JP2021524247A - 免疫チェックポイント阻害剤の共発現ベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、あらゆる目的でその全容を参照により本明細書に援用するところの2018年5月23日出願の米国特許仮出願第62/675,624号の恩典を主張する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。前記ASCIIコピーは、2019年5月22日に作成され、GSO_018_WO_Sequence_Listing.txtの名前が付けられており、そのサイズは422,185バイトである。
腫瘍特異的な抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である1〜3。例えば、非小細胞肺がん(NSCLC)及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である4,5。初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がT細胞応答を誘発し6、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こし得る7ことが示されている。
本明細書では、抗原カセットを含むベクターシステムであって、抗原カセットが、(1)少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を任意で含む、エピトープコード核酸配列と、b.任意で5’リンカー配列と、c.任意で3’リンカー配列と、をそれぞれが含む、MHCクラスI抗原コード核酸配列を任意で含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列を含む、対象内に存在する腫瘍に関連した少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、(2)少なくとも1つの抗原コード核酸に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列と、を含み、前記ベクターが、任意で前記カセット内に、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列をさらに含み、任意で、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記核酸配列が、(1)前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列と、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とを隔てる内部リボソーム進入配列(IRES)を有する、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じ転写産物上、または(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と異なる転写産物であって、少なくとも1つの第2のプロモーター配列が、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列に機能的に連結されている、前記異なる転写産物上に転写される、ベクターシステムを開示する。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
[式中、Pは、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された前記少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、Nは、前記コードされたペプチド配列を、前記野生型核酸配列によってコードされる前記対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する前記エピトープコード核酸配列の1つを含み、ここでc=1であり、L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、X=2〜400であり、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、任意で、各Xについて、対応するNcは異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、Y=0〜2であり、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列であり、任意で、各Yについて、対応するUfは異なるMHCクラスII抗原コード配列である]で記述される。特定の態様において、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=10、Y=2であり、Pは、CMVプロモーター配列であり、各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、L5は、前記MHCIエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、L3は、前記MHCIエピトープの天然のC末端アミノ酸配列をコードし、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、前記ベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている。
[式中、L1及びL2は、それぞれ独立して、−0(C=0)−、−(C=0)0−、−C(=0)−、−0−、−S(0)x−、−S−S−、−C(=0)S−、−SC(=0)−、− RaC(=0)−、−C(=0) Ra−、− RaC(=0) Ra−、−OC(=0) Ra−、−RaC(=0)0−、または直接的結合であり、G1は、Ci〜C2アルキレン、−(C=0)−、−0(C=0)−、−SC(=0)−、− RaC(=0)−、または直接的結合であり、−C(=0)−、−(C=0)0−、−C(=0)S−、−C(=0)Ra−、または直接的結合であり、Gは、Ci〜C6アルキレンであり、Raは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R1a及びR1bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してHまたはメチルであり、R7は、C4〜C20アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立してC1〜C12アルキルであるか、またはR8とR9とは、それらが結合した窒素原子と共に、5、6、または7員の複素環を形成し、a、b、c、及びdは、それぞれ独立して1〜24の整数であり、xは0、1、または2である]を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
[式中、L1及びL2は、それぞれ独立して−0(C=0)−、−(C=0)0−、または炭素−炭素二重結合であり、R1a及びR1bは、それぞれの場合で、独立して(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R1aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R1bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR1b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R2a及びR2bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R2aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R2bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR2b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R3a及びR3bは、それぞれの場合で、独立して、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R3aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R3bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR3b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R4a及びR4bは、それぞれの場合で、(a)HまたはC1〜C12アルキルであるか、または(b)R4aは、HまたはC1〜C12アルキルであり、R4bはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったR4b及びそれが結合する炭素原子と共に炭素−炭素二重結合を形成し、R5及びR6は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり、R7は、それぞれの場合で、独立してHまたはC1〜C12アルキルであり、R8及びR9は、それぞれ独立して、非置換のC1〜C12アルキルであるか、またはR8とR9とは、それらが結合した窒素原子と共に、1個の窒素原子を含む5、6、または7員の複素環を形成し、a及びdは、それぞれ独立して0〜24の整数であり、b及びcはそれぞれ独立して1〜24の整数であり、eは1または2であり、ただし、R1a、R2a、R3a、またはR4aのうちの少なくとも1つが、C1〜C12アルキルであるか、またはL1またはL2の少なくとも一方が、−0(C=0)−または−(C=0)0−であり、R1a及びR1bは、aが6である場合にはイソプロピルでなく、aが8である場合にはn−ブチルでない]を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含む。
[式中、R10及びR11は、それぞれ独立して、10〜30個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で1つ以上のエステル結合によって中断され、zは、30〜60の範囲の平均値を有する]を有するか、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体である。いくつかの態様において、R10及びR11は、それぞれ独立して、12〜16個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様において、zの平均は、約45である。
ここから開始
I.定義
概して、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
共有抗原(例えば、新生抗原)を特定するための方法は、対象の腫瘍から、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む腫瘍または免疫細胞の細胞表面上に提示される可能性が高く、かつ/または免疫原性である可能性が高い抗原を特定することを含む。例として、かかる1つの方法は、対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノム腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び/または発現データのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び/または発現データが、抗原のセット(例えば、新生抗原の場合では、各新生抗原のペプチド配列がペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含み、または変異のない共有抗原の場合では、ペプチドは正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織中で発現が変化していることが知られているかまたは見出されている任意のポリペプチドに由来する)のそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、工程と、各抗原のペプチド配列を、1つ以上の提示モデルに入力することにより、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択することにより、選択された抗原のセットを生成する工程と、を含むことができる。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。腫瘍に特異的な、共有新生抗原を含む抗原を同定するための具体的な方法は当業者には周知のものであり、こうした方法は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号により詳細に記載されている。
抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載される方法を用いて選択された1つまたは多数の抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
1つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「抗原カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原と、抗原(複数可)を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原(複数可)の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原(複数可)に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントと共に配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
(Pa−(L5b−Nc−L3d)X)Z−(P2h−(G5e−Uf)Y)W−G3g
[式中、P及びP2は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Nは、MHCクラスIエピトープコード核酸配列を含み、L5は、5’リンカー配列を含み、L3は、3’リンカー配列を含み、G5は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、G3は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、Uは、MHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、ただし、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列である]。組成物及び順序付けられた配列は、存在する要素の数を選択することによってさらに定義することができ、例えば、a=0または1である場合、b=0または1である場合、c=1である場合、d=0または1である場合、e=0または1である場合、f=1である場合、g=0または1である場合、h=0または1である場合、X=1〜400であり、Y=0、1、2、3、4または5であり、Z=1〜400であり、かつW=0、1、2、3、4または5である。
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるC68ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも1つの抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも1つの免疫調節因子(例えばscFvなどの抗体)をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、抗原カセットと、チェックポイント阻害剤をコードする1つ以上の核酸分子とを含むことができる。
V.C.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある)
7.HLAクラスのカバレッジ(HLA−I及びHLA−IIの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある)
V.D.1.アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株TC−83などの新世界型に分類される(Strauss Microbrial Review 1994)。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約12kbであり、その最初の2/3は、ウイルスゲノムを自己複製するためのRNA複製複合体を形成する非構造タンパク質(nsP)をコードする遺伝子を含んでおり、最後の1/3は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる(Frolov RNA 2001)。
アルファウイルス(アルファウイルス配列、特徴、及び、他の要素)を使用してアルファウイルスベースの送達ベクター(アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製RNA(srRNA)ベクター、または自己増幅RNA(samRNA)ベクターとも称される)を作製することができる。アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている(Pushko 1997,Rheme 2004)。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有し得る。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、VEEのTC−83株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、抗原発現カセットは、ベクターが、VEEまたはその弱毒化誘導株TC−83に由来する配列を含む(ただしこれらに限定されない)どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のRNAポリヌクレオチドである。RNA生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳IVTがある。この方法では、所望のベクターのDNA鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このDNA鋳型は、RNAに転写されることが望ましい配列の5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、T3、T7、またはSP6などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、DNA鋳型は、適当なRNAポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド(NTP)とインキュベートされる。得られたRNAポリヌクレオチドは、7−メチルグアノシンまたは関連する構造などの5’キャップ構造の付加、及び任意でポリアデニル化(ポリA)テールを有するように3’末端を改変することを含む(ただしこれらに限定されない)方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、RNAをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の1つとして、ベクター自体に対する免疫がある(Riley 2017)。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
