液中以1：500稀释该溶液来制备疫苗乳剂的稀释。
MFI 5200的分析设置：
·方法：DS500.2
·样品体积：1mL
·清理体积：0.20mL
·分析：0.68分钟或1.000.000颗粒
·连续运行：1
结果以等效圆直径(ECD)表示，并给出基于数值的分布。从结果中过滤出≥15μm的颗粒，因为已知这些颗粒是人工制品而不是乳剂颗粒。
结果
重建的药物产品的纯度
不同时间点药物产品的纯度计算如下：
纯度(％)＝100％-杂质总和≥0.05％面积
表11中给出了P53-DP-5P疫苗产品在使用中的纯度的概述。
表11：在室温储存期间重建的P53-DP-5P的纯度概述。
从表11中能看出，药物产品的纯度缓慢降低，但在疫苗制备后两小时仍然≥90.0％。在t＝0和t＝2h时疫苗的UPLC分析的实例色谱图示于图10中。
使用质谱法进行面积≥1.0％面积的主峰和杂质的鉴定。通过比较测量m/z值与肽序列的分子量及其已知和预期的修饰，报告并鉴定面积≥1.0％面积的所有相关物质。表12中给出了P53-DP-5P在使用中储存长达3小时的相关物质的结果概述。
表12：重建的P53-DP-5P的相关物质的概述和鉴定。重建后长达3小时的使用中的稳定性。
从乳剂中回收药物产品
通过比较乳化和非乳化的样品信号来验证从乳剂回收的P53-DP-5P中存在的五种肽。表13给出了结果的概述。
表13：通过比较乳化和非乳化样品信号的回收的概述。
物理稳定性
通过MFI的粒度分析分析物理稳定性。结果以等效圆直径(ECD)表示。平均粒度值在表14中给出，由基于数值的分布计算。
表14：P53 DP5P疫苗乳剂的平均粒度(ECD，μm)
结论
对含有5个衍生自P53抗原的SLP的混合物(P53DP-5P)成功进行溶解。
研究了疫苗产品的化学和物理使用中的稳定性。表11中总结的P53DP-5P的相关物质分析和纯度计算显示，疫苗制备后两小时药物产品的纯度≥90.0％。仅观察到一种峰面积％≥1％的相关物质。MS鉴定显示该峰是SEQ ID NO：203所示肽的分子内二硫化物。
通过用MFI监测其粒度来研究P53DP-5P疫苗产品的物理稳定性。粒度分析的结果总结在表14中，并显示在疫苗制备后直至3小时粒度不变。此外，在稳定性研究期间通过目测监测所有疫苗产品，并且在任何时间点均未观察到相分离。
实施例4
材料与方法
使用以下冻干的肽组合物：
PRAME DP5P：包含本文中由SEQ ID NO：153、155、156、160和166表示的肽：
根据UPLC的保留时间、氨基酸组合物的变化和由目测确定的重建溶液中的溶解，筛选出了一组5种PRAME衍生的肽。
使用的其他材料和方法与实施例3中的相同。
结果
重建的药物产品的纯度
计算出在不同的时间点的药物产品的纯度如下：
纯度(％)＝100％-杂质总和≥0.05％面积
表15中给出了PRAME-DP-5P疫苗产品的使用中的纯度的概述。应该注意，冻干的PRAME-DP-5P的纯度已经低于90％。然而，纯度的下降随时间非常有限，这表明该重建药物产品的良好的化学稳定性。
表15：在室温下储存期间重建的PRAME-DP-5P的纯度的概述。
纯度随时间的低的降低表明了高的化学稳定性。在重建之前，PRAME-DP-5P中面积≥1.0％面积的杂质已经存在于混合物中。由于在该稳定性研究中未观察到这些杂质的显著增加，因此未进行杂质的鉴定。表16给出了PRAME-DP-5P在使用中储存长达3小时的相关物质的概述。
表16：重建的PRAME-DP-5P的相关物质的概述和鉴定。重建后长达3小时的使用中的稳定性。
从乳剂中回收药物产品
通过比较乳化和非乳化的样品信号来验证从乳剂中回收PRAME-DP-5P中存在的五种单独的肽。表17给出了结果的概述。
表17：通过比较乳化和非乳化样品信号的回收的概述。
结论
PRAME DP-5P的纯度不太令人满意(＜90％)，但重建疫苗产品纯度的下降非常有限(纯度T＝082.9％，T＝3h 82.2％)，证实了本文描述的组合物的益处。
序列表
<110> ISA制药有限公司
<120> 肽疫苗制剂
<130> P6060608PCT
<150> EP16175215.9
<151> 2016-06-20
<160> 232
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
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Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 2
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
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Ile Val Thr
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
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Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
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Glu Glu Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 4
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
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Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
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<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 6
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
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Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
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Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
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Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
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Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
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<223> 肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
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Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
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<400> 13
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
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Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 14
<211> 365
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 14
Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1 5 10 15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
35 40 45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
50 55 60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
100 105 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
115 120 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
130 135 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
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His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
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Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
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Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
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Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
210 215 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
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Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
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Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
260 265 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
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Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg
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Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305 310 315 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
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Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
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Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
355 360 365
<210> 15
<211> 158
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 15
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
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Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
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<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 16
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Lys Pro
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<211> 365
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒18型
<400> 17
Met Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu Arg Leu Ser Cys Val Gln
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Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp Ser Lys Asp Ile Asp Ser
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Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val Lys Gln Leu Gln His Thr
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Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val Gly Thr Ala Lys Thr Tyr
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Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly His Cys Gly Leu Ala Glu
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Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu Leu Gly Ala Ala Thr Pro
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Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys Ser Gly Asn Thr Thr Pro
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Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr
