JP2022512912A - アルファウイルス新生抗原ベクター及びインターフェロン阻害因子 - Google Patents

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Abstract

本明細書において、アルファウイルスに基づく発現プラットフォームを含むベクターを開示する。更に、前記アルファウイルスに基づく発現プラットフォームと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の同時投与とに関連する方法も開示する。【選択図】図２６Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／７５６，９８０号の利益を主張し、これによりすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出された配列表を含み、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月７日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＧＳＯ＿０２３ＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、４２２，１９４バイトのサイズである。
背景
腫瘍特異的な抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。１～３例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、そのような治療法の特に有望な標的である。４，５初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がＴ細胞応答を誘発し６、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こし得る７ことが示されている。
現行の新生抗原予測法の課題に加えて、その多くがヒト由来のものである、ヒトにおける新生抗原送達に使用することができる既存のベクターシステムにもやはり特定の課題が存在する。例えば、多くのヒトは、過去の自然の曝露の結果としてヒトウイルスに対する既存の免疫を有しており、この免疫ががん治療を行うために新生抗原を送達するための組換えヒトウイルスの使用にとって大きな障害となり得る。
アルファウイルスに基づくベクターは、送達プラットフォームとして使用されてきた。しかし、アルファウイルスに基づくベクターに対する免疫応答は、送達プラットフォームとしての有効性を低下させる場合がある。
特にアルファウイルスに基づくベクターの場合、例えば、がんワクチンの場合には、改善された送達方法が依然として必要である。
概要
本明細書は、対象の免疫応答を刺激するための方法を開示し、該方法は、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物は発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに、（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、ｂ．任意で５’リンカー配列、及びｃ．任意で３’リンカー配列を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、（ｉｉ）任意で、少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列とを含む、前記カセットを含む。
本明細書は、対象の免疫応答を刺激するための方法も開示し、該方法は、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物が発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格が配列番号６に記載の核酸配列を含み、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、２６Ｓプロモーター配列がＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性であり、ポリ（Ａ）配列がＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性である、ＲＮＡアルファウイルス骨格、及び、（ｂ）２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列とポリ（Ａ）配列との間に組み込まれた新生抗原カセットであって、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結されており、少なくとも１つの核酸配列を含み、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列と、ｂ．任意で５’リンカー配列と、ｃ．任意で３’リンカー配列とを含む、前記カセットを含み、ここで、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子が抗ＩＦＮαβ受容体（ＩＦＮＡＲ）遮断抗体を含む。
本明細書は、がんを有する対象を治療するための方法も開示し、該方法は、発現システムを送達するための治療上有効な量の組成物を対象に投与することと、治療上有効な量のＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物が発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、及び、（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、ｂ．任意で５’リンカー配列、及びｃ．任意で３’リンカー配列を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、（ｉｉ）任意で、少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列とを含む、前記カセットを含む。
本明細書は、対象の腫瘍体積を低減させるための方法も開示し、前記方法は、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物が発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、及び、（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、ｂ．任意で５’リンカー配列、及びｃ．任意で３’リンカー配列を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、（ｉｉ）任意で、少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列とを含む、前記カセットを含む。
本明細書は、対象の腫瘍特異的な免疫応答を刺激するための方法も開示し、前記方法は、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物が発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに、（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、ｂ．任意で５’リンカー配列、及びｃ．任意で３’リンカー配列を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、（ｉｉ）任意で、少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列とを含む、前記カセットを含む。
本明細書は、アルファウイルスに基づく発現システムの送達を強化する方法も開示し、該方法は、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を対象に投与することとを含み、ここで、発現システムを送達するための組成物が発現システムを含み、発現システムは１つ以上のベクターを含み、前記１つ以上のベクターは、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列とを含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに（ｂ）カセットであって、（ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、ｂ．任意で５’リンカー配列、及びｃ．任意で３’リンカー配列とを含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、（ｉｉ）任意で、少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列とを含む、前記カセットを含む。
いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、ポリペプチドコード核酸配列を含む。いくつかの態様で、ポリペプチドコード核酸配列は、抗原コード核酸配列をコードする。いくつかの態様で、抗原コード核酸配列は、エピトープコード核酸配列である。いくつかの態様で、抗原コード核酸配列は、コードされたエピトープへの抗原プロセシングを受けることが可能なポリペプチド配列をコードする。いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、細胞の表面上にＭＨＣクラスＩによって提示されることが知られているまたは疑われているエピトープをコードし、任意で、細胞の表面は腫瘍細胞表面または感染細胞表面であり、任意で、細胞は対象の細胞である。いくつかの態様で、細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される腫瘍細胞である、または、細胞は、病原体感染細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞、及び寄生虫感染細胞からなる群から選択される感染細胞である。いくつかの態様で、ウイルス感染細胞は、ＨＩＶ感染細胞である。
いくつかの態様で、ポリペプチドコード核酸配列は、完全長タンパク質またはその機能的部分をコードする。いくつかの態様で、完全長タンパク質またはその機能的部分は、抗体、サイトカイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、及びゲノム編集システムヌクレアーゼからなる群から選択される。
いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、非コード核酸配列を含む。いくつかの態様で、非コード核酸配列は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリヌクレオチドまたはゲノム編集システムポリヌクレオチドである。
いくつかの態様で、カセットは、（ｉ）ポリペプチドコード核酸配列を含む少なくとも１つの核酸配列であって、前記ポリペプチドコード核酸配列が、抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列と、ｂ．任意で５’リンカー配列と、ｃ．任意で３’リンカー配列とを含む、前記少なくとも１つの核酸配列、（ｉｉ）任意で、抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列、（ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列、及び（ｖ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、カセットの各要素の順番に並べられた配列は、５’から３’方向へ、式：
Ｐａ－（Ｌ５ｂ－Ｎｃ－Ｌ３ｄ）Ｘ－（Ｇ５ｅ－Ｕｆ）Ｙ－Ｇ３ｇ
で記載され、
式中、Ｐは第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここでａ＝０または１であり、Ｎは、エピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、エピトープコード核酸配列はＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ここでｃ＝１であり、Ｌ５は５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、Ｌ３は３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、Ｕは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここで、ｆ＝１であり、Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、かつＹ＝０、１または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、エピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｘについて、対応するＮｃは、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、各Ｙについて、対応するＵｆは、異なるＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である。いくつかの態様では、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、Ｌ５は、ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｌ３は、ＭＨＣ Ｉエピトープの天然の末端核酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、Ｕは、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列）のそれぞれであり、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、配列番号６に記載の配列であり、かつＭＨＣクラスＩ新生抗原コード核酸配列のそれぞれは、アミノ酸１３個～２５個の長さのポリペプチドをコードする。
いくつかの態様で、発現システムを送達するための組成物は、ナノ粒子状送達ビヒクルを更に含む。いくつかの態様で、ナノ粒子状送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。いくつかの態様では、ＬＮＰは、イオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの態様では、イオン化可能なアミノ脂質は、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは発現システムを封入する。
いくつかの態様では、発現システムを送達するための組成物は、複数のＬＮＰを更に含み、ＬＮＰは、新生抗原発現システムと、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質とを含み、複数のＬＮＰのうち、少なくとも約９５％のＬＮＰは、非層状の形態を有する、または高電子密度である。いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、（１）リン脂質、及び（２）コレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物である。
いくつかの態様では、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体である。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ－リン脂質複合体、ＰＥＧ－セラミド（ＰＥＧ－Ｃｅｒ）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成員である。
いくつかの態様では、発現システムを送達するための組成物は、ＬＮＰ中に完全に封入される。
いくつかの態様では、ＬＮＰの非層状の形態は、逆六方晶（ＨＩＩ）または立方晶相構造を含む。
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を構成する。いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１．５ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、非層状の形態を有する。いくつかの態様では、ＬＮＰの９５％超は、高電子密度である。
いくつかの態様では、発現システムを送達するための組成物は、複数のＬＮＰを更に含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、非カチオン性脂質であって、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物であって、前記リン脂質が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％を構成する、前記混合物、または、前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の４９．５ｍｏｌ％以下であり、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記コレステロールまたはその誘導体が前記ＬＮＰ中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％から４０ｍｏｌ％を構成する前記混合物、のいずれかを含む、前記非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、発現システムを送達するための組成物は、複数のＬＮＰを更に含み、ＬＮＰは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の５０ｍｏｌ％～８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の０．５ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する、ＬＮＰの凝集を阻害する複合脂質と、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１３ｍｏｌ％～４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質と、を含む。
いくつかの態様では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはこれらの混合物を含む。
いくつかの態様では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＡＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＭＡ）複合体、ＰＥＧ－ジステアロイルオキシプロピル（ＰＥＧ－ＤＳＡ）複合体、またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、複合体のＰＥＧ部分は、約２,０００ダルトンの平均分子量を有する。
いくつかの態様では、複合脂質は、ＬＮＰ中に存在する全脂質の１ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式Ｉ：
Figure 2022512912000002
の構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含み、式中、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ－、－ＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接的結合であり；Ｇ１は、Ｃ１－Ｃ２アルキレン、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＲａＣ（＝Ｏ）－、または直接的結合であり；－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ－、または直接的結合であり；Ｇは、Ｃ１－Ｃ６アルキレンであり；Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２であり；Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ１ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ２ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ３ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ４ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨまたはメチルであり；Ｒ７は、Ｃ４－Ｃ２０アルキルであり；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、５、６、または７員の複素環を形成し；ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して１～２４の整数であり；ｘは０、１または２である。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、式ＩＩ：
Figure 2022512912000003
の構造を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を含み、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、または炭素－炭素二重結合であり；Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ１ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ１ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ２ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ２ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ２ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ３ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ３ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ３ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、それぞれの場合で、独立して、（ａ）ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルである、または（ｂ）Ｒ４ａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ４ｂはそれが結合する炭素原子と共に、隣り合ったＲ４ｂ及びそれが結合する炭素原子と共に炭素－炭素二重結合を形成し；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してメチルまたはシクロアルキルであり；Ｒ７は、それぞれの場合で、独立してＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、非置換のＣ１－Ｃ１２アルキルである、またはＲ８及びＲ９は、それらが結合する窒素原子と共に、５、６、または７員の複素環を形成し；ａ及びｄは、それぞれ独立して０～２４の整数であり；Ｂ及びｃは、それぞれ独立して１～２４の整数であり；ｅは１または２であり、ただし、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、またはＲ４ａのうちの少なくとも１つが、Ｃ１－Ｃ１２アルキルである、またはＬ１またはＬ２の少なくとも一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－または－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－であり；Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、ａが６である場合にはイソプロピルでなく、ａが８である場合にはｎ－ブチルでないことを条件とする。
いくつかの態様では、上記の組成物のいずれかは、中性脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質を含む１つ以上の賦形剤を更に含む。いくつかの態様では、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、中性脂質はＤＳＰＣである。
いくつかの態様では、化合物と中性脂質とのモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの態様では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの態様では、化合物とコレステロールとのモル比は、約２：１～１：１の範囲である。
いくつかの態様では、ポリマー結合脂質はＰＥＧ化脂質である。いくつかの態様では、化合物とＰＥＧ化脂質とのモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧポリエチレン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－スクシノイル－ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ｃｅｒ、またはＰＥＧジアルキルオキシプロピルカルバメートである。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、下記構造ＩＩＩ：
Figure 2022512912000004
を有する化合物、または、その薬学的に許容される塩、互変異性体、もしくは立体異性体を含み、式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和のアルキル鎖であり、前記アルキル鎖は任意で、１つ以上のエステル結合によって中断され、ｚは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの態様では、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの態様では、ｚの平均は、約４５である。
いくつかの態様では、ＬＮＰは、ポリアニオン性の核酸と混合される際に非二重層構造に自己組織化する。いくつかの態様では、非二重層構造は、６０ｎｍ～１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、非二重層構造は、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様では、ナノ粒子状送達ビヒクルは、約１００ｎｍの直径を有する。
いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、ＩＦＮα阻害因子、ＩＦＮβ阻害因子、ＩＦＮＡＲ阻害因子、及びＩ型インターフェロンシグナル伝達経路阻害因子からなる群から選択される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の阻害因子は、抗体またはその抗原結合フラグメント、低分子阻害因子、ＲＮＡｉポリヌクレオチド、ゲノム編集システム、及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される。いくつかの態様で、抗体は、抗ＩＦＮα抗体、抗ＩＦＮβ抗体、抗ＩＦＮαβ受容体（ＩＦＮＡＲ）遮断抗体からなる群から選択される。いくつかの態様で、抗ＩＦＮα抗体は、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｕｍｕｍａｂ）、ロンタリズマブ、及びＡＳＧ－００９からなる群から選択される。いくつかの態様で、抗ＩＦＮＡＲ遮断抗体は、ＭＡＲ１－５Ａ３、アニフロルマブ、ＡｍＳ３Ａ５－１、６４Ｇ１２、Ｈ２Ｋ６、Ｈ２Ｋ１、Ｈ３Ｋ６、Ｈ３Ｋ１ ３Ｆ１１、４Ｇ５、１１Ｅ２、及び９Ｄ４からなる群から選択される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路阻害因子は、ＪＡＫキナーゼ阻害因子を含む。いくつかの態様で、ＪＡＫキナーゼ阻害因子は、低分子を含む。いくつかの態様で、ＪＡＫキナーゼ阻害因子は、ＪＡＫ１／２阻害因子、またはＪＡＫ１／３阻害因子を含む。いくつかの態様で、ＪＡＫ１／３阻害因子は、トファシチニブである。
いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与の前、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与前２４時間以内に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムの送達のための組成物の投与後１２時間未満に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与後６時間以内に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与前２４時間から投与後６時間以内の間に投与される。
いくつかの態様で、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。いくつかの態様で、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）に投与される。
いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、筋肉内（ＩＭ）に投与される。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、静脈内（ＩＶ）に投与される。
いくつかの態様では、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の単回投与が行われる。
いくつかの態様では、カセットは、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれる。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、カセットと機能的に連結される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、５’７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャップを含む。いくつかの態様では、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターは、インビトロ転写によって生成される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、哺乳動物細胞内で自己複製する。
いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子を少なくとも含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列を少なくとも含む。いくつかの態様では、非構造タンパク質媒介増幅のための配列は、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない。いくつかの態様では、カセットは、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入される。
いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、ベネズエラウマ脳炎ウイルスは、塩基対７５４４と１１１７５との間の欠失を更に含む配列番号３または配列番号５の配列を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡアルファウイルス骨格は、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、カセットは、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の欠失を置換するように７５４４位に挿入される。いくつかの態様では、カセットの挿入は、ｎｓＰ１～４遺伝子と少なくとも１つの核酸配列とを含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、ｎｓＰ１～４遺伝子及び少なくとも１つの核酸配列は別々のオープンリーディングフレーム内に存在する。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列は、外因性のＲＮＡプロモーターである。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、第２のプロモーターヌクレオチド配列は、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ２ｋｂのサイズである。いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、それぞれ５ｋｂ未満のサイズである。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つは、発現されて翻訳された場合に対象の細胞上にＭＨＣクラスＩによって提示されることが可能なエピトープをコードする。いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つは、発現されて翻訳された場合に対象の細胞上にＭＨＣクラスＩＩによって提示されることが可能なエピトープをコードする。
いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、２つ以上の核酸配列を含む。いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、２つ以上のポリペプチドコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、各ポリペプチドコード核酸配列は互いに直接連結される。
いくつかの態様では、各ポリペプチドコード核酸配列は、リンカーをコードする核酸配列によって、異なるポリペプチドコード核酸配列と連結されている。いくつかの態様で、ポリペプチドコード核酸配列は抗原コード核酸配列であり、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列または１個のＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様において、リンカーは、（１）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さの連続したグリシン残基、（２）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さの連続したアラニン残基、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアーゼによって効率的にプロセシングされる、アミノ酸残基少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源となる同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、アミノ酸残基少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０個の長さである、１つ以上の天然配列、からなる群から選択される。いくつかの態様で、ポリペプチドコード核酸配列は抗原コード核酸配列であり、リンカーは、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列に連結する。いくつかの態様では、リンカーは、配列ＧＰＧＰＧを含む。
いくつかの態様で、ポリペプチドコード核酸配列は抗原コード核酸配列であり、ここで、抗原コード核酸配列は、抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング、及び提示、ならびに／または免疫原性を増強する、分離したまたは連続した配列に、機能的にまたは直接連結されている。いくつかの態様では、分離したまたは連続した配列は、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングを向上させるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意で、プロテアソームターゲティングを向上させるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する野生型核酸配列と比較して、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有する。いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する野生型核酸配列と比較して、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有する。いくつかの態様において、エピトープコード核酸配列は少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する野生型核酸配列と比較して、コードされたエピトープが、その対応するＭＨＣアレル上の提示の増大した可能性を有する。いくつかの態様では、少なくとも１つの変更は、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、または、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む。
いくつかの態様で、対象は、がんを有するとわかっているまたは疑われている。いくつかの態様で、免疫応答を刺激することによりがんが治療される。いくつかの態様では、がんは、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
いくつかの態様で、対象は、１つ以上の腫瘍を有する。いくつかの態様で、免疫応答を刺激することにより、１つ以上の腫瘍の腫瘍体積が減少する。
いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含み、任意で、各核酸配列は、異なる非コード核酸配列、異なるポリペプチドコード核酸配列、またはそれらの組み合わせをコードする。いくつかの態様で、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含み、任意で、各核酸配列は、異なる非コード核酸配列、異なるポリペプチドコード核酸配列、またはそれらの組み合わせをコードする。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のポリペプチドコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個のポリペプチドコード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の抗原コード核酸配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸配列は少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個は、細胞表面上にＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする。いくつかの態様で、ＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも２つは、腫瘍細胞表面上にＭＨＣクラスＩによって提示される。
いくつかの態様では、対象に投与され、かつ翻訳された場合に、エピトープコード核酸配列によってコードされたエピトープのうちの少なくとも１つは、抗原提示細胞上に提示され、その結果、細胞表面上にエピトープのうちの少なくとも１つを提示する細胞を標的とする免疫応答が生じる。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列またはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、対象に投与され、かつ翻訳された場合に、ＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープのうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、その結果、細胞表面上にエピトープのうちの少なくとも１つを提示する細胞を標的とする免疫応答をもたらし、任意で、ＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩエピトープコード核酸配列のそれぞれの発現が、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される。
いくつかの態様では、エピトープコード核酸配列は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、各抗原コード核酸配列は、アミノ酸８個から３５個の間の長さ、任意で、アミノ酸９～１７個、９～２５個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、または３５個の長さのポリペプチド配列をコードする。
いくつかの態様では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在する。いくつかの態様で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、かつ少なくとも１つの変更を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型の核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、各抗原コード核酸配列は、アミノ酸１２～２０個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２０～４０個の長さのポリペプチド配列をコードする。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド（配列番号４６）及びＰＡＤＲＥ（配列番号４８）のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、誘導性である。いくつかの態様では、少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または第２のプロモーターヌクレオチド配列は、非誘導性である。
いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスに固有のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、アルファウイルスにとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結される。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである。いくつかの態様では、少なくとも１つのポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである。
いくつかの態様では、カセットは、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られており少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている５’もしくは３’非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つを更に含む。
いくつかの態様では、カセットはレポーター遺伝子を更に含み、前記レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、検出可能なペプチドまたはエピトープは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される。
いくつかの態様では、１つ以上のベクターは、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列を更に含む。いくつかの態様では、免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは一緒に連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、フレキシブルなリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である。いくつかの態様では、抗体の前記重鎖配列と前記軽鎖配列は、２ＡもしくはＩＲＥＳなどの自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列は、連続したグリシン残基などのフレキシブルなリンカーによって連結される。いくつかの態様では、免疫調節物質はサイトカインである。いくつかの態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのそれらのバリアントのうちの少なくとも１つである。
いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列は、（ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、１セットのエピトープのそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、（ｂ）各エピトープのペプチド配列を提示モデルに入力して、腫瘍の腫瘍細胞表面上にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によってエピトープのそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と、（ｃ）前記セットのエピトープのサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択されたエピトープを生成する工程であって、前記選択されたエピトープが、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために用いられる、前記生成する工程とを行うことによって選択される。
いくつかの態様では、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれは、（ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、１セットのエピトープのそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記取得する工程と、（ｂ）各エピトープのペプチド配列を提示モデルに入力して、腫瘍の腫瘍細胞表面上にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によってエピトープのそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と、（ｃ）前記セットのエピトープのサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択されたエピトープを生成する工程であって、前記選択されたエピトープが、少なくとも２０個の前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために用いられる、前記生成する工程とを行うことによって選択される。いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープの数は、２～２０個である。いくつかの態様では、提示モデルは、（ａ）ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸とのペアの存在と、（ｂ）特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の、前記ペアのＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる腫瘍細胞表面上の提示の尤度と、の間の依存性を表す。
いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大しているエピトープを選択することを含み、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害を受けやすい尤度が減少しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様では、前記セットの選択されたエピトープを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少しているエピトープを選択することを含む。いくつかの態様において、エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータは、腫瘍組織においてシークエンシングを行うことによって取得される。いくつかの態様において、シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシングアプローチである。
いくつかの態様において、カセットは、カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのジャンクションエピトープ配列または各ジャンクションエピトープ配列は、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する。いくつかの態様において、各ジャンクションエピトープ配列は、非自己である。
いくつかの態様において、カセットは、翻訳される野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される。いくつかの態様において、予測された非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列は、カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である。いくつかの態様において、予測は、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づく。いくつかの態様において、カセット内の抗原コード核酸配列の順序は、（ａ）異なる順序の抗原コード核酸配列に対応する１セットの候補カセット配列を生成することと、（ｂ）各候補カセット配列について、候補カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定することと、（ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、ワクチン用のカセット配列として選択することとを含む、一連の工程によって決定される。
いくつかの態様で、発現システム及び／またはＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物中に製剤化される。いくつかの態様で、方法は、アジュバントを投与することを更に含む。
本明細書には、本明細書に記載された方法のいずれかの発現システム及びＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物と、使用のための指示書とを含む、キットも開示されている。
いくつかの態様で、得られたエピトープコード核酸配列は、対象の腫瘍に由来する。いくつかの態様で、エピトープコード核酸配列は、対象の腫瘍に由来しない。
いくつかの態様で、方法は、１つ以上の免疫調節物質を投与することを更に含み、任意で、免疫調節物質は、発現システム及び／もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物またはその医薬組成物の投与の前、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与される。いくつかの態様では、１つ以上の免疫調節物質は、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。いくつかの態様において、免疫調節物質は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される。いくつかの態様で、皮下投与は、発現システム投与部位の近傍部位での投与、または発現システムのための１つ以上の流入領域リンパ節に近接した投与である。
いくつかの態様で、方法は、対象に第２のワクチン組成物を投与することを更に含む。いくつかの態様で、第２のワクチン組成物は、発現システム及び/もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物またはその医薬組成物の投与に先立って投与される。いくつかの態様で、第２のワクチン組成物は、発現システム及び/もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物またはその医薬組成物の投与に続いて投与される。いくつかの態様で、第２のワクチン組成物は、発現システムを送達するための組成物またはその医薬組成物と同じである。いくつかの態様で、第２のワクチン組成物は、発現システムを送達するための組成物またはその医薬組成物とは異なる。いくつかの態様では、第２のワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む。いくつかの態様では、チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる抗原コード核酸配列は、前述の方法クレームのいずれかの抗原コード核酸配列と同じである。いくつかの態様で、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子、またはその医薬組成物の第２の投与は、第２のワクチン組成物の投与の前、前記投与と同時、または前記投与の後に行われる。
