TW202000907A - 共有抗原 - Google Patents

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詹姆士 欣 孫
米雪兒 巴斯比
珍妮佛 巴斯比
蘇利文 布萊登 布理克
莫伊卡 斯科博恩
偉德 布萊爾
卡琳 約斯
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Abstract

本文揭示組合物，其包括抗原編碼核酸序列及/或抗原肽。亦揭示與該等組合物相關之核苷酸、細胞及方法，包括該等組合物作為疫苗之用途。

Description

共有抗原
基於腫瘤特異性抗原之治療性疫苗作為下一代個人化癌症免疫療法具有極大的前景1 - 3 。舉例而言，具有高突變負荷之癌症，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及黑素瘤鑒於新抗原產生之可能性相對較大而係此類療法之尤其有吸引力之目標4,5 。早期證據表明，基於新抗原之疫苗接種可引發T細胞反應6 ，且靶向新抗原之細胞療法可在選定患者之某些情形下引起腫瘤消退。7
新抗原疫苗設計之一個問題為個體腫瘤中存在之許多編碼突變中的哪一個可生成「最佳」治療性新抗原，例如可引發抗腫瘤免疫性且引起腫瘤消退之抗原。
已提出初步方法，其併入使用下一代定序的基於突變之分析、RNA基因表現及預測候選新抗原肽之MHC結合親和力8 。然而，此等提出之方法可能無法模擬整個抗原決定基產生過程，除基因表現及MHC結合之外，其含有許多步驟(例如TAP轉運、蛋白酶體裂解及/或TCR識別)9 。因此，現有方法可能會降低低陽性預測值(PPV)。
事實上，由多個組進行的由腫瘤細胞呈現之肽的分析已顯示，使用基因表現及MHC結合親和力預測將呈現之肽的＜5%可在腫瘤表面MHC上發現10 , 11 。結合受限之新抗原對檢查點抑制劑反應之預測準確性相對於單獨突變數目沒有提高的最新觀察結果進一步加強結合預測與MHC呈現之間的此種低相關性。12
預測呈現之現有方法的此低陽性預測值(PPV)提出有關基於新抗原之疫苗設計的問題。若使用PPV低的預測來設計疫苗，則大多數患者不太可能接受治療性新抗原，更少的患者可能接受多於一種(即使假設所有呈現肽均為免疫原性的)。因此，用當前方法接種新抗原不可能在大量具有腫瘤之個體中成功。
此外，先前方法僅使用順式作用突變產生候選新抗原，且很大程度上忽視考慮neo-ORF之其他來源，包括在多種腫瘤類型中發生且導致許多基因異常剪接的剪接因子之突變13 ，及形成或移除蛋白酶裂解位點之突變。
最後，由於文庫構建、外顯子組及轉錄組捕捉、定序或資料分析中之次最佳條件，腫瘤基因組及轉錄組分析之標準方法可能會遺漏產生候選新抗原之體細胞突變。同樣，標準腫瘤分析方法可能無意中促進序列偽影或生殖系多形現象作為新抗原，分別導致低效使用疫苗能力或自身免疫性風險。
除當前新抗原預測方法之挑戰外，對於可用於人類之新抗原遞送的可用載體系統亦存在某些挑戰，其中許多源自人類。舉例而言，由於先前的自然暴露，許多人類對人類病毒具有預先存在的免疫性，且此種免疫性可為使用重組人類病毒用於癌症治療之新抗原遞送的主要障礙。
另外，靶向患有癌症之患者之間共有的抗原作為疫苗策略具有極大前景，包括靶向具有突變之新抗原以及不具有突變之腫瘤抗原(例如不恰當地表現之腫瘤抗原)。共有抗原疫苗策略之挑戰至少包括上文所論述之彼等。
本文揭示一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含：抗原表現系統，其中該抗原表現系統包含一或多種載體，該一或多種載體包含：(a)載體主鏈，其中該主鏈包含：(i)至少一個啟動子核苷酸序列，及(ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含：(i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含：(I)至少一個腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含：(A)MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基，(B)視情況存在之5'連接子序列，及(C)視情況存在之3'連接子序列；(ii)視情況存在之可操作地連接於抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及(iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列；(iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之核酸序列；以及(v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中該第二poly(A)序列係載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
本文亦揭示一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含：抗原表現系統，其中該抗原表現系統包含一或多種載體，該一或多種載體包含：(a)載體主鏈，其中該主鏈包含：(i)至少一個啟動子核苷酸序列，及(ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含：(i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含：至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個彼此線性連接之腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含：(A) KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 19,831之MHC I類，(B) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 14,954之MHC I類抗原決定基，(C) KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,749及19,865組成之群的MHC I類抗原決定基，及(D)KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由以下組成之群的MHC I類抗原決定基：SEQ ID NO: 19,976；19,979; 19,779；11,495；以及19,974，其中腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含I類抗原決定基編碼核酸序列，視情況其中各MHC I抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基，且其中腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含：(A)視情況存在之5'連接子序列，及(B)視情況存在之3'連接子序列；(ii)視情況存在之可操作地連接於抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及(iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列；(iv)視情況存在之編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之至少一個核酸序列；以及(v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中第二poly(A)序列係載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