V.E.1.チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
1つ以上の抗原を送達するためのワクチン組成物(例えば、抗原カセットを介し、1つ以上の新生抗原を含む)は、チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることにより作出することができる。チンパンジーC68アデノウイルス(本明細書ではChAdV68とも呼ぶ)のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる(SEQ ID NO:1を参照)。C68アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第6,083,716号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス(Ad)を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能(ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合)をヘルパーウイルスまたは細胞株(すなわち、相補性またはパッケージング細胞株)によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのE1遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはHEK293またはその変異体が含まれ得る。チンパンジーE1遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール(米国特許第6,083,716号の実施例3及び4)にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも1種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、C68のようなチンパンジーアデノウイルスDNA配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。C68ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。C68ベクターは1つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの1つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも1つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスC68ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、E1aまたはE1b遺伝子に機能的欠失を有し、任意で例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び/またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている[例えば、上記に引用のKozarsky I及びII、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第5,240,846号を参照]。
最小チンパンジーAd C68ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の5’及び3’の末端逆位繰り返し配列(ITR)(複製起点として機能する)と、天然の5’パッケージング/エンハンサードメイン(直鎖状のAdのゲノム及びE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む)とを含む。例えば、国際出願第WO96/13597号において「最小」ヒトAdベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたDNA配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のcDNAのクローニング法、インビトロ組換え法(例えば、ギブソンアセンブリ)、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、CaPO4沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーC68アデノウイルス(上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される)は、抗原(複数可)をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の抗原などの1つ以上の抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に1つ以上の抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはAAYなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって隔てられた約20個の抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのMHCII抗原、及びユニバーサルクラスII抗原とみなされるPADRE抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤(CPI)と組み合わせて(例えば、同時、その前、またはその後で)対象に投与することができる。CPIは、抗体またはその抗原結合部分など、CTLA4、PD1、及び/またはPDL1を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
VIII.A.抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。臨床設定における抗原の特定において、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。最適化の例は当業者には周知のものであり、例えば、そのような方法が、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号により詳細に記載されている。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った(55〜58)。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
ペプチドYVYVADVAAKを用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図24A及び24Bに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに充分であるように見えることを示す。質量分析を本明細書に記載される予測アルゴリズムと組み合わせて用いてHLAの提示を検証することができる。例えば、質量分析を用いてEDGE提示モデルによって生成されたエピトープ候補を検証することができる(国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号に記載される、MS/MSによりシークエンシングされたHLA提示ペプチド上で訓練されたディープラーニングモデル)。標的化MSによるEDGEスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関の例を図25に示す。
提示モデルを用いて、患者におけるペプチド提示尤度を特定することができる。異なる提示モデルは当業者には周知のものであり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、同第WO/2018/208856号、及び同第WO2016187508号、ならびに米国特許出願第US20110293637号により詳細に記載されている。
訓練モジュールを用いて、ペプチド配列がそのペプチド配列に関連したMHCアレルによって提示される尤度を生成する1つ以上の提示モデルを訓練データセットに基づいて構築することができる。様々な訓練モジュールが当業者には周知であり、例えば、そのような提示モデルは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号により詳細に記載されている。訓練モジュールは、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための予測モデルを構築することができる。訓練モジュールは、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル場面においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルも構築することができる。
予測モジュールを用いて、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して不適切に発現している候補抗原を特定することにより、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん性組織で発現が変化している候補抗原を特定することができる。
XI.B.1 概要
カセット設計モジュールを用いて、患者に注射するために選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成することができる。様々なカセット設計モジュールが当業者に周知であり、例えば、そのようなカセット設計モジュールは、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号により詳細に記載されている。
本明細書に記載される計算方法のいずれにおいてもコンピュータを使用することができる。当業者には、コンピュータは異なるアーキテクチャを有し得る点が認識されよう。当業者には周知のコンピュータの例は、例えば、あらゆる目的で本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用する国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号により詳細に記載されている。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答(複数可)を刺激するクラスI MHCに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)を送達することができる。1つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって隔てられている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはTSNA特異的CD8 T細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼし得るいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、(1)1個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いT細胞応答を生じることができるかどうか、(2)どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のTSNA間に配置される最適リンカーを作るか、(3)カセット内の各エピトープの相対位置がT細胞応答に影響するか、(4)カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するT細胞応答の程度または質に影響するかどうか、(5)細胞ターゲティング配列の付加がT細胞応答を向上させるか。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCVIRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
ペプチドは、ProImmune社またはGenscript社より購入し、水/DMSO(2:8,v/v)に加えた10mM tris(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)で10mg/mLに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはGibco社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清(FBShi)はSeradigm社より入手した。QUANTI−Luc基質、ゼオシン、及びプロマイシンはInvivoGen社より入手した。Jurkat−Lucia NFAT細胞(InvivoGen社)を10% FBShi、ピルビン酸ナトリウム、及び100μg/mLのゼオシンを添加したRPMI1640中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに0.3μg/mLのプロマイシンを加えた。T2細胞(ATCC CRL−1992)をIscove培地(IMDM)+20%FBShi中で培養した。U−87 MG(ATCC HTB−14)細胞を、10%FBShiを添加したMEM Eagles培地中で維持した。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内因性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV、FLLTRICT)をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM+1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
トランスジェニックHLA−A2.1(HLA−A2 Tg)マウスをTaconic Labs,Inc社より入手した。これらのマウスは、ヒトHLA−A2.1リーダードメイン、α1ドメイン、及びα2ドメインと、マウスH2−Kb α3ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインで構成されるキメラクラスI分子からなる導入遺伝子を有するものである(Vitiello et al.,1991)。これらの実験で使用したマウスは、C57Bl/6バックグラウンドの野生型BALB/cAnNTacの雌及びホモ接合型HLA−A2.1Tgの雌の第1世代子孫(F1)である。
HLA−A2 Tgマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により1×1010〜1×106個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の12日後に測定した。
免疫化したマウスの新しく収集した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。GentleMACS組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、10%ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンと共に含むRPMI(完全RPMI)中で組織を解離させた。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン(Janetzki et al.,2015)にしたがってELISPOT分析を行った。1×105個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
新しく単離したリンパ球を2〜5×106細胞/mLの密度で10uMの示したペプチドと2時間インキュベートした。2時間後、ブレフェルジンAを5ug/mlの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに4時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素eFluor780で標識し、抗CD8 APC(クローン53−6.7,BioLegend社)により1:400の希釈率で染色した。細胞内染色には抗IFNg PE(クローンXMG1.2,BioLegend社)を1:100で使用した。試料をAttune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific社)で収集した。FlowJoを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、CD8+細胞のIFNg+の割合(%)及び全IFNg+細胞数/1×106個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した(図1)。認識後、特性がよく知られているペプチド−HLAの組み合わせに特異的な5種類のTCRのうちの1つを発現するように操作されたJurkat−LuciaレポーターT細胞が活性化され、活性化T細胞の核因子(NFAT)を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターCD8 T細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
抗原カセット設計の評価の別の例として、HLA−A*02:01に制限された形でCD8 T細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた5つのヒトクラスI MHCエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した(図2A、3、5A)。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、HLA−A2トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した(図4)。このマウスモデルは、ヒトHLA−A*0201及びマウスH2−Kbから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトHLA−A2.1のリーダー、マウスα3に連結されたα1及びα2ドメイン、膜貫通及び細胞質H2−Kbドメインで構成されたキメラクラスI MHC分子をコードしている(Vitiello et al.,1991)。このキメラ分子は、HLA−A*02:01に制限された抗原提示を可能とする一方で、CD8共受容体とMHC上のα3ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