本発明のこれらの、ならびに他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明文、及び添付図面を参照することでより深い理解がなされるであろう。
インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発を説明する。抗原提示細胞へのワクチンカセットの送達が、異なるペプチド抗原の発現、エピトーププロセシング、及びＭＨＣ制限提示につながるアッセイの概略。特異的なペプチド－ＭＨＣの組み合わせに一致するＴ細胞受容体を有するように操作されたレポーターＴ細胞が活性化され、ルシフェラーゼが発現される。 図２Ａは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、互いに対して同じ位置で連結された５個のクラスＩ ＭＨＣクラス制限エピトープ（エピトープ１～５）に２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープ（ＭＨＣ－ＩＩ）が繋げられたものを示す。異なるリンカーを用いて種々の繰り返しが生成された。場合によっては、Ｔ細胞エピトープは互いに直接連結される。他の場合では、Ｔ細胞エピトープの片側または両側にその天然配列が隣接する。他の繰り返しでは、Ｔ細胞エピトープは、非天然配列ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰにより連結される。図２Ｂは、短いカセット内のリンカー配列の評価を説明し、短いカセット内に埋め込まれたＴ細胞エピトープの配列情報を示す。 モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価を説明する。ターゲティングカセットは、短いカセット設計を、ユビキチン（Ｕｂ）、シグナルペプチド（ＳＰ）及び膜貫通（ＴＭ）ドメインによって延長し、５個のマーカーヒトＴ細胞エピトープ（エピトープ１～５）の隣に２個のマウスＴ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＳＩＩ）（配列番号５７）及びＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（Ａ５）（配列番号５８）を更に有し、Ｔ細胞エピトープの両側に隣接する非天然リンカーＡＡＹ－または天然リンカー配列を用いている（２５ｍｅｒ）。 短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価を説明する。Ａ）ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスを使用したワクチンカセットのインビボ評価の実験計画。 長い２１ｍｅｒカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、長いカセットの設計が、それらの２５ｍｅｒ天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる５個のマーカークラスＩエピトープ（エピトープ１～５）であって、それらの２５ｍｅｒ天然配列に含まれる更なる周知のＴ細胞クラスＩエピトープ（エピトープ６～２１）によって隔てられたマーカークラスＩエピトープと、２個のユニバーサルクラスエピトープ（ＭＨＣ－ＩＩ０）とを含み、各クラスＩエピトープの相対位置のみが異なることを示す。 長い２１ｍｅｒカセット内のエピトープ位置の影響のインビボ評価を説明し、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報を示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、最終カセットの設計が、それらの２５ｍｅｒ天然配列（リンカー＝天然フランキング配列）に含まれる２０個のＭＨＣ Ｉエピトープを含み、６個の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）エピトープ、５個のヒトエピトープ、９個のマウスエピトープ、及び２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープで構成されることを示す。 前臨床的ＩＮＤ申請実験用の最終カセット設計を説明し、非ヒト霊長類、マウス、及びヒト起源のクラスＩ ＭＨＣ上に提示される、使用されるＴ細胞エピトープの配列情報、ならびに２個のユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号４８）及び破傷風トキソイド（配列番号４６）の配列を示す。 図７Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して可視化した。図７Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リン酸カルシウムプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製がトランスフェクションの１０日後に観察され、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを蛍光顕微鏡（倍率１００倍）を使用して可視化した。 図８Ａは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、光学顕微鏡（倍率４０倍）を使用して３日後に撮影した。図８Ｂは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡（倍率４０倍）を使用して３日後に撮影した。図８Ｃは、トランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスの生成を説明する。リポフェクタミンプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ ＤＮＡをトランスフェクトした。ウイルス複製（プラーク）がトランスフェクションの１０日後に観察された。ライセートを調製し、Ｔ２５フラスコの２９３Ａ細胞に再感染させるのに用いた。ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰウイルスプラークを可視化し、蛍光顕微鏡（倍率１００倍）を使用して３日後に撮影した。 ウイルス粒子の生成スキームを説明する。 アルファウイルス由来ＶＥＥ自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターを説明する。 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡを接種した後のインビボのレポーター発現を説明する。異なる時点でＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを免疫した（ＭＣ３に封入したものを１０μｇ／マウスで両側性に筋肉内注射）後のルシフェラーゼシグナルの代表的イメージを示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０μｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（対照）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）、またはＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）を注射した。更に、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」は配列番号５７として開示される）をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける、ＭＣ３ ＬＮＰにより製剤化したＶＥＥ ｓｒＲＮＡで免疫した１４日後に測定されたＴ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、１０μｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡ（対照）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ（Ｖａｘ）、ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）、またはＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）を注射した。更に、すべてのマウスを７日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。各グループは８匹のマウスで構成した。免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答（「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」は配列番号５７として開示される）をＭＨＣＩペンタマー染色により評価し、ペンタマー陽性細胞としてＣＤ８陽性細胞に対する割合（％）として報告する。各線は中央値を示す。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。更に、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。更に、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。更に、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに、アデノウイルス発現ＧＦＰ（Ａｄ５－ＧＦＰ）を注射し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹを注射し、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。第３のグループは、Ａｄ５－ＧＦＰプライム／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡブーストと抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置し、第４のグループは、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライム／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹブーストと抗ＣＴＬＡ－４（Ｖａｘ＋ａＣＴＬＡ－４）との組み合わせで処置した。更に、すべてのマウスを２１日目に開始して抗ＰＤ－１ｍＡｂで処置した。Ｔ細胞応答をＭＨＣクラスＩペンタマー染色により測定した。アデノウイルスによる免疫の１４日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの１４日後（プライムの２８日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５－ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５－ＧＦＰ／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（ａ抗ＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／ｃ系）腫瘍保有マウスにおける異種プライム／ブースト後の抗原特異的Ｔ細胞応答を説明する。マウスを、Ａｄ５－ＧＦＰで免疫し、アデノウイルスプライムの１５日後にＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡでブーストする（対照）か、またはＡｄ５－ＵｂＡＡＹでプライムし、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡでブーストした（Ｖａｘ）。対照及びＶａｘのグループの両方を、ＩｇＧ対照ｍＡｂでも処置した。別のグループに、Ａｄ５－ＧＦＰ／ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（ａ抗ＰＤ１）との組み合わせを投与し、第４のグループに、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ／ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹプライム／ブーストと抗抗ＰＤ－１（Ｖａｘ＋ａＰＤ１）との組み合わせを投与した。ＡＨ１ペプチドに対するＴ細胞応答をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定した。アデノウイルスによる免疫の１２日後及びｓｒＲＮＡによるブーストの６日後（プライムの２１日後）にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節を採取した。 マウスにおけるマウス腫瘍抗原に対するＣｈＡｄＶ６８誘発Ｔ細胞応答を説明する。マウスをＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒで免疫し、ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）（配列番号５７）に対するＴ細胞応答をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１－Ａ５をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された脾細胞１０６個当たりの平均のスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ－１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答を説明する。抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、各グループから６匹のマウスの脾細胞で測定した。結果を、脾細胞１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で示す。各グループの中央値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ６、ＣｈＡｄＶ＋抗ＰＤ－１、ｓｒＲＮＡ、ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１、または抗ＰＤ－１単独のいずれかによる１回の免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答を説明する。ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的ＩＦＮ－γ産生をＩＣＳを用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞として全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合（％）として示す。各グループの中間値を横線で示す。各グループの中央値を横線で示す。Ｐ値は、ダネット多重比較検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ－１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。腫瘍体積を週２回測定し、平均腫瘍体積を実験の最初の２１日間について示す。実験開始時に各グループは２２～２８匹のマウスで構成された。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。Ｐ値は、ダネット検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ。 ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡ異種プライム／ブースト、ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ異種プライム／ブースト、またはｓｒＲＮＡ／ｓｒＲＮＡ同種プライマー／ブーストによる免疫後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける生存率を説明する。プライム及びブーストにおいて抗ＰＤ－１の投与を行った、または行わない場合のプライム／ブースト免疫も比較として示す。Ｐ値は、ログランク検定を用いて求めた。すなわち、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、ｓｒＲＮＡ＝ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、最初のブースト免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３０μｇ）（図２０Ａ）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（１００μｇ） （図２０Ｂ）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）（図２０Ｃ）による同種プライム／ブースト、またはＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブースト群（図２０Ｄ）について、ＰＢＭＣ中で測定した（各群６匹のアカゲザル）。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープについて、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。各動物の値は、プレブリード（０週目）のレベルに対して正規化した。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる異種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ２による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 ＥＬＩＳｐｏｔを用いて測定した抗原特異的細胞性免疫応答を示す。６種類の異なるｍａｍｕＡ０１制限エピトープに対する抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ ＬＮＰ１による同種プライム／ブーストレジメンによる免疫化後にＰＢＭＣ中で測定した。結果を、積み上げバーグラフフォーマットで、各エピトープ（各群６匹のアカゲザル）について、ＰＢＭＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）として示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ製ダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ製ダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 ＥＤＧＥスコアと、標的化ＭＳによって候補共有される新生抗原ペプチドの検出の確率との間の相関を示す。 抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブのいずれかと組み合わせたＶＥＥ－ルシフェラーゼｓａｍＲＮＡでＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫した後のインビボレポーター発現を示す。相対発光（ＲＬＵ）を、ＶＥＥＥ－ルシフェラーゼ（マウス１匹当たり１０μｇ、筋肉内投与、両側投与）による免疫化後、１日目、２日目及び５日目に各マウスについて定量化した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、免疫化の２４時間前に単回投与として腹腔内に送達した（２ｍｇ）。トファシチニブを、免疫化の２４時間前から６日間、１日２回２ｍｇを経口投与した。平均＋／－ＳＥＭ、５匹のマウス群。 抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブまたは対照のいずれかと組み合わせた、ＶＥＥＥ－ＭＡＧ ｓａｍＲＮＡによりＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した後のインビボ抗原特異的Ｔ細胞応答を示す。ＡＨ１－Ａ５ペプチド（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号５８））に対するＴ細胞応答を、細胞内サイトカイン染色を用いて測定した。マウスを屠殺し、ＶＥＥ－ＭＡＧ（１０μｇ、ＩＭ）による免疫化後１２日目に脾臓を採取した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、免疫化の２４時間前に単回投与として腹腔内に送達した（２ｍｇ）。トファシチニブを、免疫化の２４時間前から８日間、１日２回２ｍｇを経口投与した。各群８匹のマウス、バーは中央値を示す。 ＩＦＮａの早期抑制が、ｓａｍＲＮＡ発現及び免疫応答の増加に必要であることを示している。１μｇのｓａｍＲＮＡによる単回免疫化後１２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答。マウスは更に、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の前またはその後の指定された時間に、抗ＩｇＧ抗体対照またはＩＦＮＡＲを標的とするモノクローナル遮断抗体のいずれかで処理された。抗体処理はすべて２ｍｇの用量で、腹腔内に送達した。細胞内サイトカイン染色を用いて、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生を測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として示す。各グループの中央値を横線で示す。 ＩＦＮａの抑制を継続しても免疫応答が低下しないことを示している。１μｇのｓａｍＲＮＡによる単回免疫化後１２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答。マウスは、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の前及びその後の指定された時間に、抗ＩｇＧ抗体対照またはＩＦＮＡＲを標的とするモノクローナル遮断抗体のいずれかで処理された。抗体処理はすべて２ｍｇの用量で、腹腔内に送達した。抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩテトラマー染色を用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として示された。各グループの中央値を横線で示す。 ＩＦＮａの抑制を継続しても免疫応答が低下しないことを示している。１μｇのｓａｍＲＮＡによる単回免疫化後１２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答。マウスは、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の前及びその後の指定された時間に、抗ＩｇＧ抗体対照またはＩＦＮＡＲを標的とするモノクローナル遮断抗体のいずれかで処理された。抗体処置はすべて２ｍｇの用量で、腹腔内に送達した。細胞内サイトカイン染色を用いて、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生を測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として示す。各グループの中央値を横線で示す。 ＩＦＮａの局所的な抑制が全身送達と同様にｓａｍＲＮＡ免疫応答を増加させるのに有効であることを示している。１μｇのｓａｍＲＮＡによる単回免疫化後１２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答。マウスは、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の２４時間前に、抗ＩｇＧ抗体対照（ＩＰ）、またはＩＦＮＡＲを標的とするモノクローナル遮断抗体（ＩＰまたは筋肉内投与）のいずれかで処理した。抗体処理はすべて０．５ｍｇの用量で行った。筋肉内注射はすべて、前脛骨に両側から送達された。抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩテトラマー染色を用いて測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として示された。各グループの中央値を横線で示す。 ＩＦＮａの局所的な抑制が全身送達と同様にｓａｍＲＮＡ免疫応答を増加させるのに有効であることを示している。１μｇのｓａｍＲＮＡによる単回免疫化後１２日目のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答。マウスは、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の２４時間前に、抗ＩｇＧ抗体対照（ＩＰ）、またはＩＦＮＡＲを標的とするモノクローナル遮断抗体（ＩＰまたは筋肉内投与）のいずれかで処理した。抗体処理はすべて０．５ｍｇの用量で行った。筋肉内注射はすべて、前脛骨に両側から送達された。細胞内サイトカイン染色を用いて、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生を測定し、結果を、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の全ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として示す。各グループの中央値を横線で示す。 ３０（Ｌ）、４０（ＸＬ）または５０（ＸＸＬ）のいずれかのエピトープを有するラージ抗原カセットにおける、様々な種からのモデルエピトープの一般的な組織を示す。 すべてのカセットに共通する配列を認識する抗クラスＩＩ（ＰＡＤＲＥ）抗体を用いた前述のウエスタンブロットによって示されるように、ロングカセットを発現するＣｈＡｄベクターを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、可変サイズのラージカセット（ｃｈＡｄ６８－５０ＸＸＬ、ｃｈＡｄ６８－４０ＸＬ及びｃｈＡｄ６８－３０Ｌ）を発現するｃｈＡｄ６８ベクターで感染させた。感染は、ＭＯＩ０．２で設定した。２４時間後の感染ＭＧ１３２プロテアソーム阻害因子を、１セットの感染したウェルに添加した（＋記号で示されている）。ウイルス処理したウェルの別のセットは、ＭＧ１３２で処理しなかった（－記号で示されている）。感染していないＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｆ）を陰性対照として使用した。感染の４８時間後に細胞ペレットを採取し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動、及びウサギ抗クラスＩＩ ＰＡＤＲＥ抗体を用いた免疫ブロット法により分析した。検出には、ＨＲＰ抗ウサギ抗体及びＥＣＬ化学発光基質を使用した。 ＩＣＳによってＡＨ１（上）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（下）に対して検出された、ｃｈＡｄ６８ラージカセット免疫化マウスにおけるＣＤ８＋免疫応答を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞を、総ＣＤ８細胞に対する割合として示している。 ｃｈＡｄ６８ラージカセットワクチン接種後のＬＤ－ＡＨ１＋（上）及びＫｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋（下）テトラマーに対するＣＤ８＋応答を示す。データは、モデルテトラマーペプチド複合体に対して反応性の総ＣＤ８細胞に対する割合として示される。テューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。すべてのｐ値は、ＭＡＧ２０－抗原カセットと比較した。 ＩＣＳによってＡＨ１（上）及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（下）に対して検出された、アルファウイルスラージカセット処理マウスにおけるＣＤ８＋免疫応答を示す。データは、モデルエピトープに対するＩＦＮｇ＋細胞を、総ＣＤ８細胞に対する割合として示している。テューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。すべてのｐ値は、ＭＡＧ２０－抗原カセットと比較した。 アカゲザルにおける抗原カセット含有ベクターの免疫原性を評価するために使用されたワクチン接種法を示す。三角形は、０週目と３２週目におけるｃｈＡｄ６８ワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０，４、１２、２０、２８及び３２週目のアルファウイルスワクチン接種を示す。四角は、抗ＣＴＬＡ４抗体の投与を示す。 ｃｈＡｄ－ＭＡＧ単独を投与されたアカゲザル（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間経過を示す。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ－ＭＡＧ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）をＩＶに投与されたアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間経過を示す。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ｃｈＡｄ－ＭＡＧ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）をＳＣに投与されたアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間経過を示す。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞を示す。 ＥＬＩＳｐｏｔによって測定されたＣｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって生成された、抗原特異的な記憶応答を示す。結果を、各点が１匹の動物を表す、個別のドットプロットとして示す。免疫化前のベースライン（左パネル）及びプライム後１８か月の記憶応答（右パネル）を示す。 コンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色を用いたフローサイトメトリーによる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶細胞表現型を示す。 試験１８月目の４つのＭａｕｍｕ－Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の合計内での記憶細胞型の分布を示す。記憶細胞は、以下のように特徴づけられた。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。 ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおけるＣＴ２６腫瘍抗原ＡＨ１を認識する、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示す。Ｐ値は、テューキーの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡを用いて決定された。＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５。ＣｈＡｄＶ＝ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ；ａＣＴＬＡ４＝抗ＣＴＬＡ４抗体、クローン９Ｄ９。
詳細な説明
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、更なる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を誘導する物質のことである。抗原は、新生抗原である。抗原は、特定の集団、例えば、がん患者の特定の集団の間で見られる抗原である「共通抗原」であり得る。
本明細書で使用するところの「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞の変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾によって、抗原を対応する野生型抗原とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する抗原のことである。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含んでよい。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライスバリアントも含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常リン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームによって生成されるスプライス抗原も含むことができる。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６Ｏｃｔ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照されたい。そのような共通新生抗原は、投与を介して対象に免疫応答を誘導するのに有用である。対象は、様々な診断方法、例えば、以下に更に記載される患者選択方法の使用を介して、投与のために同定され得る。
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞または組織に存在するが、対象の対応する正常細胞もしくは組織には存在しない抗原、または正常細胞もしく組織と比較して、腫瘍細胞もしくがん組織で発現が変化していることが知られているまたは発見されているポリペプチドに由来する抗原である。
本明細書で使用される場合、「抗原ベースのワクチン」という用語は、１つ以上の抗原、例えば複数の抗原に基づいたワクチン組成物のことである。ワクチンは、ヌクレオチドベース（例えば、ウイルスベース、ＲＮＡベース、またはＤＮＡベース）、タンパク質ベース（例えば、ペプチドベース）、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書で使用される場合、「候補抗原」という用語は、抗原を表し得る、新たな配列を生じる変異、または他の異常のことである。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分のことである。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ＯＲＦ」という用語は、変異またはスプライシングなどの他の異常により生じる腫瘍特異的なＯＲＦのことである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすか、または基準開始コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一性」％という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一性」％は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性％を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳される配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一性％及び配列類似性％を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を誘発する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「バリアントコール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出されるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「体細胞バリアント」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍の発生の初期に生じ、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異」という用語は、腫瘍の発生において後期に生じ、腫瘍の細胞の一部のみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンであり得る。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上にＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、及び／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、及び喫煙歴を含むことができる。
「腫瘍由来の抗原コード核酸配列」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲによって腫瘍から直接抽出された核酸配列、または、腫瘍をシークエンシングした後、例えば当技術分野では周知の様々な合成法もしくはＰＣＲに基づく方法によりシークエンシングデータを利用して核酸配列を合成することによって得られた配列データのことを指す。
「アルファウイルス」という用語は、トガウイルス科のメンバーのことを指し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルファウイルスは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される。アルファウイルスは一般的には自己複製ＲＮＡウイルスである。
「アルファウイルス骨格」という用語は、ウイルスゲノムの自己複製を可能とするアルファウイルスの最小配列のことを指す。最小配列としては、非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、ｎｓＰ４遺伝子、及びポリＡ配列、ならびに、２６Ｓプロモーター因子をはじめとするサブゲノムウイルスＲＮＡの発現用の配列を挙げることができる。
「非構造タンパク質媒介増幅用の保存配列」という用語には、当技術分野では周知のアルファウイルス保存配列因子（ＣＳＥ）が含まれる。ＣＳＥとしては、これらに限定されるものではないが、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１－ｎｔ ＣＳＥ、２４－ｎｔ ＣＳＥ、または他の２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、１９－ｎｔ ＣＳＥ、及びアルファウイルス３’ＵＴＲが挙げられる。
「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語には、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリヌクレオチドの生成を触媒するポリメラーゼが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６を含むバクテリオファージ由来ポリメラーゼが挙げられる。
「脂質」という用語には、疎水性及び／または両親媒性分子が含まれる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。脂質は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、脂肪、及び脂溶性ビタミンを含み得る。脂質には、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）及びＭＣ３様分子も含まれ得る。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語には、リポソームとも呼ばれる、水性の内部を包囲する脂質含有膜を用いて形成された小胞様構造が含まれる。脂質ナノ粒子は、界面活性剤により安定化された固体脂質コアを有する脂質ベースの組成物を含む。コア脂質は、脂肪酸、アシルグリセロール、ワックス、及びこれらの界面活性剤の混合物であってよい。リン脂質、スフィンゴミエリン、胆汁酸（タウロコール酸）、及びステロール類（コレステロール）のような生体膜脂質を安定化剤として用いることができる。脂質ナノ粒子は、１種類以上のカチオン性、アニオン性、または中性脂質の規定の比率を含む（ただし、これに限定されない）、規定の比率の異なる脂質分子を用いて形成することができる。脂質ナノ粒子は、外膜シェル内に分子を封入することができ、その後、標的細胞と接触させて封入分子を宿主細胞のサイトゾルに送達することができる。脂質ナノ粒子は、それらの表面などを非脂質分子で修飾または官能化することができる。脂質ナノ粒子は、単一層（単層）または多層（複層）とすることができる。脂質ナノ粒子は、核酸と複合体化することができる。単層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となる。複層脂質ナノ粒子を核酸と複合体化することができ、その場合、核酸は水性の内部となるか、またはその間を形成するかまたはその間に挟まれる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
特に断らない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される「約」という用語は、例えば、平均から標準偏差２つ分以内など、当技術分野における公称公差の範囲内にあるものとして理解される。「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内として理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に示されるすべての数値は「約」という語によって修飾されている。
本明細書において直接定義されていない任意の用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者に更なる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされ得る点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．抗原を同定する方法
共通抗原（例えば、新生抗原）を同定するための方法は、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、腫瘍細胞もしくは免疫細胞表面上に提示される可能性が高い、及び／または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の抗原を同定するための方法を開示する。例として、そのような１つの方法は、対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータならびに／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータ及び／または発現データが、１セットの抗原のそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される（例えば、各新生抗原のペプチド配列が、対応する野生型ペプチド配列と異なるものにする少なくとも１つの変更を含む新生抗原の場合、またはペプチドが、正常な細胞もしく組織と比較して、腫瘍細胞またはがん組織での発現が変化していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチドに由来する、変異のない共通抗原の場合）、前記取得する工程と；各抗原の前記ペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力して、対象の腫瘍の腫瘍細胞表面上に、または腫瘍に存在する腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって抗原のそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と；前記セットの抗原のサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択された抗原を生成する工程とを含むことができる。
提示モデルは、１セットの対応するラベルを含む１セットの参照データ（訓練データセットとも呼ばれる）で訓練された、統計学的回帰または機械学習（例えば、ディープラーニング）モデルを含むことができ、前記セットの参照データは、任意で、一部の対象が腫瘍を有し得る複数の別個の対象の各々から取得され、また、前記セットの参照データは、腫瘍組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、正常組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のトランスクリプトームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のプロテオーム配列を表すデータ、及び腫瘍組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータ、及び正常組織由来のＭＨＣペプチドーム配列を表すデータのうちの少なくとも１つを含む。参照データは、合成タンパク質、正常及び腫瘍ヒト細胞株、ならびに新鮮な及び凍結された初代試料に対してその後曝露される所定のＭＨＣアレルを発現するように操作された単一アレル細胞株の質量分析データ、シークエンシングデータ、ＲＮＡシークエンシングデータ、発現プロファイリングデータ及びプロテオミクスデータ、ならびにＴ細胞アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ）を更に含むことができる。特定の態様では、前記セットの参照データは、参照データの各形態を含む。
提示モデルは、前記セットの参照データに少なくとも一部由来する１セットの特性を含むことができ、前記セットの特性は、アレル依存的特性及びアレル非依存的特性のうちの少なくとも１つを含む。特定の態様では、各特性が含まれる。
共通抗原を同定するための方法は、腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の１つ以上の腫瘍細胞に由来する１つ以上の抗原を同定することによって個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することも含む。例として、そのような１つの方法は、対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データが、腫瘍細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データと正常細胞からのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データを比較することによって同定した１セットの抗原のそれぞれについてのペプチド配列（例えば、各新生抗原のペプチド配列が、対応する野生型ペプチド配列と異なるものにする少なくとも１つの変更を含む新生抗原の場合、またはペプチドが、正常な細胞もしく組織と比較して、腫瘍細胞またはがん組織での発現が変化していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチドに由来する、変異のない共通抗原の場合）、対象の正常細胞から同定されたペプチド配列、を表すデータを取得するために使用される、前記取得する工程と；抗原のそれぞれのペプチド配列を対応する数値ベクトルにコードする工程であって、各数値ベクトルが、ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸及びペプチド配列内におけるアミノ酸の位置のセットに関する情報を含む、前記コードする工程と；コンピュータのプロセッサを使用して数値ベクトルをディープラーニング提示モデルに入力して、前記セットの抗原について１セットの提示尤度を生成する工程であって、セット内の各提示尤度が、１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレルによって対応する抗原が対象の腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、ディープラーニング提示モデルが、前記セットの抗原のサブセットを、前記セットの提示尤度に基づいて選択して、１セットの選択された抗原を生成する、前記生成する工程と；前記セットの選択された抗原に基づいて、個別化されたがんワクチンを構築するための出力を生成する工程とを含むことができる。
新生抗原を含む、抗原を同定するための特定の方法は当業者に公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳細に記載されている方法であって、それぞれは、すべての目的のためにその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される抗原の同定方法のいずれかの工程を行うことを含み、選択された抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを得ることと、腫瘍ワクチンを対象に投与することとを更に含む、腫瘍を有する対象を治療する方法が本明細書に記載される。
本明細書に開示される方法はまた、サブセットの中の抗原のうちの少なくとも１つに対して抗原特異的な１つ以上のＴ細胞を同定することを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、同定は、１つ以上の抗原特異的Ｔ細胞を増殖させる条件下で１つ以上のＴ細胞をサブセットの中の抗原のうちの１つ以上と共培養することを含む。更なる実施形態では、同定は、１つ以上のＴ細胞を、サブセットの中の抗原のうちの１つ以上を含むテトラマーと、Ｔ細胞とテトラマーとの結合が可能な条件下で接触させることを含む。更に別の実施形態で、本明細書に開示される方法はまた、１つ以上の同定されたＴ細胞の１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定することを更に含むことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＴ細胞受容体を同定することは、前記１つ以上の同定されたＴ細胞のＴ細胞受容体配列をシークエンシングすることを含む。本明細書に開示される方法は、１つ以上の同定されたＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することと、複数のＴ細胞を増殖させる条件下で複数のＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することとを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の同定されたＴ細胞受容体の少なくとも１つを発現するように複数のＴ細胞を遺伝子操作することは、１つ以上の同定されたＴ細胞の前記Ｔ細胞受容体配列を発現ベクターにクローニングすることと、複数のＴ細胞のそれぞれに発現ベクターをトランスフェクトすることとを含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、１つ以上のＴ細胞を増殖させる条件下で１つ以上の同定されたＴ細胞を培養することと、増殖させたＴ細胞を対象に注入することとを更に含む。
本明細書ではまた、サブセットの中の少なくとも１つの選択された抗原に対して抗原特異的である単離Ｔ細胞も開示される。
本明細書ではまた、腫瘍ワクチンを製造するための方法も開示され、前記方法は、対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータ及び／または発現データが、１セットの抗原のそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される（例えば、各新生抗原のペプチド配列が、対応する野生型ペプチド配列と異なるものにする少なくとも１つの変更を含む新生抗原の場合、またはペプチドが、正常な細胞もしく組織と比較して、腫瘍細胞またはがん組織での発現が変化していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチドに由来する、変異のない共通抗原の場合）、前記取得する工程と；各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力して、対象の腫瘍の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって抗原のそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と；前記セットの抗原のサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択された抗原を生成する工程と；前記セットの選択された抗原を含む腫瘍ワクチンを生産するまたはこれまでに生産している工程とを含む。
本明細書ではまた、対象の腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータ及び／または発現データのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータ及び／または発現データが、１セットの抗原のそれぞれについてのペプチド配列、および各抗原のペプチド配列（例えば、各新生抗原のペプチド配列が、対応する野生型ペプチド配列と異なるものにする少なくとも１つの変更を含む新生抗原の場合、またはペプチドが、正常な細胞もしく組織と比較して、腫瘍細胞またはがん組織での発現が変化していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチドに由来する、変異のない共通抗原の場合の）を表すデータを取得するために使用される、前記取得する工程と；各抗原のペプチド配列を１つ以上の提示モデルに入力して、対象の腫瘍の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上にＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって抗原のそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と；前記セットの抗原のサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択された抗原を生成する工程と；前記セットの選択された抗原を含む腫瘍ワクチンを生産するまたはこれまでに生産している工程とを含む、方法を実行することによって選択された、１セットの選択された抗原を含む腫瘍ワクチンも提供される。
腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの１つ以上を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性を示す１つ以上の抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、１つ以上の抗原を含まなくともよい。
腫瘍ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、賦形剤を含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて、選択されない抗原と比較して腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて、選択されない抗原と比較して対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて、選択されない抗原と比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している抗原を選択することを含んでもよく、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて、選択されない抗原と比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害を受けやすい尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示される方法はまた、提示モデルに基づいて、選択されない抗原と比較して対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している抗原を選択することを含んでもよい。
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシング及び／または発現データは、腫瘍組織においてシークエンシングを行うことによって取得することができる。
シークエンシングは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシングアプローチであってもよい。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル相互作用特性によって更に同定することができる。すなわち、ＭＨＣアレルと抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性；抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測安定性；抗原コード化ペプチドの配列及び長さ；質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する抗原コード化ペプチドの提示の確率；対象とされる対象の特定のＭＨＣアレルの発現レベル（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；特定のＭＨＣアレルを発現する他の別個の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率；他の別個の対象における、同じ分子のファミリー（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも１つを含む少なくともＭＨＣアレル非相互作用特性によって更に同定される。すなわち、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端及びＮ末端配列；任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在；適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度；ＲＮＡ－ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ；腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる）；新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定される）；細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現；例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏにみることができるような、由来源タンパク質及び／またはそのドメインの特性の包括的なカタログ；ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、βシートに対するαヘリックス）；選択的スプライシング；他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率；ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率；腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑによって測定される、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない）；腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数；ペプチドがＴＡＰに結合する確率、またはＴＡＰに対するペプチドの測定または予測される結合親和性；腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベル（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる）；以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無：ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、及び抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における変異。その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；喫煙歴；任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い；以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）における多型；腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、メラノーマ）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）；喫煙歴；場合によりドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
少なくとも１つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化であってよい。
腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択することができる。
本明細書に開示される方法はまた、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを得ることを含んでもよく、任意で、腫瘍ワクチンを対象に投与することを更に含む。
選択された新生抗原のセット内の新生抗原の少なくとも１つは、ポリペプチド形態である場合、以下のうちの少なくとも１つを含んでもよい：ＩＣ５０値が１０００ｎＭ未満のＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩのポリペプチドではアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドではアミノ酸６～３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在。ＭＨＣクラスＩＩでは、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
本明細書では、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い１つ以上の新生抗原を同定するための方法が開示され、前記方法は、複数の新鮮なまたは凍結得様試料に由来する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と；腫瘍試料中に存在し、かつ、各訓練ペプチド配列に関連する１つ以上のＭＨＣアレル上に提示される、１セットの訓練ペプチド配列を、少なくとも同定することにより、訓練データセットを取得する工程と；前記訓練ペプチド配列に基づいて、１セットの訓練タンパク質配列を取得する工程と；前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの１セットの数値的パラメータを訓練する工程であって、前記提示モデルが、腫瘍細胞表面上に１つ以上のＭＨＣアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的尤度を与える、前記訓練する工程とを含む。
提示モデルは、ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸とのペアの存在と、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の、前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる腫瘍細胞表面上の提示の尤度と、の間の依存性を表すことができる。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、腫瘍の細胞表面上に提示される尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大していることから選択される。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書に開示される方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、中枢性寛容または末梢性寛容により阻害を受けやすい尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれが１つ以上の別個の腫瘍新生抗原に対して、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少していることから選択される。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択することを含んでもよく、新生抗原のサブセットは、それぞれがＡＰＣに対して腫瘍細胞において差次的に翻訳後修飾される尤度が減少していることから選択され、任意で、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書における方法の実施においては、特に断らない限り、当技術分野における技能の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。これらの技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
ＩＩＩ．新生抗原における腫瘍特異的変異の同定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル）の同定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。共通新生抗原を含む、新生抗原を同定するための特定の方法は当業者に公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳細に記載されている方法であって、それぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（１）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（２）Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（３）成熟ｍＲＮＡにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（４）２種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をシークエンシングすることによって同定することができる。
また、変異は、以前に同定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップなどの種々のＤＮＡ「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。更に他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成及びその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
ＰＣＲベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のＰＣＲ産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。この方法にしたがって、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（仏国特許第２，６５０，８４０号；国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９１／０２０８７号））。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして公知である代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（国際ＰＣＴ特許出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。したがって、組み込まれるラベル化ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、それに対して相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（仏国特許第２，６５０，８４０号；国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
ＤＮＡにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９－７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４－６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３－１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９－１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７－１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１－１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６－５９（１９９３））。
数多くのイニシアティブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に対して相補的であるＤＮＡの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。１つの方法において、長さが３０～５０塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、５’端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、２つの機能を果たす。第１に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、及び、色素を除去するための色素－リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、及び色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ－ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシークエンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシークエンシングプラットフォームを、変異を同定するために使用することができる。上記のように、４種類の主要な合成によるシークエンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａより販売される１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓより販売されるＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより販売されるＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成によるシークエンシングプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／ユニバーサルプライミング部位を、鋳型の３’端及び／または５’端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（ユニバーサル捕捉配列とも呼ばれる）は、ユニバーサルプライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン－ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存性の合成によるシークエンシングを含む、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているような、単一分子検出／シークエンシングによって解析することができる。合成によるシークエンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シークエンシングはまた、他の超並列シークエンシング、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法及びプラットフォームも含むことができる。超並列シークエンシング技法及びプラットフォームの追加的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、ＴｈｅｒｍｏＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加的な類似した現在の超並列シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を同定または検証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて同定することができる。
ＩＶ．抗原
抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であることができる。ワクチンにおいて有用な抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
本明細書に開示する方法によって同定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び、本明細書に開示する方法によって同定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。抗原ペプチドは、抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
更に本明細書には、正常な細胞もしくは組織と比較して、腫瘍細胞もしくはがん組織で発現が変化していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチド（例えば、正常な細胞もしくは組織と比較して、腫瘍細胞もしくはがん組織で異常に発現していることが知られているまたは発見されている、任意のポリペプチド）に由来するペプチドも開示されている。抗原性ペプチドが由来することができる、適しているポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースにおいて見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトがんにおける体細胞性変異についての総合的な情報の管理を行う。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。
抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在。ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドについてはアミノ酸６～３０個、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外もしくはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン）によるペプチド促進切断部位またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合部位内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する１つ以上の抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも１つの抗原性ペプチド分子のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個の、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８～約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６～３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２～５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シークエンシングにより、腫瘍中に存在する長い（１０残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のＨＬＡに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。いずれの例においても、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導がもたらされ得る。
抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも２種類以上の抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の異なるペプチドを含有する。少なくとも２種類の異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含むことが知られているもしくは発見されている、任意のポリペプチド、または正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん組織で発現が変化していることが知られているもしくは発見されている、任意のポリペプチドに由来するペプチド（例えば、正常細胞または組織と比較して腫瘍細胞またはがん組織で異常に発現していることが知られているもしくは発見されている、任意のポリペプチドに由来するペプチド）である。抗原性ペプチドが由来することができる、好適なポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースまたはＡＡＣＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（ＧＥＮＩＥ）データベースにおいて見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトがんにおける体細胞性変異についての総合的な情報の管理を行う。ＡＡＣＲ ＧＥＮＩＥは、何万人ものがん患者の臨床転帰と臨床グレードのがんゲノムデータを集約し、リンクしている。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性質を有する抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変に更に供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３～６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風トキソイドの８３０～８４３、インフルエンザの３０７～３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２～３９８及び３７８～３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
更なる態様において、抗原は、抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。また更なる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
Ｖ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された１つ以上の抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１～３０種類のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０種類の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、１～１００種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１～３０種類の抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なる抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なる抗原配列を含有することができる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、及び／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体を更に含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、Ｔ細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物への混合物が抗原に対する免疫応答を増加させる、または改変する、任意の物質である。担体は、抗原が結合可能な足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖類であり得る。任意で、アジュバントは、共通結合的または非共通結合的に共役される。
抗原に対する免疫反応を増加させるアジュバントの能力は通常、免疫介在反応の有意なもしくは実質的な増加、または疾患症状の減少によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増加は、抗原に対して上昇した抗体の力価の有意な増加によって明らかになり、Ｔ細胞活性の増加は通常、増加した細胞増殖、細胞毒性、またはサイトカインの分泌によって明らかになる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性応答またはＴｈ応答を、主に細胞性応答またはＴｈ応答に変化させることによって、免疫応答を変化させることもできる。
適切なアジュバントとしては、１０１８ＩＳＳ、ミョウバン、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム（Ｖｉｒｏｓｏｍｅ）及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ａｑｕｉｌａ製ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）（サポニン、マイコバクテリア抽出物、合成細菌細胞壁擬態物に由来）、ならびに他の専売のアジュバント（例えば、Ｒｉｂｉ製Ｄｅｔｏｘ． ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）などが挙げられるが、これらに限定されない。不完全フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びその調製は、先に記載した（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。サイトカインも使用できる。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞の移動（例えば、ＴＮＦ－α）に影響を与え、樹状細胞の成熟を加速してＴリンパ球のための効率的な抗原提示細胞（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１及びＩＬ－４）にして（米国特許第５，８４９，５８９号、特に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及び免疫アジュバント（例えば、ＩＬ－１２）として作用することに直接関連している（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）。
ＣｐＧ免疫活性オリゴヌクレオチドも、ワクチンの設定でアジュバントの効果を増強することが報告されている。他のＴＬＲ結合分子（例えば、ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９）も使用され得る。
有用なアジュバントの他の例としては、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ポリ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに治療上及び／またはアジュバントとして作用し得る、免疫活性小分子及び抗体（例えば、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５）が挙げられるが、これらに限定されない。アジュバント及び添加剤の量及び濃度は、当業者であれば、不必要な実験を行うことなく容易に決定することができる。追加のアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、２種以上の異なるアジュバントを含むことができる。更に、治療用組成物は、前述のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチン及びアジュバントが、任意の適切な順序で一緒にまたは別々に投与され得ることも企図される。
担体（または、賦形剤）は、アジュバントとは独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増加させるために、特定の変異体の分子量を増加させて、安定性を付与し、生物学的活性を増加させ、または血清半減期を増加させることであり得る。更に、担体は、Ｔ細胞へのペプチドの提示を助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適切な担体、例えばタンパク質または抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンまたはオーバルブミン）、免疫グロブリン、またはホルモン（例えば、インスリンまたはパルミチン酸）であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫化のために、担体は一般的に、ヒトに許容される生理学的に許容される担体であり、安全である。しかし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイドが好適な担体である。あるいは、担体は、例えばセファロースのようなデキストランでもよい。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、完全な外来抗原そのものではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形で抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置している。したがって、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、ＡＰＣの三量体複合体が存在すれば、ＣＴＬの活性化が可能である。これに対応して、ＣＴＬの活性化にペプチドを使用するだけでなく、対応するＭＨＣ分子を有するＡＰＣを追加的に加えると、免疫応答を増強することができる。したがって、いくつかの実施形態で、ワクチン組成物は、少なくとも１つの抗原提示細胞を追加的に含有する。
抗原にはまた、ウイルスベクター系ワクチンプラットフォーム（例えば、ワクシニア、フォウルポックス、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス）（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、またはこれらに限定されない、第２、第３またはハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス、及び特定の細胞型または受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含む、レンチウイルスも含まれる（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１，Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８，Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）。前述のウイルスベクター系ワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、この方法は、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする、１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。この配列は、非変異配列に隣接されていてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または細胞内区画を標的とする１つ以上の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８，Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０参照のこと）。宿主に導入されると、感染した細胞は抗原を発現し、それによってペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を誘発する。免疫化プロトコールで有用なワクチンベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ３５１：４５６－４６０ （１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な他の種々のワクチンベクター（例えばチフス菌ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。
Ｖ．Ａ．抗原カセット
１つ以上の抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当技術分野の範囲内である。「抗原カセット」とは、選択された抗原または複数の抗原と、抗原を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。抗原または複数の抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。そのような要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で抗原の発現を駆動することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、抗原カセットは、抗原に連結されており組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントと共に配置された、選択されたプロモーターも含むことができる。
有用なプロモーターは、構成性プロモーター、または発現させる抗原の量を制御することが可能な調節された（誘導性）プロモーターであってよい。例えば、望ましいプロモーターとして、サイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサーのものがある（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照）。別の望ましいプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーが挙げられる。更に別のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリβアクチンプロモーターである（Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３））。当業者であれば、他の適当な、または望ましいプロモーターも選択することができる。
抗原カセットは、転写産物の効率的なポリアデニル化（ポリ（Ａ）、ポリＡまたはｐＡ）のためのシグナルを与える配列ならびに機能的スプライスドナー及びアクセプター部位を含むイントロンを含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列も含み得る。本明細書の例示的なベクターに用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ－４０由来のものである。ポリＡ配列は、抗原ベースの配列の後で、ウイルスベクター配列の前にカセットに挿入することができる。一般的なイントロン配列もまたＳＶ－４０由来のものでよく、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。抗原カセットは、プロモーター／エンハンサー配列と抗原との間に位置するイントロンを含んでもよい。これら及び他の一般的なベクターエレメントの選択は従来のものであり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書に引用される参照文献を参照）、多くのかかる配列が商業的及び産業的供給元、ならびにＧｅｎｂａｎｋより入手可能である。
抗原カセットは、１つ以上の抗原を有することができる。例えば、特定のカセットは、１～１０個、１～２０個、１～３０個、１０～２０個、１５～２５個、１５～２０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの抗原を含むことができる。抗原は、互いに直接連結されてもよい。抗原は、リンカーによって互いに連結されてもよい。抗原は、Ｎ～ＣまたはＣ～Ｎを含む、互いに対して任意の方向とすることができる。
前述したように、抗原カセットは、選択することができるものの中でもとりわけ、例えばＥ１遺伝子領域の欠失、またはＥ３遺伝子領域の欠失などのウイルスベクター内の任意の選択された欠失部位内に配置することができる。
抗原カセットは、５’から３’方向へ各要素の順番に並べられた配列を記述する式：
Figure 2022512912000005
を用いて記述することができ、
式中、Ｐ及びＰ２は、プロモーターヌクレオチド配列を含み、Ｎは、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、Ｌ５は、５’リンカー配列を含み、Ｌ３は、３’リンカー配列を含み、Ｇ５は、アミノ酸リンカーをコードする核酸配列を含み、Ｇ３は、アミノ酸リンカーをコードする少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、Ｕは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列を含み、ここで、各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、各Ｙについて、対応するＵｆは、抗原コード核酸配列である。組成物及び順番に並べられた配列は、存在する要素の数を選択することによって更に定義することができ、例えば、ａ＝０または１である場合、ｂ＝０または１である場合、ｃ＝１である場合、ｄ＝０または１である場合、ｅ＝０または１である場合、ｆ＝１である場合、ｇ＝０または１である場合、ｈ＝０または１である場合、Ｘ＝１～４００であり、Ｙ＝０、１、２、３、４または５であり、Ｚ＝１～４００であり、かつＷ＝０、１、２、３、４または５である。
１つの例では、存在する要素は、ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝０、Ｘ＝１０、Ｙ＝２、Ｚ＝１、かつＷ＝１であり、更なるプロモーターが存在しない場合が記述される場合（すなわち、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列のみが存在する）、２０個のＭＨＣクラスＩエピトープが存在し、各Ｎについて５’リンカーが存在し、各Ｎについて３’リンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープを連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの５’末端を最後のＭＨＣクラスＩエピトープの３’リンカーに連結するリンカーが存在し、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープの３’末端をベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）に連結するリンカーが存在する。抗原カセットの３’末端の、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）との連結の例としては、３’の１９ｎｔのＣＳＥのような、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられる３’ＵＴＲ要素に直接連結することが挙げられる。抗原カセットの５’末端の、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）との連結の例としては、２６Ｓプロモーター配列、アルファウイルスの５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、または２４ｎｔのＣＳＥに直接連結することが挙げられる。
他の例としては、ａ＝１であり、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外のプロモーターが存在する場合が記述される場合；ａ＝１かつＺが１よりも大きく、それぞれが１つ以上の異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列の発現を駆動する、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列以外の複数のプロモーターが存在する場合；ｈ＝１であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列の発現を駆動する別のプロモーターが存在することが記述される場合；及び、ｇ＝０であり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原コード核酸配列（存在する場合）がベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）に直接連結される場合などが挙げられる。
他の例としては、存在する各ＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーを有する、３’リンカーを有する、どちらも有さない、または両方を有する場合が挙げられる。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが、５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在する例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカー及び３’リンカーの両方を有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープが同じ抗原カセット内に存在するその他の例では、一部のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーのどちらかを有してよく、他のＭＨＣクラスＩＩエピトープが５’リンカーまたは３’リンカーを有するか、またはどちらも有さなくてもよい。
プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と同じであってよい。例えば、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーター配列であるＰｎ及びＰ２が、それぞれ２６Ｓのサブゲノムプロモーターを含むことができる。プロモーターヌクレオチド配列Ｐ及び／またはＰ２は、ベクター骨格（例えば、アルファウイルス骨格などのウイルス骨格）によって与えられるプロモーターヌクレオチド配列と異なっていてもよく、また、互いと異なっていてもよい。
５’リンカーＬ５は、天然配列または非天然配列であってよい。非天然配列としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＹ、ＲＲ、及びＤＰＰが挙げられる。３’リンカーＬ３もまた、天然配列または非天然配列であってよい。更に、Ｌ５及びＬ３は、いずれも天然配列であってよく、いずれも非天然配列であってよく、または一方が天然で他方が非天然であってもよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーは、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｘについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｙについて、アミノ酸リンカーＧ５は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。各Ｙについて、アミノ酸リンカーはまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
アミノ酸リンカーＧ３は、アミノ酸２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の長さであってよい。Ｇ３はまた、アミノ酸が少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さであってもよい。
各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることができる。各Ｘについて、各Ｎは、アミノ酸５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。各Ｘについて、各Ｎはまた、アミノ酸が少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードしてもよい。
Ｖ．Ｂ．免疫チェックポイント
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるＣ６８ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも１つの抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも１つの免疫調節因子（例えばｓｃＦｖなどの抗体）をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、抗原と、チェックポイント阻害因子をコードする１つ以上の核酸分子とを含むことができる。
遮断または阻害するための標的となり得る例示的な免疫チェックポイント分子としては、これらに限定されるものではないが、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリーの分子に属し、すべてのＮＫ（γδ）及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現する）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害因子には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ－１５０４９の１つ以上に結合してその活性を遮断または阻害する抗体、またはその抗原結合フラグメント、または他の結合タンパク質が挙げられる。例示的な免疫チェックポイント阻害因子としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、イピリムマブ、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１ｂｌｏｃｋｅｒ）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）、及びヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害因子）が挙げられる。抗体をコードする配列は、当技術分野における通常の技能を用いてベクターに操作により組み込むことができる。例示的な方法の１つが、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｙ；２３（５）：５８４－９０．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｐｒ １７；に記載されている。
抗原をコードするカセットと同じベクターシステムにコードされた免疫調節因子（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１抗体のようなチェックポイント阻害抗体）もまた、免疫調節因子をコードする核酸配列が、抗原コード核酸配列と同じ転写物の一部として転写されるようにコードされ得る。抗原及び免疫調節剤の両方の翻訳を可能にする追加の要素を核酸配列カセットに組み込むことができる。例えば、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）配列を使用して、抗原及び免疫調節因子をコードする配列を分離し、抗原及び免疫調節因子の別々の翻訳を可能にすることができる。別の例で、自己切断２Ａペプチドをコードする配列を抗原及び免疫調節因子の間に組み込むことができ、抗原及び免疫調節因子の両方を同じタンパク質の一部として翻訳し、次いで２Ａペプチドを切断することを可能にし、その結果、抗原及び免疫調節因子のための別個のタンパク質が得られる。これらの例は、限定することを意味するものではなく、複数の要素を組み合わせて、ＩＲＥＳ配列及び２Ａペプチドをコードする配列の両方を使用するような、抗原及び免疫調節因子の両方の共発現を容易にすることができることも理解される。そのうえ、２Ａペプチドをコードする配列の５'に、フリン切断部位をコードする配列を組み込むことができる。フリン切断部位は、自己切断に続く２Ａペプチド残基の除去を可能にする。
抗原及び免疫調節因子が同じ転写物上にコードされている例で、抗原及び免疫調節因子の順序は、任意の順序であり得る。例えば、抗原及び免疫調節因子を分離するためにＩＲＥＳ配列を使用する場合、５'から３'方向への順序は、抗原－ＩＲＥＳ－免疫調節因子の向き、または免疫調節因子－ＩＲＥＳ－抗原の向きのいずれかであり得る。
更に、抗原をコードするカセットと同じベクターシステムでコードされた免疫調節因子は、免疫調節因子をコードする核酸配列が抗原コード核酸配列とは異なる転写体上に転写されるようにコードされることもできる。例えば、免疫調節剤及び抗原コード核酸配列の転写をそれぞれ駆動するために、別個のプロモーターを組み込むことができる。別個のプロモーターは、同じプロモーターであっても異なったプロモーターであってもよく、それぞれが誘導性または構成性プロモーターであってもよい。例示のプロモーター配列には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＲＳＶ、ＰＧＫ、ＭＣＫ、ＨＳＡ、及びＥＢＶプロモーター配列が含まれるが、これらに限定されない。別の例で、抗原をコードするカセット及び免疫調節剤をコードする核酸配列は、それぞれが独立して転写されるように、欠失領域を含む、同じウイルスベクターの異なる領域に挿入することができる。一例で、発現カセットが欠失したＥ１領域に導入されるベクターが設計され、免疫チェックポイント阻害因子が、Ｅ１／Ｅ３欠失ＣｈＡｄＶ６８ウイルスベクターの欠失したＥ３領域に導入される。
Ｖ．Ｃ．ワクチン設計及び製造に関する更なる考慮事項
