JP2021525076A - 共有抗原 - Google Patents

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Abstract

本明細書は、抗原コード核酸配列及び／または抗原ペプチドを含む組成物を開示する。ワクチンとしてのそれらの使用を含む、この組成物に関連するヌクレオチド、細胞、及び方法も開示する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的でその全容を参照によって本明細書にそれぞれ援用するところの２０１８年５月２３日出願の米国特許仮出願第６２／６７５，６４９号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，５５９号の利益を主張するものである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年５月２２日に作成され、ＧＳＯ−０１９＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは６，９２５，５８５バイトである。
背景
腫瘍特異的な抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。１〜３例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である。４，５初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がＴ細胞応答を誘発し６、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる７ことが示されている。
新生抗原ワクチンの設計に関する１つの疑問は、対象とする腫瘍に存在する多数のコーディング変異のうちのどれが「最良の」治療用新生抗原（例えば、抗腫瘍免疫を誘発し、腫瘍退縮を引き起こすことができる抗原）を生じることができるか、ということである。
次世代のシークエンシング、ＲＮＡ遺伝子発現、及び新生抗原ペプチドのＭＨＣ結合親和性の予測を用いた、変異に基づいた分析を取り入れた初期の方法が提案されている８。しかしながら、これらの提案されている方法では、遺伝子発現及びＭＨＣ結合以外の多くの段階（例えば、ＴＡＰ輸送、プロテアソーム切断、及び／またはＴＣＲ認識）を含む９エピトープ生成プロセスの全体をモデル化することはできない。したがって、既存の方法は、陽性適中率（ＰＰＶ）が低くなるという問題を有する傾向にある。
実際、複数のグループによって実施された、腫瘍細胞により提示されるペプチドの分析は、遺伝子発現及びＭＨＣ結合親和性を用いて提示されることが予測されたペプチドの５％未満しか腫瘍表面のＭＨＣ上に見られないことを示している１０，１１。結合予測とＭＨＣ提示との間のこのような低い相関は、変異の数単独に対してチェックポイント阻害剤反応について結合に制限された新生抗原の予測精度の向上が認められないという最近の所見によりさらに強調されている１２。
提示を予測するための既存の方法のこのような低い陽性適中率（ＰＰＶ）は、新生抗原に基づいたワクチンの設計において問題を提示する。ＰＰＶの低い予測を用いてワクチンが設計される場合、大部分の患者で治療用新生抗原が投与される可能性は低くなり、複数の新生抗原が投与される患者はさらに少なくなるものと考えられる（提示されるペプチドのすべてが免疫原性であると仮定したとしても）。したがって、現行の方法による新生抗原ワクチン接種は、腫瘍を有する対象の相当数において奏功する可能性は低い。
さらに、これまでのアプローチは、シス作用性の変異のみを用いて候補新生抗原を生成するものであり、複数の腫瘍タイプで生じ、多くの遺伝子で異常スプライシングにつながるスプライシング因子の変異１３、及びプロテアーゼ切断部位を生じるかまたは除去する変異を含む、新生ＯＲＦのさらなる由来源をほとんどの場合で考慮していなかった。
最後に、腫瘍ゲノム及びトランスクリプトーム解析に対する標準的アプローチは、ライブラリ構築、エクソーム及びトランスクリプトームの捕捉、シークエンシング、またはデータ分析における最適に満たない条件のために、候補新生抗原を生ずる体細胞突然変異を見逃す可能性がある。同様に、標準的な腫瘍分析のアプローチでは、配列アーチファクトまたは生殖系列多型を新生抗原として誤って助長してしまう場合があり、それぞれワクチン容量の非効率的な利用または自己免疫のリスクにつながりうる。
現行の新生抗原予測法の課題に加えて、その多くがヒト由来のものである、ヒトにおける新生抗原送達に使用することができる既存のベクター系にもやはり特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、過去の自然の曝露の結果としてヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫ががん治療を行うために新生抗原を送達するための組換えヒトウイルスの使用にとって大きな障害となりうる。
さらに、変異を有する新生抗原及び変異のない腫瘍抗原（例えば、不適切に発現している腫瘍抗原）の両方をターゲティングすることを含む、がんを有する患者間で共有されている抗原をターゲティングすることは、ワクチン戦略として極めて有望である。共有抗原ワクチン戦略における課題としては少なくとも上記に述べたものが挙げられる。
概要
本明細書では、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物が開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）任意で５’リンカー配列、及び
（Ｃ）任意で３’リンカー配列
を含む、前記少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物も開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、クラスＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、各ＭＨＣ Ｉエピトープコード核酸配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、３’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物が開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｅ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｆ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｇ）ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｈ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｉ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｊ）ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｋ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｌ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｍ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｎ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｏ）ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｐ）ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｑ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｒ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｓ）ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｔ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｕ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、３’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
いくつかの態様では、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープを含まない。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物も開示される：
（ａ）任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格、
（ｂ）２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的なＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
（Ａ）アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、前記ＭＨＣクラスＩエピトープの少なくとも１つが、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、５’リンカー配列、
（Ｃ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＣ末端酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、３’リンカー配列
を含み、
前記抗原カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の各３’末端が、前記抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の５’末端に連結されている、
前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４８）と、
（ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４６）と、
（ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第１の核酸配列と、
（ＩＶ）前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の５’末端と、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第２の核酸配列と、
（Ｖ）任意で、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の３’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第３の核酸配列と
を含む、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）１）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを有するかどうか、及び、
以下：
１）対象の腫瘍が前記抗原に関連した遺伝子を発現するかどうか、任意で、前記遺伝子が正常細胞または組織と比較して異常に発現しているかどうか、
２）前記対象の腫瘍が前記抗原に関連した変異を有するかどうか
の一方または両方
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現しており、かつ前記対象の腫瘍が前記遺伝子を発現している、かつ／または前記対象の腫瘍が前記変異を有する場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程であって、
前記抗原が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を含む、
前記工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
１）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含む、前記工程と
を含む、前記方法も開示される。
本明細書ではまた、がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）前記対象が、
１）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有するか、
２）Ａ０２０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有するか、
３）Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有するか、または
４）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルまたはＡ３１０１ ＨＬＡアレルまたはＣ０１０２ ＨＬＡアレルまたはＡ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有するか
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が、
１）前記Ａ０３０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有する場合、
２）前記Ａ０２０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有する場合、
３）前記Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有する場合、または
４）前記Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ３１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ｃ０１０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有する場合
に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
１）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
２）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＡＤ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含むものである、前記工程と
を含む、前記方法も開示する。
いくつかの態様では、工程（ａ）及び／または（ｂ）は、前記対象からの試料を処理したサードパーティーからデータセットを得ることを含む。いくつかの態様では、工程（ａ）は、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることと、を含む。いくつかの態様では、前記試料は、腫瘍試料、正常組織試料、または前記腫瘍試料及び前記正常組織試料を含む。いくつかの態様では、前記試料は、組織、体液、血液、腫瘍生検、脊髄液、及び針穿刺吸引物から選択される。いくつかの態様では、前記遺伝子は、表３４に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される。いくつかの態様では、前記遺伝子は、表３２に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される。いくつかの態様では、前記がんは、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌からなる群から選択される。いくつかの態様では、前記ＨＬＡアレルは、少なくとも５％のＨＬＡ頻度を有する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープは、前記対象の腫瘍に関連した細胞上のＨＬＡアレルによって提示される。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書に開示される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを含む。
本明細書はまた、がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、方法も開示する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列は、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来しない。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、方法も開示する。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列は、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、方法も開示する。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含み、前記対象が、表３４に示される対応する変異（例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２）と結びつけられた表３４に示される少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、方法も開示する。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む、方法も提供する。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書に記載される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書に記載される医薬組成物のいずれか１つを含む。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列は、５’から３’にかけて、
Ｐａ−（Ｌ５ｂ−Ｎｃ−Ｌ３ｄ）Ｘ−（Ｇ５ｅ−Ｕｆ）Ｙ−Ｇ３ｇ
を含む式で説明され、
式中、
Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、
Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｃ＝１であり、
Ｌ５は、前記５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、
Ｌ３は、前記３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、
Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、
Ｘ＝１〜４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。
いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である。
いくつかの態様では、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、前記骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、前記骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、各Ｎは、アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、Ｌ５は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｌ３は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、前記前記ベクター骨格が、任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含み、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、新生抗原コード核酸配列と機能的に連結される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、５’７−メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写によって生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、哺乳動物細胞内で自己複製する。
いくつかの態様では、骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介増幅のための配列は、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。
いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、ＴＣ−８３株を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４と１１１７５との間に欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列である。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように挿入される。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの挿入は、ｎｓＰ１〜４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、ｎｓＰ１〜４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列は別々のオープンリーディングフレーム内にある。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外因性のＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター、任意でＣ６８ベクターである。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が配列から完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、配列番号１に記載の配列を含み、任意で、配列は、配列番号１に記載の配列の（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３、または（３）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、及びＥ４が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、任意で、遺伝子は、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、Ｅ１領域、Ｅ３領域、及び／または、新生抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたＡｄＶ領域においてアデノウイルスベクターに挿入される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、誘導性である。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、非誘導性である。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、またはＥＢＶプロモーター配列である。
いくつかの態様では、アデノウイルスの新生抗原カセットは、複数の新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含み、任意で、前記ポリＡ配列は、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの配列の３’側に位置する。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、第１世代、第２世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの１つから生成される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列の塩基対番号５７７〜３４０７に１つ以上の欠失を含み、任意で、アデノウイルスベクターは、塩基対２７１４１〜３２０２２の間、または塩基対２７８１６〜３１３３２に１つ以上の欠失をさらに含む。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列の塩基対番号３９５７〜１０３４６、塩基対番号２１７８７〜２３３７０、及び塩基対番号３３４８６〜３６１９３に１つ以上の欠失をさらに含む。
いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列内の各抗原コード核酸配列は互いに直接連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する。いくつかの態様において、リンカーは、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２〜２０個の長さの１つ以上の天然配列からなる群から選択される。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する。いくつかの態様では、リンカーは、配列ＧＰＧＰＧを含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つの配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に機能的または直接的に連結される。いくつかの態様では、分離したまたは連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）−１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様において、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つの変異は、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む。
いくつかの態様では、腫瘍は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも２〜１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも１１〜２０個、１５〜２０個、１１〜１００個、１１〜２００個、１１〜３００個、１１〜４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は少なくとも２〜４００個の核酸配列を含み、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個は、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも１つは抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ新生抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示されて、腫瘍細胞表面上の新生抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現は、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される。
いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、アミノ酸８〜３５個の長さ、任意で、アミノ酸９〜１７個、９〜２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のポリペプチド配列をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在する。いくつかの態様において、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を対応する野生型の親核酸配列とは異なるものとする少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列は、アミノ酸１２〜２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０〜４０個の長さである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。
いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている５’または３’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列とは連続したグリシン残基などの柔軟性リンカーによって連結される。
いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−２１、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも１つである。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットの数は、２〜２０である。
いくつかの態様では、提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、該ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表す。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択された抗原は、１つ以上の特異的なＨＬＡアレルにより提示されることが検証されている。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されてない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様において、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得される。いくつかの態様において、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列は、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する。いくつかの態様において、各ジャンクショナルエピトープ配列は、非自己である。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されている。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアは、集団において少なくとも０．０１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する。いくつかの態様において、新生抗原カセットは、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される。いくつかの態様において、非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列は、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である。いくつかの態様において、予測は、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである。いくつかの態様において、新生抗原カセット内の少なくとも１つの抗原コード核酸配列の順序は、（ａ）前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程と、（ｂ）前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程と、を含む一連の工程によって決定される。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってよい。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは新生抗原発現系を封入する。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、新生抗原発現系、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質とを含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰは、非層状の形態を有するか、または高電子密度であるかのいずれかである。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質、及び（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物である。
いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ−リン脂質複合体、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成員である。
いくつかの態様では、新生抗原発現系は、ＬＮＰ中に完全に封入される。
いくつかの態様では、ＬＮＰの非層状の形態は、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む。
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、非層状の形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、高電子密度である。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％を構成し、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％を構成する、混合物、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、リン脂質がＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％を構成し、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％を構成する、混合物、または、ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成する混合物、のいずれかを含む、非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％〜８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％〜４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ−ジステアロイルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉの構造：
Figure 2021525076
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、−０（Ｃ＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、−Ｃ（＝０）−、−０−、−Ｓ（０）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝０）Ｓ−、−ＳＣ（＝０）−、−ＲａＣ（＝０）−、−Ｃ（＝０）Ｒａ−、−ＲａＣ（＝０）Ｒａ−、−ＯＣ（＝０）Ｒａ−、−ＲａＣ（＝０）０−、または直接的結合であり、Ｇ１は、Ｃｉ〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝０）−、−０（Ｃ＝０）−、−ＳＣ（＝０）−、−ＲａＣ（＝０）−、または直接的結合であり、−Ｃ（＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、−Ｃ（＝０）Ｓ−、−Ｃ（＝０）Ｒａ−、または直接的結合であり、Ｇは、Ｃｉ〜Ｃ６アルキレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に、炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、５、６、または７員の複素環を形成し、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して１〜２４の整数であり、ｘは０、１、または２である］
を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩの構造：
Figure 2021525076
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して−０（Ｃ＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、または炭素−炭素二重結合であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、Ｒ７は、それぞれの場合で、独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し、ａ及びｄは、それぞれ独立して０〜２４の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１〜２４の整数であり、ｅは１または２であり、ただし、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１またはＬ２の少なくとも一方が、−０（Ｃ＝０）−または−（Ｃ＝０）０−であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ−ブチルでない］
を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、中性脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質を含む１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び １，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの態様では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１〜1：１の範囲である。
いくつかの態様では、ポリマー結合脂質はＰＥＧ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とＰＥＧ化脂質とのモル比は、約１００：１〜約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧ−スクシノイル−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメートである。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、下記構造ＩＩＩ：
Figure 2021525076
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０〜３０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で１つ以上のエステル結合によって中断され、ｚは、３０〜６０の範囲の平均値を有する］
を有するか、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体である。いくつかの態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１２〜１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、ｚの平均は、約４５である。
ここから開始
いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する。いくつかの態様では、非二重層構造は、６０ｎｍ〜１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、非二重層構造は、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、約１００ｎｍの直径を有する。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれか（本明細書に開示されるアルファウイルスに基づく、またはＣｈＡｄに基づくベクターなど）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も開示される。いくつかの態様において、医薬組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、免疫調節物質をさらに含む。いくつかの態様において、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
本明細書ではまた、先行の組成物の請求項のいずれかに記載の新生抗原カセットと、配列番号３または配列番号５の配列から得られる１つ以上の要素と、を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記１つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号３または配列番号５に記載の配列のｎｓＰ１〜４遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットも開示される。いくつかの態様では、配列または単離ヌクレオチド配列のセットは、配列番号６または配列番号７に記載の配列の７５４４位に挿入された、本明細書に開示される新生抗原カセットを含む。いくつかの態様では、単離ヌクレオチド配列は、配列番号３または配列番号５の配列から得られた前記１つ以上の要素の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、任意で、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と、をさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される新生抗原カセットは、配列番号８または配列番号９の７５６３位に挿入される。別の態様では、配列番号８または配列番号９に記載の配列は、１７位に挿入されたさらなるアデニンヌクレオチドをさらに含む。
本明細書では、本明細書に開示される新生抗原カセットと、本明細書に開示される少なくとも１つのプロモーターとを含む単離ヌクレオチド配列も開示される。いくつかの態様において、単離ヌクレオチド配列は、ＣｈＡｄに基づく遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、ＣｈＡｄに基づく遺伝子は、配列番号１の配列から得られ、任意で、前記遺伝子が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスのＩＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で前記細胞が、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１−２ａ細胞である、単離細胞も提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含むベクターも開示される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターまたは組成物と、使用説明書と、を含むキットも開示される。
本明細書ではまた、がんを有する対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む方法も開示される。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来しない。
本明細書ではまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、本明細書に記載される組成物、ベクター、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法も開示される。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む。
いくつかの態様では、ベクターまたは組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、１つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、免疫調節物質は、組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与されてもよい。いくつかの態様では、１つ以上の免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される。いくつかの態様において、皮下投与は、組成物もしくは医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と同じものである。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と異なる。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、上記の組成物またはベクターのいずれかの少なくとも１つの抗原コード核酸配列と同じである。
本明細書では、上記の組成物のいずれかの１つ以上のベクターを製造する方法であって、前記骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、直線化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される。いくつかの態様では、ＤＮＡプラスミド配列は、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することは、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれかを製造する方法であって、ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、新生抗原発現系を提供することと、前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、かかる条件は、マイクロ流体混合によって提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるアデノウイルスベクターを製造する方法であって、前記少なくとも１つのプロモーター配列と前記新生抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、前記プラスミド配列を１つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、前記１つ以上の宿主細胞から前記アデノウイスベクターを単離することと、を含む方法も開示される。
いくつかの態様において、単離することは、宿主細胞を溶解してアデノウイルスベクターを含む細胞ライセートを得ることと、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することと、を含む。
いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様において、前記１つ以上の宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、及びＡＥ１−２ａ細胞のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様において、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することは、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの１つ以上を行う。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発を説明する。抗原提示細胞へのワクチンカセットの送達が、異なるペプチド抗原の発現、プロセシング、及びＭＨＣ制限提示につながるアッセイの概略。特異的なペプチド−ＭＨＣの組み合わせに一致するＴ細胞受容体を有するように操作されたレポーターＴ細胞が活性化され、ルシフェラーゼが発現される。 図２Ａは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、互いに対して同じ位置で連結された５個のクラスＩ ＭＨＣクラス制限エピトープ（エピトープ１〜５）に２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープ（ＭＨＣ−ＩＩ）が繋げられたものを示す。異なるリンカーを用いて種々の繰り返しが生成された。場合によっては、Ｔ細胞エピトープは互いに直接連結される。他の場合では、Ｔ細胞エピトープの片側または両側にその天然配列が隣接する。他の繰り返しでは、Ｔ細胞エピトープは、非天然配列ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰにより連結される。図２Ｂは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、短いカセット内に埋め込まれたＴ細胞エピトープの配列情報を示す。 モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価を説明する。ターゲティングカセットは、短いカセット設計を、ユビキチン（Ｕｂ）、シグナルペプチド（ＳＰ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメインによって延長し、５個のマーカーヒトＴ細胞エピトープ（エピトープ１〜５）の隣に２個のマウスＴ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＩＩ）及びＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（Ａ５）をさらに有し、Ｔ細胞エピトープの両側に隣接する非天然リンカーＡＡＹ−または天然リンカー配列を用いている（２５マー）。 短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価を説明する。Ａ）ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを使用したワクチンカセットのインビボ評価の実験計画。 長い２１マーカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、長いカセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる５個のマーカークラスＩエピトープ（エピトープ１〜５）であって、それらの２５マー天然配列に含まれるさらなる周知のＴ細胞クラスＩエピトープ（エピトープ６〜２１）によって隔てられたマーカークラスＩエピトープと、２個のユニバーサルクラスエピトープＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ０）とを含み、各クラスＩエピトープの相対位置のみが異なることを示す。 長い２１マーカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報を示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、最終カセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる２０個のＭＨＣ Ｉエピトープを含み、６個の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）エピトープ、５個のヒトエピトープ、９個のマウスエピトープ、及び２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープで構成されることを示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、非ヒト霊長類、マウス、及びヒト由来のクラスＩ ＭＨＣ上に提示される、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報、ならびに２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイドの配列を示す。 図７Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡を使用して倍率１００倍で可視化した。 図８Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して３日後に撮影した。図８Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率４０倍で使用して３日後に撮影した。図８Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率１００倍で使用して３日後に撮影した。 ウイルス粒子の生成スキームを説明する。 アルファウイルス由来ＶＥＥ自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターを説明する。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを接種した後のインビボのレポーター発現を説明する。異なる時点でＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを免疫した（ＭＣ３に封入したものを１０ｕｇ／マウスで両側性に筋肉内注射）後のルシフェラーゼシグナルの代表的イメージを示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）、またはＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）、またはＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答をＭＨＣＩペンタマー染色により評価し、ペンタマー陽性細胞として、ＣＤ８陽性細胞に対する割合（％）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５−ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５−ＧＦＰ／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１（ａＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１ ｍＡｂ（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５−ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５−ＧＦＰ／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１（ａＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１ ｍＡｂ（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの６日後（プライムの２１日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 マウスにおけるマウス腫瘍抗原に対するＣｈＡｄＶ６８誘発Ｔ細胞応答を説明する。マウスをＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫し、ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）に対するＴ細胞応答をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１−Ａ５をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された脾細胞１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ−１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答を説明する。抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、各グループから６匹のマウスの脾細胞で測定した。結果を、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示す。各グループの中央値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ−１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を説明する。ＣＤ８ Ｔ細胞における抗原特異的ＩＦＮ−γ産生をＩＣＳを用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞として、全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合（％）として示した。各グループの中間値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ−１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。腫瘍体積を週２回測定し、平均腫瘍体積を実験の最初の２１日間について示す。実験開始時に各グループは２２〜２８匹のマウスで構成された。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｐ値は、ダネット検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける生存率を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ−１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。Ｐ値は、ログランク検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 図２０は、ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、最初のブースト免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）（図２０Ａ）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）（図２０Ｂ）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）（図２０Ｃ）による同種プライム／ブースト、またはＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブースト群（図２０Ｄ）について、ＰＢＭＣ中で測定した（各群６匹のアカゲザル）。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープについて、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。各動物の値は、プレブリード（０週目）のレベルに対して正規化した。 図２０Ａの説明を参照のこと。 図２０Ａの説明を参照のこと。 図２０Ａの説明を参照のこと。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ２による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ１による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 標的化ＭＳによるＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関を示す。 変異ペプチドＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーで染色した患者からの増殖させたＴＩＬを示す。ＣＤ８＋細胞に対するフローサイトメトリーゲーティング手法（左パネル）及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーによるＣＤ８＋細胞の染色（右パネル）を示す。 一般的なＴＣＲシークエンシング手法及びワークフローを示す。 ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーを用いた代表的な例のＴＣＲシークエンシング手法を示す。 ３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）または５０（ＸＸＬ）個のエピトープを有する大きな抗原カセットにおける異なる腫瘍由来のモデルエピトープの一般的な編成を示す。 ＣｈＡｄベクターが、すべてのカセットに共通の配列を認識する抗クラスＩＩ（ＰＡＤＲＥ）抗体を使用した上記のウェスタンブロットによって示されるように長いカセットを発現することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に異なるサイズの大きなカセット（ｃｈＡｄ６８−５０ＸＸＬ、ｃｈＡｄ６８−４０ＸＬ及びｃｈＡｄ６８−３０Ｌ）を発現するｃｈＡｄ６８ベクターを感染させた。感染はＭＯＩ＝０．２に設定した。感染２４時間後にプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を、感染させたウェルのセットに加えた（＋符合で示す）。ウイルス処理したウェルの別のセットはＭＧ１３２で処理しなかった（−符合で示す）。非感染ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｆ）をネガティブコントロールとして用いた。感染４８時間後に細胞ペレットを回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動で分析し、ウサギ抗クラスＩＩ ＰＡＤＲＥ抗体を用いてイムノブロッティングした。ＨＲＰ抗ラビット抗体及びＥＣＬ化学発光基質を検出に用いた。 ＩＣＳによりＡＨ１（上図）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（下図）に対して検出された、ｃｈＡｄ６８の大きなカセットで免疫したマウスにおけるＣＤ８＋免疫反応を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞として、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。 ｃｈＡｄ６８の大きなカセットによるワクチン接種後のＬＤ−ＡＨ１＋（上図）及びＫｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋（下図）テトラマーに対するＣＤ８＋応答を示す。データは、モデルテトラマーペプチド複合体に対する反応性を有する、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。テューキー検定を用いたＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。 ＩＣＳによりＡＨ１（上図）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（下図）に対して検出された、アルファウイルスの大きなカセットで処置したマウスにおけるＣＤ８＋免疫反応を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞として、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。テューキー検定を用いたＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０１。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。 アカゲザルにおける抗原カセット含有ベクターの免疫原性を評価するためのワクチン接種手法を示す。三角は、０及び３２週目におけるｃｈＡｄ６８によるワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０、４、１２、１２、２０、２８、及び３２週目におけるアルファウイルスワクチン接種を表す。四角は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与を表す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧを投与したアカゲザル単独（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＩＶ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＳＣ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ＥＬＩＳｐｏｔにより測定したｃｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって生じた抗原特異的メモリー応答を示す。結果は各ドットが１匹の動物を表す個別のドットプロットとして示す。免疫前のベースライン（左パネル）及びプライム１８ヶ月後のメモリー反応（右パネル）を示す。 コンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色を用いたフローサイトメトリーによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリー細胞表現型判定を示す。 実験１８ヶ月目における４種類のＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の総和中のメモリー細胞タイプの分布を示す。メモリー細胞は以下のようにキャラクタライズした。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。 ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおけるＣＴ２６腫瘍抗原ＡＨ１を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。テューキーの多重比較検定による１元配置ＡＮＯＶＡを用いてＰ値を求めた（＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５）。ＣｈＡｄＶ＝ ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；ａＣＴＬＡ４＝抗ＣＴＬＡ４抗体、クローン９Ｄ９。
詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を誘導する物質のことである。抗原は新生抗原であってよい。抗原は、特定の集団、例えば、がん患者の特定の集団内にみられる抗原である「共有抗原」であってよい。
本明細書で使用するところの「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞の変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾によって、抗原を対応する野生型抗原とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する抗原のことである。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含んでよい。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライスバリアントも含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常リン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームによって生成されるスプライス抗原も含むことができる。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ− ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４−３５８を参照されたい。例示的な共有新生抗原が表Ａ及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果（配列番号１０７５５〜２９３５７）に示されており、各抗原について対応するＨＬＡアレル（複数可）も示されている。そのような共有新生抗原は、投与によって対象において免疫応答を誘導するうえで有用である。対象は、例えば下記にさらに述べる患者選択方法のようなさまざまな診断法によって投与を行うために特定することができる。
本明細書で使用するところの「腫瘍抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞もしくは組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞もしくは組織中には存在しない抗原、または正常細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されているポリペプチドに由来する抗原である。
本明細書において使用するところの「抗原ベースワクチン」という用語は、１つ以上の抗原、例えば複数の抗原に基づいたワクチン組成物のことである。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはこれらの組み合わせであってよい。
本明細書において使用される場合、「候補抗原」という用語は、抗原を表しうる配列を生じる変異、または他の異常のことである。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分のことである。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ＯＲＦ」という用語は、変異またはスプライシングなどの他の異常により生じる腫瘍特異的なＯＲＦのことである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または基準開始コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一率（％）を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳後の配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を誘発する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「バリアントコール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出されるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「体細胞バリアント」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍の発生の初期に生じ、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異」という用語は、腫瘍の発生において後期に生じ、腫瘍の細胞の一部のみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンでありうる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド−ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、及び喫煙歴を含むことができる。
「腫瘍由来の抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ−ＰＣＲによって腫瘍から直接抽出された核酸配列、または、腫瘍をシークエンシングした後、例えば当該技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。
「アルファウイルス」という用語は、トガウイルス科のメンバーのことを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ−８３などの新世界型に分類される。アルファウイルスは一般的には自己複製ＲＮＡウイルスである。
「アルファウイルス骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とするアルファウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。最小配列としては、非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびに、２６Ｓプロモーター因子をはじめとするサブゲノミックウイルスＲＮＡの発現用の配列を挙げることができる。
「非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列」という用語には、当該技術分野では周知のアルファウイルス保存配列因子（ＣＳＥ）が含まれる。ＣＳＥとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１−ｎｔ ＣＳＥ、２４−ｎｔ ＣＳＥ、または他の２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９−ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられる。
「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語には、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６を含むバクテリオファージ由来ポリメラーゼが挙げられる。
「脂質」という用語には、疎水性及び／または両親媒性分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。脂質は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンを含みうる。脂質には、ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれうる。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語には、リポソームとも呼ばれる、水性の内部を包囲する脂質含有膜を用いて形成された小胞様構造が含まれる。脂質ナノ粒子は、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベースの組成物を含む。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であってよい。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸（タウロコール酸）、及びステロール類（コレステロール）のような生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１種類以上のカチオン性、アニオン性、または中性脂質の規定の比率を含む（ただし、これに限定されない）、規定の比率の異なる脂質分子を用いて形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を封入することができ、その後、標的細胞と接触させて封入分子を宿主細胞のサイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面などを非脂質分子で修飾または官能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層）または多層（複層）とすることができる。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体化することができる。単層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となる。複層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となるか、またはその間を形成するかまたはその間に挟まれる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、例えば、平均から標準偏差２つ分以内など、当該技術分野における公称公差の範囲内にあるものとして理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に示される全ての数値は「約」という語によって修飾されている。
本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者にさらなる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされうる点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．抗原を特定する方法
共有抗原（例えば、新生抗原）を特定するための方法は、対象の腫瘍から、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む腫瘍または免疫細胞の細胞表面上に提示される可能性が高く、かつ／または免疫原性である可能性が高い抗原を特定することを含む。例として、かかる１つの方法は、
対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では、各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を、１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を含むことができる。
提示モデルは、対応するラベルのセットを含む参照データのセット（訓練データセットとも呼ばれる）で訓練された、統計学的回帰または機械学習（例えば、ディープラーニング）モデルを含むことができ、前記参照データのセットは、任意で、一部の対象が腫瘍を有しうる複数の別個の対象の各々から取得され、また、前記参照データのセットは、腫瘍組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、正常組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のトランスクリプトームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のプロテオーム配列を表すデータ、及び腫瘍組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータ、及び正常組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータのうちの少なくとも１つを含む。参照データは、合成タンパク質、正常及び腫瘍ヒト細胞株、ならびに新鮮な及び凍結された初代試料に対してその後曝露される所定のＭＨＣアレルを発現するように操作された単一アレル細胞株の質量分析データ、シークエンシングデータ、ＲＮＡシークエンシングデータ、発現プロファイリングデータ、及びプロテオミクスデータ、ならびにＴ細胞アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ）をさらに含むことができる。特定の態様では、参照データのセットは、参照データの各形態を含む。
提示モデルは、参照データのセットに少なくとも一部由来する特性のセットを含むことができ、前記特性のセットは、アレル依存的特性及びアレル非依存的特性のうちの少なくとも１つを含む。特定の態様では、各特性が含まれる。
共有抗原を特定するための方法はまた、腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の１つ以上の腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原を特定することによって個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することも含む。例として、かかる１つの方法は、対象の腫瘍細胞及び正常細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、腫瘍細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データと正常細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データ、対象の正常細胞から特定されたペプチド配列とを比較することによって特定された抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、前記抗原のそれぞれの前記ペプチド配列を対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸及び前記ペプチド配列内における前記アミノ酸の位置のセットに関する情報を含む、工程と、コンピュータのプロセッサを使用して、前記数値ベクトルをディープラーニング提示モデルに入力して前記抗原のセットについて提示尤度のセットを生成する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する抗原が１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記ディープラーニング提示モデルが、前記抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択することにより、選択された抗原のセットを生成する工程と、前記選択された抗原のセットに基づいて前記個別化されたがんワクチンを構築するための前記出力を生成する工程と、を含むことができる。
新生抗原を含む抗原を同定するための具体的な方法は当業者には周知のものであり、こうした方法は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
本明細書では、本明細書に記載される抗原の特定方法のいずれかの工程を行うことを含み、選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを得る工程と、腫瘍ワクチンを対象に投与する工程と、をさらに含む、腫瘍を有する対象を治療する方法が開示される。
本明細書に開示される方法はまた、サブセットの中の抗原のうちの少なくとも１つに対して抗原特異的な１つ以上のＴ細胞を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、同定は、１つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる条件下で１つ以上のＴ細胞をサブセットの中の抗原のうちの１つ以上と共培養することを含む。さらなる実施形態では、同定は、１つ以上のＴ細胞を、サブセットの中の抗原のうちの１つ以上を含むテトラマーと、Ｔ細胞とテトラマーとの結合が可能な条件下で接触させることを含む。いっそうさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法はまた、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体を同定することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列をシークエンシングすることを含む。本明細書に開示される方法は、前記１つ以上の同定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することと、前記複数のＴ細胞を増殖させる条件下で前記複数のＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の同定されたＴ細胞受容体の少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の前記Ｔ細胞受容体配列を発現ベクターにクローニングすることと、前記複数のＴ細胞のそれぞれに発現ベクターをトランスフェクトすることと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、さらに、前記１つ以上のＴ細胞を増殖させる条件下で前記１つ以上の同定されたＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含む。
本明細書ではまた、前記サブセットの中の少なくとも１つの選択された抗原に対して抗原特異的である単離Ｔ細胞も開示される。
本明細書ではまた、腫瘍ワクチンを製造するための方法であって、
対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
前記抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、
前記選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と
を含む方法も開示される。
本明細書ではまた、
対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各抗原のペプチド配列（例えば、新生抗原の場合では、各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）、前記取得する工程と、
前記抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、
前記選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と
を含む方法を実行することによって選択される、選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンも開示される。
腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの１つ以上を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性を示す１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、１つ以上の抗原を含まなくともよい。
腫瘍ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、賦形剤を含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよく、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データは、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得することができる。
シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチであってもよい。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル相互作用特性によってさらに特定することができる。すなわち、ＭＨＣアレルと抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性；抗原コード化ペプチド−ＭＨＣ複合体の予測安定性；抗原コード化ペプチドの配列及び長さ；質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する抗原コード化ペプチドの提示の確率；対象とされる対象の特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；特定のＭＨＣアレルを発現する他の別個の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率；他の別個の対象における、同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル非相互作用特性によってさらに特定される。すなわち、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端及びＮ末端配列；任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現（ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在；適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度；ＲＮＡ−ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ；腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル（ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる）；新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現；例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏにみることができるような、由来源タンパク質及び／またはそのドメインの特性の包括的なカタログ；ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、βシートに対するαヘリックス）；選択的スプライシング；他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率；ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率；腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑによって測定される、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない）；腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数；ペプチドがＴＡＰに結合する確率、またはＴＡＰに対するペプチドの測定または予測される結合親和性；腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベル（ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる）；以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無：ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、及び抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＴＡＰ−１、ＴＡＰ−２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における変異。その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＴＡＰ−１、ＴＡＰ−２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；喫煙歴；任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
少なくとも１つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化であってよい。
腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択することができる。
本明細書に開示される方法はまた、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを得ることを含んでもよく、任意で腫瘍ワクチンを対象に投与することをさらに含んでもよい。
選択された新生抗原のセット内の新生抗原の少なくとも１つは、ポリペプチド形態である場合、以下のうちの少なくとも１つを含んでもよい：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満のＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩのポリペプチドではアミノ酸８〜１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドではアミノ酸６〜３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩでは、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ−ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
本明細書では、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、複数の新鮮なまたは凍結得様試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表すことができる。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、腫瘍の細胞表面上に提示される尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、中枢性寛容または末梢性寛容により阻害される尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれがＡＰＣに対して腫瘍細胞において差次的に翻訳後修飾される尤度が減少していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書における方法の実施においては、特に断らない限り、当該技術分野における技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
ＩＩＩ．新生抗原における腫瘍特異的変異の特定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル）の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。腫瘍に特異的な、共有新生抗原を含む抗原を同定するための具体的な方法は当業者には周知のものであり、こうした方法は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（１）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（２）Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（３）成熟ｍＲＮＡにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（４）２種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をシークエンシングすることによって特定することができる。
また、変異は、以前に特定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップなどの種々のＤＮＡ「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成及びその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
ＰＣＲベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のＰＣＲ産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。この方法にしたがって、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして公知である代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。取り込まれたラベル化ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定されかつこれに相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
ＤＮＡにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
数多くのイニシアティブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に対して相補的であるＤＮＡの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。１つの方法において、長さが３０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、５’端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、２つの機能を果たす。第１に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、及び、色素を除去するための色素−リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、及び色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ−ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシークエンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシークエンシングプラットフォームを、変異を特定するために使用することができる。上記のように、４種類の主要な合成によるシークエンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａより販売される１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓより販売されるＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成によるシークエンシングプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位を、鋳型の３’端及び／または５’端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン−ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存性の合成によるシークエンシングを含む、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているような、単一分子検出／シークエンシングによって解析することができる。合成によるシークエンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シークエンシングはまた、他の大規模並列処理シークエンシング、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法及びプラットフォームも含むことができる。大規模並列処理シークエンシング技法及びプラットフォームの追加的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、ＴｈｅｒｍｏＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加的な類似した現在の大規模並列処理シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を特定または実証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて特定することができる。