本文亦揭示一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含：抗原表現系統，其中該抗原表現系統包含一或多種載體，該一或多種載體包含：(a)載體主鏈，其中該主鏈包含：(i)至少一個啟動子核苷酸序列，及(ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含：(i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含：(I)至少20個彼此線性連接之腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含：(A) KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 19,831之MHC I類，(B) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 14,954之MHC I類抗原決定基，(C) KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,749及19,865組成之群的MHC I類抗原決定基，及(D) KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由以下組成之群的MHC I類抗原決定基：SEQ ID NO: 19,976；19,979；19,779；11,495；以及19,974，(E) KRAS_G13D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(F) KRAS_Q61K MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(G) TP53_R249M MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(H) CTNNB1_S45P MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(I) CTNNB1_S45F MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(J) ERBB2_Y772_A775dup MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(K) KRAS_Q61R MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(L) CTNNB1_T41A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(M) TP53_K132N MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(N) KRAS_Q61L MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(O) TP53_R213L MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(P) BRAF_G466V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(Q) KRAS_Q61H MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(R) CTNNB1_S37F MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(S) TP53_S127Y MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(T) TP53_K132E MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，(U) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，且其中腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含：(A)視情況存在之5'連接子序列，及(B)視情況存在之3'連接子序列；(ii)視情況存在之可操作地連接於抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及(iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列；(iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之核酸序列；以及(v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中該第二poly(A)序列係載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
本文亦揭示一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含：抗原表現系統，其中該抗原表現系統包含一或多種載體，該一或多種載體包含：(a)載體主鏈，其中該載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體係ChAdV68載體或α病毒載體，視情況其中該α病毒載體係委內瑞拉馬腦炎病毒載體；以及(b)整合在26S啟動子核苷酸序列與poly(A)序列之間的抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含：(i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個彼此線性連接之腫瘤特異性及MHC I類抗原編碼核酸序列且其各自包含：(A) MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基，且其中MHC I類抗原決定基中之至少一者係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，(B) 5'連接子序列，其中該5'連接子序列編碼MHC I類抗原決定基之天然N端胺基酸序列，且其中5'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽，(C) 3'連接子序列，其中該3'連接子序列編碼MHC I類抗原決定基之天然C端酸序列，且其中3'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽，且其中抗原卡匣可操作地連接於26S啟動子核苷酸序列，其中MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間的多肽，且其中各MHC I類抗原編碼核酸序列之各3'端連接於除抗原卡匣中之最終MHC I類抗原編碼核酸序列之外的後續MHC I類抗原編碼核酸序列之5'端；以及(ii)至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列，其包含：(I) PADRE MHCII類序列(SEQ ID NO: 48)，(II)破傷風類毒素MHC II類序列(SEQ ID NO: 46)，(III)第一核酸序列，其編碼連接PADRE MHC II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列之GPGPG胺基酸連接子序列，(IV)第二核酸序列，其編碼將至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之5'端連接至腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列之GPGPG胺基酸連接子序列，(V)視情況存在之第三核酸序列，其編碼至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之3'端處之GPGPG胺基酸連接子序列。