Ｖ．Ｃ．１．すべての腫瘍サブクローンをカバーする１セットのペプチドの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が、ワクチン中への包含について優先される５３。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、更なるペプチドを優先順位付けすることができる５４。
Ｖ．Ｃ．２．抗原の優先順位決定
上記の抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１．自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２．シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３．免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４．提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５．遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６．ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（１セットの抗原の提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、腫瘍が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある）
７．ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある）
更に、任意で、抗原が患者の腫瘍のすべてまたは一部において喪失するかまたは不活性化されたＨＬＡアレルによって提示されることが予想される場合には、これらの新生抗原のワクチン接種における優先順位を下げる（例えば除外）することができる。ＨＬＡアレルの喪失は、体細胞変異、ヘテロ接合性の喪失、または遺伝子座のホモ接合欠失のいずれかによって生じ得る。ＨＬＡアレルの体細胞変異の検出方法は当技術分野では周知のものである（例えば、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。体細胞ＬＯＨ及びホモ接合欠失（ＨＬＡ遺伝子座を含む）の検出方法についても同様に述べられている（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。質量分析データが、予測された抗原が予測されたＨＬＡアレルによって提示されないことを示している場合、抗原は優先順位を下げることもできる。
Ｖ．Ｄ．アルファウイルス
Ｖ．Ｄ．１．アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株ＴＣ－８３などの新世界型に分類される（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４）。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約１２ｋｂであり、その最初の２／３は、ウイルスゲノムを自己複製するためのＲＮＡ複製複合体を形成する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする遺伝子を含んでおり、最後の１／３は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる（Ｆｒｏｌｏｖ ＲＮＡ ２００１）。
アルファウイルスのモデル生活環は、複数の異なるステップを含む（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｒｉａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １９９４，Ｊｏｓｅ Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００９）。宿主細胞にウイルスが吸着した後、ビリオンが細胞内区画内の膜と融合し、最終的にゲノムＲＮＡをサイトゾル中に放出する。プラス鎖の向きを有し、５’メチルグアニル酸キャップ及び３’ポリＡテールを有するゲノムＲＮＡは、翻訳されて非構造タンパク質ｎｓＰ１－４を生成し、これが複製複合体を形成する。感染初期には、プラス鎖はこの複合体によってマイナス鎖の鋳型に複製される。現在のモデルでは、複製複合体は感染が進行するにつれて更にプロセシングされ、生じたプロセス後の複合体はマイナス鎖の完全長プラス鎖ゲノムＲＮＡ及び構造遺伝子を含む２６Ｓのサブゲノムプラス鎖ＲＮＡへの転写に切り替わる。アルファウイルスのいくつかの保存配列エレメント（ＣＳＥ）が、マイナス鎖鋳型からのプラス鎖ＲＮＡの複製における５’ＵＴＲの相補体、ゲノム鋳型からのマイナス鎖合成の複製における５１ｎｔのＣＳＥ、マイナス鎖からのサブゲノムＲＮＡの転写におけるｎｓＰと２６Ｓ ＲＮＡとのジャンクション領域内の２４ｎｔのＣＳＥ、及び、プラス鎖鋳型からのマイナス鎖合成における３’ １９ｎｔのＣＳＥを含む様々なＲＮＡ合成ステップにおいて潜在的に一定の役割を担っているものとして同定されている。
ウイルスの自然の生活環では、異なるＲＮＡ種の複製後、ウイルス粒子が通常、アセンブルされる。２６Ｓ ＲＮＡは翻訳され、生じたタンパク質は更にプロセシングされて、カプシドタンパク質、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびに２種類の小ポリペプチドＥ３及び６Ｋを含む構造タンパク質を生成する（Ｓｔｒａｕｓｓ １９９４）。ウイルス粒子のカプシド形成が生じ、通常はゲノムＲＮＡのみに特異的なカプシドタンパク質がパッケージングされた後、ビリオンがアセンブルされ、膜表面に出芽する。
Ｖ．Ｄ．２．送達ベクターとしてのアルファウイルス
アルファウイルス（アルファウイルス配列、特性、及び他の要素を含む）は、アルファウイルスに基づく送達ベクター（アルファウイルスベクター、アルファウイルスウイルスベクター、アルファウイルスワクチンベクター、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクター、または自己増幅ＲＮＡ（ｓａｍＲＮＡ）ベクターとも呼ばれる）を生成するために使用することができる。アルファウイルスは、発現ベクターシステムとして使用するために従来、遺伝子操作がなされている（Ｐｕｓｈｋｏ１９９７，Ｒｈｅｍｅ２００４）。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。更に、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有し得る。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、ＶＥＥのＴＣ－８３株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの抗原発現を可能とし、抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。更に、抗原発現カセットは、ベクターが、ＶＥＥまたはその弱毒化誘導株ＴＣ－８３に由来する配列を含む（ただしこれらに限定されない）どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス配列を用いたいくつかの発現ベクターの設計戦略が開発されている（Ｐｕｓｈｋｏ １９９７）。１つの戦略では、アルファウイルスベクターの設計は、構造タンパク質遺伝子の下流に２６Ｓプロモーター配列因子の第２のコピーを挿入した後、異種遺伝子を挿入することを含む（Ｆｒｏｌｏｖ１９９３）。これにより、天然の非構造及び構造タンパク質以外に、更なる異種タンパク質を発現するサブゲノムＲＮＡが産生される。このシステムでは、感染性ビリオンを産生するためのすべての因子が存在し、したがって、非感染細胞において発現ベクターの繰り返しの感染のラウンドが行われ得る。
別の発現ベクターの設計では、ヘルパーウイルスシステムを利用する（Ｐｕｓｈｋｏ１９９７）。この戦略では、構造タンパク質は異種遺伝子によって置換される。したがって、依然としてインタクトな非構造遺伝子によって媒介されるウイルスＲＮＡの自己複製の後、２６ＳサブゲノムＲＮＡが異種タンパク質の発現をもたらす。従来、構造タンパク質を発現する更なるベクターが、例えば、細胞株の同時トランスフェクションなどによってイン・トランスで与えられることで感染性ウイルスを生じる。１つのシステムが米国特許第８，０９３，０２１号に記載されており、それはあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヘルパーベクターシステムは、感染性粒子を形成する可能性を制限するという長所をもたらし、したがってバイオセーフティーを改善する。更に、ヘルパーベクターシステムは、全ベクター長を短縮し、複製及び発現の効率を改善する可能性がある。したがって、本明細書に記載される抗原発現ベクターの一例では、構造タンパク質が抗原カセットで置換されたアルファウイルス骨格を用いることができ、得られるベクターはバイオセーフティーの問題が低減されるのと同時に全体的な発現ベクターのサイズの減少により、効率的な発現を促進する。
Ｖ．Ｄ．３．インビトロでのアルファウイルスの生成
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のＲＮＡポリヌクレオチドである。ＲＮＡ生成のための当技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳ＩＶＴがある。この方法では、所望のベクターのＤＮＡ鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学的方法を含む当技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡに転写されることが望ましい配列の５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、ＤＮＡ鋳型は、適当なＲＮＡポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド（ＮＴＰ）とインキュベートされる。得られたＲＮＡポリヌクレオチドは、７－メチルグアノシンまたは関連する構造などの５’キャップ構造の付加、及び任意で、ポリアデニル化（ポリＡ）テールを有するように３’末端を改変することを含む（ただしこれらに限定されない）方法によって、任意で更に改変することができる。次に、ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出などの当技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
Ｖ．Ｄ．４．脂質ナノ粒子による送達
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の１つとして、ベクター自体に対する免疫がある（Ｒｉｌｅｙ ２０１７）。これは、例えば特定のヒトアデノウイルスシステムなどのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
アルファウイルスベクターの場合では、標準的な送達方法は、カプシド、Ｅ１、及びＥ２タンパク質をイン・トランスで与えることによって感染性のウイルス粒子を生じる上記に述べたヘルパーウイルスシステムである。しかしながら、Ｅ１及びＥ２タンパク質は、しばしば中和抗体の主要な標的である点に留意することが重要である（Ｓｔｒａｕｓｓ１９９４）。したがって、対象とする抗原を標的細胞に送達するためにアルファウイルスベクターを使用することの有効性は、感染性粒子が中和抗体の標的とされる場合に低下する可能性がある。
ウイルス粒子を媒介とする遺伝子送達に代わる代替的手法として、ナノ粒子を用いた発現ベクターの送達がある（Ｒｉｌｅｙ２０１７）。重要な点として、ナノ材料担体は、非免疫原性材料で形成することができ、送達ベクター自体に対する免疫の誘発を一般的に回避することができる。これらの材料としては、これらに限定されるものではないが、脂質、無機ナノ材料、及び他のポリマー材料を挙げることができる。脂質は、カチオン性、アニオン性、または中性であってよい。かかる材料は、合成または天然由来のものであってよく、特定の例では生分解性であってよい。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体（ＰＥＧ化脂質）を含む（ただしこれに限定されない）脂質複合体、ワックス、油類、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含み得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、膜及び小胞状構造の形成を可能とする脂質の両親媒性の性質のために魅力的な送達システムである（Ｒｉｌｅｙ２０１７）。一般的にこれらの小胞は、標的細胞の膜内に吸収され、サイトゾル中に核酸を放出することによって発現ベクターを送達する。更に、ＬＮＰは特定の細胞種のターゲティングを促すように更に改変または官能化することができる。ＬＮＰの設計における別の考慮事項は、ターゲティングの効率と細胞毒性との間のバランスである。脂質の組成は一般的に、カチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質の規定の混合物を含む。いくつかの例では、ＬＮＰの凝集を防止するか、脂質の酸化を防止するか、または更なる部分の付着を促す化学官能基を与えるために特定の脂質が含まれる。脂質の組成は、全体のＬＮＰのサイズ及び安定性に影響し得る。１つの例では、脂質の組成は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＭＣ３）またはＭＣ３様分子を含む。ＭＣ３及びＭＣ３様脂質の組成物は、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ複合化脂質、ステロール、または中性脂質などの１種類以上の他の脂質を含むように製剤化することができる。
血清に直接曝露された発現ベクターなどの核酸ベクターは、血清中のヌクレアーゼによる核酸の分解、または遊離核酸による免疫系のオフターゲットの刺激を含むいくつかの望ましくない影響を有し得る。したがって、アルファウイルスベクターの封入を利用して分解を防止する一方で、潜在的なオフターゲット効果も防止することができる。特定の例では、アルファウイルスベクターは、ＬＮＰの水性の内部など、送達担体内に完全に封入される。ＬＮＰ内へのアルファウイルスベクターの封入は、微小流体液滴生成装置で行われる微小流体混合及び液滴生成などの当技術分野では周知の方法によって実施することができる。かかる装置としては、これらに限定されるものではないが、標準的なＴジャンクション装置またはフローフォーカシング装置が挙げられる。１つの例では、ＭＣ３またはＭＣ３様分子含有組成物などの所望の脂質製剤を、アルファウイルス送達ベクター及び他の所望の物質と並行して液滴生成装置に供給することで、送達ベクター及び所望の物質がＭＣ３またはＭＣ３様分子ベースのＬＮＰの内部に完全に封入される。１つの例では、液滴生成装置は、生成されたＬＮＰの粒径範囲及び粒度分布を制御することができる。例えば、ＬＮＰは、直径１～１０００ｎｍの範囲の粒径、例えば、１、１０、５０、１００、５００、または１０００ｎｍの粒径を有することができる。液滴生成の後、発現ベクターを封入した送達ベクターを、投与に備えて更に処理または改変することができる。
Ｖ．Ｅ．チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）
Ｖ．Ｅ．１．チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー起源のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって１種類以上の抗原を送達する（例えば、抗原カセットにより及び１種類以上の新生抗原を含む）ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーＣ６８アデノウイルス（本明細書ではＣｈＡｄＶ６８とも呼ぶ）のヌクレオチド配列を、抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる（配列番号１を参照）。Ｃ６８アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第６，０８３，７１６号に更に詳細に記載されており、それはあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
更なる態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列と、発現を誘導する調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む、組換えアデノウイルスが提供される。この組換えウイルスは、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞に感染させることが可能であり、細胞内で抗原カセットの産物を発現することが可能である。このベクターでは、天然のチンパンジーＥ１遺伝子、及び／またはＥ３遺伝子、及び／またはＥ４遺伝子を欠失させることができる。抗原カセットを、これらの遺伝子欠失部位のいずれに挿入することもできる。抗原カセットは、それに対するプライミングされた免疫応答が望ましい抗原を含むことができる。
別の態様において、本明細書では、Ｃ６８などのチンパンジーアデノウイルスを感染させた哺乳動物細胞が提供される。
更なる別の態様では、チンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＣ６８由来の）またはその機能的フラグメントを発現する新規な哺乳動物細胞株が提供される。
更に別の態様において、本明細書では、哺乳動物細胞内に抗原カセットを送達するための方法が提供され、前記方法は、細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された、有効量のＣ６８などのチンパンジーアデノウイルスを導入する工程を含む。
更なる別の態様は、哺乳動物宿主に免疫応答を誘発してがんを治療するための方法を提供する。この方法は、免疫応答が標的とする腫瘍に由来する１種類以上の抗原をコードする抗原カセットを含む、有効量のＣ６８などの組換えチンパンジーアデノウイルスを宿主に投与する工程を含むことができる。
更に、配列番号１の配列から得られるチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する非サル哺乳動物細胞も開示される。この遺伝子は、配列番号１のアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５からなる群から選択することができる。
更に、配列番号１の配列から得られる遺伝子を含むチンパンジーアデノウイルスのＤＮＡ配列を含む核酸分子も開示される。この遺伝子は、配列番号１の前記チンパンジーアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失した、配列番号１の配列を含む。
更に、配列番号１から得られるチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、異種宿主細胞内でカセットの発現を誘導する１つ以上の調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含むベクターも開示され、任意で、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列が、複製及びカプシド形成に必要とされる少なくともシスエレメントを含み、シスエレメントが抗原カセット及び調節配列に隣接している。いくつかの態様において、チンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列は、配列番号１のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子配列から選択される遺伝子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、Ｅ１Ａ及び／またはＥ１Ｂ遺伝子を欠失していてもよい。
更に、抗原カセットを発現するように操作されたＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターをトランスフェクトした宿主細胞も開示される。更に、細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することによって細胞内に導入された選択された遺伝子を発現するヒト細胞も開示される。
更に、哺乳動物細胞に抗原カセットを送達するための方法も提供され、前記方法は、前記細胞内に、抗原カセットを発現するように操作された有効量のＣ６８ベクターなどの本明細書に開示されるベクターを導入することを含む。
更に、哺乳動物細胞内に本明細書に開示されるベクターを導入することと、適当な条件下で細胞を培養することと、抗原を産生することとを含む、抗原を産生するための方法も開示される。
Ｖ．Ｅ．２ Ｅ１発現相補性細胞株
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス（Ａｄ）を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能（ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合）をヘルパーウイルスまたは細胞株（すなわち、相補性またはパッケージング細胞株）によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのＥ１遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはＨＥＫ２９３またはそのバリアントが含まれ得る。チンパンジーＥ１遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール（米国特許第６，０８３，７１６号の実施例３及び実施例４）にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
ＡＡＶ強化アッセイを用いてチンパンジーアデノウイルスＥ１発現細胞株を同定することができる。このアッセイは、他の特性評価されていないアデノウイルス（例えば他の種由来）のＥ１遺伝子を使用して作製された細胞株においてＥ１の機能を同定するうえで有用である。このアッセイは米国特許第６，０８３，７１６号の実施例４Ｂに記載されている。
選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１）は、選択された親細胞株で発現するためのプロモーターの転写制御下にある可能性がある。この目的で誘導性または構成性プロモーターを用いることができる。誘導性プロモーターには、亜鉛によって誘導されるヒツジメタロチオニンプロモーター、または糖質コルチコイド、特にデキサメタゾンによって誘導されるマウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ９５／１３３９２号において同定されるものなどの他の誘導性プロモーターもパッケージング細胞株の作製に使用することができる。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の発現を制御する構成性プロモーターも用いることができる。
任意の所望のＣ６８遺伝子を発現する新規な細胞株を作製するために親細胞を選択することができる。限定されることなく、かかる親細胞株は、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５）、ＫＢ（ＣＣＬ１７）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２）、及びＷＩ－３８（ＣＣＬ７５）細胞であってよい。他の適当な親細胞株を他の供給元から入手することができる。親細胞株としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはそのバリアント、９１１、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＬＰ－２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＡＥ１－２ａを挙げることができる。
Ｅ１発現細胞株は、組換えチンパンジーアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用となり得る。１つ以上の他のチンパンジーアデノウイルス遺伝子産物を発現する基本的に同じ手順を用いて構築された細胞株は、これらの産物をコードする遺伝子に欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルスベクターの作製において有用である。更に、他のヒトＡｄＥ１遺伝子産物を発現する細胞株も、チンパンジー組換えＡｄを作製するうえで有用である。
Ｖ．Ｅ．３．ベクターとしての組換えウイルス粒子
本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種類の抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、Ｃ６８のようなチンパンジーアデノウイルスＤＮＡ配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された抗原カセットとを含む。Ｃ６８ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。Ｃ６８ベクターは１つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。抗原カセットは、プロモーターなどの１つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも１つの抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
「機能的に欠失された」という用語は、その遺伝子領域の充分な量が除去または例えば変異もしくは改変により他の形で変化させられていることにより、その遺伝子領域が遺伝子発現の１つ以上の機能的産物を産生できなくなっていることを意味する。機能的欠失につながり得る変異または改変としては、これらに限定されるものではないが、未成熟終止コドンの導入及び基準及び非基準開始コドンの除去のようなナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライシングまたは他の転写プロセシングを変化させる変異、またはこれらの組み合わせが挙げられる。必要な場合、遺伝子領域全体を除去することができる。
配列の欠失、挿入、及び他の変異を含む、本明細書に開示されるベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的手法を用いて生成することができるものであり、本明細書の範囲内である。
Ｖ．Ｅ．４．ウイルスプラスミドベクターの構築
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子に機能的欠失を有し、任意で例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている（例えば、上記に引用のＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＩＩ、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第５，２４０，８４６号を参照）。
抗原カセットをヒト（または他の哺乳動物）細胞に送達するための有用なチンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターの構築において、広範囲のアデノウイルス核酸配列をベクターに用いることができる。最小のチンパンジーＣ６８アデノウイルス配列を含むベクターをヘルパーウイルスと共に使用して感染性の組換えウイルス粒子を作製することができる。ヘルパーウイルスは、最小のチンパンジーアデノウイルスベクターのウイルス感染性及び増殖に必要な基本的な遺伝子産物を提供する。チンパンジーアデノウイルス遺伝子の１つ以上の選択された欠失のみが、欠失がなければ機能性のウイルスベクターに導入される場合、欠失された遺伝子産物は、欠失された遺伝子機能をイン・トランスで与えるウイルスを選択されたパッケージング細胞株内で増殖させることによるウイルスベクター作製プロセスで供給することができる。
Ｖ．Ｅ．５．組換え最小アデノウイルス
最小チンパンジーＡｄ Ｃ６８ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の５’及び３’の末端逆位繰り返し配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）と、天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン（直鎖状のＡｄのゲノム及びＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）とを含む。例えば、国際特許出願第ＷＯ９６／１３５９７号において「最小」ヒトＡｄベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
Ｖ．Ｅ．６．他の欠損アデノウイルス
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
１つの例として、適当なベクターは、Ｃ６８アデノウイルスの最初期遺伝子Ｅ１ａ及び後初期遺伝子Ｅ１ｂの全体または充分な部分を欠失させることにより、それらの正常な生物学的機能を失わせることによって形成することができる。複製不全Ｅ１欠失ウイルスは、対応する遺伝子産物をイン・トランスで与える機能的アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含むチンパンジーのアデノウイルス形質転換相補性細胞株で増殖させた場合に感染性のウイルスを複製及び生成することが可能である。既知のアデノウイルス配列に対する相同性に基づけば、得られる組換えチンパンジーアデノウイルスは、当技術分野のヒト組換えＥ１欠失アデノウイルスでそうであるように多くの細胞種に感染することが可能であり、抗原を発現することができるが、チンパンジーＥ１領域ＤＮＡを有していない多くの細胞では、細胞が極めて高い感染多重度で感染していない限りは複製できないものと予想される。
別の例として、Ｃ６８アデノウイルス後初期遺伝子Ｅ３の全体または一部を、組換えウイルスの一部を形成するチンパンジーアデノウイルス配列から除去することができる。
チンパンジーアデノウイルスＣ６８ベクターは、Ｅ４遺伝子の欠失を有するように構築することもできる。更に別のベクターは、後初期遺伝子Ｅ２ａに欠失を有することができる。
欠失は、チンパンジーＣ６８アデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１～Ｌ５のいずれに導入することもできる。同様に、中期遺伝子ＩＸ及びＩＶａ２内の欠失も特定の目的では有用となり得る。他の欠失を他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子に導入することもできる。
上記に述べた欠失は、個々に用いることもできる。すなわち、アデノウイルス配列はＥ１のみの欠失を有してもよい。また、それらの生物学的活性を破壊または低減するうえで効果的な遺伝子全体またはその一部を任意の組み合わせで用いることもできる。例えば、１つの例示的なベクターでは、アデノウイルスＣ６８配列は、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子、またはＥ１及びＥ３遺伝子、または、Ｅ３の欠失をともなうかまたはともなわない、Ｅ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子の欠失を有することができる。上記に述べたように、かかる欠失は、所望の結果を得るために温度感受性変異などの他の変異と組み合わせて用いることができる。
抗原を含むカセットを、任意でチンパンジーＣ６８Ａｄウイルスの任意の欠失領域に挿入することができる。また、必要に応じて既存の遺伝子領域内にカセットを挿入することでその領域の機能を破壊することもできる。
Ｖ．Ｅ．７．ヘルパーウイルス
抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターコンストラクト中に存在しない、及び／またはベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞株によって発現されない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。ヘルパーウイルスは複製不全であってよく、上記に述べた配列以外の様々なアデノウイルス遺伝子を含むことができる。ヘルパーウイルスは、本明細書に記載されるＥ１発現細胞株と組み合わせて用いることができる。
Ｃ６８では、「ヘルパー」ウイルスは、Ｃ６８ゲノムのＣ末端を、ウイルスの左端から約１３００ｂｐを除去するＳｓｐＩによって短縮することによって形成されるフラグメントとすることができる。次に、この短縮されたウイルスをプラスミドＤＮＡと共にＥ１発現細胞株内に同時トランスフェクトすることにより、プラスミド内のＣ６８配列との相同組換えによって組換えウイルスを形成する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６９８５－１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒ．１，１９９４）に記載されるようなポリカチオン複合体として形成することもできる。ヘルパーウイルスは、任意で、レポーター遺伝子を含んでもよい。多くのかかるレポーター遺伝子が当技術分野で知られている。アデノウイルスベクター上の抗原カセットとは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在によって、Ａｄベクターとヘルパーウイルスを独立して観察することが可能となる。この第２のレポーター遺伝子を用いることで、精製時に得られた組換えウイルスとヘルパーウイルスとを分離することが可能である。
Ｖ．Ｅ．８．ウイルス粒子のアセンブリと細胞株の感染
アデノウイルス、抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたＤＮＡ配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のｃＤＮＡのクローニング法、インビトロ組換え法（例えば、ギブソンアセンブリ）、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
例えば、所望の抗原を含むウイルスベクターの構築及びアセンブリの後、ベクターをインビトロでヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトすることができる。ヘルパーとベクター配列との間で相同組換えが起こり、これによりベクター内のアデノウイルス－抗原配列が複製されてビリオンカプシド内にパッケージングされ、組換えウイルスベクター粒子が得られる。
得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルスは、抗原カセットを選択された細胞に導入するうえで有用である。パッケージング細胞株内で増殖させた組換えウイルスを用いたインビボ実験において、Ｅ１欠失組換えチンパンジーアデノウイルスが、カセットを非チンパンジー細胞、好ましくはヒト細胞に導入するうえで実用性を有することが実証されている。
Ｖ．Ｅ．９．組換えウイルスベクターの使用
したがって、抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーＣ６８アデノウイルス（上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される）は、抗原をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
上記に述べた組換えベクターは、遺伝子治療について公開されている方法にしたがってヒトに投与される。抗原カセットを有するチンパンジーウイルスベクターは、好ましくは生体適合性溶液または薬学的に許容される送達溶媒中に懸濁させて患者に投与することができる。適当な溶媒としては滅菌生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容される担体として知られ、当業者には周知のものである他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的で使用することもできる。
チンパンジーアデノウイルスベクターは、ヒト細胞を形質転換し、医療分野の当業者によって判定することが可能な有害作用をともなわずに、または医学的に許容される生理学的作用をともなって、治療効果を与えるうえで充分なレベルの抗原の導入及び発現をもたらすのに充分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、肝臓、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
ウイルスベクターの用量は、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康状態などの因子に主として依存し、したがって患者間で異なり得る。用量は、あらゆる副作用に対して治療効果のバランスが取れるように調節され、かかる用量は、組換えベクターが用いられる治療用途に応じて異なり得る。抗原の発現レベルを観察することにより、投与頻度を決定することができる。
組換え複製不全アデノウイルスは、「薬学的有効量」、すなわち、所望の細胞をトランスフェクトし、ワクチン効果、すなわち一定の測定可能なレベルの防御免疫をもたらすような選択された遺伝子の充分な発現レベルを与えるのにある投与経路で有効な組換えアデノウイルスの量で投与することができる。抗原を含むＣ６８ベクターは、アジュバントと同時投与することができる。アジュバントは、ベクターとは別のモノマーの出会ってもよく（例えばミョウバン）または特にアジュバントがタンパク質である場合にはベクター内にコードされてもよい。アジュバントは当技術分野では周知のものである。
従来の薬学的に許容される投与経路としては、これらに限定されるものではないが、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸内、経口、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせるか、または免疫原もしくは疾患に応じて調節することができる。例えば、狂犬病の予防では、皮下、気管内、及び鼻腔内経路が好ましい。投与経路は、主として治療される疾患の性質によって決められる。
抗原に対する免疫のレベルを観察することにより、ブースターの必要性（ある場合）を決定することができる。例えば、血清中の抗体力価の評価の後、必要に応じてブースター免疫が望ましい場合がある。
ＶＩ．治療及び製造の方法
更に、１つ以上の抗原（例えば、本明細書に開示された方法を使用して同定された複数の抗原）を対象に投与すること（例えば、エピトープコード核酸配列及び任意で５’及び／または３’リンカー配列を有する、抗原コード核酸配列を含有するカセットを投与すること）により、対象の免疫応答を刺激する（例えば、免疫応答を誘導、増加、または増強する（例えば、Ｔ細胞応答を誘導、増加、もしくは増強する））、対象の腫瘍特異的な免疫応答を刺激する、腫瘍にワクチン接種を行う、対象のがんの症状を治療およびまたは緩和する方法も提供されている。例えば、本明細書に記載の方法は、エピトープ特異的なＴ細胞応答を誘導、増加、または増強する（例えば、エピトープ特異的なＴ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞サイトカイン産生及び／または分泌、Ｔ細胞分化、Ｔ細胞長寿命、またはそれらの任意の組み合わせを誘導、増加または増強する）ことができる。本明細書に記載の方法は、対象の免疫応答を刺激すること（例えば、アルファウイルスに基づく発現システム（例えば、エピトープコード核酸配列、ならびに任意で５’及び／または３’リンカー配列を有する、抗原コード核酸配列を含む、カセットをコードする１つ以上のアルファウイルスに基づくベクターを投与すること）とＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子とを組み合わせて投与することにより、免疫応答を誘導、増加、または増強すること）を含む。
更に、ＲＮＡアルファウイルス骨格及びコードされたペイロード（例えば、カセット）を有する１つ以上のベクターを、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子と組み合わせて投与することにより、アルファウイルスに基づく発現システムによるペイロードの送達を増強する方法も提供される。ペイロードは、目的の細胞に送達されることが望まれる、任意のヌクレオチド配列であり得る。一般に、ペイロードは、ヌクレオチド配列の発現を駆動するためにプロモーターに機能的に連結されたカセットである。ヌクレオチド配列は、翻訳領域（すなわち、転写され、タンパク質に翻訳されることが可能なポリペプチドコード核酸配列）であり得る。一般に、ポリペプチドコード核酸配列は、細胞内で発現されることが望まれる任意のタンパク質をコードすることができる。タンパク質の例としては、抗体、サイトカイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、またはゲノム編集システム要素（例えば、ゲノム編集システムで使用されるヌクレアーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。ゲノム編集システムには、ＣＲＩＳＰＲシステム、ジンクフィンガーシステム、メガヌクレアーゼシステム、またはＴＡＬＥＮシステムが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド配列は、非コード（すなわち、転写されることが可能であるが、タンパク質に翻訳されない核酸配列）であり得る。一般に、非コード核酸配列は、細胞内で発現されることが望まれる、任意の非コードポリヌクレオチドをコードすることができる。非コードポリヌクレオチドの例としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、またはゲノム編集システムポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、トランスアクティブＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫及び白血病などの、血液腫瘍であることができる。
抗原は、ＣＴＬ応答を誘導するのに充分な量で投与することができる。
抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質を更に投与することができる。例えば、対象に、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１を更に投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、ＣＴＬＡ－４遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各抗原の最適量、及び最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、抗原またはそのバリアントは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調製することができる。注射の方法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、及びｉ．ｖ．を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する抗原の選択、数、及び／または量が、組織、がん、及び／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされ得る、または患者の変異状態によって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、及び当然、患者のＨＬＡハプロタイプに依存し得る。更に、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における抗原の発現にしたがって抗原の選択を変えること、または、処置の第１のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
患者は、抗原ワクチンを投与するために様々な診断方法、例えば、以下に更に記載される患者選択方法を使用して同定することができる。患者選択は、１つ以上の遺伝子の変異または発現パターンを同定することを含み得る。場合によっては、患者選択は、患者のハプロタイプの同定を含む。様々な患者選択方法は、並行して実施することができ、例えば、配列決定診断は、患者の変異とハプロタイプの両方を同定することができる。種々の患者選択方法は、順次に実行することができ、例えば、１つの診断テストが変異を識別し、別個の診断テストが患者のハプロタイプを識別し、ここで、各テストは、同じ（例えば、両方ともハイスループット配列決定）または異なる（例えば、一方がハイスループット配列決定及び他方がＳａｎｇｅｒ配列決定）診断方法であることができる。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの医薬組成物は、多量に存在することができ、及び／または、この特定の抗原もしくはこの抗原の経路に特異的な１種類よりも多い抗原を含めることができる。
抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を惹起し、かつ、症候及び／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに充分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命に関わるか、または潜在的に命に関わる状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、及び抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、及びその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき抗原は、単独で、または、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性及び負電荷を有するリン脂質、及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、及び血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、及び任意でペプチドの１つ以上をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５－１４６８（１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にＤＮＡからなる粒子を、投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションをともなうかまたはともなわない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ９６／１８３７２；９３２４６４０ＷＯＡＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ＆Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６（７）：６８２－６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；９１０６３０９ＷＯＡＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されている。
抗原にはまた、ウイルスベクター系ワクチンプラットフォーム（例えば、ワクシニア、フォウルポックス、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス）（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、またはこれらに限定されない、第２、第３またはハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス、及び特定の細胞型または受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含む、レンチウイルスも含まれる（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１，Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８，Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）。前述のウイルスベクター系ワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、この方法は、１つ以上の抗原ペプチドをコードする、１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。この配列は、非変異配列に隣接されていてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または細胞内区画を標的とする１つ以上の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８，Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０参照のこと）。宿主に導入されると、感染した細胞は抗原を発現し、それによってペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を誘発する。免疫化プロトコールで有用なワクチンベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。抗原の治療的投与または免疫化に有用な他の種々のワクチンベクター（例えばチフス菌ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。
核酸を投与する手段は、１つ以上のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保持シグナルを含む。加えて、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、ＤＮＡに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちで最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び保護的、相互作用的、非縮合性（ＰＩＮＣ）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
更に、本明細書に開示する方法の工程を行うことと、多数の抗原または多数の抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産することとを含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も本明細書に開示する。
本明細書に開示する抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する抗原またはベクター（例えば、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生産する方法は、抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養することであって、宿主細胞が、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、前記培養することと、抗原またはベクターを精製することとを含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、及びクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を更に含む。特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであることができる。
ＶＩＩＡ．抗原及びペイロードの使用、ならびに投与
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に１つ以上の抗原を投与することができる（例えば、エピトープコード核酸配列及び任意で５’及び／または３’リンカー配列を有する、抗原コード核酸配列を含有する、カセットを投与すること）。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づくことができ、ブースターワクチンは、Ｃ６８（例えば、配列番号１または２に示される配列）またはｓｒＲＮＡ（例えば、配列番号３または４に示される配列）に基づくことができる。各ベクターは、通常、抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはＡＡＹなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約２０個の抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのＭＨＣＩＩ抗原、及びユニバーサルクラスＩＩ抗原とみなされるＰＡＤＲＥ抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。更に、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害因子（ＣＰＩ）と組み合わせて（例えば、同時、その前、またはその後で）対象に投与することができる。ＣＰＩは、抗体またはその抗原結合部分など、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及び／またはＰＤＬ１を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