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Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg Asp Ile Ser Ser Thr Trp
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His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr Gly Ile Leu Thr Val Thr
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Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe Leu Asn Thr Val Ala Ile
340 345 350
Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr Met Thr Met
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<211> 158
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒18型
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Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
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Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
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Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
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Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu
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Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His
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Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg
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Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
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<211> 105
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒18型
<400> 19
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
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Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
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Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
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Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
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Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
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<211> 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 20
Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
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His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu
20 25 30
<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 21
Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr
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Arg Asp Gly Asn Pro Tyr
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
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Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln
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Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
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Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr
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<220>
<223> 肽
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Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys
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Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys
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Ser Gln Lys
<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 27
Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 28
Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 29
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Arg Cys Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 33
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 34
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 35
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu
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<220>
<223> 肽
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Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg
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<211> 9
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<213> 人工序列
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Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
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<213> 人工序列
<220>
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Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val
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Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg
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Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr
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<213> 人工序列
<220>
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Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr
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Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr
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<213> 人工序列
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Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
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<213> 人工序列
<220>
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Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys
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<220>
<223> 肽
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Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
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Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 48
Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu
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Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu
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Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp
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<220>
<223> 肽
<400> 54
Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 55
Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 56
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
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<223> 肽
<400> 57
Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr
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<400> 58
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Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr
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Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val
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Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
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Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
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Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys
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Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
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<220>
<223> 肽
<400> 68
Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala
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Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu
20 25 30
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Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu
50 55 60
Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile
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Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln
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<223> 肽
<400> 69
Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr
1 5 10 15
Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys
20 25 30
Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys
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<223> 肽
<400> 70
Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr
1 5 10 15
Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg
20 25 30
Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr
35 40 45
Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val
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Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
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<220>
<223> 肽
<400> 71
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
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Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
20 25 30
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Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
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Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
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<220>
<223> 肽
<400> 72
Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu
1 5 10 15
Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp
20 25 30
Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg
35 40 45
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<220>
<223> 肽
<400> 73
Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
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<223> 肽
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<223> 肽
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<223> 肽
<400> 76
Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys
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Asn Lys Ala Leu
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Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln
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Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn
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<400> 80
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
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Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
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Asp Ile Arg
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Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
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<223> 肽
<400> 83
Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu
1 5 10 15
Gln Thr Thr Ile His Asp
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<223> 肽
<400> 84
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe
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Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala
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<223> 肽
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Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr
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<223> 肽
<400> 86
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
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Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
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<220>
<223> 肽
<400> 87
Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe
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Tyr Ser Lys Ile Ser Glu
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<220>
<223> 肽
<400> 88
Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys
20 25 30
Asp
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<223> 肽
<400> 89
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn
20
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<223> 肽
<400> 90
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro
1 5 10 15
Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20
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<220>
<223> 肽
<400> 91
Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg
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Gly Arg Trp Thr Gly Arg
20
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<220>
<223> 肽
<400> 92
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 93
Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp
1 5 10 15
Glu Ile Asp Gly Pro Ala
20
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<211> 22
<212> PRT
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<220>
<223> 肽
<400> 94
His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Cys Val Gln Ser Thr
20
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<220>
<223> 肽
<400> 95
Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 96
Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu Asn His Gln Val Val Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Asn Ile Ser Lys Ser Lys
20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 97
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
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Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly
20
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 98
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
20 25 30
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<211> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 99
Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu Glu
1 5 10 15
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 100
Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 101
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 102
Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 103
Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 104
Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn
1 5
<210> 105
<211> 845
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 105
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Gly Thr Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp
20 25 30
Ala Asp Leu His Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu
35 40 45
Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Ser Thr Val Pro Ile Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser
65 70 75 80
Phe Pro Lys Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile
100 105 110
Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Thr His Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Asp Gln Val Val Asn His Tyr Phe