ＩＶ．抗原
抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であることができる。ワクチンにおいて有用な抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。共有新生抗原は、表Ａ（配列番号１０７５５〜２１０１５を参照）及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果（配列番号２１０１６〜２９３５７を参照）に示されている。共有抗原は、表１．２（配列番号５７〜１０，７５４を参照）に示されている。
本明細書に開示する方法によって特定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び、本明細書に開示する方法によって特定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。新生抗原ペプチドは、新生抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
本明細書はまた、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチド、例えば、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で異常に発現することが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原性ペプチドが由来しうる適当なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報をキュレートしたものである。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含む。
抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８〜１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドについてはアミノ酸６〜３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ−ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド分子のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８〜約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６〜３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２〜５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シークエンシングにより、腫瘍中に存在する長い（１０残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のＨＬＡに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。いずれの例においても、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導がもたらされ得る。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも２種類以上の抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の異なるペプチドを含有する。少なくとも２種類の異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチド、例えば、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で異常に発現することが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する腫瘍特異的変異またはペプチドを含むことが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する。抗原性ペプチドが由来しうる適当なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）データベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報をキュレートしたものである。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、数万人のがん患者からの臨床成績を用いた臨床グレードのがんゲノムデータを集約及びリンクしたものである。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性質を有する抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変にさらに供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ−アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１−２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３〜６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風トキソイドの８３０〜８４３、インフルエンザの３０７〜３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２〜３９８及び３７８〜３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる態様において、抗原は、抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。またさらなる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
Ｖ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載される、または表Ａ、表１．２、またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に記載される方法を用いて選択された１つまたは多数の抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１〜３０種類のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０種類の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、１〜１００種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１〜３０種類の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なる抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列を含有することができる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、及び／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、Ｔ細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物中へのその混合が、抗原に対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で修飾する任意の物質である。担体は、抗原がそれに結合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖であることができる。任意で、アジュバントは、共有結合性または非共有結合性にコンジュゲートされる。
抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントの能力は、典型的に、免疫媒介性反応の有意なもしくは実質的な増大、または疾患症候の低減によって明示される。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して生じた抗体の力価の有意な増大によって明示され、Ｔ細胞活性の増大は、典型的に、細胞増殖、または細胞性細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増大において明示される。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはＴｈ応答を、主として細胞性またはＴｈ応答へと変更することによって、免疫応答を変化させ得る。
適しているアジュバントは、１０１８ ＩＳＳ、アラム、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、及びＲｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどの他の専売アジュバントを含むが、それらに限定されない。不完全フロインドまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが、有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８−２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３−１１）。また、サイトカインを使用することもできる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織に対する樹状細胞の遊走への影響（例えば、ＴＮＦ−α）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速化（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、及びＩＬ−４）（具体的にその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとしての作用（例えば、ＩＬ−１２）に直接結び付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４−４１８）。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することが報告されている。ＴＬＲ ７、ＴＬＲ ８、及び／またはＴＬＲ ９に結合するＲＮＡなどの他のＴＬＲ結合分子がまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントの他の例は、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに、治療的に及び／またはアジュバントとして作用し得る、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５などの免疫活性小分子及び抗体を含むが、それらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、当業者が過度の実験なしで容易に決定することができる。追加的なアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、１種類よりも多い異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記の任意またはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチン及びアジュバントを、任意の適切な配列において、一緒にまたは別々に投与できることもまた、企図される。
担体（または賦形剤）は、アジュバントから独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増大させるため、または血清半減期を増大させるために、特に変異体の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体は、Ｔ細胞に対してペプチドを提示するのを助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適している担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリンなどの血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンなどのホルモン、またはパルミチン酸であることができるが、それらに限定されない。ヒトの免疫化のためには、担体は概して、ヒトに許容されかつ安全な、生理学的に許容される担体である。しかし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは、適している担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであることができる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体よりも、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態において抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣのトリマー複合体が存在する場合に可能である。対応して、ペプチドがＣＴＬの活性化のために使用される場合だけではなく、追加的にそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが添加される場合に、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、追加的に、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。
抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６−６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５−６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３−１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２−６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３−９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３−８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７−４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（ １３）：３４０１−１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
Ｖ．Ａ．抗原カセット
１つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「抗原カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原と、k抗原（複数可）を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原（複数可）の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原（複数可）に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。カセットは、表Ａ及び／またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に示される１つ以上の新生抗原、及び／または表１．２に示される１つ以上の抗原を含むことができる。
有用なプロモーターは、構成性プロモーター、または発現させる抗原（複数可）の量を制御することが可能な調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、望ましいプロモーターとして、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのものがある［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリβアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。当業者であれば、他の適当な、または望ましいプロモーターも選択することができる。
抗原カセットは、転写産物の効率的なポリアデニル化（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）のためのシグナルを与える配列ならびに機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を含むイントロンを含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列も含みうる。本明細書の例示的なベクターに用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、抗原ベースの配列の後で、ウイルスベクター配列の前にカセットに挿入することができる。一般的なイントロン配列もまたＳＶ−４０由来のものでよく、ＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。抗原カセットは、プロモーター／エンハンサー配列と抗原（複数可）との間に位置するイントロンを含んでもよい。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は従来のものであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書に引用される参照文献を参照］、多くのかかる配列が商業的及び産業的供給元、ならびにＧｅｎｂａｎｋより入手可能である。
抗原カセットは１つ以上の抗原を有することができる。例えば個、特定のカセットは、１〜１０個、１〜２０個、１〜３０個、１０〜２０個、１５〜２５個、１５〜２０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの抗原を含むことができる。抗原は互いに直接連結されてもよい。抗原はリンカーによって互いに連結されてもよい。抗原は、Ｎ〜ＣまたはＣ〜Ｎを含む、互いに対して任意の方向とすることができる。
上記に述べたように、抗原カセットは、選択することができるものの中でもとりわけ、例えばＥ１遺伝子領域の欠失、またはＥ３遺伝子領域の欠失などのウイルスベクター内の任意の選択された欠失部位内に配置することができる。
抗原カセットは、５’から３’にかけて各要素の順序付けられた配列を説明する下式：
（Ｐａ−（Ｌ５ｂ−Ｎｃ−Ｌ３ｄ）Ｘ）Ｚ−（Ｐ２ｈ−（Ｇ５ｅ−Ｕｆ）Ｙ）Ｗ−Ｇ３ｇ
を用いて説明することができ、
式中、
Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、
Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、
Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、
Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、
Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、
Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、
Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。
組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１〜４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１〜４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
１つの例では、存在する要素は、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、かつＷ＝１であり、さらなるプロモーターが存在しない場合が記述される場合（すなわち、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、２０個のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、各Ｎについて５’リンカーが存在し、各Ｎについて３’リンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最後のＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をＲＮＡアルファウイルス骨格に連結するリンカーが存在する。抗原カセットの３’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、３’の１９ｎｔのＣＳＥのような、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる３’ＵＴＲ要素に直接連結することが挙げられる。抗原カセットの５’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、２６Ｓプロモーター配列、アルファウイルスの５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、または２４ｎｔのＣＳＥに直接連結することが挙げられる。
他の例としては、ａ＝１であり、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在する場合が記述される場合；ａ＝１かつＺが１よりも大きく、それぞれが１つ以上の異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の発現をもたらす、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在する場合；ｈ＝１であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の発現をもたらす別のプロモーターが存在することが記述される場合；及び、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列（存在する場合）がＲＮＡアルファウイルス骨格に直接連結される場合などが挙げられる。
他の例としては、存在する各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と同じであってよい。例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２が、それぞれ２６Ｓのサブゲノミックプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と異なっていてもよく、また、互いと異なっていてもよい。
５’リンカーＬ５は、天然配列または非天然配列であってよい。非天然配列としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが挙げられる。３’リンカーＬ３もまた、天然配列または非天然配列であってよい。さらに、Ｌ５及びＬ３は、いずれも天然配列であってよく、いずれも非天然配列であってよく、または一方が天然で他方が非天然であってもよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｙについて、アミノ酸リンカーＧ５は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
アミノ酸リンカーＧ３は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。Ｇ３はまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎはまた、アミノ酸が、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。
Ｖ．Ｂ．免疫チェックポイント
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるＣ６８ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも１つの免疫調節因子（例えばｓｃＦｖなどの抗体）をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、抗原カセットと、チェックポイント阻害剤をコードする１つ以上の核酸分子とを含むことができる。
遮断または阻害するための標的となりうる例示的な免疫チェックポイント分子としては、これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ（γδ）及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ−１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ−１５０４９の１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する抗体、またはその抗原結合フラグメント、または他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１ｂｌｏｃｋｅｒ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。抗体をコードする配列は、当該技術分野における通常の技能を用いてベクター、例えばＣ６８に操作により組み込むことができる。例示的な方法の１つが、あらゆる目的で参照により本明細書に援用する、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４−９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７；に記載されている。
Ｖ．Ｃ．ワクチン設計及び製造のさらなる考慮事項
Ｖ．Ｃ．１．すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が、ワクチン中への包含について優先される５３。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる５４。
Ｖ．Ｃ．２．抗原の優先順位決定
上記の抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、腫瘍が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ−Ｉ及びＨＬＡ−ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある）
さらに、場合によっては、抗原が患者の腫瘍のすべてまたは一部において喪失するかまたは不活性化されたＨＬＡアレルによって提示されることが予想される場合には、これらの新生抗原のワクチン接種における優先順位を下げる（例えば除外）することができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の喪失、または遺伝子座のホモ接合欠失のいずれかによって生じうる。ＨＬＡアレルの体細胞変異の検出方法は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ及びホモ接合欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出方法についても同様に述べられている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原は、質量分析データが、予測された抗原が予測されたＨＬＡアレルによって提示されないことを示す場合には優先順位付けを外してもよい。
Ｖ．Ｄ．アルファウイルス
Ｖ．Ｄ．１．アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ−８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞にウイルスが吸着した後、ビリオンが細胞内区画内の膜と融合し、最終的にゲノムＲＮＡをサイトゾル中に放出する。プラス鎖の向きを有し、５’末端のメチルグアニル酸キャップ及び３’末端のポリＡテールを有するゲノムＲＮＡは、翻訳されて非構造タンパク質ｎｓＰ１−４を生成し、これが複製複合体を形成する。感染初期には、プラス鎖はこの複合体によってマイナス鎖の鋳型に複製される。現在のモデルでは、複製複合体は感染が進行するにつれてさらにプロセシングされ、生じたプロセス後の複合体はマイナス鎖の完全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ及び構造遺伝子を含む２６Ｓのサブゲノムプラス鎖ＲＮＡへの転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）が、マイナス鎖鋳型からのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補体、ゲノム鋳型からのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔのＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡとのジャンクション領域内の２４ｎｔのＣＳＥ、及び、プラス鎖鋳型からのマイナス鎖合成における３’末端の１９ｎｔのＣＳＥを含む様々なＲＮＡ合成ステップにおいて潜在的に一定の役割を担っているものとして同定されている。
ウイルスの自然の生活環では、異なるＲＮＡ種の複製後、ウイルス粒子が通常、アセンブルされる。２６Ｓ ＲＮＡは翻訳され、生じたタンパク質はさらにプロセシングされて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２種類の小ポリペプチドＥ３及び６Ｋを含む構造タンパク質を生成する（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルスＲＮＡのカプシド形成が生じ、通常はゲノムＲＮＡのみに特異的なカプシドタンパク質がパッケージングされた後、ビリオンがアセンブルされ、膜表面に出芽する。
Ｖ．Ｄ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルス配列、特徴、及び、他の要素）を使用してアルファウイルスベースの送達ベクター（アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）ベクターとも称される）を作製することができる。アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ−８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ−８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス配列を用いたいくつかの発現ベクターの設計戦略が開発されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。１つの戦略では、アルファウイルスベクターの設計は、構造タンパク質遺伝子の下流に２６Ｓプロモーター配列因子の第２のコピーを挿入した後、異種遺伝子を挿入することを含む（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。これにより、天然の非構造及び構造タンパク質以外に、さらなる異種タンパク質を発現するサブゲノムＲＮＡが産生される。このシステムでは、感染性ビリオンを産生するためのすべての因子が存在し、したがって、非感染細胞において発現ベクターの繰り返しの感染のラウンドが行われうる。
別の発現ベクターの設計では、ヘルパーウイルスシステムを利用する（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質は異種遺伝子によって置換される。したがって、依然としてインタクトな非構造遺伝子によって媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製の後、２６ＳサブゲノムＲＮＡが異種タンパク質の発現をもたらす。従来、構造タンパク質を発現するさらなるベクターが、例えば、細胞株の同時トランスフェクションなどによってイン・トランスで与えられることで感染性ウイルスを生じる。１つのシステムが米国特許第８，０９３，０２１号に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。ヘルパーベクターシステムは、感染性粒子を形成する可能性を制限するという長所をもたらし、したがってバイオセーフティーを改善する。さらに、ヘルパーベクターシステムは、全ベクター長を短縮し、複製及び発現の効率を改善する可能性がある。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、構造タンパク質が抗原カセットで置換されたアルファウイルス骨格を用いることができ、得られるベクターはバイオセーフティーの問題が低減されるのと同時に全体的な発現ベクターのサイズの減少により、効率的な発現を促進する。
Ｖ．Ｄ．３．インビトロでのアルファウイルスの生成
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のＲＮＡポリヌクレオチドである。ＲＮＡ生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳ＩＶＴがある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡに転写されることが望ましい配列の５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、ＤＮＡ鋳型は、適当なＲＮＡポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）とインキュベートされる。得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、７−メチルグアノシンまたは関連する構造などの５’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化（ポリＡ）テールを有するように３’末端を改変することを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
Ｖ．Ｄ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
アルファウイルスベクターの場合では、標準的な送達方法は、カプシド、Ｅ１、及びＥ２タンパク質をイン・トランスで与えることによって感染性のウイルス粒子を生じる上記に述べたヘルパーウイルスシステムである。しかしながら、Ｅ１及びＥ２タンパク質は、しばしば中和抗体の主要な標的である点に留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、対象とする抗原を標的細胞に送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性は、感染性粒子が中和抗体の標的とされる場合に低下する可能性がある。
ウイルス粒子を媒介とする遺伝子送達に代わる代替的手法として、ナノ粒子を用いた発現ベクターの送達がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。重要な点として、ナノ材料担体は、非免疫原性材料で形成することができ、送達ベクター自体に対する免疫の誘発を一般的に回避することができる。これらの材料としては、これらに限定されるものではないが、脂質、無機ナノ材料、及び他のポリマー材料を挙げることができる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。かかる材料は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含みうる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、膜及び小胞状構造の形成を可能とする脂質の両親媒性の性質のために魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般的にこれらの小胞は、標的細胞の膜内に吸収され、サイトゾル中に核酸を放出することによって発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは特定の細胞種のターゲティングを促すようにさらに改変または官能化することができる。ＬＮＰの設計における別の考慮事項は、ターゲティングの効率と細胞毒性との間のバランスである。脂質の組成は一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の規定の混合物を含む。いくつかの例では、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、またはさらなる部分の付着を促す化学官能基を与えるために特定の脂質が含まれる。脂質の組成は、全体のＬＮＰのサイズ及び安定性に影響しうる。１つの例では、脂質の組成は、ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質の組成物は、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ複合化脂質、ステロール、または中性脂質などの１種類以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解、または遊離核酸による免疫系のオフターゲットの刺激を含むいくつかの望ましくない影響を有しうる。したがって、アルファウイルスベクターの封入を利用して分解を防止する一方で、潜在的なオフターゲット効果も防止することができる。特定の例では、アルファウイルスベクターは、ＬＮＰの水性の内部など、送達担体内に完全に封入される。ＬＮＰ内へのアルファウイルスベクターの封入は、微小流体液滴生成装置で行われる微小流体混合及び液滴生成などの当該技術分野では周知の方法によって実施することができる。かかる装置としては、これらに限定されるものではないが、標準的なＴジャンクション装置またはフローフォーカシング装置が挙げられる。１つの例では、ＭＣ３またはＭＣ３様分子含有組成物などの所望の脂質製剤を、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成装置に供給することで、送達ベクター及び所望の物質がＭＣ３またはＭＣ３様分子ベースのＬＮＰの内部に完全に封入される。１つの例では、液滴生成装置は、生成されたＬＮＰの粒径範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１〜１０００ｎｍの範囲の粒径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ｎｍの粒径を有することができる。液滴生成の後、発現ベクターを封入した送達ベクターを、投与に備えてさらに処理または改変することができる。
Ｖ．Ｅ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｅ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
１つ以上の抗原を送達するためのワクチン組成物（例えば、抗原カセットを介し、表Ａ及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に示される１つ以上の新生抗原、及び／または表１．２に示される１つ以上の抗原を含む）は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることにより作出することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（配列番号１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
さらなる態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列と、発現を誘導する調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む組換えアデノウイルスが提供される。この組換えウイルスは、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に感染させることが可能であり、細胞内で新生抗原カセットの産物を発現することが可能である。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。抗原カセットを、これらの遺伝子欠失部位のいずれに挿入することもできる。抗原カセットは、それに対するプライミングされた免疫応答が望ましい抗原を含むことができる。
別の態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスを感染させた哺乳動物細胞が提供される。
さらなる別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＣ６８由来の）またはその機能的フラグメントを発現する新規な哺乳動物細胞株が提供される。
いっそうさらなる態様において、本明細書では、哺乳動物細胞内に抗原カセットを送達するための方法であって、細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された、有効量のＣ６８などのチンパンジーアデノウイルスを導入する工程を含む方法が提供される。
さらなる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を誘発してがんを治療するための方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする腫瘍に由来する１種類以上の抗原をコードする抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
さらに、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳動物細胞も開示される。この遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択することができる。
さらに、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示される。この遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失した、配列番号１の配列を含む。
さらに、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、異種宿主細胞内でカセットの発現を誘導する１つ以上の調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含むベクターであって、任意で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列が、複製及びカプシド形成に必要とされる少なくともシスエレメントを含み、シスエレメントが抗原カセット及び調節配列に隣接している、ベクターも開示される。いくつかの態様において、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠失していてもよい。
さらに、抗原カセットを発現するように操作されたＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトした宿主細胞も開示される。さらに、細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することによって細胞内に導入された選択された遺伝子を発現するヒト細胞も開示される。
さらに、哺乳動物細胞に抗原カセットを送達するための方法であって、前記細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された有効量のＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターを導入することを含む方法も提供される。
さらに、哺乳動物細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することと、適当な条件下で細胞を培養することと、抗原を産生することと、を含む、抗原を産生するための方法も開示される。
Ｖ．Ｅ．２．Ｅ１を発現する相補性細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
ＡＡＶ強化アッセイを用いてチンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定することができる。このアッセイは、他の特性評価されていないアデノウイルス（例えば他の種由来）のＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株においてＥ１の機能を同定するうえで有用である。このアッセイは米国特許第６，０８３，７１６号の実施例４Ｂに記載されている。
選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１）は、選択された親細胞株で発現するためのプロモーターの転写制御下にある可能性がある。この目的で誘導性または構成性プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターには、亜鉛によって誘導されるヒツジメタロチオニンプロモーター、または糖質コルチコイド、特にデキサメタゾンによって誘導されるマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。本明細書に参照により援用するところの国際出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されるものなどの他の誘導性プロモーターもパッケージング細胞株の作製に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現を制御する構成性プロモーターも用いることができる。
任意の所望のＣ６８遺伝子を発現する新規な細胞株を作製するために親細胞を選択することができる。限定されることなく、かかる親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］、及びＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞であってよい。他の適当な親細胞株を他の供給元から入手することができる。親細胞株としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１−２ａを挙げることができる。
Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用となりうる。１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物を発現する基本的に同じ手順を用いて構築された細胞株は、これらの産物をコードする遺伝子に欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄＥ１遺伝子産物を発現する細胞株も、チンパンジー組換えＡｄを作製するうえで有用である。
Ｖ．Ｅ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
「機能的に欠失された」という用語は、その遺伝子領域の充分な量が除去または例えば変異もしくは改変により他の形で変化させられていることにより、その遺伝子領域が遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を産生できなくなっていることを意味する。機能的欠失につながりうる変異または改変としては、これらに限定されるものではないが、未成熟終止コドンの導入及び基準及び非基準開始コドンの除去のようなナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングまたは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはこれらの組み合わせが挙げられる。必要な場合、遺伝子領域全体を除去することができる。
配列の欠失、挿入、及び他の変異を含む、本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的手法を用いて生成することができるものであり、本明細書の範囲内である。
Ｖ．Ｅ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、任意で、例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている［例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。
抗原カセットをヒト（または他の哺乳動物）細胞に送達するための有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築において、広範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに用いることができる。最小のチンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスとともに使用して感染性の組換えウイルス粒子を作製することができる。ヘルパーウイルスは、最小のチンパンジーアデノウイルスベクターのウイルス感染性及び増殖に必要な基本的な遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択された欠失のみが、欠失がなければ機能性のウイルスベクターに導入される場合、欠失された遺伝子産物は、欠失された遺伝子機能をイン・トランスで与えるウイルスを選択されたパッケージング細胞株内で増殖させることによるウイルスベクター作製プロセスで供給することができる。
Ｖ．Ｅ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
Ｖ．Ｅ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
１つの例として、適当なベクターは、Ｃ６８アデノウイルスの最初期遺伝子Ｅ１ａ及び後初期遺伝子Ｅ１ｂの全体または充分な部分を欠失させることにより、それらの正常な生物学的機能を失わせることによって形成することができる。複製不全Ｅ１欠失ウイルスは、対応する遺伝子産物をイン・トランスで与える機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含むチンパンジーのアデノウイルス形質転換相補性細胞株で増殖させた場合に感染性のウイルスを複製及び生成することが可能である。既知のアデノウイルス配列に対する相同性に基づけば、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスでそうであるように多くの細胞種に感染することが可能であり、抗原（複数可）を発現することができるが、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを有していない多くの細胞では、細胞が極めて高い感染多重度で感染していないかぎりは複製できないものと予想される。
別の例として、Ｃ６８アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全体または一部を、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から除去することができる。
チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターは、Ｅ４遺伝子の欠失を有するように構築することもできる。さらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有することができる。
欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれに導入することもできる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２内の欠失も特定の目的では有用となりうる。他の欠失を他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子に導入することもできる。
上記に述べた欠失は、個々に用いることもできる。すなわち、アデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を有してもよい。また、それらの生物学的活性を破壊または低減するうえで効果的な遺伝子全体またはその一部を任意の組み合わせで用いることもできる。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子、またはＥ１及びＥ３遺伝子、または、Ｅ３の欠失をともなうかまたはともなわない、Ｅ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子の欠失を有することができる。上記に述べたように、かかる欠失は、所望の結果を得るために温度感受性変異などの他の変異と組み合わせて用いることができる。
抗原（複数可）を含むカセットを、任意で、チンパンジーＣ６８Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入することができる。また、必要に応じて既存の遺伝子領域内にカセットを挿入することでその領域の機能を破壊することもできる。
Ｖ．Ｅ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。ヘルパーウイルスは複製不全であってよく、上記に述べた配列以外の様々なアデノウイルス遺伝子を含むことができる。ヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて用いることができる。
Ｃ６８では、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端を、ウイルスの左端から約１３００ｂｐを除去するＳｓｐＩによって短縮することによって形成されるフラグメントとすることができる。次に、この短縮されたウイルスをプラスミドＤＮＡとともにＥ１発現細胞株内に同時トランスフェクトすることにより、プラスミド内のＣ６８配列との相同組み換えによって組換えウイルスを形成する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５−１６９８７ （１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されるようなポリカチオン複合体として形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意で、レポーター遺伝子を含んでもよい。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在によって、Ａｄベクターとヘルパーウイルスを独立して観察することが可能となる。この第２のレポーター遺伝子を用いることで、精製時に得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスとを分離することが可能である。
Ｖ．Ｅ．８．ウイルス粒子のアセンブリと細胞株の感染
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
例えば、所望の抗原を含むウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列との間で相同組み換えが起こり、これによりベクター内のアデノウイルス−抗原配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされ、組換えウイルスベクター粒子が得られる。
得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、抗原カセットを選択された細胞に導入するうえで有用である。パッケージング細胞株内で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ実験において、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスが、カセットを非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞に導入するうえで実用性を有することが実証されている。
Ｖ．Ｅ．９．組換えウイルスベクターの使用
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される）は、抗原（複数可）をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
上記に述べた組換えベクターは、遺伝子治療について公開されている方法にしたがってヒトに投与される。抗原カセットを有するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは生体適合性溶液または薬学的に許容される送達溶媒中に懸濁させて患者に投与することができる。適当な溶媒としては滅菌生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容される担体として知られ、当業者には周知のものである他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的で使用することもできる。
チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞を形質転換し、医療分野の当業者によって判定することが可能な有害作用をともなわずに、または医学的に許容される生理学的作用をともなって、治療効果を与えるうえで充分なレベルの抗原の導入及び発現をもたらすのに充分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、肝臓、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
ウイルスベクターの用量は、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に主として依存し、したがって患者間で異なりうる。用量は、あらゆる副作用に対して治療効果のバランスが取れるように調節され、かかる用量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なりうる。抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、投与頻度を決定することができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、「薬学的有効量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクトし、ワクチン効果、すなわち一定の測定可能なレベルの防御免疫をもたらすような選択された遺伝子の充分な発現レベルを与えるのにある投与経路で有効な組換えアデノウイルスの量で投与することができる。抗原を含むＣ６８ベクターは、アジュバントと同時投与することができる。アジュバントは、ベクターとは別のものであってもよく（例えばミョウバン）または特にアジュバントがタンパク質である場合にはベクター内にコードされてもよい。アジュバントは当該技術分野では周知のものである。
従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせるか、または免疫原もしくは疾患に応じて調節することができる。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、及び鼻腔内経路が好ましい。投与経路は、主として治療される疾患の性質によって決められる。
抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、ブースターの必要性（ある場合）を決定することができる。例えば、血清中の抗体力価の評価の後、必要に応じてブースター免疫が望ましい場合がある。
ＶＩ．治療及び製造方法
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の抗原などの１つ以上の抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び／または緩和する方法も提供される。
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫及び白血病などの、血液腫瘍であることができる。
抗原は、ＣＴＬ応答を誘導するのに充分な量で投与することができる。
抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質をさらに投与することができる。例えば、対象に、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１をさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、ＣＴＬＡ−４遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各抗原の最適量、及び最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調製することができる。注射の方法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、及びｉ．ｖ．を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数、及び／または量が、組織、がん、及び／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされるか、または患者の変異状態によって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、及び当然、患者のＨＬＡハロタイプに依存し得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における抗原の発現にしたがって抗原の選択を変えること、または、処置の第１のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
抗原ワクチンの投与を行うための患者は、さまざまな診断方法、例えば、下記でさらに述べる患者選択方法の使用により特定することができる。患者選択では、１つ以上の遺伝子の変異または発現パターンを特定することを含むことができる。場合により、患者選択では、患者のハプロタイプを特定することを含む。さまざまな患者選択方法を並行して行うことができ、例えば、シークエンシング診断によって患者の変異及びハプロタイプの両方を特定することができる。さまざまな患者選択方法を順次行うこともでき、例えば、１つの診断検査で変異を特定し、別の診断検査で患者のハプロタイプを特定し、その場合、各検査は、同じ（例えば、両方ともハイスループットシークエンシング）か、または異なる（例えば、一方がハイスループットシークエンシングで他方がサンガーシークエンシング）診断方法であってよい。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの薬学的組成物は、多量に存在することができ、及び／または、この特定の抗原もしくはこの抗原の経路に特異的な１種類よりも多い抗原を含めることができる。
抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を惹起し、かつ、症候及び／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに充分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命に関わるか、または潜在的に命に関わる状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、及び抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、及びその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき抗原は、単独で、または、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性及び負電荷を有するリン脂質、及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、及び血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７ （１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、及び任意でペプチドの１つ以上をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８ （１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にＤＮＡからなる粒子を、投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションを伴うかまたは伴わない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ ９６／１８３７２；９３２４６４０ＷＯＡＷＯ ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）： ６８２−６９１ （１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号 Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；９１０６３０９ＷＯＡＷＯ ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４ （１９８７）に記載されている。
抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００４） １０， ６１６−６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１） ２３９（１）： ４５−６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２） ４４３（３）：６０３−１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５） ４３ （１）： ６８２−６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８） ７２ （１２）： ９８７３−９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６） ２２ （４）：４３３−８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６） ３５２ （６２９１）：１３３７−４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４） ２０（ １３）：３４０１−１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０ （１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
核酸を投与する手段は、１つ以上のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保持シグナルを含む。加えて、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、ＤＮＡに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちでもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び保護的、相互作用的、非縮合性（ＰＩＮＣ）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
また、本明細書に開示する方法の工程を行うこと；及び、多数の抗原または多数の抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産する工程を含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も、本明細書に開示する。
本明細書に開示する抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生産する方法は、抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む工程、及び、抗原またはベクターを精製する工程を含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、及びクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであることができる。
ＶＩＩ．抗原の使用及び投与
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはＡＡＹなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約２０個の抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのＭＨＣＩＩ抗原、及びユニバーサルクラスＩＩ抗原とみなされるＰＡＤＲＥ抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）と組み合わせて（例えば、同時、その前、またはその後で）対象に投与することができる。ＣＰＩは、抗体またはその抗原結合部分など、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
プライミングワクチンは、対象に注射（例えば筋肉内に）することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１〜１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１〜１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
プライムワクチン接種後に、ワクチンブースト（ブースターワクチン）を注射（例えば筋肉内に）することができる。ブースターワクチンは、プライム後の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと、及び／または８週間ごとに投与することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１〜１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１〜１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
抗ＣＴＬＡ−４（例えばトレメリムマブ）を対象に投与することもできる。例えば、抗ＣＴＬＡ４を筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはｓｒＲＮＡ低用量）の部位の近くに皮下投与することで同じリンパ節内に確実に送り込むことができる。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ−４の選択的ヒトＩｇＧ２ｍＡｂ阻害剤である。標的抗ＣＴＬＡ−４（トレメリムマブ）皮下用量は、通常、７０〜７５ｍｇ（詳細には７５ｍｇ）であり、例えば、１〜１００ｍｇまたは５〜４２０ｍｇの用量範囲である。
特定の場合では、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）などの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ−１及びＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する選択的な高親和性のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般的に４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。
免疫モニタリングを、ワクチン投与の前、その間、及び／またはその後に行うことができる。かかるモニタリングは、他のパラメータの中でもとりわけ、安全性及び有効性についての情報を与えることができる。
免疫モニタリングを行うには、ＰＢＭＣが一般的に用いられる。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種の前、及びプライムワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に単離することができる。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前、及び各ブーストワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に採取することができる。
Ｔ細胞応答を、免疫モニタリングプロトコールの一環として評価することができる。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌、及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイなどの当業者には周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮ−γなどの細胞内または細胞外で捕捉されたサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を用い、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、３Ｈチミジン、ブロモデオキシウリジン、及びカルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の取り込み後に、Ｔ細胞集団のエクスビボ増殖を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム放出アッセイまたは代替的な比色細胞毒性アッセイにより機能的に評価することができる。
ＶＩＩＩ．抗原の特定
ＶＩＩＩ．Ａ．抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析のための研究法を、抗原の特定のスペースに記載し、適用している６，１４，１５。臨床設定における抗原の特定において、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びＮＧＳデータ解析に関連するものの、２つの区域にグループ化することができる。最適化の例は当業者には周知のものであり、例えば、そのような方法が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＶＩＩＩ．Ｂ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５〜５８）。清澄化した溶解物を、ＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。
免疫沈降は、抗体がＨＬＡ分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスＩ ＨＬＡ免疫沈降のためには、汎クラスＩ ＣＲ抗体を使用し、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲのためには、ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、ＮＨＳ−セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、ＩＰのために等分した（５９、６０）。免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにＰｒｏｔｅｉｎＡ及び／またはＰｒｏｔｅｉｎＧでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。ＭＨＣ／ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
Figure 2021525076
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なＩＰを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはＣ１８分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、ＭＳ解析の前に−２０℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているＨＰＬＣ緩衝液において再構成し、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）における勾配溶出のために、Ｃ−１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度で収集し、その後、ＭＳ２低解像度スキャンを、選択イオンのＨＣＤフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、ＭＳ２スペクトルは、ＣＩＤもしくはＥＴＤフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための３つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。ＭＳ２スペクトルはまた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のＭＳ２スペクトルを、Ｃｏｍｅｔ（６１、６２）を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定を、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ（６３〜６５）を用いてスコア化する。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）及び他のサーチエンジンを用いてさらなるシークエンシングを行うか、またはスペクトルマッチング及びデノボシークエンシング（９７）を含むシークエンシング法を用いることができる。
ＶＩＩＩ．Ｂ．１．総合的ＨＬＡペプチドシークエンシングのためのＭＳ検出限界の研究
ペプチドＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫを用いて、何が検出の限界かを、ＬＣカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、及び１００ａｍｏｌであった。（表１）結果を図２４Ａ及び２４Ｂに示す。これらの結果は、検出の最低限界（ＬｏＤ）がアトモルの範囲（１０−１８）にあること、ダイナミックレンジが５桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（１０−１５）でシークエンシングに充分であるように見えることを示す。
（表１）
Figure 2021525076
ＩＸ．提示モデル
提示モデルを用いて、患者におけるペプチド提示の尤度を特定することができる。異なる提示モデルは当業者には周知のものであり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１１０２９３６３７号により詳細に記載されている。
Ｘ．訓練モジュール
訓練モジュールを用いて、ペプチド配列がそのペプチド配列に関連したＭＨＣアレルによって提示される尤度を生成する１つ以上の提示モデルを訓練データセットに基づいて構築することができる。さまざまな訓練モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。訓練モジュールは、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための予測モデルを構築することができる。訓練モジュールは、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル場面においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルも構築することができる。
ＸＩ．予測モジュール
予測モジュールを用いて、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して不適切に発現している候補抗原を特定することにより、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織で発現が変化している候補抗原を特定することができる。
提示モジュールは、１つ以上の提示モデルを処理されたペプチド配列に適用してペプチド配列の提示尤度を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、提示モデルを候補抗原に適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現形態では、提示モジュールは、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補抗原配列を選択する。別の実現形態では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補抗原を含むワクチンを患者に注射して免疫応答を誘導することができる。
ＸＩ．Ｂ． カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
カセット設計モジュールを用いて、患者に注射するために選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成することができる。さまざまなカセット設計モジュールが当業者に周知であり、例えば、そのようなカセット設計モジュールは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
治療エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示尤度（提示尤度は、提示モデルにより決定される）に関連付けられた予測モジュールによって決定された選択されたペプチドに基づいて生成することができる。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープのセットは、多くの方法の任意の１つ以上（単独または組み合わせ）に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合親和性もしくは予測される結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合安定性もしくは予測される結合安定性、ランダムサンプリングなどに基づいて、生成することができる。
治療エピトープはそれ自体が選択されたペプチドに相当してもよい。治療エピトープは、選択されたペプチド以外にＣ及び／またはＮ末端フランキング配列を含むこともできる。Ｎ及びＣ末端フランキング配列は、その由来源タンパク質との関連において治療ワクチンエピトープの天然のＮ及びＣ末端フランキング配列であってよい。治療エピトープは固定長のエピトープを表してもよい。治療エピトープは、可変長のエピトープを表してもよく、エピトープの長さは例えばＣまたはＮ末端フランキング配列の長さによって異なりうる。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、それぞれ２〜５残基の異なる長さを有してよく、これによりエピトープの１６種類の可能な選択肢が与えられる。
カセット設計モジュールは、カセット内の１組の治療エピトープ間の連結部にまたがるジャンクションエピトープの提示を考慮することによってカセット配列を生成することもできる。ジャンクションエピトープは、カセット内で治療エピトープ及びリンカー配列を連結するプロセスによってカセット内に生じる新規な非自己であるが無関係なエピトープ配列である。ジャンクションエピトープの新規な配列は、カセットの治療エピトープ自体とは異なる。
カセット設計モジュールは、ジャンクションエピトープがその患者において提示される尤度を低下させるカセット配列を生成することができる。具体的には、カセットが患者に注射される際、ジャンクションエピトープは、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルによって提示される可能性を有し、それぞれＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する。かかる応答は、ジャンクションエピトープに対する反応性を有するＴ細胞は治療効果を有さないことから望ましくなく、抗原競合によりカセット内の選択された治療エピトープに対する免疫応答を消失させる可能性がある７６。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットについて繰り返し処理を行って、そのカセット配列に関連付けられたジャンクションエピトープの提示スコアが数値閾値を下回るカセット配列を決定することができる。ジャンクションエピトープ提示スコアは、カセット内のジャンクションエピトープの提示尤度に関連付けられた量であり、ジャンクションエピトープ提示スコアの値が高いほど、カセットのジャンクションエピトープがＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩまたはその両方によって提示されやすいことを示す。
一実施形態では、カセット設計モジュールは、候補カセット配列間で最も低いジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられたカセット配列を決定することができる。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列について繰り返し処理を行い、各候補カセットのジャンクションエピトープ提示スコアを決定し、閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた最適なカセット配列を特定することができる。
カセット設計モジュールは、候補カセット配列内のジャンクションエピトープのいずれかが、ワクチンを設計しようとする特定の患者の自己エピトープであるかどうかを識別するために１つ以上の候補カセット配列をさらに確認することができる。これを行うには、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴなどの既知のデータベースに対してジャンクションエピトープを確認する。一実施形態では、カセット設計モジュールは、ジャンクション自己エピトープを防止するカセットを設計するように構成することができる。
カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチを実行して、すべての、または大部分の可能な候補カセット配列について繰り返し処理を行うことで最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する配列を選択することができる。しかしながら、かかる候補カセットの数は、ワクチンの容量が大きくなるにしたがって途方もなく大きくなりうる。例えば、２０個のエピトープのワクチン容量では、カセット設計モジュールは、最小のエピトープ提示スコアを有するカセットを決定するために約１０１８個の可能な候補カセットについて繰り返し処理を行わなければならない。この決定は、カセット設計モジュールが妥当な長さの時間内で患者に対するワクチンを生成するには計算の負荷（必要とされる計算処理リソースの点で）が大きくなり、時として処理不能となりうる。さらに、各候補カセットについて可能なジャンクションエピトープを処理することはよりいっそうの負荷となりうる。したがって、カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチにおける候補カセット配列の数よりも大幅に小さい候補カセット配列の数について繰り返し処理を行う方法に基づいてカセット配列を選択することができる。
カセット設計モジュールは、ランダムに、または少なくとも疑似ランダムに生成された候補カセットを生成し、所定の閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた候補カセットをカセット配列として選択することができる。さらに、カセット設計モジュールは、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有するサブセットからの候補カセットをカセット配列として選択することができる。例えば、カセット設計モジュールは、２０個の選択されたエピトープのセットについて約１００万の候補カセットのサブセットを生成し、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する候補カセットを選択することができる。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、このサブセットからジャンクションエピトープ提示スコアの低いカセット配列を選択することはブルートフォースアプローチと比べて最適とはいえないが、これは、必要な計算リソースが大幅に少なく、そのため、その実施が技術的に可能である。さらに、このより効率的な手法に対してブルートフォース法を行うことは、ジャンクションエピトープ提示スコアのわずかな、またはさらには無視される程度の改善しかもたらされない可能性があるため、リソースの配分の観点からはあまり価値がない。カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ配列を非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）として定式化することにより、改善されたカセット構成を決定することができる。ノードのリスト、及び各ノードのペア間の距離が与えられた場合、ＴＳＰは、各ノードをちょうど１回ずつ訪問して元のノードに戻るための最小の総距離に関連付けられたノードの配列を決定する。例えば、互いの間の距離が既知である都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられた場合、ＴＳＰの解は、可能な巡回路のうちで各都市をちょうど１回ずつ訪問するのに移動する総距離が最小となるような都市の閉じた配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンは、ノードのペア間の距離が非対象である場合の最適なノードの配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢに移動するための「距離」は、ノードＢからノードＡに移動するための「距離」と異なる場合がある。非対称ＴＳＰを用いて改善された最適カセットについて解くことにより、カセット設計モジュールは、カセットの各エピトープ間のジャンクションにわたって低い提示スコアを与えるカセット配列を見つけることができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの各ジャンクションにわたったジャンクションエピトープ提示スコアを最小とするために各エピトープが連結されなければならない順序に対応した治療エピトープの配列を示す。このアプローチによって決定されたカセット配列は、ジャンクションエピトープの提示が大幅に低い配列を与える一方で、特に生成される候補カセット配列の数が大きい場合に、必要とされる計算リソースがランダムサンプリングアプローチよりも大幅に少なくなる可能性がある。異なる計算手法及び最適化カセット設計の比較の例示的な例が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩ．Ｂ．２ 共有抗原ワクチン配列の選択
共有抗原ワクチンに含めるための共有抗原の配列及びかかるワクチンによる治療に適当な患者は、本明細書に示される詳細な開示を用いることで当業者が選択することができる。例えば、表Ａ、１．２、またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を、配列の選択に用いることができる。特定の場合では、特定の変異とＨＬＡアレルの組み合わせが好ましい場合があり（例えば、それぞれが対象に存在することを示す特定の対象から得られるシークエンシングデータに基づき）、次にこれらを組み合わせて用い、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を用いてワクチンに含めるための共有新生抗原配列を同定することができる。例示的な変異とそれらに結びつけられたＨＬＡアレルを表３２及び３４に示す。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍと、Ｂ３５１２、Ｂ３５０３、及びＢ３５０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐと、Ａ０１０１、Ａ０３０１、Ｂ５７０１、Ａ６８０１、Ａ０３０２、及びＡ１１０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、及びＡ６８０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ及びＢ１８０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＤまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＲまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａと、Ａ０３０１、Ａ０３０２、Ａ１１０１、Ｂ１５１０、Ｃ０３０３、及びＣ０３０４のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎと、Ａ２４０２及びＡ２３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ及びＡ０３０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＬまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌと、Ａ０２０７、Ｃ０８０２、及びＡ０２０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖと、Ｂ１５０１及びＢ１５０３の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、Ａ３１０１、Ｃ０１０２、及びＡ０３０２のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＨまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆと、Ａ２３０１、Ａ２４０２、Ｂ１５１０、Ｂ３９０６、Ｃ０５０１、Ｃ１４０２、及びＣ１４０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙと、Ａ１１０１及びＡ０３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅと、Ａ２４０２、Ｃ１４０３、及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＣまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＸＩＩＩ．例示的なコンピュータ
本明細書に記載される計算方法のいずれにおいてもコンピュータを使用することができる。当業者には、コンピュータは異なるアーキテクチャを有し得る点が認識されよう。当業者には周知のコンピュータの例は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩＶ．抗原送達ベクターの例
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に完全に説明されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい）。
ＸＩＶ．Ａ．新生抗原カセットの設計
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答（複数可）を刺激するクラスＩ ＭＨＣに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原（ＴＳＮＡ）を送達することができる。１つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはＴＳＮＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、（１）１個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いＴ細胞応答を生じることができるかどうか、（２）どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のＴＳＮＡ間に配置される最適リンカーを作るか、（３）カセット内の各エピトープの相対位置がＴ細胞応答に影響するか、（４）カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するＴ細胞応答の程度または質に影響するかどうか、（５）細胞ターゲティング配列の付加がＴ細胞応答を向上させるか。
抗原提示及びモデルカセット内のマーカーエピトープに特異的なＴ細胞応答を評価するために以下の２つの指標が開発された。すなわち、（１）特殊な操作を行ったレポーターＴ細胞の活性化によって測定される抗原提示の評価を可能としたインビトロ細胞ベーススクリーン（Ａａｒｎｏｕｄｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、及び（２）対応するエピトープ特異的Ｔ細胞応答によるヒト由来のカセットから誘導されたエピトープのワクチン接種後の免疫原性を評価するためにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を使用したインビボアッセイ（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