本文亦揭示一種評估患有癌症之個體之方法，其包含以下步驟：a)判定或已判定：1)該個體是否具有經預測或已知呈現基於抗原之疫苗中包括之抗原的HLA對偶基因，及以下中之一或兩者：1)個體之腫瘤是否表現與抗原相關之基因，2)個體之腫瘤是否具有與抗原相關之突變，b)根據(a)之結果判定或已判定當個體表現HLA對偶基因，個體之腫瘤表現該基因，或/及個體之腫瘤具有突變時，個體係利用基於抗原之疫苗之療法的候選者，其中該抗原包含至少一個選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基序列，及c)視情況存在之向該個體投與，已投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列。
本文亦揭示一種評估患有癌症之個體之方法，其包含以下步驟：a)判定或已判定若該個體表現：1) A0301 HLA對偶基因，則該個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12A突變，2) A0201 HLA對偶基因，則個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12C突變，3) C0802 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因，則個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12D突變，或4) A0301 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因或A3101 HLA對偶基因或C0102 HLA對偶基因或A0302 HLA對偶基因，則個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12V突變，及b)根據(a)之結果判定或已判定當個體為以下情況時：1) A0301對偶基因，個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12A突變，2) A0201對偶基因，個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12C突變，3) C0802 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因，個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12D突變，或4) A0301 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因或A3101 HLA對偶基因或C0102 HLA對偶基因或A0302 HLA對偶基因，個體之腫瘤表現KRAS基因，且個體之腫瘤具有KRAS_G12V突變時，個體係利用基於抗原之疫苗之療法的候選者，及c)視情況向該個體投與，已投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，其分別包含KRAS_G12A突變、KRAS_G12C突變、KRAS_G12D突變或KRAS_G12V突變，或2)編碼至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，該至少一個MHC I類抗原決定基分別包含KRAS_G12A突變、KRAS_G12C突變、KRAS_G12AD突變或KRAS_G12V突變。
在一些態樣中，步驟(a)及/或(b)包含自已處理來自個體之樣品之第三方獲得資料集。在一些態樣中，步驟(a)包含自該個體獲得樣品且使用選自由以下組成之群的方法分析該樣品：外顯子組定序、目標外顯子組定序、轉錄組定序、桑格定序(Sanger sequencing)、基於PCR之基因分型分析、基於質譜法之方法、微陣列、奈米串、ISH及IHC。在一些態樣中，樣品包含腫瘤樣品、正常組織樣品或該腫瘤樣品及該正常組織樣品。在一些態樣中，樣品係選自組織、體液、血液、腫瘤生檢、脊髓液及針抽出物。在一些態樣中，基因選自由以下組成之群：表34中發現之基因中之任一者。在一些態樣中，基因選自由以下組成之群：表32中發現之基因中之任一者。在一些態樣中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、微衛星穩定結腸癌及胰臟癌。在一些態樣中，HLA對偶基因具有至少5%之HLA頻率。在一些態樣中，至少一個MHC I類抗原決定基由HLA對偶基因呈現在與個體之腫瘤相關之細胞上。在一些態樣中，基於抗原之疫苗包含抗原表現系統。在一些態樣中，抗原表現系統包含本文揭示之抗原表現系統中之任一者。在一些態樣中，基於抗原之疫苗包含本文所揭示之醫藥組合物中之任一者。
本文亦揭示一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群。在一些態樣中，至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列源自患有癌症之個體之腫瘤。在一些態樣中，至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列並非源自患有癌症之個體之腫瘤。
本文亦揭示一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗向該個體，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群。在一些態樣中，該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因。在一些態樣中，該個體表現經預測或已知呈現至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表34中提及之突變組成之群的突變。在一些態樣中，該個體表現至少一個經預測或已知呈現至少一個MHC I類抗原決定基序列之HLA對偶基因，且其中至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表32中提及之突變組成之群的突變。
本文亦揭示一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現至少一個經預測或已知呈現至少一個MHC I類抗原決定基序列之HLA對偶基因。
本文亦揭示一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現至少一個經預測或已知呈現至少一個MHC I類抗原決定基序列之HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表34中提及之突變組成之群的突變，且其中該個體表現表34中所示與表34中所示之相應突變相匹配之至少一個HLA對偶基因(例如KRAS_G13D及C0802)。
本文亦揭示一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含：1)至少一個MHC I類抗原決定基，或2)編碼至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現至少一個經預測或已知呈現至少一個MHC I類抗原決定基序列之HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表32中提及之突變組成之群的突變。在一些態樣中，基於抗原之疫苗包含抗原表現系統。在一些態樣中，抗原表現系統包含本文描述之抗原表現系統中之任一者。在一些態樣中，基於抗原之疫苗包含本文所描述之醫藥組合物中之任一者。
在一些態樣中，新抗原卡匣之各元件之有序序列描述於下式中，自5'至3'包含： Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