130 135 140
Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr
145 150 155 160
Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser
165 170 175
Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Ile Lys Thr Ser Gln
180 185 190
Arg His Gly Asp Glu Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser
195 200 205
Arg Ser Ser Val Gly Pro Cys Ile Arg Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg
210 215 220
Leu Gly Leu Gln Pro Arg Gln Gly Arg Leu Ala Ser Ser Gln Pro Ser
225 230 235 240
Arg Ser Gly Ser Ile Arg Ala Lys Ala His Pro Ser Thr Arg Arg Tyr
245 250 255
Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Asp His Ser Val Asn
260 265 270
Asn Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr
275 280 285
Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val
290 295 300
Glu Phe His Cys Leu Pro Pro Asn Ser Ala Gly Ser Gln Ser Gln Gly
305 310 315 320
Ser Val Ser Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys
325 330 335
Ser Glu Tyr Cys Leu Ser His Leu Val Asn Leu Arg Glu Asp Trp Gly
340 345 350
Pro Cys Asp Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro
355 360 365
Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn
370 375 380
Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly
385 390 395 400
Ile Ser Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser
405 410 415
Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val
420 425 430
Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His
435 440 445
Leu Leu Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser
450 455 460
Ser Asn Ser Arg Ile Asn Asn Asn Gln Tyr Gly Thr Met Gln Asn Leu
465 470 475 480
His Asp Ser Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Met Leu Leu Tyr
485 490 495
Lys Thr Tyr Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu
500 505 510
Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu
515 520 525
Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro
530 535 540
His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
545 550 555 560
Ser Val Gln His Arg Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu
565 570 575
Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly
580 585 590
Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Ile Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu
595 600 605
Pro Gln Asp His Ile Val Gln Lys Ile Lys His Cys Phe Arg Lys Leu
610 615 620
Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly
625 630 635 640
Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu
645 650 655
Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser
660 665 670
Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Ser Lys Gln Tyr Met Asn Leu Tyr Pro
675 680 685
Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr
690 695 700
Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr
705 710 715 720
Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys
725 730 735
Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser
740 745 750
Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys
755 760 765
Thr Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser
770 775 780
Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Ser
785 790 795 800
Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Gln Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser
805 810 815
Leu Tyr Ala Val Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Val Arg Val
820 825 830
His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
835 840 845
<210> 106
<211> 214
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 106
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80
His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr
85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp
100 105 110
Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Ile Arg Gln
115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
130 135 140
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro
180 185 190
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln
195 200 205
Ser Arg Glu Ser Gln Cys
210
<210> 107
<211> 154
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 107
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly Ala Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Ala Asp
35 40 45
His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu
65 70 75 80
Thr Thr Val Asn Ala His Gln Ile Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg
115 120 125
Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser
130 135 140
Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala
145 150
<210> 108
<211> 400
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 108
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Val
35 40 45
Lys Asp Asp Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Arg Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His
115 120 125
Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His
145 150 155 160
Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Met Glu
165 170 175
Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly
180 185 190
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser
195 200 205
Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly
210 215 220
Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro
225 230 235 240
Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile
245 250 255
Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu
260 265 270
Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr
275 280 285
Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly
290 295 300
Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn
305 310 315 320
Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu
325 330 335
Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro
340 345 350
Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala
355 360 365
Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser
370 375 380
Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
385 390 395 400
<210> 109
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 109
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Gly Thr Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu
20 25 30
<210> 110
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 110
Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Val Pro Ile Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro Lys
20 25 30
Ile His Leu
35
<210> 111
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 111
Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr
1 5 10 15
Pro Thr His Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr
20 25 30
Tyr
<210> 112
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 112
Tyr Pro Thr His Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro
1 5 10 15
Tyr Tyr Pro Asp Gln Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr
20 25 30
Leu
<210> 113