ＸＩＶ．Ｂ．抗原カセット設計の評価
ＸＩＶ．Ｂ．１．方法及び材料
ＴＣＲ及びカセット設計及びクローニング
選択されたＴＣＲは、Ａ＊０２０１により提示される場合にペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＰＤＢ番号５Ｄ２Ｎ）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（ＰＤＢ番号３ＲＥＶ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（ＰＤＢ番号１ＯＧＡ）ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（ＰＤＢ番号１ＡＯ７）を認識する。２Ａペプチド連結ＴＣＲサブユニット（βに続きα）、ＥＭＣＶＩＲＥＳ、及び２Ａ連結ＣＤ８サブユニット（βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子）を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ社により合成されたものである。
インビトロエピトーププロセシング及び提示実験用の細胞株の作製
ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社より購入し、水／ＤＭＳＯ（２：８，ｖ／ｖ）に加えた１０ｍＭ ｔｒｉｓ（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはＧｉｂｃｏ社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳｈｉ）はＳｅｒａｄｉｇｍ社より入手した。ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質、ゼオシン、及びプロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社より入手した。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を１０％ ＦＢＳｈｉ、ピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに０．３μｇ／ｍＬのプロマイシンを加えた。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９２）をＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＤＭ）＋２０％ＦＢＳｈｉ中で培養した。Ｕ−８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４）細胞を、１０％ＦＢＳｈｉを添加したＭＥＭ Ｅａｇｌｅｓ培地中で維持した。
Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞は、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターコンストラクトを含んでいる。Ｌｕｃｉａ遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合によって活性化されると、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを培地中に分泌させる。このルシフェラーゼは、ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃルシフェラーゼ検出試薬を用いて測定することができる。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ細胞をレンチウイルスで形質導入して抗原特異的ＴＣＲを発現させた。ＨＩＶ由来レンチウイルストランスファーベクターをＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社より入手し、ＶＳＶ−Ｇ（ｐＣＭＶ−ＶｓｖＧ）、Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）及びＧａｇ−ｐｏｌ（ｐＣｇｐＶ）を発現するレンチウイルス支持プラスミドをＣｅｌｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ社より入手した。
レンチウイルスを、４０μＬのリポフェクタミン及び２０μｇのＤＮＡミクスチャー（重量比４：２：１：１のトランスファープラスミドｐＣｇｐＶ：ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ：ｐＣＭＶ−ＶｓｖＧ）を使用し、ＨＥＫ２９３細胞の５０〜８０％コンフルエンスにあるＴ７５フラスコをリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でトランスフェクトすることにより調製した。８〜１０ｍＬのウイルス含有培地をＬｅｎｔｉ−Ｘシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて濃縮し、ウイルスを１００〜２００μｌの新鮮培地中に再懸濁した。この体積を用いて等しい体積のＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ細胞（５×１０Ｅ４〜１×１０Ｅ６個の細胞を異なる実験で使用した）にオーバーレイした。０．３μｇ／ｍｌのプロマイシン含有培地中での培養後、細胞をソートしてクロナリティーを得た。これらのＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンを、ペプチドを取り込ませたＴ２細胞を用いて活性及び選択性について試験した。
インビトロエピトーププロセシング及び提示アッセイ
Ｔ２細胞はＴＣＲによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。Ｔ２細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており（ＴＡＰ欠損）、内因性のペプチドをＭＨＣ上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、Ｔ２細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。５種類のマーカーペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ及び２種類の無関係のペプチドＷＬＳＬＬＶＰＦＶ、ＦＬＬＴＲＩＣＴをＴ２細胞に取り込ませた。簡単に述べると、Ｔ２細胞をカウントし、ＩＭＤＭ＋１％ＦＢＳｈｉで１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。各ペプチドは１０μｇペプチド／１×１０６細胞となるように加えた。次いで細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。細胞をＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳｈｉで２回洗浄し、５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬを９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレートにプレーティングした。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬをＴ２細胞に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いでプレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
アデノウイルスカセットによるマーカーエピトープ提示を試験するため、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を代理抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用い、アデノウイルスベクターで形質導入した。Ｕ−８７ ＭＧ細胞を収穫し、９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレート中で培地中に５×１０Ｅ５細胞／１００μｌでプレーティングした。プレートを３７℃で約２時間インキュベートした。アデノウイルスカセットをＭＥＭ＋１０％ＦＢＳｈｉでＭＯＩ１００、５０、１０、５、１及び０に希釈し、Ｕ−８７ ＭＧ細胞に５μｌ／ウェルで加えた。プレートを再び３７℃で約２時間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ−８７ ＭＧ細胞に１００μＬ／ウェルで加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートした。プレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
免疫原性実験用のマウス系統
トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ社より入手した。これらのマウスは、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１リーダードメイン、α１ドメイン、及びα２ドメインと、マウスＨ２−Ｋｂ α３ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインから構成されるキメラクラスＩ分子からなる導入遺伝子を有するものである（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらの実験で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドの野生型ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃの雌及びホモ接合型ＨＬＡ−Ａ２．１Ｔｇの雌の第１世代子孫（Ｆ１）である。
アデノウイルスベクター（Ａｄ５ｖ）による免疫化
ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により１×１０１０〜１×１０６個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の１２日後に測定した。
リンパ球の単離
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、１０％ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）中で組織を解離させた。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。１×１０５個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
新しく単離したリンパ球を２〜５×１０６細胞／ｍＬの密度で１０ｕＭの示したペプチドと２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３−６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を１：１００で使用した。試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で収集した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮｇ＋の割合（％）及び全ＩＦＮｇ＋細胞数／１×１０６個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
ＸＩＶ．Ｂ．２．抗原カセット設計のインビトロ評価
抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した（図１）。認識後、特性がよく知られているペプチド−ＨＬＡの組み合わせに特異的な５種類のＴＣＲのうちの１つを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ−ＬｕｃｉａレポーターＴ細胞が活性化され、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターＣＤ８ Ｔ細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
個々のＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａレポーター株は、等モル量の翻訳産物が得られるようにＰ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された抗原特異的ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖を含む発現コンストラクトによるレンチウイルス形質導入によって改変されたものである（Ｂａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。細胞表面上のＣＤ８は標的ｐＭＨＣ分子に対する結合親和性にとって重要であり、その細胞質テールの結合を介してシグナル伝達を促進する（Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｙａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）ことから、レンチウイルスコンストラクトへの第２のＣＤ８β−Ｐ２Ａ−ＣＤ８α因子の付加によって、親レポーター細胞株に欠損しているＣＤ８共受容体の発現がもたらされる。
レンチウイルスによる形質導入の後、Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａレポーターをプロマイシン選択下で増殖させ、ＦＡＣＳ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（単一細胞蛍光支援細胞選別）に供し、モノクローナル集団をルシフェラーゼ発現について試験した。これにより、機能的細胞応答を有する特異的ペプチド抗原１、２、４、及び５について安定的に形質導入されたレポーター細胞株が得られた（表２）。
（表２）インビトロＴ細胞活性化アッセイの開発
ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的Ｔ細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、一連の短いカセットにおいて、すべてのマーカーエピトープを同じ位置に組み込み（図２Ａ）、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（図２Ｂ）を分離するリンカーのみを変えた。レポーターＴ細胞を、これらの短いカセットを発現するアデノウイルスコンストラクトを感染させたＵ−８７抗原提示細胞（ＡＰＣ）と個々に混合し、ルシフェラーゼ発現を非感染コントロールに対して測定した。モデルカセット内の４つすべての抗原が、一致するレポーターＴ細胞により認識され、複数の抗原が効率的にプロセシング及び提示されていることが示された。Ｔ細胞応答の程度は、天然及びＡＡＹリンカーについて概ね同様の傾向にしたがった。ＲＲリンカーベースのカセットから放出された抗原は、低いルシフェラーゼの誘導を示す（表３）。抗原プロセシングを阻害するように設計されたＤＰＰリンカーは、エピトープ提示が低いワクチンカセットを生じた（表３）。
（表３）短いカセット内のリンカー配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、ＤＰＰベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。Ｔ細胞エピトープのみ（リンカー無し）＝９ＡＡ、片側に天然リンカー＝１７ＡＡ、両側に天然リンカー＝２５ＡＡ、非天然リンカー＝ＡＡＹ，ＲＲ，ＤＰＰ
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、ヒト及びマウスのエピトープ以外に、カセットのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置された、ユビキチン（Ｕｂ）、ＭＨＣ及びＩｇ−κシグナルペプチド（ＳＰ）、及び／またはＭＨＣ膜貫通（ＴＭ）モチーフなどのターゲティング配列を含むさらなる一連の短いカセットを構築した（図３）。アデノウイルスベクターによってＵ−８７ ＡＰＣに送達されると、レポーターＴ細胞は、複数のカセット由来の抗原の効率的なプロセシング及び提示を示した。しかしながら、Ｔ細胞応答の程度は、異なるターゲティング機構によって大きく影響されなかった（表４）。
（表４）モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイを用いることにより、４つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がＴ細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
ＸＩＶ．Ｂ．３．抗原カセット設計のインビボ評価
抗原カセット設計の評価の別の例として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に制限された形でＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた５つのヒトクラスＩ ＭＨＣエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した（図２Ａ、３、５Ａ）。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した（図４）。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１及びマウスＨ２−Ｋｂから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１のリーダー、マウスα３に連結されたα１及びα２ドメイン、膜貫通及び細胞質Ｈ２−Ｋｂドメインで構成されたキメラクラスＩ ＭＨＣ分子をコードしている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。このキメラ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に制限された抗原提示を可能とする一方で、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ上のα３ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
短いカセットでは、すべてのマーカーエピトープが、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した際に、一般的に報告されているもの（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）よりも約１０〜５０倍強い、Ｔ細胞応答を生じた。評価を行ったすべてのリンカーのうち、それぞれにその天然のアミノ酸配列が隣接した最小エピトープを含む２５マー配列のコンカテマーが、最大かつ最も広いＴ細胞応答を生じた（表５）。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーにより、抗原特異的Ｔ細胞応答がＣＤ８ Ｔ細胞から誘導されることが示された。
（表５）短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスが１ｅ１１個のアデノウイルス粒子による感染１７日後にカセット内のすべてのクラスＩ ＭＨＣ制限エピトープに対してＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2021525076
別の例では、元の５つのマーカーエピトープの隣に、既知のＣＤ８ Ｔ細胞反応性を有するさらに１６個のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１及びＢ＊４４：０５エピトープを含む一連の長いワクチンカセットを構築し、アデノウイルスベクターに組み込んだ（図５Ａ、Ｂ）。これらの長いカセットのサイズは、最終的な臨床用のカセット設計によく似たものとし、各エピトープの互いに対する位置のみを変えた。ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方でその程度及び幅において同等であり、（ａ）さらなるエピトープの追加が元のエピトープのセットに対する免疫応答の程度に大きく影響せず、また、（ｂ）カセット内のエピトープの位置はそれに続くＴ細胞応答に大きく影響しないことを示すものである（表６）。
（表６）長いカセット内のエピトープの位置の影響のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスが５ｅ１０アデノウイルス粒子による感染１７日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2021525076
＊技術的なエラーによりＴ細胞応答が見られなかったと疑われる。
ＸＩＶ．Ｂ．４．免疫原性及び毒性試験用の抗原カセットの設計
要約すると、モデルカセット評価による知見（図２〜５、表２〜６）によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約２０個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列（例えば、両側に８個のアミノ酸残基）が隣接した最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ（例えば、９個のアミノ酸残基）をそれぞれが埋め込んだ２５マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのＮ末端及び／またはＣ末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ＭＨＣ ＩのエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶは、その５’末端側に天然の５’配列ＷＱＡＧＩＬＡＲが、その３’末端側に天然の３’配列ＱＧＱＮＬＫＹＱが隣接し、それによりＨＣＭＶ ｐｐ６５由来源タンパク質内にみられる
Figure 2021525076
という２５マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列（複数可）が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各２５マー配列は、それに続く２５マー配列に直接連結される。最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープがアミノ酸９個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然２５マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸１０個のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープには、アミノ酸８個とアミノ酸７個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に含ませた２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた。これらのクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーによって最後のクラスＩエピトープに連結した。この２個のクラスＩＩエピトープはまた、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーによって互いに対しても連結され、さらにＣ末端側にＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）を隣接させた。エピトープの位置もその数もＴ細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
さらなる例として、モデルカセットにより得られたインビトロ及びインビボデータ（図２〜５、表２〜６）に基づき、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、マウス及びヒトで免疫原性を示すことが知られている、特性のよく知られたＴ細胞エピトープを交互に配したカセット設計を生成した。いずれもそれらの天然の２５マー配列に埋め込まれた２０個のエピトープの後に、評価を行ったすべてのモデルカセットに存在する２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた（図６）。このカセット設計を用いて、複数種における免疫原性を調べ、ならびに薬理学的及び毒物学的研究を行った。
ＸＩＶ．Ｂ．５． 抗原カセットの設計ならびに３０個、４０個、及び５０個の抗原の評価
それぞれがアミノ酸２５個の長さである３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）、または５０個（ＸＸＬ）のエピトープを有する大きな抗原カセットを設計した。これらのエピトープは、腫瘍抗原を含む疾患抗原をモデル化するためのヒト、ＮＨＰ、及びマウスのエピトープの混合である。図２９に、異なる種からのエピトープの一般的な編成を示す。使用したモデル抗原は、ヒト、霊長類、及びマウスモデルについて表３７、３８、及び３９にそれぞれ記載されている。表３７、３８、及び３９のそれぞれは、エピトープの位置、名前、最小エピトープの記述、及びＭＨＣクラスを記載している。
これらのカセットを記載したようにｃｈＡｄ６８及びアルファウイルスベクターにクローニングし、より長い複数エピトープのカセットのの有効性の評価を行った。図３０は、ウェスタンブロットによる、予想されたサイズの少なくとも１つの大きなバンドによって示されるように、大きな抗原カセットのそれぞれがＣｈＡｄＶベクターから発現されたことを示している。
マウスを記載したように免疫して大きなカセットの有効性の評価を行った。Ｔ細胞応答を、エピトープＡＨ１（上のパネル）及びＳＩＮＮＦＥＫＬ（下のパネル）について、ｃｈＡｄ６８ベクターによる免疫後にＩＣＳ及びテトラマー染色することにより（それぞれ図３１／表４０及び図３２／表４１）、また、ｓｒＲＮＡベクターによる免疫後にＩＣＳ染色することにより（図３３／表４２）分析した。３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）、または５０個（ＸＸＬ）のエピトープを発現するｃｈＡｄ６８及びｓｒＲＮＡワクチンベクターを用いた免疫により、モデル疾患エピトープに対するＣＤ８＋免疫応答が誘導された。
（表３７）大きなカセット内のヒトエピトープ
Figure 2021525076
（表３８）大きなカセット内のＮＨＰエピトープ
Figure 2021525076
（表３９）大きなカセット内のマウスエピトープ
Figure 2021525076
（表４０）ＣｈＡｄの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＮＮＦＥＫＬペプチドに応答した平均のＩＦＮｇ＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
（表４１）ＣｈＡｄの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＮＮＦＥＫＬ抗原に対する平均のテトラマー＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
（表４２）ＳＡＭの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＮＮＦＥＫＬペプチドに応答した平均のＩＦＮｇ＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
ＸＶ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクター
ＸＶ．Ａ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの構築
１つの例では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）を操作して抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１（米国特許第６０８３７１６号に記載の配列番号２）に基づいて合成し、Ｅ１（ｎｔ４５７〜３０１４）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。このクローンをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型Ｃ６８ウイルスの配列を確認するため、単離ＶＲ−５９４をＡＴＣＣより入手して継代した後、個々に配列決定した（配列番号１０）。ＡＣ＿００００１１．１配列を野生型ＣｈＡｄＶ６８ウイルスのＡＴＣＣ ＶＲ−５９４配列（配列番号１０）と比較したところ、６個のヌクレオチドの相違が特定された。１つの例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ 配列番号１）。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７〜３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１１）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；配列番号１２）を、欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７〜３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，１２５〜３１，８２５）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１３）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；配列番号２）を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
関連するベクターを下記に示す。
− 完全長ＣｈＡｄＶＣ６８配列「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換したＡＣ＿００００１１．１配列
− ＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ Ｃ６８ （配列番号１０）；独立してシークエンシングしたもの；完全長Ｃ６８
− ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ （配列番号１１）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１（ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；ＧＦＰレポーターは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
− ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー （配列番号１２）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１ （ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；モデル新生抗原カセットは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
− ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ （配列番号１３）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１（ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，１２５〜３１，８２５）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換；ＧＦＰレポーターは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
ＸＶ．Ｂ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの試験
ＸＶ．Ｂ．１．ＣｈＡｄベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞のトランスフェクション
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
１０ｕｇのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化してウイルスゲノムを遊離させた。次いでＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を製造者の指示にしたがって使用してＤＮＡを長いＤＮＡフラグメントについて精製し、２０ｕｌの予め加熱した水中に溶出した。溶出工程の前にカラムを３７℃で０．５〜１時間放置した。
トランスフェクションの１４〜１８時間前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を１０６細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに導入した。各ウェルごとに細胞に新鮮な培地（ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミン酸を含む１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ｈｉＦＢＳ）を被せた。トランスフェクションでは、各ウェル当たり１〜２ｕｇの精製したＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがってｕｌ体積の２倍（２〜４ｕｌ）のリポフェクタミン２０００とともに用いた。トランスフェクションミックスを含む０．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を、各ウェル内で１ｍｌの通常の培地に加え、細胞上で一晩放置した。
トランスフェクトした細胞培養物を３７℃で少なくとも５〜７日間インキュベートした。ウイルスプラークがトランスフェクションの７日後に視認されなかった場合、細胞を１：４または１：６に分割し、３７℃でインキュベートしてプラーク生成について監視した。あるいは、トランスフェクトした細胞を収穫し、３サイクルの凍結と解凍に供し、細胞ライセートを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させ、ウイルスプラークが観察されるまで細胞をインキュベートしてもよい。
リン酸カルシウムを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞へのＣｈＡｄＶ６８ベクターのトランスフェクション及び三次ウイルスストックの生成
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの１日前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を５％ＢＳ／ＤＭＥＭ／１ＸＰ／Ｓ，１×Ｇｌｕｔａｍａｘ中で、６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で播種した。トランスフェクション当たり２個のウェルが必要とされる。トランスフェクションの２〜４時間前に培地を新鮮な培地に交換した。ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰプラスミドをＰａｃＩで直鎖状とした。次いで、直鎖状とされたＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出し、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、及び２体積の１００％エタノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１２，０００×ｇで５分間遠心することによってペレット化した後、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを風乾し、５０μＬの滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用してＤＮＡ濃度を決定し、体積を５μｇのＤＮＡ／５０μＬに調整した。
１６９μＬの滅菌水をマイクロチューブに加えた。次いで５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２をこの水に加え、ピペッティングして静かに混合した。５０μＬのＤＮＡをＣａＣｌ２溶液に滴下した。次いで２６μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加えてμピペッターで２回ピペッティングして静かに混合した。この最終溶液は、２５０μＬの０．２５Ｍ ＣａＣｌ２中の５μｇのＤＮＡからなるはずである。次いで２５０μＬの２×ＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）の入った第２のチューブを用意した。ピペットエイドに取り付けた２ｍＬ滅菌ピペットを使用して２×ＨＢＳ溶液に空気を徐々にバブリングした。同時に、０．２５Ｍ ＣａＣｌ２溶液中のＤＮＡ溶液を滴下した。最後のＤＮＡの液滴の滴下後、約５秒間、バブリングを継続した。次いで溶液を室温で最大２０分間インキュベートした後、２９３Ａ細胞に加えた。６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で１日前に播種した２９３Ａ細胞の単層に２５０μｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム溶液を滴下した。細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートした。２４時間後に培地を交換した。７２時間後に細胞を６ウェルプレート内に１：６に分割した。単層を細胞変性効果（ＣＰＥ）の証拠について光学顕微鏡によって毎日監視した。トランスフェクションの７〜１０日後にウイルスプラークを観察し、ウェル内の培地をピペッティングして細胞を浮かせることにより単層を収穫した。収穫した細胞及び培地を５０ｍＬの遠心チューブに移した後、凍結解凍を３ラウンド行った（−８０℃及び３７℃）。その後得られた、一次ウイルスストックと呼ばれるライセートを、ベンチトップ遠心分離器上で最大速度（４３００×ｇ）で遠心することにより清澄化させ、ライセートの一定の割合（１０〜５０％）を使用してＴ２５フラスコ中で２９３Ａ細胞に感染させた。感染細胞を４８時間インキュベートした後、細胞及び培地を完全なＣＰＥで収穫した。細胞を再び収穫し、凍結解凍して清澄化した後、この二次ウイルスストックを使用して、フラスコ当たり１．５×１０７細胞で播種されたＴ１５０フラスコに感染させた。７２時間後に完全ＣＰＥが得られた時点で細胞を収穫し、上記のウイルスストックと同様に処理して三次ストックを生成した。
２９３Ｆ細胞内での生成
８％ＣＯ２のインキュベーター内の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞内でＣｈＡｄＶ６８ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率９８％で１ｍＬ当たり１０６細胞に希釈し、１ＬのＳｈａｋｅフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中、１回の生成操作当たり４００ｍＬを使用した。１回の感染当たり目標ＭＯＩが３．３よりも高い４ｍＬの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が７０％を下回るまで４８〜７２時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再び遠心してから２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を３回行って溶解し、４，３００×ｇで５分間遠心して清澄化した。
ＣｓＣｌ遠心分離による精製
ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ遠心分離により精製した。２つの不連続な勾配の操作を行った。第１の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第２の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
１０ｍＬの１．２（２６．８ｇのＣｓＣｌを９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）ＣｓＣｌをポリアロマー製チューブに加えた。次いで、８ｍＬの１．４ＣｓＣｌ（５３ｇのＣｓＣｌを８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）をピペットを用いてチューブの底に届けるように慎重に加えた。清澄化したウイルスをこの１．２の層の上に層をなすように慎重に加えた。必要な場合、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えてチューブのバランスを取った。次いでチューブをＳＷ−３２Ｔｉローターに入れて、１０℃で２時間３０分遠心した。次いでチューブを層流キャビネットに取り出して、１８ゲージの針と１０ｍＬの注射器を使用してウイルスバンドを引き抜いた。夾雑した宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質を除去しないように注意を払った。次いでバンドを少なくとも２回１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で希釈し、上記に述べた不連続勾配で上記と同様に層をなすように加えた。今回は操作を一晩行った以外は上記と同様にして遠心操作を行った。翌日、機能不全の粒子バンドを引き抜かないように注意しながらバンドを引き抜いた。次いでカセット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用してＡＲＭバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ｐＨ８．０，２５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５％グリセロール）に対してウイルスを透析した。これをバッファーを１回交換するごとに３回、１時間行った。次いでウイルスを一定分量に分けて−８０℃で保存した。
ウイルスアッセイ
１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数はＯＤ２６０ｎｍの吸光度の値＝１に相当することに基づき、ＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮を行った。アデノウイルスの２つの希釈度（１：５と１：１０）をウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で作った。両方の希釈度でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈係数×１．１×１０１２ＶＰを掛けることによりＶＰ濃度／ｍＬを測定した。
感染単位（ＩＵ）力価を、ウイルスストックの限界希釈アッセイによって計算した。ウイルスを最初にＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳ中で１００倍に希釈した後、１０倍希釈率を用いて１×１０−７にまで希釈した。次いで１００μＬのこれらの希釈液を、２４ウェルプレートのウェル当たり３ｅ５細胞で少なくとも１時間前に播種した２９３Ａ細胞に加えた。これを２重に行った。プレートを４８時間、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター内でインキュベートした。次いで細胞を、１×ＰＢＳで洗浄した後、１００％の冷却メタノール（−２０℃）で固定した。次いでプレートは最小で２０分間にわたって−２０℃でインキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で１時間、室温でブロッキングした。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファー（ウェル当たり０．２５ｍＬ）中に１：８，０００の希釈率で加え、室温で１時間インキュベートした。各ウェルをウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄した。１０００倍に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）を各ウェルに加え、最終回の洗浄の１時間前にインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を５回行い、０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中、ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）基質を使用して現像した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６７ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ）。各ウェルをカウントの５分前に現像した。視野当たり４〜４０個の染色された細胞を与えるような希釈率を用いて１０倍の対物レンズ下で細胞をカウントした。使用した視野は０．３２ｍｍ２の格子とし、２４ウェルプレート上の視野当たり６２５個に相当した。１ｍＬ当たりの感染性ウイルスの数は、格子１個当たりの染色細胞の数×視野当たりの格子の数×希釈係数１０によって求めることができる。同様に、ＧＦＰ発現細胞を扱う場合には、カプシド染色の代わりに蛍光を用いて１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現ビリオンの数を決定することができる。
免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌性マウス及びＢａｌｂ／ｃ系の雌性マウスに、１００ｕＬ体積中１×１０８個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性の筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶ．Ｂ．２．ＤＮＡトランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図７）及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図８）のＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製（ウイルスプラーク）をトランスフェクションの７〜１０日後に観察した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルスプラークを光学（図７Ａ及び８Ａ）及び蛍光顕微鏡法（図７Ｂ〜Ｃ、及び図８Ｂ〜Ｃ）を使用して可視化した。ＧＦＰは、増殖性ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成を示す。
ＸＶ．Ｂ．３．ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の増殖
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルスをＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの１８日後に生成した（図９）。精製ＣｈＡｄＶ６８ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びＣｈＡｄＶＹ２５（近縁のＣｈＡｄＶ；Ｄｉｃｋｓ，２０１２，ＰｌｏＳ ＯＮＥ７，ｅ４０３８５）ウイルスストックと比較した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルス力価は、Ａｄ５及びＣｈＡｄＶＹ２５と同等であった（表７）。
（表７）２９３Ｆ懸濁細胞内でのアデノウイルスベクターの生成
Figure 2021525076
＊ＳＤは、複数回の生成工程が行われた場合にのみ報告している。
ＸＶ．Ｂ．４．腫瘍モデルにおける免疫原性の評価
マウス腫瘍抗原を発現するＣ６８ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、Ｃ６８ベクターがＴ細胞応答を誘発することを実証する。ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬに対するＴ細胞応答Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１−Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：５２９−５３８）に対するＴ細胞応答をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。図１５に示されるように、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるマウスの免疫後にコントロールに対して強いＴ細胞応答が測定された。脾細胞１０６個当たり、８９５７個及び４０１９個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均の細胞性免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系またはＢａｌｂ／ｃ系マウスをそれぞれＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫した場合に免疫の１０日後に観察された。
腫瘍浸潤リンパ球についても、ＣｈＡｄＶ及び抗ＣＴＬＡ４抗体の共投与を評価するＣＴ２６腫瘍モデルにおいて評価した。マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、移植７日後にＣｈＡｄＶワクチンで免疫し、抗ＣＴＬＡ４抗体（クローン９Ｄ９）またはコントロールとしてＩｇＧで処置した。免疫１２日後に腫瘍浸潤リンパ球を分析した。各マウスからの腫瘍をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びマウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解離させた。解離した細胞を３０ミクロンのフィルターに通して濾過し、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。抗原特異的細胞をＭＨＣ−テトラマー複合体によって同定し、抗ＣＤ８及び生細胞マーカーで共染色した。プライム免疫の１２日後に腫瘍を回収した。
腫瘍内の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ、ＣｈＡｄＶ、抗ＣＴＬＡ４、及びＣｈＡｄＶ＋抗ＣＴＬＡ４処置群において、全生細胞集団の中央値で３．３％、２．２％、または８．１％を構成していた（図４１及び表４５）。活性ＣｈＡｄＶ免疫と組み合わせた抗ＣＴＬＡによる処置により、ＣｈＡｄＶ単独及び抗ＣＴＬＡ４単独のいずれよりも抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が統計的に有意に増大し、抗ＣＴＬＡ４はｃｈＡｄ６８ワクチンと共投与される場合に腫瘍内の浸潤Ｔ細胞の数を増大させることが示された。
（表４５）ＣＴ２６腫瘍中のテトラマー＋浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の頻度
Figure 2021525076
ＸＶＩ．アルファウイルス抗原送達ベクター
ＸＶＩ．Ａ．アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
ＲＮＡを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドＤＮＡをＰｍｅＩによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し（ＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ社）、テンプレートとして使用した。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をｍ７Ｇキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造者の指示にしがって使用してｍＲＮＡを精製した。
インビボ実験を行うには、ＴｒｉＬＩｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって生成され、精製されたＲＮＡをＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｐ１でキャップした。
ＲＮＡのトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、９６ウェルのウェル当たり６ｅ４細胞で、２４ウェルのウェル当たり２ｅ５細胞で、トランスフェクションの約１６時間前に播種した。細胞にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用してｍＲＮＡをトランスフェクションした。９６ウェルでは、ウェル当たり０．１５ｕＬのリポフェクタミン及び１０ ｎｇ のｍＲＮＡを使用し、２４ウェルでは、ウェル当たり０．７５ｕＬのリポフェクタミン及び１５０ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ＧＦＰを発現するｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をトランスフェクションのコントロールとして使用した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の９６ウェルプレートで、ＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して測定した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの２時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったｍＲＮＡをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でＲＬＴ ｐｌｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してホモジナイズし、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して全ＲＮＡを定量した。製造者のプロトコールにしたがってｑＴｏｗｅｒ３ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、反応当たり２０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ＡｃｔｉｎまたはＧｕｓＢを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー／プローブはＩＤＴ社により生成されたものである（表８）。
（表８）ｑＰＣＲプライマー／プローブ
Figure 2021525076
Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの左下脇腹に１０５個のＢ１６−ＯＶＡ細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、３日間にわたって増殖させた。
ＣＴ２６腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中１０ｕｇのＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ａｄ５ワクチンについては、マウスに、１００ｕＬ体積中５×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｄ９，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ−１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
インビボ生物発光イメージング
各時点においてマウスに腹腔内注射により１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を注射し、注射の１０〜１５分後にＩＶＩＳインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して生物発光を測定した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶＩ．Ｂ．アルファウイルスベクター
ＸＶＩ．Ｂ．１．アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、抗原発現システム用のＲＮＡアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ：Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００−４１３）ベースの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターから生成した。１つの例では、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ（ＶＥＥ配列の７５４４〜１１，１７５を欠失させた。番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。配列番号６）、抗原配列（配列番号１４及び配列番号４）またはルシフェラーゼレポーター（例えばＶＥＥ−ルシフェラーゼ、配列番号１５）に置き換えた（図１０）。ＲＮＡをインビトロでｓｒＲＮＡ ＤＮＡベクターから転写させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする（非複製）ｍＲＮＡを比較のためにトランスフェクトした。ＶＥＥ−ルシフェラーゼのｓｒＲＮＡでは、２時間の測定値を２３時間の測定値と比較した場合にｓｒＲＮＡレポーターシグナルの約３０，０００倍の増大が観察された（表９）。これに対して、同じ時間でのｍＲＮＡレポーターのシグナルの増大は１０倍未満であった（表９）。
（表９）ＶＥＥ自己複製ベクターからのルシフェラーゼの発現は経時的に増大する
９６ウェル中、ウェル当たり１０ｎｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡまたは１０ｎｇの非複製ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｌ−６３０７）をＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位（ＲＬＵ）として報告する。各データポイントは、３つのトランスフェクトしたウェルの平均±ＳＤである。
Figure 2021525076
別の例では、ｓｒＲＮＡの複製を、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ルシフェラーゼをコードしたｓｒＲＮＡ（ＶＥＥ−ルシフェラーゼ）または複数のエピトープカセット（ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー）をコードしたｓｒＲＮＡのいずれかのトランスフェクション後のＲＮＡレベルを測定することにより確認した。ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでは約１５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１０）のに対して、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡでは３０〜５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１１）。これらのデータは、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターが細胞にトランスフェクトされると複製されることを示すものである。
（表１０）ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３Ａ細胞にＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。
Figure 2021525076
（表１１）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３細胞にＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はＧｕｓＢ参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもｓｒＲＮＡのエピトープカセット領域を検出する２つの異なるｑＰＣＲプライマー／プローブのセットを表す。
Figure 2021525076
ＸＶＩ．Ｂ．２．アルファウイルスベクターのインビボ評価
別の例において、ＶＥＥ−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを注射し、注射の２４及び４８時間後、ならびに７及び１４日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の２４時間後に検出され、時間とともに増大し、ｓｒＲＮＡ注射の７日後にピークとなった（図１１）。
ＸＶＩ．Ｂ．３．アルファウイルスベクター腫瘍モデルの評価
１つの実現形態において、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、２つの異なるＭＨＣクラスＩマウス腫瘍エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ及びＡＨ１−Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９−５３８）を発現するＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターを作製した（ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ，配列番号１４）。ＳＦＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）エピトープは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞株によって発現され、ＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ；Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）エピトープは、ＣＴ２６結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするＴ細胞を誘導する（ＡＨ１／ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：９７３０−９７３５）。１つの例では、インビボ実験において、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ が、Ｔ７ポリメラーゼ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された。
ＳＦＬを標的とした、コントロールに対して強い抗原特異的Ｔ細胞応答が、ＭＣ３で製剤化したＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによる、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化の２週間後に観察された。１つの例では、脾細胞１０６個当たり中央値で３８３５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＳＦＬペプチドによる刺激後に測定され（図１２Ａ、表１２）、ペンタマー染色により測定した場合に、ＣＤ８ Ｔ細胞の１．８％（中央値）がＳＦＬ抗原特異的であった（図１２Ｂ、表１２）。別の例では、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＶＥＥ ｓｒＲＮＡワクチンとの同時投与によって、全体のＴ細胞応答の中度の増大が認められ、脾細胞１０６個当たり中央値で４７９４．５個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１２Ａ、表１２）。
（表１２）Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにおけるＶＥＥ ｓｒＲＮＡ免疫化の１４日後のＥＬＩＳＰＯＴ及びＭＨＣＩペンタマー染色アッセイの結果
Figure 2021525076
*Ｖａｘグループのマウス＃６からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
別の実現形態では、臨床アプローチを反映するため、Ｂ１６−ＯＶＡ及びＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて異種プライム／ブーストを行い、腫瘍を有するマウスを、同じ抗原カセット（Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ）を発現するアデノウイルスベクターで最初に免疫した後、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライムの１４日後にＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡワクチンでブースト免疫を行った。１つの例では、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹワクチンによって抗原特異的免疫応答が誘導され、脾細胞１０６個当たり７３３０個（中央値）のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ａ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の２．９％（中央値）がＳＦＬ抗原を標的化していた（図１３Ｃ、表１３）。別の例では、Ｔ細胞応答は、Ｂ１６−ＯＶＡモデルにおいてＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブーストの２週間後に維持され、脾細胞１０６個当たり３９６０個（中央値）のＳＦＬ特異的ＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ｂ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の３．１％（中央値）がＳＦＬを標的化していた（図１３Ｄ、表１３）。
（表１３）Ａｄ５ワクチンプライム及びｓｒＲＮＡブーストによる異種プライム／ブースト後のＢ１６−ＯＶＡマウスの免疫モニタリング
Figure 2021525076
別の実現形態では、同様の結果が、ＣＴ２６マウスモデルにおけるＡｄ５−ＵｂＡＡＹによるプライム及びＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後に観察された。１つの例では、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹによるプライム後（１４日目）にＡＨ１抗原特異的応答が観察され、脾細胞１０６個当たり平均で５１８７個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１４Ａ、表１４）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後（２８日目）には脾細胞１０６個当たり３７９９個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１４Ｂ、表１４）。
（表１４）ＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおける異種プライム／ブースト後の免疫モニタリング
Figure 2021525076
ＸＶＩＩ．ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、マウスＣＴ２６腫瘍モデルで評価した。
ＸＶＩＩ．Ａ ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の方法及び材料
腫瘍の注入
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アーム（各群当たりマウス２８〜４０匹）をランダムカセット配列し、処置を開始した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。各実験アームは表１５に詳細に記載したとおりである。
（表１５）ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の実験アーム
Figure 2021525076
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中１０ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ｃ６８ワクチンについては、マウスに、１００ｕＬ体積中１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ−１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶＩＩ．Ｂ ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの評価
ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの異種プライム／ブースト、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの同種プライム／ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表１５に詳細に、また表１６により一般的に記載したとおりである。
（表１６）プライム／ブースト実験アーム
Figure 2021525076
脾臓をプライムワクチン接種の１４日後に収穫して免疫モニタリングを行った。腫瘍及び体重測定値を週２回測定し、生存率を監視した。すべての活性ワクチン群でコントロールに対する強い免疫応答が観察された。
それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ−１／グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ−１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、最初の免疫の１４日後に、脾細胞１０６個当たり、中央値で１０，６３０個、１２，９７６個、３３１９個、または３７４５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の細胞性免疫応答が観察された（図１６及び表１７）。これに対して、ワクチンコントロール（グループ１）または抗ＰＤ−１をともなうワクチンコントロール（グループ２）は、それぞれ、脾細胞１０６個当たり中央値で２９６個または２８５個のＳＦＣの細胞性免疫応答を示した。
（表１７）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答
Figure 2021525076
ＥＬＩＳｐｏｔのデータと一致して、それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ−１／グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ−１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析において、最初の免疫の１４日後にＣＤ８ Ｔ細胞の５．６、７．８、１．８、または１．９％（中央値）が抗原特異的応答を示した（図１７及び表１８）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ−１との組み合わせで免疫したマウスは、それぞれ、０．２及び０．１％の抗原特異的ＣＤ８応答を示した。
（表１８）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答
Figure 2021525076
ＣＴ２６結腸腫瘍モデルのすべてのグループで腫瘍増殖が測定され、腫瘍増殖は処置開始の２１日後（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射の２８日後）までみられる。大きな腫瘍サイズ（＞２５００ｍｍ３）に基づいて処置開始の２１日後にマウスを屠殺したため、分析のバイアスを避けるために最初の２１日間のみを示している。２１日目における平均腫瘍体積は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ−１（グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト＋抗ＰＤ−１（グループ６）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ７）、及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ−１（グループ８）でそれぞれ、１１２９、８４８、２１４２、１４１８、２１９８及び１６０６ ｍｍ３であった（図１８及び表１９）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ−１との組み合わせにおける平均腫瘍体積は、それぞれ、２３６１または２０６７ｍｍ３であった。これらのデータに基づけば、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（グループ６）、及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（グループ８）は、コントロール（グループ１）と有意に異なる腫瘍増殖の低下を２１日目にもたらした。
（表１９）ＣＴ２６モデルで測定された２１日目の腫瘍サイズ
Figure 2021525076
ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて処置開始後３５日間（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射後４２日間）にわたって生存率を監視した。改善された生存率が、試験した組み合わせのうちの４つでマウスをワクチン接種した後に観察された。ワクチン接種後、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ４；コントロールグループ１に対してＰ＜０．０００１）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ８；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００６）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００３）、及び、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ６；コントロールグループ１に対してＰ＝０．００１６）を用いたマウスの、それぞれ、６４％，４６％，４１％及び３６％が生存した（図１９及び表２０）。生存率は、残りの処置群［ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ７）、及び抗ＰＤ−１単独（グループ２）］ではコントロールグループ１（≦１４％）と有意差は認められなかった。
（表２０）ＣＴ２６モデルにおける生存率
Figure 2021525076
結論として、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡは、コントロールに対して、各ワクチンによりコードされたマウス腫瘍抗原に対する強いＴ細胞応答を誘発した。腫瘍を有するマウスへの、抗ＰＤ−１の同時投与をともなう、もしくはともなわないＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストの投与、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーと抗ＰＤ−１との組み合わせの投与、または、同種プライムブースト免疫としてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡと抗ＰＤ−１との組み合わせの投与は、高い生存率につながった。
ＸＶＩＩＩ．非ヒト霊長類実験
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で評価した。
材料及び方法
プライミングワクチンを各ＮＨＰで筋肉内（ＩＭ）注射して実験を開始した（ワクチンプライム）。１回以上のブースターワクチン（ワクチンブースト）も各ＮＨＰに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
免疫化
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＬＮＰ−１またはＬＮＰ−２中で製剤化した１×１０１２個のウイルス粒子（注射１回当たり５×１０１１個のウイルス粒子）のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、３０ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、１００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、または３００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡで両側性に免疫した。３０ｕｇ、１００ｕｇまたは３００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
免疫モニタリング
ＰＢＭＣを、プライムワクチン接種後の示した時間にＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）及びＬｅｕｃｏＳｅｐ分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）を使用して単離し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリー法を用いてＴ細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（エクスビボ酵素結合免疫スポット）分析を用いてＩＦＮ−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。サルＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。２００，０００個のＰＢＭＣを、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープに対する特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを用いてＩＦＮ−γなどの細胞内サイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。いずれの方法の結果も、サイトカインが、エピトープに対して抗原特異的な形で誘導したことを示している。
アカゲザルにおける免疫原性
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３０μｇ及び１００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、（ｂ）ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕ−Ａ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各群６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡベクターのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
（表２１）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2021525076
免疫化の前及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った。
結果
６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後に測定した。表２１に示すように、各動物に、４及び８週目に、ＬＮＰ１またはＬＮＰ２のいずれかと製剤化した用量３０μｇまたは１００μｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによるブースト免疫を行った。６種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした（図２０Ａ〜Ｄ及び表２２〜２５）。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７０、１４、１５、１１、７、８、１４、１７、１２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ａ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１０８、−３、１４、１、３７、４、１０５、１７、２５ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｂ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり−１７、３８、１４、−２、８７、２１、１０４、１２９、８９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｃ）。負の値は、各エピトープ／動物のプレブリード値に対して正規化した結果である。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１２１８、１７８４、１８６６、９７３、１８１３、７４７、７９７、１２４９、及び５４７ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｄ）。免疫応答は、予想されたプロファイルを示し、ピーク免疫応答がプライム免疫化の約２〜３週後に測定され、４週後に免疫応答が退縮した。ＰＢＭＣ１０６個当たり１８１３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の５週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後（５週目）に測定された免疫応答は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化（３週目）について測定されたピーク免疫応答と同等であった（図２０Ｄ）。ＰＢＭＣ１０６個当たり１２４９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答がそれぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の９週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後（９週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前に測定された免疫応答よりも約２倍高かった（図２０Ｄ）。
（表２２）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）（グループ１）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２３）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）（グループ２）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２４）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）（グループ３）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２５）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー プライムについての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験（より高い用量）
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性を評価し、（ｂ）用量３００μｇで、ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。さらに、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕＡ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各グループ６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ−Ａ＊０１制限抗原を含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
グループ１については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（異種のプライム／ブースト）。グループ２及び３については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（同種のプライム／ブースト）。
（表２６）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2021525076
結果
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４週後に測定した（図２１及び表２７）。動物に、４、１２、及び２０週目にＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７５０、４２２５、１１００、２５２９、３２１８、１９１５、１７０８、１５６１、５０７７、４５４３、４９２０、５８２０、３３９５、２７２８、１９９６、１４６５、４７３０、２９８４、２８２８、または３０４３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２１）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブースト免疫化の１週後（１３週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前（１２週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる３度目のブースト免疫化の１週後（２１週目）に測定された免疫応答は、２度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前（２０週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、さらに、２種類の異なるＬＮＰ製剤（ＬＮＰ１及びＬＮＰ２）を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後に測定した（図２２及び２３、表２８及び２９）。動物に、４及び１２週目にＬＮＰ１またはＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。複合的な抗原特異的免疫応答が、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１６８、２０４、１０３、１２６、１４０、１４５、３３０、２０３、及び１６２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２２）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１８９、１８５、３４９、４３７、４９２、５７０、２３３、８８６、３６９、及び３８１ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２３）。
（表２７）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（グループ１）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２８）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（３００μｇ）（グループ２）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２９）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３００μｇ）（グループ３）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
ｓｒＲＮＡの用量範囲実験
本発明の一実現形態では、ｓｒＲＮＡの用量範囲実験を、ｍａｍｕＡ０１インドアカゲザルで実施することによって、どのｓｒＲＮＡ用量をＮＨＰ免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。１つの例では、ＭａｍｕＡ０１インドアカゲザルに、複数のｍａｍｕＡ０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたｓｒＲＮＡベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで１つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、２週間ごとにＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する（表３０）。
（表３０）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験
Figure 2021525076
＊ｓｒＲＮＡの用量範囲は３００μｇ以下の高用量で決定される。
インドアカゲザルにおける免疫原性の実験
抗原ベクターを用いて免疫原性を実証するため、ｍａｍｕＡ０１のインドアカゲザル（ＮＨＰ）でワクチン実験を行った。図３４は、ワクチン接種の手法を示す。ＮＨＰの３つのグループを、チェックポイント阻害剤として抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブ（グループ５及び６）とともに、またはチェックポイント阻害剤なし（グループ４）で、ＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫した。抗体は、静脈内（グループ５）または皮下（グループ６）投与した。三角は、０週目及び３２週目におけるｃｈＡｄ６８によるワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０、４、１２、２０、２８、及び３２週目におけるアルファウイルスワクチン接種を示す。
免疫したＮＨＰにおけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的経過を、ｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫単独（図３５及び表３１Ａ）、ｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫とチェックポイント阻害剤の静脈内（ＩＶ）投与（図３６及び表３１Ｂ）、及びｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫とチェックポイント阻害剤の皮下（ＳＣ）投与（図３７及び表３１Ｃ）について示す。これらの結果は、ｃｈＡｄ６８ベクターが霊長類においてＣＤ８＋応答を効率的にプライミングし、アルファウイルスベクターがｃｈＡｄ６８ワクチンのプライミング応答を効率的にブーストし、チェックポイント阻害剤は静脈内または皮下投与のいずれでもプライミング及びブースト応答の両方を増幅し、ワクチン接種後のｃｈＡｄベクターの再投与が免疫応答を効果的にブーストしたことを示している。
（表３１Ａ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧを投与したアカゲザル（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
（表３１Ｂ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＩＶ投与による抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
（表３１Ｃ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＳＣ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
インドアカゲザルにおけるメモリー表現型の判定
アカゲザルを、抗ＣＴＬＡ４と、または抗ＣＴＬＡ４なしで、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーのｓｒＲＮＡ異種プライミング／ブーストレジメンで免疫してから、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで再びブーストした。各グループを、最後のｃｈＡｄＶ６８の投与の１１ヶ月後（実験１８ヶ月目）に、記載されるようにＥＬＩＳｐｏｔを行って評価した。図３８及び表４３は、免疫前（左パネル）及び１８ヶ月後（右パネル）にＥＬＩＳｐｏｔにより測定した６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する細胞応答を示す。制限エピトープに対する応答の検出は、ｃｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって抗原特異的メモリー応答が生じたことを示す。
メモリーを評価するため、ワクチンにコードされた４種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を、各抗原が固有のダブルポジティブの組み合わせによって示されることで、単一の試料中の４つの抗原特異的集団のすべてを特定することができる、２色Ｍａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー標識を用いて観測した。メモリー細胞の表現型判定を、細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７で共染色することにより行った。図３９及び表４４は、４種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープを認識するメモリーＴ細胞についてコンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色の結果を示す。Ｔ細胞表現型をフローサイトメトリーによっても評価した。図４０は、実験１８ヶ月目における４種類のＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の総和中のメモリー細胞タイプの分布を示す。メモリー細胞は以下のようにキャラクタライズした。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。まとめると、これらの結果は、最後のブーストの少なくとも１年後にメモリー応答が検出されたことを示し、エフェクター、セントラルメモリー、及びエフェクターメモリーを含む、長期的に持続する免疫を示すものである。
（表４３）プライミング前及びメモリー評価の時点（１８ヶ月）における各動物のＰＢＭＣ１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）
Figure 2021525076
ND=技術的排除により測定されず。
（表４４）生ＣＤ８＋細胞に占めるＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー陽性の割合（％）
Figure 2021525076
ＸＩＸ．ＭＨＣ／ペプチド標的反応性Ｔ細胞及びＴＣＲの同定
標的応答性Ｔ細胞及びＴＣＲを、表Ａ、ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果、及び／または表１．２に記載される抗原／ＨＬＡペプチド（配列番号５７〜２９３５７、及び下記を参照）のペアのうちの１つ以上について同定する。
Ｔ細胞は、患者の血液、リンパ節、または腫瘍から単離することができる。Ｔ細胞は、例えば、抗原−ＭＨＣテトラマー結合細胞を分取することにより、またはＴ細胞と抗原でパルスした抗原提示細胞とのインビトロ共培養物中で刺激した活性化された細胞を分取することにより、抗原特異的Ｔ細胞について濃縮することができる。抗原ロードテトラマー及び他のＭＨＣベースの試薬をはじめとする、抗原特異的Ｔ細胞の同定のためのさまざまな試薬が当該技術分野で知られている。
抗原関連αβ（またはγδ）ＴＣＲダイマーを、抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲのシングルセルシークエンシングによって同定することができる。また、抗原特異的Ｔ細胞のバルクＴＣＲシークエンシングを行ってもよく、マッチングの確率が高いαβのペアを当該技術分野では周知のＴＣＲペアリング法を用いて決定することができる。
代わりにまたはこれに加えて、健康なドナーから得たナイーブＴ細胞のインビトロプライミングによって抗原特異的Ｔ細胞を得ることもできる。ＰＢＭＣ、リンパ節、または臍帯血から得られたＴ細胞を抗原でパルスした抗原提示細胞によって繰り返し刺激することにより、抗原経験Ｔ細胞の分化を開始させることができる。この後、ＴＣＲを患者からの抗原特異的Ｔ細胞について上記に述べたのと同様にして同定することができる。
ＸＸ．共有抗原の同定