*技術的なエラーによりT細胞応答がみられなかったと疑われる。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図2〜5、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25mer配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IのエピトープNLVPMVATVは、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILARが、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQが隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられる
という25merペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25mer配列は、それに続く25mer配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25merのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカーによって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカーを隣接させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
それぞれがアミノ酸25個の長さである30個(L)、40個(XL)、または50個(XXL)のエピトープを有する大きな抗原カセットを設計した。これらのエピトープは、腫瘍抗原を含む疾患抗原をモデル化するためのヒト、NHP、及びマウスのエピトープの混合である。図29に、異なる種からのエピトープの一般的な編成を示す。使用したモデル抗原は、ヒト、霊長類、及びマウスモデルについて表37、38、及び39にそれぞれ記載されている。表37、38、及び39のそれぞれは、エピトープの位置、名前、最小エピトープの記述、及びMHCクラスを記載している。
XV.A.ChAd抗原カセット送達ベクターの構築
1つの例では、チンパンジーアデノウイルス(ChAd)を操作して抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ChAdV68ベクターを、AC_000011.1(米国特許第6083716号に記載のSEQ ID NO:2)に基づいて合成し、E1(nt457〜3014)及びE3(nt27,816〜31,332)配列を欠失させた。CMVプロモーター/エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたE1配列の代わりに挿入した。このクローンをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型C68ウイルスの配列を確認するため、単離VR−594をATCCより入手して継代した後、個々に配列決定した(SEQ ID NO:10)。AC_000011.1配列を野生型ChAdV68ウイルスのATCC VR−594配列(SEQ ID NO:10)と比較したところ、6個のヌクレオチドの相違が特定された。1つの例では、改変ChAdV68ベクターを、AC_000011.1に基づいて作製し、対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換した(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
−完全長ChAdVC68配列「ChAdV68.5WTnt」(SEQ ID NO:1);対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換したAC_000011.1配列。
−ATCC VR−594 C68 (SEQ ID NO:10);独立してシークエンシングしたもの;完全長C68。
−ChAdV68.4WTnt.GFP (SEQ ID NO:11);AC_000011.1のE1(nt 577〜3403)及びE3 (nt 27,816〜31,332)配列を欠失させたもの;対応するATCC VR−594ヌクレオチドを4つの位置で置換;GFPレポーターは、欠失させたE1の代わりに挿入されたCMVプロモーター/エンハンサーの制御下にある。
−ChAdV68.4WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:12);AC_000011.1のE1 (nt 577〜3403)及びE3 (nt 27,816〜31,332)配列を欠失させたもの;対応するATCC VR−594ヌクレオチドを4つの位置で置換;モデル新生抗原カセットは、欠失させたE1の代わりに挿入されたCMVプロモーター/エンハンサーの制御下にある。
−ChAdV68.5WTnt.GFP (SEQ ID NO:13);AC_000011.1のE1(nt 577〜3403)及びE3 (nt 27,125〜31,825)配列を欠失させたもの;対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換;GFPレポーターは、欠失させたE1の代わりに挿入されたCMVプロモーター/エンハンサーの制御下にある。
XV.B.1.ChAdベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたHEK293A細胞のトランスフェクション
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、及びChAdV68.5WTnt.MAG25mer)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
8%CO2のインキュベーター内の293FreeStyle(商標)(ThermoFisher社)培地中で増殖させた293F細胞内でChAdV68ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率98%で1mL当たり106細胞に希釈し、1LのShakeフラスコ(Corning社)中、1回の生成操作当たり400mLを使用した。1回の感染当たり目標MOIが3.3よりも高い4mLの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が70%を下回るまで48〜72時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収集し、1×PBS中で洗浄し、再び遠心してから20mLの10mM Tris pH7.4に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を3回行って溶解し、4,300×gで5分間遠心して清澄化した。
ウイルスDNAをCsCl遠心分離により精製した。2つの不連続な勾配の操作を行った。第1は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第2は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
1.1×1012個のウイルス粒子(VP)の消光係数はOD260nmの吸光度の値=1に相当することに基づき、OD260アッセイを用いてVP濃縮を行った。アデノウイルスの2つの希釈度(1:5と1:10)をウイルス溶解バッファー(0.1%SDS,10mM Tris pH7.4,1mM EDTA)中で作った。両方の希釈度でODを2重に測定し、OD260値×希釈係数×1.1×1012VPを掛けることによりVP濃度/mLを測定した。
C57BL/6J系の雌性マウス及びBalb/c系の雌性マウスに、1×108個のChAdV68.5WTnt.MAG25merのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性の筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP(図7)及びChAdV68.5WTnt.GFP(図8)のDNAを、HEK293A細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製(ウイルスプラーク)をトランスフェクションの7〜10日後に観察した。ChAdV68ウイルスプラークを光学(図7A及び8A)及び蛍光顕微鏡法(図7B〜C、及び図8B〜C)を使用して可視化した。GFPは、増殖性ChAdV68ウイルス送達粒子の生成を示す。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、及びChAdV68.5WTnt.MAG25merウイルスをHEK293F細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの18日後に生成した(図9)。精製ChAdV68ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス5型(Ad5)及びChAdVY25(近縁のChAdV;Dicks,2012,PloS ONE7,e40385)ウイルスストックと比較した。ChAdV68ウイルス力価は、Ad5及びChAdVY25と同等であった(表7)。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKLに対するT細胞応答をC57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図15に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25merによるマウスの免疫後に対照に対して強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25merで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
XVI.A.アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
RNAを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドDNAをPmeIによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し(GeneJet DNA cleanup kit,Thermo社)、テンプレートとして使用した。RiboMAX Large Scale RNA production System(Promega社)をm7Gキャップアナログ(Promega社)と共に製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。RNeasy kit(Qiagen社)を製造者の指示にしがって使用してmRNAを精製した。
HEK293A細胞を、96ウェルのウェル当たり6e4細胞で、24ウェルのウェル当たり2e5細胞で、トランスフェクションの約16時間前に播種した。細胞にMessengerMAXリポフェクタミン(Invitrogen社)を製造者のプロトコールにしたがって使用してmRNAをトランスフェクションした。96ウェルでは、ウェル当たり0.15uLのリポフェクタミン及び10 ng のmRNAを使用し、24ウェルでは、ウェル当たり0.75uLのリポフェクタミン及び150ngのmRNAを使用した。GFPを発現するmRNA(TriLink Biotechnologies社)をトランスフェクションの対照として使用した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の96ウェルプレートで、ONE−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega社)を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をSpectraMaxを使用して測定した。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの2時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったmRNAをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でRLT plus lysis buffer(Qiagen社)中に収集し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってQiaShredder(Qiagen社)を使用してホモジナイズし、RNeasy kit(Qiagen社)を使用してRNAを抽出した。Nanodrop(Thermo Scientific社)を使用して全RNAを定量した。製造者のプロトコールにしたがってqTower3 (Analytik Jena)でQuantitect Probe One−Step RT−PCR kit(Qiagen社)を使用し、反応当たり20ngの全RNAを使用してqRT−PCRを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ActinまたはGusBを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー/プローブはIDT社により生成されたものである(表8)。
C57BL/6J系マウスの左下脇腹に105個のB16−OVA細胞/動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、3日間にわたって増殖させた。
Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。Ad5ワクチンについては、マウスに5×1010個のウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗CTLA−4(クローン9D9,BioXcell社)、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各時点においてマウスに腹腔内注射により150mg/kgのルシフェリン基質を注射し、注射の10〜15分後にIVISインビボイメージングシステム(PerkinElmer社)を使用して生物発光を測定した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI:10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
XVI.B.1.アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、抗原発現システム用のRNAアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)(Venezuelan Equine Encephalitis(VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400−413)ベースの自己複製RNA(srRNA)ベクターから生成した。1つの例では、26Sサブゲノムプロモーターの3’側に位置するVEEの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ(VEE配列の7544〜11,175を欠失させた。番号付けはKinney et al 1986に基づく。SEQ ID NO:6)、抗原配列(SEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:4)またはルシフェラーゼレポーター(例えばVEE−ルシフェラーゼ、SEQ ID NO:15)に置き換えた(図10)。RNAをインビトロでsrRNA DNAベクターから転写させ、HEK293A細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする(非複製)mRNAを比較のためにトランスフェクトした。VEE−ルシフェラーゼのsrRNAでは、2時間の測定値を23時間の測定値と比較した場合にsrRNAレポーターシグナルの約30,000倍の増大が観察された(表9)。これに対して、同じ時間でのmRNAレポーターのシグナルの増大は10倍未満であった(表9)。
別の例において、VEE−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された10ugのVEE−ルシフェラーゼsrRNAを注射し、注射の24及び48時間後、ならびに7及び14日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の24時間後に検出され、時間と共に増大し、srRNA注射の7日後にピークとなった(図11)。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL)エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF;Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸がん細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF;Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
*Vax群のマウス#6からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、マウスCT26腫瘍モデルで評価した。
腫瘍の注入
Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アーム(各群当たりマウス28〜40匹)をランダムカセット配列し、処置を開始した。Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。各実験アームは表15に詳細に記載したとおりである。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのVEE−MAG25mer srRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。C68ワクチンについては、マウスに1×1011個のChAdV68.5WTnt.MAG25merのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE−MAG25mer srRNAの異種プライム/ブースト、またはVEE−MAG25mer srRNAの同種プライム/ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表15に詳細に、また表16により一般的に記載したとおりである。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類(NHP)において評価した。