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 113
Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp
1 5 10 15
Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe
20 25 30
Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp
35
<210> 114
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 114
Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile
1 5 10 15
Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro
20 25 30
Tyr Ser Trp
35
<210> 115
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 115
Asp Gln Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr
1 5 10 15
Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Phe
<210> 116
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 116
Ser Gln Ser Gln Gly Ser Val Ser Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg
1 5 10 15
Asn Ser Lys Pro Cys Ser Glu Tyr Cys Leu Ser His Leu Val Asn Leu
20 25 30
<210> 117
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 117
Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ser Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser
20 25 30
Leu
<210> 118
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 118
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
1 5 10 15
Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
20 25 30
Ile Gly Ser Ser Gly Leu
35
<210> 119
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 119
Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr
1 5 10 15
His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Ile Gly Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Ser Arg Tyr
35
<210> 120
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 120
Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His
1 5 10 15
Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg
20 25 30
Tyr
<210> 121
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 121
His Asp Ser Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Met Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu
20 25 30
Gly Phe
<210> 122
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 122
Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val
1 5 10 15
Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val
20 25 30
Val Leu Gly Ala
35
<210> 123
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 123
Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg
1 5 10 15
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
20 25 30
Gly Ala
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 124
Arg Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn
20 25 30
Phe Met
<210> 125
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 125
Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly
1 5 10 15
Tyr Ile Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Asp His Ile Val Gln
20 25 30
Lys Ile
<210> 126
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 126
Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala
1 5 10 15
Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Ser Lys Gln Tyr Met
20 25 30
Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg
35
<210> 127
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 127
Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Ser Lys Gln Tyr Met Asn Leu Tyr Pro
20 25 30
Val Ala Arg
35
<210> 128
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 128
Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu
20 25 30
<210> 129
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 129
Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Thr
1 5 10 15
Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala
20 25 30
Leu Asn Pro Ala Asp Asp
35
<210> 130
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 130
Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Thr Ala Asn Trp
1 5 10 15
Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro
20 25 30
Ala Asp Asp Pro
35
<210> 131
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 131
Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Thr
1 5 10 15
Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala
20 25 30
Leu Asn Pro Ala
35
<210> 132
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 132
Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val
1 5 10 15
Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
20 25 30
Phe Gly Arg
35
<210> 133
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 133
Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe
1 5 10 15
Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
20 25 30
Ile Leu
<210> 134
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 134
Ala Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Ala Asp His Gly Ala
1 5 10 15
His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly
20 25 30
Pro
<210> 135
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 135
Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala
1 5 10 15
Arg Arg Met Glu Thr Thr Val Asn Ala His Gln Ile Leu Pro Lys Val
20 25 30
Leu His Lys
35
<210> 136
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 136
His Gln Ile Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser
1 5 10 15
Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe
20 25 30
Lys Asp Trp
35
<210> 137
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 137
Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His
20 25 30
Lys Leu
<210> 138
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 138
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp
35
<210> 139
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 139
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
20 25 30
Leu Leu Asp Tyr
35
<210> 140
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 140
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu
1 5 10 15
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
20 25 30
Gln Trp Phe Val
35
<210> 141
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 141
Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val
1 5 10 15
Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val
20 25 30
<210> 142
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 142
Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val
20 25 30
<210> 143
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 143
Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu
20 25 30
Trp Val Tyr Ile
35
<210> 144
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 144
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe
1 5 10 15
Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
20 25 30
<210> 145
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 145
Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro
1 5 10 15
Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
20 25 30
<210> 146
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 146
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr
1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Tyr Lys Glu
35