其中P包含第二啟動子核苷酸序列，其中a=0或1，N包含MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之一者，其中c = 1，L5包含5'連接子序列，其中b = 0或1，L3包含3'連接子序列，其中d=0或1，G5包含編碼GPGPG胺基酸連接子之至少一個核酸序列中之一者，其中e=0或1，G3包含編碼GPGPG胺基酸連接子之至少一個核酸序列中之一者，其中g=0或1，U包含至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列中之一者，其中f=1，X=1至400，其中對於各X，相應的Nc係抗原決定基編碼核酸序列，且Y=0、1或2，其中對於各Y，相應的Uf係抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，對於各X，相應Nc係不同的MHC I類抗原決定基編碼核酸序列。在一些態樣中，對於各Y，相應Uf係不同的MHC II類抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，a = 0，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2，至少一個啟動子核苷酸序列係由主鏈提供之單一26S啟動子核苷酸序列，至少一個聚腺苷酸化poly(A)序列係由主鏈提供之至少100個連續A核苷酸之poly(A)序列，各N編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基，L5係天然5'連接子序列，其編碼MHC I抗原決定基之天然N端胺基酸序列，且其中5'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽，L3係天然3'連接子序列，其編碼MHC I抗原決定基之天然核末端酸，且其中3'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽，U係PADRE II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之每一者，載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體係ChAdV68載體，或α病毒載體，視情況其中該α病毒載體係委內瑞拉馬腦炎病毒載體，且MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間的多肽。
在一些態樣中，新抗原卡匣整合在至少一個啟動子核苷酸序列與至少一個poly(A)序列之間。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列可操作地連接於新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，一或多種載體包含一或多種+-股RNA載體。在一些態樣中，一或多種+-股RNA載體包含5' 7-甲基鳥苷(m7g)端帽。在一些態樣中，一或多種+-股RNA載體係藉由活體外轉錄製備。在一些態樣中，一或多種載體在哺乳動物細胞內自我複製。
在一些態樣中，主鏈包含奧拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅斯河病毒(Ross River virus)、勝利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)或馬雅羅病毒(Mayaro virus)之至少一個核苷酸序列。在一些態樣中，主鏈包含委內瑞拉馬腦炎病毒之至少一個核苷酸序列。在一些態樣中，主鏈至少包含用於非結構蛋白質介導之擴增的序列、26S啟動子序列、poly(A)序列、非結構蛋白質1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因及nsP4基因，其由奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅斯河病毒、勝利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬雅羅病毒之核苷酸序列編碼。在一些態樣中，主鏈至少包含用於非結構蛋白質介導之擴增的序列、26S啟動子序列及poly(A)序列，其由奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅斯河病毒、勝利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬雅羅病毒之核苷酸序列編碼。在一些態樣中，用於非結構蛋白質介導之擴增的序列選自由以下組成之群：α病毒5' UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S次基因組啟動子序列、19-nt CSE、α病毒3' UTR或其組合。
在一些態樣中，主鏈不編碼結構病毒粒子蛋白質衣殼E2及E1。在一些態樣中，新抗原卡匣代替結構病毒粒子蛋白質插入奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅斯河病毒、勝利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬雅羅病毒之核苷酸序列內。
在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)包含病毒株TC-83。在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5中闡述之序列。在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒包含序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5，其進一步包含在鹼基對7544與11175之間的缺失。在一些態樣中，主鏈係SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中闡述之序列。在一些態樣中，插入新抗原卡匣以取代序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5中所闡述之鹼基對7544與11175之間的缺失。
在一些態樣中，插入新抗原卡匣提供包含nsP1-4基因及至少一個抗原編碼核酸序列之多順反子RNA之轉錄，其中nsP1-4基因及至少一個抗原編碼核酸序列位於分開的開放閱讀框架中。
在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列係由主鏈編碼之天然26S啟動子核苷酸序列。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列係外源性RNA啟動子。在一些態樣中，第二啟動子核苷酸序列係26S啟動子核苷酸序列。在一些態樣中，第二啟動子核苷酸序列包含多個26S啟動子核苷酸序列，其中各26S啟動子核苷酸序列提供分開的開放閱讀框架中之一或多者的轉錄。
在一些態樣中，腺病毒載體為黑猩猩腺病毒(ChAd)載體，視情況C68載體。在一些態樣中，腺病毒載體包含SEQ ID NO: 1中闡述之序列。在一些態樣中，腺病毒載體包含SEQ ID NO:1中闡述之序列，但完全缺失或功能性缺失選自由以下組成之群的至少一個基因中的序列：SEQ ID NO:1中所闡述之序列的黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，視情況其中完全缺失或功能性缺失以下各者中的序列：SEQ ID NO:1中所闡述之序列的(1) E1A及E1B；(2) E1A、E1B及E3；或(3) E1A、E1B、E3及E4。在一些態樣中，腺病毒載體包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因或調節序列，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1中所闡述之序列的黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