プライミングワクチンを各NHPで筋肉内(IM)注射して実験を開始した(ワクチンプライム)。1回以上のブースターワクチン(ワクチンブースト)も各NHPに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
Mamu−A*01インドアカゲザルを、LNP−1またはLNP−2中で製剤化した1×1012個のウイルス粒子(注射1回当たり5×1011個のウイルス粒子)のChAdV68.5WTnt.MAG25mer、30ugのVEE−MAG25mer srRNA、100ugのVEE−MAG25mer srRNA、または300ugのVEE−MAG25mer srRNAで両側性に免疫した。30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25mer srRNAのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
PBMCを、プライムワクチン接種後の示した時間にLymphocyte Separation Medium(LSM,MP Biomedicals社)及びLeucoSep分離チューブ(Greiner Bio−One社)を使用して単離し、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだRPMIに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ELISpotまたはフローサイトメトリー法を用いてT細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた6種類の異なるアカゲザルMamu−A*01クラスIエピトープに対するT細胞応答を、ELISpot(ex vivo enzyme−linked immunospot)(エクスビボ酵素結合免疫スポット)分析を用いてIFN−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、PBMCから観測した。サルIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISpot分析を行った。200,000個のPBMCを、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入した。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25mer srRNAの30μg及び100μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25merとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、(b)LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25mer srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25mer srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25merによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の1、2、3、4、5、6、8、9、及び10週後に測定した。表21に示すように、各動物に、4及び8週目に、LNP1またはLNP2のいずれかと製剤化した用量30μgまたは100μgのVEE−MAG25mer srRNAによるブースト免疫を行った。6種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした(図20A〜D及び表22〜25)。
この実験は、(a)同種のプライム/ブーストまたは異種のプライム/ブーストとしてのVEE−MAG25mer srRNAの300μgの用量とChAdV68.5WTnt.MAG25merとの組み合わせの免疫原性を評価し、(b)用量300μgで、LNP2に対してLNP1を使用した脂質ナノ粒子中のVEE−MAG25mer srRNAの免疫応答を比較し、(c)VEE−MAG25mer srRNA及びChAdV68.5WTnt.MAG25merによる免疫化に対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。
Mamu−A*01インドアカゲザルを、ChAdV68.5−WTnt.MAG25merで免疫化した。6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する末梢血単核細胞(PBMC)中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24週後に測定した(図21及び表27)。動物に、4、12、及び20週目にLNP2製剤を用いてVEE−MAG25mer srRNAによる免疫化を行った。最初のChAdV68.5WTnt.MAG25merによる初期免疫化の4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24週後に、PBMC106個当たり1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828、または3043SFC(6つのエピトープの合計)の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された(図21)。VEE−MAG25mer srRNAによる2度目のブースト免疫化の1週後(13週目)に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前(12週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。VEE−MAG25mer srRNAによる3度目のブースト免疫化の1週後(21週目)に測定された免疫応答は、2度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前(20週目)に測定された免疫応答よりも約3倍高かった。
本発明の一実現形態では、srRNAの用量範囲実験を、mamuA01インドアカゲザルで実施することによって、どのsrRNA用量をNHP免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。1つの例では、MamuA01インドアカゲザルに、複数のmamuA01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたsrRNAベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗CTLA−4モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで1つの動物群でワクチン流入領域のリンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、2週間ごとにPBMCを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する(表30)。
抗原ベクターを用いて免疫原性を実証するため、mamuA01のインドアカゲザル(NHP)でワクチン実験を行った。図34は、ワクチン接種の手法を示す。NHPの3つのグループを、チェックポイント阻害剤として抗CTLA−4抗体であるイピリムマブ(グループ5及び6)と共に、またはチェックポイント阻害剤なし(グループ4)で、ChAdV68.5−WTnt.MAG25merで免疫した。抗体は、静脈内(グループ5)または皮下(グループ6)投与した。三角は、0週目及び32週目におけるchAd68によるワクチン接種(1e12vp/動物)を示す。丸は、0、4、12、20、28、及び32週目におけるアルファウイルスワクチン接種を示す。
アカゲザルを、抗CTLA4と、または抗CTLA4なしで、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE−MAG25merのsrRNA異種プライミング/ブーストレジメンで免疫してから、ChAdV68.5WTnt.MAG25merで再びブーストした。各グループを、最後のChAdV68の投与の11ヶ月後(実験18ヶ月目)に、記載されるようにELISpotを行って評価した。図38及び表43は、免疫前(左パネル)及び18ヶ月後(右パネル)にELISpotにより測定した6種類の異なるMamu−A*01制限エピトープに対する細胞応答を示す。制限エピトープに対する応答の検出は、ChAdV68/samRNAワクチンプロトコールによって抗原特異的メモリー応答が生じたことを示す。
抗原と免疫チェックポイント阻害剤を共発現するベクター(複数可)を遺伝子操作により作製する。
1つの例では、チンパンジーアデノウイルスベクターを、モデル抗原と、免疫チェックポイント阻害剤として抗CTLA4とを発現するように設計する。
以下の5’から3’にかけての方向で以下のフォーマット(図26を参照):[CMV−モデル抗原/GFP−IRES−抗CTLA4−SV40]の発現カセットを、欠失させたE1領域に導入したE1/E3欠失ChAdV68ウイルスベクターを設計した。カセット発現は、モデル抗原カセット(またはGFPレポーター)の5’側に配置されたサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター及び抗CTLA4抗体の3’側のSV−40ポリアデニル化シグナルによって誘導した。モデル抗原カセットは、セクションXIV.B.4(SEQ ID NO:34)で上記に述べたMAG25merカセットとした。抗原カセット(またはGFPレポーター)と抗CTLA4抗体とは、同じ転写産物からモデル抗原と抗CTLA4抗体との別々の翻訳を可能とするIRES配列によって分離した。抗CTLA4抗体ヌクレオチドは、Genbank(NCBI番号LQ222660.1及びLQ222658.1)より入手され、その教示のすべてを参照により本明細書に援用するところのPCT公開第WO2016025642号にさらに記載される抗CTLA4クローン9D9配列に基づいたものとした。抗CTLA4抗体の発現カセットは以下のフォーマットで設計した。[完全長の重鎖−フーリン切断部位−T2A部位−完全長の軽鎖]((Fang J,Qian JJ,Yi S,Harding TC,Tu GH,Van Roey M,Jooss K.(2005).Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol.23(5):584−90)に記載されるもの)。ここで、T2A部位はThosea asignaウイルスの2Aペプチドである。可変領域は、9D9の元のアイソタイプに対応したマウスIgG2bの定常領域に付加した。これらのヌクレオチド配列はまた、Genbank配列に対して発現についてコドン最適化した。
抗CTLA4発現ウイルスベクターを、PacI消化したpA68−MAG−o9D9(モデル抗原カセット及び抗CTLA4のo9D9バージョンを発現するChAdV68ベクターを含むプラスミド)、pA68−GFP−IRES−o9D9(GFPレポーター及び抗CTLA4のo9D9バージョンを発現するChAdV68ベクターを含むプラスミド)、及びpA68−GFP−IRES−g9D9(GFPレポーター及び抗CTLA4のg9D9バージョンを発現するChAdV68ベクターを含むプラスミド)を、Fugene6(Promega)を使用して293A細胞にトランスフェクトすることにより作製した。ウイルスベクターを293細胞内で増殖させた後、293F浮遊細胞中で大規模に生産した(400mLスケール)。感染48時間後に細胞を回収し、溶解し、2ラウンドのCsCl勾配によってウイルスを精製した。ウイルスを20mM Tris pH8.0、25mM NaCl、及び2.5%グリセロール中に透析した。精製したウイルスベクターをアリコートに分けて−80℃で保存した。精製したウイルスベクターの感染単位力価を抗カプシドアッセイにより決定した。インビトロ及びインビボ実験では、用量はIU単位に基づくものとした。
293F細胞に後述するウイルスベクターをMOI=1で感染させた。感染後、上清を回収し、プロテインAビーズを用いて抗体を回収した。抗体をビーズから溶出し、4〜20%のSDS−PAGEゲル上で分離した。このゲルを、TBST−5%乾燥ミルク中、希釈率1:2,500でヤギ抗マウスHRP結合抗体(Millipore,AP124P)を用い、次いで化学発光検出試薬(Thermofisher,ECL Plus)を用いてウェスタンブロット分析にかけた。
C56F1マウスに、後述するウイルスベクターを前脛骨筋に両側性に筋肉内(IM)注射で投与することでIU=1.5e7または1.5e6で投与した。抗CTLA4を同時投与したマウスに、週2回、250μgで腹腔内(IP)投与により抗体を投与した。投与グループ、用量、経路、及び注射のタイミングを下記に示す。抗原特異的T細胞を、ELISpot及び細胞内サイトカインの染色により測定した。異なる時点で血清を得て、抗CTLA4濃度をELISAにより測定した。
上記に述べたようにしてウイルスを産生し、定量した。インビボ実験で用いたchAd68−o9D9ロット番号CS110617Eを下記に示す。
293F細胞に以下のウイルスベクター、ChAdVC68−MAG25mer−IRES−o9D9(「5WT−MAG−o9D9」)、ChAdVC68−GFP−IRES−o9D9、及びChAdVC68−GFP−IRES−g9D9を感染させた。上清を感染の7、20、30及び48時間後に回収し、プロテインAビーズを用いて抗体を回収した後、ウェスタンによって分析した。市販の9D9抗体を陽性対照(「(+)ctrl」)として用いた。GFPのみをコードし、抗CTLA 9D9抗体はコードしていないウイルスベクターからの上清を陰性対照(「(−)ctrl」)として用いた。図27に示されるように、9D9抗CTLA4陽性対照の重鎖及び軽鎖に関連するバンドが、感染20時間後から試験した3つのベクターの上清中に存在したのに対して、陰性対照のレーンにはタンパク質のバンドは存在せず、各ベクターが所望の抗CTLA4抗体を発現したことを示している。タンパク質は細胞のライセートのみのレーン(すなわち、タンパク質Aビーズを用いた抗体回収を行わなかった試料)(レーン2)でも認められず、発現された抗体の検出には抗体回収が必要であることを示している。
モデル抗原カセット(MAG)と抗CTLA4抗体(o9D9)を共発現するChAdVC68−MAG25mer−IRES−o9D9 (「chAd−MAG−CTLA4」)を、マウスにおける細胞抗原特異的免疫応答及び血清中の抗CTLA4の発現について評価した。この共発現ベクターによる処置を、同じモデル抗原カセットを発現するが抗CTLA4抗体を発現しないベクター(「chAd−MAG」)を投与したマウス、または同じモデル抗原カセットを発現するが抗CTLA4抗体を発現しないベクターを、9D9抗CTLA4抗体(BioXcellから購入)と同時投与したマウスと比較した。chAdウイルスは、筋肉内(IM)経路で1.5e7または1.5e6のIUで投与した。同時投与される抗CTLA4抗体は用量250μgで腹腔内(IP)注射した。異なるグループを下記表に詳細に記載する。
抗CTLA4の共発現を伴うかまたは伴わない、任意で自己複製RNA(srRNA)と組み合わせたChAdV68を用いて異なる投与プロトコールを、マウスCT26またはB16−OVA腫瘍モデルにおいて評価する。
腫瘍の注入
B16−OVA腫瘍モデルでは、Balb/c系マウスの左下脇腹に105個/動物のB16−OVA細胞を注射する。腫瘍を免疫前の3日間にわたって増殖させる。
モデル抗原カセット(MAG)と抗CTLA4抗体(o9D9)を共発現するChAdVC68−MAG25mer−IRES−o9D9、同じモデル抗原カセットを発現するが抗CTLA4抗体は発現しないベクター、及び/または、9D9抗CTLA4抗体(BioXcellより購入したもの)を同時投与した、同じモデル抗原カセットを発現するが抗CTLA4抗体を発現しないベクターでマウスを免疫する。異なる実験群において、マウスに、同じモデル抗原を発現するアルファウイルスワクチンベクターによるブースト免疫を投与する。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールする。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行う。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解する。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁する。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントする。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整する。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行う。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートする。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像する。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させる。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントする。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外する。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正する。陰性ペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによって陰性バックグラウンドを補正する。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に四捨五入する。
異なる実験群のマウスを、ELISpot及びICSによる細胞抗原特異的免疫応答、血清中の抗CTLA4抗体レベル、腫瘍増殖、及び生存率について評価する。ChAdVC68−MAG25mer−IRES−o9D9による免疫は、改善された免疫応答を示す。
1つの例では、ウイルスベクターを、モデル抗原及び免疫チェックポイント阻害剤の両方を発現するように設計する。免疫チェックポイント阻害剤を共発現するウイルスベクターを、同じモデル抗原を発現するが免疫チェックポイント阻害剤は発現しないベクター、及び/または、免疫チェックポイント阻害剤を同時投与した、同じモデル抗原を発現するが免疫チェックポイント阻害剤は発現しないベクターと比較する。他の免疫調節物質も同じ要領で試験する。