<210> 147
<211> 509
<212> PRT
<213> 人类
<400> 147
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu
35 40 45
Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg
50 55 60
His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys
65 70 75 80
Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr
85 90 95
Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val
100 105 110
Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser
115 120 125
His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr
130 135 140
Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu
165 170 175
Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe
180 185 190
Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu
195 200 205
Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys
210 215 220
Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu
245 250 255
Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala
260 265 270
Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
275 280 285
Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val
305 310 315 320
Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu
325 330 335
Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser
340 345 350
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
355 360 365
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
370 375 380
Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
420 425 430
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
435 440 445
Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His
450 455 460
Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val
465 470 475 480
Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr
485 490 495
Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
500 505
<210> 148
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 148
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Ser
<210> 149
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 149
Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser Leu
1 5 10 15
Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro Arg
20 25 30
Glu Leu Phe
35
<210> 150
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 150
Pro Glu Pro Thr Ile Asp Glu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His Ser Gln Thr Leu Lys Ala
20 25 30
Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr
35 40
<210> 151
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 151
Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu Pro Leu Gly
1 5 10 15
Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe Lys Ala Val
20 25 30
Leu
<210> 152
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 152
Cys Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu
20 25 30
Val Arg Pro
35
<210> 153
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 153
Leu Glu Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gln Glu Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg
20 25 30
Lys
<210> 154
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 154
Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn
1 5 10 15
Ser His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu
20 25 30
Tyr
<210> 155
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 155
Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val Asp Gly Leu
20 25 30
Ser Thr
<210> 156
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 156
Ile Pro Val Glu Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys
1 5 10 15
Asp Glu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn
20 25 30
Val Leu Arg
35
<210> 157
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 157
Glu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val
1 5 10 15
Leu Arg Leu Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln
20 25 30
Asp Ile
<210> 158
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 158
Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu
20 25 30
Leu Leu Ser
35
<210> 159
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 159
Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser Ser Tyr Ile Ser Pro
20 25 30
Glu
<210> 160
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 160
Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser Ser Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr Ser Gln Phe Leu
20 25 30
Ser
<210> 161
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 161
Tyr Ile Ala Gln Phe Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln
20 25 30
Leu
<210> 162
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 162
Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg
1 5 10 15
Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met Asn Pro Leu Glu Thr
20 25 30
Leu
<210> 163
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 163
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val
20 25 30
Phe Asp Glu
35
<210> 164
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 164
Leu Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr
1 5 10 15
Gly Asn Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu
20 25 30
Ile
<210> 165
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 165
Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr
20 25 30
Glu Asp
<210> 166
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 166
Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser
20 25 30
Met Val
<210> 167
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 167
Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp
1 5 10 15
Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro
20 25 30
Asn
<210> 168
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 168
Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val
20 25
<210> 169
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 169
Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser Leu
1 5 10 15
Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu
20 25
<210> 170
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 170
Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly
1 5 10 15
Arg His Ser Gln Thr Leu
20
<210> 171
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 171
Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr
20 25
<210> 172
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 172
Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu
20 25
<210> 173
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 173
Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe Lys Ala
1 5 10 15
Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln
20 25
<210> 174
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 174
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
1 5 10 15
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu
20 25
<210> 175
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 175
Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His Gln Asp
1 5 10 15
Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser
20 25