在一些態樣中，新抗原卡匣插入於腺病毒載體中之E1區、E3區及/或允許併入新抗原卡匣之任何缺失的AdV區。
在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列係誘發性的。在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列係非誘發性的。在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列係CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK或EBV啟動子序列。
在一些態樣中，腺病毒載體之新抗原卡匣另外包含可操作地連接於複數個序列中之至少一者的至少一個polyA序列，視情況其中該polyA序列位於複數個序列中之至少一者的3'。
在一些態樣中，腺病毒載體係由第一代、第二代或輔助病毒依賴性腺病毒載體中之一者產生。
在一些態樣中，腺病毒載體包含鹼基對編號577與3407之間的一或多個缺失，且視情況其中該腺病毒載體另外包含SEQ ID NO:1中所闡述之序列的鹼基對27,141與32,022之間或鹼基對27,816與31,332之間的一或多個缺失。在一些態樣中，腺病毒載體另外包含SEQ ID NO:1中所闡述之序列的鹼基對編號3957與10346、鹼基對編號21787與23370及鹼基對編號33486與36193之間的一或多個缺失。
在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體各自係至少300 nt大小。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體各自係至少1 kb大小。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體各自係2 kb大小。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體各自係小於5 kb大小。
在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼由MHC I類呈現在腫瘤細胞上之多肽序列或其部分。在一些態樣中，各抗原編碼核酸序列彼此直接連接。在一些態樣中，至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者利用編碼連接子之核酸序列連接於不同的抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，連接子連接兩個MHC I類序列或將MHC I類序列連接於MHC II類序列。在一些態樣中，連接子係選自由以下組成之群：(1)連續甘胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(2)連續丙胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)藉由哺乳動物蛋白酶體有效加工之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基長之共同序列；及(6)源自同源蛋白的側接抗原且至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或2-20個胺基酸殘基長之一或多個天然序列。在一些態樣中，連接子連接兩個MHC II類序列或將MHC II類序列連接於MHC I類序列。在一些態樣中，連接子包含序列GPGPG。
在一些態樣中，至少一個抗原編碼核酸序列之至少一個序列可操作地連接或直接連接於分隔或連續序列，該分離或連續序列提高至少一個抗原編碼核酸序列之表現、穩定性、細胞遷移、處理及呈現，及/或免疫原性。在一些態樣中，分離或連續序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如泛素序列在位置76處含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、主要組織相容性I類序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白及主要組織相容性II類序列；視情況其中經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。
在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列對其相應MHC對偶基因之結合親和力增加的多肽序列或其部分。在一些態樣中，複數個至少一個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列對其相應MHC對偶基因之結合穩定性增加的多肽序列或其部分。在一些態樣中，複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型親本核酸序列在其相應MHC對偶基因上呈現之可能性增加的多肽序列或其部分。
在一些態樣中，至少一個突變包含點突變、讀框轉移突變、非讀框轉移突變、缺失突變、插入突變、剪接變異體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
在一些態樣中，腫瘤選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、成人急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列包含至少2-10個、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸序列。在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列包含至少11-20、15-20、11-100、11-200、11-300、11-400、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400個核酸序列。
在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列包含至少2-400個核酸序列且其中新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由MHC I類呈現在腫瘤細胞表面上之多肽序列或其部分。在一些態樣中，新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由MHC I類呈現在腫瘤細胞表面上之多肽序列或其部分。在一些態樣中，當向個體投與且轉譯時，由至少一個新抗原編碼核酸序列編碼之新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，從而導致靶向腫瘤細胞表面上之新抗原中之至少一者的免疫反應。在一些態樣中，至少一個新抗原編碼核酸序列在向個體投與且經轉譯時，MHC I類或II類新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，導致靶向腫瘤細胞表面上之新抗原中之至少一者的免疫反應，且視情況其中至少一個新抗原編碼核酸序列中之每一者之表現由至少一個啟動子核苷酸序列驅動。
在一些態樣中，各MHC I類新抗原編碼核酸序列編碼8至35個胺基酸長、視情況9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸長之多肽序列。
在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且其包含至少一個MHC II類新抗原編碼核酸序列，該至少一個MHC II類新抗原編碼核酸序列包含至少一個使其不同於相應野生型親本核酸序列的突變。在一些態樣中，至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列為12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸長。在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且其包含至少一個通用MHC II類抗原編碼核酸序列，視情況其中該至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列或第二啟動子核苷酸序列係誘發性的。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列或第二啟動子核苷酸序列係非誘發性的。