プライミングワクチンは、対象に注射（例えば筋肉内に）することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ（例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１～１μｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１μｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１～１００μｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００μｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
プライムワクチン接種後に、ワクチンブースト（ブースターワクチン）を注射（例えば筋肉内に）することができる。ブースターワクチンは、プライム後の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間ごと、例えば、４週間ごと、及び／または８週間ごとに投与することができる。用量ごとに両側性注射を用いることができる。例えば、ＣｈＡｄＶ６８（Ｃ６８）の１回以上の注射を用いることができ（例えば、総用量１×１０１２個のウイルス粒子）、０．００１～１μｇのＲＮＡの範囲から選択される低ワクチン用量、詳細には０．１もしくは１μｇの自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の１回以上の注射を用いることができ、または、１～１００μｇのＲＮＡの範囲から選択される高ワクチン用量、詳細には１０もしくは１００μｇのｓｒＲＮＡの１回以上の注射を用いることができる。
抗ＣＴＬＡ－４（例えばトレメリムマブ）を対象に投与することもできる。例えば、抗ＣＴＬＡ４を筋肉内ワクチン注射（ＣｈＡｄＶ６８プライムまたはｓｒＲＮＡ低用量）の部位の近くに皮下投与することで同じリンパ節内に確実に送り込むことができる。トレメリムマブは、ＣＴＬＡ－４の選択的ヒトＩｇＧ２ｍＡｂ阻害因子である。標的抗ＣＴＬＡ－４（トレメリムマブ）皮下用量は、通常、７０～７５ｍｇ（詳細には７５ｍｇ）であり、例えば、１～１００ｍｇまたは５～４２０ｍｇの用量範囲である。
特定の場合では、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用することができる。デュルバルマブは、ＰＤ－１及びＣＤ８０へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する選択的な高親和性のヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。デュルバルマブは一般的に４週間ごとに２０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。
免疫モニタリングを、ワクチン投与の前、その間、及び／またはその後に行うことができる。かかるモニタリングは、他のパラメータの中でもとりわけ、安全性及び有効性についての情報を与えることができる。
免疫モニタリングを行うには、ＰＢＭＣが一般的に用いられる。ＰＢＭＣは、プライムワクチン接種の前、及びプライムワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に単離することができる。ＰＢＭＣは、ブーストワクチン接種の直前、及び各ブーストワクチン接種の後（例えば、４週間及び８週間）に採取することができる。
Ｔ細胞応答を、免疫モニタリングプロトコールの一環として評価することができる。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、サイトカイン分泌、及び細胞表面捕捉、Ｔ細胞増殖、ＭＨＣマルチマー染色、または細胞毒性アッセイなどの当業者には周知の１つ以上の方法を用いて測定することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対するＴ細胞応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＩＦＮ－γなどのサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを用いて、ＩＦＮ－γなどの細胞内または細胞外で捕捉されたサイトカインの誘導を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣマルチマー染色を用い、エピトープ／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞集団を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに対する特異的なＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞応答は、３Ｈチミジン、ブロモデオキシウリジン、及びカルボキシフルオロセイン－ジアセテート－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）の取り込み後に、Ｔ細胞集団のエクスビボ増殖を測定することによりＰＢＭＣから監視することができる。ワクチンにコードされたエピトープに特異的なＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の抗原認識能及び溶解活性は、クロム放出アッセイまたは代替的な比色細胞毒性アッセイにより機能的に評価することができる。
プロトコールは、１つ以上のアルファウイルスに基づく発現システムを対象に投与するために使用することができる（すなわち、ＲＮＡアルファウイルス骨格及びコードされたペイロード（例えば、カセット）を有する、１つ以上のベクターを投与すること）。一般に、ワクチン接種に対する前述のプロトコールに、本明細書に記載されたアルファウイルスに基づく発現システムのいずれかを投与するために従うことができる。
ＶＩＩＢ．Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の使用及び投与
本明細書に記載の方法は、ＲＮＡアルファウイルス骨格及びコードされたペイロード（例えば、カセット）を有する、１つ以上のベクターを組み合わせた投与、ならびにＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の投与を介して、アルファウイルスに基づく発現システムによるペイロードの送達を増強する方法を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の投与は、対象への投与後の、インビボでのアルファウイルスに基づくベクターの自己複製／自己増幅を改善する。アルファウイルスに基づくベクターの自己複製／自己増幅は、コード化されたペイロード（例えば、カセット）の改善された発現をもたらし得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、医薬組成物として製剤化することができる。
Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、ＩＦＮα阻害因子、ＩＦＮβ阻害因子、ＩＦＮＡＲ阻害因子、または他のＩ型インターフェロンシグナル伝達経路阻害因子であり得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の阻害因子は、抗体またはその抗原結合フラグメント、低分子阻害因子、ＲＮＡｉポリヌクレオチド、ゲノム編集システム、Ｆｃ融合タンパク質であり得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、抗ＩＦＮＡＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり得て、これには、ＭＡＲ１－５Ａ３、アニフロルマブ（ＭＥＤＩ５４６とも呼ばれる）、ＡｍＳ３Ａ５－１、６４Ｇ１２、Ｈ２Ｋ６、Ｈ２Ｋ１、Ｈ３Ｋ６、Ｈ３Ｋ１ ３Ｆ１１、４Ｇ５、１１Ｅ２、及び９Ｄ４が含まれるが、これらに限定されない。その詳細は、米国特許第７，６６２，３８１号及び同第７，６１９，０７０号に記載されており、それぞれがすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、抗ＩＦＮα抗体またはその抗原結合フラグメントであり得て、これには、シファリムマブ、ロンタリズマブ、またはＡＳＧ－００９が含まれるが、これらに限定されない。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の阻害因子は、ＪＡＫキナーゼの低分子阻害因子を含む、ＪＡＫキナーゼ阻害因子であり得る。ＪＡＫキナーゼ阻害因子としては、ＪＡＫ１／２阻害因子またはＪＡＫ１／３阻害因子が挙げられるが、これらに限定されない。ＪＡＫ１／３阻害因子の例としては、トファシチニブ（商品名Ｘｅｌｊａｎｚ、Ｊａｋｖｉｎｕｓ、及びＴｏｆａｃｉｎｉｘ）またはフィルゴチニブ（ＧＬＰＧ０６３４）が挙げられる。ＪＡＫ１／２阻害因子の例としては、ルキソリチニブ、バリシチニブ、またはモメロチニブ（ＣＹＴ３８７）が挙げられる。
Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物（すなわち、アルファウイルスに基づく送達プラットフォーム）の投与の前、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与前２４時間以内に投与され得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与前２４時間以内、２３時間以内、２２時間以内、２１時間以内、２０時間以内、１９時間以内、１８時間以内、１７時間以内、１６時間以内、１５時間以内、１４時間以内、１３時間以内、１２時間以内、１１時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムの送達のための組成物の投与後１２時間未満に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与後１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、または１時間未満に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与後６時間以内に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与後６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、または１時間以内に投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、発現システムを送達するための組成物の投与の２４時間前から投与後６時間以内の間に投与することができる。
Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与することができ、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、静脈内（ＩＶ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、静脈内投与（ＩＶ）することができ、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、ＩＭ投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、ＩＭ投与することができ、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、静脈内（ＩＶ）に投与することができ、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）投与することができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子は、ＩＭ投与することができ、発現システムを送達するための組成物は、筋肉内（ＩＭ）投与することができる。
Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の単回投与が行われ得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の複数回投与が行われ得る。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の複数の投与が、発現送達プラットフォームの複数の投与（例えば、アルファウイルスに基づく送達プラットフォームの複数の投与）と組み合わせて行われることができる。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子の複数の投与は、同一の方法で投与してもよいし、異なる方法（例えば、異なる経路、タイミングまたは投与量）で投与してもよい。
ＶＩＩＩ．抗原の同定
ＶＩＩＩ．Ａ．抗原候補の同定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析のための研究法を、抗原同定スペースに記載し、適用している６，１４，１５。臨床環境での抗原同定のための感度及び特異性を高めるために、一定の最適化を検討することができる。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びＮＧＳデータ解析に関連するものの、２つの区域にグループ化することができる。最適化の例は当業者に公知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳細に記載されている方法であって、それぞれは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩＩＩ．Ｂ． ＨＬＡペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った（５５～５８）。清澄化した溶解物を、ＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。
免疫沈降は、抗体がＨＬＡ分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスＩ ＨＬＡ免疫沈降のためには、汎クラスＩ ＣＲ抗体を使用し、クラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲのためには、ＨＬＡ－ＤＲ抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、ＮＨＳ－セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、ＩＰのために等分した（５９、６０）。免疫沈降は、ビーズに共有結合されていない抗体を用いて行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにＰｒｏｔｅｉｎＡ及び／またはＰｒｏｔｅｉｎＧでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。ＭＨＣ／ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
Figure 2022512912000006
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なＩＰを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはＣ１８分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、ＭＳ解析の前に－２０℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているＨＰＬＣ緩衝液において再構成し、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）における勾配溶出のために、Ｃ－１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度で収集し、その後、ＭＳ２低解像度スキャンを、選択イオンのＨＣＤフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、ＭＳ２スペクトルは、ＣＩＤもしくはＥＴＤフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための３つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。ＭＳ２スペクトルはまた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のＭＳ２スペクトルを、Ｃｏｍｅｔ（６１、６２）を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド同定を、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ（６３～６５）を用いてスコア化する。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）及び他のサーチエンジンを用いて更なるシークエンシングを行うか、またはスペクトルマッチング及びデノボシークエンシング（９７）を含むシークエンシング法を用いることができる。
ＶＩＩＩ．Ｂ．１．総合的ＨＬＡペプチドシークエンシングを支援するＭＳ検出限界の研究
ペプチドＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ（配列番号５９）を用いて、何が検出の限界かを、ＬＣカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、及び１００ａｍｏｌであった。（表１）結果を図２４Ａ及び図２４Ｂに示す。これらの結果は、検出の最低限界（ＬｏＤ）がアトモルの範囲（１０－１８）にあること、ダイナミックレンジが５桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（１０－１５）でシークエンシングに充分であるように見えることを示す。質量分析は、ＨＬＡ提示を検証するために、本明細書に記載された予測アルゴリズムと組み合わせて使用することができる。例えば、質量分析は、ＥＤＧＥ予測モデル（国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に記載されているように、ＭＳ／ＭＳによって配列決定されたＨＬＡ提示ペプチド上で訓練されたディープラーニングモデル）によって生成されたエピトープ候補を検証するために使用することができる。ＥＤＧＥスコアと、標的化ＭＳによって候補共有される新生抗原ペプチドの検出の確率との間の相関の例を、図２５に示す。
（表１）
Figure 2022512912000007
ＩＸ．提示モデル
提示モデルは、患者のペプチド提示の尤度を識別するために使用することができる。様々な提示モデルは当業者には公知であり、例えば、提示モデルは、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号、同第ＷＯ２０１６１８７５０８号、及び米国特許出願第２０１１０２９３６３７号に更に詳細に記載されており、それぞれがすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
Ｘ．訓練モジュール
ペプチド配列が、ペプチド配列に関連するＭＨＣ対立遺伝子によって提示されるかどうかの尤度を生成する訓練データセットに基づいて、１つ以上の提示モデルを構築するために、訓練モジュールを使用することができる。様々な訓練モジュールが当業者には公知であり、例えば、提示モデルは、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に更に詳細に記載されており、それぞれの全体が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。訓練モジュールは、アレル単位でペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築することができる。訓練モジュールはまた、２つ以上のＭＨＣ対立遺伝子が存在する複数アレル設定で、ペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築することもできる。
ＸＩ．予測モジュール
予測モジュールは、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補抗原を選択することができる。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の変異を有する部分を同定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を同定することができる。予測モジュールは、患者の正常組織細胞から抽出された配列データとその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データとを比較することにより、正常細胞または組織と比較して、腫瘍細胞またはがん組織で発現が変化した候補抗原を同定し、不適切に発現した候補抗原を同定し得る。
提示モジュールは、１つ以上の提示モデルを処理されたペプチド配列に適用して、ペプチド配列の提示尤度を推定することができる。具体的には、予測モジュールは、提示モデルを候補抗原に適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現態様では、提示モジュールは、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補抗原配列を選択する。別の実現態様では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するＮ個の候補抗原配列を選択する（Ｎは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補抗原を含む、ワクチンを、患者に注射して免疫応答を誘導することができる。
ＸＩ．Ｂ．カセット設計モジュール
ＸＩ．Ｂ．１．概要
カセット設計モジュールを使用して、患者に注射するための選択された候補ペプチドに基づいて、ワクチンカセット配列を生成することができる。種々のカセット設計モジュールは当業者に公知であり、例えば、カセット設計モジュールは、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に更に詳細に記載されており、そのそれぞれは、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
１セットの治療エピトープは、所定の閾値を上回る提示尤度（提示尤度は、提示モデルにより決定される）に関連付けられた予測モジュールによって決定された、選択されたペプチドに基づいて生成することができる。しかしながら、他の実施形態では、前記セットの治療エピトープは、多くの方法の任意の１つ以上（単独または組み合わせ）に基づいて、例えば、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合親和性もしくは予測される結合親和性、患者のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩアレルに対する結合安定性もしくは予測される結合安定性、ランダムサンプリングなどに基づいて、生成することができる。
治療エピトープは、選択されたペプチドに対応してもよい。治療エピトープは、選択されたペプチドに加えてＣ及び／またはＮ末端フランキング配列を含んでもよい。Ｎ及びＣ末端フランキング配列は、その由来源タンパク質との関連において、治療ワクチンエピトープの天然のＮ及びＣ末端フランキング配列であり得る。治療エピトープは、固定長のエピトープを表すことができる。治療エピトープは可変長のエピトープを表してもよく、ここで、エピトープの長さは、例えばＣまたはＮ末端フランキング配列の長さによって異なり得る。例えば、Ｃ末端フランキング配列及びＮ末端フランキング配列は、それぞれ２～５残基の異なる長さを有してよく、これによりエピトープの１６種類の可能な選択肢が与えられる。
カセット設計モジュールは、カセット内の一対の治療エピトープ間の連結部にまたがる、ジャンクションエピトープの提示を考慮することによってカセット配列を生成できる。ジャンクションエピトープは、カセット内で治療エピトープ及びリンカー配列を連結するプロセスによってカセット内に生じる、新規な非自己であるが無関係なエピトープ配列である。ジャンクションエピトープの新規な配列は、カセットの治療エピトープ自体とは異なる。
カセット設計モジュールは、ジャンクションエピトープがその患者で提示される尤度を低下させる、カセット配列を生成できる。具体的には、カセットが患者に注射される際、ジャンクションエピトープは、患者のＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩアレルによって提示される可能性を有し、それぞれＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激する。そのような応答は、ジャンクションエピトープに対する反応性を有するＴ細胞は治療効果を有さないことから望ましくなく、抗原競合によりカセット内の選択された治療エピトープに対する免疫応答を消失させる可能性がある７６。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセットについて繰り返し処理を行って、そのカセット配列に関連付けられたジャンクションエピトープの提示スコアが数値閾値を下回る、カセット配列を決定できる。ジャンクションエピトープ提示スコアは、カセット内のジャンクションエピトープの提示尤度に関連付けられた量であり、ジャンクションエピトープ提示スコアの値が高いほど、カセットのジャンクションエピトープがＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩまたはその両方によって提示されやすいことを示す。
一実施形態で、カセット設計モジュールは、候補カセット配列間で最も低いジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられたカセット配列を決定することができる。
カセット設計モジュールは、１つ以上の候補カセット配列について繰り返し処理を行い、各候補カセットのジャンクションエピトープ提示スコアを決定し、閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた最適なカセット配列を同定することができる。
カセット設計モジュールは、候補カセット配列内のジャンクションエピトープのいずれかが、ワクチンを設計しようとする特定の患者の自己エピトープであるかどうかを識別するために１つ以上の候補カセット配列を更に確認することができる。これを行うには、カセット設計モジュールは、ＢＬＡＳＴなどの既知のデータベースに対してジャンクションエピトープを確認する。一実施形態にて、カセット設計モジュールは、ジャンクション自己エピトープを防止するカセットを設計するように構成することができる。
カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチを実行して、すべての、または大部分の可能な候補カセット配列について繰り返し処理を行うことで最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する配列を選択することができる。しかしながら、かかる候補カセットの数は、ワクチンの容量が大きくなるにしたがって途方もなく大きくなり得る。例えば、２０個のエピトープのワクチン容量では、カセット設計モジュールは、最小のエピトープ提示スコアを有するカセットを決定するために約１０１８個の可能な候補カセットについて繰り返し処理を行わなければならない。この決定は、カセット設計モジュールが妥当な長さの時間内で患者に対するワクチンを生成するには計算の負荷（必要とされる計算処理リソースの点で）が大きくなり、時として処理不能となり得る。更に、各候補カセットについて可能なジャンクションエピトープを処理することはよりいっそうの負荷となり得る。したがって、カセット設計モジュールは、ブルートフォースアプローチにおける候補カセット配列の数よりも大幅に小さい候補カセット配列の数について繰り返し処理を行う方法に基づいてカセット配列を選択することができる。
カセット設計モジュールは、ランダムに、または少なくとも疑似ランダムに生成された候補カセットを生成することができ、所定の閾値を下回るジャンクションエピトープ提示スコアに関連付けられた候補カセットをカセット配列として選択する。更に、カセット設計モジュールは、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有するサブセットからの候補カセットをカセット配列として選択することができる。例えば、カセット設計モジュールは、２０個の選択されたエピトープのセットについて約１００万の候補カセットのサブセットを生成し、最小のジャンクションエピトープ提示スコアを有する候補カセットを選択することができる。ランダムカセット配列のサブセットを生成し、このサブセットからジャンクションエピトープ提示スコアの低いカセット配列を選択することはブルートフォースアプローチと比べて最適とはいえないが、これは、必要な計算リソースが大幅に少なく、そのため、その実施が技術的に可能である。更に、このより効率的な手法に対してブルートフォース法を行うことは、ジャンクションエピトープ提示スコアのわずかな、または更には無視される程度の改善しかもたらされない可能性があるため、リソースの配分の観点からはあまり価値がない。カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ配列を非対称巡回セールスマン問題（ＴＳＰ）として定式化することにより、改善されたカセット構成を決定できる。ノードのリスト及び各ノードのペア間の距離が与えられた場合、ＴＳＰは、各ノードをちょうど１回ずつ訪問して元のノードに戻るための最小の総距離に関連付けられたノードの配列を決定する。例えば、互いの間の距離が既知である都市Ａ、Ｂ、及びＣが与えられた場合、ＴＳＰの解は、可能な巡回路のうちで各都市をちょうど１回ずつ訪問するのに移動する総距離が最小となるような都市の閉じた配列を生成する。ＴＳＰの非対称バージョンは、ノードのペア間の距離が非対象である場合の最適なノードの配列を決定する。例えば、ノードＡからノードＢに移動するための「距離」は、ノードＢからノードＡに移動するための「距離」と異なる場合がある。非対称ＴＳＰを用いて改良された最適カセットを解くことにより、カセット設計モジュールは、カセットのエピトープ間の接合部をまたいで低減された提示スコアをもたらす、カセット配列を見つけることができる。非対称ＴＳＰの解は、カセットの接合部をまたぐ接合エピトープ提示スコアを最小化するために、エピトープがカセット内で連結されるべき順序に対応する、治療用エピトープの配列を示す。この方法によって決定されたカセット配列は、生成された候補カセット配列の数が多い場合には特に、ランダムサンプリングアプローチよりもかなり少ない計算リソースを必要とする可能性がある一方で、接合部エピトープの提示がかなり少ない配列をもたらすことができる。カセット設計を最適化するための異なる計算方法及び比較の例示的な例は、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に更に詳細に記載されており、それぞれが、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＩＩＩ．例示的なコンピュータ
コンピュータは、本明細書に記載された計算方法のいずれかに使用することができる。当業者であれば、コンピュータが異なるアーキテクチャを有し得ることを認識するであろう。コンピュータの例は当業者に公知であり、例えば、コンピュータは、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／１０６６３８号、同第ＷＯ／２０１８／１９５３５７号、及び同第ＷＯ／２０１８／２０８８５６号に詳細に記載されており、それぞれは、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＸＩＶ．抗原送達ベクターの例
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
本発明の実施では、特に断らない限りは、当該技術分野の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いている。これらの技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
ＸＩＶ．Ａ．抗原カセットの設計
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答を刺激するクラスＩ ＭＨＣに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原（ＴＳＮＡ）を送達することができる。１つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはＴＳＮＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼし得るいくつかの設計パラメータが同定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、（１）１個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いＴ細胞応答を生じることができるかどうか、（２）どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のＴＳＮＡ間に配置される最適リンカーを作るか、（３）カセット内の各エピトープの相対位置がＴ細胞応答に影響するか、（４）カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するＴ細胞応答の程度または質に影響するかどうか、（５）細胞ターゲティング配列の付加がＴ細胞応答を向上させるか。
抗原提示及びモデルカセット内のマーカーエピトープに特異的なＴ細胞応答を評価するために以下の２つのリードアウトが開発された。すなわち、（１）特殊な操作を行ったレポーターＴ細胞の活性化によって測定される抗原提示の評価を可能としたインビトロ細胞ベーススクリーン（Ａａｒｎｏｕｄｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、及び（２）対応するエピトープ特異的Ｔ細胞応答によるヒト由来のカセットから誘導されたエピトープのワクチン接種後の免疫原性を評価するためにＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウス（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を使用したインビボアッセイ（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
ＸＩＶ．Ｂ．抗原カセット設計の評価
ＸＩＶ．Ｂ．１．方法及び材料
ＴＣＲ及びカセット設計及びクローニング
選択されたＴＣＲは、Ａ＊０２０１により提示される場合にペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１３２）（ＰＤＢ番号５Ｄ２Ｎ）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１３３）（ＰＤＢ番号３ＲＥＶ）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１３４）（ＰＤＢ番号１ＯＧＡ）ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号１３５）（ＰＤＢ番号１ＡＯ７）を認識する。２Ａペプチド連結ＴＣＲサブユニット（βに続きα）、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及び２Ａ連結ＣＤ８サブユニット（βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子）を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成されたものである。
インビトロエピトーププロセシング及び提示実験用の細胞株の作製
ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅまたはＧｅｎｓｃｒｉｐｔより購入し、水／ＤＭＳＯ（２：８，ｖ／ｖ）に加えた１０ｍＭ ｔｒｉｓ（２－カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはＧｉｂｃｏより入手した。熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳｈｉ）はＳｅｒａｄｉｇｍより入手した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質、ゼオシン、及びプロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎより入手した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を１０％ ＦＢＳｈｉ、ピルビン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬのゼオシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。形質導入した後、これらの細胞に更に０．３μｇ／ｍＬのプロマイシンを加えた。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２）をＩｓｃｏｖｅ培地（ＩＭＤＭ）＋２０％ＦＢＳｈｉ中で培養した。Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）細胞を、１０％ＦＢＳｈｉを添加したＭＥＭ Ｅａｇｌｅｓ培地中で維持した。
Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞は、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターコンストラクトを含んでいる。Ｌｕｃｉａ遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合によって活性化されると、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを培地中に分泌させる。このルシフェラーゼは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃルシフェラーゼ検出試薬を用いて測定することができる。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ細胞をレンチウイルスで形質導入して抗原特異的ＴＣＲを発現させた。ＨＩＶ由来レンチウイルストランスファーベクターをＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａより入手し、ＶＳＶ－Ｇ（ｐＣＭＶ－ＶｓｖＧ）、Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ）及びＧａｇ－ｐｏｌ（ｐＣｇｐＶ）を発現するレンチウイルス支持プラスミドをＣｅｌｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓより入手した。
レンチウイルスを、４０μＬのリポフェクタミン及び２０μｇのＤＮＡミクスチャー（重量比４：２：１：１のトランスファープラスミドｐＣｇｐＶ：ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ：ｐＣＭＶ－ＶｓｖＧ）を使用し、ＨＥＫ２９３細胞の５０～８０％コンフルエンスにあるＴ７５フラスコをリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でトランスフェクトすることにより調製した。８～１０ｍＬのウイルス含有培地をＬｅｎｔｉ－Ｘシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて濃縮し、ウイルスを１００～２００μｌの新鮮培地中に再懸濁した。この体積を用いて等しい体積のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ細胞（５×１０Ｅ４～１×１０Ｅ６個の細胞を異なる実験で使用した）にオーバーレイした。０．３μｇ／ｍｌのプロマイシン含有培地中での培養後、細胞をソートしてクロナリティーを得た。これらのＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンを、ペプチドを取り込ませたＴ２細胞を用いて活性及び選択性について試験した。
インビトロエピトーププロセシング及び提示アッセイ
Ｔ２細胞はＴＣＲによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。Ｔ２細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており（ＴＡＰ欠損）、内因性のペプチドをＭＨＣ上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、Ｔ２細胞には外因性ペプチドを容易に取り込ませることができる。５種類のマーカーペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１３２）、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１３３）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号１３６）、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号１３５）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１３４）及び２種類の無関係のペプチドＷＬＳＬＬＶＰＦＶ（配列番号１３７）、ＦＬＬＴＲＩＣＴ（配列番号１３８））をＴ２細胞に取り込ませた。簡単に述べると、Ｔ２細胞をカウントし、ＩＭＤＭ ＋１％ＦＢＳｈｉで１×１０６細胞／ｍＬに希釈した。各ペプチドは１０μｇペプチド／１×１０６細胞となるように加えた。次いで細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。細胞をＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳｈｉで２回洗浄し、５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬを９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレートにプレーティングした。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬをＴ２細胞に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次に、プレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
アデノウイルスカセットによるマーカーエピトープ提示を試験するため、Ｕ－８７ ＭＧ細胞を代理抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用い、アデノウイルスベクターで形質導入した。Ｕ－８７ ＭＧ細胞を収穫し、９６ウェルＣｏｓｔａｒ組織培養プレート中で培地中に５×１０Ｅ５細胞／１００μｌでプレーティングした。プレートは、３７℃でおよそ２時間インキュベートされた。アデノウイルスカセットをＭＥＭ＋１０％ＦＢＳｈｉでＭＯＩ１００、５０、１０、５、１及び０に希釈し、Ｕ－８７ＭＧ細胞に５μｌ／ウェルで加えた。プレートを再び３７℃で約２時間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＴＣＲクローンをカウントし、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳｈｉ中で５×１０Ｅ５細胞／ｍＬに希釈し、Ｕ－８７ＭＧ細胞に１００μＬ／ウェルで加えた。次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートした。プレートを４００ｇで３分間遠心し、２０μＬの上清を白色平底Ｇｒｅｉｎｅｒプレートに取った。指示にしたがってＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ基質を調製し、５０μＬ／ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＥ３ｘで読み取った。
免疫原性実験用のマウス系統
トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２．１（ＨＬＡ－Ａ２ Ｔｇ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃより入手した。これらのマウスは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１リーダードメイン、α１ドメイン、及びα２ドメインと、マウスＨ２－Ｋｂα３ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる導入遺伝子を有するものである（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これらの実験で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドの野生型ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃの雌及びホモ接合型ＨＬＡ－Ａ２．１Ｔｇの雌の第１世代子孫（Ｆ１）である。
アデノウイルスベクター（Ａｄ５ｖ）免疫化
ＨＬＡ－Ａ２ Ｔｇマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により１×１０１０～１×１０６個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の１２日後に測定した。
リンパ球の単離
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、１０％ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンと共に含むＲＰＭＩ（完全ＲＰＭＩ）中で組織を解離させた。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（Ｊａｎｅｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。１×１０５個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０μＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。アルカリホスファターゼを用いて、スポットを現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
エクスビボ細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー分析
新しく単離したリンパ球を２～５×１０６細胞／ｍＬの密度で１０μＭの示したペプチドと２時間インキュベートした。２時間後、ブレフェルジンＡを５μｇ／ｍｌの濃度にまで加え、細胞を刺激物質と更に４時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素ｅＦｌｕｏｒ７８０で標識し、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（クローン５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により１：４００の希釈率で染色した。細胞内染色には抗ＩＦＮｇ ＰＥ（クローンＸＭＧ１．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１：１００で使用した。試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で収集した。ＦｌｏｗＪｏを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮｇ＋の割合（％）及び全ＩＦＮｇ＋細胞数／１×１０６個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
ＸＩＶ．Ｂ．２．抗原カセット設計のインビトロ評価
抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した（図１）。認識後、特性がよく知られているペプチド－ＨＬＡの組み合わせに特異的な５種類のＴＣＲのうちの１つを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ－ＬｕｃｉａレポーターＴ細胞が活性化され、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターＣＤ８ Ｔ細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
個々のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａレポーター株は、等モル量の翻訳産物が得られるようにＰ２Ａリボソームスキップ配列によって分離された抗原特異的ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖を含む発現コンストラクトによるレンチウイルス形質導入によって改変されたものである（Ｂａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。細胞表面上のＣＤ８は標的ｐＭＨＣ分子に対する結合親和性にとって重要であり、その細胞質テールの結合を介してシグナル伝達を促進する（Ｌｙｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｙａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）ことから、レンチウイルスコンストラクトへの第２のＣＤ８β－Ｐ２Ａ－ＣＤ８α因子の付加によって、親レポーター細胞株に欠損しているＣＤ８共受容体の発現がもたらされる。
レンチウイルスによる形質導入の後、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａレポーターをプロマイシン選択下で増殖させ、ＦＡＣＳ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（単一細胞蛍光支援細胞選別）に供し、モノクローナル集団をルシフェラーゼ発現について試験した。これにより、機能的細胞応答を有する特異的ペプチド抗原１、２、４、及び５について安定的に形質導入されたレポーター細胞株が得られた（表２）。
（表２）インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発。ルシフェラーゼの誘導によって測定されるペプチド特異的Ｔ細胞認識は、ワクチンカセット抗原の効果的なプロセシング及び提示を示す。インビトロＴ細胞活性化合物アッセイの開発を説明する。
Figure 2022512912000008
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、一連の短いカセットにおいて、すべてのマーカーエピトープを同じ位置に組み込み（図２Ａ）、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限エピトープ（図２Ｂ）を分離するリンカーのみを変えた。レポーターＴ細胞を、これらの短いカセットを発現するアデノウイルスコンストラクトを感染させたＵ－８７抗原提示細胞（ＡＰＣ）と個々に混合し、ルシフェラーゼ発現を非感染対照に対して測定した。モデルカセット内の４つすべての抗原が、一致するレポーターＴ細胞により認識され、複数の抗原が効率的にプロセシング及び提示されていることが示された。Ｔ細胞応答の程度は、天然及びＡＡＹリンカーについて概ね同様の傾向にしたがった。ＲＲリンカーベースのカセットから放出された抗原は、低いルシフェラーゼの誘導を示す（表３）。抗原プロセシングを阻害するように設計されたＤＰＰリンカーは、エピトープ提示が低いワクチンカセットを生じた（表３）。
（表３）短いカセット内のリンカー配列の評価。インビトロＴ細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、ＤＰＰベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。Ｔ細胞エピトープのみ（リンカーなし）＝９ＡＡ、片側に天然リンカー＝１７ＡＡ、両側に天然リンカー＝２５ＡＡ、非天然リンカー＝ＡＡＹ，ＲＲ，ＤＰＰ。
Figure 2022512912000009
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
別の例では、ヒト及びマウスのエピトープ以外に、カセットのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置された、ユビキチン（Ｕｂ）、ＭＨＣ及びＩｇ－κシグナルペプチド（ＳＰ）、及び／またはＭＨＣ膜貫通（ＴＭ）モチーフなどのターゲティング配列を含む更なる一連の短いカセットを構築した（図３）。アデノウイルスベクターによってＵ－８７ ＡＰＣに送達されると、レポーターＴ細胞は、複数のカセット由来の抗原の効率的なプロセシング及び提示を示した。しかしながら、Ｔ細胞応答の程度は、異なるターゲティング機構によって大きく影響されなかった（表４）。