1つの例では、以下の5’から3’にかけての方向で以下のフォーマット:[CMV−モデル抗原/GFP−IRES−免疫チェックポイント阻害剤−SV40]の発現カセットを、欠失させたE1領域に導入したE1/E3欠失ChAdV68ウイルスベクターを設計する。カセット発現は、モデル抗原カセット(またはGFPレポーター)の5’側に配置されたサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター及び免疫チェックポイント阻害剤の3’側のSV−40ポリアデニル化シグナルによって誘導する。モデル抗原カセットは、セクションXIV.B.4(SEQ ID NO:34)で上記に述べたMAG25merカセットとする。抗原カセット(またはGFPレポーター)と免疫チェックポイント阻害剤とは、同じ転写産物からモデル抗原と免疫チェックポイント阻害剤との別々の翻訳を可能とするIRES配列によって隔てられた。免疫チェックポイント阻害剤または免疫調節物質は、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントについて、利用可能な配列、利用可能な抗体のペプチドシークエンシングにより得られる配列及びそれに続く発現用のヌクレオチド配列の設計、またはハイブリドーマのBCRシークエンシングにより得られる配列に基づいたものである。利用可能な免疫チェックポイント阻害剤及び免疫調節物質を下記表35に記載する。配列もまた、発現用に改変され、例えば、クローニングベクターに導入するためにコドン最適化または遺伝子操作される。ヌクレオチドをコードする抗体は、(Fang J,Qian JJ,Yi S,Harding TC,Tu GH,Van Roey M,Jooss K.(2005). Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol.23(5):584−90)に記載される以下のフォーマット:[重鎖−フーリン切断部位−T2A部位−軽鎖]で設計される。ここで、T2A部位はThosea asignaウイルスの2Aペプチドである。可変領域は、マウスIgアイソタイプの定常領域に付加される。
免疫チェックポイント阻害剤発現ウイルスベクターを、Fugene6(Promega)を用いて線状ベクターを293A細胞にトランスフェクトすることにより生成する。ウイルスベクターを293細胞内で増殖させた後、293F浮遊細胞中で大規模に生産する(400mLスケール)。感染48時間後に細胞を回収し、溶解し、2ラウンドのCsCl勾配によってウイルスを精製する。ウイルスを20mM Tris pH8.0、25mM NaCl、及び2.5%グリセロール中に透析する。精製したウイルスベクターをアリコートに分けて−80℃で保存する。精製したウイルスベクターの感染単位力価を抗カプシドアッセイにより決定する。インビトロ及びインビボ実験では、用量はIU単位に基づくものとした。
293F細胞に様々なウイルスベクターをMOI=1で感染させる。感染後、上清を回収し、プロテインAビーズを用いて抗体を回収する。抗体をビーズから溶出し、4〜20%のSDS−PAGEゲル上で分離する。このゲルを、TBST−5%乾燥ミルク中、希釈率1:2,500でヤギ抗マウスHRP結合抗体(Millipore,AP124P)を用い、次いで化学発光検出試薬(Thermofisher,ECL Plus)を用いてウェスタンブロット分析にかける。
マウスを、異なるウイルスベクターを前脛骨筋の両側性の筋肉内(IM)注射により投与して免疫する。免疫チェックポイント阻害剤を発現しないウイルスベクターを投与した選択されたグループのマウスに免疫チェックポイント阻害剤を同時投与した。抗原特異的T細胞を、ELISpot及び細胞内サイトカインの染色により測定する。異なる時点で血清を得て、免疫チェックポイント阻害剤濃度をELISAにより測定する。
免疫チェックポイント阻害剤を共発現するものを含む様々なウイルスベクターを作製し、定量する。免疫チェックポイント阻害剤をコードするウイルスベクターは、免疫チェックポイント阻害剤をインビトロ及び血清中で検出可能なレベルで発現する。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
[式中、Pは、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された前記少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、Nは、前記コードされたペプチド配列を、前記野生型核酸配列によってコードされる前記対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する前記エピトープコード核酸配列の1つを含み、ここでc=1であり、L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、G5は、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)をコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、G3は、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)をコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、X=2〜400であり、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、任意で、各Xについて、対応するNcは異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、Y=0〜2であり、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列であり、任意で、各Yについて、対応するUfは異なるMHCクラスII抗原コード配列である]で記述される。特定の態様において、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=10、Y=2であり、Pは、CMVプロモーター配列であり、各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、L5は、前記MHCIエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、L3は、前記MHCIエピトープの天然のC末端アミノ酸配列をコードし、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、前記ベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている。
抗原カセットを含むベクターシステムであって、
前記抗原カセットが、
(1)少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を任意で含む、エピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と、
をそれぞれが含む、MHCクラスI抗原コード核酸配列
を任意で含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列
を含む、対象内に存在する腫瘍に関連した少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列と、
を含み、
前記ベクターが、任意で前記カセット内に、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列をさらに含み、
任意で、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記核酸配列が、
(1)前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列と、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とを隔てる内部リボソーム進入配列(IRES)配列を有する、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じ転写産物上、または
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と異なる転写産物であって、少なくとも1つの第2のプロモーター配列が、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列に機能的に連結されている、前記異なる転写産物上
に転写される、
前記ベクターシステム。
[本発明1002]
チンパンジーアデノウイルスベクターであって、
a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.免疫チェックポイント阻害剤をコードする核酸配列と、
e.抗原カセットであって、以下:
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、
互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端核酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のC末端核酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と、
を含み、
前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、最後のMHCクラスI抗原コード核酸配列を除いて、各MHCクラスI抗原コード核酸配列の各3’末端が、それに続くMHCクラスI抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、前記MHCクラスI抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第1の核酸配列と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と、前記少なくとも10個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第2の核酸配列と、
(E)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第3の核酸配列と、
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
を含む、前記抗原カセットと、
を含み、
前記抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記抗原カセットに機能的に連結され、
前記チェックポイント阻害剤をコードする前記核酸配列が、
(1)前記チェックポイント阻害剤をコードする前記配列と、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とを隔てる内部リボソーム進入配列(IRES)配列を有する、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じ転写産物上、または
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とは異なる転写産物であって、任意で第2のCMVプロモーター配列が前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列に機能的に連結されているか、もしくは任意で前記少なくとも1つの免疫調節物質が前記E3欠失内に挿入されている、前記異なる転写産物上
に転写される、
前記チンパンジーアデノウイルスベクター。
[本発明1003]
前記ベクターの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’にかけて、下式:
P a −(L5 b −N c −L3 d ) X −(G5 e −U f ) Y −G3 g −A h
で表され、
式中、
Pは、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された前記少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、
Nは、前記コードされたペプチド配列を、前記野生型核酸配列によってコードされる前記対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する前記エピトープコード核酸配列の1つを含み、ここでc=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、
G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、
G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、
Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、
X=2〜400であり、ここで、各Xについて、対応するN c は、エピトープコード核酸配列であり、任意で、各Xについて、対応するN c は、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、
Y=0〜2であり、ここで、各Yについて、対応するU f は、抗原コード核酸配列であり、任意で、各Yについて、対応するU f は、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である、
本発明1001のベクター。
[本発明1004]
b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=10、Y=2であり、
Pが、CMVプロモーター配列であり、
各Nが、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5が、前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
L3が、前記MHC Iエピトープの天然のC末端アミノ酸配列をコードし、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Uが、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記ベクターが、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、
前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている、
本発明1003のベクター。
[本発明1005]
前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードしている、本発明1001〜1004のいずれかのベクター。
[本発明1006]
各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって、異なる抗原コード核酸配列と連結されている、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1008]
前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列をMHCクラスII配列に連結する、本発明1007のベクター。
[本発明1009]
前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)同族の起源タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、本発明1008のベクター。
[本発明1010]
前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列をMHCクラスI配列に連結する、本発明1007のベクター。
[本発明1011]
前記リンカーが、配列GPGPGを含む、本発明1010のベクター。
[本発明1012]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める分離したまたは連続した配列に、機能的または直接的に連結されている、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1013]
前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意で、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、本発明1012のベクター。
[本発明1014]
前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1015]
前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1016]
前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1017]
前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1018]
前記腫瘍が、肺がん、メラノーマ、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1019]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって駆動される、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1020]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1021]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも11、12、13、4、15、16、17、18、19、20、または最大400個の核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1022]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1023]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1024]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個のMHCクラスI及び/またはクラスII抗原コード核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記MHCクラスIまたはクラスII抗原のうちの少なくとも1つが、抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも2〜400個のMHCクラスIまたはクラスII抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって駆動される、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1025]