本発明者らは、一連の工程を用いて共有新生抗原を同定した。本発明者らは、ＣＯＳＭＩＣデータベースより、「ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ」として分類される共通のドライバー変異のリストを取得した。各変異について、本発明者らは、モデル化したすべてのＨＬＡアレルについて候補新生抗原（８〜１１マーのペプチド）を生成し、ＴＰＭ＝１００を用い、本発明者らのＥＤＧＥ予測モデル（いずれもあらゆる目的でそれらの全容を本明細書に援用するところの国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に記載される、ＭＳ／ＭＳによりシークエンシングしたＨＬＡ提示ペプチドで訓練したディープラーニングモデル）を使った。各ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸を含み、自己ペプチドではなかった点に留意されたい。次に、本発明者らは、ＥＤＧＥスコア＞０．００１を有するＨＬＡアレルを有するすべてのペプチドを記録した。結果を表Ａに示す。これにより、合計で１０２６１個の新生抗原配列が同定され、これらを配列番号１０７５５〜２１０１５として記載する。各配列について対応するＨＬＡアレル（複数可）を示す。
表Ａに示される初期のリストを、患者集団内の新生抗原／ＨＬＡ出現率のレベルについてさらに分析した。「抗原／ＨＬＡ出現率」は、特定の集団内の抗原の頻度（Ａ）にその特定の集団内のＨＬＡアレルの頻度（Ｂ）を掛けた値として計算される。抗原／ＨＬＡ出現率は、変異／ＨＬＡ出現率または新生抗原／ＨＬＡ出現率のことも指す場合がある。この分析の一環として、各変異について、その（Ａ）頻度をＴＣＧＡにおける共通の腫瘍タイプにわたって得て、腫瘍タイプ間でその最も高い頻度で記録した。（Ｂ）ＥＤＧＥ内の各ＨＬＡアレルについて、ＨＬＡアレル頻度ＴＣＧＡ（主に白人の集団）を記録した。ＨＬＡアレル頻度については、あらゆる目的で本明細書に援用するところのＳｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１１５２−１１５８ ２０１５）に詳細に記載されている。新生抗原／ＨＬＡ出現率は、（Ａ）に（Ｂ）を掛けた値として計算した。この方法を用いて出現率が０．１％よりも大きい表Ａ内のすべての新生エピトープ／ＨＬＡのペアを「最も普通１」（２３８７／１０２６１）として同定した。
さらに、本発明者らは、潜在的な臨床試験に関連した進行がん患者の集団を代表する患者試料の大きなコホートにまたがったがんドライバー変異の出現率を特性評価した。ダナ・ファーバー、ジョンズ・ホプキンズ、ＭＤアンダーソン、ＭＳＫＣＣ、バンダービルトを含む、主要な学術的がん研究機関より得た５０〜５００遺伝子の範囲のＮＧＳがん遺伝子パネルでシークエンシングした４万人の患者を有する、一般に開放されているＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅ ｖ４．１データセットを用いてＥＤＧＥ予測を行った。本発明者らは、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌における塩基置換ならびにｉｎｄｅｌ変異を選択し、複数の遺伝子パネルにまたがったカバレッジを要した。本発明者らは、本発明者らのＥＤＧＥ抗原提示予測モデルでカバーされる９０種を超えるＣｌａｓｓＩ ＨＬＡアレルのそれぞれとペアをなす各新生抗原ペプチドを分析し、ＨＬＡ提示スコアのＥＤＧＥ確率が０．００１よりも大きいエピトープ及び対応するＨＬＡアレルを記録した。次いで、本発明者らは、Ａが３つの腫瘍タイプ間で最も高い変異の頻度であり、ＢがＨＬＡアレル頻度であるものとして、Ａ＊Ｂとして計算されるＥＤＧＥスコア＞０．００１であるペプチドの新生抗原／ＨＬＡ出現率を求めた。本発明者らは、ＴＣＧＡ集団からのＨＬＡアレルを調べ、各ＨＬＡアレルの頻度を表にすることにより（Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、米国における集団を代表するＨＬＡアレル頻度を用いた。分析からの新生抗原／ＨＬＡ出現率＞０．０１％を示したペプチド及び対応するＨＬＡアレルを配列番号２１０１６〜２９３５７に記載し、ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果と称する。
ＸＸＩ．共有された新生抗原提示の検証
候補共有新生抗原の質量分析（ＭＳ）による検証を、標的化質量分析法を用いて行った。およそ５００個の凍結、切除した肺腫瘍、大腸直腸腫瘍、及び膵臓腫瘍試料をホモジナイズし、ＨＬＡ／ペプチド複合体のＲＮＡＳｅｑトランスクリプトームシークエンシング及び免疫沈降の両方で使用した。トランスクリプトームの分析により各試料についてペプチド標的リストを生成し、それにより、ＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅ ｖ４．１データセットに定義されるような再発性がんドライバー変異を同定し、ＲＮＡ発現レベルを評価した。次いで、抗原提示のＥＤＧＥモデルを変異配列及び発現データに適用してターゲティングリストのペプチドを優先順位付けした。質量分析に先立ってＨＬＡ分子からのペプチドを溶出し、サイズ排除を用いて回収して提示ペプチドを単離した。同じアミノ酸配列を有する合成重標識ペプチドを各試料とともに共ロードして標的化質量分析を行った。本発明者らは、重標識ペプチドと実験ペプチドの共溶出及び断片化パターンの分析の両方を用いて候補エピトープの検証を行った。質量分析法は、あらゆる目的で本明細書にその全容を援用するところのＧｉｌｌｅｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｊａｎ；１０（１）：２８−３４）により詳細に記載されている。さらなる検討を行うのに充分な出現率を有するこの方法により検証されたドライバー変異からの共有新生抗原エピトープを、試料腫瘍タイプ及び関連するＨＬＡアレルとともに下記表３２に要約する。
（表３２）ＭＳで検証された新生抗原エピトープの発現
Figure 2021525076
＊ある患者において複数のＨＬＡアレルによって同じペプチドが提示され、ＭＳ／ＭＳによって検出されると予測された場合、このペプチドは、ＥＤＧＥによるスコアが最も高いＨＬＡアレルによって、またはスコアが充分に近い場合には両方のアレルによって提示されるものと推測された。
本発明者らは、治療するための特定のＨＬＡを有する患者を幅狭くターゲティングする（例えば、ワクチンカセットに含まれる新生抗原を提示する少なくとも１つの検証または予測されたＨＬＡアレルを患者が有することが求められる）ことの価値を評価するため、ペプチドが検出されなかった変異に関してＭＳデータをさらに評価した。
例えば、ＫＲＡＳの場合、本発明者らは、特定のＨＬＡアレルについてＫＲＡＳエピトープペプチドが検出された、または検出されなかった患者試料の数をカウントした。（ある患者において複数のＨＬＡアレルによって同じペプチドが提示され、ＭＳ／ＭＳによって検出されると予測された場合、このペプチドは、ＥＤＧＥによるスコアが最も高いＨＬＡアレルによって、またはスコアが充分に近い場合には両方のアレルによって提示されるものと推測された。）結果を表３３に示す。これらの結果に基づけば、いくつかの共通のＨＬＡアレルは特定のＫＲＡＳ新生抗原を提示すると予想されず、これらのＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペアは、この場合、ワクチンカセットの設計及び患者の選択のための選択基準の目的では除外することができる。例えば、表３４は、ペプチドが試験した１７個の試料で検出されなかったことに基づき、特定のワクチン／カセット（下記、セクションＸＸＩＩを参照）が予測された新生抗原／ＨＬＡペアＧ１２Ｄ／Ａ＊０２：０１を含まず、同様に、ペプチドが試験した９つの試料で検出されたかったことに基づき、Ｇ１２Ｖ／Ａ＊０２：０１を含まなかったことを示している。これに対して、新生抗原／ＨＬＡペアＧ１２Ｄ／Ａ＊１１：０１は、試験した５つの試料のうちの１つで検出されたことに基づいて検証されたとみなされ、Ｇ１２Ｖ／Ａ＊１１：０１はペプチドが試験した６つの試料のうちの２つで検出されたことに基づいて検証されたとみなされた。
これらの結果は、表３４に記載されるものなどの共有新生抗原ワクチンによる治療を行うための患者の選択において適正なＨＬＡ型を選択するための関連した新生抗原／ＨＬＡペアを同定することの重要性を強調するものである。具体的には、いくつかの共通のＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペアはこの場合、選択基準の目的で除外したが、これは、ＭＳデータが、共有された新生抗原ワクチンがその予測されたＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペア（例えば、Ｇ１２Ｄ／Ａ＊０２：０１またはＧ１２Ｖ／Ａ＊０２：０１）を有する患者に有益な効果をもたらす可能性が低いことを示唆したことによる。
（表３３）
Figure 2021525076
Figure 2021525076
Figure 2021525076
ＸＸＩＩ．Ａ． ワクチンカセット用の共有新生抗原の選択
２０個の共有新生抗原を含むワクチンカセット（「ＧＯ−００５」）を構築した。表３４は、カセット用に選択された新生抗原の特徴を示す。表３２で上記に記載したように、質量分析によって腫瘍細胞の表面で直接検出された共有新生抗原がカセットに含まれ、エピトープのＨＬＡを変異の適格なＨＬＡリストに加えた。本発明者らのアッセイで提示されるものとして独立して検証されなかった新生抗原は、腫瘍提示の有力な文献の証拠がある場合には検証されたものとみなし、カセットに加えた（例えば、新生抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）。ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２により提示されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄは、この新生抗原を標的としてＣＲＣの患者に腫瘍退縮を引き起こした養子細胞療法の文献の証拠に基づいて検証されたものとみなし、加えた（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６ Ｄｅｃ ８；３７５（２３）：２２５５−２２６２．）。検証されたＨＬＡアレルを有する新生抗原が２０個のスロットの６個を占めた。
さらに、腫瘍細胞によって提示されることが予測されるが、ＭＳによって検証されてはいない、より稀な新生抗原を用いて初期のセットを補完した。標的化質量分析（ＭＳ）検証実験（上記セクションＸＸＩを参照）により本発明者らが観察したＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の強い依存関係を考慮し、高いＥＤＧＥスコアを有する変異は予測される新生抗原として含まれるように優先順位付けした。標的化ＭＳによるＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関を示す結果を図２５に示す。具体的には、残りのスロットを、ＥＤＧＥ ＨＬＡ提示スコアが少なくとも０．３であり、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、及び膵癌にまたがって最も高い累積新生抗原／ＨＬＡ出現率を有する予測新生抗原で埋めた。カセット内の各スロットについて、組み合わされたＨＬＡ頻度が少なくとも５〜１０％であることが求められた（例えば、米国人集団の１１％がＨＬＡアレルＢ１５０１またはＢ１５０３を保有する）。留意すべき点として、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳはコドン１２、１３、及び６１の周囲の同じカセット配列を有するため、高頻度のＮＲＡＳ変異の組み込みにはさらなるスロットを必要としなかった。検証されたＨＬＡ、ＥＤＧＥスコアが少なくとも０．３である予測されるＨＬＡ、予測されるＨＬＡの平均ＥＤＧＥスコア、及び３つのがん集団における新生抗原／ＨＬＡ出現率も表３４に示す。
（表３４）ワクチンカセットＧＯ−００５内の選択された共有新生抗原
Figure 2021525076
Figure 2021525076
さらに、本発明者らは、共有新生抗原ワクチンＧＯ−００５に含まれる少なくとも１つの共有新生抗原を提示するものとして同定された（すなわち、検証されたかまたは予測された）少なくとも１つのＨＬＡアレルを有する患者の全集団を決定し、これを、患者が同定されたアレルを有しているかどうかとは関係なく、変異を有する患者の集団と比較した。ＧＯ−００５が標的とする患者集団を推定するために表３４のＧＯ−００５ワクチンカセットを考慮し、本発明者らはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅから患者の変異データを収集した。これらの患者は一致するＨＬＡアレルを有していないため、本発明者らはＴＣＧＡ集団からＨＬＡアレルをサンプリングし、これをＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅのデータセットとペアに組み合わせた。次いで、腫瘍タイプを考慮し、変異及びＨＬＡの両方で一致するＡＡＣＲからのすべての患者を陽性として標識し、この基準を満たさないすべての患者は陰性として標識した。陽性率（％）は、表３５の各腫瘍タイプ当たりの全体の治療対象となりうる患者集団を与える。
表３５より、特定の変異を有する患者のサブセットのみがその変異を新生抗原として提示する可能性が高いＨＬＡアレルも有していることが容易に理解される。この変異を有するが適当なＨＬＡアレルを有さない患者は、治療から有益な効果を得る可能性は低い。例として、膵癌患者の推定約６０％が適当な変異／新生抗原を有しているのに対して、これらの患者の３分の２超が対応するＨＬＡアレル（複数可）を有していない。したがって、提案される関連する変異とＨＬＡアレルのペアを考慮したワクチン接種手法は、有益な効果を受け得る患者のみを標的とするものとなる。したがって、検証されたかまたは高いスコアを有する予測されたＨＬＡによるエピトープ提示を考慮することは、共有新生抗原ワクチンの潜在的有効性を決定するうえで重要なステップである。
（表３５）標的集団における新生抗原／ＨＬＡ出現率
Figure 2021525076
ＸＸＩＩ．Ｂ．共有新生抗原ワクチンカセット配列の選択
共有新生抗原ワクチンに含めるための共有新生抗原配列を選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍと、Ｂ３５１２、Ｂ３５０３、及びＢ３５０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐと、Ａ０１０１、Ａ０３０１、Ｂ５７０１、Ａ６８０１、Ａ０３０２、及びＡ１１０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、及びＡ６８０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ及びＢ１８０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＤまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１） ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方、または（２） ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＲまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａと、Ａ０３０１、Ａ０３０２、Ａ１１０１、Ｂ１５１０、Ｃ０３０３、及びＣ０３０４のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎと、Ａ２４０２及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ及びＡ０３０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＬまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌと、Ａ０２０７、Ｃ０８０２、及びＡ０２０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖと、Ｂ１５０１及びＢ１５０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、Ａ３１０１、Ｃ０１０２、及びＡ０３０２のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＨまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆと、Ａ２３０１、Ａ２４０２、Ｂ１５１０、Ｂ３９０６、Ｃ０５０１、Ｃ１４０２、及びＣ１４０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙと、Ａ１１０１及びＡ０３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅと、Ａ２４０２、Ｃ１４０３、及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＣまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＸＸＩＩＩ．共有新生抗原のＴ細胞認識の評価
本発明者らは、新生抗原が患者に免疫応答を誘導するかどうかを評価した。本発明者らは、肺腺癌を有する患者から解離腫瘍細胞を得た。腫瘍細胞をシークエンシングして患者のＨＬＡを決定し、変異を同定した。患者はＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しており、本発明者らは、腫瘍にＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ変異を同定した。同時に、本発明者らは、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を代表するＣＤ４５＋細胞を分取して増殖させた。増殖させたＴＩＬを変異させたペプチドＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーで染色して患者におけるこの変異の免疫原性を評価した。図２６は、ＣＤ８＋細胞に対するフローサイトメトリーゲーティング手法（左パネル）及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーによるＣＤ８＋細胞の染色（右パネル）を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな割合（６６％超）が、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ：ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーへの結合を示し、新生抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示し、また、新生抗原に対する既存の免疫応答を示した。
さらに、本発明者らは、共有新生抗原を認識することが可能な健康なドナーのナイーブＴ細胞のレパートリー中のＴ細胞前駆細胞の存在について評価を行った。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮化し、ワクチンカセットＧＯ−００５の中に存在する共有新生抗原候補である２ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖペプチド、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃペプチド、及びＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐペプチドエピトープのうちのいくつかを提示するＭＨＣマルチマーで染色した。ＨＬＡペプチド結合細胞を分取して増殖させ、新生抗原に対するそれらの特異性を確認した。試験した変異のすべてについて前駆細胞が検出された（表３６）。新生抗原に特異的なＴ細胞のＴＣＲシークエンシングも行った。図２７は、一般的なＴＣＲシークエンシング手法及びワークフローを示す。図２８は、ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーのＴＣＲシークエンシング手法の代表的な例を示す。ＴＣＲシークエンシング手法によってポリクローナル応答が示され、ペプチド／ＭＨＣ当たり、及びドナー当たり中央値で７３種（２５〜９８７種の範囲）のクロノタイプが同定された（表３６）。したがって、ナイーブＴ細胞のレパートリー分析は、これらの新生抗原がワクチン接種によって投与された場合に選択された患者に免疫応答を誘導すると予想されることを示唆するものである。
（表３６）新生抗原応答性ナイーブＴ細胞前駆細胞の評価
Figure 2021525076
ＸＸＩＶ．共有新生抗原及び患者集団の選択
本明細書に記載される表３４、表Ａ、表１．２、またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果（配列番号５７〜２９３５７）に示される抗原のうちの１つ以上を用いて本明細書に記載されるようなワクチン組成物を配合する。ワクチンを例えばがんを治療する目的で患者に投与する。特定の場合では、患者を、例えば、コンパニオン診断、またはＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ ＣＤｘ、Ｇｕａｒｄａｎｔ ３６０、Ｇｕａｒｄａｎｔ ＯＭＮＩ、またはＭＳＫ ＩＭＰＡＣＴなどの一般的に用いられているがん遺伝子パネルＮＧＳアッセイを用いて選択する。例示的な患者選択基準を下記に述べる。例示的な共有新生抗原ワクチン組成物ＧＯ−００５は、表３４に記載される変異を標的とするものである。
患者選択
共有新生抗原をワクチン接種するための患者選択は、腫瘍遺伝子発現、体細胞変異の状態、及び患者のＨＬＡ型を考慮して行われる。具体的には、患者は、以下の場合にワクチン治療に適格であるとみなされる。すなわち、
（ａ）ワクチンに含まれるエピトープを提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを患者が有し、患者の腫瘍がそのエピトープ配列を有する遺伝子を発現している、
（ｂ）ワクチンに含まれるエピトープを提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを患者が有し、患者の腫瘍がそのエピトープ配列を生じる変異を有している、
（ｃ）（ｂ）と同じであるが、患者の腫瘍が所定の閾値（例えば、１ＴＰＭまたは１０ＴＰＭ）を上回る変異を有する遺伝子を発現していることも求められる、または、
（ｄ）（ｂ）と同じであるが、患者の腫瘍が所定の閾値（例えば、ＲＮＡのレベルで観察される少なくとも１つの変異リード）を上回る変異を発現していることも求められる、
（ｅ）（ｂ）と同じであるが、（ｃ）及び（ｄ）におけるさらなる基準の両方も求められる、
（ｆ）上記のいずれかであるが、提示ＨＬＡアレルの喪失が腫瘍で検出されないことも任意で求められる。
遺伝子発現は、ＲＮＡＳｅｑ、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ナノストリング、ＩＳＨ、質量分析、またはＩＨＣを含む確立された方法のいずれかによってＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定される。遺伝子発現の陽性の閾値は、以下を含むいくつかの方法によって確立される。すなわち、（１）異なる遺伝子発現レベルでのＨＬＡアレルによるエピトープの提示の予測される確率、（２）質量分析により測定される遺伝子発現とＨＬＡエピトープ提示との相関、及び／または（３）異なるレベルで遺伝子を発現している患者で得られるワクチン接種の臨床効果。患者選択は、ワクチンに含まれる複数のエピトープ、例えば、少なくとも２、３、４、または５個のエピトープについて陽性が求められるようにさらに広げられる。
体細胞変異の状態は、エクソームシークエンシング（ＮＧＳ ＤＮＡＳｅｑ）、標的化エクソームシークエンシング（遺伝子のパネル）、トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡＳｅｑ）、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ（例えば、Ｔａｑｍａｎまたは液滴デジタルＰＣＲ）、質量分析に基づく方法（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍによる）、または当業者には周知の他の任意の方法により評価される。
さらに新たな新生抗原が例えば質量分析により、記載の方法のいずれかを用いて同定される。これらの新たに同定された共有新生抗原は本明細書に記載のワクチンカセットに組み込まれる。
以前に検証された新生抗原が、さらなるＨＬＡアレルによって提示されるものとしてさらに検証され、ワクチンカセットに新生抗原選択についての情報を与え、及び／または潜在的に治療可能な集団を広げる。
新たな新生抗原を含めることで、対処可能な腫瘍タイプを広げる（例えば、ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ）ことが可能となり、新たな腫瘍タイプを有する患者を含めることが可能となる。
ＸＸＶ．共有抗原の同定
本発明者らは、３つの計算ステップを用いて共有抗原遺伝子に基づいた標的を同定した。最初に、本発明者らは、ＧＴＥｘ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） プロジェクト［１］より利用可能なデータを用いて多くの正常組織における発現が低いかまたは発現されない遺伝子を同定した。本発明者らは、ＧＴＥｘ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） プロジェクト（バージョンＶ７ｐ２）より集計された遺伝子発現データを取得した。このデータセットは、７００人を上回る個人及び５０種よりも多い異なる組織タイプからの１１０００個を上回る死体試料からなるものであった。ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びＧＴＥｘ標準パイプライン（https://www.gtexportal.org/home/documentationPage）にしたがって計算処理を用いて発現を測定した。ＲＳＥＭ ｖ１．２．２２［２］を用いて計算したアイソフォーム発現の総和を用いて遺伝子発現を計算した。
次に、本発明者らは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（http://cancergenome.nih.gov/）からのデータを用いてこれらの遺伝子のうちのどの遺伝子ががん試料で異常に発現しているかを同定した。本発明者らは、ＴＣＧＡ（データリリース６．０）より入手可能な１１０００種を上回る試料を調べた。
最後に、これらの遺伝子において、本発明者らは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容を援用するところの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７１５９号に記載されるような、ＭＳ／ＭＳによりシークエンシングされるＨＬＡ提示ペプチドで訓練されたディープラーニングモデルを用いて、どのペプチドがＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面抗原として提示される可能性が高いかを同定した。
本発明者らは、共通腫瘍抗原（ＣＴＡ；共有抗原）を同定するため、腫瘍特異性を確実とするだけ充分に厳密であるが、リードミスアラインメントなどの潜在的アーチファクトを説明する、正常組織で発現される遺伝子を除外するための基準を定義しようと試みた。遺伝子は、以下の基準を満たした場合にＣＴＡとして含めるのに適格とした。すなわち、脳、心臓、または肺の一部である各臓器におけるＧＴＥｘ発現の中央値は、０．１ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）未満であり、５ＴＰＭを上回る試料はなかった。他の必須臓器におけるＧＴＥｘの中央値は２ＴＰＭ未満であり、１０ＴＰＭを上回る試料はなかった。発現は非必須として分類される臓器（精巣、甲状腺、及び小唾液腺）では無視した。遺伝子は、少なくとも３０個の試料でＴＣＧＡにおける発現が１０ＴＰＭよりも大きい場合に腫瘍試料で発現されているものとみなした。文献のレビューに基づき、本発明者らは、遺伝子ＭＡＧＥＢ４及びＭＡＧＥＢ６も加えた。
本発明者らは、遺伝子ＣＴＡＧ１Ａ／ＣＴＡＧ１Ｂ （ＮＹ−ＥＳＯ−１）も加えた。その発現がＴＣＧＡデータリリース６．０の計算方法を用いて正確には定量できないことから、本発明者らは、多重マッピングしたリードを構成するＴＣＧＡレガシーアーカイブ（https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive）で利用可能なＲＳＥＭ計算に依った。
本発明者らは、ＴＣＧＡ試料にまたがった残りの遺伝子の発現の分布を調べた。本発明者らが、既知のＣＴＡ、例えば遺伝子のＭＡＧＥファミリーを調べたところ、対数空間におけるこれらの遺伝子の発現は二峰性分布によって一般的に特徴付けられることを認めた。この分布は、より低い発現値の周囲の左の峰と、より高い発現値における右の峰（または太い尾部）を含んでいた。この発現パターンは、いくつかの最小の発現を多数の試料においてベースラインで検出することができ、遺伝子のより高い発現がエピジェネティックな調節不全を生じた腫瘍のサブセットで観察されるような生物学的モデルと一致している。本発明者らは、ＴＣＧＡ試料にまたがった各遺伝子の発現分布を検討し、顕著な右側の尾部のない単峰性分布のみを認めたものを破棄した。例えば、遺伝子がＧＴＥｘにはない組織で発現する可能性が高い場合、ハンドキュレーションによって少数の遺伝子を破棄した。この結果、５９個の遺伝子のセットが得られた。表４６を参照されたい。表４６において、Ｘは、遺伝子が、少なくとも１％の症例において１０ＴＰＭを上回る値で発現されるがんを示して用いる。
（表４６）がんサブタイプにおける発現レベルの分析
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ＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面抗原として提示される可能性が高いペプチドを同定するため、本発明者らは、スライディングウィンドウを用いてこれらのタンパク質のそれぞれをそれらを構成するアミノ酸８〜１１個の配列に区切って解析した。本発明者らは、これらのペプチド及びそのフランキング配列をＨＬＡペプチド提示ディープラーニングモデルで処理してＴＣＧＡにおいてこの遺伝子で観察される各ペプチドの提示確率を９９．９パーセンタイルの発現レベルで計算した。本発明者らは、本発明者らのモデルにより計算したクオンタイル正規化した提示確率が０．００１よりも高い場合に、提示される可能性が高いペプチドとみなした（すなわち、候補ターゲット）。
特定の適応症に関連する可能性の高い遺伝子を優先順位付けするため、本発明者らは、がん症例の少なくとも０．９８％において少なくとも１０ＴＰＭのレベルで発現される遺伝子を選択した。
結果を表１．２に示す。合計で１０６９８個の共有抗原配列が同定された。各配列について対応するＨＬＡアレル（複数可）を示す。
表Ａ
配列表の配列番号１０７５５〜２１０１５を参照されたい。わかりやすさのため、あるＨＬＡアレルを有する特定のＨＬＡアレルペプチドと０．００１よりも高いＥＤＧＥスコアで関連することが予測された各ペプチドに固有の配列番号を割り当てる。上記の配列識別子のそれぞれは、ペプチドのアミノ酸配列、ＨＬＡサブタイプ、ペプチドに対応する遺伝子名、ペプチドに関連した変異、及び、ペプチド：ＨＬＡペアの頻度が０．１％よりも大きいか（「１」で示す）または０．１％よりも小さい（「０」で示す）かに関連付けられている。
表Ａは、本明細書に参照によりその全容を援用するところの２０１８年１２月５月２３日出願の米国特許仮出願第６２／６７５５５９号にその全容が開示されている。
ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果
配列表の配列番号２１０１６〜２９３５７を参照されたい。わかりやすさのため、あるＨＬＡアレルを有する特定のＨＬＡアレルペプチドと０．００１よりも高いＥＤＧＥスコアかつ０．１％よりも高い頻度で関連することが予測された各ペプチドに固有の配列番号を割り当てる。上記の配列識別子のそれぞれは、ペプチドに対応する遺伝子名及び変異、ＨＬＡサブタイプ、ペプチドのアミノ酸配列と関連付けられている。
表１．２
配列表の配列番号５７〜１０７５４を参照されたい。遺伝子に関連付けられた予測された共有抗原は、がん症例の少なくとも０．９８％において少なくとも１０ＴＰＭのレベルで発現された。上記の配列識別子のそれぞれは、遺伝子名、ペプチドのアミノ酸配列、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ、及び対応するＨＬＡアレル（複数可）と関連付けられている。
特定の配列
本明細書で言及するベクター、カセット、及び抗体を以下に記載し、配列番号で呼ぶ。
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参考文献
Figure 2021525076
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関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的でその全容を参照によって本明細書にそれぞれ援用するところの２０１８年５月２３日出願の米国特許仮出願第６２／６７５，６４９号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，５５９号の利益を主張するものである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年５月２２日に作成され、ＧＳＯ−０１９＿ＳＬ．ｔｘｔの名前が付けられており、そのサイズは６，９２５，５８５バイトである。
背景
腫瘍特異的な抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。１〜３例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である。４，５初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がＴ細胞応答を誘発し６、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる７ことが示されている。
新生抗原ワクチンの設計に関する１つの疑問は、対象とする腫瘍に存在する多数のコーディング変異のうちのどれが「最良の」治療用新生抗原（例えば、抗腫瘍免疫を誘発し、腫瘍退縮を引き起こすことができる抗原）を生じることができるか、ということである。
次世代のシークエンシング、ＲＮＡ遺伝子発現、及び新生抗原ペプチドのＭＨＣ結合親和性の予測を用いた、変異に基づいた分析を取り入れた初期の方法が提案されている８。しかしながら、これらの提案されている方法では、遺伝子発現及びＭＨＣ結合以外の多くの段階（例えば、ＴＡＰ輸送、プロテアソーム切断、及び／またはＴＣＲ認識）を含む９エピトープ生成プロセスの全体をモデル化することはできない。したがって、既存の方法は、陽性適中率（ＰＰＶ）が低くなるという問題を有する傾向にある。
実際、複数のグループによって実施された、腫瘍細胞により提示されるペプチドの分析は、遺伝子発現及びＭＨＣ結合親和性を用いて提示されることが予測されたペプチドの５％未満しか腫瘍表面のＭＨＣ上に見られないことを示している１０，１１。結合予測とＭＨＣ提示との間のこのような低い相関は、変異の数単独に対してチェックポイント阻害剤反応について結合に制限された新生抗原の予測精度の向上が認められないという最近の所見によりさらに強調されている１２。
提示を予測するための既存の方法のこのような低い陽性適中率（ＰＰＶ）は、新生抗原に基づいたワクチンの設計において問題を提示する。ＰＰＶの低い予測を用いてワクチンが設計される場合、大部分の患者で治療用新生抗原が投与される可能性は低くなり、複数の新生抗原が投与される患者はさらに少なくなるものと考えられる（提示されるペプチドのすべてが免疫原性であると仮定したとしても）。したがって、現行の方法による新生抗原ワクチン接種は、腫瘍を有する対象の相当数において奏功する可能性は低い。
さらに、これまでのアプローチは、シス作用性の変異のみを用いて候補新生抗原を生成するものであり、複数の腫瘍タイプで生じ、多くの遺伝子で異常スプライシングにつながるスプライシング因子の変異１３、及びプロテアーゼ切断部位を生じるかまたは除去する変異を含む、新生ＯＲＦのさらなる由来源をほとんどの場合で考慮していなかった。
最後に、腫瘍ゲノム及びトランスクリプトーム解析に対する標準的アプローチは、ライブラリ構築、エクソーム及びトランスクリプトームの捕捉、シークエンシング、またはデータ分析における最適に満たない条件のために、候補新生抗原を生ずる体細胞突然変異を見逃す可能性がある。同様に、標準的な腫瘍分析のアプローチでは、配列アーチファクトまたは生殖系列多型を新生抗原として誤って助長してしまう場合があり、それぞれワクチン容量の非効率的な利用または自己免疫のリスクにつながりうる。
現行の新生抗原予測法の課題に加えて、その多くがヒト由来のものである、ヒトにおける新生抗原送達に使用することができる既存のベクター系にもやはり特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、過去の自然の曝露の結果としてヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫ががん治療を行うために新生抗原を送達するための組換えヒトウイルスの使用にとって大きな障害となりうる。
さらに、変異を有する新生抗原及び変異のない腫瘍抗原（例えば、不適切に発現している腫瘍抗原）の両方をターゲティングすることを含む、がんを有する患者間で共有されている抗原をターゲティングすることは、ワクチン戦略として極めて有望である。共有抗原ワクチン戦略における課題としては少なくとも上記に述べたものが挙げられる。
概要
本明細書では、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物が開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）任意で５’リンカー配列、及び
（Ｃ）任意で３’リンカー配列
を含む、前記少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物も開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、クラスＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、各ＭＨＣ Ｉエピトープコード核酸配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、３’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物が開示される：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｅ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｆ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｇ）ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｈ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｉ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｊ）ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｋ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｌ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｍ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｎ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｏ）ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｐ）ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｑ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｒ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｓ）ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｔ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｕ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、３’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
いくつかの態様では、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープを含まない。
本明細書ではまた、抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物も開示される：
（ａ）任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格、
（ｂ）２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的なＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
（Ａ）アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、前記ＭＨＣクラスＩエピトープの少なくとも１つが、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、５’リンカー配列、
（Ｃ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＣ末端酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、３’リンカー配列
を含み、
前記抗原カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の各３’末端が、前記抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の５’末端に連結されている、
前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４８）と、
（ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４６）と、
（ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする第１の核酸配列と、
（ＩＶ）前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の５’末端と、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする第２の核酸配列と、
（Ｖ）任意で、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の３’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする第３の核酸配列と
を含む、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
を含む、前記抗原カセット。
本明細書ではまた、がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）１）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを有するかどうか、及び、
以下：
１）対象の腫瘍が前記抗原に関連した遺伝子を発現するかどうか、任意で、前記遺伝子が正常細胞または組織と比較して異常に発現しているかどうか、
２）前記対象の腫瘍が前記抗原に関連した変異を有するかどうか
の一方または両方
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現しており、かつ前記対象の腫瘍が前記遺伝子を発現している、かつ／または前記対象の腫瘍が前記変異を有する場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程であって、
前記抗原が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を含む、
前記工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
１）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含む、前記工程と
を含む、前記方法も開示される。
本明細書ではまた、がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）前記対象が、
１）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有するか、
２）Ａ０２０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有するか、
３）Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有するか、または
４）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルまたはＡ３１０１ ＨＬＡアレルまたはＣ０１０２ ＨＬＡアレルまたはＡ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有するか
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が、
１）前記Ａ０３０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有する場合、
２）前記Ａ０２０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有する場合、
３）前記Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有する場合、または
４）前記Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ３１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ｃ０１０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有する場合
に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
１）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
２）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＡＤ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含むものである、前記工程と
を含む、前記方法も開示する。
いくつかの態様では、工程（ａ）及び／または（ｂ）は、前記対象からの試料を処理したサードパーティーからデータセットを得ることを含む。いくつかの態様では、工程（ａ）は、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることと、を含む。いくつかの態様では、前記試料は、腫瘍試料、正常組織試料、または前記腫瘍試料及び前記正常組織試料を含む。いくつかの態様では、前記試料は、組織、体液、血液、腫瘍生検、脊髄液、及び針穿刺吸引物から選択される。いくつかの態様では、前記遺伝子は、表３４に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される。いくつかの態様では、前記遺伝子は、表３２に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される。いくつかの態様では、前記がんは、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌からなる群から選択される。いくつかの態様では、前記ＨＬＡアレルは、少なくとも５％のＨＬＡ頻度を有する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープは、前記対象の腫瘍に関連した細胞上のＨＬＡアレルによって提示される。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書に開示される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを含む。
本明細書はまた、がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、方法も開示する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列は、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来しない。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、方法も開示する。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列は、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む。いくつかの態様では、前記対象は、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、方法も開示する。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含み、前記対象が、表３４に示される対応する変異（例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２）と結びつけられた表３４に示される少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、方法も開示する。
本明細書はまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、１）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む、方法も提供する。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、抗原発現系を含む。いくつかの態様では、抗原発現系は、本明細書に記載される抗原発現系のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、抗原ベースワクチンは、本明細書に記載される医薬組成物のいずれか１つを含む。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの各要素の順序付けられた配列は、５’から３’にかけて、
Ｐａ−（Ｌ５ｂ−Ｎｃ−Ｌ３ｄ）Ｘ−（Ｇ５ｅ−Ｕｆ）Ｙ−Ｇ３ｇ
を含む式で説明され、
式中、
Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、
Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｃ＝１であり、
Ｌ５は、前記５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、
Ｌ３は、前記３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、
Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、
Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）をコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、
Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、
Ｘ＝１〜４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。
いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である。
いくつかの態様では、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、前記骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、前記骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列（配列番号２９３５８）であり、各Ｎは、アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、Ｌ５は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｌ３は、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、前記前記ベクター骨格が、任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含み、前記ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、新生抗原コード核酸配列と機能的に連結される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、５’７−メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写によって生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、哺乳動物細胞内で自己複製する。
いくつかの態様では、骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む。いくつかの態様では、骨格は、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介増幅のための配列は、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。
いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、ＴＣ−８３株を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４と１１１７５との間に欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列である。いくつかの態様では、新生抗原カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように挿入される。
いくつかの態様では、新生抗原カセットの挿入は、ｎｓＰ１〜４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、ｎｓＰ１〜４遺伝子及び少なくとも１つの抗原コード核酸配列は別々のオープンリーディングフレーム内にある。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外因性のＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクター、任意でＣ６８ベクターである。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が配列から完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、配列番号１に記載の配列を含み、任意で、配列は、配列番号１に記載の配列の（１）Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、（２）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、及びＥ３、または（３）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、及びＥ４が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、任意で、遺伝子は、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択される。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、Ｅ１領域、Ｅ３領域、及び／または、新生抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたＡｄＶ領域においてアデノウイルスベクターに挿入される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、誘導性である。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、非誘導性である。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターの少なくとも１つのプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、またはＥＢＶプロモーター配列である。
いくつかの態様では、アデノウイルスの新生抗原カセットは、複数の新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含み、任意で、前記ポリＡ配列は、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの配列の３’側に位置する。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、第１世代、第２世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの１つから生成される。
いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列の塩基対番号５７７〜３４０７に１つ以上の欠失を含み、任意で、アデノウイルスベクターは、塩基対２７１４１〜３２０２２の間、または塩基対２７８１６〜３１３３２に１つ以上の欠失をさらに含む。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号１に記載の配列の塩基対番号３９５７〜１０３４６、塩基対番号２１７８７〜２３３７０、及び塩基対番号３３４８６〜３６１９３に１つ以上の欠失をさらに含む。
いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上の新生抗原発現ベクターは、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、各抗原コード核酸配列内の各抗原コード核酸配列は互いに直接連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する。いくつかの態様において、リンカーは、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基（配列番号２９３５９）、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基（配列番号２９３６０）、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２〜２０個の長さの１つ以上の天然配列からなる群から選択される。いくつかの態様では、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する。いくつかの態様では、リンカーは、配列ＧＰＧＰＧ（配列番号５６）を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つの配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に機能的または直接的に連結される。いくつかの態様では、分離したまたは連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）−１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様において、複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列の少なくとも１つは、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つの変異は、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む。
いくつかの態様では、腫瘍は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも２〜１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は、少なくとも１１〜２０個、１５〜２０個、１１〜１００個、１１〜２００個、１１〜３００個、１１〜４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列は少なくとも２〜４００個の核酸配列を含み、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個は、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様では、対象に投与されて翻訳された場合、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列によってコードされた新生抗原のうちの少なくとも１つは抗原提示細胞上に提示され、腫瘍細胞表面上の新生抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす。いくつかの態様では、少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列が、対象に投与されて翻訳された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ新生抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示されて、腫瘍細胞表面上の新生抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも１つの新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現は、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される。
いくつかの態様では、各ＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、アミノ酸８〜３５個の長さ、任意で、アミノ酸９〜１７個、９〜２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個のポリペプチド配列をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在する。いくつかの態様において、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を対応する野生型の親核酸配列とは異なるものとする少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ新生抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列は、アミノ酸１２〜２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０〜４０個の長さである。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列は、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。
いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、前記骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２９３６１）である。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチド（配列番号２９３５８）である。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている５’または３’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの態様では、新生抗原カセットは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とは、２ＡまたはＩＲＥＳのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列とは連続したグリシン残基などの柔軟性リンカーによって連結される。
いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−２１、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも１つである。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）新生抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成するために、新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットの数は、２〜２０である。
いくつかの態様では、提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、該ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表す。
いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの実施形態では、選択された抗原は、１つ以上の特異的なＨＬＡアレルにより提示されることが検証されている。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されてない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。いくつかの態様において、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得される。いくつかの態様において、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチである。
いくつかの態様において、新生抗原カセットは、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列は、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する。いくつかの態様において、各ジャンクショナルエピトープ配列は、非自己である。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されている。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアは、集団において少なくとも０．０１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する。いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれは、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する。いくつかの態様において、新生抗原カセットは、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される。いくつかの態様において、非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列は、新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である。いくつかの態様において、予測は、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである。いくつかの態様において、新生抗原カセット内の少なくとも１つの抗原コード核酸配列の順序は、（ａ）前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程と、（ｂ）前記各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程と、を含む一連の工程によって決定される。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってよい。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは新生抗原発現系を封入する。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、新生抗原発現系、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質とを含み、前記複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰは、非層状の形態を有するか、または高電子密度であるかのいずれかである。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質、及び（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物である。
いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ−リン脂質複合体、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成員である。
いくつかの態様では、新生抗原発現系は、ＬＮＰ中に完全に封入される。
いくつかの態様では、ＬＮＰの非層状の形態は、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む。
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、非層状の形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、高電子密度である。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、前記ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％〜６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％を構成し、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％を構成する、混合物、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、リン脂質がＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％〜１５ｍｏｌ％を構成し、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％〜４０ｍｏｌ％を構成する、混合物、または、ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、コレステロールまたはその誘導体がＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成する混合物、のいずれかを含む、非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、複数のＬＮＰをさらに含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％〜８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％〜４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ−ジステアロイルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、約２０００ダルトンの平均分子量を有する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％〜２ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉの構造：
Figure 2021525076
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、−０（Ｃ＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、−Ｃ（＝０）−、−０−、−Ｓ（０）ｘ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（＝０）Ｓ−、−ＳＣ（＝０）−、−ＲａＣ（＝０）−、−Ｃ（＝０）Ｒａ−、−ＲａＣ（＝０）Ｒａ−、−ＯＣ（＝０）Ｒａ−、−ＲａＣ（＝０）０−、または直接的結合であり、Ｇ１は、Ｃｉ〜Ｃ２アルキレン、−（Ｃ＝０）−、−０（Ｃ＝０）−、−ＳＣ（＝０）−、−ＲａＣ（＝０）−、または直接的結合であり、−Ｃ（＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、−Ｃ（＝０）Ｓ−、−Ｃ（＝０）Ｒａ−、または直接的結合であり、Ｇは、Ｃｉ〜Ｃ６アルキレンであり、Ｒａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に、炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり、Ｒ７は、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、５、６、または７員の複素環を形成し、ａ、ｂ、ｃ、及びｄは、それぞれ独立して１〜２４の整数であり、ｘは０、１、または２である］
を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩの構造：
Figure 2021525076
［式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して−０（Ｃ＝０）−、−（Ｃ＝０）０−、または炭素−炭素二重結合であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ１ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ２ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ３ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、（ａ）ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、または（ｂ）Ｒ４ａは、ＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、Ｒ７は、それぞれの場合で、独立してＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルであり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＲ８とＲ９とは、それらが結合した窒素原子とともに、１個の窒素原子を含む５、６、または７員の複素環を形成し、ａ及びｄは、それぞれ独立して０〜２４の整数であり、ｂ及びｃはそれぞれ独立して１〜２４の整数であり、ｅは１または２であり、ただし、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであるか、またはＬ１またはＬ２の少なくとも一方が、−０（Ｃ＝０）−または−（Ｃ＝０）０−であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ−ブチルでない］
を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、中性脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質を含む１つ以上の賦形剤をさらに含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び １，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの態様では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１〜1：１の範囲である。
いくつかの態様では、ポリマー結合脂質はＰＥＧ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とＰＥＧ化脂質とのモル比は、約１００：１〜約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧ−スクシノイル−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメートである。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、下記構造ＩＩＩ：
Figure 2021525076
［式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０〜３０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で１つ以上のエステル結合によって中断され、ｚは、３０〜６０の範囲の平均値を有する］
を有するか、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体である。いくつかの態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１２〜１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、ｚの平均は、約４５である。
ここから開始
いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する。いくつかの態様では、非二重層構造は、６０ｎｍ〜１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、非二重層構造は、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、ナノ粒子状の送達ビヒクルは、約１００ｎｍの直径を有する。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれか（本明細書に開示されるアルファウイルスに基づく、またはＣｈＡｄに基づくベクターなど）と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も開示される。いくつかの態様において、医薬組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、免疫調節物質をさらに含む。いくつかの態様において、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
本明細書ではまた、先行の組成物の請求項のいずれかに記載の新生抗原カセットと、配列番号３または配列番号５の配列から得られる１つ以上の要素と、を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、任意で、前記１つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号３または配列番号５に記載の配列のｎｓＰ１〜４遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットも開示される。いくつかの態様では、配列または単離ヌクレオチド配列のセットは、配列番号６または配列番号７に記載の配列の７５４４位に挿入された、本明細書に開示される新生抗原カセットを含む。いくつかの態様では、単離ヌクレオチド配列は、配列番号３または配列番号５の配列から得られた前記１つ以上の要素の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、任意で、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と、をさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される新生抗原カセットは、配列番号８または配列番号９の７５６３位に挿入される。別の態様では、配列番号８または配列番号９に記載の配列は、１７位に挿入されたさらなるアデニンヌクレオチドをさらに含む。
本明細書では、本明細書に開示される新生抗原カセットと、本明細書に開示される少なくとも１つのプロモーターとを含む単離ヌクレオチド配列も開示される。いくつかの態様において、単離ヌクレオチド配列は、ＣｈＡｄに基づく遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、ＣｈＡｄに基づく遺伝子は、配列番号１の配列から得られ、任意で、前記遺伝子が、配列番号１に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスのＩＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で前記細胞が、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１−２ａ細胞である、単離細胞も提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示される単離ヌクレオチド配列を含むベクターも開示される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるベクターまたは組成物と、使用説明書と、を含むキットも開示される。
本明細書ではまた、がんを有する対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書に開示されるベクター、または本明細書に開示される医薬組成物を投与することを含む方法も開示される。いくつかの態様では、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列は、がんを有する対象の腫瘍に由来しない。
本明細書ではまた、対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、本明細書に記載される組成物、ベクター、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む方法も開示される。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む。いくつかの態様では、対象は、ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、ＭＨＣクラスＩエピトープは、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む。
いくつかの態様では、ベクターまたは組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、１つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、免疫調節物質は、組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与されてもよい。いくつかの態様では、１つ以上の免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される。いくつかの態様において、皮下投与は、組成物もしくは医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と同じものである。いくつかの態様において、第２のワクチン組成物は、上記の組成物または医薬組成物と異なる。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる少なくとも１つの抗原コード核酸配列は、上記の組成物またはベクターのいずれかの少なくとも１つの抗原コード核酸配列と同じである。
本明細書では、上記の組成物のいずれかの１つ以上のベクターを製造する方法であって、前記骨格及び前記新生抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、直線化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される。いくつかの態様では、ＤＮＡプラスミド配列は、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様では、１つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することは、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む。
本明細書ではまた、本明細書に開示される組成物のいずれかを製造する方法であって、ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、新生抗原発現系を提供することと、前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記新生抗原発現系が新生抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと、を含む方法も開示される。いくつかの態様では、かかる条件は、マイクロ流体混合によって提供される。
本明細書ではまた、本明細書に開示されるアデノウイルスベクターを製造する方法であって、前記少なくとも１つのプロモーター配列と前記新生抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、前記プラスミド配列を１つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、前記１つ以上の宿主細胞から前記アデノウイスベクターを単離することと、を含む方法も開示される。
いくつかの態様において、単離することは、宿主細胞を溶解してアデノウイルスベクターを含む細胞ライセートを得ることと、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することと、を含む。
いくつかの態様では、プラスミド配列は、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの１つを用いて生成される。いくつかの態様において、前記１つ以上の宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、及びＡＥ１−２ａ細胞のうちの少なくとも１つである。いくつかの態様において、細胞ライセートからアデノウイルスベクターを精製することは、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの１つ以上を行う。
[本発明1001]
抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも1つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）少なくとも1つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号57〜29357からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）任意で5’リンカー配列、及び
（Ｃ）任意で3’リンカー配列
を含む、前記少なくとも1つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号56）をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも1つの第2のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
[本発明1002]
抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも1つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号19831の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号14954の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号19749及び19865からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号19976、19979、19779、11495、及び19974からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、クラスＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、各ＭＨＣ Ｉエピトープコード核酸配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、5’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、3’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号56）をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも1つの第2のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
[本発明1003]
抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
（ａ）ベクター骨格であって、
（ｉ）少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも1つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
を含む、前記ベクター骨格、
（ｂ）抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも20個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ａ）配列番号19831の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）配列番号14954の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｃ）配列番号19749及び19865からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
（Ｄ）配列番号19976、19979、19779、11495、及び19974からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｅ）ＫＲＡＳ＿Ｇ13Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｆ）ＫＲＡＳ＿Ｑ61Ｋ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｇ）ＴＰ53＿Ｒ249Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｈ）ＣＴＮＮＢ1＿Ｓ45Ｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｉ）ＣＴＮＮＢ1＿Ｓ45Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｊ）ＥＲＢＢ2＿Ｙ772＿Ａ775ｄｕｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｋ）ＫＲＡＳ＿Ｑ61Ｒ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｌ）ＣＴＮＮＢ1＿Ｔ41Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｍ）ＴＰ53＿Ｋ132Ｎ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｎ）ＫＲＡＳ＿Ｑ61Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｏ）ＴＰ53＿Ｒ213Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｐ）ＢＲＡＦ＿Ｇ466Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｑ）ＫＲＡＳ＿Ｑ61Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｒ）ＣＴＮＮＢ1＿Ｓ37Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｓ）ＴＰ53＿Ｓ127Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｔ）ＴＰ53＿Ｋ132Ｅ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｕ）ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
（Ａ）任意で、5’リンカー配列、及び
（Ｂ）任意で、3’リンカー配列
を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第2のプロモーターヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）任意で、少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号56）をコードする少なくとも1つの核酸配列と、
（ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも1つの第2のポリ（Ａ）配列と
を含む、前記抗原カセット。
[本発明1004]
抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
前記抗原発現系が1つ以上のベクターを含み、
前記1つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
（ａ）任意でＣｈＡｄＶ68ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格、
（ｂ）26Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた抗原カセットであって、
（ｉ）少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の腫瘍特異的なＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
（Ａ）アミノ酸7〜15個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、前記ＭＨＣクラスＩエピトープの少なくとも1つが、配列番号57〜29357からなる群から選択される、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
（Ｂ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列、
（Ｃ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のC末端酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列
を含み、
前記抗原カセットが前記26Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の各3’末端が、前記抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
（ｉｉ）少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
（Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号48）と、
（ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号46）と、
（ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第1の核酸配列と、
（ＩＶ）前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の5’末端と、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第2の核酸配列と、
（Ｖ）任意で、前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の3’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第3の核酸配列と
を含む、前記少なくとも2個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
を含む、前記抗原カセット。
[本発明1005]
前記抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’にかけて、
Ｐ ａ −（Ｌ5 ｂ −Ｎ ｃ −Ｌ3 ｄ ） Ｘ −（Ｇ5 ｅ −Ｕ ｆ ） Ｙ −Ｇ3 ｇ
を含む式で説明され、
式中、
Ｐは、前記第2のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝0または1であり、
Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここでｃ＝1であり、
Ｌ5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでｂ＝0または1であり、
Ｌ3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでｄ＝0または1であり、