（表４）モデルワクチンカセットに付加された細胞ターゲティング配列の評価。インビトロＴ細胞活性化アッセイを用いることにより、４つのＨＬＡ－Ａ＊０２０１制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がＴ細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
Figure 2022512912000010
＊エピトープ３のレポーターＴ細胞はまだ生成されていない。
ＸＩＶ．Ｂ．３．抗原カセット設計のインビボ評価
抗原カセット設計の評価の別の例として、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に制限された形でＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた５つのヒトクラスＩ ＭＨＣエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した（図Ａ、図３、図５Ａ）。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した（図４）。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０２０１及びマウスＨ２－Ｋｂから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のリーダー、マウスα３に連結されたα１及びα２ドメイン、膜貫通及び細胞質Ｈ２－Ｋｂドメインで構成されたキメラクラスＩ ＭＨＣ分子をコードしている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。このキメラ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に制限された抗原提示を可能とする一方で、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ上のα３ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
短いカセットでは、すべてのマーカーエピトープが、一般的に報告されているもの（Ｃｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｄｅｐｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｉｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）よりも約１０～５０倍強い、Ｔ細胞応答を生じた。評価を行ったすべてのリンカーのうち、それぞれにその天然のアミノ酸配列が隣接した最小エピトープを含む２５ｍｅｒ配列のコンカテマーが、最大かつ最も広いＴ細胞応答を生じた（表５）。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーにより、抗原特異的Ｔ細胞応答がＣＤ８ Ｔ細胞から誘導されることが示された。
（表５）短いカセット内のリンカー配列のインビボ評価。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスが１×ｅ１１個のアデノウイルス粒子による感染１７日後にカセット内のすべてのクラスＩ ＭＨＣ制限エピトープに対してＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2022512912000011
別の例では、元の５つのマーカーエピトープの隣に、既知のＣＤ８ Ｔ細胞反応性を有する更に１６個のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、Ａ＊０３：０１及びＢ＊４４：０５エピトープを含む一連の長いワクチンカセットを構築し、アデノウイルスベクターに組み込んだ（図５Ａ、図５Ｂ）。これらの長いカセットのサイズは、最終的な臨床用のカセット設計によく似たものとし、各エピトープの互いに対する位置のみを変えた。ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方でその程度及び幅において同等であり、（ａ）更なるエピトープの追加が元のエピトープのセットに対する免疫応答の程度に大きく影響せず、また、（ｂ）カセット内のエピトープの位置はそれに続くＴ細胞応答に大きく影響しないことを示すものである（表６）。
（表６）長いカセット内のエピトープの位置の影響のインビボ評価。ＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスが５ｅ１０アデノウイルス粒子による感染１７日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのＴ細胞応答を生じたことを示した。
Figure 2022512912000012
＊技術的なエラーによりＴ細胞応答が見られなかったと疑われる。
ＸＩＶ．Ｂ．４．免疫原性及び毒性試験用の抗原カセットの設計
要約すると、モデルカセット評価による知見（図２～５、表２～６）によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスに基づくベクターとの関連で約２０個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に強い免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列（例えば、両側に８個のアミノ酸残基）が隣接した最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ（例えば、９個のアミノ酸残基）をそれぞれが埋め込んだ２５ｍｅｒ配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのＮ末端及び／またはＣ末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ＭＨＣ ＩのエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１３２）は、その５’末端側に天然の５’配列ＷＱＡＧＩＬＡＲ（配列番号１３９）が、その３’末端側に天然の３’配列ＱＧＱＮＬＫＹＱ（配列番号１４０）が隣接し、それによりＨＣＭＶ ｐｐ６５由来源タンパク質内にみられるＷＱＡＧＩＬＡＲＮＬＶＰＭＶＡＴＶＱＧＱＮＬＫＹＱ（配列番号１４１）という２５ｍｅｒペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各２５ｍｅｒ配列は、それに続く２５ｍｅｒ配列に直接連結される。最小のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープがアミノ酸９個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然２５ｍｅｒのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸１０個のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープには、アミノ酸８個とアミノ酸７個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に含ませた２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた。これらのクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）によって最後のクラスＩエピトープに連結した。２個のクラスＩＩエピトープは、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）によって互いに対しても連結し、更にＣ末端側にＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー（配列番号５６）を連結させた。エピトープの位置もその数もＴ細胞の認識または応答に大きく影響しないようであった。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
更なる例として、モデルカセットにより得られたインビトロ及びインビボデータ（図２～５、表２～６）に基づき、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、マウス及びヒトで免疫原性を示すことが知られている、特性のよく知られたＴ細胞エピトープを交互に配したカセット設計を生成した。いずれもそれらの天然の２５ｍｅｒ配列に埋め込まれた２０個のエピトープの後に、評価を行ったすべてのモデルカセットに存在する２個のユニバーサルクラスＩＩ ＭＨＣエピトープを繋げた（図６）。この設計を用いて、複数種における免疫原性を調べ、ならびに薬理学的及び毒物学的研究を行った。
ＸＩＶ．Ｂ．５． ３０、４０、または５０抗原のための抗原カセット設計及び評価
３０（Ｌ）、４０（ＸＬ）または５０（ＸＸＬ）エピトープのいずれかを有するラージ抗原カセットが設計され、それぞれは、アミノ酸２５個の長さである。エピトープは、腫瘍抗原を含む疾患抗原をモデルとするために、ヒト、ＮＨＰ及びマウスのエピトープの混合物であった。図２９は、様々な種からのエピトープの一般的な組織を示している。使用されたモデル抗原は、ヒト、霊長類及びマウスのモデルエピトープについて、それぞれ表３７、表３８及び表３９に記載されている。表３７、表３８及び表３９のそれぞれは、エピトープの位置、名前、最小エピトープの記述、及びＭＨＣクラスを記載した。
これらのカセットを、より長い複数エピトープカセットの有効性を評価するために、記載されているようにｃｈＡｄ６８及びｓｒＲＮＡワクチンベクターにクローニングした。図３０は、ウエスタンブロットによって予想される大きさの少なくとも１つの主要なバンドによって示されるように、ラージ抗原カセットのそれぞれがＣｈＡｄＶベクターから発現されたことを示している。
マウスは、ラージカセットの有効性を評価するために記載されているように免疫化した。Ｔ細胞応答は、ｃｈＡｄ６８ベクターによる免疫化後のＩＣＳ及びテトラマー染色によって分析され（それぞれ、図３１／表４０及び図３２／表４１）、ならびにエピトープＡＨ１（上のパネル）及びＳＩＮＮＦＥＫＬ（下のパネル）に対するｓｒＲＮＡベクターによる免疫化後のＩＣＳによって分析された（図３３／表４２）。３０（Ｌ）、４０（ＸＬ）、５０（ＸＸＬ）のエピトープを発現する、ｃｈＡｄ６８及びｓｒＲＮＡワクチンベクターを用いた免疫化は、モデル疾患エピトープに対するＣＤ８＋免疫応答を誘導した。
（表３７）ラージカセット内のヒトエピトープ
Figure 2022512912000013
（表３８）ラージカセット内のＮＨＰエピトープ
Figure 2022512912000014
（表３９）ラージカセット内のマウスエピトープ
Figure 2022512912000015
（表４０）ＣｈＡｄラージカセット処理マウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号５７）ペプチドへの応答における平均ＩＦＮｇ＋細胞。データは、総ＣＤ８細胞に対する％として示されている。グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値は、ＭＡＧ２０－抗原カセットと比較した。
Figure 2022512912000016
（表４１）ＣｈＡｄラージカセット処理マウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原における平均テトラマー＋細胞。データは、総ＣＤ８細胞に対する％として示されている。グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値は、ＭＡＧ２０－抗原カセットと比較した。
Figure 2022512912000017
（表４２）ＳＡＭラージカセット処理マウスにおけるＡＨ１及びＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドへの応答における平均ＩＦＮｇ＋細胞。データは、総ＣＤ８細胞に対する％として示されている。グループ当たりの平均及び標準偏差、ならびにテューキーの検定を用いたＡＮＯＶＡによるｐ値を示す。すべてのｐ値は、ＭＡＧ２０－抗原カセットと比較した。
Figure 2022512912000018
ＸＶ． ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクター
ＸＶ．Ａ． ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの構築
１つの例では、チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）を操作して抗原カセットの送達ベクターとした。更なる例では、完全長ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１（米国特許第６０８３７１６号に記載の配列番号２）に基づいて合成し、Ｅ１（ｎｔ４５７～３０１４）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列を欠失させた。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。このクローンをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型Ｃ６８ウイルスの配列を確認するため、単離ＶＲ－５９４をＡＴＣＣより入手して継代した後、個々に配列決定した（配列番号１０）。ＡＣ＿００００１１．１配列を野生型ＣｈＡｄＶ６８ウイルスのＡＴＣＣ ＶＲ－５９４配列（配列番号１０）と比較したところ、６個のヌクレオチドの相違が同定された。１つの例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ 配列番号１）。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを４つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１１）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ；配列番号１２）を、欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
別の例では、改変ＣｈＡｄＶ６８ベクターを、ＡＣ＿００００１１．１に基づいて作製し、Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列を欠失させ、対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドを５つの位置で置換した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ；配列番号１３）またはモデル新生抗原カセット（ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ；配列番号２）を欠失させたＥ１配列の代わりに挿入した。
関連するベクターを以下に記載する。
- 完全長ＣｈＡｄＶＣ６８配列”ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ”（配列番号１）；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが５つの位置で置換されたＡＣ＿００００１１．１配列
- ＡＴＣＣ ＶＲ－５９４Ｃ６８（配列番号１０）；独立に配列決定；完全長Ｃ６８
- ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（配列番号１１）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列が欠失したＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが４つの位置で置換された；欠失したＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター
- ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（配列番号１２）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，８１６～３１，３３２）配列が欠失したＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが４つの位置で置換された；欠失したＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるモデル新生抗原カセット
- ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（配列番号１３）；Ｅ１（ｎｔ５７７～３４０３）及びＥ３（ｎｔ２７，１２５～３１，８２５）配列が欠失したＡＣ＿００００１１．１；対応するＡＴＣＣ ＶＲ－５９４ヌクレオチドが５つの位置で置換された；欠失したＥ１の代わりに挿入されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下にあるＧＦＰレポーター
ＸＶ．Ｂ． ＣｈＡｄ抗原カセット送達ベクターの試験
ＸＶ．Ｂ．１． ＣｈＡｄベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞のトランスフェクション
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
１０μｇのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩで消化してウイルスゲノムを遊離させた。次いでＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造者の指示にしたがって使用してＤＮＡを長いＤＮＡフラグメントについて精製し、２０μｌのあらかじめ加熱した水中に溶出した。溶出工程の前にカラムを３７℃で０．５～１時間放置した。
トランスフェクションの１４～１８時間前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を１０６細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに導入した。各ウェルごとに細胞に新鮮な培地（ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミン酸を含む１ｍｌのＤＭＥＭ－１０％ｈｉＦＢＳ）を被せた。トランスフェクションでは、各ウェル当たり１～２μｇの精製したＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがってｕｌ体積の２倍（２～４μｌ）のリポフェクタミン２０００と共に用いた。トランスフェクションミックスを含む０．５ｍｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地を、各ウェル内で１ｍｌの通常の培地に加え、細胞上で一晩放置した。
トランスフェクトした細胞培養物を３７℃で少なくとも５～７日間インキュベートした。ウイルスプラークがトランスフェクションの７日後に視認されなかった場合、細胞を１：４または１：６に分割し、３７℃でインキュベートしてプラーク生成について監視した。あるいは、トランスフェクトした細胞を収穫し、３サイクルの凍結と解凍に供し、細胞ライセートを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させ、ウイルスプラークが観察されるまで細胞をインキュベートしてもよい。
リン酸カルシウムを用いたＨＥＫ２９３Ａ細胞へのＣｈＡｄＶ６８ベクターのトランスフェクション及び三次ウイルスストックの生成
ＣｈＡｄＶ６８コンストラクト（ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ）のＤＮＡを調製し、以下のプロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの１日前にＨＥＫ２９３Ａ細胞を５％ＢＳ／ＤＭＥＭ／１ＸＰ／Ｓ，１×Ｇｌｕｔａｍａｘ中で、６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で播種した。トランスフェクション当たり２個のウェルが必要とされる。トランスフェクションの２～４時間前に培地を新鮮な培地に交換した。ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰプラスミドをＰａｃＩで直鎖状とした。次いで、直鎖状とされたＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出し、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、及び２体積の１００％エタノールを用いて沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１２，０００×ｇで５分間遠心することによってペレット化した後、７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを風乾し、５０μＬの滅菌水に再懸濁した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＤＮＡ濃度を決定し、体積を５μｇのＤＮＡ／５０μＬに調整した。
１６９μＬの滅菌水をマイクロチューブに加えた。次いで５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２をこの水に加え、ピペッティングして静かに混合した。５０μＬのＤＮＡをＣａＣｌ２溶液に滴下した。次いで２６μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加えてマイクロピペッターで２回ピペッティングして静かに混合した。この最終溶液は、２５０μＬの０．２５Ｍ ＣａＣｌ２中の５μｇのＤＮＡからなるはずである。次いで２５０μＬの２×ＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）の入った第２のチューブを用意した。ピペットエイドに取り付けた２ｍＬ滅菌ピペットを使用して２×ＨＢＳ溶液に空気を徐々にバブリングした。同時に、０．２５Ｍ ＣａＣｌ２溶液中のＤＮＡ溶液を滴下した。最後のＤＮＡの液滴の滴下後、約５秒間、バブリングを継続した。次いで溶液を室温で最大２０分間インキュベートした後、２９３Ａ細胞に加えた。６ウェルプレートの各ウェル当たり１０６細胞で１日前に播種した２９３Ａ細胞の単層に２５０μｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム溶液を滴下した。細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートした。２４時間後に培地を交換した。７２時間後に細胞を６ウェルプレート内に１：６に分割した。単層を細胞変性効果（ＣＰＥ）の証拠について光学顕微鏡によって毎日監視した。トランスフェクションの７～１０日後にウイルスプラークを観察し、ウェル内の培地をピペッティングして細胞を浮かせることにより単層を収穫した。収穫した細胞及び培地を５０ｍＬの遠心チューブに移した後、凍結解凍を３ラウンド行った（－８０℃及び３７℃で）。その後得られた、一次ウイルスストックと呼ばれるライセートを、ベンチトップ遠心分離器上で最大速度（４３００×ｇ）で遠心することにより清澄化させ、ライセートの一定の割合（１０～５０％）を使用してＴ２５フラスコ中で２９３Ａ細胞に感染させた。感染細胞を４８時間インキュベートした後、細胞及び培地を完全なＣＰＥで収穫した。細胞を再び収穫し、凍結解凍して清澄化した後、この二次ウイルスストックを使用して、フラスコ当たり１．５×１０７細胞で播種されたＴ１５０フラスコに感染させた。７２時間後に完全ＣＰＥが得られた時点で細胞を収穫し、上記のウイルスストックと同様に処理して三次ストックを生成した。
２９３Ｆ細胞内での生成
８％ＣＯ２のインキュベーター内の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）培地中で増殖させた２９３Ｆ細胞内でＣｈＡｄＶ６８ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率９８％で１ｍＬ当たり１０６細胞に希釈し、１ＬのＳｈａｋｅフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１回の生成ラン当たり４００ｍＬを使用した。１回の感染当たり目標ＭＯＩが３．３よりも高い４ｍＬの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が７０％を下回るまで４８～７２時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、１×ＰＢＳ中で洗浄し、再び遠心してから２０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を３回行って溶解し、４，３００×ｇで５分間遠心して清澄化した。
ＣｓＣｌ遠心分離による精製
ウイルスＤＮＡをＣｓＣｌ遠心分離により精製した。２つの不連続な勾配ランを行った。第１の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第２の遠心は、細胞成分からの分離物を更に精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
１０ｍＬの１．２（２６．８ｇのＣｓＣｌを９２ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）ＣｓＣｌをポリアロマー製チューブに加えた。次いで、８ｍＬの１．４ＣｓＣｌ（５３ｇのＣｓＣｌを８７ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶かしたもの）をピペットを用いてチューブの底に届けるように慎重に加えた。清澄化したウイルスをこの１．２の層の上に層をなすように慎重に加えた。必要な場合、更に１０ｍＭ Ｔｒｉｓを加えてチューブのバランスを取った。次いでチューブをＳＷ－３２Ｔｉローターに入れて、１０℃で２時間３０分遠心した。そうしてチューブを層流キャビネットに取り出して、１８ゲージの針と１０ｍＬの注射器を使用してウイルスバンドを引き抜いた。夾雑した宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質を除去しないように注意を払った。次いでバンドを少なくとも１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で希釈し、上記に述べた不連続勾配で上記と同様に層をなすように加えた。今回はランを一晩行った以外は上記と同様にしてランを行った。翌日、機能不全の粒子バンドを引き抜かないように注意しながらバンドを引き抜いた。次いでＳｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＡＲＭバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，２５ｍＭ ＮａＣｌ，２．５％グリセロール）に対してウイルスを透析した。これをバッファーを１回交換するごとに３回、１時間行った。次いでウイルスを一定分量に分けて－８０℃で保存した。
ウイルスアッセイ
１．１×１０１２個のウイルス粒子（ＶＰ）の消光係数はＯＤ２６０ｎｍの吸光度の値＝１に相当することに基づき、ＯＤ２６０アッセイを用いてＶＰ濃縮を行った。アデノウイルスの２つの希釈度（１：５と１：１０）をウイルス溶解バッファー（０．１％ＳＤＳ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で作った。両方の希釈度でＯＤを２重に測定し、ＯＤ２６０値×希釈係数×１．１×１０１２ＶＰを掛けることによりＶＰ濃度／ｍＬを測定した。
感染単位（ＩＵ）力価を、ウイルスストックの限界希釈アッセイによって計算した。ウイルスを最初にＤＭＥＭ／５％ＮＳ／１×ＰＳ中で１００倍に希釈した後、１０倍希釈率を用いて１×１０－７にまで希釈した。次いで１００μＬのこれらの希釈液を、２４ウェルプレートのウェル当たり３ｅ５細胞で少なくとも１時間前に播種した２９３Ａ細胞に加えた。これを２重に行った。プレートを４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。次いで細胞を、１×ＰＢＳで洗浄した後、１００％の冷却メタノール（－２０℃）で固定した。次いでプレートは最小で２０分間にわたって－２０℃でインキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳで洗浄した後、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で１時間、室温でブロッキングした。ウサギ抗Ａｄ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）をブロッキングバッファー（ウェル当たり０．２５ｍＬ）中に１：８，０００の希釈率で加え、室温で１時間インキュベートした。各ウェルをウェル当たり０．５ｍＬのＰＢＳで４回洗浄した。１０００倍に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｔｅｘａｓ）を各ウェルに加え、最終回の洗浄の１時間前にインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄を５回行い、０．０１％Ｈ２Ｏ２を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中、ＤＡＢ（ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）基質を使用して現像した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、０．６７ｍｇ／ｍＬ ＤＡＢ）。各ウェルをカウントの５分前に現像した。視野当たり４～４０個の染色された細胞を与えるような希釈率を用いて１０倍の対物レンズ下で細胞をカウントした。使用した視野は０．３２ｍｍ２の格子とし、２４ウェルプレート上の視野当たり６２５個に相当した。１ｍＬ当たりの感染性ウイルスの数は、格子１個当たりの染色細胞の数×視野当たりの格子の数×希釈係数１０によって求めることができる。同様に、ＧＦＰ発現細胞を扱う場合には、カプシド染色の代わりに蛍光を用いて１ｍＬ当たりのＧＦＰ発現ビリオンの数を決定することができる。
免疫化
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌性マウス及びＢａｌｂ／ｃ系の雌性マウスに、１×１０８個のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒのウイルス粒子（ＶＰ）を、１００μＬ体積中で両側性の筋肉内注射（各脚５０μＬ）により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０マイクロメートルのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０マイクロメートルのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０μＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶ．Ｂ．２． ＤＮＡトランスフェクション後のＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図７）及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ（図８）のＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製（ウイルスプラーク）をトランスフェクションの７～１０日後に観察した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルスプラークを光学（図７Ａ及び図８Ａ）及び蛍光顕微鏡法（図７Ｂ～Ｃ、及び図８Ｂ～Ｃ）を使用して可視化した。ＧＦＰは、増殖性ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の生成を示す。
ＸＶ．Ｂ．３． ＣｈＡｄＶ６８ウイルス送達粒子の増殖
１つの例において、ＣｈＡｄＶ６８．４ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＧＦＰ、及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒウイルスをＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの１８日後に生成した（図９）。精製ＣｈＡｄＶ６８ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス５型（Ａｄ５）及びＣｈＡｄＶＹ２５（近縁のＣｈＡｄＶ；Ｄｉｃｋｓ，２０１２，ＰｌｏＳ ＯＮＥ７，ｅ４０３８５）ウイルスストックと比較した。ＣｈＡｄＶ６８ウイルス力価は、Ａｄ５及びＣｈＡｄＶＹ２５と同等であった（表７）。
（表７）２９３Ｆ懸濁細胞内でのアデノウイルスベクターの生成
Figure 2022512912000019
＊ＳＤは、複数回の生成ランが行われた場合にのみ報告している。
ＸＶ．Ｂ．４．腫瘍モデルにおける免疫原性の評価
マウス腫瘍抗原を発現するＣ６８ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、Ｃ６８ベクターがＴ細胞応答を誘発することを実証する。ＭＨＣクラスＩエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号５７）に対するＴ細胞応答Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雌性マウスで測定し、ＭＨＣクラスＩエピトープＡＨ１－Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：５２９－５３８）に対するＴ細胞応答をＢａｌｂ／ｃ系マウスで測定した。図１５に示されるように、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによるマウスの免疫後に対照に対して強いＴ細胞応答が測定された。脾細胞１０６個当たり、８９５７個及び４０１９個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均の細胞性免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系またはＢａｌｂ／ｃ系マウスをそれぞれＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒで免疫した場合に免疫の１０日後に観察された。
腫瘍浸潤リンパ球も、ＣｈＡｄＶを評価するＣＴ２６腫瘍モデル、及び抗ＣＴＬＡ４抗体の併用投与で評価した。マウスにＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、移植の７日後にＣｈＡｄＶワクチンで免疫し、抗ＣＴＬＡ４抗体（クローン９Ｄ９）またはＩｇＧを対照として投与した。腫瘍浸潤リンパ球を、免疫化の１２日後に分析した。各マウスからの腫瘍を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びマウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解離した。解離した細胞を３０マイクロメートルのフィルターで濾過し、完全なＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。抗原特異的細胞は、ＭＨＣテトラマー複合体によって同定され、抗ＣＤ８及び生存率マーカーで共染色された。腫瘍は、プライム免疫化から１２日後に収穫した。
腫瘍内の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣｈＡｄＶ、抗ＣＴＬＡ４、及びＣｈＡｄＶ＋抗ＣＴＬＡ４を投与した群の生細胞集団全体では、それぞれ３．３％、２．２％、または８．１％の中央値を含んだ（図４１及び表３６）。活性ＣｈＡｄＶ免疫と組み合わせて抗ＣＴＬＡを投与すると、ＣｈＡｄＶ単独及び抗ＣＴＬＡ４単独よりも抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞頻度が統計学的に有意に増加し、ｃｈＡｄ６８ワクチンと併用投与したとき、腫瘍内の浸潤するＴ細胞の数が増加した。
（表３６）ＣＴ２６腫瘍のテトラマー＋浸潤ＣＤ８ Ｔ細胞頻度
Figure 2022512912000020
ＸＶＩ．アルファウイルス抗原カセット送達ベクター
ＸＶＩ．Ａ． アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
ＲＮＡを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドＤＮＡをＰｍｅＩによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し（ＧｅｎｅＪｅｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ）、テンプレートとして使用した。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をｍ７Ｇキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示にしがって使用してｍＲＮＡを精製した。
インビボ実験を行うには、ＴｒｉＬＩｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって生成され、精製されたＲＮＡをＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｐ１でキャップした。
ＲＮＡのトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、９６ウェルのウェル当たり６ｅ４細胞で、２４ウェルのウェル当たり２ｅ５細胞で、トランスフェクションの約１６時間前に播種した。細胞にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールにしたがって使用してｍＲＮＡをトランスフェクションした。９６ウェルでは、ウェル当たり０．１５μＬのリポフェクタミン及び１０ｎｇのｍＲＮＡを使用し、２４ウェルでは、ウェル当たり０．７５ｕＬのリポフェクタミン及び１５０ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ＧＦＰを発現するｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をトランスフェクションの対照として使用した。
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の９６ウェルプレートで、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して測定した。
ｑＲＴ－ＰＣＲ
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの２時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったｍＲＮＡをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でＲＬＴ ｐｌｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して全ＲＮＡを定量した。製造者のプロトコールにしたがってｑＴｏｗｅｒ３（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、反応当たり２０ｎｇの全ＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ＡｃｔｉｎまたはＧｕｓＢを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー／プローブはＩＤＴにより生成されたものである（表８）。
（表８）ｑＰＣＲプライマー／プローブ
Figure 2022512912000021
Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデル
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの左下脇腹に１０５個のＢ１６－ＯＶＡ細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、３日間にわたって増殖させた。
ＣＴ２６腫瘍モデル
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個のＣＴ２６細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中、１０μｇのＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０μＬ）により注射した。Ａｄ５ワクチンについては、マウスに５×１０１０個のウイルス粒子（ＶＰ）を、１００μＬ体積中で両側性に筋肉内注射（各脚５０μＬ）により注射した。各動物に、抗ＣＴＬＡ－４（クローン９Ｄ９，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ－１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、用量２５０μｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
インビボ生物発光イメージング
各時点においてマウスに腹腔内注射により１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を注射し、注射の１０～１５分後にＩＶＩＳインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して生物発光を測定した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０マイクロメートルのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０マイクロメートルのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０μＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶＩ．Ｂ．アルファウイルスベクター
ＸＶＩ．Ｂ．１．アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ＶＥＥ））（Ｋｉｎｎｅｙ，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：４００－４１３）に基づく自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターから生成した。１つの例では、２６Ｓサブゲノムプロモーターの３’側に位置するＶＥＥの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ（ＶＥＥ配列の７５４４～１１，１７５を欠失させた。番号付けはＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ １９８６に基づく。配列番号６）、抗原配列（配列番号１４及び配列番号４）またはルシフェラーゼレポーター（例えばＶＥＥ－ルシフェラーゼ、配列番号１５）に置き換えた（図１０）。ＲＮＡをインビトロでｓｒＲＮＡ ＤＮＡベクターから転写させ、ＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。更に、ルシフェラーゼをコードする（非複製）ｍＲＮＡを比較のためにトランスフェクトした。ＶＥＥ－ルシフェラーゼのｓｒＲＮＡでは、２時間の測定値を２３時間の測定値と比較した場合にｓｒＲＮＡレポーターシグナルの約３０，０００倍の増大が観察された（表９）。これに対して、同じ時間でのｍＲＮＡレポーターのシグナルの増大は１０倍未満であった（表９）。
（表９）ＶＥＥ自己複製ベクターからのルシフェラーゼの発現は経時的に増大する。９６ウェル中、ウェル当たり１０ｎｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡまたは１０ｎｇの非複製ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｌ－６３０７）をＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位（ＲＬＵ）として報告する。各データポイントは、３つのトランスフェクトしたウェルの平均±ＳＤである。
Figure 2022512912000022
別の例では、ｓｒＲＮＡの複製を、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、ルシフェラーゼをコードするｓｒＲＮＡ（ＶＥＥ－ルシフェラーゼ）または複数のエピトープカセット（ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ）をコードするｓｒＲＮＡのいずれかのトランスフェクション後のＲＮＡレベルを測定することにより確認した。ＶＥＥ－ルシフェラーゼでは約１５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１０）のに対して、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡでは３０～５０倍のＲＮＡの増大が観察された（表１１）。これらのデータは、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターが細胞にトランスフェクトされると複製されることを示すものである。
（表１０）ＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定。ＨＥＫ２９３Ａ細胞にＶＥＥ－ルシフェラーゼｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する変化倍率を示す。
Figure 2022512912000023
（表１１）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＲＮＡ複製の直接測定。ＨＥＫ２９３細胞にＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡをトランスフェクトし（２４ウェルのウェル当たり１５０ｎｇ）、トランスフェクション後の異なる時間にｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡレベルを定量した。各測定値はＧｕｓＢ参照遺伝子に対して正規化し、２時間の時点に対する変化倍率を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもｓｒＲＮＡのエピトープカセット領域を検出する２つの異なるｑＰＣＲプライマー／プローブのセットを表す。
Figure 2022512912000024
ＸＶＩ．Ｂ．２．アルファウイルスベクターのインビボ評価
別の例において、ＶＥＥ－ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された１０μｇのＶＥＥ－ルシフェラーゼを注射し、注射の２４時間後及び４８時間後、ならびに７日後及び１４日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の２４時間後に検出され、時間と共に増大し、ｓｒＲＮＡ注射の７日後にピークとなった（図１１）。
ＸＶＩ．Ｂ．３．アデノウイルスベクター腫瘍モデルの評価
１つの実現態様にて、ＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、２つの異なるＭＨＣクラスＩマウス腫瘍エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号５７）及びＡＨ１－Ａ５（Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９－５３８）を発現するＶＥＥ ｓｒＲＮＡベクターを作製した（ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ，配列番号１４）。ＳＦＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号５７））エピトープは、Ｂ１６－ＯＶＡメラノーマ細胞株によって発現され、ＡＨ１－Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号５８）；Ｓｌａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）エピトープは、ＣＴ２６結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするＴ細胞を誘導する（ＡＨ１／ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１９３）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：９７３０－９７３５）。１つの例では、インビボ実験において、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡ が、Ｔ７ポリメラーゼ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）に封入された。
ＳＦＬを標的とした、対照に対して強い抗原特異的Ｔ細胞応答が、ＭＣ３で製剤化したＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによる、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの免疫化の２週間後に観察された。１つの例では、脾細胞１０６個当たり中央値で３８３５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてＳＦＬペプチドによる刺激後に測定され、ペンタマー染色により測定した場合に、ＣＤ８ Ｔ細胞の１．８％（中央値）がＳＦＬ抗原特異的であった（図１２Ｂ、表１２）。別の例では、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＶＥＥ ｓｒＲＮＡワクチンとの同時投与によって、全体のＴ細胞応答の中度の増大が認められ、脾細胞１０６個当たり中央値で４７９４．５個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１２Ａ、表１２）。
（表１２）Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスにおけるＶＥＥ ｓｒＲＮＡ免疫化の１４日後のＥＬＩＳＰＯＴ及びＭＨＣＩペンタマー染色アッセイの結果。
Figure 2022512912000025
*Ｖａｘ群のマウス＃６からの結果は、三つ組のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
別の実現態様では、臨床アプローチを反映するため、Ｂ１６－ＯＶＡ及びＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて異種プライム／ブーストを行い、腫瘍を有するマウスを、同じ抗原カセット（Ａｄ５－ＵｂＡＡＹ）を発現するアデノウイルスベクターで最初に免疫した後、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹプライムの１４日後にＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡワクチンでブースト免疫を行った。１つの例では、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹワクチンによって抗原特異的免疫応答が誘導され、脾細胞１０６個当たり７３３０個（中央値）のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ａ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の２．９％（中央値）がＳＦＬ抗原を標的化していた（図１３Ｃ、表１３）。別の例では、Ｔ細胞応答は、Ｂ１６－ＯＶＡモデルにおいてＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブーストの２週間後に維持され、脾細胞１０６個当たり３９６０個（中央値）のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１３Ｂ、表１３）、ペンタマー染色により測定した場合にＣＤ８ Ｔ細胞の３．１％（中央値）がＳＦＬを標的化していた（図１３Ｄ、表１３）。
（表１３）Ａｄ５ワクチンプライム及びｓｒＲＮＡブーストによる異種プライム／ブースト後のＢ１６－ＯＶＡマウスの免疫モニタリング
Figure 2022512912000026
別の実現態様で、同様の結果が、ＣＴ２６マウスモデルにおけるＡｄ５－ＵｂＡＡＹによるプライム及びＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後に観察された。１つの例では、Ａｄ５－ＵｂＡＡＹによるプライム後（１４日目）にＡＨ１抗原特異的応答が観察され、脾細胞１０６個当たり平均で５１８７個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定され（図１４Ａ、表１４）、ＶＥＥ－ＵｂＡＡＹ ｓｒＲＮＡによるブースト後（２８日目）には脾細胞１０６個当たり３７９９個のＳＦＣがＥＬＩＳｐｏｔアッセイで測定された（図１４Ｂ、表１４）。
（表１４）ＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおける異種プライム／ブースト後の免疫モニタリング
Figure 2022512912000027
ＸＶＩＩ． ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、マウスＣＴ２６腫瘍モデルで評価した。