各MHCクラスI抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個の長さのポリペプチド配列をコードする、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1026]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在している、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1027]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1028]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または20〜40個の長さである、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1029]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、
任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREの少なくとも一方を含む、
本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1030]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、誘導性である、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1031]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、非誘導性である、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1032]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、CMV、SV40、EF−1、RSV、PGK、HSA、MCK、またはEBVプロモーター配列である、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1033]
前記抗原カセットが、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された少なくとも1つのポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含み、任意で、前記ポリA配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の3’側に位置する、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1034]
前記ポリA配列が、ウシ成長ホルモン(BGH)SV40のポリA配列を含む、本発明1033のベクター。
[本発明1035]
前記抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、2A自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、mRNAの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている5’または3’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1036]
前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼ変異体を含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1037]
前記少なくとも1つの免疫調節物質が、免疫チェックポイント分子を阻害する、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1038]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1037のベクター。
[本発明1039]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長IgG)である、本発明1038のベクター。
[本発明1040]
前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、任意で自己切断配列の5’側にフーリン切断部位配列を有する、2Aなどの自己切断配列によって、もしくはIRES配列によって隔てられた連続的配列であるか、または
前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、連続したグリシン残基などの柔軟なリンカーによって連結されている、
本発明1038または1039のベクター。
[本発明1041]
前記免疫調節物質がサイトカインである、本発明1037のベクター。
[本発明1042]
前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21の少なくとも1つ、またはそれぞれのその変異体である、本発明1041のベクター。
[本発明1043]
前記ベクターがチンパンジーアデノウイルスベクターであり、任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターがChAdV68ベクターであるか、または
前記ベクターがsrRNAベクターであり、任意で前記srRNAベクターがベネズエラウマ脳炎ウイルスsrRNAベクターである、
本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1044]
SEQ ID NO:1に記載の配列を含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1045]
前記ベクターが、SEQ ID NO:1に記載の配列におけるチンパンジーアデノウイルスE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いてSEQ ID NO:1に記載の配列を含み、
任意で、SEQ ID NO:1に記載の配列の(1)E1A及びE1B、(2)E1A、E1B、及びE3、または(3)E1A、E1B、E3、及びE4が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている、
本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1046]
前記ベクターが、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、
任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルス末端逆位繰り返し配列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される、
本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1047]
前記抗原カセットが、E1領域、E3領域、及び/または、前記抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたAdV領域において、ベクターに挿入されている、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1048]
第1世代、第2世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの1つから生成される、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1049]
SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号577〜3403、または塩基対456〜3014に1つ以上の欠失を含み、任意で、塩基対27,125〜31,825、または塩基対27,816〜31,333に1つ以上の欠失をさらに含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1050]
SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号3957〜10346、塩基対番号21787〜23370、及び塩基対番号33486〜36193に1つ以上の欠失をさらに含む、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1051]
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、以下の工程:
腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノム腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程;
抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程;ならびに
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程
を行うことによって選択される、本発明1002または1004を除く、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1052]
前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、以下の工程:
腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノム腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程;
抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程;ならびに
前記少なくとも2つのMHCクラスI抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程
を行うことによって選択される、本発明1002のベクター。
[本発明1053]
前記選択された抗原のセットの数が、2〜20である、本発明1051のベクター。
[本発明1054]
前記提示モデルが、
前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示尤度と
の間の依存性を表す、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1055]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1056]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1057]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1058]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1059]
前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記対象の正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1060]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織においてシークエンシングを行うことによって取得される、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1061]
前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1062]
前記抗原カセットが、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1063]
少なくとも1つの、または各ジャンクションエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、本発明1062のベクター。
[本発明1064]
各ジャンクションエピトープ配列が、非自己である、本発明1062または1063のベクター。
[本発明1065]
前記抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1066]
前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である、本発明1065のベクター。
[本発明1067]
前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、本発明1062または1066のベクター。
[本発明1068]
前記抗原カセット内における前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、以下を含む一連の工程:
1.前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程;
2.前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程;及び
3.所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程
によって決定される、本発明1062〜1067のいずれかのベクター。
[本発明1069]
先行本発明のいずれかの前記ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1070]
アジュバントをさらに含む、本発明1069の医薬組成物。
[本発明1071]
免疫調節物質をさらに含む、本発明1069または1070の医薬組成物。
[本発明1072]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1071の医薬組成物。
[本発明1073]
先行するベクターの発明のいずれかの抗原カセットと、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子とを含む、単離ヌクレオチド配列であって、任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、前記単離ヌクレオチド配列。
[本発明1074]
本発明1073のヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で前記細胞が、CHO、HEK293もしくはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
[本発明1075]
本発明1073のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
[本発明1076]
先行するベクターの発明のいずれかのベクターと、使用説明書とを含む、キット。
[本発明1077]
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行するベクターの発明のいずれかのベクター、または本発明1069〜1070のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1078]
前記ベクターまたは組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記対象に免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記ベクターまたは医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、本発明1077または1078の方法。
[本発明1080]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、本発明1079の方法。
[本発明1082]
前記皮下投与が、前記ベクターまたは組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、本発明1077〜1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物の投与の前に投与される、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物の投与の後に投与される、本発明1083の方法。
[本発明1086]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物と同じである、本発明1084または1085の方法。
[本発明1087]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物と異なる、本発明1084または1085の方法。
[本発明1088]
前記第2のワクチン組成物がチンパンジーアデノウイルスベクターを含み、任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターがChAdV68ベクターであるか、または
前記第2のワクチン組成物がsrRNAベクターを含み、任意で前記srRNAベクターがベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであり、
任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列を含む、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行するベクターの発明のいずれかの前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じであり、任意で、前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターによってコードされる前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列が、先行する本発明のいずれかの前記少なくとも1つの免疫調節物質と同じである、本発明1088の方法。
[本発明1090]
先行するベクターの発明のいずれかのベクターの製造方法であって、
前記少なくとも1つのプロモーター配列と前記抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、
前記プラスミド配列を1つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、
前記1つ以上の宿主細胞から前記ベクターを単離することと、
を含む、前記製造方法。
[本発明1091]
前記単離することが、
前記ベクターを含む細胞ライセートを得るために、前記1つ以上の宿主細胞を溶解することと、
前記細胞ライセートから、及び任意で、前記1つ以上の宿主細胞を培養するために用いた培地からも、前記ベクターを精製することと、