Ｇ5は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでｅ＝0または1であり、
Ｇ3は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでｇ＝0または1であり、
Ｕは、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでｆ＝1であり、
Ｘ＝1〜400であり、ここで各Ｘについて、対応するＮ ｃ は、エピトープコード核酸配列であり、
Ｙ＝0、1、または2であり、ここで各Ｙについて、対応するＵ ｆ は、抗原コード核酸配列である、
本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1006]
各Ｘについて、対応するＮ ｃ が、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
各Ｙについて、対応するＵ ｆ が、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である、本発明1005または1006の組成物。
[本発明1008]
ａ＝0、ｂ＝1、ｄ＝1、ｅ＝1、ｇ＝1、ｈ＝1、Ｘ＝20、Ｙ＝2であり、
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記骨格によって与えられる単一の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
前記少なくとも1つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記骨格によって与えられる少なくとも100個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
各Ｎが、アミノ酸7〜15個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
Ｌ5が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の5’リンカー配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Ｌ3が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の3’リンカー配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、
前記ベクター骨格が、任意でＣｈＡｄＶ68ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含み、
前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸13〜25個の長さのポリペプチドをコードする、
本発明1005〜1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1010]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ3様（ジリノレイルメチル−4−ジメチルアミノブチレート）分子を含む、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、前記抗原発現系を封入している、本発明1009〜1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
前記抗原カセットが、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1013のいずれかの組成物。
[本発明1015]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
前記1つ以上のベクターが、1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
前記1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、5’7−メチルグアノシン（ｍ7ｇ）キャップを含む、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
前記1つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、インビトロ転写によって生成される、本発明1016または1017の組成物。
[本発明1019]
前記1つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
前記骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
前記骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1022]
前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質1（ｎｓＰ1）遺伝子、ｎｓＰ2遺伝子、ｎｓＰ3遺伝子、及びｎｓＰ4遺伝子を含む、本発明1020または1021の組成物。
[本発明1023]
前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、26Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、本発明1020または1021の組成物。
[本発明1024]
前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス5’ＵＴＲ、51ｎｔのＣＳＥ、24ｎｔのＣＳＥ、26Ｓサブゲノミックプロモーター配列、19ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス3’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1022または1023の組成物。
[本発明1025]
前記骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ2及びＥ1をコードしていない、本発明1022〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
前記抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号3または配列番号5に記載の配列を含む、本発明1020または1021の組成物。
[本発明1028]
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対7544と11175との間に欠失をさらに含む配列番号3または配列番号5の配列を含む、本発明1020または1021のの組成物。
[本発明1029]
前記骨格が、配列番号6または配列番号7に記載の配列を含む、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
前記抗原カセットが、配列番号3または配列番号5の配列に記載される塩基対7544と11175との間の前記欠失を置換するように7544位に挿入されている、本発明1028または1029の組成物。
[本発明1031]
前記抗原カセットの挿入が、前記ｎｓＰ1〜4遺伝子及び前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ1〜4遺伝子及び前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、本発明1026〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1032]
前記骨格が、チンパンジーアデノウイルスベクターの少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1033]
前記チンパンジーアデノウイルスベクターが、ＣｈＡｄＶ68ベクターである、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記骨格によってコードされた天然の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列が、外因性のＲＮＡプロモーターである、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1036]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が、26Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が複数の26Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各26Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの1つ以上の転写をもたらす、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1035のいずれかの組成物。
[本発明1038]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも300ｎｔのサイズである、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1039]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも1ｋｂのサイズである、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1040]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ2ｋｂのサイズである、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1041]
前記1つ以上のベクターが、それぞれ5ｋｂ未満のサイズである、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1042]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、前記腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1043]
各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1043のいずれかの組成物。
[本発明1045]
前記リンカーが、2個のＭＨＣクラスＩ配列または1個のＭＨＣクラスＩ配列を1個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
前記リンカーが、（1）少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、（2）少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、（3）2個のアルギニン残基（ＲＲ）、（4）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（5）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び（6）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列からなる群から選択される、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
前記リンカーが、2個のＭＨＣクラスＩＩ配列または1個のＭＨＣクラスＩＩ配列を1個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する、本発明1044の組成物。
[本発明1048]
前記リンカーが、配列ＧＰＧＰＧを含む、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に機能的または直接的に連結されている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1048のいずれかの組成物。
[本発明1050]
前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、76位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）−1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも1つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ76である、本発明1049の組成物。
[本発明1051]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1052]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1053]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1054]
前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1055]
前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1056]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも2〜10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の核酸配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1055のいずれかの組成物。
[本発明1057]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも11〜20個、15〜20個、11〜100個、11〜200個、11〜300個、11〜400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または最大で400個の核酸配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1055のいずれかの組成物。
[本発明1058]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1055のいずれかの組成物。
[本発明1059]
前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2つが、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1004または1008の組成物。
[本発明1060]
前記対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1061]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1062]
各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個の長さのポリペプチド配列をコードする、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1061のいずれかの組成物。
[本発明1063]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在している、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1062のいずれかの組成物。
[本発明1064]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1062のいずれかの組成物。
[本発明1065]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、または20〜40個の長さである、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1064のいずれかの組成物。
[本発明1066]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1065のいずれかの組成物。
[本発明1067]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
前記少なくとも1つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第2のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1066のいずれかの組成物。
[本発明1069]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1068のいずれかの組成物。
[本発明1070]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列を含む、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1068のいずれかの組成物。
[本発明1071]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つと機能的に連結されている、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1070のいずれかの組成物。
[本発明1072]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、または少なくとも90個の連続したＡヌクレオチドである、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1071のいずれかの組成物。
[本発明1073]
前記少なくとも1つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも100個の連続したＡヌクレオチドである、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1071のいずれかの組成物。
[本発明1074]
前記抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、2Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている5’または3’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも1つをさらに含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1075]
前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1076]
前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ5タグからなる群から選択される、本発明1075の組成物。
[本発明1077]
前記1つ以上のベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1078]
前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1077の組成物。
[本発明1079]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、本発明1078の組成物。
[本発明1080]
前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、2ＡまたはＩＲＥＳのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが連続したグリシン残基などの柔軟性リンカーによって連結されている、本発明1078または1079の組成物。
[本発明1081]
前記免疫調節物質がサイトカインである、本発明1077の組成物。
[本発明1082]
前記サイトカインが、ＩＬ−2、ＩＬ−7、ＩＬ−12、ＩＬ−15、もしくはＩＬ−21、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも1つである、本発明1081の組成物。
[本発明1083]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される、本発明1001〜1003、1005〜1007、または1009〜1082のいずれかの組成物。
[本発明1084]
前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
(ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
（ｂ）抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
（ｃ）前記少なくとも20個のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を行うことによって選択される、本発明1004または1008の組成物。
[本発明1085]
前記選択された抗原のセットの数が、2〜20である、本発明1083の組成物。
[本発明1086]
前記提示モデルが、
(ａ)前記ＭＨＣアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
（ｂ）前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1083〜1085のいずれかの組成物。
[本発明1087]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記選択された抗原が、1つ以上の特異的ＨＬＡアレルによって提示されると検証されている、本発明1083〜1086のいずれかの組成物。
[本発明1088]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む、本発明1083〜1087のいずれかの組成物。
[本発明1089]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、本発明1083〜1088のいずれかの組成物。
[本発明1090]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む、本発明1083〜1089のいずれかの組成物。
[本発明1091]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む、本発明1083〜1090のいずれかの組成物。
[本発明1092]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得される、本発明1083〜1091のいずれかの組成物。
[本発明1093]
前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、本発明1092の組成物。
[本発明1094]
前記抗原カセットが、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1095]
少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、ＭＨＣに対して500ｎＭよりも高い親和性を有する、本発明1094の組成物。
[本発明1096]
各ジャンクショナルエピトープ配列が、非自己である、本発明1094または1095の組成物。
[本発明1097]
前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、集団の少なくとも5％に存在する少なくとも1つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されている、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1098]
前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、少なくとも1つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも0．01％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1099]
前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、少なくとも1つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも0．1％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1100]
前記抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1101]
前記非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、本発明1100の組成物。
[本発明1102]
前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、本発明1094〜1101のいずれかの組成物。
[本発明1103]
前記抗原カセット内における前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、
（ａ）前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程と、
（ｂ）前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、
（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程と
を含む一連の工程によって決定される、本発明1094〜1102のいずれかの組成物。
[本発明1104]
前記本発明のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1105]
アジュバントをさらに含む、本発明1104の組成物。
[本発明1106]
免疫調節物質をさらに含む、本発明1104または1105の医薬組成物。
[本発明1107]
前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1106の医薬組成物。
[本発明1108]
先行の組成物の発明のいずれかの抗原カセットと、
配列番号3または配列番号5の配列から得られる1つ以上の要素と
を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、
任意で、前記1つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、26Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号3または配列番号5に記載の配列のｎｓＰ1〜4遺伝子からなる群から選択され、
任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、
前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
[本発明1109]
前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、配列番号6または配列番号7に記載の配列の7544位に挿入された先行の組成物の発明のいずれかの抗原カセットを含む、本発明1108の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1110]
配列番号3または配列番号5の配列から得られた前記1つ以上の要素の5’側に位置するＴ7またはＳＰ6 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
任意で、前記ポリ（Ａ）配列の3’側に位置する1つ以上の制限部位と
をさらに含む、本発明1108または1109の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1111]
先行の組成物の発明のいずれかの抗原カセットが、配列番号8または配列番号9の7563位に挿入されている、本発明1108の単離ヌクレオチド配列。
[本発明1112]
本発明1108〜1111のいずれかのヌクレオチド配列を含むベクターまたはベクターのセット。
[本発明1113]
本発明1108〜1112のいずれかのヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、ＢＨＫ−21、ＣＨＯ、ＨＥＫ293もしくはそのバリアント、911、ＨｅＬａ、Ａ549、ＬＰ−293、ＰＥＲ．Ｃ6、またはＡＥ1−2ａ細胞である、前記単離細胞。
[本発明1114]
先行の組成物の発明のいずれかの組成物と使用説明書とを含む、キット。
[本発明1115]
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1104〜1107のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1116]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、本発明1115の方法。
[本発明1117]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、本発明1115の方法。
[本発明1118]
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の発明のいずれかの組成物、または本発明1104〜1107のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1119]
前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現する、本発明1115〜1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表34に示される変異からなる群から選択される変異を含む、本発明1115〜1118のいずれかの方法。
[本発明1121]
前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表32に示される変異からなる群から選択される変異を含む、本発明1115〜1118のいずれかの方法。
[本発明1122]
前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、本発明1115〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
前記組成物が筋肉内投与される、本発明1115〜1121のいずれかの方法。
[本発明1124]
1つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、本発明1115〜1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
前記1つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、本発明1124の方法。
[本発明1126]
前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される、本発明1124または1125の方法。
[本発明1127]
前記皮下投与が、前記組成物もしくは医薬組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、本発明1126の方法。
[本発明1128]
前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、本発明1115〜1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1115〜1127のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、本発明1128の方法。
[本発明1130]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1115〜1127のいずれかの組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、本発明1128の方法。
[本発明1131]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1115〜1127のいずれかの組成物または医薬組成物と同じである、本発明1129または1130の方法。
[本発明1132]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1115〜1127のいずれかの組成物または医薬組成物と異なる、本発明1129または1130の方法。
[本発明1133]
前記第2のワクチン組成物が、少なくとも1つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、本発明1132の方法。
[本発明1134]
前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の発明のいずれかの少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じである、本発明1133の方法。
[本発明1135]
先行の組成物の発明のいずれかの1つ以上のベクターを製造する方法であって、
（ａ）前記骨格及び前記抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、
（ｂ）前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ7ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
（ｃ）前記インビトロ転写反応から前記1つ以上のベクターを単離することと
を含む、前記方法。
[本発明1136]
前記直線化ＤＮＡ配列が、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される、本発明1135の製造方法。
[本発明1137]
前記ＤＮＡプラスミド配列が、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの1つを用いて生成される、本発明1136の製造方法。
[本発明1138]
前記1つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの1つ以上を含む、本発明1135の製造方法。
[本発明1139]
前記抗原発現系を送達するための、先行の組成物の発明のいずれかの組成物を製造する方法であって、
（ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
（ｂ）前記抗原発現系を提供することと、
（ｃ）前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記抗原発現系が前記抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
を含む、前記方法。
[本発明1140]
前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、本発明1139の製造方法。
[本発明1141]
がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）1）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを有するかどうか、及び、
以下：
1）対象の腫瘍が前記抗原に関連した遺伝子を発現するかどうか、任意で、前記遺伝子が正常細胞または組織と比較して異常に発現しているかどうか、
2）前記対象の腫瘍が前記抗原に関連した変異を有するかどうか
の一方または両方
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現しており、かつ前記対象の腫瘍が前記遺伝子を発現している、かつ／または前記対象の腫瘍が前記変異を有する場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程であって、
前記抗原が、配列番号57〜29357からなる群から選択される少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を含む、
前記工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
1）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含む、前記工程と
を含む、前記方法。
[本発明1142]
がんを有する対象を評価する方法であって、
ａ）前記対象が、
1）Ａ0301 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ変異を有するか、
2）Ａ0201 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ変異を有するか、
3）Ｃ0802 ＨＬＡアレルまたはＡ1101 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ変異を有するか、または
4）Ａ0301 ＨＬＡアレルまたはＡ1101 ＨＬＡアレルまたはＡ3101 ＨＬＡアレルまたはＣ0102 ＨＬＡアレルまたはＡ0302 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ変異を有するか
を判定する、または既に判定している工程と、
ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が、
1）前記Ａ0301アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ変異を有する場合、
2）前記Ａ0201アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ変異を有する場合、
3）前記Ｃ0802 ＨＬＡアレルまたは前記Ａ1101 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ変異を有する場合、または
4）前記Ａ0301 ＨＬＡアレルまたは前記Ａ1101 ＨＬＡアレルまたは前記Ａ3101 ＨＬＡアレルまたは前記Ｃ0102 ＨＬＡアレルまたは前記Ａ0302 ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ変異を有する場合
に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程と、
ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
1）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ変異をそれぞれ含む少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ12Ｖ変異をそれぞれ含む前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含むものである、前記工程と
を含む、前記方法。
[本発明1143]
前記工程（ａ）及び／または（ｂ）が、前記対象からの試料を処理したサードパーティーからデータセットを得ることを含む、本発明1141または1142の方法。
[本発明1144]
前記工程（ａ）が、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることと、を含む、本発明1141または1142の方法。
[本発明1145]
前記試料が、腫瘍試料、正常組織試料、または前記腫瘍試料及び前記正常組織試料を含む、本発明1143または1144の方法。
[本発明1146]
前記試料が、組織、体液、血液、腫瘍生検、脊髄液、及び針穿刺吸引物から選択される、本発明1145の方法。
[本発明1147]
前記遺伝子が、表34に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される、本発明1141または1143〜1146のいずれかの方法。
[本発明1148]
前記遺伝子が、表32に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される、本発明1141または1143〜1146のいずれかの方法。
[本発明1149]
前記がんが、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌からなる群から選択される、本発明1141〜1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
前記ＨＬＡアレルが、少なくとも5％のＨＬＡ頻度を有する、本発明1141〜1149のいずれかの方法。
[本発明1151]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープが、前記対象の腫瘍に関連した細胞上の前記ＨＬＡアレルによって提示される、本発明1141〜1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、本発明1141〜1151のいずれかの方法。
[本発明1153]
前記抗原発現系が、本発明1001〜1103のいずれかの抗原発現系のいずれか1つを含む、本発明1152の方法。
[本発明1154]
前記抗原ベースワクチンが、本発明1104〜1107のいずれかの医薬組成物のいずれか1つを含む、本発明1141〜1151のいずれかの方法。
[本発明1155]
がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
1）少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択される、
前記方法。
[本発明1156]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、本発明1155の方法。
[本発明1157]
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の前記腫瘍に由来しない、本発明1155の方法。
[本発明1158]
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
1）少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択される、
前記方法。
[本発明1159]
前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現する、本発明1155〜1158のいずれかの方法。
[本発明1160]
前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表34に示される変異からなる群から選択される変異を含む、本発明1155〜1158のいずれかの方法。
[本発明1161]
前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表32に示される変異からなる群から選択される変異を含む、本発明1155〜1158のいずれかの方法。
[本発明1162]
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
1）少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現する、
前記方法。
[本発明1163]
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
1）少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表34に示される変異からなる群から選択される変異を含み、前記対象が、表34に示される対応する変異（例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ13Ｄ及びＣ0802）と結びつけられた表34に示される少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現する、
前記方法。
[本発明1164]
対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
1）少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
2）前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
を含み、
前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号57〜29357からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも1つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも1つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表32に示される変異からなる群から選択される変異を含む、
前記方法。
[本発明1165]
前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、本発明1155〜1164のいずれかの方法。
[本発明1166]
前記抗原発現系が、本発明1001〜1103のいずれかの抗原発現系のいずれか1つを含む、本発明1165の方法。
[本発明1167]
前記抗原ベースワクチンが、本発明1104〜1107のいずれかの医薬組成物のいずれか1つを含む、本発明1155〜1164のいずれかの方法。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発を説明する。抗原提示細胞へのワクチンカセットの送達が、異なるペプチド抗原の発現、プロセシング、及びＭＨＣ制限提示につながるアッセイの概略。特異的なペプチド−ＭＨＣの組み合わせに一致するＴ細胞受容体を有するように操作されたレポーターＴ細胞が活性化され、ルシフェラーゼが発現される。 図２Ａは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、互いに対して同じ位置で連結された５個のクラスＩ ＭＨＣクラス制限エピトープ（エピトープ１〜５）に２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープ（ＭＨＣ−ＩＩ）が繋げられたものを示す。異なるリンカーを用いて種々の繰り返しが生成された。場合によっては、Ｔ細胞エピトープは互いに直接連結される。他の場合では、Ｔ細胞エピトープの片側または両側にその天然配列が隣接する。他の繰り返しでは、Ｔ細胞エピトープは、非天然配列ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰにより連結される。図２Ｂは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、短いカセット内に埋め込まれたＴ細胞エピトープの配列情報を示す。図は、出現順に配列番号２９３６５〜２９３６６、２９３６９、２９３６８、２９３６７、及び２９４９４〜２９４９５をそれぞれ開示する。 モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価を説明する。ターゲティングカセットは、短いカセット設計を、ユビキチン（Ｕｂ）、シグナルペプチド（ＳＰ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメインによって延長し、５個のマーカーヒトＴ細胞エピトープ（エピトープ１〜５）の隣に２個のマウスＴ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）（ＳＩＩ）及びＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号２９３６３）（Ａ５）をさらに有し、Ｔ細胞エピトープの両側に隣接する非天然リンカーＡＡＹ−または天然リンカー配列を用いている（２５マー）。 短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価を説明する。Ａ）ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを使用したワクチンカセットのインビボ評価の実験計画。 長い２１マーカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、長いカセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる５個のマーカークラスＩエピトープ（エピトープ１〜５）であって、それらの２５マー天然配列に含まれるさらなる周知のＴ細胞クラスＩエピトープ（エピトープ６〜２１）によって隔てられたマーカークラスＩエピトープと、２個のユニバーサルクラスエピトープＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ０）とを含み、各クラスＩエピトープの相対位置のみが異なることを示す。 長い２１マーカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報を示す。図は、出現順に配列番号２９３６５〜２９３６６、２９３６９、２９３６８、２９３６７、２９４９６〜２９４９８、２９３７０、及び２９４９９〜２９５１０をそれぞれ開示する。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、最終カセットの設計が、それらの２５マー天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる２０個のＭＨＣ Ｉエピトープを含み、６個の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）エピトープ、５個のヒトエピトープ、９個のマウスエピトープ、及び２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープで構成されることを示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、非ヒト霊長類、マウス、及びヒト由来のクラスＩ ＭＨＣ上に提示される、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報、ならびに２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープＰＡＤＲＥ及び破傷風トキソイドの配列を示す。図は、出現順に配列番号２９４２６〜２９４３１、２９３６２〜２９３６３、２９４５６、２９５１１、２９４６０〜２９４６２、２９４５８〜２９４５９、２９３６７〜２９３６９、２９３６５〜２９３６６、２９４９４、及び２９５１２をそれぞれ開示する。 図７Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトする。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡を使用して倍率１００倍で可視化した。 図８Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して３日後に撮影した。図８Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率４０倍で使用して３日後に撮影した。図８Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡を倍率１００倍で使用して３日後に撮影した。 ウイルス粒子の生成スキームを説明する。 アルファウイルス由来ＶＥＥ自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターを説明する。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを接種した後のインビボのレポーター発現を説明する。異なる時点でＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを免疫した（ＭＣ３に封入したものを１０ｕｇ／マウスで両側性に筋肉内注射）後のルシフェラーゼシグナルの代表的イメージを示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）、またはＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）特異的Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（コントロール）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）、またはＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）を注射した。さらに、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）特異的Ｔ細胞応答をＭＨＣＩペンタマー染色により評価し、ペンタマー陽性細胞として、ＣＤ８陽性細胞に対する割合（％）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５−ＧＦＰプライム／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ−４（ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ−４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ−４）との組み合わせで処置した。さらに、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ−１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５−ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５−ＧＦＰ／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１（ａＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１ ｍＡｂ（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５−ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（コントロール）か、またはＡｄ５−ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。コントロール及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧコントロールｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５−ＧＦＰ／ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１（ａＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗ＰＤ−１ ｍＡｂ（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの６日後（プライムの２１日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 マウスにおけるマウス腫瘍抗原に対するＣｈＡｄＶ６８誘発Ｔ細胞応答を説明する。マウスをＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫し、ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）（ＯＶＡ）に対するＴ細胞応答をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１−Ａ５をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された脾細胞１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ−１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答を説明する。抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、各グループから６匹のマウスの脾細胞で測定した。結果を、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示す。各グループの中央値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ−１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を説明する。ＣＤ８ Ｔ細胞における抗原特異的ＩＦＮ−γ産生をＩＣＳを用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞として、全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合（％）として示した。各グループの中間値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ−１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。腫瘍体積を週２回測定し、平均腫瘍体積を実験の最初の２１日間について示す。実験開始時に各グループは２２〜２８匹のマウスで構成された。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｐ値は、ダネット検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける生存率を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ−１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。Ｐ値は、ログランク検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ。 図２０は、ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、最初のブースト免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）（図２０Ａ）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）（図２０Ｂ）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）（図２０Ｃ）による同種プライム／ブースト、またはＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブースト群（図２０Ｄ）について、ＰＢＭＣ中で測定した（各群６匹のアカゲザル）。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープについて、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。各動物の値は、プレブリード（０週目）のレベルに対して正規化した。 図２０Ａの説明を参照のこと。 図２０Ａの説明を参照のこと。 図２０Ａの説明を参照のこと。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ２による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ−γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ１による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。図は、配列番号２９３６４を開示する。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 標的化ＭＳによるＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関を示す。 変異ペプチドＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーで染色した患者からの増殖させたＴＩＬを示す。ＣＤ８＋細胞に対するフローサイトメトリーゲーティング手法（左パネル）及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーによるＣＤ８＋細胞の染色（右パネル）を示す。 一般的なＴＣＲシークエンシング手法及びワークフローを示す。 ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーを用いた代表的な例のＴＣＲシークエンシング手法を示す。 ３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）または５０（ＸＸＬ）個のエピトープを有する大きな抗原カセットにおける異なる腫瘍由来のモデルエピトープの一般的な編成を示す。 ＣｈＡｄベクターが、すべてのカセットに共通の配列を認識する抗クラスＩＩ（ＰＡＤＲＥ）抗体を使用した上記のウェスタンブロットによって示されるように長いカセットを発現することを示す。ＨＥＫ２９３細胞に異なるサイズの大きなカセット（ｃｈＡｄ６８−５０ＸＸＬ、ｃｈＡｄ６８−４０ＸＬ及びｃｈＡｄ６８−３０Ｌ）を発現するｃｈＡｄ６８ベクターを感染させた。感染はＭＯＩ＝０．２に設定した。感染２４時間後にプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を、感染させたウェルのセットに加えた（＋符合で示す）。ウイルス処理したウェルの別のセットはＭＧ１３２で処理しなかった（−符合で示す）。非感染ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｆ）をネガティブコントロールとして用いた。感染４８時間後に細胞ペレットを回収し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動で分析し、ウサギ抗クラスＩＩ ＰＡＤＲＥ抗体を用いてイムノブロッティングした。ＨＲＰ抗ラビット抗体及びＥＣＬ化学発光基質を検出に用いた。 ＩＣＳによりＡＨ１（上図）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）（下図）に対して検出された、ｃｈＡｄ６８の大きなカセットで免疫したマウスにおけるＣＤ８＋免疫反応を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞として、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。 ｃｈＡｄ６８の大きなカセットによるワクチン接種後のＬＤ−ＡＨ１＋（上図）及びＫｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）＋（下図）テトラマーに対するＣＤ８＋応答を示す。データは、モデルテトラマーペプチド複合体に対する反応性を有する、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。テューキー検定を用いたＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。 ＩＣＳによりＡＨ１（上図）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）（下図）に対して検出された、アルファウイルスの大きなカセットで処置したマウスにおけるＣＤ８＋免疫反応を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞として、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。テューキー検定を用いたＡＮＯＶＡによる＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０１。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。 アカゲザルにおける抗原カセット含有ベクターの免疫原性を評価するためのワクチン接種手法を示す。三角は、０及び３２週目におけるｃｈＡｄ６８によるワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０、４、１２、１２、２０、２８、及び３２週目におけるアルファウイルスワクチン接種を表す。四角は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与を表す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧを投与したアカゲザル単独（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＩＶ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＳＣ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的推移を示す。平均のＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ＥＬＩＳｐｏｔにより測定したｃｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって生じた抗原特異的メモリー応答を示す。結果は各ドットが１匹の動物を表す個別のドットプロットとして示す。免疫前のベースライン（左パネル）及びプライム１８ヶ月後のメモリー反応（右パネル）を示す。 コンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色を用いたフローサイトメトリーによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリー細胞表現型判定を示す。 実験１８ヶ月目における４種類のＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の総和中のメモリー細胞タイプの分布を示す。メモリー細胞は以下のようにキャラクタライズした。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。 ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおけるＣＴ２６腫瘍抗原ＡＨ１を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。テューキーの多重比較検定による１元配置ＡＮＯＶＡを用いてＰ値を求めた（＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５）。ＣｈＡｄＶ＝ ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；ａＣＴＬＡ４＝抗ＣＴＬＡ４抗体、クローン９Ｄ９。
詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を誘導する物質のことである。抗原は新生抗原であってよい。抗原は、特定の集団、例えば、がん患者の特定の集団内にみられる抗原である「共有抗原」であってよい。
本明細書で使用するところの「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞の変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾によって、抗原を対応する野生型抗原とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する抗原のことである。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含んでよい。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライスバリアントも含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常リン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームによって生成されるスプライス抗原も含むことができる。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ− ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４−３５８を参照されたい。例示的な共有新生抗原が表Ａ及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果（配列番号１０７５５〜２９３５７）に示されており、各抗原について対応するＨＬＡアレル（複数可）も示されている。そのような共有新生抗原は、投与によって対象において免疫応答を誘導するうえで有用である。対象は、例えば下記にさらに述べる患者選択方法のようなさまざまな診断法によって投与を行うために特定することができる。
本明細書で使用するところの「腫瘍抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞もしくは組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞もしくは組織中には存在しない抗原、または正常細胞もしくは組織と比較して腫瘍細胞もしくはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されているポリペプチドに由来する抗原である。
本明細書において使用するところの「抗原ベースワクチン」という用語は、１つ以上の抗原、例えば複数の抗原に基づいたワクチン組成物のことである。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはこれらの組み合わせであってよい。
本明細書において使用される場合、「候補抗原」という用語は、抗原を表しうる配列を生じる変異、または他の異常のことである。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分のことである。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ＯＲＦ」という用語は、変異またはスプライシングなどの他の異常により生じる腫瘍特異的なＯＲＦのことである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または基準開始コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一率（％）を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳後の配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を誘発する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「バリアントコール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出されるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「体細胞バリアント」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍の発生の初期に生じ、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異」という用語は、腫瘍の発生において後期に生じ、腫瘍の細胞の一部のみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンでありうる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド−ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、及び喫煙歴を含むことができる。
「腫瘍由来の抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ−ＰＣＲによって腫瘍から直接抽出された核酸配列、または、腫瘍をシークエンシングした後、例えば当該技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。
「アルファウイルス」という用語は、トガウイルス科のメンバーのことを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ−８３などの新世界型に分類される。アルファウイルスは一般的には自己複製ＲＮＡウイルスである。
「アルファウイルス骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とするアルファウイルスの最小配列（複数可）のことを指す。最小配列としては、非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびに、２６Ｓプロモーター因子をはじめとするサブゲノミックウイルスＲＮＡの発現用の配列を挙げることができる。
「非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列」という用語には、当該技術分野では周知のアルファウイルス保存配列因子（ＣＳＥ）が含まれる。ＣＳＥとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１−ｎｔ ＣＳＥ、２４−ｎｔ ＣＳＥ、または他の２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９−ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられる。
「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語には、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６を含むバクテリオファージ由来ポリメラーゼが挙げられる。
「脂質」という用語には、疎水性及び／または両親媒性分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。脂質は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンを含みうる。脂質には、ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれうる。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語には、リポソームとも呼ばれる、水性の内部を包囲する脂質含有膜を用いて形成された小胞様構造が含まれる。脂質ナノ粒子は、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベースの組成物を含む。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であってよい。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸（タウロコール酸）、及びステロール類（コレステロール）のような生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１種類以上のカチオン性、アニオン性、または中性脂質の規定の比率を含む（ただし、これに限定されない）、規定の比率の異なる脂質分子を用いて形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を封入することができ、その後、標的細胞と接触させて封入分子を宿主細胞のサイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面などを非脂質分子で修飾または官能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層）または多層（複層）とすることができる。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体化することができる。単層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となる。複層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となるか、またはその間を形成するかまたはその間に挟まれる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、例えば、平均から標準偏差２つ分以内など、当該技術分野における公称公差の範囲内にあるものとして理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に示される全ての数値は「約」という語によって修飾されている。
本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者にさらなる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされうる点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．抗原を特定する方法
共有抗原（例えば、新生抗原）を特定するための方法は、対象の腫瘍から、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む腫瘍または免疫細胞の細胞表面上に提示される可能性が高く、かつ／または免疫原性である可能性が高い抗原を特定することを含む。例として、かかる１つの方法は、
対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では、各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を、１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
を含むことができる。
提示モデルは、対応するラベルのセットを含む参照データのセット（訓練データセットとも呼ばれる）で訓練された、統計学的回帰または機械学習（例えば、ディープラーニング）モデルを含むことができ、前記参照データのセットは、任意で、一部の対象が腫瘍を有しうる複数の別個の対象の各々から取得され、また、前記参照データのセットは、腫瘍組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、正常組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のトランスクリプトームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のプロテオーム配列を表すデータ、及び腫瘍組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータ、及び正常組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータのうちの少なくとも１つを含む。参照データは、合成タンパク質、正常及び腫瘍ヒト細胞株、ならびに新鮮な及び凍結された初代試料に対してその後曝露される所定のＭＨＣアレルを発現するように操作された単一アレル細胞株の質量分析データ、シークエンシングデータ、ＲＮＡシークエンシングデータ、発現プロファイリングデータ、及びプロテオミクスデータ、ならびにＴ細胞アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ）をさらに含むことができる。特定の態様では、参照データのセットは、参照データの各形態を含む。
提示モデルは、参照データのセットに少なくとも一部由来する特性のセットを含むことができ、前記特性のセットは、アレル依存的特性及びアレル非依存的特性のうちの少なくとも１つを含む。特定の態様では、各特性が含まれる。
共有抗原を特定するための方法はまた、腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の１つ以上の腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原を特定することによって個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することも含む。例として、かかる１つの方法は、対象の腫瘍細胞及び正常細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、腫瘍細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データと正常細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データ、対象の正常細胞から特定されたペプチド配列とを比較することによって特定された抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、前記抗原のそれぞれの前記ペプチド配列を対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸及び前記ペプチド配列内における前記アミノ酸の位置のセットに関する情報を含む、工程と、コンピュータのプロセッサを使用して、前記数値ベクトルをディープラーニング提示モデルに入力して前記抗原のセットについて提示尤度のセットを生成する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する抗原が１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記ディープラーニング提示モデルが、前記抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択することにより、選択された抗原のセットを生成する工程と、前記選択された抗原のセットに基づいて前記個別化されたがんワクチンを構築するための前記出力を生成する工程と、を含むことができる。
新生抗原を含む抗原を同定するための具体的な方法は当業者には周知のものであり、こうした方法は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
本明細書では、本明細書に記載される抗原の特定方法のいずれかの工程を行うことを含み、選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを得る工程と、腫瘍ワクチンを対象に投与する工程と、をさらに含む、腫瘍を有する対象を治療する方法が開示される。
本明細書に開示される方法はまた、サブセットの中の抗原のうちの少なくとも１つに対して抗原特異的な１つ以上のＴ細胞を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、同定は、１つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる条件下で１つ以上のＴ細胞をサブセットの中の抗原のうちの１つ以上と共培養することを含む。さらなる実施形態では、同定は、１つ以上のＴ細胞を、サブセットの中の抗原のうちの１つ以上を含むテトラマーと、Ｔ細胞とテトラマーとの結合が可能な条件下で接触させることを含む。いっそうさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法はまた、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することをさらに含むことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体を同定することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列をシークエンシングすることを含む。本明細書に開示される方法は、前記１つ以上の同定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することと、前記複数のＴ細胞を増殖させる条件下で前記複数のＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の同定されたＴ細胞受容体の少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞の前記Ｔ細胞受容体配列を発現ベクターにクローニングすることと、前記複数のＴ細胞のそれぞれに発現ベクターをトランスフェクトすることと、を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、さらに、前記１つ以上のＴ細胞を増殖させる条件下で前記１つ以上の同定されたＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することと、をさらに含む。
本明細書ではまた、前記サブセットの中の少なくとも１つの選択された抗原に対して抗原特異的である単離Ｔ細胞も開示される。
本明細書ではまた、腫瘍ワクチンを製造するための方法であって、
対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセット（例えば、新生抗原の場合では各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
前記抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、
前記選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と
を含む方法も開示される。
本明細書ではまた、
対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各抗原のペプチド配列（例えば、新生抗原の場合では、各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも１つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する）、前記取得する工程と、
前記抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と、
前記選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するか、またはこれまでに生産している工程と
を含む方法を実行することによって選択される、選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンも開示される。
腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの１つ以上を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性を示す１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、１つ以上の抗原を含まなくともよい。
腫瘍ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、賦形剤を含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよく、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データは、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得することができる。
シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシングアプローチであってもよい。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル相互作用特性によってさらに特定することができる。すなわち、ＭＨＣアレルと抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性；抗原コード化ペプチド−ＭＨＣ複合体の予測安定性；抗原コード化ペプチドの配列及び長さ；質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する抗原コード化ペプチドの提示の確率；対象とされる対象の特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；特定のＭＨＣアレルを発現する他の別個の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率；他の別個の対象における、同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル非相互作用特性によってさらに特定される。すなわち、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端及びＮ末端配列；任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現（ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在；適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度；ＲＮＡ−ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ；腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル（ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる）；新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現；例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏにみることができるような、由来源タンパク質及び／またはそのドメインの特性の包括的なカタログ；ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、βシートに対するαヘリックス）；選択的スプライシング；他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率；ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率；腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑによって測定される、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない）；腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数；ペプチドがＴＡＰに結合する確率、またはＴＡＰに対するペプチドの測定または予測される結合親和性；腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベル（ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる）；以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無：ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、及び抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＴＡＰ−１、ＴＡＰ−２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における変異。その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＴＡＰ−１、ＴＡＰ−２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；喫煙歴；任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
少なくとも１つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化であってよい。
腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択することができる。
本明細書に開示される方法はまた、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを得ることを含んでもよく、任意で腫瘍ワクチンを対象に投与することをさらに含んでもよい。
選択された新生抗原のセット内の新生抗原の少なくとも１つは、ポリペプチド形態である場合、以下のうちの少なくとも１つを含んでもよい：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満のＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩのポリペプチドではアミノ酸８〜１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドではアミノ酸６〜３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩでは、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ−ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
本明細書では、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、複数の新鮮なまたは凍結得様試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上の１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、工程と、を含む方法が開示される。
提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の尤度と、の間の依存性を表すことができる。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、腫瘍の細胞表面上に提示される尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、中枢性寛容または末梢性寛容により阻害される尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれがＡＰＣに対して腫瘍細胞において差次的に翻訳後修飾される尤度が減少していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書における方法の実施においては、特に断らない限り、当該技術分野における技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。かかる技術は文献に充分な説明がなされている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
ＩＩＩ．新生抗原における腫瘍特異的変異の特定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル）の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。腫瘍に特異的な、共有新生抗原を含む抗原を同定するための具体的な方法は当業者には周知のものであり、こうした方法は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（１）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（２）Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（３）成熟ｍＲＮＡにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（４）２種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をシークエンシングすることによって特定することができる。
また、変異は、以前に特定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップなどの種々のＤＮＡ「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成及びその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
ＰＣＲベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のＰＣＲ産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。この方法にしたがって、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして公知である代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。取り込まれたラベル化ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定されかつこれに相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
ＤＮＡにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