ＸＶＩＩ．Ａ ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の方法及び材料
腫瘍注入
Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アーム（各群当たりマウス２８～４０匹）をランダムカセット配列し、処置を開始した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスの左下脇腹に１０６個のＣＴ２６細胞／動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、７日間にわたって増殖させた。各実験アームは表１５に詳細に記載したとおりである。
（表１５）ＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの腫瘍モデル評価の実験アーム
Figure 2022512912000028
免疫化
ｓｒＲＮＡワクチンについては、マウスに１００ｕＬ体積中、１０ｕｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡを、両側性に筋肉内注射（各脚５０μＬ）により注射した。Ｃ６８ワクチンについては、マウスに１×１０１１個のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡのウイルス粒子（ＶＰ）を、１００μＬ体積中で両側性に筋肉内注射（各脚５０μＬ）により注射した。各動物に、抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、または抗ＩｇＧ（クローンＭＰＣ－１１，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、用量２５０μｇで、週２回、腹腔内注射により注射した。
脾細胞の解離
各マウスの脾臓及びリンパ節を、３ｍＬの完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中にプールした。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ組織解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を４０マイクロメートルのフィルターに通して濾過し、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解した。細胞を３０マイクロメートルのフィルターに通して再び濾過した後、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
エクスビボ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析
マウスＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８）にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。５×１０４個の脾細胞を、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０μＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ＸＶＩＩ．Ｂ ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣｈＡｄＶ／ｓｒＲＮＡの組み合わせの評価
ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの異種プライム／ブースト、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの同種プライム／ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。Ｂａｌｂ／ｃ系マウスにＣＴ２６細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の７日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表１５に詳細に、また表１６により一般的に記載したとおりである。
（表１６）プライム／ブースト実験アーム
Figure 2022512912000029
脾臓をプライムワクチン接種の１４日後に収穫して免疫モニタリングを行った。腫瘍及び体重測定値を週２回測定し、生存率を監視した。すべての活性ワクチン群で対照に対する強い免疫応答が観察された。
それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ＋抗ＰＤ－１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ－１／グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ－１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスのＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、最初の免疫の１４日後に、脾細胞１０６個当たり、中央値で１０，６３０個、１２，９７６個、３３１９個、または３７４５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）の細胞性免疫応答が観察された（図１６及び表１７）。これに対して、ワクチン対照（グループ１）または抗ＰＤ－１をともなうワクチン対照（グループ２）は、それぞれ、脾細胞１０６個当たり中央値で２９６個または２８５個のＳＦＣの細胞性免疫応答を示した。
（表１７）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける細胞性免疫応答
Figure 2022512912000030
ＥＬＩＳｐｏｔのデータと一致して、それぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（ＣｈＡｄＶ／グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ＋抗ＰＤ－１（ＣｈＡｄＶ＋ＰＤ－１／グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ／グループ５と７を合わせた中央値）、またはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（ｓｒＲＮＡ＋ＰＤ－１／グループ６と８を合わせた中央値）で免疫したマウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）分析において、最初の免疫の１４日後にＣＤ８ Ｔ細胞の５．６、７．８、１．８、または１．９％が抗原特異的応答を示した（図１７及び表１８）。ワクチン対照、またはワクチン対照と抗ＰＤ－１との組み合わせで免疫したマウスは、それぞれ、０．２及び０．１％の抗原特異的ＣＤ８応答を示した。
（表１８）ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答
Figure 2022512912000031
ＣＴ２６結腸腫瘍モデルのすべてのグループで腫瘍増殖が測定され、腫瘍増殖は処置開始の２１日後（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射の２８日後）までみられる。大きな腫瘍サイズ（＞２５００ｍｍ３）に基づいて処置開始の２１日後にマウスを屠殺したため、分析のバイアスを避けるために最初の２１日間のみを示している。２１日目における平均腫瘍体積は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブースト（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ－１（グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒブースト（グループ５）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒブースト＋抗ＰＤ－１（グループ６）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブースト（グループ７）、及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブースト＋抗ＰＤ－１（グループ８）でそれぞれ、１１２９、８４８、２１４２、１４１８、２１９８及び１６０６ｍｍ３であった（図１８及び表１９）。ワクチン対照、またはワクチン対照と抗ＰＤ－１との組み合わせにおける平均腫瘍体積は、それぞれ、２３６１または２０６７ｍｍ３であった。これらのデータに基づけば、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ（グループ３）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（グループ４）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ＋抗ＰＤ－１（グループ６）、及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ＋抗ＰＤ－１（グループ８）は、対照（グループ１）と有意に異なる腫瘍増殖の低下を２１日目にもたらした。
（表１９）ＣＴ２６モデルで測定された腫瘍サイズ
Figure 2022512912000032
ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて処置開始後３５日間（ＣＴ２６腫瘍細胞の注射後４２日間）にわたって生存率を監視した。改善された生存率が、試験した組み合わせのうちの４つでマウスをワクチン接種した後に観察された。ワクチン接種後、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ４；対照群１に対してＰ＜０．０００１）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ８；対照群１に対してＰ＝０．０００６）、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブースト（グループ３；対照群１に対してＰ＝０．０００３）、及び、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒブーストと抗ＰＤ－１との組み合わせ（グループ６；対照群１に対してＰ＝０．００１６）を用いたマウスの、それぞれ、６４％，４６％，４１％及び３６％が生存した（図１９及び表２０）。生存率は、残りの処置群（ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒブースト（グループ５）、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ（グループ７）、及び抗ＰＤ－１単独（グループ２））では対照グループ１（≦１４％）と有意差は認められなかった。
（表２０）ＣＴ２６モデルにおける生存率
Figure 2022512912000033
結論として、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡは、対照に対して、各ワクチンによりコードされたマウス腫瘍抗原に対する強いＴ細胞応答を誘発した。腫瘍を有するマウスへの、抗ＰＤ－１の同時投与をともなう、もしくはともなわないＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒプライム及びＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡブーストの投与、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡプライム及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒと抗ＰＤ－１との組み合わせの投与、または、同種プライムブースト免疫としてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡと抗ＰＤ－１との組み合わせの投与は、高い生存率につながった。
ＸＶＩＩＩ．非ヒト霊長類実験
ＣｈＡｄＶ６８及び自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＮＨＰで評価した。
材料及び方法
プライミングワクチンを各ＮＨＰで筋肉内（ＩＭ）注射して実験を開始した（ワクチンプライム）。１回以上のブースターワクチン（ワクチンブースト）も各ＮＨＰに筋肉内注射した。下記表に概略を示し、下記に要約した各グループにしたがって、投与ごとに両側性注射で投与した。
免疫化
Ｍａｍｕ Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＬＮＰ－１またはＬＮＰ－２中で製剤化した１×１０１２個のウイルス粒子（注射１回当たり５×１０１１個のウイルス粒子）のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ、３０μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ、１００μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ、または３００μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡで両側性に免疫した。３０μｇ、１００μｇまたは３００μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡのワクチンブーストをプライムワクチン接種後の示した時間に筋肉内投与した。
免疫モニタリング
ＰＢＭＣを、プライムワクチン接種後の示した時間にＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ，ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及びＬｅｕｃｏＳｅｐ分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を使用して単離し、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリー法を用いてＴ細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ－Ａ＊０１クラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を、ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（エクスビボ酵素結合免疫スポット）分析を用いてＩＦＮ－γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。サルＩＦＮｇ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用し、ＥＬＩＳＰＯＴハーモナイゼーションガイドライン（ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０６８）にしたがってＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。２００，０００個のＰＢＭＣを、９６ウェルＩＦＮｇ抗体コーティングプレート中で、１０μＭの示したペプチドと１６時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を１０分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをＡＩＤ ｖＳｐｏｔ Ｒｅａｄｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてカウントした。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行うため、飽和度が５０％よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が１０％よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式：スポットカウント＋２×（スポットカウント×コンフルエンス（％）／［１００％－コンフルエンス（％）］）を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、１００の位までの概数に四捨五入した。
ワクチンにコードされた６種類の異なるアカゲザルＭａｍｕ－Ａ＊０１クラスＩエピトープに対する特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを用いてＩＦＮ－γなどの細胞内サイトカインの誘導を測定することにより、ＰＢＭＣから観測した。いずれの方法の結果も、サイトカインが、エピトープに対して抗原特異的な形で誘導したことを示している。
アカゲザルにおける免疫原性
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの３０μｇ及び１００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒとの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、（ｂ）ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕ－Ａ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各群６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードするＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒまたはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡベクターのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
（表２１）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2022512912000034
免疫化の前及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った。
結果
６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、及び１０日後に測定した。表２１に示すように、各動物に、４週目及び８週目に、ＬＮＰ１またはＬＮＰ２のいずれかと製剤化した用量３０μｇまたは１００μｇのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによるブースト免疫を行った。６種類のエピトープすべてに対する複合的な免疫応答を、それぞれの免疫モニタリング時点についてプロットした（図２０Ａ～Ｄ及び表２２～表２５）。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（３０μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７０、１４、１５、１１、７、８、１４、１７、１２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ａ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１０８、－３、１４、１、３７、４、１０５、１７、２５ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｂ）。複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）によるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり－１７、３８、１４、－２、８７、２１、１０４、１２９、８９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｃ）。負の値は、各エピトープ／動物のプレブリード値に対して正規化した結果である。
複合的な抗原特異的免疫応答が、最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによるプライム免疫化の１、２、３、４、５、６、８、９、または１０週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１２１８、１７８４、１８６６、９７３、１８１３、７４７、７９７、１２４９、及び５４７ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２０Ｄ）。免疫応答は、予想されたプロファイルを示し、ピーク免疫応答がプライム免疫化の約２～３週後に測定され、４週後に免疫応答が退縮した。ＰＢＭＣ１０６個当たり１８１３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによる最初の免疫化の５週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる最初のブーストの１週後（５週目）に測定された免疫応答は、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによるプライム免疫化（３週目）について測定されたピーク免疫応答と同等であった（図２０Ｄ）。ＰＢＭＣ１０６個当たり１２４９ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答がそれぞれ、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによる最初の免疫化の９週後に測定された（すなわち、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる２度目のブーストの１週後（９週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前に測定された免疫応答よりも約２倍高かった（図２０Ｄ）。
（表２２）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３０μｇ）（グループ１）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000035
（表２３）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（１００μｇ）（グループ２）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000036
（表２４）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（１００μｇ）（グループ３）についての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000037
（表２５）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ プライムについての各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000038
インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験（より高い用量）
この実験は、（ａ）同種のプライム／ブーストまたは異種のプライム／ブーストとしてのＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの３００μｇの用量とＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒとの組み合わせの免疫原性を評価し、（ｂ）用量３００μｇで、ＬＮＰ２に対してＬＮＰ１を使用した脂質ナノ粒子中のＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡの免疫応答を比較し、（ｃ）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ及びＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによる免疫化に対するＴ細胞応答の速度論を評価するように設計した。
この実験アームを、免疫原性を実証するためにＭａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。更に、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはＭａｍｕＡ＊０１ ＭＨＣクラスＩハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを異なる実験アーム（各グループ６匹のアカゲザル）にランダム化し、複数のＭａｍｕ－Ａ＊０１制限抗原を含むモデル抗原をコードするＣｈＡｄＶ６８．５－ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒまたはＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡのいずれかを筋肉内注射により両側性に投与した。各実験アームは下記に記載したとおりである。
グループ１については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（異種のプライム／ブースト）。グループ２及び３については、免疫化の前及び初期免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後にＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行った（同種のプライム／ブースト）。
（表２６）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ免疫原性の実験
Figure 2022512912000039
結果
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルを、ＣｈＡｄＶ６８．５－ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４週後に測定した（図２１及び表２７）。動物に、４、１２、及び２０週目にＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。最初のＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒによる初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１７５０、４２２５、１１００、２５２９、３２１８、１９１５、１７０８、１５６１、５０７７、４５４３、４９２０、５８２０、３３９５、２７２８、１９９６、１４６５、４７３０、２９８４、２８２８、または３０４３ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２１）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる２度目のブースト免疫化の１週後（１３週目）に測定された免疫応答は、ブースト免疫化の直前（１２週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる３度目のブースト免疫化の１週後（２１週目）に測定された免疫応答は、２度目のブーストで観察された応答と同様、ブースト免疫化の直前（２０週目）に測定された免疫応答よりも約３倍高かった。
Ｍａｍｕ－Ａ＊０１インドアカゲザルをまた、２種類の異なるＬＮＰ製剤（ＬＮＰ１及びＬＮＰ２）を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡで免疫化した。６種類の異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の抗原特異的細胞性免疫応答を、免疫化の前、及び初期免疫化の４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週後に測定した（図２２及び図２３、表２８及び表２９）。動物に、４及び１２週目にＬＮＰ１またはＬＮＰ２製剤を用いてＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡによる免疫化を行った。複合的な抗原特異的免疫応答が、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５週後にそれぞれ、ＰＢＭＣ１０６個当たり１６８、２０４、１０３、１２６、１４０、１４５、３３０、２０３、及び１６２ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）ですべての測定において観察された（図２２）。ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１による免疫化の４、５、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５週後に、ＰＢＭＣ１０６個当たり１８９、１８５、３４９、４３７、４９２、５７０、２３３、８８６、３６９、及び３８１ＳＦＣ（６つのエピトープの合計）の複合的な抗原特異的免疫応答が観察された（図２３）。
（表２７）ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ（グループ１）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000040
（表２８）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ２（３００μｇ）（グループ２）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000041
（表２９）ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡ－ＬＮＰ１（３００μｇ）（グループ３）によるプライミングワクチン接種における各エピトープに対するＰＭＢＣ１０６個当たりの平均スポット形成細胞（ＳＦＣ）±ＳＥＭ
Figure 2022512912000042
ｓｒＲＮＡの用量範囲実験
本発明の一実現形態では、ｓｒＲＮＡの用量範囲実験を、ｍａｍｕＡ０１インドアカゲザルで実施することによって、どのｓｒＲＮＡ用量をＮＨＰ免疫原性実験に進めるべきかを特定することができる。１つの例では、ＭａｍｕＡ０１インドアカゲザルに、複数のｍａｍｕＡ０１制限エピトープを含むモデル抗原をコードするｓｒＲＮＡベクターを筋肉内注射により投与することができる。別の例では、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を、筋肉内ワクチン注射の部位の近位に皮下投与することで１つの動物群でワクチン流入領域リンパ節をターゲティングすることができる。最初の免疫化後、２週間ごとにＰＢＭＣを採取して免疫モニタリングを行うことができる。各実験アームを下記に記載する（表３０）。
（表３０）インドアカゲザルにおける非ＧＬＰ ＲＮＡ用量範囲実験
Figure 2022512912000043
＊ｓｒＲＮＡの用量範囲は３００μｇ以下の高用量で決定される。
インドアカゲザルにおける免疫原性の実験
抗原ベクターを用いた免疫原性を実証するために、ｍａｍｕ Ａ０１インドアカゲザル（ＮＨＰ）を用いてワクチン試験を行った。図３４にワクチン接種法を示す。３つのグループのＮＨＰを、ＣｈＡｄＶ６８．５－ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒと、チェックポイント阻害抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブで免疫した（グループ５＆グループ６）、またはチェックポイント阻害因子なしで免疫した（グループ４）。抗体は、静脈内投与（グループ５）または皮下投与（グループ６）のいずれかで投与した。三角形は、０週目と３２週目におけるｃｈＡｄ６８ワクチン接種（１ｅ１２ｖｐ／動物）を示す。丸は、０，４、１２、２０、２８及び３２週目のアルファウイルスワクチン接種を示す。
免疫したＮＨＰでのＣＤ８＋抗エピトープ応答の時間経過を、ｃｈＡｄ－ＭＡＧ免疫単独（図３５及び表３１Ａ）、チェックポイント阻害因子送達ＩＶによるｃｈＡｄ－ＭＡＧ免疫（図３６及び表３１Ｂ）、及びチェックポイント阻害因子送達ＳＣによるｃｈＡｄ－ＭＡＧ免疫（図３７及び表３１Ｃ）を示す。結果は、ｃｈＡｄ６８ベクターが霊長類のＣＤ８＋応答を効率的にプライミングし、アルファウイルスベクターがｃｈＡＤ６８ワクチンのプライミング応答を効率的にブーストし、チェックポイント阻害因子がＩＶまたはＳＣに送達されたか否かにかかわらず、プライミング応答及びブースト応答の両方を増幅し、ワクチン接種後に再投与されたｃｈＡｄベクターが免疫応答を効果的にブーストしたことを実証している。
（表３１Ａ）ｃｈＡｄ－ＭＡＧを投与されたアカゲザル（グループ４）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／－標準誤差を示す。
Figure 2022512912000044
（表３１Ｂ）ｃｈＡｄ－ＭＡＧ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）をＩＶ送達されたアカゲザル（グループ５）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／－標準誤差を示す。
Figure 2022512912000045
（表３１Ｃ）ｃｈＡｄ－ＭＡＧ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）をＳＣ送達されたアカゲザル（グループ６）におけるＣＤ８＋抗エピトープ応答。平均ＳＦＣ／１ｅ６脾細胞＋／－標準誤差を示す。
Figure 2022512912000046
インドアカゲザルにおける記憶表現型検査
アカゲザルをＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒ／ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓｒＲＮＡヘテロログスプライム・ブーストレジメンで抗ＣＴＬＡ４をともなうまたはそれをともなわず免疫し、ＣｈＡｄＶ６８．５ＷＴｎｔ．ＭＡＧ２５ｍｅｒで再度ブーストした。群は、最終的なＣｈＡｄＶ６８投与の１１か月後（試験１８か月目）に評価した。ＥＬＩＳｐｏｔによる評価は、記載されているように実施した。図３８及び表４３は、免疫化前（左パネル）及び１８か月後（右パネル）の両方でＥＬＩＳｐｏｔによって測定された、６つの異なるＭａｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープに対する細胞応答を示す。制限エピトープに対する応答の検出は、抗原特異的記憶応答がＣｈＡｄＶ６８／ｓａｍＲＮＡワクチンプロトコールによって生成されたことを実証している。
記憶を評価するために、ワクチンにコードされた４つの異なるアカゲザルＭａｍｕ－Ａ＊０１クラスＩエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞をデュアルカラーＭａｍｕ－Ａ＊０１テトラマー標識を用いてモニターし、各抗原は独自の二重陽性の組み合わせで表され、１つの試料内の４つの抗原特異的集団のすべてを同定することができた。記憶細胞の表現型検査は、細胞表面マーカーＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７との共染色によって行われた。図３９及び表４４は、４つの異なるＭａｕｍｕ－Ａ＊０１制限エピトープを認識するメモリーＴ細胞についてのコンビナトリアルテトラマー染色及びＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７共染色の結果を示す。Ｔ細胞の表現型もフローサイトメトリーによって評価した。図４０は、試験１８か月目の４つのＭａｍｕ－Ａ＊０１テトラマー＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の合計内の記憶細胞型の分布を示す。記憶細胞は、以下のように特徴づけられた。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋＝ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－＝エフェクター（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋＝セントラルメモリー（Ｔｃｍ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－＝エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）。まとめると、結果は、記憶応答が、最後のブーストから少なくとも１年後に検出されたことを示しており、エフェクター、セントラルメモリー、及びエフェクターメモリー集団を含む、免疫の長期持続性を示している。
（表４３）プレプライム及び記憶評価の両方の時点（１８か月）での各動物のＰＢＭＣ１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値
Figure 2022512912000047
ＮＤ＝技術的に除外されているため不確定
（表４４）生存ＣＤ８＋細胞のうちのＭａｍｕ－Ａ＊０１テトラマー陽性の割合
Figure 2022512912000048
ＸＩＸ．インターフェロンシグナル伝達抑制との併用によるワクチン接種
アルファウイルスに基づくｓａｍＲＮＡワクチンの発現及び効力を増大させるために、Ｉ型ＩＦＮ媒介性抑制の抗原発現及び免疫原性への影響を評価した。例えば、Ｐｅｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．,Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７Ｍａｙ１５；１９８（１０）：４０１２－４０２４を参照のこと。
材料及び方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＬＮＰ製剤化したＶＥＥ－ルシフェラーゼｓａｍＲＮＡ（配列番号１５）（１匹当たり１０μｇ、筋肉内、両側に送達）、及び抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブのいずれかで免疫化した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、免疫化の２４時間前に単回投与として腹腔内に投与した（２ｍｇ）。トファシチニブを、免疫化の２４時間前から6日間、１日２回２ｍｇを経口投与した。相対発光（ＲＬＵ）を、ＶＥＥＥ－ルシフェラーゼによる免疫化後、１日目、２日目及び５日目に各マウスについて定量化した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓａｍＲＮＡ（配列番号４；マウス１匹当たり１０μｇ、筋肉内、両側に送達）、及び抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブのいずれかで免疫化した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、免疫化の２４時間前に単回投与として腹腔内に投与した（２ｍｇ）。トファシチニブを、免疫化の２４時間前から８日間、１日２回２ｍｇを経口投与した。マウスを屠殺し、ＶＥＥ－ＭＡＧによる免疫化後１２日目に脾臓を採取した。ＡＨ１－Ａ５ペプチド（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ（配列番号１９３））に対するＴ細胞応答を、細胞内サイトカイン染色を用いて測定した。
結果
ＩＦＮを阻害するために、ＩＦＮαβ受容体（ＩＦＮＡＲ）をブロックするモノクローナル抗体（ＭＡＲ１－５Ａ３）、またはＪＡＫ１及びＪＡＫ３の低分子阻害因子であるトファシチニブを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＶＥＥ－ルシフェラーゼ、またはモデル抗原カセットを発現するＶＥＥ－ＭＡＧのいずれかでワクチン接種の２４時間前にマウスに注射した。ルシフェラーゼ発現は、インビボイメージングによって免疫化後の様々な時点で評価した。免疫化の２４時間後のルシフェラーゼ発現は、ａＩＦＮＡＲ ＭＡｂによる前処理で約２００倍の増加になり、トファシチニブによる前処理で約６０倍の増加になった（図２６Ａ、表３２）。
（表３２）抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブのいずれかと組み合わせたＶＥＥ－ルシフェラーゼＳＡＭでＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫化した後の平均ＲＬＵ値
Figure 2022512912000049
抗原特異的Ｔ細胞応答は、免疫化後の１２日目に細胞内サイトカイン染色により測定した。発現の増加と一致して、ａＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファチニブのいずれかによる前処理は、抗原特異的Ｔ細胞の有意な増加をもたらした（ａＩＦＮＡＲ：ＩｇＧで処理した対照の９％と比較して、平均２２％のＩＦＮｇ＋（ＣＤ８＋に対する％）、ｐ＜０．００１；トファチニブ：ビヒクルで処理した対照の９％と比較して、平均１３％のＩＦＮｇ＋（ＣＤ８＋に対する％）、ｐ＜０．０５）。図２６Ｂ及び表３３を参照のこと。
（表３３）抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂまたはトファシチニブまたは対照のいずれかと組み合わせた、ＶＥＥ－ＭＡＧ ＳＡＭによる免疫化後１２日目の平均抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ８に対する％）
Figure 2022512912000050
ＸＸ．インターフェロンシグナル伝達抑制の時機の評価
Ｉ型ＩＦＮ介在抑制の時機及び/または継続が、ワクチンの抗原発現ならびに免疫原性に与える影響を評価した。
材料及び方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓａｍＲＮＡ（配列番号４；マウス１匹当たり１μｇ、筋肉内、両側に送達）、及び抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ抗体または抗ＩｇＧ抗体対照のいずれかで免疫化した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、以下に示されるように、ｓａｍＲＮＡとの免疫化の前後の指定された時間に腹腔内（２ｍｇ）に投与した。マウスを屠殺し、ＶＥＥ－ＭＡＧによる免疫化後１２日目に脾臓を採取した。ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生をＩＦＮ－γ産生を細胞内サイトカイン染色を用いて測定し、ＡＨ１－Ａ５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合をＭＨＣクラスＩテトラマー染色を用いて測定した。
結果
ｓａｍＲＮＡワクチン接種での免疫応答の改善におけるＩ型ＩＦＮＡＲの阻害を更に評価するために、ｓａｍＲＮＡワクチンの投与に対する抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂの投与タイミングを評価した。具体的には、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂをｓａｍＲＮＡワクチン投与の２４時間前、同時期、６時間後、１２時間後、２４時間後のいずれかに投与した。免疫応答は、ＣＤ８ Ｔ細胞での抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生をアッセイして評価し、総ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として定量化した。図２７Ａ及び表３４Ａに示すように、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂを、ｓａｍＲＮＡワクチンを投与する２４時間前、同時に、または６時間後に投与すると、対照抗体を投与した場合と比較して、抗原特異的免疫応答が有意に改善された。一方、抗ＩＦＮＡＲ ＭａｂをｓａｍＲＮＡワクチン投与の１２時間後または２４時間後に投与しても、対照抗体と比較して免疫応答は改善しなかった。したがって、この結果は、ＩＦＮａの早期抑制が抗原特異的免疫応答の改善につながることを示している。
（表３４Ａ）ＡＨ１－Ａ５特異的ＩＦＮ－γ産生（ＣＤ８ Ｔ細胞全体に占める割合）
Figure 2022512912000051
＊ダネット検定
ｓａｍＡワクチン接種での免疫応答の改善のＩ型ＩＦＮの阻害を更に評価するために、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂの継続投与が、ＳＡＭ発現の増加にもかかわらず、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害を継続することが、全体的な免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）に負の影響を与えるかなどを評価した。前述を評価するために、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂを、ｓａｍＲＮＡワクチンを投与する２４時間前、２４時間前と２４時間後の両方、または２４時間前と４日目と８日目に投与した。免疫応答は、ＣＤ８ Ｔ細胞での抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＭＨＣテトラマー染色及びＩＦＮ－γ産生をアッセイして評価し、総ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として定量化した。図２７Ｂ及び表３４Ｂ（ＭＨＣテトラマー染色）、ならびに図２７Ｃ及び表３４Ｃ（ＩＦＮ－γ産生）に示すように、ｓａｍＲＮＡワクチン投与後の抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂの追加投与は、ｓａｍＲＮＡワクチン投与の２４時間前に抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂの単回投与を行った場合と比較して、免疫応答を変化させなかったが、すべての抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ処置プロトコールは、対照抗体を投与した場合と比較して抗原特異的免疫応答の改善をもたらした。したがって、この結果は、ＩＦＮａの抑制を継続して行っても、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害に起因する、エピトープ特異的免疫応答の増加を顕著には変化させない（例えば、鈍化させない）ことを示している。
（表３４Ｂ）ＡＨ１－Ａ５特異的ＭＨＣテトラマー染色（全ＣＤ８ Ｔ細胞に占める割合）
Figure 2022512912000052
（表３４Ｃ）ＡＨ１－Ａ５特異的ＩＦＮ－γ産生（ＣＤ８ Ｔ細胞全体に占める割合）
Figure 2022512912000053
ＸＸＩ．インターフェロンシグナル伝達抑制の投与経路の評価
Ｉ型ＩＦＮ介在抑制の投与経路が、ワクチンの抗原発現ならびに免疫原性に与える影響を評価した。
材料及び方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＶＥＥ－ＭＡＧ２５ｍｅｒ ｓａｍＲＮＡ（配列番号４；マウス１匹当たり１μｇ、筋肉内、両側に送達）、及び抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ抗体または抗ＩｇＧ抗体対照のいずれかで免疫化した。抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂ（クローンＭＡＲ１－５Ａ３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の２４時間前にＩＰまたは筋肉内（０．５ｍｇ）に投与した。抗ＩｇＧ抗体対照は、ｓａｍＲＮＡによる免疫化の２４時間前にＩＰ（０．５ｍｇ）に投与した。マウスを屠殺し、ＶＥＥ－ＭＡＧによる免疫化後１２日目に脾臓を採取した。ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＩＦＮ－γ産生をＩＦＮ－γ産生を細胞内サイトカイン染色を用いて測定し、ＡＨ１－Ａ５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合をＭＨＣクラスＩテトラマー染色を用いて測定した。
結果
ｓａｍＲＮＡワクチン接種での免疫応答の改善におけるＩ型ＩＦＮＡＲの阻害を更に評価するために、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂの投与経路を評価した。具体的には、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂをｓａｍＲＮＡによる免疫化の２４時間前にＩＰまたは筋肉内（ＩＭ）に投与した（０．５ｍｇ）。免疫応答は、ＣＤ８ Ｔ細胞での抗原特異的（ＡＨ１－Ａ５）ＭＨＣテトラマー染色及びＩＦＮ－γ産生をアッセイして評価し、総ＣＤ８ Ｔ細胞に対する割合として定量化した。図２８Ａ及び表３５Ａ（ＭＨＣテトラマー染色）、ならびに図２８Ｂ及び表３５Ｂ（ＩＦＮ－γ産生）に示すように、抗ＩＦＮＡＲ ＭＡｂをＩＭ（局所的）またはＩＰ（全身的）のいずれかで投与すると、対照抗体を投与した場合と比較して、免疫応答が有意に改善された。したがって、この結果は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の局所的な抑制が、ｓａｍＲＮＡワクチンに対する免疫応答を増加させる上で、全身投与と同様に有効であることを示している。
（表３５Ａ）ＡＨ１－Ａ５特異的ＭＨＣテトラマー染色（全ＣＤ８ Ｔ細胞に占める割合）
Figure 2022512912000054
＊ダネット検定
（表３５Ｂ）ＡＨ１－Ａ５特異的ＩＦＮ－γ産生（ＣＤ８ Ｔ細胞全体に占める割合）
Figure 2022512912000055
＊ダネット検定
特定の配列
ベクター、カセット、及び抗体の配列を以下に示す。
Figure 2022512912000056
Figure 2022512912000057
参考文献
Figure 2022512912000058
Figure 2022512912000059
Figure 2022512912000060
Figure 2022512912000061
Figure 2022512912000062
Figure 2022512912000063

Claims (161)

  1. 対象の免疫応答を刺激するための方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための組成物を前記対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
    （ｂ）カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、
    ｂ．任意で５’リンカー配列、及び
    ｃ．任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記カセット
    を含む、前記方法。
  2. 対象の免疫応答を刺激するための方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための組成物を前記対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）ＲＮＡアルファウイルス骨格が配列番号６に記載の核酸配列を含み、ＲＮＡアルファウイルス骨格配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列及びポリ（Ａ）配列を含み、前記２６Ｓプロモーター配列がＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性であり、前記ポリ（Ａ）配列が前記ＲＮＡアルファウイルス骨格にとって内因性である、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
    （ｂ）前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と前記ポリ（Ａ）配列との間に組み込まれたカセットであって、前記カセットが前記２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結されており、前記カセットが、少なくとも１つの核酸配列を含み、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列と、
    ｂ．任意で５’リンカー配列と、
    ｃ．任意で３’リンカー配列と
    を含む、前記カセット
    を含み、
    ここで、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が抗ＩＦＮαβ受容体(ＩＦＮＡＲ)遮断抗体を含む、前記方法。
  3. 前記少なくとも１つの核酸配列が前記ポリペプチドコード核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチドコード核酸配列が前記抗原コード核酸配列をコードする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗原コード核酸配列が前記エピトープコード核酸配列である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記抗原コード核酸配列が、コードされた前記エピトープへの抗原プロセシングを受けることが可能なポリペプチド配列をコードする、請求項４に記載の方法。