を含む、本発明の製造方法。
[本発明1092]
前記プラスミド配列が、以下のうちの1つ、すなわち、DNA組換え、または細菌組換え、または全ゲノムDNA合成、または細菌細胞内での合成DNAの増幅を伴う全ゲノムDNA合成、を用いて生成される、本発明1090または1091の製造方法。
[本発明1093]
前記1つ以上の宿主細胞が、CHO、HEK293またはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、及びAE1−2a細胞のうちの少なくとも1つである、本発明1090〜1092のいずれかの製造方法。
[本発明1094]
前記細胞ライセートから前記ベクターを精製することが、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの1つ以上を含む、本発明1091〜1093のいずれかの製造方法。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
ペプチドYVYVADVAAK(SEQ ID NO:85)を用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図24A及び24Bに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに充分であるように見えることを示す。質量分析を本明細書に記載される予測アルゴリズムと組み合わせて用いてHLAの提示を検証することができる。例えば、質量分析を用いてEDGE提示モデルによって生成されたエピトープ候補を検証することができる(国際特許出願公開第WO/2017/106638号、同第WO/2018/195357号、及び同第WO/2018/208856号に記載される、MS/MSによりシークエンシングされたHLA提示ペプチド上で訓練されたディープラーニングモデル)。標的化MSによるEDGEスコアと候補共有新生抗原ペプチドの検出確率との間の相関の例を図25に示す。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(SEQ ID NO:86)(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:87)(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:88)(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(SEQ ID NO:89)(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCVIRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内因性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV(SEQ ID NO:86)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:87)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:90)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO:89)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:88))及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV(SEQ ID NO:91)、FLLTRICT(SEQ ID NO:92))をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM+1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図2〜5、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25mer配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IのエピトープNLVPMVATV(SEQ ID NO:86)は、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILAR(SEQ ID NO:93)が、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQ(SEQ ID NO:94)が隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられる
(SEQ ID NO:95)という25merペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25mer配列は、それに続く25mer配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25merのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカーを隣接させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKL(SEQ ID NO:83)に対するT細胞応答をC57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図15に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25merによるマウスの免疫後に対照に対して強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25merで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL(SEQ ID NO:83)及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL(SEQ ID NO:83))エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO:84);Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸がん細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF(SEQ ID NO:112);Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
Claims (94)
- 抗原カセットを含むベクターシステムであって、
前記抗原カセットが、
(1)少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を任意で含む、エピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と、
をそれぞれが含む、MHCクラスI抗原コード核酸配列
を任意で含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列
を含む、対象内に存在する腫瘍に関連した少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列と、
を含み、
前記ベクターが、任意で前記カセット内に、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列をさらに含み、
任意で、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記核酸配列が、
(1)前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列と、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とを隔てる内部リボソーム進入配列(IRES)配列を有する、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じ転写産物上、または
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と異なる転写産物であって、少なくとも1つの第2のプロモーター配列が、前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列に機能的に連結されている、前記異なる転写産物上
に転写される、
前記ベクターシステム。 - チンパンジーアデノウイルスベクターであって、
a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.免疫チェックポイント阻害剤をコードする核酸配列と、
e.抗原カセットであって、以下:
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する少なくとも1つの抗原コード核酸配列であって、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、
互いに直鎖状に連結された、少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI抗原コード核酸配列であって、それぞれが、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然のN末端核酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然のC末端核酸配列をコードし、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と、
を含み、
前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、最後のMHCクラスI抗原コード核酸配列を除いて、各MHCクラスI抗原コード核酸配列の各3’末端が、それに続くMHCクラスI抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、前記MHCクラスI抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも10個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI抗原コード核酸配列
を含む、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第1の核酸配列と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端と、前記少なくとも10個の腫瘍特異的かつ対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列とを連結するGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第2の核酸配列と、
(E)任意で、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端のGPGPGアミノ酸リンカー配列をコードする第3の核酸配列と、
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
を含む、前記抗原カセットと、
を含み、
前記抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記抗原カセットに機能的に連結され、
前記チェックポイント阻害剤をコードする前記核酸配列が、
(1)前記チェックポイント阻害剤をコードする前記配列と、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とを隔てる内部リボソーム進入配列(IRES)配列を有する、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じ転写産物上、または
(2)前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列とは異なる転写産物であって、任意で第2のCMVプロモーター配列が前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする前記配列に機能的に連結されているか、もしくは任意で前記少なくとも1つの免疫調節物質が前記E3欠失内に挿入されている、前記異なる転写産物上
に転写される、
前記チンパンジーアデノウイルスベクター。 - 前記ベクターの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’にかけて、下式:
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
で表され、
式中、
Pは、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された前記少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、
Nは、前記コードされたペプチド配列を、前記野生型核酸配列によってコードされる前記対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を有する前記エピトープコード核酸配列の1つを含み、ここでc=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、
G5は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、
G3は、GPGPGアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、
Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、
X=2〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、エピトープコード核酸配列であり、任意で、各Xについて、対応するNcは、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、
Y=0〜2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、抗原コード核酸配列であり、任意で、各Yについて、対応するUfは、異なるMHCクラスII抗原コード核酸配列である、
請求項1に記載のベクター。 - b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=10、Y=2であり、
Pが、CMVプロモーター配列であり、
各Nが、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5が、前記MHC Iエピトープの天然のN末端アミノ酸配列をコードし、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
L3が、前記MHC Iエピトープの天然のC末端アミノ酸配列をコードし、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸3個の長さであるペプチドをコードし、
Uが、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記ベクターが、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、
前記MHCクラスI抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている、
請求項3に記載のベクター。 - 前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードしている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
- 各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、リンカーをコードする核酸配列によって、異なる抗原コード核酸配列と連結されている、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列をMHCクラスII配列に連結する、請求項7に記載のベクター。
- 前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)同族の起源タンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、請求項8に記載のベクター。 - 前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列をMHCクラスI配列に連結する、請求項7に記載のベクター。
- 前記リンカーが、配列GPGPGを含む、請求項10に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める分離したまたは連続した配列に、機能的または直接的に連結されている、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意で、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、請求項12に記載のベクター。
- 前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示尤度を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記腫瘍が、肺がん、メラノーマ、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、及び小細胞肺がんからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって駆動される、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸配列を含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、少なくとも11、12、13、4、15、16、17、18、19、20、または最大400個の核酸配列を含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個のMHCクラスI及び/またはクラスII抗原コード核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記MHCクラスIまたはクラスII抗原のうちの少なくとも1つが、抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記腫瘍細胞表面上の前記抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも2〜400個のMHCクラスIまたはクラスII抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって駆動される、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 各MHCクラスI抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在している、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列を含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または20〜40個の長さである、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、