数多くのイニシアティブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に対して相補的であるＤＮＡの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。１つの方法において、長さが３０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、５’端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、２つの機能を果たす。第１に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、及び、色素を除去するための色素−リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、及び色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ−ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシークエンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシークエンシングプラットフォームを、変異を特定するために使用することができる。上記のように、４種類の主要な合成によるシークエンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａより販売される１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓより販売されるＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成によるシークエンシングプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位を、鋳型の３’端及び／または５’端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン−ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存性の合成によるシークエンシングを含む、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているような、単一分子検出／シークエンシングによって解析することができる。合成によるシークエンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シークエンシングはまた、他の大規模並列処理シークエンシング、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法及びプラットフォームも含むことができる。大規模並列処理シークエンシング技法及びプラットフォームの追加的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、ＴｈｅｒｍｏＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加的な類似した現在の大規模並列処理シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を特定または実証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて特定することができる。
ＩＶ．抗原
抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であることができる。ワクチンにおいて有用な抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。共有新生抗原は、表Ａ（配列番号１０７５５〜２１０１５を参照）及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果（配列番号２１０１６〜２９３５７を参照）に示されている。共有抗原は、表１．２（配列番号５７〜１０，７５４を参照）に示されている。
本明細書に開示する方法によって特定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び、本明細書に開示する方法によって特定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。新生抗原ペプチドは、新生抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
本明細書はまた、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチド、例えば、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で異常に発現することが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来するペプチドも開示する。抗原性ペプチドが由来しうる適当なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報をキュレートしたものである。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含む。
抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８〜１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドについてはアミノ酸６〜３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ−ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド分子のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８〜約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６〜３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２〜５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シークエンシングにより、腫瘍中に存在する長い（１０残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のＨＬＡに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。いずれの例においても、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導がもたらされ得る。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも２種類以上の抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の異なるペプチドを含有する。少なくとも２種類の異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチド、例えば、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で異常に発現することが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する腫瘍特異的変異またはペプチドを含むことが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する。抗原性ペプチドが由来しうる適当なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）データベースに見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトのがんにおける体細胞変異に関する包括的な情報をキュレートしたものである。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、数万人のがん患者からの臨床成績を用いた臨床グレードのがんゲノムデータを集約及びリンクしたものである。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性質を有する抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変にさらに供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ−アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１−２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３〜６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風トキソイドの８３０〜８４３、インフルエンザの３０７〜３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２〜３９８及び３７８〜３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる態様において、抗原は、抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。またさらなる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
Ｖ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載される、または表Ａ、表１．２、またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に記載される方法を用いて選択された１つまたは多数の抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１〜３０種類のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０種類の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、１〜１００種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１〜３０種類の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なる抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列を含有することができる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、及び／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、Ｔ細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物中へのその混合が、抗原に対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で修飾する任意の物質である。担体は、抗原がそれに結合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖であることができる。任意で、アジュバントは、共有結合性または非共有結合性にコンジュゲートされる。
抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントの能力は、典型的に、免疫媒介性反応の有意なもしくは実質的な増大、または疾患症候の低減によって明示される。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して生じた抗体の力価の有意な増大によって明示され、Ｔ細胞活性の増大は、典型的に、細胞増殖、または細胞性細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増大において明示される。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはＴｈ応答を、主として細胞性またはＴｈ応答へと変更することによって、免疫応答を変化させ得る。
適しているアジュバントは、１０１８ ＩＳＳ、アラム、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、及びＲｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどの他の専売アジュバントを含むが、それらに限定されない。不完全フロインドまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが、有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８−２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３−１１）。また、サイトカインを使用することもできる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織に対する樹状細胞の遊走への影響（例えば、ＴＮＦ−α）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速化（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、及びＩＬ−４）（具体的にその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとしての作用（例えば、ＩＬ−１２）に直接結び付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４−４１８）。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することが報告されている。ＴＬＲ ７、ＴＬＲ ８、及び／またはＴＬＲ ９に結合するＲＮＡなどの他のＴＬＲ結合分子がまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントの他の例は、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに、治療的に及び／またはアジュバントとして作用し得る、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５などの免疫活性小分子及び抗体を含むが、それらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、当業者が過度の実験なしで容易に決定することができる。追加的なアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、１種類よりも多い異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記の任意またはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチン及びアジュバントを、任意の適切な配列において、一緒にまたは別々に投与できることもまた、企図される。
担体（または賦形剤）は、アジュバントから独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増大させるため、または血清半減期を増大させるために、特に変異体の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体は、Ｔ細胞に対してペプチドを提示するのを助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適している担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリンなどの血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンなどのホルモン、またはパルミチン酸であることができるが、それらに限定されない。ヒトの免疫化のためには、担体は概して、ヒトに許容されかつ安全な、生理学的に許容される担体である。しかし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは、適している担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであることができる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体よりも、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態において抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣのトリマー複合体が存在する場合に可能である。対応して、ペプチドがＣＴＬの活性化のために使用される場合だけではなく、追加的にそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが添加される場合に、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、追加的に、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。
抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６−６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５−６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３−１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２−６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３−９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３−８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７−４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（ １３）：３４０１−１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
Ｖ．Ａ．抗原カセット
１つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「抗原カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原と、k抗原（複数可）を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原（複数可）の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原（複数可）に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。カセットは、表Ａ及び／またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に示される１つ以上の新生抗原、及び／または表１．２に示される１つ以上の抗原を含むことができる。
有用なプロモーターは、構成性プロモーター、または発現させる抗原（複数可）の量を制御することが可能な調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、望ましいプロモーターとして、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのものがある［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。さらに別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリβアクチンプロモーターである［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］。当業者であれば、他の適当な、または望ましいプロモーターも選択することができる。
抗原カセットは、転写産物の効率的なポリアデニル化（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）のためのシグナルを与える配列ならびに機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を含むイントロンを含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列も含みうる。本明細書の例示的なベクターに用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、抗原ベースの配列の後で、ウイルスベクター配列の前にカセットに挿入することができる。一般的なイントロン配列もまたＳＶ−４０由来のものでよく、ＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。抗原カセットは、プロモーター／エンハンサー配列と抗原（複数可）との間に位置するイントロンを含んでもよい。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は従来のものであり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書に引用される参照文献を参照］、多くのかかる配列が商業的及び産業的供給元、ならびにＧｅｎｂａｎｋより入手可能である。
抗原カセットは１つ以上の抗原を有することができる。例えば個、特定のカセットは、１〜１０個、１〜２０個、１〜３０個、１０〜２０個、１５〜２５個、１５〜２０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの抗原を含むことができる。抗原は互いに直接連結されてもよい。抗原はリンカーによって互いに連結されてもよい。抗原は、Ｎ〜ＣまたはＣ〜Ｎを含む、互いに対して任意の方向とすることができる。
上記に述べたように、抗原カセットは、選択することができるものの中でもとりわけ、例えばＥ１遺伝子領域の欠失、またはＥ３遺伝子領域の欠失などのウイルスベクター内の任意の選択された欠失部位内に配置することができる。
抗原カセットは、５’から３’にかけて各要素の順序付けられた配列を説明する下式：
（Ｐａ−（Ｌ５ｂ−Ｎｃ−Ｌ３ｄ）Ｘ）Ｚ−（Ｐ２ｈ−（Ｇ５ｅ−Ｕｆ）Ｙ）Ｗ−Ｇ３ｇ
を用いて説明することができ、
式中、
Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、
Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、
Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、
Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、
Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、
Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、
Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。
組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１〜４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１〜４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
１つの例では、存在する要素は、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、かつＷ＝１であり、さらなるプロモーターが存在しない場合が記述される場合（すなわち、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、２０個のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、各Ｎについて５’リンカーが存在し、各Ｎについて３’リンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最後のＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をＲＮＡアルファウイルス骨格に連結するリンカーが存在する。抗原カセットの３’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、３’の１９ｎｔのＣＳＥのような、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる３’ＵＴＲ要素に直接連結することが挙げられる。抗原カセットの５’末端の、ＲＮＡアルファウイルス骨格との連結の例としては、２６Ｓプロモーター配列、アルファウイルスの５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、または２４ｎｔのＣＳＥに直接連結することが挙げられる。
他の例としては、ａ＝１であり、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在する場合が記述される場合；ａ＝１かつＺが１よりも大きく、それぞれが１つ以上の異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の発現をもたらす、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在する場合；ｈ＝１であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の発現をもたらす別のプロモーターが存在することが記述される場合；及び、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列（存在する場合）がＲＮＡアルファウイルス骨格に直接連結される場合などが挙げられる。
他の例としては、存在する各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と同じであってよい。例えば、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２が、それぞれ２６Ｓのサブゲノミックプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と異なっていてもよく、また、互いと異なっていてもよい。
５’リンカーＬ５は、天然配列または非天然配列であってよい。非天然配列としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが挙げられる。３’リンカーＬ３もまた、天然配列または非天然配列であってよい。さらに、Ｌ５及びＬ３は、いずれも天然配列であってよく、いずれも非天然配列であってよく、または一方が天然で他方が非天然であってもよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｙについて、アミノ酸リンカーＧ５は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
アミノ酸リンカーＧ３は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。Ｇ３はまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎはまた、アミノ酸が、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。
Ｖ．Ｂ．免疫チェックポイント
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるＣ６８ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも１つの免疫調節因子（例えばｓｃＦｖなどの抗体）をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、抗原カセットと、チェックポイント阻害剤をコードする１つ以上の核酸分子とを含むことができる。
遮断または阻害するための標的となりうる例示的な免疫チェックポイント分子としては、これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ（γδ）及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ−１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ−１５０４９の１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する抗体、またはその抗原結合フラグメント、または他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１ｂｌｏｃｋｅｒ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。抗体をコードする配列は、当該技術分野における通常の技能を用いてベクター、例えばＣ６８に操作により組み込むことができる。例示的な方法の１つが、あらゆる目的で参照により本明細書に援用する、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４−９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７；に記載されている。
Ｖ．Ｃ．ワクチン設計及び製造のさらなる考慮事項
Ｖ．Ｃ．１．すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が、ワクチン中への包含について優先される５３。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる５４。
Ｖ．Ｃ．２．抗原の優先順位決定
上記の抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、腫瘍が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ−Ｉ及びＨＬＡ−ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある）
さらに、場合によっては、抗原が患者の腫瘍のすべてまたは一部において喪失するかまたは不活性化されたＨＬＡアレルによって提示されることが予想される場合には、これらの新生抗原のワクチン接種における優先順位を下げる（例えば除外）することができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の喪失、または遺伝子座のホモ接合欠失のいずれかによって生じうる。ＨＬＡアレルの体細胞変異の検出方法は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ及びホモ接合欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出方法についても同様に述べられている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。抗原は、質量分析データが、予測された抗原が予測されたＨＬＡアレルによって提示されないことを示す場合には優先順位付けを外してもよい。
Ｖ．Ｄ．アルファウイルス
Ｖ．Ｄ．１．アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ−８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞にウイルスが吸着した後、ビリオンが細胞内区画内の膜と融合し、最終的にゲノムＲＮＡをサイトゾル中に放出する。プラス鎖の向きを有し、５’末端のメチルグアニル酸キャップ及び３’末端のポリＡテールを有するゲノムＲＮＡは、翻訳されて非構造タンパク質ｎｓＰ１−４を生成し、これが複製複合体を形成する。感染初期には、プラス鎖はこの複合体によってマイナス鎖の鋳型に複製される。現在のモデルでは、複製複合体は感染が進行するにつれてさらにプロセシングされ、生じたプロセス後の複合体はマイナス鎖の完全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ及び構造遺伝子を含む２６Ｓのサブゲノムプラス鎖ＲＮＡへの転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）が、マイナス鎖鋳型からのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補体、ゲノム鋳型からのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔのＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡとのジャンクション領域内の２４ｎｔのＣＳＥ、及び、プラス鎖鋳型からのマイナス鎖合成における３’末端の１９ｎｔのＣＳＥを含む様々なＲＮＡ合成ステップにおいて潜在的に一定の役割を担っているものとして同定されている。
ウイルスの自然の生活環では、異なるＲＮＡ種の複製後、ウイルス粒子が通常、アセンブルされる。２６Ｓ ＲＮＡは翻訳され、生じたタンパク質はさらにプロセシングされて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２種類の小ポリペプチドＥ３及び６Ｋを含む構造タンパク質を生成する（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルスＲＮＡのカプシド形成が生じ、通常はゲノムＲＮＡのみに特異的なカプシドタンパク質がパッケージングされた後、ビリオンがアセンブルされ、膜表面に出芽する。
Ｖ．Ｄ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルス配列、特徴、及び、他の要素）を使用してアルファウイルスベースの送達ベクター（アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）ベクターとも称される）を作製することができる。アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７，Ｒｈｅｍｅ ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ−８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ−８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス配列を用いたいくつかの発現ベクターの設計戦略が開発されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。１つの戦略では、アルファウイルスベクターの設計は、構造タンパク質遺伝子の下流に２６Ｓプロモーター配列因子の第２のコピーを挿入した後、異種遺伝子を挿入することを含む（Ｆｒｏｌｏｖ １９９３）。これにより、天然の非構造及び構造タンパク質以外に、さらなる異種タンパク質を発現するサブゲノムＲＮＡが産生される。このシステムでは、感染性ビリオンを産生するためのすべての因子が存在し、したがって、非感染細胞において発現ベクターの繰り返しの感染のラウンドが行われうる。
別の発現ベクターの設計では、ヘルパーウイルスシステムを利用する（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。この戦略では、構造タンパク質は異種遺伝子によって置換される。したがって、依然としてインタクトな非構造遺伝子によって媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製の後、２６ＳサブゲノムＲＮＡが異種タンパク質の発現をもたらす。従来、構造タンパク質を発現するさらなるベクターが、例えば、細胞株の同時トランスフェクションなどによってイン・トランスで与えられることで感染性ウイルスを生じる。１つのシステムが米国特許第８，０９３，０２１号に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。ヘルパーベクターシステムは、感染性粒子を形成する可能性を制限するという長所をもたらし、したがってバイオセーフティーを改善する。さらに、ヘルパーベクターシステムは、全ベクター長を短縮し、複製及び発現の効率を改善する可能性がある。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、構造タンパク質が抗原カセットで置換されたアルファウイルス骨格を用いることができ、得られるベクターはバイオセーフティーの問題が低減されるのと同時に全体的な発現ベクターのサイズの減少により、効率的な発現を促進する。
Ｖ．Ｄ．３．インビトロでのアルファウイルスの生成
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のＲＮＡポリヌクレオチドである。ＲＮＡ生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳ＩＶＴがある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡに転写されることが望ましい配列の５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、ＤＮＡ鋳型は、適当なＲＮＡポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）とインキュベートされる。得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、７−メチルグアノシンまたは関連する構造などの５’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化（ポリＡ）テールを有するように３’末端を改変することを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
Ｖ．Ｄ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
アルファウイルスベクターの場合では、標準的な送達方法は、カプシド、Ｅ１、及びＥ２タンパク質をイン・トランスで与えることによって感染性のウイルス粒子を生じる上記に述べたヘルパーウイルスシステムである。しかしながら、Ｅ１及びＥ２タンパク質は、しばしば中和抗体の主要な標的である点に留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。したがって、対象とする抗原を標的細胞に送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性は、感染性粒子が中和抗体の標的とされる場合に低下する可能性がある。
ウイルス粒子を媒介とする遺伝子送達に代わる代替的手法として、ナノ粒子を用いた発現ベクターの送達がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。重要な点として、ナノ材料担体は、非免疫原性材料で形成することができ、送達ベクター自体に対する免疫の誘発を一般的に回避することができる。これらの材料としては、これらに限定されるものではないが、脂質、無機ナノ材料、及び他のポリマー材料を挙げることができる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。かかる材料は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含みうる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、膜及び小胞状構造の形成を可能とする脂質の両親媒性の性質のために魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。一般的にこれらの小胞は、標的細胞の膜内に吸収され、サイトゾル中に核酸を放出することによって発現ベクターを送達する。さらに、ＬＮＰは特定の細胞種のターゲティングを促すようにさらに改変または官能化することができる。ＬＮＰの設計における別の考慮事項は、ターゲティングの効率と細胞毒性との間のバランスである。脂質の組成は一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の規定の混合物を含む。いくつかの例では、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、またはさらなる部分の付着を促す化学官能基を与えるために特定の脂質が含まれる。脂質の組成は、全体のＬＮＰのサイズ及び安定性に影響しうる。１つの例では、脂質の組成は、ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質の組成物は、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ複合化脂質、ステロール、または中性脂質などの１種類以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解、または遊離核酸による免疫系のオフターゲットの刺激を含むいくつかの望ましくない影響を有しうる。したがって、アルファウイルスベクターの封入を利用して分解を防止する一方で、潜在的なオフターゲット効果も防止することができる。特定の例では、アルファウイルスベクターは、ＬＮＰの水性の内部など、送達担体内に完全に封入される。ＬＮＰ内へのアルファウイルスベクターの封入は、微小流体液滴生成装置で行われる微小流体混合及び液滴生成などの当該技術分野では周知の方法によって実施することができる。かかる装置としては、これらに限定されるものではないが、標準的なＴジャンクション装置またはフローフォーカシング装置が挙げられる。１つの例では、ＭＣ３またはＭＣ３様分子含有組成物などの所望の脂質製剤を、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成装置に供給することで、送達ベクター及び所望の物質がＭＣ３またはＭＣ３様分子ベースのＬＮＰの内部に完全に封入される。１つの例では、液滴生成装置は、生成されたＬＮＰの粒径範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１〜１０００ｎｍの範囲の粒径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ｎｍの粒径を有することができる。液滴生成の後、発現ベクターを封入した送達ベクターを、投与に備えてさらに処理または改変することができる。
Ｖ．Ｅ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｅ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
１つ以上の抗原を送達するためのワクチン組成物（例えば、抗原カセットを介し、表Ａ及びＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果に示される１つ以上の新生抗原、及び／または表１．２に示される１つ以上の抗原を含む）は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることにより作出することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（配列番号１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
さらなる態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列と、発現を誘導する調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む組換えアデノウイルスが提供される。この組換えウイルスは、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に感染させることが可能であり、細胞内で新生抗原カセットの産物を発現することが可能である。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。抗原カセットを、これらの遺伝子欠失部位のいずれに挿入することもできる。抗原カセットは、それに対するプライミングされた免疫応答が望ましい抗原を含むことができる。
別の態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスを感染させた哺乳動物細胞が提供される。
さらなる別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＣ６８由来の）またはその機能的フラグメントを発現する新規な哺乳動物細胞株が提供される。
いっそうさらなる態様において、本明細書では、哺乳動物細胞内に抗原カセットを送達するための方法であって、細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された、有効量のＣ６８などのチンパンジーアデノウイルスを導入する工程を含む方法が提供される。
さらなる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を誘発してがんを治療するための方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする腫瘍に由来する１種類以上の抗原をコードする抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
さらに、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳動物細胞も開示される。この遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択することができる。
さらに、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示される。この遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失した、配列番号１の配列を含む。
さらに、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、異種宿主細胞内でカセットの発現を誘導する１つ以上の調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含むベクターであって、任意で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列が、複製及びカプシド形成に必要とされる少なくともシスエレメントを含み、シスエレメントが抗原カセット及び調節配列に隣接している、ベクターも開示される。いくつかの態様において、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠失していてもよい。
さらに、抗原カセットを発現するように操作されたＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトした宿主細胞も開示される。さらに、細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することによって細胞内に導入された選択された遺伝子を発現するヒト細胞も開示される。
さらに、哺乳動物細胞に抗原カセットを送達するための方法であって、前記細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された有効量のＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターを導入することを含む方法も提供される。
さらに、哺乳動物細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することと、適当な条件下で細胞を培養することと、抗原を産生することと、を含む、抗原を産生するための方法も開示される。
Ｖ．Ｅ．２．Ｅ１を発現する相補性細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
ＡＡＶ強化アッセイを用いてチンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定することができる。このアッセイは、他の特性評価されていないアデノウイルス（例えば他の種由来）のＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株においてＥ１の機能を同定するうえで有用である。このアッセイは米国特許第６，０８３，７１６号の実施例４Ｂに記載されている。
選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１）は、選択された親細胞株で発現するためのプロモーターの転写制御下にある可能性がある。この目的で誘導性または構成性プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターには、亜鉛によって誘導されるヒツジメタロチオニンプロモーター、または糖質コルチコイド、特にデキサメタゾンによって誘導されるマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。本明細書に参照により援用するところの国際出願第ＷＯ９５／１３３９２号において特定されるものなどの他の誘導性プロモーターもパッケージング細胞株の作製に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現を制御する構成性プロモーターも用いることができる。
任意の所望のＣ６８遺伝子を発現する新規な細胞株を作製するために親細胞を選択することができる。限定されることなく、かかる親細胞株は、ＨｅＬａ［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］、及びＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞であってよい。他の適当な親細胞株を他の供給元から入手することができる。親細胞株としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１−２ａを挙げることができる。
Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用となりうる。１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物を発現する基本的に同じ手順を用いて構築された細胞株は、これらの産物をコードする遺伝子に欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。さらに、他のヒトＡｄＥ１遺伝子産物を発現する細胞株も、チンパンジー組換えＡｄを作製するうえで有用である。
Ｖ．Ｅ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
「機能的に欠失された」という用語は、その遺伝子領域の充分な量が除去または例えば変異もしくは改変により他の形で変化させられていることにより、その遺伝子領域が遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を産生できなくなっていることを意味する。機能的欠失につながりうる変異または改変としては、これらに限定されるものではないが、未成熟終止コドンの導入及び基準及び非基準開始コドンの除去のようなナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングまたは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはこれらの組み合わせが挙げられる。必要な場合、遺伝子領域全体を除去することができる。
配列の欠失、挿入、及び他の変異を含む、本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的手法を用いて生成することができるものであり、本明細書の範囲内である。
Ｖ．Ｅ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、任意で、例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている［例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照］。
抗原カセットをヒト（または他の哺乳動物）細胞に送達するための有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築において、広範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに用いることができる。最小のチンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスとともに使用して感染性の組換えウイルス粒子を作製することができる。ヘルパーウイルスは、最小のチンパンジーアデノウイルスベクターのウイルス感染性及び増殖に必要な基本的な遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択された欠失のみが、欠失がなければ機能性のウイルスベクターに導入される場合、欠失された遺伝子産物は、欠失された遺伝子機能をイン・トランスで与えるウイルスを選択されたパッケージング細胞株内で増殖させることによるウイルスベクター作製プロセスで供給することができる。
Ｖ．Ｅ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
Ｖ．Ｅ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
１つの例として、適当なベクターは、Ｃ６８アデノウイルスの最初期遺伝子Ｅ１ａ及び後初期遺伝子Ｅ１ｂの全体または充分な部分を欠失させることにより、それらの正常な生物学的機能を失わせることによって形成することができる。複製不全Ｅ１欠失ウイルスは、対応する遺伝子産物をイン・トランスで与える機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含むチンパンジーのアデノウイルス形質転換相補性細胞株で増殖させた場合に感染性のウイルスを複製及び生成することが可能である。既知のアデノウイルス配列に対する相同性に基づけば、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは、当該技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスでそうであるように多くの細胞種に感染することが可能であり、抗原（複数可）を発現することができるが、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを有していない多くの細胞では、細胞が極めて高い感染多重度で感染していないかぎりは複製できないものと予想される。
別の例として、Ｃ６８アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全体または一部を、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から除去することができる。
チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターは、Ｅ４遺伝子の欠失を有するように構築することもできる。さらに別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有することができる。
欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれに導入することもできる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２内の欠失も特定の目的では有用となりうる。他の欠失を他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子に導入することもできる。
上記に述べた欠失は、個々に用いることもできる。すなわち、アデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を有してもよい。また、それらの生物学的活性を破壊または低減するうえで効果的な遺伝子全体またはその一部を任意の組み合わせで用いることもできる。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子、またはＥ１及びＥ３遺伝子、または、Ｅ３の欠失をともなうかまたはともなわない、Ｅ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子の欠失を有することができる。上記に述べたように、かかる欠失は、所望の結果を得るために温度感受性変異などの他の変異と組み合わせて用いることができる。
抗原（複数可）を含むカセットを、任意で、チンパンジーＣ６８Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入することができる。また、必要に応じて既存の遺伝子領域内にカセットを挿入することでその領域の機能を破壊することもできる。
Ｖ．Ｅ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。ヘルパーウイルスは複製不全であってよく、上記に述べた配列以外の様々なアデノウイルス遺伝子を含むことができる。ヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて用いることができる。
Ｃ６８では、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端を、ウイルスの左端から約１３００ｂｐを除去するＳｓｐＩによって短縮することによって形成されるフラグメントとすることができる。次に、この短縮されたウイルスをプラスミドＤＮＡとともにＥ１発現細胞株内に同時トランスフェクトすることにより、プラスミド内のＣ６８配列との相同組み換えによって組換えウイルスを形成する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５−１６９８７ （１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されるようなポリカチオン複合体として形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意で、レポーター遺伝子を含んでもよい。多くのかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在によって、Ａｄベクターとヘルパーウイルスを独立して観察することが可能となる。この第２のレポーター遺伝子を用いることで、精製時に得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスとを分離することが可能である。
Ｖ．Ｅ．８．ウイルス粒子のアセンブリと細胞株の感染
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
例えば、所望の抗原を含むウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列との間で相同組み換えが起こり、これによりベクター内のアデノウイルス−抗原配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされ、組換えウイルスベクター粒子が得られる。
得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、抗原カセットを選択された細胞に導入するうえで有用である。パッケージング細胞株内で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ実験において、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスが、カセットを非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞に導入するうえで実用性を有することが実証されている。
Ｖ．Ｅ．９．組換えウイルスベクターの使用
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される）は、抗原（複数可）をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
上記に述べた組換えベクターは、遺伝子治療について公開されている方法にしたがってヒトに投与される。抗原カセットを有するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは生体適合性溶液または薬学的に許容される送達溶媒中に懸濁させて患者に投与することができる。適当な溶媒としては滅菌生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容される担体として知られ、当業者には周知のものである他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的で使用することもできる。
チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞を形質転換し、医療分野の当業者によって判定することが可能な有害作用をともなわずに、または医学的に許容される生理学的作用をともなって、治療効果を与えるうえで充分なレベルの抗原の導入及び発現をもたらすのに充分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、肝臓、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
ウイルスベクターの用量は、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に主として依存し、したがって患者間で異なりうる。用量は、あらゆる副作用に対して治療効果のバランスが取れるように調節され、かかる用量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なりうる。抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、投与頻度を決定することができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、「薬学的有効量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクトし、ワクチン効果、すなわち一定の測定可能なレベルの防御免疫をもたらすような選択された遺伝子の充分な発現レベルを与えるのにある投与経路で有効な組換えアデノウイルスの量で投与することができる。抗原を含むＣ６８ベクターは、アジュバントと同時投与することができる。アジュバントは、ベクターとは別のものであってもよく（例えばミョウバン）または特にアジュバントがタンパク質である場合にはベクター内にコードされてもよい。アジュバントは当該技術分野では周知のものである。
従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせるか、または免疫原もしくは疾患に応じて調節することができる。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、及び鼻腔内経路が好ましい。投与経路は、主として治療される疾患の性質によって決められる。
抗原（複数可）の発現レベルを観察することにより、ブースターの必要性（ある場合）を決定することができる。例えば、血清中の抗体力価の評価の後、必要に応じてブースター免疫が望ましい場合がある。
ＶＩ．治療及び製造方法
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の抗原などの１つ以上の抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び／または緩和する方法も提供される。
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫及び白血病などの、血液腫瘍であることができる。
抗原は、ＣＴＬ応答を誘導するのに充分な量で投与することができる。
抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質をさらに投与することができる。例えば、対象に、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１をさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、ＣＴＬＡ−４遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各抗原の最適量、及び最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調製することができる。注射の方法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、及びｉ．ｖ．を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数、及び／または量が、組織、がん、及び／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされるか、または患者の変異状態によって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、及び当然、患者のＨＬＡハロタイプに依存し得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における抗原の発現にしたがって抗原の選択を変えること、または、処置の第１のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
抗原ワクチンの投与を行うための患者は、さまざまな診断方法、例えば、下記でさらに述べる患者選択方法の使用により特定することができる。患者選択では、１つ以上の遺伝子の変異または発現パターンを特定することを含むことができる。場合により、患者選択では、患者のハプロタイプを特定することを含む。さまざまな患者選択方法を並行して行うことができ、例えば、シークエンシング診断によって患者の変異及びハプロタイプの両方を特定することができる。さまざまな患者選択方法を順次行うこともでき、例えば、１つの診断検査で変異を特定し、別の診断検査で患者のハプロタイプを特定し、その場合、各検査は、同じ（例えば、両方ともハイスループットシークエンシング）か、または異なる（例えば、一方がハイスループットシークエンシングで他方がサンガーシークエンシング）診断方法であってよい。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの薬学的組成物は、多量に存在することができ、及び／または、この特定の抗原もしくはこの抗原の経路に特異的な１種類よりも多い抗原を含めることができる。
抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を惹起し、かつ、症候及び／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに充分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命に関わるか、または潜在的に命に関わる状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、及び抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、及びその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき抗原は、単独で、または、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性及び負電荷を有するリン脂質、及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、及び血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７ （１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、及び任意でペプチドの１つ以上をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８ （１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にＤＮＡからなる粒子を、投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションを伴うかまたは伴わない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ ９６／１８３７２；９３２４６４０ＷＯＡＷＯ ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）： ６８２−６９１ （１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号 Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；９１０６３０９ＷＯＡＷＯ ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４ （１９８７）に記載されている。
抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００４） １０， ６１６−６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１） ２３９（１）： ４５−６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２） ４４３（３）：６０３−１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５） ４３ （１）： ６８２−６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８） ７２ （１２）： ９８７３−９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６） ２２ （４）：４３３−８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６） ３５２ （６２９１）：１３３７−４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４） ２０（ １３）：３４０１−１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０ （１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
核酸を投与する手段は、１つ以上のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保持シグナルを含む。加えて、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、ＤＮＡに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちでもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び保護的、相互作用的、非縮合性（ＰＩＮＣ）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
また、本明細書に開示する方法の工程を行うこと；及び、多数の抗原または多数の抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産する工程を含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も、本明細書に開示する。
本明細書に開示する抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生産する方法は、抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む工程、及び、抗原またはベクターを精製する工程を含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、及びクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであることができる。
ＶＩＩ．抗原の使用及び投与
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはＡＡＹなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約２０個の抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのＭＨＣＩＩ抗原、及びユニバーサルクラスＩＩ抗原とみなされるＰＡＤＲＥ抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）と組み合わせて（例えば、同時、その前、またはその後で）対象に投与することができる。ＣＰＩは、抗体またはその抗原結合部分など、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
プライミングワクチンは、対象に注射（例えば筋肉内に）することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１〜１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１〜１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
プライムワクチン接種後に、ワクチンブースト（ブースターワクチン）を注射（例えば筋肉内に）することができる。ブースターワクチンは、プライム後の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと、及び／または８週間ごとに投与することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ(例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１〜１ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１ｕｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１〜１００ｕｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００ｕｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
抗ＣＴＬＡ−４（例えばトレメリムマブ）を対象に投与することもできる。例えば、抗ＣＴＬＡ４を筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはｓｒＲＮＡ低用量）の部位の近くに皮下投与することで同じリンパ節内に確実に送り込むことができる。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ−４の選択的ヒトＩｇＧ２ｍＡｂ阻害剤である。標的抗ＣＴＬＡ−４（トレメリムマブ）皮下用量は、通常、７０〜７５ｍｇ（詳細には７５ｍｇ）であり、例えば、１〜１００ｍｇまたは５〜４２０ｍｇの用量範囲である。
特定の場合では、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）などの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ−１及びＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合を阻害する選択的な高親和性のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般的に４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。
免疫モニタリングを、ワクチン投与の前、その間、及び／またはその後に行うことができる。かかるモニタリングは、他のパラメータの中でもとりわけ、安全性及び有効性についての情報を与えることができる。
免疫モニタリングを行うには、ＰＢＭＣが一般的に用いられる。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種の前、及びプライムワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に単離することができる。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前、及び各ブーストワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に採取することができる。
Ｔ細胞応答を、免疫モニタリングプロトコールの一環として評価することができる。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌、及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイなどの当業者には周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮ−γなどの細胞内または細胞外で捕捉されたサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を用い、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、３Ｈチミジン、ブロモデオキシウリジン、及びカルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の取り込み後に、Ｔ細胞集団のエクスビボ増殖を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム放出アッセイまたは代替的な比色細胞毒性アッセイにより機能的に評価することができる。
ＶＩＩＩ．抗原の特定
ＶＩＩＩ．Ａ．抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析のための研究法を、抗原の特定のスペースに記載し、適用している６，１４，１５。臨床設定における抗原の特定において、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びＮＧＳデータ解析に関連するものの、２つの区域にグループ化することができる。最適化の例は当業者には周知のものであり、例えば、そのような方法が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＶＩＩＩ．Ｂ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５〜５８）。清澄化した溶解物を、ＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。
免疫沈降は、抗体がＨＬＡ分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスＩ ＨＬＡ免疫沈降のためには、汎クラスＩ ＣＲ抗体を使用し、クラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲのためには、ＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、ＮＨＳ−セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、ＩＰのために等分した（５９、６０）。免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにＰｒｏｔｅｉｎＡ及び／またはＰｒｏｔｅｉｎＧでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。ＭＨＣ／ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
Figure 2021525076
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なＩＰを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはＣ１８分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、ＭＳ解析の前に−２０℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているＨＰＬＣ緩衝液において再構成し、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）における勾配溶出のために、Ｃ−１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度で収集し、その後、ＭＳ２低解像度スキャンを、選択イオンのＨＣＤフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、ＭＳ２スペクトルは、ＣＩＤもしくはＥＴＤフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための３つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。ＭＳ２スペクトルはまた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のＭＳ２スペクトルを、Ｃｏｍｅｔ（６１、６２）を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定を、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ（６３〜６５）を用いてスコア化する。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）及び他のサーチエンジンを用いてさらなるシークエンシングを行うか、またはスペクトルマッチング及びデノボシークエンシング（９７）を含むシークエンシング法を用いることができる。
ＶＩＩＩ．Ｂ．１．総合的ＨＬＡペプチドシークエンシングのためのＭＳ検出限界の研究
ペプチドＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ（配列番号２９３６４）を用いて、何が検出の限界かを、ＬＣカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、及び１００ａｍｏｌであった。（表１）結果を図２４Ａ及び２４Ｂに示す。これらの結果は、検出の最低限界（ＬｏＤ）がアトモルの範囲（１０−１８）にあること、ダイナミックレンジが５桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（１０−１５）でシークエンシングに充分であるように見えることを示す。
（表１）
Figure 2021525076
ＩＸ．提示モデル
提示モデルを用いて、患者におけるペプチド提示の尤度を特定することができる。異なる提示モデルは当業者には周知のものであり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、及び同第ＷＯ２０１６１８７５０８号、ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１１０２９３６３７号により詳細に記載されている。
Ｘ．訓練モジュール
訓練モジュールを用いて、ペプチド配列がそのペプチド配列に関連したＭＨＣアレルによって提示される尤度を生成する１つ以上の提示モデルを訓練データセットに基づいて構築することができる。さまざまな訓練モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。訓練モジュールは、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための予測モデルを構築することができる。訓練モジュールは、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル場面においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルも構築することができる。
ＸＩ．予測モジュール
予測モジュールを用いて、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して不適切に発現している候補抗原を特定することにより、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織で発現が変化している候補抗原を特定することができる。
提示モジュールは、１つ以上の提示モデルを処理されたペプチド配列に適用してペプチド配列の提示尤度を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、提示モデルを候補抗原に適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現形態では、提示モジュールは、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補抗原配列を選択する。別の実現形態では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補抗原を含むワクチンを患者に注射して免疫応答を誘導することができる。
ＸＩ．Ｂ． カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１ 概要
カセット設計モジュールを用いて、患者に注射するために選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成することができる。さまざまなカセット設計モジュールが当業者に周知であり、例えば、そのようなカセット設計モジュールは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
治療エピトープのセットは、所定の閾値を上回る提示尤度（提示尤度は、提示モデルにより決定される）に関連付けられた予測モジュールによって決定された選択されたペプチドに基づいて生成することができる。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープのセットは、多くの方法の任意の１つ以上（単独または組み合わせ）に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合親和性もしくは予測される結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合安定性もしくは予測される結合安定性、ランダムサンプリングなどに基づいて、生成することができる。
治療エピトープはそれ自体が選択されたペプチドに相当してもよい。治療エピトープは、選択されたペプチド以外にＣ及び／またはＮ末端フランキング配列を含むこともできる。Ｎ及びＣ末端フランキング配列は、その由来源タンパク質との関連において治療ワクチンエピトープの天然のＮ及びＣ末端フランキング配列であってよい。治療エピトープは固定長のエピトープを表してもよい。治療エピトープは、可変長のエピトープを表してもよく、エピトープの長さは例えばＣまたはＮ末端フランキング配列の長さによって異なりうる。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、それぞれ２〜５残基の異なる長さを有してよく、これによりエピトープの１６種類の可能な選択肢が与えられる。
カセット設計モジュールは、カセット内の１組の治療エピトープ間の連結部にまたがるジャンクションエピトープの提示を考慮することによってカセット配列を生成することもできる。ジャンクションエピトープは、カセット内で治療エピトープ及びリンカー配列を連結するプロセスによってカセット内に生じる新規な非自己であるが無関係なエピトープ配列である。ジャンクションエピトープの新規な配列は、カセットの治療エピトープ自体とは異なる。
カセット設計モジュールは、ジャンクションエピトープがその患者において提示される尤度を低下させるカセット配列を生成することができる。具体的には、カセットが患者に注射される際、ジャンクションエピトープは、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルによって提示される可能性を有し、それぞれＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する。かかる応答は、ジャンクションエピトープに対する反応性を有するＴ細胞は治療効果を有さないことから望ましくなく、抗原競合によりカセット内の選択された治療エピトープに対する免疫応答を消失させる可能性がある７６。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットについて繰り返し処理を行って、そのカセット配列に関連付けられたジャンクションエピトープの提示スコアが数値閾値を下回るカセット配列を決定することができる。ジャンクションエピトープ提示スコアは、カセット内のジャンクションエピトープの提示尤度に関連付けられた量であり、ジャンクションエピトープ提示スコアの値が高いほど、カセットのジャンクションエピトープがＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩまたはその両方によって提示されやすいことを示す。
一実施形態では、カセット設計モジュールは、候補カセット配列間で最も低いジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられたカセット配列を決定することができる。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列について繰り返し処理を行い、各候補カセットのジャンクションエピトープ提示スコアを決定し、閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた最適なカセット配列を特定することができる。
カセット設計モジュールは、候補カセット配列内のジャンクションエピトープのいずれかが、ワクチンを設計しようとする特定の患者の自己エピトープであるかどうかを識別するために１つ以上の候補カセット配列をさらに確認することができる。これを行うには、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴなどの既知のデータベースに対してジャンクションエピトープを確認する。一実施形態では、カセット設計モジュールは、ジャンクション自己エピトープを防止するカセットを設計するように構成することができる。
カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチを実行して、すべての、または大部分の可能な候補カセット配列について繰り返し処理を行うことで最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する配列を選択することができる。しかしながら、かかる候補カセットの数は、ワクチンの容量が大きくなるにしたがって途方もなく大きくなりうる。例えば、２０個のエピトープのワクチン容量では、カセット設計モジュールは、最小のエピトープ提示スコアを有するカセットを決定するために約１０１８個の可能な候補カセットについて繰り返し処理を行わなければならない。この決定は、カセット設計モジュールが妥当な長さの時間内で患者に対するワクチンを生成するには計算の負荷（必要とされる計算処理リソースの点で）が大きくなり、時として処理不能となりうる。さらに、各候補カセットについて可能なジャンクションエピトープを処理することはよりいっそうの負荷となりうる。したがって、カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチにおける候補カセット配列の数よりも大幅に小さい候補カセット配列の数について繰り返し処理を行う方法に基づいてカセット配列を選択することができる。
カセット設計モジュールは、ランダムに、または少なくとも疑似ランダムに生成された候補カセットを生成し、所定の閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた候補カセットをカセット配列として選択することができる。さらに、カセット設計モジュールは、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有するサブセットからの候補カセットをカセット配列として選択することができる。例えば、カセット設計モジュールは、２０個の選択されたエピトープのセットについて約１００万の候補カセットのサブセットを生成し、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する候補カセットを選択することができる。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、このサブセットからジャンクションエピトープ提示スコアの低いカセット配列を選択することはブルートフォースアプローチと比べて最適とはいえないが、これは、必要な計算リソースが大幅に少なく、そのため、その実施が技術的に可能である。さらに、このより効率的な手法に対してブルートフォース法を行うことは、ジャンクションエピトープ提示スコアのわずかな、またはさらには無視される程度の改善しかもたらされない可能性があるため、リソースの配分の観点からはあまり価値がない。カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ配列を非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）として定式化することにより、改善されたカセット構成を決定することができる。ノードのリスト、及び各ノードのペア間の距離が与えられた場合、ＴＳＰは、各ノードをちょうど１回ずつ訪問して元のノードに戻るための最小の総距離に関連付けられたノードの配列を決定する。例えば、互いの間の距離が既知である都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられた場合、ＴＳＰの解は、可能な巡回路のうちで各都市をちょうど１回ずつ訪問するのに移動する総距離が最小となるような都市の閉じた配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンは、ノードのペア間の距離が非対象である場合の最適なノードの配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢに移動するための「距離」は、ノードＢからノードＡに移動するための「距離」と異なる場合がある。非対称ＴＳＰを用いて改善された最適カセットについて解くことにより、カセット設計モジュールは、カセットの各エピトープ間のジャンクションにわたって低い提示スコアを与えるカセット配列を見つけることができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの各ジャンクションにわたったジャンクションエピトープ提示スコアを最小とするために各エピトープが連結されなければならない順序に対応した治療エピトープの配列を示す。このアプローチによって決定されたカセット配列は、ジャンクションエピトープの提示が大幅に低い配列を与える一方で、特に生成される候補カセット配列の数が大きい場合に、必要とされる計算リソースがランダムサンプリングアプローチよりも大幅に少なくなる可能性がある。異なる計算手法及び最適化カセット設計の比較の例示的な例が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩ．Ｂ．２ 共有抗原ワクチン配列の選択
共有抗原ワクチンに含めるための共有抗原の配列及びかかるワクチンによる治療に適当な患者は、本明細書に示される詳細な開示を用いることで当業者が選択することができる。例えば、表Ａ、１．２、またはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を、配列の選択に用いることができる。特定の場合では、特定の変異とＨＬＡアレルの組み合わせが好ましい場合があり（例えば、それぞれが対象に存在することを示す特定の対象から得られるシークエンシングデータに基づき）、次にこれらを組み合わせて用い、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を用いてワクチンに含めるための共有新生抗原配列を同定することができる。例示的な変異とそれらに結びつけられたＨＬＡアレルを表３２及び３４に示す。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍと、Ｂ３５１２、Ｂ３５０３、及びＢ３５０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐと、Ａ０１０１、Ａ０３０１、Ｂ５７０１、Ａ６８０１、Ａ０３０２、及びＡ１１０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、及びＡ６８０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ及びＢ１８０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＤまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＲまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａと、Ａ０３０１、Ａ０３０２、Ａ１１０１、Ｂ１５１０、Ｃ０３０３、及びＣ０３０４のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎと、Ａ２４０２及びＡ２３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ及びＡ０３０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＬまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌと、Ａ０２０７、Ｃ０８０２、及びＡ０２０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖと、Ｂ１５０１及びＢ１５０３の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、Ａ３１０１、Ｃ０１０２、及びＡ０３０２のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＨまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆと、Ａ２３０１、Ａ２４０２、Ｂ１５１０、Ｂ３９０６、Ｃ０５０１、Ｃ１４０２、及びＣ１４０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙと、Ａ１１０１及びＡ０３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅと、Ａ２４０２、Ｃ１４０３、及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択される。
例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＣまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原または共有新生抗原コード配列は、表ＡまたはＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果を参照して選択することができ、含めるために検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１を記載したすべての横列を特定することにより選択される。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＸＩＩＩ．例示的なコンピュータ