  7. 前記エピトープコード核酸配列が、細胞の表面上にＭＨＣクラスＩによって提示されることが知られているまたは疑われているエピトープをコードし、任意で前記細胞の表面が腫瘍細胞表面または感染細胞表面であり、任意で前記細胞が前記対象の細胞である、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
  8. 細胞が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される腫瘍細胞である、または
    細胞が、病原体感染細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞、及び寄生虫感染細胞からなる群から選択される感染細胞である、
    請求項７に記載の方法。
  9. 前記ウイルス感染細胞がＨＩＶ感染細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ポリペプチドコード核酸配列が完全長タンパク質またはその機能的部分をコードする、請求項３に記載の方法。
  11. 前記完全長タンパク質またはその機能的部分が、抗体、サイトカイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、及びゲノム編集システムヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの核酸配列が非コード核酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
  13. 前記非コード核酸配列が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリヌクレオチドまたはゲノム編集システムポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記カセットが、
    （ｉ）前記ポリペプチドコード核酸配列を含む少なくとも１つの核酸配列であって、前記ポリペプチコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列と、
    ｂ．任意で５’リンカー配列と、
    ｃ．任意で３’リンカー配列と
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列、
    （ｉｉ）任意で、前記抗原コード核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列、
    （ｉｖ）任意で、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカー配列（配列番号５６）をコードする少なくとも１つの核酸配列、及び
    （ｖ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたは前記アルファウイルスにとって外因性のポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列
    を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記カセットの各要素の順番に並べられた配列が、５’から３’方向へ、式：
    Figure 2022512912000064
    で記載され、
    式中、Ｐは前記第２のプロモーターヌクレオチド配列を含み、ここでａ＝０または１であり、
    Ｎは前記エピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、前記エピトープコード核酸配列はＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ここでｃ＝１であり、
    Ｌ５は前記５’リンカー配列を含み、ここでｂ＝０または１であり、
    Ｌ３は前記３’リンカー配列を含み、ここでｄ＝０または１であり、
    Ｇ５は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｅ＝０または１であり、
    Ｇ３は、ＧＰＧＰＧアミノ酸リンカーをコードする前記少なくとも１つの核酸配列のうちの１つを含み、ここでｇ＝０または１であり、
    Ｕは、前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のうちの１つを含み、ここでｆ＝１であり、
    Ｘ＝１～４００であり、ここで各Ｘについて、対応するＮｃは、エピトープコード核酸配列であり、かつ
    Ｙ＝０、１、または２であり、ここで各Ｙについて、対応するＵｆは、エピトープコード核酸配列である、
    請求項１４に記載の方法。
  16. 各Ｘについて、前記対応するＮｃが、異なるＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列である、請求項１５に記載の方法。
  17. 各Ｙについて、前記対応するＵｆが、異なるＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. ａ＝０、ｂ＝１、ｄ＝１、ｅ＝１、ｇ＝１、ｈ＝１、Ｘ＝２０、Ｙ＝２であり、
    前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる単一の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列であり、
    前記少なくとも１つのポリアデニル化ポリ（Ａ）配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によって与えられる少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列であり、
    各Ｎが、アミノ酸７～１５個の長さのＭＨＣクラスＩエピトープをコードし、
    Ｌ５が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＮ末端アミノ酸配列をコードする天然の５’リンカー配列であり、前記５’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｌ３が、前記ＭＨＣ Ｉエピトープの天然のＣ末端アミノ酸配列をコードする天然の３’リンカー配列であり、前記３’リンカー配列が、少なくともアミノ酸３個の長さであるペプチドをコードし、
    Ｕが、ＰＡＤＲＥクラスＩＩ配列及び破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ配列のそれぞれであり、
    前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６に記載の配列であり、かつ
    前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸１３個から２５個の間の長さのポリペプチドをコードする、
    請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記発現システムを送達するための前記組成物がナノ粒子状送達ビヒクルを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ナノ粒子状送達ビヒクルが脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＬＮＰが、イオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記イオン化可能なアミノ脂質が、ＭＣ３様（ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート）分子を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ナノ粒子状送達ビヒクルが前記発現システムを封入する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ナノ粒子状送達ビヒクルが約１００ｎｍの直径を有する、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、ＩＦＮα阻害因子、ＩＦＮβ阻害因子、ＩＦＮＡＲ阻害因子、及びＩ型インターフェロンシグナル伝達経路阻害因子からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  26. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の前記阻害因子が、抗体またはその抗原結合フラグメント、低分子阻害因子、ＲＮＡｉポリヌクレオチド、ゲノム編集システム、及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記抗体が、抗ＩＦＮα抗体、抗ＩＦＮβ抗体、抗ＩＦＮαβ受容体（ＩＦＮＡＲ）遮断抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記抗ＩＦＮα抗体が、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｕｍｕｍａｂ）、ロンタリズマブ、及びＡＳＧ－００９からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記抗ＩＦＮＡＲ遮断抗体が、ＭＡＲ１－５Ａ３、アニフロルマブ、ＡｍＳ３Ａ５－１、６４Ｇ１２、Ｈ２Ｋ６、Ｈ２Ｋ１、Ｈ３Ｋ６、Ｈ３Ｋ１ ３Ｆ１１、４Ｇ５、１１Ｅ２、及び９Ｄ４からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路阻害因子がＪＡＫキナーゼ阻害因子を含む、請求項２５に記載の方法。
  31. 前記ＪＡＫキナーゼ阻害因子が低分子を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＪＡＫキナーゼ阻害因子がＪＡＫ１／２阻害因子またはＪＡＫ１／３阻害因子を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記ＪＡＫ１／３阻害因子がトファシチニブである、請求項３２に記載の方法。
  34. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、前記発現システムを送達するための前記組成物の投与の前、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  35. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、前記発現システムを送達するための前記組成物の投与前２４時間以内に投与される、請求項３４に記載の方法。
  36. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、前記発現システムの送達のための前記組成物の投与後１２時間未満に投与される、請求項３４に記載の方法。
  37. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、前記発現システムを送達するための前記組成物の投与後６時間以内に投与される、請求項３４に記載の方法。
  38. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、前記発現システムを送達するための前記組成物の投与前２４時間から投与後６時間以内の間に投与される、請求項３４に記載の方法。
  39. 前記発現システムを送達するための前記組成物が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記発現システムを送達するための前記組成物が筋肉内（ＩＭ）に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  41. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、または静脈内（ＩＶ）に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  42. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が筋肉内（ＩＭ）に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  43. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子が静脈内（ＩＶ）に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  44. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子の単回投与が行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記カセットが、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列との間に組み込まれている、請求項１、３～１７、または１９～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が前記カセットと機能的に連結されている、請求項１、３～１７、または１９～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記１つ以上のベクターが、１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターを含む、請求項１、３～１７、または１９～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターが５’７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャップを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記１つ以上の＋鎖ＲＮＡベクターがインビトロ転写によって生成される、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 前記１つ以上のベクターが哺乳動物細胞内で自己複製する、請求項１、３～１７、または１９～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、フォートモルガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１、３～１７、または１９～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１、３～１７、または１９～５０のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、
    アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、ポリ（Ａ）配列、非構造タンパク質１（ｎｓＰ１）遺伝子、ｎｓＰ２遺伝子、ｎｓＰ３遺伝子、及びｎｓＰ４遺伝子
    を少なくとも含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、
    アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列によってコードされた、非構造タンパク質媒介増幅のための配列、２６Ｓプロモーター配列、及びポリ（Ａ）配列
    を少なくとも含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  55. 非構造タンパク質媒介増幅のための配列が、アルファウイルス５’ＵＴＲ、５１ｎｔのＣＳＥ、２４ｎｔのＣＳＥ、２６Ｓサブゲノムプロモーター配列、１９ｎｔのＣＳＥ、アルファウイルス３’ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が構造ビリオンタンパク質カプシドＥ２及びＥ１をコードしていない、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記カセットが、アウラウイルス、フォートモルガンウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはマヤロウイルスのヌクレオチド配列内の構造ビリオンタンパク質の代わりに挿入されている、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、配列番号３または配列番号５に記載の配列を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  59. 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスが、塩基対７５４４と１１１７５との間の欠失を更に含む配列番号３または配列番号５の配列を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  60. 前記ＲＮＡアルファウイルス骨格が、配列番号６または配列番号７に記載の配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記カセットが、配列番号３または配列番号５の配列に記載される塩基対７５４４と１１１７５との間の前記欠失を置換するように７５４４位に挿入されている、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記カセットの挿入が、ｎｓＰ１～４遺伝子と前記少なくとも１つの核酸配列とを含むポリシストロニックＲＮＡの転写をもたらし、前記ｎｓＰ１～４遺伝子及び前記少なくとも１つの核酸配列が別々のオープンリーディングフレーム内に存在する、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が、前記ＲＮＡアルファウイルス骨格によってコードされた天然の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１、３～１７、または１９～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列が外因性ＲＮＡプロモーターである、請求項１、３～１７、または１９～６２のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列である、請求項１、３～１７、または１９～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が、複数の２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列を含み、各２６Ｓプロモーターヌクレオチド配列が、前記別々のオープンリーディングフレームのうちの１つ以上の転写をもたらす、請求項１、３～１７、または１９～６４のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記１つ以上のベクターがそれぞれ少なくとも３００ｎｔのサイズである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記１つ以上のベクターがそれぞれ少なくとも１ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記１つ以上のベクターがそれぞれ２ｋｂのサイズである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記１つ以上のベクターがそれぞれ５ｋｂ未満のサイズである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つが、発現されかつ翻訳された場合に前記対象の細胞上にＭＨＣクラスＩによって提示されることが可能なエピトープをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記エピトープコード核酸配列のうちの少なくとも１つが、発現されかつ翻訳された場合に前記対象の細胞上にＭＨＣクラスＩＩによって提示されることが可能なエピトープをコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記少なくとも１つの核酸配列が、２つ以上の核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記少なくとも１つの核酸配列が、２つ以上のポリペプチドコード核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. 各ポリペプチドコード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項７４に記載の方法。
  76. 各ポリペプチドコード核酸配列が、リンカーをコードする核酸配列によって、異なるポリペプチドコード核酸配列と連結されている、請求項１～１７または１９～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列または１個のＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列に連結している、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記リンカーが、
    （１）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さの連続したグリシン残基、（２）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基の長さの連続したアラニン残基、（３）２個のアルギニン残基（ＲＲ）、（４）アラニン、アラニン、チロシン（ＡＡＹ）、（５）哺乳動物プロテアーゼによって効率的にプロセシングされる、アミノ酸残基少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の長さのコンセンサス配列、及び（６）起源となる同族タンパク質に由来する抗原に隣接し、アミノ酸残基少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２～２０個の長さである、１つ以上の天然配列
    からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記リンカーが、２個のＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列または１個のＭＨＣクラスＩＩ配列を、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列に連結している、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記リンカーが配列ＧＰＧＰＧを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、ここで、前記抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセシング、及び提示、ならびに／または免疫原性を増強する、分離したまたは連続した配列に、前記抗原コード核酸配列が機能的にまたは直接連結されている、請求項１～１７または１９～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティングを向上させるように改変されたユビキチン配列（例えば、７６位にＧｌｙからＡｌａへの置換を含むユビキチン配列）、免疫グロブリンシグナル配列（例えばＩｇＫ）、主要組織適合性クラスＩ配列、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）－１、ヒト樹状細胞リソソーム関連膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスＩＩ配列のうちの少なくとも１つを含み、任意で、プロテアソームターゲティングを向上させるように改変された前記ユビキチン配列がＡ７６である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する前記野生型核酸配列と比較して、コードされた前記エピトープがその対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合親和性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する前記野生型核酸配列と比較して、コードされた前記エピトープがその対応するＭＨＣアレルに対する増大した結合安定性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を含み、前記変更によって、翻訳された対応する前記野生型核酸配列と比較して、コードされた前記エピトープがその対応するＭＨＣアレル上の提示の増大した可能性を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記少なくとも１つの変更が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、または、プロテアソームにより生成されたスプライス抗原を含む、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  87. 前記対象が、がんを有するとわかっているまたは疑われている、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  88. 前記免疫応答を刺激することにより前記がんが治療される、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記がんが、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項８７または８８に記載の方法。
  90. 前記対象が、１つ以上の腫瘍を有する、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  91. 前記免疫応答を刺激することにより、前記１つ以上の腫瘍の腫瘍体積が減少する、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の核酸配列を含み、任意で、各核酸配列が、異なる非コード核酸配列、異なるポリペプチドコード核酸配列、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の核酸配列を含み、任意で、各核酸配列が、異なる非コード核酸配列、異なるポリペプチドコード核酸配列、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のポリペプチドコード核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個のポリペプチドコード核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも２～１０個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の抗原コード核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも１１～２０個、１５～２０個、１１～１００個、１１～２００個、１１～３００個、１１～４００個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または最大で４００個の抗原コード核酸配列を含む、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記少なくとも１つの核酸配列が、少なくとも２～４００個の抗原コード核酸配列を含み、前記抗原コード核酸配列のうちの少なくとも２個が、細胞表面上にＭＨＣクラスＩによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項１～１７または１９～９１のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも２つが、前記腫瘍細胞表面上にＭＨＣクラスＩによって提示される、請求項１８に記載の方法。
  100. 前記対象に投与され、かつ翻訳された場合に、前記エピトープコード核酸配列によってコードされた前記エピトープのうちの少なくとも１つが、抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記細胞表面上に前記エピトープのうちの少なくとも１つを提示する細胞を標的とする免疫応答が生じる、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  101. 前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列またはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記対象に投与され、かつ翻訳された場合に、前記ＭＨＣクラスＩエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープのうちの少なくとも１つが抗原提示細胞上に提示され、その結果、前記細胞表面上に前記エピトープのうちの少なくとも１つを提示する細胞を標的とする免疫応答をもたらし、任意で前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列及び／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列のそれぞれについての発現が、前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列によって駆動される、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  102. 前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、アミノ酸８個から３５個の間の長さ、任意で、アミノ酸９～１７個、９～２５個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、または３５個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項１～１７または１９～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在している、請求項１４～１７または１９～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、かつ少なくとも１つの変更を含む少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、前記変更が、前記コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた前記対応するペプチド配列とは異なるものにする、請求項１４～１７または１９～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記エピトープコード核酸配列が、１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、各抗原コード核酸配列が、アミノ酸１２～２０個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２０～４０個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項１～１７または１９～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記エピトープコード核酸配列が、ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が存在し、少なくとも１つの前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列が、少なくとも１つのユニバーサルＭＨＣクラスＩＩエピトープコード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも１つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びＰＡＤＲＥのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～１７または１９～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が誘導性である、請求項１、３～１７、または１９～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列または前記第２のプロモーターヌクレオチド配列が非誘導性である、請求項１、３～１７、または１９～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスに固有のポリ（Ａ）配列を含む、請求項１、３～１７、または１９～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記アルファウイルスにとって外因性のポリ（Ａ）配列を含む、請求項１、３～１７、または１９～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、前記少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１つと機能的に連結されている、請求項１、３～１７、または１９～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、または少なくとも９０個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１、３～１７、または１９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記少なくとも１つのポリ（Ａ）配列が、少なくとも１００個の連続したＡヌクレオチドである、請求項１、３～１７、または１９～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）配列、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）配列、２Ａ自己切断ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、フリン切断部位をコードするヌクレオチド配列、または、ｍＲＮＡの核輸送、安定性、もしくは翻訳効率を向上させることが知られており前記少なくとも１つの核酸配列のうちの少なくとも１つに機能的に連結されている５’もしくは３’非コード領域内の配列のうちの少なくとも１つを更に含む、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  115. 前記カセットがレポーター遺伝子を更に含み、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼバリアント、または検出可能なペプチドもしくはエピトープを含むが、これらに限定されない、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  116. 前記検出可能なペプチドまたはエピトープが、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＶ５タグからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記１つ以上のベクターが、少なくとも１つの免疫調節物質をコードする１つ以上の核酸配列を更に含む、先行請求項のいずれかに一項に記載の方法。
  118. 前記免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一特異性抗体もしくは一緒に連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、ラクダ科動物抗体ドメイン）、または完全長の一本鎖抗体（例えば、フレキシブルなリンカーによって重鎖と軽鎖が連結された完全長ＩｇＧ）である、請求項１１８に記載の方法。
  120. 抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが、２ＡもしくはＩＲＥＳなどの自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが、連続したグリシン残基などのフレキシブルなリンカーによって連結されている、請求項１１８または１１９に記載の方法。
  121. 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項１１７に記載の方法。
  122. 前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、もしくはＩＬ－２１、またはそれぞれのそれらのバリアントのうちの少なくとも１つである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記エピトープコード核酸配列が、ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を含み、ここで、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列が、
    （ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、１セットのエピトープのそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得する工程と、
    （ｂ）各エピトープの前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記腫瘍の腫瘍細胞表面上に前記ＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記エピトープのそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と、
    （ｃ）前記セットのエピトープのサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために用いられる選択された１セットのエピトープを生成する工程と
    を行うことによって選択される、請求項１～１７または１９～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
    （ａ）腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも１つを取得する工程であって、腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、１セットのエピトープのそれぞれについてのペプチド配列を表すデータを取得するために使用される、前記取得する工程と、
    （ｂ）各エピトープの前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記腫瘍の腫瘍細胞表面上に前記ＭＨＣアレルのうちの１つ以上によって前記エピトープのそれぞれが提示される１セットの数値的尤度を生成する工程であって、前記セットの数値的尤度が、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて同定されている、前記生成する工程と、
    （ｃ）前記セットのエピトープのサブセットを、前記セットの数値的尤度に基づいて選択して、１セットの選択されたエピトープを生成する工程であって、前記選択されたエピトープが、少なくとも２０個の前記ＭＨＣクラスＩエピトープコード核酸配列を生成するために用いられる、前記生成する工程と
    を行うことによって選択される、請求項１８に記載の方法。
  125. 前記セットの選択されたエピトープの数が２～２０個である、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記提示モデルが、
    （ａ）前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つとペプチド配列の特定の位置における特定のアミノ酸とのペアの存在と、
    （ｂ）前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の、前記ペアの前記ＭＨＣアレルのうちの特定の１つによる前記腫瘍細胞表面上の提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項１２３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記セットの選択されたエピトープを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大しているエピトープを選択することを含む、請求項１２３～１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記セットの選択されたエピトープを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大しているエピトープを選択することを含む、請求項１２３～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記セットの選択されたエピトープを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大しているエピトープを選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１２３～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記セットの選択されたエピトープを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害を受けやすい尤度が減少しているエピトープを選択することを含む、請求項１２３～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記セットの選択されたエピトープを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されないエピトープと比較して前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少しているエピトープを選択することを含む、請求項１２３～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織においてシークエンシングを行うことによって取得される、請求項１２３～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または任意の超並列シークエンシング手法である、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記カセットが、前記カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  135. 少なくとも１つのジャンクションエピトープ配列または各ジャンクションエピトープ配列が、ＭＨＣに対して５００ｎＭよりも高い親和性を有する、請求項１３４に記載の方法。
  136. 各ジャンクションエピトープ配列が非自己である、請求項１３４または１３５に記載の方法。
  137. 前記カセットが、翻訳される野生型核酸配列を含む非治療的ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩエピトープ核酸配列をコードしておらず、非治療的エピトープが前記対象のＭＨＣアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  138. 予測された前記非治療的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープ配列が、前記カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクションエピトープ配列である、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示尤度に基づく、請求項１３４～１３８に記載の方法。
  140. 前記カセット内の前記抗原コード核酸配列の順序が、
    （ａ）異なる順序の前記抗原コード核酸配列に対応する１セットの候補カセット配列を生成することと、
    （ｂ）各候補カセット配列について、前記候補カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定することと、
    （ｃ）所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、ワクチン用の前記カセット配列として選択することと
    を含む一連の工程によって決定される、請求項１３４～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記発現システム及び／またはＩ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子を送達するための前記組成物が、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物中に製剤化される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  142. アジュバントを投与することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  143. 先行する方法クレームのいずれか一項に記載の発現システム及びＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を送達するための組成物と、使用のための指示書とを含む、キット。
  144. 得られた前記エピトープコード核酸配列が前記対象の腫瘍に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記エピトープコード核酸配列が前記対象の腫瘍に由来しない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記方法が、１つ以上の免疫調節物質を投与することを更に含み、任意で、前記免疫調節物質が、前記発現システム及び／もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子を送達するための前記組成物またはその医薬組成物の投与の前、前記投与と同時に、または前記投与の後に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記１つ以上の免疫調節物質が、抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗４－１ＢＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＯＸ－４０抗体もしくはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記免疫調節物質が、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、または皮下（ＳＣ）に投与される、請求項１４６または１４７に記載の方法。
  149. 前記皮下投与が、前記発現システム投与部位の近傍部位での投与、または前記発現システムのための１つ以上の流入領域リンパ節に近接した投与である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記対象に第２のワクチン組成物を投与することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記第２のワクチン組成物が、前記発現システム及び/もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子を送達するための前記組成物またはその医薬組成物の投与に先立って投与される、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記第２のワクチン組成物が、前記発現システム及び/もしくはＩ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子を送達するための前記組成物またはその医薬組成物の投与に続いて投与される、請求項１５０に記載の方法。
  153. 前記第２のワクチン組成物が、前記発現システム送達のための前記組成物またはその医薬組成物と同じである、請求項１５０～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記第２のワクチン組成物が、前記発現システムを送達するための前記組成物またはその医薬組成物とは異なる、請求項１５０～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  155. 前記第２のワクチン組成物が、少なくとも１つの抗原コード核酸配列をコードするチンパンジーアデノウイルスベクターを含む、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記チンパンジーアデノウイルスベクターによってコードされる前記少なくとも１つの抗原コード核酸配列が、先行する方法クレームのいずれか一項に記載の抗原コード核酸配列と同じである、請求項１５５に記載の方法。
  157. Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の前記阻害因子またはその医薬組成物の第２の投与が、前記第２のワクチン組成物の投与の前、前記投与と同時、または前記投与の後に行われる、請求項１５０～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. がんを有する対象を治療するための方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための治療上有効な量の組成物を前記対象に投与することと、治療上有効な量のＩ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
    （ｂ）カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、
    ｂ．任意で５’リンカー配列、及び
    ｃ．任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記カセット
    を含む、前記方法。
  159. 対象の腫瘍体積を低減させるための方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための組成物を前記対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに、
    （ｂ）カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、
    ｂ．任意で５’リンカー配列、及び
    ｃ．任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記カセット
    を含む、前記方法。
  160. 対象の腫瘍特異的な免疫応答を刺激するための方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための組成物を前記対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに、
    （ｂ）カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、
    ｂ．任意で５’リンカー配列、及び
    ｃ．任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたはアルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記カセット
    を含む、前記方法。
  161. アルファウイルスに基づく発現システムの送達を強化する方法であって、
    前記方法が、発現システムを送達するための組成物を対象に投与することと、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の阻害因子を前記対象に投与することとを含み、
    ここで、前記発現システムを送達するための前記組成物が前記発現システムを含み、
    前記発現システムが、１つ以上のベクターを含み、
    前記１つ以上のベクターが、
    （ａ）（ｉ）少なくとも１つのプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのポリアデニル化（ポリ（Ａ））配列と
    を含む、ＲＮＡアルファウイルス骨格、ならびに
    （ｂ）カセットであって、
    （ｉ）少なくとも１つの核酸配列であって、任意で前記少なくとも１つの核酸配列がポリペプチドコード核酸配列を含み、任意で前記ポリペプチドコード核酸配列が抗原コード核酸配列であり、前記抗原コード核酸配列が、
    ａ．エピトープコード核酸配列であって、前記エピトープコード核酸配列が、少なくとも１つの変更を任意で含み、前記変更が、コードされたエピトープ配列を、野生型核酸配列によってコードされた対応するペプチド配列とは異なるものにする、前記エピトープコード核酸配列、
    ｂ．任意で５’リンカー配列、及び
    ｃ．任意で３’リンカー配列
    を含む、前記少なくとも１つの核酸配列と、
    （ｉｉ）任意で、前記少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結された第２のプロモーターヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）任意で、少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列であって、前記第２のポリ（Ａ）配列が、天然型ポリ（Ａ）配列であるまたは前記アルファウイルスにとって外因性ポリ（Ａ）配列である、前記少なくとも１つの第２のポリ（Ａ）配列と
    を含む、前記カセット、
    を含む、前記方法。
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