<210> 176
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 176
Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg
20 25
<210> 177
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 177
Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg
20 25
<210> 178
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 178
Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys
1 5 10 15
Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met
20 25
<210> 179
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 179
Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ala Lys Phe Ser Pro Tyr
20
<210> 180
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 180
Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser
20 25
<210> 181
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 181
Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His
1 5 10 15
Ala Ser Ser Tyr Ile Ser
20
<210> 182
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 182
Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser Ser Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe
20 25
<210> 183
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 183
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu
20 25
<210> 184
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 184
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln
1 5 10 15
Leu Leu Arg His Val Met Asn Pro Leu Glu Thr
20 25
<210> 185
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 185
Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr
20 25
<210> 186
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 186
Leu Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr
1 5 10 15
Gly Asn Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser
20 25
<210> 187
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 187
Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val
1 5 10 15
Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp
20 25
<210> 188
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 188
Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu
20 25
<210> 189
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 189
Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro
1 5 10 15
Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
20 25
<210> 190
<211> 393
<212> PRT
<213> 人类
<400> 190
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
340 345 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
370 375 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
<210> 191
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 191
Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys
1 5 10 15
Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His
20 25 30
<210> 192
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 192
Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn
20 25 30
<210> 193
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 193
Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val
1 5 10 15
Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu
20 25 30
<210> 194
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 194
Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val
1 5 10 15
Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp
20 25 30
<210> 195
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 195
Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro
20 25 30
<210> 196
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 196
Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn
1 5 10 15
Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg
20 25
<210> 197
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 197
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
1 5 10 15
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile
20 25 30
<210> 198
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 198
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
1 5 10 15
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu
20 25 30
<210> 199
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 199
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
1 5 10 15
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly
20 25 30
<210> 200
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 200
Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu
1 5 10 15
Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn
20 25 30
<210> 201
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 201
Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala
1 5 10 15
Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val
20 25 30
<210> 202
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 202
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
1 5 10 15
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe
20 25 30
<210> 203
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 203
Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys
1 5 10 15
Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr
20 25 30
<210> 204
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 204
Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser
20 25 30
<210> 205
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 205
Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro
1 5 10 15
His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro
20 25 30
<210> 206
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 206
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
1 5 10 15
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly
20 25 30
<210> 207
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 207
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
1 5 10 15
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys
20 25 30
<210> 208
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 208
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
1 5 10 15
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
20 25
<210> 209
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 209
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro
20 25 30
<210> 210
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 210
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
1 5 10 15
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu
20 25 30
<210> 211
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 211
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
1 5 10 15
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser
20 25 30
<210> 212
<211> 720
<212> PRT
<213> 人类
<400> 212
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
<210> 213
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 213
Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg Pro
1 5 10 15
Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu
20 25 30
Leu
<210> 214
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 214
Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser
1 5 10 15