本明細書に記載される計算方法のいずれにおいてもコンピュータを使用することができる。当業者には、コンピュータは異なるアーキテクチャを有し得る点が認識されよう。当業者には周知のコンピュータの例は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号により詳細に記載されている。
ＸＩＶ．抗原送達ベクターの例
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。かかる技術は文献に完全に説明されている（例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい）。
ＸＩＶ．Ａ．新生抗原カセットの設計
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答（複数可）を刺激するクラスＩ ＭＨＣに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原（ＴＳＮＡ）を送達することができる。１つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはＴＳＮＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、（１）１個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いＴ細胞応答を生じることができるかどうか、（２）どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のＴＳＮＡ間に配置される最適リンカーを作るか、（３）カセット内の各エピトープの相対位置がＴ細胞応答に影響するか、（４）カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するＴ細胞応答の程度または質に影響するかどうか、（５）細胞ターゲティング配列の付加がＴ細胞応答を向上させるか。
抗原提示及びモデルカセット内のマーカーエピトープに特異的なＴ細胞応答を評価するために以下の２つの指標が開発された。すなわち、（１）特殊な操作を行ったレポーターＴ細胞の活性化によって測定される抗原提示の評価を可能としたインビトロ細胞ベーススクリーン（Ａａｒｎｏｕｄｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、及び（２）対応するエピトープ特異的Ｔ細胞応答によるヒト由来のカセットから誘導されたエピトープのワクチン接種後の免疫原性を評価するためにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を使用したインビボアッセイ（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
ＸＩＶ．Ｂ．抗原カセット設計の評価
ＸＩＶ．Ｂ．１．方法及び材料
ＴＣＲ及びカセット設計及びクローニング
選択されたＴＣＲは、Ａ＊０２０１により提示される場合にペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２９３６５）（ＰＤＢ番号５Ｄ２Ｎ）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号２９３６６）（ＰＤＢ番号３ＲＥＶ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２９３６７）（ＰＤＢ番号１ＯＧＡ）ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号２９３６８）（ＰＤＢ番号１ＡＯ７）を認識する。２Ａペプチド連結ＴＣＲサブユニット（βに続きα）、ＥＭＣＶＩＲＥＳ、及び２Ａ連結ＣＤ８サブユニット（βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子）を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ社により合成されたものである。
インビトロエピトーププロセシング及び提示実験用の細胞株の作製
ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社より購入し、水／ＤＭＳＯ（２：８，ｖ／ｖ）に加えた１０ｍＭ ｔｒｉｓ（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはＧｉｂｃｏ社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳｈｉ）はＳｅｒａｄｉｇｍ社より入手した。ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質、ゼオシン、及びプロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社より入手した。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を１０％ ＦＢＳｈｉ、ピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに０．３μｇ／ｍＬのプロマイシンを加えた。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９２）をＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＤＭ）＋２０％ＦＢＳｈｉ中で培養した。Ｕ−８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４）細胞を、１０％ＦＢＳｈｉを添加したＭＥＭ Ｅａｇｌｅｓ培地中で維持した。
Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞は、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターコンストラクトを含んでいる。Ｌｕｃｉａ遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合によって活性化されると、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを培地中に分泌させる。このルシフェラーゼは、ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃルシフェラーゼ検出試薬を用いて測定することができる。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ細胞をレンチウイルスで形質導入して抗原特異的ＴＣＲを発現させた。ＨＩＶ由来レンチウイルストランスファーベクターをＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社より入手し、ＶＳＶ−Ｇ（ｐＣＭＶ−ＶｓｖＧ）、Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）及びＧａｇ−ｐｏｌ（ｐＣｇｐＶ）を発現するレンチウイルス支持プラスミドをＣｅｌｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ社より入手した。
レンチウイルスを、４０μＬのリポフェクタミン及び２０μｇのＤＮＡミクスチャー（重量比４：２：１：１のトランスファープラスミドｐＣｇｐＶ：ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ：ｐＣＭＶ−ＶｓｖＧ）を使用し、ＨＥＫ２９３細胞の５０〜８０％コンフルエンスにあるＴ７５フラスコをリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でトランスフェクトすることにより調製した。８〜１０ｍＬのウイルス含有培地をＬｅｎｔｉ−Ｘシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて濃縮し、ウイルスを１００〜２００μｌの新鮮培地中に再懸濁した。この体積を用いて等しい体積のＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ細胞（５×１０Ｅ４〜１×１０Ｅ６個の細胞を異なる実験で使用した）にオーバーレイした。０．３μｇ／ｍｌのプロマイシン含有培地中での培養後、細胞をソートしてクロナリティーを得た。これらのＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンを、ペプチドを取り込ませたＴ２細胞を用いて活性及び選択性について試験した。
インビトロエピトーププロセシング及び提示アッセイ
Ｔ２細胞はＴＣＲによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。Ｔ２細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており（ＴＡＰ欠損）、内因性のペプチドをＭＨＣ上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、Ｔ２細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。５種類のマーカーペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２９３６５）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号２９３６６）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２９３６９）、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号２９３６８）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２９３６７）及び２種類の無関係のペプチドＷＬＳＬＬＶＰＦＶ（配列番号２９３７０）、ＦＬＬＴＲＩＣＴ（配列番号２９３７１）をＴ２細胞に取り込ませた。簡単に述べると、Ｔ２細胞をカウントし、ＩＭＤＭ＋１％ＦＢＳｈｉで１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。各ペプチドは１０μｇペプチド／１×１０６細胞となるように加えた。次いで細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。細胞をＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳｈｉで２回洗浄し、５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬを９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレートにプレーティングした。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬをＴ２細胞に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いでプレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
アデノウイルスカセットによるマーカーエピトープ提示を試験するため、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を代理抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用い、アデノウイルスベクターで形質導入した。Ｕ−８７ ＭＧ細胞を収穫し、９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレート中で培地中に５×１０Ｅ５細胞／１００μｌでプレーティングした。プレートを３７℃で約２時間インキュベートした。アデノウイルスカセットをＭＥＭ＋１０％ＦＢＳｈｉでＭＯＩ１００、５０、１０、５、１及び０に希釈し、Ｕ−８７ ＭＧ細胞に５μｌ／ウェルで加えた。プレートを再び３７℃で約２時間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ−８７ ＭＧ細胞に１００μＬ／ウェルで加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートした。プレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
免疫原性実験用のマウス系統
トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２．１（ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ社より入手した。これらのマウスは、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１リーダードメイン、α１ドメイン、及びα２ドメインと、マウスＨ２−Ｋｂ α３ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインから構成されるキメラクラスＩ分子からなる導入遺伝子を有するものである（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらの実験で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドの野生型ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃの雌及びホモ接合型ＨＬＡ−Ａ２．１Ｔｇの雌の第１世代子孫（Ｆ１）である。
アデノウイルスベクター（Ａｄ５ｖ）による免疫化
ＨＬＡ−Ａ２ Ｔｇマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により１×１０１０〜１×１０６個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の１２日後に測定した。
リンパ球の単離
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、１０％ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）中で組織を解離させた。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。１×１０５個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
新しく単離したリンパ球を２〜５×１０６細胞／ｍＬの密度で１０ｕＭの示したペプチドと２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５ｕｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３−６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を１：１００で使用した。試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で収集した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮｇ＋の割合（％）及び全ＩＦＮｇ＋細胞数／１×１０６個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
ＸＩＶ．Ｂ．２．抗原カセット設計のインビトロ評価
抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した（図１）。認識後、特性がよく知られているペプチド−ＨＬＡの組み合わせに特異的な５種類のＴＣＲのうちの１つを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ−ＬｕｃｉａレポーターＴ細胞が活性化され、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターＣＤ８ Ｔ細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
個々のＪｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａレポーター株は、等モル量の翻訳産物が得られるようにＰ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された抗原特異的ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖を含む発現コンストラクトによるレンチウイルス形質導入によって改変されたものである（Ｂａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。細胞表面上のＣＤ８は標的ｐＭＨＣ分子に対する結合親和性にとって重要であり、その細胞質テールの結合を介してシグナル伝達を促進する（Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｙａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）ことから、レンチウイルスコンストラクトへの第２のＣＤ８β−Ｐ２Ａ−ＣＤ８α因子の付加によって、親レポーター細胞株に欠損しているＣＤ８共受容体の発現がもたらされる。
レンチウイルスによる形質導入の後、Ｊｕｒｋａｔ−Ｌｕｃｉａレポーターをプロマイシン選択下で増殖させ、ＦＡＣＳ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（単一細胞蛍光支援細胞選別）に供し、モノクローナル集団をルシフェラーゼ発現について試験した。これにより、機能的細胞応答を有する特異的ペプチド抗原１、２、４、及び５について安定的に形質導入されたレポーター細胞株が得られた（表２）。
（表２）インビトロＴ細胞活性化アッセイの開発
ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的Ｔ細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、一連の短いカセットにおいて、すべてのマーカーエピトープを同じ位置に組み込み（図２Ａ）、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限エピトープ（図２Ｂ）を分離するリンカーのみを変えた。レポーターＴ細胞を、これらの短いカセットを発現するアデノウイルスコンストラクトを感染させたＵ−８７抗原提示細胞（ＡＰＣ）と個々に混合し、ルシフェラーゼ発現を非感染コントロールに対して測定した。モデルカセット内の４つすべての抗原が、一致するレポーターＴ細胞により認識され、複数の抗原が効率的にプロセシング及び提示されていることが示された。Ｔ細胞応答の程度は、天然及びＡＡＹリンカーについて概ね同様の傾向にしたがった。ＲＲリンカーベースのカセットから放出された抗原は、低いルシフェラーゼの誘導を示す（表３）。抗原プロセシングを阻害するように設計されたＤＰＰリンカーは、エピトープ提示が低いワクチンカセットを生じた（表３）。
（表３）短いカセット内のリンカー配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、ＤＰＰベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。Ｔ細胞エピトープのみ（リンカー無し）＝９ＡＡ、片側に天然リンカー＝１７ＡＡ、両側に天然リンカー＝２５ＡＡ、非天然リンカー＝ＡＡＹ，ＲＲ，ＤＰＰ
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、ヒト及びマウスのエピトープ以外に、カセットのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置された、ユビキチン（Ｕｂ）、ＭＨＣ及びＩｇ−κシグナルペプチド（ＳＰ）、及び／またはＭＨＣ膜貫通（ＴＭ）モチーフなどのターゲティング配列を含むさらなる一連の短いカセットを構築した（図３）。アデノウイルスベクターによってＵ−８７ ＡＰＣに送達されると、レポーターＴ細胞は、複数のカセット由来の抗原の効率的なプロセシング及び提示を示した。しかしながら、Ｔ細胞応答の程度は、異なるターゲティング機構によって大きく影響されなかった（表４）。
（表４）モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価
インビトロＴ細胞活性化アッセイを用いることにより、４つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がＴ細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
Figure 2021525076
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
ＸＩＶ．Ｂ．３．抗原カセット設計のインビボ評価
抗原カセット設計の評価の別の例として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に制限された形でＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた５つのヒトクラスＩ ＭＨＣエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した（図２Ａ、３、５Ａ）。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した（図４）。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１及びマウスＨ２−Ｋｂから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１のリーダー、マウスα３に連結されたα１及びα２ドメイン、膜貫通及び細胞質Ｈ２−Ｋｂドメインで構成されたキメラクラスＩ ＭＨＣ分子をコードしている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。このキメラ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に制限された抗原提示を可能とする一方で、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ上のα３ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
短いカセットでは、すべてのマーカーエピトープが、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した際に、一般的に報告されているもの（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）よりも約１０〜５０倍強い、Ｔ細胞応答を生じた。評価を行ったすべてのリンカーのうち、それぞれにその天然のアミノ酸配列が隣接した最小エピトープを含む２５マー配列のコンカテマーが、最大かつ最も広いＴ細胞応答を生じた（表５）。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーにより、抗原特異的Ｔ細胞応答がＣＤ８ Ｔ細胞から誘導されることが示された。
（表５）短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスが１ｅ１１個のアデノウイルス粒子による感染１７日後にカセット内のすべてのクラスＩ ＭＨＣ制限エピトープに対してＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2021525076
別の例では、元の５つのマーカーエピトープの隣に、既知のＣＤ８ Ｔ細胞反応性を有するさらに１６個のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１及びＢ＊４４：０５エピトープを含む一連の長いワクチンカセットを構築し、アデノウイルスベクターに組み込んだ（図５Ａ、Ｂ）。これらの長いカセットのサイズは、最終的な臨床用のカセット設計によく似たものとし、各エピトープの互いに対する位置のみを変えた。ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方でその程度及び幅において同等であり、（ａ）さらなるエピトープの追加が元のエピトープのセットに対する免疫応答の程度に大きく影響せず、また、（ｂ）カセット内のエピトープの位置はそれに続くＴ細胞応答に大きく影響しないことを示すものである（表６）。
（表６）長いカセット内のエピトープの位置の影響のインビボ評価
ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスが５ｅ１０アデノウイルス粒子による感染１７日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2021525076
＊技術的なエラーによりＴ細胞応答が見られなかったと疑われる。
ＸＩＶ．Ｂ．４．免疫原性及び毒性試験用の抗原カセットの設計
要約すると、モデルカセット評価による知見（図２〜５、表２〜６）によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約２０個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列（例えば、両側に８個のアミノ酸残基）が隣接した最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ（例えば、９個のアミノ酸残基）をそれぞれが埋め込んだ２５マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのＮ末端及び／またはＣ末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ＭＨＣ ＩのエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２９３６５）は、その５’末端側に天然の５’配列ＷＱＡＧＩＬＡＲ（配列番号２９３７２）が、その３’末端側に天然の３’配列ＱＧＱＮＬＫＹＱ（配列番号２９３７３）が隣接し、それによりＨＣＭＶ ｐｐ６５由来源タンパク質内にみられる
Figure 2021525076
という２５マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列（複数可）が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各２５マー配列は、それに続く２５マー配列に直接連結される。最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープがアミノ酸９個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然２５マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸１０個のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープには、アミノ酸８個とアミノ酸７個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に含ませた２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた。これらのクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）によって最後のクラスＩエピトープに連結した。この２個のクラスＩＩエピトープはまた、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）によって互いに対しても連結され、さらにＣ末端側にＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）を隣接させた。エピトープの位置もその数もＴ細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
さらなる例として、モデルカセットにより得られたインビトロ及びインビボデータ（図２〜５、表２〜６）に基づき、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、マウス及びヒトで免疫原性を示すことが知られている、特性のよく知られたＴ細胞エピトープを交互に配したカセット設計を生成した。いずれもそれらの天然の２５マー配列に埋め込まれた２０個のエピトープの後に、評価を行ったすべてのモデルカセットに存在する２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた（図６）。このカセット設計を用いて、複数種における免疫原性を調べ、ならびに薬理学的及び毒物学的研究を行った。
ＸＩＶ．Ｂ．５． 抗原カセットの設計ならびに３０個、４０個、及び５０個の抗原の評価
それぞれがアミノ酸２５個の長さである３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）、または５０個（ＸＸＬ）のエピトープを有する大きな抗原カセットを設計した。これらのエピトープは、腫瘍抗原を含む疾患抗原をモデル化するためのヒト、ＮＨＰ、及びマウスのエピトープの混合である。図２９に、異なる種からのエピトープの一般的な編成を示す。使用したモデル抗原は、ヒト、霊長類、及びマウスモデルについて表３７、３８、及び３９にそれぞれ記載されている。表３７、３８、及び３９のそれぞれは、エピトープの位置、名前、最小エピトープの記述、及びＭＨＣクラスを記載している。
これらのカセットを記載したようにｃｈＡｄ６８及びアルファウイルスベクターにクローニングし、より長い複数エピトープのカセットのの有効性の評価を行った。図３０は、ウェスタンブロットによる、予想されたサイズの少なくとも１つの大きなバンドによって示されるように、大きな抗原カセットのそれぞれがＣｈＡｄＶベクターから発現されたことを示している。
マウスを記載したように免疫して大きなカセットの有効性の評価を行った。Ｔ細胞応答を、エピトープＡＨ１（上のパネル）及びＳＩＮＮＦＥＫＬ（配列番号２９３７５）（下のパネル）について、ｃｈＡｄ６８ベクターによる免疫後にＩＣＳ及びテトラマー染色することにより（それぞれ図３１／表４０及び図３２／表４１）、また、ｓｒＲＮＡベクターによる免疫後にＩＣＳ染色することにより（図３３／表４２）分析した。３０個（Ｌ）、４０個（ＸＬ）、または５０個（ＸＸＬ）のエピトープを発現するｃｈＡｄ６８及びｓｒＲＮＡワクチンベクターを用いた免疫により、モデル疾患エピトープに対するＣＤ８＋免疫応答が誘導された。
（表３７）大きなカセット内のヒトエピトープ（列の順に、それぞれ２９３６７〜２９３６９、２９３６５〜２９３６６、２９４０２〜２９４１４、２９３７４、及び２９４１５〜２９４２５）
Figure 2021525076
（表３８）大きなカセット内のＮＨＰエピトープ（列の順に、それぞれ２９４２６〜２９４５５）
Figure 2021525076
（表３９）大きなカセット内のマウスエピトープ（列の順に、それぞれ２９３６２、２９４５６〜２９４５８、２９３６３、２９４５９〜２９４９３）
Figure 2021525076
（表４０）ＣｈＡｄの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）ペプチドに応答した平均のＩＦＮｇ＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
（表４１）ＣｈＡｄの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）抗原に対する平均のテトラマー＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
（表４２）ＳＡＭの大きなカセットで処置したマウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）ペプチドに応答した平均のＩＦＮｇ＋細胞
データは、全ＣＤ８細胞に対する％として示す。各グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値をＭＡＧ２０抗原カセットと比較した。
Figure 2021525076
ＸＶ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクター
ＸＶ．Ａ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの構築
１つの例では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）を操作して抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１（米国特許第６０８３７１６号に記載の配列番号２）に基づいて合成し、Ｅ１（ｎｔ４５７〜３０１４）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。このクローンをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型Ｃ６８ウイルスの配列を確認するため、単離ＶＲ−５９４をＡＴＣＣより入手して継代した後、個々に配列決定した（配列番号１０）。ＡＣ＿００００１１．１配列を野生型ＣｈＡｄＶ６８ウイルスのＡＴＣＣ ＶＲ−５９４配列（配列番号１０）と比較したところ、６個のヌクレオチドの相違が特定された。１つの例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ 配列番号１）。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７〜３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１１）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；配列番号１２）を、欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７〜３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，１２５〜３１，８２５）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１３）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー；配列番号２）を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
関連するベクターを下記に示す。
− 完全長ＣｈＡｄＶＣ６８配列「ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ」（配列番号１）；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換したＡＣ＿００００１１．１配列
− ＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ Ｃ６８ （配列番号１０）；独立してシークエンシングしたもの；完全長Ｃ６８
− ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ （配列番号１１）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１（ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；ＧＦＰレポーターは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
− ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー （配列番号１２）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１ （ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，８１６〜３１，３３２）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換；モデル新生抗原カセットは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
− ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ （配列番号１３）；ＡＣ＿００００１１．１のＥ１（ｎｔ ５７７〜３４０３）及びＥ３ （ｎｔ ２７，１２５〜３１，８２５）配列を欠失させたもの；対応するＡＴＣＣ ＶＲ−５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換；ＧＦＰレポーターは、欠失させたＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にある
ＸＶ．Ｂ．ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの試験
ＸＶ．Ｂ．１．ＣｈＡｄベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞のトランスフェクション
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
１０ｕｇのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化してウイルスゲノムを遊離させた。次いでＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を製造者の指示にしたがって使用してＤＮＡを長いＤＮＡフラグメントについて精製し、２０ｕｌの予め加熱した水中に溶出した。溶出工程の前にカラムを３７℃で０．５〜１時間放置した。
トランスフェクションの１４〜１８時間前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を１０６細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに導入した。各ウェルごとに細胞に新鮮な培地（ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミン酸を含む１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ｈｉＦＢＳ）を被せた。トランスフェクションでは、各ウェル当たり１〜２ｕｇの精製したＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがってｕｌ体積の２倍（２〜４ｕｌ）のリポフェクタミン２０００とともに用いた。トランスフェクションミックスを含む０．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を、各ウェル内で１ｍｌの通常の培地に加え、細胞上で一晩放置した。
トランスフェクトした細胞培養物を３７℃で少なくとも５〜７日間インキュベートした。ウイルスプラークがトランスフェクションの７日後に視認されなかった場合、細胞を１：４または１：６に分割し、３７℃でインキュベートしてプラーク生成について監視した。あるいは、トランスフェクトした細胞を収穫し、３サイクルの凍結と解凍に供し、細胞ライセートを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させ、ウイルスプラークが観察されるまで細胞をインキュベートしてもよい。
リン酸カルシウムを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞へのＣｈＡｄＶ６８ベクターのトランスフェクション及び三次ウイルスストックの生成
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの１日前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を５％ＢＳ／ＤＭＥＭ／１ＸＰ／Ｓ，１×Ｇｌｕｔａｍａｘ中で、６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で播種した。トランスフェクション当たり２個のウェルが必要とされる。トランスフェクションの２〜４時間前に培地を新鮮な培地に交換した。ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰプラスミドをＰａｃＩで直鎖状とした。次いで、直鎖状とされたＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出し、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、及び２体積の１００％エタノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１２，０００×ｇで５分間遠心することによってペレット化した後、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを風乾し、５０μＬの滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用してＤＮＡ濃度を決定し、体積を５μｇのＤＮＡ／５０μＬに調整した。
１６９μＬの滅菌水をマイクロチューブに加えた。次いで５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２をこの水に加え、ピペッティングして静かに混合した。５０μＬのＤＮＡをＣａＣｌ２溶液に滴下した。次いで２６μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加えてμピペッターで２回ピペッティングして静かに混合した。この最終溶液は、２５０μＬの０．２５Ｍ ＣａＣｌ２中の５μｇのＤＮＡからなるはずである。次いで２５０μＬの２×ＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）の入った第２のチューブを用意した。ピペットエイドに取り付けた２ｍＬ滅菌ピペットを使用して２×ＨＢＳ溶液に空気を徐々にバブリングした。同時に、０．２５Ｍ ＣａＣｌ２溶液中のＤＮＡ溶液を滴下した。最後のＤＮＡの液滴の滴下後、約５秒間、バブリングを継続した。次いで溶液を室温で最大２０分間インキュベートした後、２９３Ａ細胞に加えた。６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で１日前に播種した２９３Ａ細胞の単層に２５０μｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム溶液を滴下した。細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートした。２４時間後に培地を交換した。７２時間後に細胞を６ウェルプレート内に１：６に分割した。単層を細胞変性効果（ＣＰＥ）の証拠について光学顕微鏡によって毎日監視した。トランスフェクションの７〜１０日後にウイルスプラークを観察し、ウェル内の培地をピペッティングして細胞を浮かせることにより単層を収穫した。収穫した細胞及び培地を５０ｍＬの遠心チューブに移した後、凍結解凍を３ラウンド行った（−８０℃及び３７℃）。その後得られた、一次ウイルスストックと呼ばれるライセートを、ベンチトップ遠心分離器上で最大速度（４３００×ｇ）で遠心することにより清澄化させ、ライセートの一定の割合（１０〜５０％）を使用してＴ２５フラスコ中で２９３Ａ細胞に感染させた。感染細胞を４８時間インキュベートした後、細胞及び培地を完全なＣＰＥで収穫した。細胞を再び収穫し、凍結解凍して清澄化した後、この二次ウイルスストックを使用して、フラスコ当たり１．５×１０７細胞で播種されたＴ１５０フラスコに感染させた。７２時間後に完全ＣＰＥが得られた時点で細胞を収穫し、上記のウイルスストックと同様に処理して三次ストックを生成した。
２９３Ｆ細胞内での生成
８％ＣＯ２のインキュベーター内の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞内でＣｈＡｄＶ６８ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率９８％で１ｍＬ当たり１０６細胞に希釈し、１ＬのＳｈａｋｅフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中、１回の生成操作当たり４００ｍＬを使用した。１回の感染当たり目標ＭＯＩが３．３よりも高い４ｍＬの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が７０％を下回るまで４８〜７２時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再び遠心してから２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を３回行って溶解し、４，３００×ｇで５分間遠心して清澄化した。
ＣｓＣｌ遠心分離による精製
ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ遠心分離により精製した。２つの不連続な勾配の操作を行った。第１の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第２の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
１０ｍＬの１．２（２６．８ｇのＣｓＣｌを９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）ＣｓＣｌをポリアロマー製チューブに加えた。次いで、８ｍＬの１．４ＣｓＣｌ（５３ｇのＣｓＣｌを８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）をピペットを用いてチューブの底に届けるように慎重に加えた。清澄化したウイルスをこの１．２の層の上に層をなすように慎重に加えた。必要な場合、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えてチューブのバランスを取った。次いでチューブをＳＷ−３２Ｔｉローターに入れて、１０℃で２時間３０分遠心した。次いでチューブを層流キャビネットに取り出して、１８ゲージの針と１０ｍＬの注射器を使用してウイルスバンドを引き抜いた。夾雑した宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質を除去しないように注意を払った。次いでバンドを少なくとも２回１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で希釈し、上記に述べた不連続勾配で上記と同様に層をなすように加えた。今回は操作を一晩行った以外は上記と同様にして遠心操作を行った。翌日、機能不全の粒子バンドを引き抜かないように注意しながらバンドを引き抜いた。次いでカセット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用してＡＲＭバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）ｐＨ８．０，２５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５％グリセロール）に対してウイルスを透析した。これをバッファーを１回交換するごとに３回、１時間行った。次いでウイルスを一定分量に分けて−８０℃で保存した。
ウイルスアッセイ
１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数はＯＤ２６０ｎｍの吸光度の値＝１に相当することに基づき、ＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮を行った。アデノウイルスの２つの希釈度（１：５と１：１０）をウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で作った。両方の希釈度でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈係数×１．１×１０１２ＶＰを掛けることによりＶＰ濃度／ｍＬを測定した。
感染単位（ＩＵ）力価を、ウイルスストックの限界希釈アッセイによって計算した。ウイルスを最初にＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳ中で１００倍に希釈した後、１０倍希釈率を用いて１×１０−７にまで希釈した。次いで１００μＬのこれらの希釈液を、２４ウェルプレートのウェル当たり３ｅ５細胞で少なくとも１時間前に播種した２９３Ａ細胞に加えた。これを２重に行った。プレートを４８時間、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター内でインキュベートした。次いで細胞を、１×ＰＢＳで洗浄した後、１００％の冷却メタノール（−２０℃）で固定した。次いでプレートは最小で２０分間にわたって−２０℃でインキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で１時間、室温でブロッキングした。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファー（ウェル当たり０．２５ｍＬ）中に１：８，０００の希釈率で加え、室温で１時間インキュベートした。各ウェルをウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄した。１０００倍に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）を各ウェルに加え、最終回の洗浄の１時間前にインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を５回行い、０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中、ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）基質を使用して現像した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６７ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ）。各ウェルをカウントの５分前に現像した。視野当たり４〜４０個の染色された細胞を与えるような希釈率を用いて１０倍の対物レンズ下で細胞をカウントした。使用した視野は０．３２ｍｍ２の格子とし、２４ウェルプレート上の視野当たり６２５個に相当した。１ｍＬ当たりの感染性ウイルスの数は、格子１個当たりの染色細胞の数×視野当たりの格子の数×希釈係数１０によって求めることができる。同様に、ＧＦＰ発現細胞を扱う場合には、カプシド染色の代わりに蛍光を用いて１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現ビリオンの数を決定することができる。
免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌性マウス及びＢａｌｂ／ｃ系の雌性マウスに、１００ｕＬ体積中１×１０８個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性の筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶ．Ｂ．２．ＤＮＡトランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図７）及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図８）のＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製（ウイルスプラーク）をトランスフェクションの７〜１０日後に観察した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルスプラークを光学（図７Ａ及び８Ａ）及び蛍光顕微鏡法（図７Ｂ〜Ｃ、及び図８Ｂ〜Ｃ）を使用して可視化した。ＧＦＰは、増殖性ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成を示す。
ＸＶ．Ｂ．３．ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の増殖
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルスをＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの１８日後に生成した（図９）。精製ＣｈＡｄＶ６８ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びＣｈＡｄＶＹ２５（近縁のＣｈＡｄＶ；Ｄｉｃｋｓ，２０１２，ＰｌｏＳ ＯＮＥ７，ｅ４０３８５）ウイルスストックと比較した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルス力価は、Ａｄ５及びＣｈＡｄＶＹ２５と同等であった（表７）。
（表７）２９３Ｆ懸濁細胞内でのアデノウイルスベクターの生成
Figure 2021525076
＊ＳＤは、複数回の生成工程が行われた場合にのみ報告している。
ＸＶ．Ｂ．４．腫瘍モデルにおける免疫原性の評価
マウス腫瘍抗原を発現するＣ６８ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、Ｃ６８ベクターがＴ細胞応答を誘発することを実証する。ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）に対するＴ細胞応答Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１−Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：５２９−５３８）に対するＴ細胞応答をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。図１５に示されるように、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるマウスの免疫後にコントロールに対して強いＴ細胞応答が測定された。脾細胞１０６個当たり、８９５７個及び４０１９個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均の細胞性免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系またはＢａｌｂ／ｃ系マウスをそれぞれＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫した場合に免疫の１０日後に観察された。
腫瘍浸潤リンパ球についても、ＣｈＡｄＶ及び抗ＣＴＬＡ４抗体の共投与を評価するＣＴ２６腫瘍モデルにおいて評価した。マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、移植７日後にＣｈＡｄＶワクチンで免疫し、抗ＣＴＬＡ４抗体（クローン９Ｄ９）またはコントロールとしてＩｇＧで処置した。免疫１２日後に腫瘍浸潤リンパ球を分析した。各マウスからの腫瘍をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びマウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解離させた。解離した細胞を３０ミクロンのフィルターに通して濾過し、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。抗原特異的細胞をＭＨＣ−テトラマー複合体によって同定し、抗ＣＤ８及び生細胞マーカーで共染色した。プライム免疫の１２日後に腫瘍を回収した。
腫瘍内の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ、ＣｈＡｄＶ、抗ＣＴＬＡ４、及びＣｈＡｄＶ＋抗ＣＴＬＡ４処置群において、全生細胞集団の中央値で３．３％、２．２％、または８．１％を構成していた（図４１及び表４５）。活性ＣｈＡｄＶ免疫と組み合わせた抗ＣＴＬＡによる処置により、ＣｈＡｄＶ単独及び抗ＣＴＬＡ４単独のいずれよりも抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が統計的に有意に増大し、抗ＣＴＬＡ４はｃｈＡｄ６８ワクチンと共投与される場合に腫瘍内の浸潤Ｔ細胞の数を増大させることが示された。
（表４５）ＣＴ２６腫瘍中のテトラマー＋浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の頻度
Figure 2021525076
ＸＶＩ．アルファウイルス抗原送達ベクター
ＸＶＩ．Ａ．アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
ＲＮＡを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドＤＮＡをＰｍｅＩによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し（ＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ社）、テンプレートとして使用した。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をｍ７Ｇキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造者の指示にしがって使用してｍＲＮＡを精製した。
インビボ実験を行うには、ＴｒｉＬＩｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって生成され、精製されたＲＮＡをＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｐ１でキャップした。
ＲＮＡのトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、９６ウェルのウェル当たり６ｅ４細胞で、２４ウェルのウェル当たり２ｅ５細胞で、トランスフェクションの約１６時間前に播種した。細胞にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用してｍＲＮＡをトランスフェクションした。９６ウェルでは、ウェル当たり０．１５ｕＬのリポフェクタミン及び１０ ｎｇ のｍＲＮＡを使用し、２４ウェルでは、ウェル当たり０．７５ｕＬのリポフェクタミン及び１５０ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ＧＦＰを発現するｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をトランスフェクションのコントロールとして使用した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の９６ウェルプレートで、ＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して測定した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの２時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったｍＲＮＡをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でＲＬＴ ｐｌｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してホモジナイズし、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して全ＲＮＡを定量した。製造者のプロトコールにしたがってｑＴｏｗｅｒ３ （Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、反応当たり２０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ＡｃｔｉｎまたはＧｕｓＢを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー／プローブはＩＤＴ社により生成されたものである（表８）。
（表８）ｑＰＣＲプライマー／プローブ
Figure 2021525076
Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの左下脇腹に１０５個のＢ１６−ＯＶＡ細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、３日間にわたって増殖させた。
ＣＴ２６腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中１０ｕｇのＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ａｄ５ワクチンについては、マウスに、１００ｕＬ体積中５×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｄ９，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ−１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
インビボ生物発光イメージング
各時点においてマウスに腹腔内注射により１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を注射し、注射の１０〜１５分後にＩＶＩＳインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して生物発光を測定した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶＩ．Ｂ．アルファウイルスベクター
ＸＶＩ．Ｂ．１．アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、抗原発現システム用のＲＮＡアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ：Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００−４１３）ベースの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターから生成した。１つの例では、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ（ＶＥＥ配列の７５４４〜１１，１７５を欠失させた。番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。配列番号６）、抗原配列（配列番号１４及び配列番号４）またはルシフェラーゼレポーター（例えばＶＥＥ−ルシフェラーゼ、配列番号１５）に置き換えた（図１０）。ＲＮＡをインビトロでｓｒＲＮＡ ＤＮＡベクターから転写させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする（非複製）ｍＲＮＡを比較のためにトランスフェクトした。ＶＥＥ−ルシフェラーゼのｓｒＲＮＡでは、２時間の測定値を２３時間の測定値と比較した場合にｓｒＲＮＡレポーターシグナルの約３０，０００倍の増大が観察された（表９）。これに対して、同じ時間でのｍＲＮＡレポーターのシグナルの増大は１０倍未満であった（表９）。
（表９）ＶＥＥ自己複製ベクターからのルシフェラーゼの発現は経時的に増大する
９６ウェル中、ウェル当たり１０ｎｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡまたは１０ｎｇの非複製ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｌ−６３０７）をＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位（ＲＬＵ）として報告する。各データポイントは、３つのトランスフェクトしたウェルの平均±ＳＤである。
Figure 2021525076
別の例では、ｓｒＲＮＡの複製を、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ルシフェラーゼをコードしたｓｒＲＮＡ（ＶＥＥ−ルシフェラーゼ）または複数のエピトープカセット（ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー）をコードしたｓｒＲＮＡのいずれかのトランスフェクション後のＲＮＡレベルを測定することにより確認した。ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでは約１５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１０）のに対して、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡでは３０〜５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１１）。これらのデータは、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターが細胞にトランスフェクトされると複製されることを示すものである。
（表１０）ＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３Ａ細胞にＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。
Figure 2021525076
（表１１）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定
ＨＥＫ２９３細胞にＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はＧｕｓＢ参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する倍率変化を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもｓｒＲＮＡのエピトープカセット領域を検出する２つの異なるｑＰＣＲプライマー／プローブのセットを表す。
Figure 2021525076
ＸＶＩ．Ｂ．２．アルファウイルスベクターのインビボ評価
別の例において、ＶＥＥ−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された１０ｕｇのＶＥＥ−ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを注射し、注射の２４及び４８時間後、ならびに７及び１４日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の２４時間後に検出され、時間とともに増大し、ｓｒＲＮＡ注射の７日後にピークとなった（図１１）。
ＸＶＩ．Ｂ．３．アルファウイルスベクター腫瘍モデルの評価
１つの実現形態において、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、２つの異なるＭＨＣクラスＩマウス腫瘍エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２）及びＡＨ１−Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９−５３８）を発現するＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターを作製した（ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ，配列番号１４）。ＳＦＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９３６２））エピトープは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞株によって発現され、ＡＨ１−Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号２９３６３）；Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）エピトープは、ＣＴ２６結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするＴ細胞を誘導する（ＡＨ１／ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２９３９１）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：９７３０−９７３５）。１つの例では、インビボ実験において、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ が、Ｔ７ポリメラーゼ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された。
ＳＦＬを標的とした、コントロールに対して強い抗原特異的Ｔ細胞応答が、ＭＣ３で製剤化したＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによる、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化の２週間後に観察された。１つの例では、脾細胞１０６個当たり中央値で３８３５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＳＦＬペプチドによる刺激後に測定され（図１２Ａ、表１２）、ペンタマー染色により測定した場合に、ＣＤ８ Ｔ細胞の１．８％（中央値）がＳＦＬ抗原特異的であった（図１２Ｂ、表１２）。別の例では、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＶＥＥ ｓｒＲＮＡワクチンとの同時投与によって、全体のＴ細胞応答の中度の増大が認められ、脾細胞１０６個当たり中央値で４７９４．５個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１２Ａ、表１２）。
（表１２）Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにおけるＶＥＥ ｓｒＲＮＡ免疫化の１４日後のＥＬＩＳＰＯＴ及びＭＨＣＩペンタマー染色アッセイの結果
Figure 2021525076
*Ｖａｘグループのマウス＃６からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
別の実現形態では、臨床アプローチを反映するため、Ｂ１６−ＯＶＡ及びＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて異種プライム／ブーストを行い、腫瘍を有するマウスを、同じ抗原カセット（Ａｄ５−ＵｂＡＡＹ）を発現するアデノウイルスベクターで最初に免疫した後、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹプライムの１４日後にＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡワクチンでブースト免疫を行った。１つの例では、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹワクチンによって抗原特異的免疫応答が誘導され、脾細胞１０６個当たり７３３０個（中央値）のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ａ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の２．９％（中央値）がＳＦＬ抗原を標的化していた（図１３Ｃ、表１３）。別の例では、Ｔ細胞応答は、Ｂ１６−ＯＶＡモデルにおいてＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブーストの２週間後に維持され、脾細胞１０６個当たり３９６０個（中央値）のＳＦＬ特異的ＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ｂ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の３．１％（中央値）がＳＦＬを標的化していた（図１３Ｄ、表１３）。
（表１３）Ａｄ５ワクチンプライム及びｓｒＲＮＡブーストによる異種プライム／ブースト後のＢ１６−ＯＶＡマウスの免疫モニタリング
Figure 2021525076
別の実現形態では、同様の結果が、ＣＴ２６マウスモデルにおけるＡｄ５−ＵｂＡＡＹによるプライム及びＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後に観察された。１つの例では、Ａｄ５−ＵｂＡＡＹによるプライム後（１４日目）にＡＨ１抗原特異的応答が観察され、脾細胞１０６個当たり平均で５１８７個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１４Ａ、表１４）、ＶＥＥ−ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後（２８日目）には脾細胞１０６個当たり３７９９個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１４Ｂ、表１４）。
（表１４）ＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおける異種プライム／ブースト後の免疫モニタリング
Figure 2021525076
ＸＶＩＩ．ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、マウスＣＴ２６腫瘍モデルで評価した。
ＸＶＩＩ．Ａ ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の方法及び材料
腫瘍の注入
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アーム（各群当たりマウス２８〜４０匹）をランダムカセット配列し、処置を開始した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個／動物のＣＴ２６細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。各実験アームは表１５に詳細に記載したとおりである。
（表１５）ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の実験アーム
Figure 2021525076
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中１０ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。Ｃ６８ワクチンについては、マウスに、１００ｕＬ体積中１×１０１１個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーウイルス粒子（ＶＰ）を、両側性に筋肉内注射（各脚５０ｕＬ）により注射した。各動物に、抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ−１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）を、用量２５０ｕｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ＸＶＩＩ．Ｂ ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの評価
ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの異種プライム／ブースト、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡの同種プライム／ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表１５に詳細に、また表１６により一般的に記載したとおりである。
（表１６）プライム／ブースト実験アーム
Figure 2021525076
脾臓をプライムワクチン接種の１４日後に収穫して免疫モニタリングを行った。腫瘍及び体重測定値を週２回測定し、生存率を監視した。すべての活性ワクチン群でコントロールに対する強い免疫応答が観察された。
それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ−１／グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ−１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、最初の免疫の１４日後に、脾細胞１０６個当たり、中央値で１０，６３０個、１２，９７６個、３３１９個、または３７４５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の細胞性免疫応答が観察された（図１６及び表１７）。これに対して、ワクチンコントロール（グループ１）または抗ＰＤ−１をともなうワクチンコントロール（グループ２）は、それぞれ、脾細胞１０６個当たり中央値で２９６個または２８５個のＳＦＣの細胞性免疫応答を示した。
（表１７）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答
Figure 2021525076
ＥＬＩＳｐｏｔのデータと一致して、それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ−１／グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ−１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析において、最初の免疫の１４日後にＣＤ８ Ｔ細胞の５．６、７．８、１．８、または１．９％（中央値）が抗原特異的応答を示した（図１７及び表１８）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ−１との組み合わせで免疫したマウスは、それぞれ、０．２及び０．１％の抗原特異的ＣＤ８応答を示した。
（表１８）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答
Figure 2021525076
ＣＴ２６結腸腫瘍モデルのすべてのグループで腫瘍増殖が測定され、腫瘍増殖は処置開始の２１日後（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射の２８日後）までみられる。大きな腫瘍サイズ（＞２５００ｍｍ３）に基づいて処置開始の２１日後にマウスを屠殺したため、分析のバイアスを避けるために最初の２１日間のみを示している。２１日目における平均腫瘍体積は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ−１（グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト＋抗ＰＤ−１（グループ６）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ７）、及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ−１（グループ８）でそれぞれ、１１２９、８４８、２１４２、１４１８、２１９８及び１６０６ ｍｍ３であった（図１８及び表１９）。ワクチンコントロール、またはワクチンコントロールと抗ＰＤ−１との組み合わせにおける平均腫瘍体積は、それぞれ、２３６１または２０６７ｍｍ３であった。これらのデータに基づけば、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（グループ４）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー＋抗ＰＤ−１（グループ６）、及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ−１（グループ８）は、コントロール（グループ１）と有意に異なる腫瘍増殖の低下を２１日目にもたらした。
（表１９）ＣＴ２６モデルで測定された２１日目の腫瘍サイズ
Figure 2021525076
ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて処置開始後３５日間（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射後４２日間）にわたって生存率を監視した。改善された生存率が、試験した組み合わせのうちの４つでマウスをワクチン接種した後に観察された。ワクチン接種後、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ４；コントロールグループ１に対してＰ＜０．０００１）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ８；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００６）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブースト（グループ３；コントロールグループ１に対してＰ＝０．０００３）、及び、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブーストと抗ＰＤ−１との組み合わせ（グループ６；コントロールグループ１に対してＰ＝０．００１６）を用いたマウスの、それぞれ、６４％，４６％，４１％及び３６％が生存した（図１９及び表２０）。生存率は、残りの処置群［ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーブースト（グループ５）、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ（グループ７）、及び抗ＰＤ−１単独（グループ２）］ではコントロールグループ１（≦１４％）と有意差は認められなかった。
（表２０）ＣＴ２６モデルにおける生存率
Figure 2021525076
結論として、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡは、コントロールに対して、各ワクチンによりコードされたマウス腫瘍抗原に対する強いＴ細胞応答を誘発した。腫瘍を有するマウスへの、抗ＰＤ−１の同時投与をともなう、もしくはともなわないＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マープライム及びＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡブーストの投与、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡプライム及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーと抗ＰＤ−１との組み合わせの投与、または、同種プライムブースト免疫としてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡと抗ＰＤ−１との組み合わせの投与は、高い生存率につながった。
ＸＶＩＩＩ．非ヒト霊長類実験
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で評価した。
材料及び方法
プライミングワクチンを各ＮＨＰで筋肉内（ＩＭ）注射して実験を開始した（ワクチンプライム）。１回以上のブースターワクチン（ワクチンブースト）も各ＮＨＰに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
免疫化
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＬＮＰ−１またはＬＮＰ−２中で製剤化した１×１０１２個のウイルス粒子（注射１回当たり５×１０１１個のウイルス粒子）のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー、３０ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、１００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡ、または３００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーｓｒＲＮＡで両側性に免疫した。３０ｕｇ、１００ｕｇまたは３００ｕｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
免疫モニタリング
ＰＢＭＣを、プライムワクチン接種後の示した時間にＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）及びＬｅｕｃｏＳｅｐ分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）を使用して単離し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリー法を用いてＴ細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（エクスビボ酵素結合免疫スポット）分析を用いてＩＦＮ−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。サルＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン｛ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８｝にしたがってＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。２００，０００個のＰＢＭＣを、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０ｕＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％−コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に丸めた。
ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープに対する特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを用いてＩＦＮ−γなどの細胞内サイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。いずれの方法の結果も、サイトカインが、エピトープに対して抗原特異的な形で誘導したことを示している。
アカゲザルにおける免疫原性
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３０μｇ及び１００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、（ｂ）ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕ−Ａ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各群６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡベクターのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
（表２１）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2021525076
免疫化の前及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った。
結果
６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後に測定した。表２１に示すように、各動物に、４及び８週目に、ＬＮＰ１またはＬＮＰ２のいずれかと製剤化した用量３０μｇまたは１００μｇのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによるブースト免疫を行った。６種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした（図２０Ａ〜Ｄ及び表２２〜２５）。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７０、１４、１５、１１、７、８、１４、１７、１２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ａ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１０８、−３、１４、１、３７、４、１０５、１７、２５ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｂ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり−１７、３８、１４、−２、８７、２１、１０４、１２９、８９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｃ）。負の値は、各エピトープ／動物のプレブリード値に対して正規化した結果である。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１２１８、１７８４、１８６６、９７３、１８１３、７４７、７９７、１２４９、及び５４７ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｄ）。免疫応答は、予想されたプロファイルを示し、ピーク免疫応答がプライム免疫化の約２〜３週後に測定され、４週後に免疫応答が退縮した。ＰＢＭＣ１０６個当たり１８１３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の５週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後（５週目）に測定された免疫応答は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによるプライム免疫化（３週目）について測定されたピーク免疫応答と同等であった（図２０Ｄ）。ＰＢＭＣ１０６個当たり１２４９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答がそれぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる最初の免疫化の９週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後（９週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前に測定された免疫応答よりも約２倍高かった（図２０Ｄ）。
（表２２）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３０μｇ）（グループ１）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２３）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（１００μｇ）（グループ２）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２４）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（１００μｇ）（グループ３）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２５）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー プライムについての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験（より高い用量）
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの３００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーとの組み合わせの免疫原性を評価し、（ｂ）用量３００μｇで、ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。さらに、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕＡ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各グループ６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ−Ａ＊０１制限抗原を含むモデル抗原をコードしたＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーまたはＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
グループ１については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（異種のプライム／ブースト）。グループ２及び３については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（同種のプライム／ブースト）。
（表２６）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2021525076
結果
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４週後に測定した（図２１及び表２７）。動物に、４、１２、及び２０週目にＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーによる初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７５０、４２２５、１１００、２５２９、３２１８、１９１５、１７０８、１５６１、５０７７、４５４３、４９２０、５８２０、３３９５、２７２８、１９９６、１４６５、４７３０、２９８４、２８２８、または３０４３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２１）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる２度目のブースト免疫化の１週後（１３週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前（１２週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる３度目のブースト免疫化の１週後（２１週目）に測定された免疫応答は、２度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前（２０週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。
Ｍａｍｕ−Ａ＊０１インドアカゲザルを、さらに、２種類の異なるＬＮＰ製剤（ＬＮＰ１及びＬＮＰ２）を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後に測定した（図２２及び２３、表２８及び２９）。動物に、４及び１２週目にＬＮＰ１またはＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。複合的な抗原特異的免疫応答が、ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１６８、２０４、１０３、１２６、１４０、１４５、３３０、２０３、及び１６２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２２）。ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１８９、１８５、３４９、４３７、４９２、５７０、２３３、８８６、３６９、及び３８１ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２３）。
（表２７）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー（グループ１）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２８）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ２（３００μｇ）（グループ２）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
（表２９）ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マー ｓｒＲＮＡ−ＬＮＰ１（３００μｇ）（グループ３）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2021525076
ｓｒＲＮＡの用量範囲実験
本発明の一実現形態では、ｓｒＲＮＡの用量範囲実験を、ｍａｍｕＡ０１インドアカゲザルで実施することによって、どのｓｒＲＮＡ用量をＮＨＰ免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。１つの例では、ＭａｍｕＡ０１インドアカゲザルに、複数のｍａｍｕＡ０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたｓｒＲＮＡベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで１つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、２週間ごとにＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する（表３０）。
（表３０）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験
Figure 2021525076
＊ｓｒＲＮＡの用量範囲は３００μｇ以下の高用量で決定される。
インドアカゲザルにおける免疫原性の実験
抗原ベクターを用いて免疫原性を実証するため、ｍａｍｕＡ０１のインドアカゲザル（ＮＨＰ）でワクチン実験を行った。図３４は、ワクチン接種の手法を示す。ＮＨＰの３つのグループを、チェックポイント阻害剤として抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブ（グループ５及び６）とともに、またはチェックポイント阻害剤なし（グループ４）で、ＣｈＡｄＶ６８．５−ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで免疫した。抗体は、静脈内（グループ５）または皮下（グループ６）投与した。三角は、０週目及び３２週目におけるｃｈＡｄ６８によるワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０、４、１２、２０、２８、及び３２週目におけるアルファウイルスワクチン接種を示す。