任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREの少なくとも一方を含む、
請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、誘導性である、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、非誘導性である、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、CMV、SV40、EF−1、RSV、PGK、HSA、MCK、またはEBVプロモーター配列である、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記抗原カセットが、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された少なくとも1つのポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含み、任意で、前記ポリA配列が、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の3’側に位置する、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ポリA配列が、ウシ成長ホルモン(BGH)SV40のポリA配列を含む、請求項33に記載のベクター。
- 前記抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、2A自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フーリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された、mRNAの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている5’または3’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP変異体、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼ変異体を含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの免疫調節物質が、免疫チェックポイント分子を阻害する、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項37に記載のベクター。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異性のもしくは互いに連結された多重特異性としての単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、柔軟なリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長IgG)である、請求項38に記載のベクター。
- 前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、任意で自己切断配列の5’側にフーリン切断部位配列を有する、2Aなどの自己切断配列によって、もしくはIRES配列によって隔てられた連続的配列であるか、または
前記抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列とが、連続したグリシン残基などの柔軟なリンカーによって連結されている、
請求項38または39に記載のベクター。 - 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項37に記載のベクター。
- 前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21の少なくとも1つ、またはそれぞれのその変異体である、請求項41に記載のベクター。
- 前記ベクターがチンパンジーアデノウイルスベクターであり、任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターがChAdV68ベクターであるか、または
前記ベクターがsrRNAベクターであり、任意で前記srRNAベクターがベネズエラウマ脳炎ウイルスsrRNAベクターである、
請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - SEQ ID NO:1に記載の配列を含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターが、SEQ ID NO:1に記載の配列におけるチンパンジーアデノウイルスE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いてSEQ ID NO:1に記載の配列を含み、
任意で、SEQ ID NO:1に記載の配列の(1)E1A及びE1B、(2)E1A、E1B、及びE3、または(3)E1A、E1B、E3、及びE4が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている、
請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - 前記ベクターが、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、
任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルス末端逆位繰り返し配列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される、
請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - 前記抗原カセットが、E1領域、E3領域、及び/または、前記抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたAdV領域において、ベクターに挿入されている、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 第1世代、第2世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターの1つから生成される、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号577〜3403、または塩基対456〜3014に1つ以上の欠失を含み、任意で、塩基対27,125〜31,825、または塩基対27,816〜31,333に1つ以上の欠失をさらに含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号3957〜10346、塩基対番号21787〜23370、及び塩基対番号33486〜36193に1つ以上の欠失をさらに含む、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、以下の工程:
腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノム腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程;
抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程;ならびに
前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程
を行うことによって選択される、請求項2または4を除く、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - 前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、以下の工程:
腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノム腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程;
抗原のそれぞれが腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的尤度のセットを生成するために、各抗原のペプチド配列を提示モデルに入力する工程であって、前記数値的尤度のセットが、受け取られた質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記入力する工程;ならびに
前記少なくとも2つのMHCクラスI抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された抗原のセットを生成するために、前記抗原のセットのサブセットを、前記数値的尤度のセットに基づいて選択する工程
を行うことによって選択される、請求項2に記載のベクター。 - 前記選択された抗原のセットの数が、2〜20である、請求項51に記載のベクター。
- 前記提示モデルが、
前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示尤度と
の間の依存性を表す、請求項51または52に記載のベクター。 - 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されない抗原と比べて、前記対象の正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織においてシークエンシングを行うことによって取得される、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記抗原カセットが、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 少なくとも1つの、または各ジャンクションエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、請求項62に記載のベクター。
- 各ジャンクションエピトープ配列が、非自己である、請求項62または63に記載のベクター。
- 前記抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である、請求項65に記載のベクター。
- 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づいたものである、請求項62または66に記載のベクター。
- 前記抗原カセット内における前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の順序が、以下を含む一連の工程:
1.前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列の様々な順序に対応した候補抗原カセット配列のセットを生成する工程;
2.前記各候補抗原カセット配列について、前記候補抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程;及び
3.所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、抗原ワクチン用の抗原カセット配列として選択する工程
によって決定される、請求項62〜67のいずれか1項に記載のベクター。 - 先行請求項のいずれか一項に記載の前記ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項69に記載の医薬組成物。
- 免疫調節物質をさらに含む、請求項69または70に記載の医薬組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項71に記載の医薬組成物。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載の抗原カセットと、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子とを含む、単離ヌクレオチド配列であって、任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択され、任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、前記単離ヌクレオチド配列。
- 請求項73に記載のヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で前記細胞が、CHO、HEK293もしくはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
- 請求項73に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクターと、使用説明書とを含む、キット。
- がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクター、または請求項69〜70のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記ベクターまたは組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、請求項77に記載の方法。
- 前記対象に免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記ベクターまたは医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項77または78に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項79に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、請求項79に記載の方法。
- 前記皮下投与が、前記ベクターまたは組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項81に記載の方法。
- 前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項77〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか1項に記載のベクターまたは医薬組成物の投与の前に投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか1項に記載のベクターまたは医薬組成物の投与の後に投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか1項に記載のベクターまたは医薬組成物と同じである、請求項84または85に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか1項に記載のベクターまたは医薬組成物と異なる、請求項84または85に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物がチンパンジーアデノウイルスベクターを含み、任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターがChAdV68ベクターであるか、または
前記第2のワクチン組成物がsrRNAベクターを含み、任意で前記srRNAベクターがベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターであり、
任意で前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターが、少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列を含む、請求項87に記載の方法。 - 前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターによってコードされる前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載の前記少なくとも1つの抗原コード核酸配列と同じであり、任意で、前記チンパンジーアデノウイルスベクターまたは前記srRNAベクターによってコードされる前記少なくとも1つの免疫調節物質をコードする核酸配列が、先行する請求項のいずれか一項に記載の前記少なくとも1つの免疫調節物質と同じである、請求項88に記載の方法。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクターの製造方法であって、
前記少なくとも1つのプロモーター配列と前記抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、
前記プラスミド配列を1つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、
前記1つ以上の宿主細胞から前記ベクターを単離することと、
を含む、前記製造方法。 - 前記単離することが、
前記ベクターを含む細胞ライセートを得るために、前記1つ以上の宿主細胞を溶解することと、
前記細胞ライセートから、及び任意で、前記1つ以上の宿主細胞を培養するために用いた培地からも、前記ベクターを精製することと、
を含む、請求項に記載の製造方法。 - 前記プラスミド配列が、以下のうちの1つ、すなわち、DNA組換え、または細菌組換え、または全ゲノムDNA合成、または細菌細胞内での合成DNAの増幅を伴う全ゲノムDNA合成、を用いて生成される、請求項90または91に記載の製造方法。
- 前記1つ以上の宿主細胞が、CHO、HEK293またはその変異体、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、及びAE1−2a細胞のうちの少なくとも1つである、請求項90〜92のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記細胞ライセートから前記ベクターを精製することが、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの1つ以上を含む、請求項91〜93のいずれか一項に記載の製造方法。
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