Asn Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu
20 25 30
Asp Glu Leu
35
<210> 215
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 215
Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu
1 5 10 15
Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala
20 25 30
Gly Thr Glu Gln
35
<210> 216
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 216
Lys Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro
20 25 30
Asn Tyr Ile Ser Ile
35
<210> 217
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 217
Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu
1 5 10 15
Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys
20 25 30
Leu
<210> 218
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 218
Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly
20 25 30
Val Lys Ser Tyr
35
<210> 219
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 219
Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu
1 5 10 15
Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala
20 25 30
Glu Ala Val Gly Leu
35
<210> 220
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 220
Ala Gln Lys Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser
1 5 10 15
Ser Trp Arg Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe
20 25 30
<210> 221
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 221
Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val Thr Arg Ile Tyr
1 5 10 15
Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro Asp Arg Tyr
20 25 30
<210> 222
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 222
Ala Val Val His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu
1 5 10 15
Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu
20 25 30
Glu Phe
<210> 223
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 223
Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val
1 5 10 15
Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg
20 25 30
Val
<210> 224
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 224
Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys
1 5 10 15
Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu Leu Lys
20 25 30
Ser Pro Asp
35
<210> 225
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 225
Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu Leu Lys Ser Pro
1 5 10 15
Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys
20 25 30
<210> 226
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 226
Ser Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu
1 5 10 15
Val Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr
20 25 30
Lys
<210> 227
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 227
Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val
1 5 10 15
Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala Gln
20 25 30
Val
<210> 228
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 228
Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg
1 5 10 15
Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val Leu Pro Phe Asp
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr
35
<210> 229
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 229
Val Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His
1 5 10 15
Pro Gln Glu Met Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser
20 25 30
Ala Val
<210> 230
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 230
Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser Asn Pro Ile Val Leu Arg Met
1 5 10 15
Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu
20 25 30
Gly Leu
<210> 231
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 231
Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp
20 25 30
Ala Leu Phe
35
<210> 232
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 232
Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln
1 5 10 15
Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser
20 25 30
Glu Val

Claims (22)

1.用于重建干燥的肽的组合物，其中所述组合物包含或由以下组成：约60-80％v/v的包含有机酸的水溶液、约5-10％v/v丙二醇(CAS号57-55-6)、约10-20％v/v低级醇和约5-10％v/v非离子亲水性表面活性剂。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述有机酸为柠檬酸，并且其中所述柠檬酸以约0.05-0.1M的浓度存在于所述水溶液中。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述低级醇为乙醇。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述非离子亲水性表面活性剂：
a.是单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油，优选乙氧基化三酰甘油，和/或
b.具有在9和14之间的亲水-亲脂平衡(HLB)值。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述非离子亲水性表面活性剂是乙氧基化蓖麻油，优选聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS号61791-12-6)。
6.根据权利要求4或5的组合物，其中所述组合物包含或由以下组成：约75％v/v的包含约0.1M柠檬酸的水溶液、约6.25％v/v丙二醇(CAS号57-55-6)、约12.5％v/v乙醇和约6.25％v/v聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS号61791-12-6)。
7.药物组合物，其包含如权利要求1-6中任一项所述的重建组合物，并且进一步包含肽，优选长度为15至100个氨基酸的肽。
8.根据权利要求7的药物组合物，进一步包含基于油的佐剂。
9.根据权利要求7或8的药物组合物，其中所述组合物包含至少三种不同的肽。
10.根据权利要求7-9中任一项的药物组合物，其中所述肽衍生自至少一种蛋白抗原，其中优选地，所述蛋白抗原是在感染的、癌变前的和/或癌变的细胞上特异性表达的蛋白抗原，并且其中优选地，所述蛋白抗原是人乳头瘤病毒蛋白。
11.根据权利要求7-10中任一项的药物组合物，其中所述组合物不包含以下两种性质均满足的任何肽：
a.碱性氨基酸残基的百分比等于酸性氨基酸残基的百分比，和
b.疏水性氨基酸残基的百分比为48％或更高。
12.根据权利要求7-11中任一项的药物组合物，其中所述肽包含或由以下组成：HPV免疫原性区E6和/或E7内的连续序列，优选HPV16血清型的HPV免疫原性区E6和/或E7内的连续序列。
13.根据权利要求7-12的药物组合物，其中所述连续氨基酸序列包含表位，所述表位包含选自由SEQ ID NO：20-104表示的氨基酸序列组成的组的连续氨基酸序列。
14.根据权利要求7-13中任一项的药物组合物，其中所述肽是肽的混合物，其具有：至少2、3、4或5种包含或由选自SEQ ID NO：1-5的序列组成的肽；至少2、3、4、5或6种包含或由以下组成的肽：选自由SEQ ID NO：1-6表示的氨基酸序列组成的组的连续氨基酸序列；或至少2、3、4、5、6或7种包含或由以下组成的肽：选自由SEQ ID NO：7-13表示的氨基酸序列组成的组的连续氨基酸序列。
15.根据权利要求7-14中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含或由以下组成：在约40-60％v/v所述重建组合物和约40-60％Montanide ISA 51VG中的约1-2mg/mL肽，并且其中所述肽是由SEQ ID NO：1-5或SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：7-13表示的不同肽的混合物。
16.根据权利要求7-15中任一项的药物组合物，其中所述肽由SEQ ID NO：1-5表示的5种不同肽的混合物或SEQ ID NO：7-13表示的7种不同肽的混合物组成。
17.根据权利要求7-11中任一项的药物组合物，其中所述肽：
a.包含或由以下组成：选自由SEQ ID NO：109-146组成的组的氨基酸序列，或
b.包含或由选自SEQ ID NO：148-167所定义的氨基酸序列的肽组成，或为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种选自SEQ ID NO：148-167的不同肽的混合物，优选其中所述肽是SEQ ID NO：153、155、156、160和166所示的五种肽的混合物，或，
c.包含选自SEQ ID NO：168-169的Th表位，或
d.包含或由选自SEQ ID NO：191-211所定义的氨基酸序列的肽组成，或为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种选自SEQ ID NO：191-211的不同肽的混合物，优选其中所述肽是SEQ ID NO：191、193、194、201和203所示的五种肽的混合物，或
e.包含或由选自SEQ ID NO：213-232所定义的氨基酸序列的肽组成，或为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种选自SEQ ID NO：213-232的不同肽的混合物。
18.根据权利要求7-17中任一项的药物组合物，其用作药剂，所述药剂优选为疫苗。
19.根据权利要求16的用于所述用途的药物组合物，其中所述药剂是用于诱导针对所述肽的至少一个表位的T细胞应答的疫苗。
20.一种重建干燥的，优选冻干的肽的制备方法，包括以下后续步骤：
a)提供包含干燥的，优选冻干的肽的小瓶，其中优选所述肽是长度为15至100个氨基酸的肽；
b)融解所述肽，优选融解约5-30分钟；
c)将根据权利要求1-6中任一项的重建组合物加入到包含所述肽的所述小瓶，优选不涡旋所述小瓶；
d)允许混合，优选混合约0.5-5分钟；和
e)涡旋直至获得澄清溶液，优选涡旋约1-3分钟。
21.一种制备药物组合物的方法，包括以下后续步骤：
(i)在第一注射器中收集通过权利要求20的方法可获得的重建的肽；
(ii)使用连接器将步骤(i)的所述第一注射器连接到包含基于油的佐剂的第二注射器；
(iii)将所述第一注射器的内容物推入第二注射器并回推；
(iv)在约10-50秒内总共重复步骤(iii)约10-50次。
22.一种组合试剂盒，包括：
4.第一小瓶，其含有干燥的，优选冻干的肽，其中优选所述肽长度为15至100个氨基酸的肽；
5.第二小瓶，其含有根据权利要求1-6中任一项的组合物；以及任选的，
6.第三小瓶，其含有基于油的佐剂。
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