免疫したＮＨＰにおけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間的経過を、ｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫単独（図３５及び表３１Ａ）、ｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫とチェックポイント阻害剤の静脈内（ＩＶ）投与（図３６及び表３１Ｂ）、及びｃｈＡｄ−ＭＡＧによる免疫とチェックポイント阻害剤の皮下（ＳＣ）投与（図３７及び表３１Ｃ）について示す。これらの結果は、ｃｈＡｄ６８ベクターが霊長類においてＣＤ８＋応答を効率的にプライミングし、アルファウイルスベクターがｃｈＡｄ６８ワクチンのプライミング応答を効率的にブーストし、チェックポイント阻害剤は静脈内または皮下投与のいずれでもプライミング及びブースト応答の両方を増幅し、ワクチン接種後のｃｈＡｄベクターの再投与が免疫応答を効果的にブーストしたことを示している。
（表３１Ａ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧを投与したアカゲザル（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
（表３１Ｂ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＩＶ投与による抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
（表３１Ｃ）ｃｈＡｄ−ＭＡＧ及びＳＣ投与により抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）を投与したアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答
平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／−標準誤差を示す。
Figure 2021525076
インドアカゲザルにおけるメモリー表現型の判定
アカゲザルを、抗ＣＴＬＡ４と、または抗ＣＴＬＡ４なしで、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マー／ＶＥＥ−ＭＡＧ２５マーのｓｒＲＮＡ異種プライミング／ブーストレジメンで免疫してから、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５マーで再びブーストした。各グループを、最後のｃｈＡｄＶ６８の投与の１１ヶ月後（実験１８ヶ月目）に、記載されるようにＥＬＩＳｐｏｔを行って評価した。図３８及び表４３は、免疫前（左パネル）及び１８ヶ月後（右パネル）にＥＬＩＳｐｏｔにより測定した６種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープに対する細胞応答を示す。制限エピトープに対する応答の検出は、ｃｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって抗原特異的メモリー応答が生じたことを示す。
メモリーを評価するため、ワクチンにコードされた４種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ−Ａ＊０１クラスＩエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を、各抗原が固有のダブルポジティブの組み合わせによって示されることで、単一の試料中の４つの抗原特異的集団のすべてを特定することができる、２色Ｍａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー標識を用いて観測した。メモリー細胞の表現型判定を、細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７で共染色することにより行った。図３９及び表４４は、４種類の異なるＭａｍｕ−Ａ＊０１制限エピトープを認識するメモリーＴ細胞についてコンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色の結果を示す。Ｔ細胞表現型をフローサイトメトリーによっても評価した。図４０は、実験１８ヶ月目における４種類のＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の総和中のメモリー細胞タイプの分布を示す。メモリー細胞は以下のようにキャラクタライズした。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。まとめると、これらの結果は、最後のブーストの少なくとも１年後にメモリー応答が検出されたことを示し、エフェクター、セントラルメモリー、及びエフェクターメモリーを含む、長期的に持続する免疫を示すものである。
（表４３）プライミング前及びメモリー評価の時点（１８ヶ月）における各動物のＰＢＭＣ１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）
Figure 2021525076
ND=技術的排除により測定されず。
（表４４）生ＣＤ８＋細胞に占めるＭａｍｕ−Ａ＊０１テトラマー陽性の割合（％）
Figure 2021525076
ＸＩＸ．ＭＨＣ／ペプチド標的反応性Ｔ細胞及びＴＣＲの同定
標的応答性Ｔ細胞及びＴＣＲを、表Ａ、ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果、及び／または表１．２に記載される抗原／ＨＬＡペプチド（配列番号５７〜２９３５７、及び下記を参照）のペアのうちの１つ以上について同定する。
Ｔ細胞は、患者の血液、リンパ節、または腫瘍から単離することができる。Ｔ細胞は、例えば、抗原−ＭＨＣテトラマー結合細胞を分取することにより、またはＴ細胞と抗原でパルスした抗原提示細胞とのインビトロ共培養物中で刺激した活性化された細胞を分取することにより、抗原特異的Ｔ細胞について濃縮することができる。抗原ロードテトラマー及び他のＭＨＣベースの試薬をはじめとする、抗原特異的Ｔ細胞の同定のためのさまざまな試薬が当該技術分野で知られている。
抗原関連αβ（またはγδ）ＴＣＲダイマーを、抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲのシングルセルシークエンシングによって同定することができる。また、抗原特異的Ｔ細胞のバルクＴＣＲシークエンシングを行ってもよく、マッチングの確率が高いαβのペアを当該技術分野では周知のＴＣＲペアリング法を用いて決定することができる。
代わりにまたはこれに加えて、健康なドナーから得たナイーブＴ細胞のインビトロプライミングによって抗原特異的Ｔ細胞を得ることもできる。ＰＢＭＣ、リンパ節、または臍帯血から得られたＴ細胞を抗原でパルスした抗原提示細胞によって繰り返し刺激することにより、抗原経験Ｔ細胞の分化を開始させることができる。この後、ＴＣＲを患者からの抗原特異的Ｔ細胞について上記に述べたのと同様にして同定することができる。
ＸＸ．共有抗原の同定
本発明者らは、一連の工程を用いて共有新生抗原を同定した。本発明者らは、ＣＯＳＭＩＣデータベースより、「ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ」として分類される共通のドライバー変異のリストを取得した。各変異について、本発明者らは、モデル化したすべてのＨＬＡアレルについて候補新生抗原（８〜１１マーのペプチド）を生成し、ＴＰＭ＝１００を用い、本発明者らのＥＤＧＥ予測モデル（いずれもあらゆる目的でそれらの全容を本明細書に援用するところの国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に記載される、ＭＳ／ＭＳによりシークエンシングしたＨＬＡ提示ペプチドで訓練したディープラーニングモデル）を使った。各ペプチドは、少なくとも１つの変異アミノ酸を含み、自己ペプチドではなかった点に留意されたい。次に、本発明者らは、ＥＤＧＥスコア＞０．００１を有するＨＬＡアレルを有するすべてのペプチドを記録した。結果を表Ａに示す。これにより、合計で１０２６１個の新生抗原配列が同定され、これらを配列番号１０７５５〜２１０１５として記載する。各配列について対応するＨＬＡアレル（複数可）を示す。
表Ａに示される初期のリストを、患者集団内の新生抗原／ＨＬＡ出現率のレベルについてさらに分析した。「抗原／ＨＬＡ出現率」は、特定の集団内の抗原の頻度（Ａ）にその特定の集団内のＨＬＡアレルの頻度（Ｂ）を掛けた値として計算される。抗原／ＨＬＡ出現率は、変異／ＨＬＡ出現率または新生抗原／ＨＬＡ出現率のことも指す場合がある。この分析の一環として、各変異について、その（Ａ）頻度をＴＣＧＡにおける共通の腫瘍タイプにわたって得て、腫瘍タイプ間でその最も高い頻度で記録した。（Ｂ）ＥＤＧＥ内の各ＨＬＡアレルについて、ＨＬＡアレル頻度ＴＣＧＡ（主に白人の集団）を記録した。ＨＬＡアレル頻度については、あらゆる目的で本明細書に援用するところのＳｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１１５２−１１５８ ２０１５）に詳細に記載されている。新生抗原／ＨＬＡ出現率は、（Ａ）に（Ｂ）を掛けた値として計算した。この方法を用いて出現率が０．１％よりも大きい表Ａ内のすべての新生エピトープ／ＨＬＡのペアを「最も普通１」（２３８７／１０２６１）として同定した。
さらに、本発明者らは、潜在的な臨床試験に関連した進行がん患者の集団を代表する患者試料の大きなコホートにまたがったがんドライバー変異の出現率を特性評価した。ダナ・ファーバー、ジョンズ・ホプキンズ、ＭＤアンダーソン、ＭＳＫＣＣ、バンダービルトを含む、主要な学術的がん研究機関より得た５０〜５００遺伝子の範囲のＮＧＳがん遺伝子パネルでシークエンシングした４万人の患者を有する、一般に開放されているＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅ ｖ４．１データセットを用いてＥＤＧＥ予測を行った。本発明者らは、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌における塩基置換ならびにｉｎｄｅｌ変異を選択し、複数の遺伝子パネルにまたがったカバレッジを要した。本発明者らは、本発明者らのＥＤＧＥ抗原提示予測モデルでカバーされる９０種を超えるＣｌａｓｓＩ ＨＬＡアレルのそれぞれとペアをなす各新生抗原ペプチドを分析し、ＨＬＡ提示スコアのＥＤＧＥ確率が０．００１よりも大きいエピトープ及び対応するＨＬＡアレルを記録した。次いで、本発明者らは、Ａが３つの腫瘍タイプ間で最も高い変異の頻度であり、ＢがＨＬＡアレル頻度であるものとして、Ａ＊Ｂとして計算されるＥＤＧＥスコア＞０．００１であるペプチドの新生抗原／ＨＬＡ出現率を求めた。本発明者らは、ＴＣＧＡ集団からのＨＬＡアレルを調べ、各ＨＬＡアレルの頻度を表にすることにより（Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、米国における集団を代表するＨＬＡアレル頻度を用いた。分析からの新生抗原／ＨＬＡ出現率＞０．０１％を示したペプチド及び対応するＨＬＡアレルを配列番号２１０１６〜２９３５７に記載し、ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果と称する。
ＸＸＩ．共有された新生抗原提示の検証
候補共有新生抗原の質量分析（ＭＳ）による検証を、標的化質量分析法を用いて行った。およそ５００個の凍結、切除した肺腫瘍、大腸直腸腫瘍、及び膵臓腫瘍試料をホモジナイズし、ＨＬＡ／ペプチド複合体のＲＮＡＳｅｑトランスクリプトームシークエンシング及び免疫沈降の両方で使用した。トランスクリプトームの分析により各試料についてペプチド標的リストを生成し、それにより、ＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅ ｖ４．１データセットに定義されるような再発性がんドライバー変異を同定し、ＲＮＡ発現レベルを評価した。次いで、抗原提示のＥＤＧＥモデルを変異配列及び発現データに適用してターゲティングリストのペプチドを優先順位付けした。質量分析に先立ってＨＬＡ分子からのペプチドを溶出し、サイズ排除を用いて回収して提示ペプチドを単離した。同じアミノ酸配列を有する合成重標識ペプチドを各試料とともに共ロードして標的化質量分析を行った。本発明者らは、重標識ペプチドと実験ペプチドの共溶出及び断片化パターンの分析の両方を用いて候補エピトープの検証を行った。質量分析法は、あらゆる目的で本明細書にその全容を援用するところのＧｉｌｌｅｔｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｊａｎ；１０（１）：２８−３４）により詳細に記載されている。さらなる検討を行うのに充分な出現率を有するこの方法により検証されたドライバー変異からの共有新生抗原エピトープを、試料腫瘍タイプ及び関連するＨＬＡアレルとともに下記表３２に要約する。
（表３２）ＭＳで検証された新生抗原エピトープの発現
Figure 2021525076
＊ある患者において複数のＨＬＡアレルによって同じペプチドが提示され、ＭＳ／ＭＳによって検出されると予測された場合、このペプチドは、ＥＤＧＥによるスコアが最も高いＨＬＡアレルによって、またはスコアが充分に近い場合には両方のアレルによって提示されるものと推測された。
本発明者らは、治療するための特定のＨＬＡを有する患者を幅狭くターゲティングする（例えば、ワクチンカセットに含まれる新生抗原を提示する少なくとも１つの検証または予測されたＨＬＡアレルを患者が有することが求められる）ことの価値を評価するため、ペプチドが検出されなかった変異に関してＭＳデータをさらに評価した。
例えば、ＫＲＡＳの場合、本発明者らは、特定のＨＬＡアレルについてＫＲＡＳエピトープペプチドが検出された、または検出されなかった患者試料の数をカウントした。（ある患者において複数のＨＬＡアレルによって同じペプチドが提示され、ＭＳ／ＭＳによって検出されると予測された場合、このペプチドは、ＥＤＧＥによるスコアが最も高いＨＬＡアレルによって、またはスコアが充分に近い場合には両方のアレルによって提示されるものと推測された。）結果を表３３に示す。これらの結果に基づけば、いくつかの共通のＨＬＡアレルは特定のＫＲＡＳ新生抗原を提示すると予想されず、これらのＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペアは、この場合、ワクチンカセットの設計及び患者の選択のための選択基準の目的では除外することができる。例えば、表３４は、ペプチドが試験した１７個の試料で検出されなかったことに基づき、特定のワクチン／カセット（下記、セクションＸＸＩＩを参照）が予測された新生抗原／ＨＬＡペアＧ１２Ｄ／Ａ＊０２：０１を含まず、同様に、ペプチドが試験した９つの試料で検出されたかったことに基づき、Ｇ１２Ｖ／Ａ＊０２：０１を含まなかったことを示している。これに対して、新生抗原／ＨＬＡペアＧ１２Ｄ／Ａ＊１１：０１は、試験した５つの試料のうちの１つで検出されたことに基づいて検証されたとみなされ、Ｇ１２Ｖ／Ａ＊１１：０１はペプチドが試験した６つの試料のうちの２つで検出されたことに基づいて検証されたとみなされた。
これらの結果は、表３４に記載されるものなどの共有新生抗原ワクチンによる治療を行うための患者の選択において適正なＨＬＡ型を選択するための関連した新生抗原／ＨＬＡペアを同定することの重要性を強調するものである。具体的には、いくつかの共通のＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペアはこの場合、選択基準の目的で除外したが、これは、ＭＳデータが、共有された新生抗原ワクチンがその予測されたＫＲＡＳ新生抗原／ＨＬＡペア（例えば、Ｇ１２Ｄ／Ａ＊０２：０１またはＧ１２Ｖ／Ａ＊０２：０１）を有する患者に有益な効果をもたらす可能性が低いことを示唆したことによる。
（表３３）
Figure 2021525076
Figure 2021525076
Figure 2021525076
ＸＸＩＩ．Ａ． ワクチンカセット用の共有新生抗原の選択
２０個の共有新生抗原を含むワクチンカセット（「ＧＯ−００５」）を構築した。表３４は、カセット用に選択された新生抗原の特徴を示す。表３２で上記に記載したように、質量分析によって腫瘍細胞の表面で直接検出された共有新生抗原がカセットに含まれ、エピトープのＨＬＡを変異の適格なＨＬＡリストに加えた。本発明者らのアッセイで提示されるものとして独立して検証されなかった新生抗原は、腫瘍提示の有力な文献の証拠がある場合には検証されたものとみなし、カセットに加えた（例えば、新生抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）。ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２により提示されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄは、この新生抗原を標的としてＣＲＣの患者に腫瘍退縮を引き起こした養子細胞療法の文献の証拠に基づいて検証されたものとみなし、加えた（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６ Ｄｅｃ ８；３７５（２３）：２２５５−２２６２．）。検証されたＨＬＡアレルを有する新生抗原が２０個のスロットの６個を占めた。
さらに、腫瘍細胞によって提示されることが予測されるが、ＭＳによって検証されてはいない、より稀な新生抗原を用いて初期のセットを補完した。標的化質量分析（ＭＳ）検証実験（上記セクションＸＸＩを参照）により本発明者らが観察したＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の強い依存関係を考慮し、高いＥＤＧＥスコアを有する変異は予測される新生抗原として含まれるように優先順位付けした。標的化ＭＳによるＥＤＧＥスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関を示す結果を図２５に示す。具体的には、残りのスロットを、ＥＤＧＥ ＨＬＡ提示スコアが少なくとも０．３であり、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ、及び膵癌にまたがって最も高い累積新生抗原／ＨＬＡ出現率を有する予測新生抗原で埋めた。カセット内の各スロットについて、組み合わされたＨＬＡ頻度が少なくとも５〜１０％であることが求められた（例えば、米国人集団の１１％がＨＬＡアレルＢ１５０１またはＢ１５０３を保有する）。留意すべき点として、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳはコドン１２、１３、及び６１の周囲の同じカセット配列を有するため、高頻度のＮＲＡＳ変異の組み込みにはさらなるスロットを必要としなかった。検証されたＨＬＡ、ＥＤＧＥスコアが少なくとも０．３である予測されるＨＬＡ、予測されるＨＬＡの平均ＥＤＧＥスコア、及び３つのがん集団における新生抗原／ＨＬＡ出現率も表３４に示す。
（表３４）ワクチンカセットＧＯ−００５内の選択された共有新生抗原
Figure 2021525076
Figure 2021525076
さらに、本発明者らは、共有新生抗原ワクチンＧＯ−００５に含まれる少なくとも１つの共有新生抗原を提示するものとして同定された（すなわち、検証されたかまたは予測された）少なくとも１つのＨＬＡアレルを有する患者の全集団を決定し、これを、患者が同定されたアレルを有しているかどうかとは関係なく、変異を有する患者の集団と比較した。ＧＯ−００５が標的とする患者集団を推定するために表３４のＧＯ−００５ワクチンカセットを考慮し、本発明者らはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅから患者の変異データを収集した。これらの患者は一致するＨＬＡアレルを有していないため、本発明者らはＴＣＧＡ集団からＨＬＡアレルをサンプリングし、これをＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅのデータセットとペアに組み合わせた。次いで、腫瘍タイプを考慮し、変異及びＨＬＡの両方で一致するＡＡＣＲからのすべての患者を陽性として標識し、この基準を満たさないすべての患者は陰性として標識した。陽性率（％）は、表３５の各腫瘍タイプ当たりの全体の治療対象となりうる患者集団を与える。
表３５より、特定の変異を有する患者のサブセットのみがその変異を新生抗原として提示する可能性が高いＨＬＡアレルも有していることが容易に理解される。この変異を有するが適当なＨＬＡアレルを有さない患者は、治療から有益な効果を得る可能性は低い。例として、膵癌患者の推定約６０％が適当な変異／新生抗原を有しているのに対して、これらの患者の３分の２超が対応するＨＬＡアレル（複数可）を有していない。したがって、提案される関連する変異とＨＬＡアレルのペアを考慮したワクチン接種手法は、有益な効果を受け得る患者のみを標的とするものとなる。したがって、検証されたかまたは高いスコアを有する予測されたＨＬＡによるエピトープ提示を考慮することは、共有新生抗原ワクチンの潜在的有効性を決定するうえで重要なステップである。
（表３５）標的集団における新生抗原／ＨＬＡ出現率
Figure 2021525076
ＸＸＩＩ．Ｂ．共有新生抗原ワクチンカセット配列の選択
共有新生抗原ワクチンに含めるための共有新生抗原配列を選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＫまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍと、Ｂ３５１２、Ｂ３５０３、及びＢ３５０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐと、Ａ０１０１、Ａ０３０１、Ｂ５７０１、Ａ６８０１、Ａ０３０２、及びＡ１１０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、及びＡ６８０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ及びＢ１８０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＤまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１） ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方、または（２） ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄと、Ａ１１０１及びＣ０８０２の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＲまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａと、Ａ０３０１、Ａ０３０２、Ａ１１０１、Ｂ１５１０、Ｃ０３０３、及びＣ０３０４のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎと、Ａ２４０２及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ及びＡ０３０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＬまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌと、Ａ０２０７、Ｃ０８０２、及びＡ０２０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖと、Ｂ１５０１及びＢ１５０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖと、Ａ０３０１、Ａ１１０１、Ａ３１０１、Ｃ０１０２、及びＡ０３０２のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＫＲＡＳ＿Ｑ６１ＨまたはＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ及びＡ０１０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆと、Ａ２３０１、Ａ２４０２、Ｂ１５１０、Ｂ３９０６、Ｃ０５０１、Ｃ１４０２、及びＣ１４０３のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙと、Ａ１１０１及びＡ０３０１の少なくとも一方とを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列を表ＡまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅと、Ａ２４０２、Ｃ１４０３、及びＡ２３０１のうちの少なくとも１つとを記載したすべての横列を特定することにより選択した。
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２ＣまたはＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃでは、ワクチンに含めるための共有新生抗原コード配列は表Ａ３２またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果を参照して選択し、検討したそれぞれの関連する配列は、（１）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１、または（２）ＮＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ及びＡ０２０１を記載したすべての横列を特定することにより選択した。例えば、表３２に示される関連する配列を参照されたい。
ＸＸＩＩＩ．共有新生抗原のＴ細胞認識の評価
本発明者らは、新生抗原が患者に免疫応答を誘導するかどうかを評価した。本発明者らは、肺腺癌を有する患者から解離腫瘍細胞を得た。腫瘍細胞をシークエンシングして患者のＨＬＡを決定し、変異を同定した。患者はＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しており、本発明者らは、腫瘍にＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ変異を同定した。同時に、本発明者らは、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を代表するＣＤ４５＋細胞を分取して増殖させた。増殖させたＴＩＬを変異させたペプチドＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーで染色して患者におけるこの変異の免疫原性を評価した。図２６は、ＣＤ８＋細胞に対するフローサイトメトリーゲーティング手法（左パネル）及びＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーによるＣＤ８＋細胞の染色（右パネル）を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな割合（６６％超）が、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ：ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーへの結合を示し、新生抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を示し、また、新生抗原に対する既存の免疫応答を示した。
さらに、本発明者らは、共有新生抗原を認識することが可能な健康なドナーのナイーブＴ細胞のレパートリー中のＴ細胞前駆細胞の存在について評価を行った。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮化し、ワクチンカセットＧＯ−００５の中に存在する共有新生抗原候補である２ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖペプチド、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃペプチド、及びＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐペプチドエピトープのうちのいくつかを提示するＭＨＣマルチマーで染色した。ＨＬＡペプチド結合細胞を分取して増殖させ、新生抗原に対するそれらの特異性を確認した。試験した変異のすべてについて前駆細胞が検出された（表３６）。新生抗原に特異的なＴ細胞のＴＣＲシークエンシングも行った。図２７は、一般的なＴＣＲシークエンシング手法及びワークフローを示す。図２８は、ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖ／ ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１テトラマーのＴＣＲシークエンシング手法の代表的な例を示す。ＴＣＲシークエンシング手法によってポリクローナル応答が示され、ペプチド／ＭＨＣ当たり、及びドナー当たり中央値で７３種（２５〜９８７種の範囲）のクロノタイプが同定された（表３６）。したがって、ナイーブＴ細胞のレパートリー分析は、これらの新生抗原がワクチン接種によって投与された場合に選択された患者に免疫応答を誘導すると予想されることを示唆するものである。
（表３６）新生抗原応答性ナイーブＴ細胞前駆細胞の評価
Figure 2021525076
ＸＸＩＶ．共有新生抗原及び患者集団の選択
本明細書に記載される表３４、表Ａ、表１．２、またはＡＡＣＲ Ｇｅｎｉｅの結果（配列番号５７〜２９３５７）に示される抗原のうちの１つ以上を用いて本明細書に記載されるようなワクチン組成物を配合する。ワクチンを例えばがんを治療する目的で患者に投与する。特定の場合では、患者を、例えば、コンパニオン診断、またはＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ ＣＤｘ、Ｇｕａｒｄａｎｔ ３６０、Ｇｕａｒｄａｎｔ ＯＭＮＩ、またはＭＳＫ ＩＭＰＡＣＴなどの一般的に用いられているがん遺伝子パネルＮＧＳアッセイを用いて選択する。例示的な患者選択基準を下記に述べる。例示的な共有新生抗原ワクチン組成物ＧＯ−００５は、表３４に記載される変異を標的とするものである。
患者選択
共有新生抗原をワクチン接種するための患者選択は、腫瘍遺伝子発現、体細胞変異の状態、及び患者のＨＬＡ型を考慮して行われる。具体的には、患者は、以下の場合にワクチン治療に適格であるとみなされる。すなわち、
（ａ）ワクチンに含まれるエピトープを提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを患者が有し、患者の腫瘍がそのエピトープ配列を有する遺伝子を発現している、
（ｂ）ワクチンに含まれるエピトープを提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを患者が有し、患者の腫瘍がそのエピトープ配列を生じる変異を有している、
（ｃ）（ｂ）と同じであるが、患者の腫瘍が所定の閾値（例えば、１ＴＰＭまたは１０ＴＰＭ）を上回る変異を有する遺伝子を発現していることも求められる、または、
（ｄ）（ｂ）と同じであるが、患者の腫瘍が所定の閾値（例えば、ＲＮＡのレベルで観察される少なくとも１つの変異リード）を上回る変異を発現していることも求められる、
（ｅ）（ｂ）と同じであるが、（ｃ）及び（ｄ）におけるさらなる基準の両方も求められる、
（ｆ）上記のいずれかであるが、提示ＨＬＡアレルの喪失が腫瘍で検出されないことも任意で求められる。
遺伝子発現は、ＲＮＡＳｅｑ、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ナノストリング、ＩＳＨ、質量分析、またはＩＨＣを含む確立された方法のいずれかによってＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定される。遺伝子発現の陽性の閾値は、以下を含むいくつかの方法によって確立される。すなわち、（１）異なる遺伝子発現レベルでのＨＬＡアレルによるエピトープの提示の予測される確率、（２）質量分析により測定される遺伝子発現とＨＬＡエピトープ提示との相関、及び／または（３）異なるレベルで遺伝子を発現している患者で得られるワクチン接種の臨床効果。患者選択は、ワクチンに含まれる複数のエピトープ、例えば、少なくとも２、３、４、または５個のエピトープについて陽性が求められるようにさらに広げられる。
体細胞変異の状態は、エクソームシークエンシング（ＮＧＳ ＤＮＡＳｅｑ）、標的化エクソームシークエンシング（遺伝子のパネル）、トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡＳｅｑ）、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ（例えば、Ｔａｑｍａｎまたは液滴デジタルＰＣＲ）、質量分析に基づく方法（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍによる）、または当業者には周知の他の任意の方法により評価される。
さらに新たな新生抗原が例えば質量分析により、記載の方法のいずれかを用いて同定される。これらの新たに同定された共有新生抗原は本明細書に記載のワクチンカセットに組み込まれる。
以前に検証された新生抗原が、さらなるＨＬＡアレルによって提示されるものとしてさらに検証され、ワクチンカセットに新生抗原選択についての情報を与え、及び／または潜在的に治療可能な集団を広げる。
新たな新生抗原を含めることで、対処可能な腫瘍タイプを広げる（例えば、ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ）ことが可能となり、新たな腫瘍タイプを有する患者を含めることが可能となる。
ＸＸＶ．共有抗原の同定
本発明者らは、３つの計算ステップを用いて共有抗原遺伝子に基づいた標的を同定した。最初に、本発明者らは、ＧＴＥｘ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） プロジェクト［１］より利用可能なデータを用いて多くの正常組織における発現が低いかまたは発現されない遺伝子を同定した。本発明者らは、ＧＴＥｘ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） プロジェクト（バージョンＶ７ｐ２）より集計された遺伝子発現データを取得した。このデータセットは、７００人を上回る個人及び５０種よりも多い異なる組織タイプからの１１０００個を上回る死体試料からなるものであった。ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びＧＴＥｘ標準パイプライン（https://www.gtexportal.org/home/documentationPage）にしたがって計算処理を用いて発現を測定した。ＲＳＥＭ ｖ１．２．２２［２］を用いて計算したアイソフォーム発現の総和を用いて遺伝子発現を計算した。
次に、本発明者らは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（http://cancergenome.nih.gov/）からのデータを用いてこれらの遺伝子のうちのどの遺伝子ががん試料で異常に発現しているかを同定した。本発明者らは、ＴＣＧＡ（データリリース６．０）より入手可能な１１０００種を上回る試料を調べた。
最後に、これらの遺伝子において、本発明者らは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容を援用するところの国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７１５９号に記載されるような、ＭＳ／ＭＳによりシークエンシングされるＨＬＡ提示ペプチドで訓練されたディープラーニングモデルを用いて、どのペプチドがＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面抗原として提示される可能性が高いかを同定した。
本発明者らは、共通腫瘍抗原（ＣＴＡ；共有抗原）を同定するため、腫瘍特異性を確実とするだけ充分に厳密であるが、リードミスアラインメントなどの潜在的アーチファクトを説明する、正常組織で発現される遺伝子を除外するための基準を定義しようと試みた。遺伝子は、以下の基準を満たした場合にＣＴＡとして含めるのに適格とした。すなわち、脳、心臓、または肺の一部である各臓器におけるＧＴＥｘ発現の中央値は、０．１ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）未満であり、５ＴＰＭを上回る試料はなかった。他の必須臓器におけるＧＴＥｘの中央値は２ＴＰＭ未満であり、１０ＴＰＭを上回る試料はなかった。発現は非必須として分類される臓器（精巣、甲状腺、及び小唾液腺）では無視した。遺伝子は、少なくとも３０個の試料でＴＣＧＡにおける発現が１０ＴＰＭよりも大きい場合に腫瘍試料で発現されているものとみなした。文献のレビューに基づき、本発明者らは、遺伝子ＭＡＧＥＢ４及びＭＡＧＥＢ６も加えた。
本発明者らは、遺伝子ＣＴＡＧ１Ａ／ＣＴＡＧ１Ｂ （ＮＹ−ＥＳＯ−１）も加えた。その発現がＴＣＧＡデータリリース６．０の計算方法を用いて正確には定量できないことから、本発明者らは、多重マッピングしたリードを構成するＴＣＧＡレガシーアーカイブ（https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive）で利用可能なＲＳＥＭ計算に依った。
本発明者らは、ＴＣＧＡ試料にまたがった残りの遺伝子の発現の分布を調べた。本発明者らが、既知のＣＴＡ、例えば遺伝子のＭＡＧＥファミリーを調べたところ、対数空間におけるこれらの遺伝子の発現は二峰性分布によって一般的に特徴付けられることを認めた。この分布は、より低い発現値の周囲の左の峰と、より高い発現値における右の峰（または太い尾部）を含んでいた。この発現パターンは、いくつかの最小の発現を多数の試料においてベースラインで検出することができ、遺伝子のより高い発現がエピジェネティックな調節不全を生じた腫瘍のサブセットで観察されるような生物学的モデルと一致している。本発明者らは、ＴＣＧＡ試料にまたがった各遺伝子の発現分布を検討し、顕著な右側の尾部のない単峰性分布のみを認めたものを破棄した。例えば、遺伝子がＧＴＥｘにはない組織で発現する可能性が高い場合、ハンドキュレーションによって少数の遺伝子を破棄した。この結果、５９個の遺伝子のセットが得られた。表４６を参照されたい。表４６において、Ｘは、遺伝子が、少なくとも１％の症例において１０ＴＰＭを上回る値で発現されるがんを示して用いる。
（表４６）がんサブタイプにおける発現レベルの分析
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ＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面抗原として提示される可能性が高いペプチドを同定するため、本発明者らは、スライディングウィンドウを用いてこれらのタンパク質のそれぞれをそれらを構成するアミノ酸８〜１１個の配列に区切って解析した。本発明者らは、これらのペプチド及びそのフランキング配列をＨＬＡペプチド提示ディープラーニングモデルで処理してＴＣＧＡにおいてこの遺伝子で観察される各ペプチドの提示確率を９９．９パーセンタイルの発現レベルで計算した。本発明者らは、本発明者らのモデルにより計算したクオンタイル正規化した提示確率が０．００１よりも高い場合に、提示される可能性が高いペプチドとみなした（すなわち、候補ターゲット）。
特定の適応症に関連する可能性の高い遺伝子を優先順位付けするため、本発明者らは、がん症例の少なくとも０．９８％において少なくとも１０ＴＰＭのレベルで発現される遺伝子を選択した。
結果を表１．２に示す。合計で１０６９８個の共有抗原配列が同定された。各配列について対応するＨＬＡアレル（複数可）を示す。
表Ａ
配列表の配列番号１０７５５〜２１０１５を参照されたい。わかりやすさのため、あるＨＬＡアレルを有する特定のＨＬＡアレルペプチドと０．００１よりも高いＥＤＧＥスコアで関連することが予測された各ペプチドに固有の配列番号を割り当てる。上記の配列識別子のそれぞれは、ペプチドのアミノ酸配列、ＨＬＡサブタイプ、ペプチドに対応する遺伝子名、ペプチドに関連した変異、及び、ペプチド：ＨＬＡペアの頻度が０．１％よりも大きいか（「１」で示す）または０．１％よりも小さい（「０」で示す）かに関連付けられている。
表Ａは、本明細書に参照によりその全容を援用するところの２０１８年１２月５月２３日出願の米国特許仮出願第６２／６７５５５９号にその全容が開示されている。
ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥの結果
配列表の配列番号２１０１６〜２９３５７を参照されたい。わかりやすさのため、あるＨＬＡアレルを有する特定のＨＬＡアレルペプチドと０．００１よりも高いＥＤＧＥスコアかつ０．１％よりも高い頻度で関連することが予測された各ペプチドに固有の配列番号を割り当てる。上記の配列識別子のそれぞれは、ペプチドに対応する遺伝子名及び変異、ＨＬＡサブタイプ、ペプチドのアミノ酸配列と関連付けられている。
表１．２
配列表の配列番号５７〜１０７５４を参照されたい。遺伝子に関連付けられた予測された共有抗原は、がん症例の少なくとも０．９８％において少なくとも１０ＴＰＭのレベルで発現された。上記の配列識別子のそれぞれは、遺伝子名、ペプチドのアミノ酸配列、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ、及び対応するＨＬＡアレル（複数可）と関連付けられている。
特定の配列
本明細書で言及するベクター、カセット、及び抗体を以下に記載し、配列番号で呼ぶ。
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参考文献
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Claims (167)

  1. 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
    （ａ）ベクター骨格であって、
    （ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、前記ベクター骨格、
    （ｂ）抗原カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
    （Ａ）配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｂ）任意で５’リンカー配列、及び
    （Ｃ）任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
    を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
    （ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記抗原カセット。
  2. 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
    （ａ）ベクター骨格であって、
    （ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、前記ベクター骨格、
    （ｂ）抗原カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
    （Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
    （Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、クラスＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、各ＭＨＣ Ｉエピトープコード核酸配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
    前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
    （Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
    （Ｂ）任意で、３’リンカー配列
    を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
    を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
    （ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記抗原カセット。
  3. 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
    （ａ）ベクター骨格であって、
    （ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、前記ベクター骨格、
    （ｂ）抗原カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも２０個の腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、
    （Ａ）配列番号１９８３１の配列を含むＭＨＣクラスＩをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｂ）配列番号１４９５４の配列を含むＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｃ）配列番号１９７４９及び１９８６５からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、及び
    （Ｄ）配列番号１９９７６、１９９７９、１９７７９、１１４９５、及び１９９７４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｅ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｆ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｋ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｇ）ＴＰ５３＿Ｒ２４９Ｍ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｈ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｉ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ４５Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｊ）ＥＲＢＢ２＿Ｙ７７２＿Ａ７７５ｄｕｐ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｋ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｒ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｌ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｔ４１Ａ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｍ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｎ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｏ）ＴＰ５３＿Ｒ２１３Ｌ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｐ）ＢＲＡＦ＿Ｇ４６６Ｖ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｑ）ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｒ）ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｓ）ＴＰ５３＿Ｓ１２７Ｙ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｔ）ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｅ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｕ）ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、
    （Ａ）任意で、５’リンカー配列、及び
    （Ｂ）任意で、３’リンカー配列
    を含む、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
    を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と、
    （ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｖ）任意で、天然のポリ（Ａ）配列、または前記ベクター骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列である、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記抗原カセット。
  4. 抗原発現系を含む、抗原発現系を送達するための組成物であって、
    前記抗原発現系が１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが以下を含む、前記組成物：
    （ａ）任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含む、ベクター骨格、
    （ｂ）２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた抗原カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）互いに直鎖状に連結された少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の腫瘍特異的なＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
    （Ａ）アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードする、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列であって、前記ＭＨＣクラスＩエピトープの少なくとも１つが、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列、
    （Ｂ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、５’リンカー配列、
    （Ｃ）前記ＭＨＣクラスＩエピトープの天然のC末端酸配列をコードし、かつ少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードする、３’リンカー配列
    を含み、
    前記抗原カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結され、前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードし、各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の各３’末端が、前記抗原カセット内の最後のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を除いて、それに続くＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列の５’末端に連結されている、
    前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列
    を含む、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列と、
    （ｉｉ）少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列であって、
    （Ｉ）ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４８）と、
    （ＩＩ）破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列（配列番号４６）と、
    （ＩＩＩ）前記ＰＡＤＲＥ ＭＨＣクラスＩＩ配列と前記破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第１の核酸配列と、
    （ＩＶ）前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の５’末端と、前記腫瘍特異的ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列とを連結するＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第２の核酸配列と、
    （Ｖ）任意で、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の３’末端のＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列をコードする第３の核酸配列と
    を含む、前記少なくとも２個のＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列と
    を含む、前記抗原カセット。
  5. 前記抗原カセットの各要素の順序付けられた配列が、５’から３’にかけて、
    Ｐａ−（Ｌ５ｂ−Ｎｃ−Ｌ３ｄ）Ｘ−（Ｇ５ｅ−Ｕｆ）Ｙ−Ｇ３ｇ
    を含む式で説明され、
    式中、
    Ｐは、前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ＝０または１であり、
    Ｎは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｃ＝１であり、
    Ｌ５は、前記５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、
    Ｌ３は、前記３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、
    Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、
    Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、
    Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、
    Ｘ＝1〜４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、
    Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 各Ｘについて、対応するＮｃが、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である、請求項５に記載の組成物。
  7. 各Ｙについて、対応するＵｆが、異なるＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列である、請求項５または６に記載の組成物。
  8. ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、
    前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
    前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
    各Ｎが、アミノ酸７〜１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
    Ｌ５が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｌ３が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、
    前記ベクター骨格が、任意でＣｈＡｄＶ６８ベクターであるチンパンジーアデノウイルスベクター、または任意でベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであるアルファウイルスベクターを含み、
    前記ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３〜２５個の長さのポリペプチドをコードする、
    請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. ナノ粒子状の送達ビヒクルをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル−４−ジメチルアミノブチレート）分子を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ナノ粒子状の送達ビヒクルが、前記抗原発現系を封入している、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記抗原カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、請求項１〜３、５〜７、または９〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記抗原コード核酸配列と機能的に連結されている、請求項１〜３、５〜７、または９〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記１つ以上のベクターが、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、５’７−メチルグアノシン（ｍ７ｇ）キャップを含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが、インビトロ転写によって生成される、請求項１６または１７に記載の組成物。
  19. 前記１つ以上のベクターが、哺乳動物細胞内で自己複製する、請求項１〜３、５〜７、または９〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記骨格が、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を含む、請求項２０または２１に記載の組成物。
  23. 前記骨格が、少なくとも、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を含む、請求項２０または２１に記載の組成物。
  24. 前記非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノミックプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の組成物。
  25. 前記骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記抗原カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号３または配列番号５に記載の配列を含む、請求項２０または２１に記載の組成物。
  28. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４と１１１７５との間に欠失をさらに含む配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項２０または２１に記載のの組成物。
  29. 前記骨格が、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記抗原カセットが、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように７５４４位に挿入されている、請求項２８または２９に記載の組成物。
  31. 前記抗原カセットの挿入が、前記ｎｓＰ１〜４遺伝子及び前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列を含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ１〜４遺伝子及び前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内にある、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記骨格が、チンパンジーアデノウイルスベクターの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記チンパンジーアデノウイルスベクターが、ＣｈＡｄＶ６８ベクターである、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１〜３、５〜７、または９〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、外因性のＲＮＡプロモーターである、請求項１〜３、５〜７、または９〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１〜３、５〜７、または９〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす、請求項１〜３、５〜７、または９〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ２ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  41. 前記１つ以上のベクターが、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、前記腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項１〜３、５〜７、または９〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、リンカーをコードする核酸配列によって異なる抗原コード核酸配列と連結されている、請求項１〜３、５〜７、または９〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
  45. 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩＩ配列と連結する、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記リンカーが、（１）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したグリシン残基、（２）少なくとも残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さの連続したアラニン残基、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源の同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２〜２０個の長さの１つ以上の天然配列からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩＩ配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を１個のＭＨＣクラスＩ配列と連結する、請求項４４に記載の組成物。
  48. 前記リンカーが、配列ＧＰＧＰＧを含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つの配列が、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに／または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に機能的または直接的に連結されている、請求項１〜３、５〜７、または９〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）−１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意でプロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  53. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するＭＨＣアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記少なくとも１つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  55. 前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔリンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  56. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも２〜１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、少なくとも１１〜２０個、１５〜２０個、１１〜１００個、１１〜２００個、１１〜３００個、１１〜４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が少なくとも２〜４００個の核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個が、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項１〜３、５〜７、または９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２つが、前記腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項４または８に記載の組成物。
  60. 前記対象に投与されて翻訳された場合、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列によってコードされた抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原のうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも１つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  62. 各ＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸８〜３５個の長さ、任意で、アミノ酸９〜１７個、９〜２５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項１〜３、５〜７、または９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在している、請求項１〜３、５〜７、または９〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
  65. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が、アミノ酸１２〜２０個、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０〜４０個の長さである、請求項１〜３、５〜７、または９〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
  66. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥの少なくとも一方を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、請求項１〜３、５〜７、または９〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
  68. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、請求項１〜３、５〜７、または９〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
  69. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に天然に存在するポリ（Ａ）配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
  70. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記骨格に対して外因性のポリ（Ａ）配列を含む、請求項１〜３、５〜７、または９〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
  71. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結されている、請求項１〜３、５〜７、または９〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
  72. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１〜３、５〜７、または９〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
  73. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１〜３、５〜７、または９〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
  74. 前記抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結された、ｍＲＮＡの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている５’または３’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  76. 前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される、請求項７５に記載の組成物。
  77. 前記１つ以上のベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、請求項７８に記載の組成物。
  80. 前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、２ＡまたはＩＲＥＳのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが連続したグリシン残基などの柔軟性リンカーによって連結されている、請求項７８または７９に記載の組成物。
  81. 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項７７に記載の組成物。
  82. 前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−２１、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも１つである、請求項８１に記載の組成物。
  83. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、
    (ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
    （ｂ）抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
    （ｃ）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
    を行うことによって選択される、請求項１〜３、５〜７、または９〜８２のいずれか１項に記載の組成物。
  84. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
    (ａ)腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、
    （ｂ）抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程と、
    （ｃ）前記少なくとも２０個のＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程と
    を行うことによって選択される、請求項４または８に記載の組成物。
  85. 前記選択された抗原のセットの数が、２〜２０である、請求項８３に記載の組成物。
  86. 前記提示モデルが、
    (ａ)前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
    （ｂ）前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの前記特定の１つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
  87. 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記選択された抗原が、１つ以上の特異的ＨＬＡアレルによって提示されると検証されている、請求項８３〜８６のいずれか１項に記載の組成物。
  88. 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む、請求項８３〜８７のいずれか１項に記載の組成物。
  89. 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、請求項８３〜８８のいずれか１項に記載の組成物。
  90. 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項８３〜８９のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項８３〜９０のいずれか１項に記載の組成物。
  92. エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織に関してシークエンシングを行うことによって取得される、請求項８３〜９１のいずれか１項に記載の組成物。
  93. 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、請求項９２に記載の組成物。
  94. 前記抗原カセットが、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  95. 少なくとも１つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する、請求項９４に記載の組成物。
  96. 各ジャンクショナルエピトープ配列が、非自己である、請求項９４または９５に記載の組成物。
  97. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、集団の少なくとも５％に存在する少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されている、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  98. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．０１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  99. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープのそれぞれが、少なくとも１つのＨＬＡアレルによって提示が可能であることが予測または検証されており、各抗原／ＨＬＡペアが、集団において少なくとも０．１％の抗原／ＨＬＡ出現率を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  100. 前記抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  101. 前記非治療的な予測されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、請求項１００に記載の組成物。
  102. 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、請求項９４〜１０１のいずれか１項に記載の組成物。
  103. 前記抗原カセット内における前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の順序が、
    （ａ）前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程と、
    （ｂ）前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、
    （ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程と
    を含む一連の工程によって決定される、請求項９４〜１０２のいずれか１項に記載の組成物。
  104. 先行請求項のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  105. アジュバントをさらに含む、請求項１０４に記載の組成物。
  106. 免疫調節物質をさらに含む、請求項１０４または１０５に記載の医薬組成物。
  107. 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１０６に記載の医薬組成物。
  108. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットと、
    配列番号３または配列番号５の配列から得られる１つ以上の要素と
    を含む単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットであって、
    任意で、前記１つ以上の要素が、非構造タンパク質媒介増幅に必要な配列、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列、ポリ（Ａ）配列、及び配列番号３または配列番号５に記載の配列のｎｓＰ１〜４遺伝子からなる群から選択され、
    任意で、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、
    前記単離ヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセット。
  109. 前記配列または単離ヌクレオチド配列のセットが、配列番号６または配列番号７に記載の配列の７５４４位に挿入された先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットを含む、請求項１０８に記載の単離ヌクレオチド配列。
  110. 配列番号３または配列番号５の配列から得られた前記１つ以上の要素の５’側に位置するＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列と、
    任意で、前記ポリ（Ａ）配列の３’側に位置する１つ以上の制限部位と
    をさらに含む、請求項１０８または１０９に記載の単離ヌクレオチド配列。
  111. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の抗原カセットが、配列番号８または配列番号９の７５６３位に挿入されている、請求項１０８に記載の単離ヌクレオチド配列。
  112. 請求項１０８〜１１１のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含むベクターまたはベクターのセット。
  113. 請求項１０８〜１１２のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列または単離ヌクレオチド配列のセットを含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３もしくはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ−２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１−２ａ細胞である、前記単離細胞。
  114. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物と使用説明書とを含む、キット。
  115. がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  116. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来しない、請求項１１５に記載の方法。
  118. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  119. 前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  121. 前記対象が、前記ＭＨＣクラスＩエピトープを提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記ＭＨＣクラスＩエピトープが、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、請求項１１５〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 前記組成物が筋肉内投与される、請求項１１５〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
  124. １つ以上の免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記組成物または医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項１１５〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記１つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４−１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ−４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される、請求項１２４または１２５に記載の方法。
  127. 前記皮下投与が、前記組成物もしくは医薬組成物の投与部位の近くに、または１つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記対象に第２のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項１１５〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１１５〜１２７のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の前に投与される、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１１５〜１２７のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物の投与の後に投与される、請求項１２８に記載の方法。
  131. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１１５〜１２７のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と同じである、請求項１２９または１３０に記載の方法。
  132. 前記第２のワクチン組成物が、請求項１１５〜１２７のいずれか１項に記載の組成物または医薬組成物と異なる、請求項１２９または１３０に記載の方法。
  133. 前記第２のワクチン組成物が、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原コード核酸配列と同じである、請求項１３３に記載の方法。
  135. 先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の１つ以上のベクターを製造する方法であって、
    （ａ）前記骨格及び前記抗原カセットを含む直線化ＤＮＡ配列を得ることと、
    （ｂ）前記直線化ＤＮＡ配列を、前記直線化ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写するために必要なすべての成分を含んだインビトロ転写反応に加えることにより、前記直線化ＤＮＡ配列をインビトロ転写することであって、任意で、得られたＲＮＡに前記ｍ７ｇキャップをインビトロで加えることをさらに含む、前記インビトロ転写することと、
    （ｃ）前記インビトロ転写反応から前記１つ以上のベクターを単離することと
    を含む、前記方法。
  136. 前記直線化ＤＮＡ配列が、ＤＮＡプラスミド配列を直線化することにより、またはＰＣＲを用いた増幅により生成される、請求項１３５に記載の製造方法。
  137. 前記ＤＮＡプラスミド配列が、細菌組換え、または全ゲノムＤＮＡ合成、または細菌細胞内での合成ＤＮＡの増幅を伴う全ゲノムＤＮＡ合成、のうちの１つを用いて生成される、請求項１３６に記載の製造方法。
  138. 前記１つ以上のベクターを前記インビトロ転写反応から単離することが、フェノールクロロホルム抽出、シリカカラムを用いた精製、または同様のＲＮＡ精製法のうちの１つ以上を含む、請求項１３５に記載の製造方法。
  139. 前記抗原発現系を送達するための、先行の組成物の請求項のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法であって、
    （ａ）ナノ粒子状の送達ビヒクルの成分を提供することと、
    （ｂ）前記抗原発現系を提供することと、
    （ｃ）前記ナノ粒子状の送達ビヒクル及び前記抗原発現系が前記抗原発現系を送達するための前記組成物を生成するのに充分な条件を提供することと
    を含む、前記方法。
  140. 前記条件がマイクロ流体混合によって提供される、請求項１３９に記載の製造方法。
  141. がんを有する対象を評価する方法であって、
    ａ）１）前記対象が、抗原ベースワクチンに含まれる抗原を提示することが予測されるまたは知られているＨＬＡアレルを有するかどうか、及び、
    以下：
    １）対象の腫瘍が前記抗原に関連した遺伝子を発現するかどうか、任意で、前記遺伝子が正常細胞または組織と比較して異常に発現しているかどうか、
    ２）前記対象の腫瘍が前記抗原に関連した変異を有するかどうか
    の一方または両方
    を判定する、または既に判定している工程と、
    ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が前記ＨＬＡアレルを発現しており、かつ前記対象の腫瘍が前記遺伝子を発現している、かつ／または前記対象の腫瘍が前記変異を有する場合に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程であって、
    前記抗原が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を含む、
    前記工程と、
    ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
    １）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含む、前記工程と
    を含む、前記方法。
  142. がんを有する対象を評価する方法であって、
    ａ）前記対象が、
    １）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有するか、
    ２）Ａ０２０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有するか、
    ３）Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有するか、または
    ４）Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたはＡ１１０１ ＨＬＡアレルまたはＡ３１０１ ＨＬＡアレルまたはＣ０１０２ ＨＬＡアレルまたはＡ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有するか
    を判定する、または既に判定している工程と、
    ｂ）前記（ａ）の結果から、前記対象が、
    １）前記Ａ０３０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異を有する場合、
    ２）前記Ａ０２０１アレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異を有する場合、
    ３）前記Ｃ０８０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍が前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異を有する場合、または
    ４）前記Ａ０３０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ１１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ３１０１ ＨＬＡアレルまたは前記Ｃ０１０２ ＨＬＡアレルまたは前記Ａ０３０２ ＨＬＡアレルを発現し、かつ前記対象の腫瘍がＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異を有する場合
    に、前記対象が前記抗原ベースワクチンによる治療の候補であることを判定する、または既に判定している工程と、
    ｃ）任意で、前記抗原ベースワクチンを前記対象に投与するか、または既に投与している工程であって、前記抗原ベースワクチンが、
    １）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ変異、前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ変異、または前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ変異をそれぞれ含む前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含むものである、前記工程と
    を含む、前記方法。
  143. 前記工程（ａ）及び／または（ｂ）が、前記対象からの試料を処理したサードパーティーからデータセットを得ることを含む、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  144. 前記工程（ａ）が、前記対象から試料を得ることと、前記試料を、エクソームシークエンシング、標的化エクソームシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、サンガーシークエンシング、ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ、質量分析に基づく方法、マイクロアレイ、ナノストリング、ＩＳＨ、及びＩＨＣからなる群から選択される方法を用いてアッセイすることと、を含む、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  145. 前記試料が、腫瘍試料、正常組織試料、または前記腫瘍試料及び前記正常組織試料を含む、請求項１４３または１４４に記載の方法。
  146. 前記試料が、組織、体液、血液、腫瘍生検、脊髄液、及び針穿刺吸引物から選択される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記遺伝子が、表３４に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される、請求項１４１または１４３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
  148. 前記遺伝子が、表３２に見られる遺伝子のいずれかからなる群から選択される、請求項１４１または１４３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
  149. 前記がんが、肺癌、マイクロサテライト安定性結腸癌、及び膵癌からなる群から選択される、請求項１４１〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
  150. 前記ＨＬＡアレルが、少なくとも５％のＨＬＡ頻度を有する、請求項１４１〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
  151. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープが、前記対象の腫瘍に関連した細胞上の前記ＨＬＡアレルによって提示される、請求項１４１〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
  152. 前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 前記抗原発現系が、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の抗原発現系のいずれか１つを含む、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記抗原ベースワクチンが、請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物のいずれか１つを含む、請求項１４１〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  155. がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
    １）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、
    前記方法。
  156. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の腫瘍に由来する、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ抗原コード核酸配列が、がんを有する前記対象の前記腫瘍に由来しない、請求項１５５に記載の方法。
  158. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
    １）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択される、
    前記方法。
  159. 前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、請求項１５５〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
  160. 前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含む、請求項１５５〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
  161. 前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む、請求項１５５〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
  162. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
    １）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、
    前記方法。
  163. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
    １）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３４に示される変異からなる群から選択される変異を含み、前記対象が、表３４に示される対応する変異（例えば、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ及びＣ０８０２）と結びつけられた表３４に示される少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現する、
    前記方法。
  164. 対象において免疫応答を誘導するための方法であって、前記対象に対する抗原ベースワクチンを前記対象に投与することを含み、前記抗原ベースワクチンが、
    １）少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、または
    ２）前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープをコードするＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列
    を含み、
    前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、配列番号５７〜２９３５７からなる群から選択され、前記対象が、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列を提示することが予測されるまたは知られている少なくとも１つのＨＬＡアレルを発現し、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ配列が、表３２に示される変異からなる群から選択される変異を含む、
    前記方法。
  165. 前記抗原ベースワクチンが、抗原発現系を含む、請求項１５５〜１６４のいずれか１項に記載の方法。
  166. 前記抗原発現系が、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の抗原発現系のいずれか１つを含む、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記抗原ベースワクチンが、請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物のいずれか１つを含む、請求項１５５〜１６４のいずれか１項に記載の方法。
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