在一些態樣中，至少一個poly(A)序列包含主鏈之天然poly(A)序列。在一些態樣中，至少一個poly(A)序列包含主鏈之外源性poly(A)序列。在一些態樣中，至少一個poly(A)序列可操作地連接於至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。在一些態樣中，至少一個poly(A)序列係至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個或至少90個連續A核苷酸。在一些態樣中，至少一個poly(A)序列係至少100個連續A核苷酸。
在一些態樣中，新抗原卡匣進一步包含以下中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體入口序列(IRES)序列、編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列、編碼弗林裂解位點之核苷酸序列，或5'或3'非編碼區中已知增強mRNA之核輸出、穩定性或轉譯效率之序列，該序列可操作地連接於至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。
在一些態樣中，新抗原卡匣另外包含報導體基因，其包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變異體、分泌型鹼性磷酸酶、螢光素酶或螢光素酶變異體，或可偵測肽或抗原決定基。在一些態樣中，可偵測肽或抗原決定基係選自由以下組成之群：HA標籤、Flag標籤、His標籤或V5標籤。
在一些態樣中，該一或多種載體進一步包含一或多個編碼至少一種免疫調節因子之核酸序列。在一些態樣中，免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、呈單個特異性或連接在一起之多個特異性形式的單結構域抗體(sdAb) (例如駱駝科抗體結構域)、或全長單鏈抗體(例如具有藉由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。在一些態樣中，抗體之重鏈及輕鏈序列為由諸如2A之自裂解序列或IRES分開的連續序列；或抗體之重鏈及輕鏈序列藉由諸如連續甘胺酸殘基之可撓性連接子連接。
在一些態樣中，免疫調節因子為細胞介素。在一些態樣中，細胞介素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自變異體中之至少一者。
在一些態樣中，至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列係藉由執行以下步驟來選擇：(a)自腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料；(b)將各新抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在腫瘤之腫瘤細胞表面上由MHC對偶基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；(c)及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生所選擇之新抗原集合，其用於產生至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者係藉由執行以下步驟來選擇：(a)自腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料；(b)將各新抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在腫瘤之腫瘤細胞表面上由MHC對偶基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；及(c)基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生所選擇之新抗原集合，其用於產生至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，該所選擇之新抗原集合的數目為2-20個。
在一些態樣中，呈現模型表示以下兩者之間的依賴性：MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與由在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的該對MHC對偶基因中之一特定對偶基因呈現在腫瘤細胞表面上的可能性。
在一些態樣中，選擇該所選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未選擇之新抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的新抗原。在一些態樣中，所選擇抗原已驗證為由一或多個特異性HLA對偶基因呈現。在一些態樣中，選擇該所選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未選擇之新抗原能夠在個體中誘發腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的新抗原。在一些態樣中，選擇該所選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未選擇之新抗原能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的新抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。在一些態樣中，選擇該所選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未選擇之新抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。在一些態樣中，選擇該所選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未選擇之新抗原能夠在個體中誘發針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低的新抗原。在一些態樣中，外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。在一些態樣中，定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
在一些態樣中，新抗原卡匣包含由新抗原卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。在一些態樣中，每個連接抗原決定基序列為非自身的。在一些態樣中，MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證能夠由至少5%群體中存在之至少一個HLA對偶基因呈現。在一些態樣中，MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中每個抗原/HLA對在群體中的抗原/HLA發生率為至少0.01%。在一些態樣中，MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中每個抗原/HLA對在群體中的抗原/HLA發生率為至少0.1%。在一些態樣中，新抗原卡匣不編碼包含野生型轉譯核酸序列之非治療性MHC I類或II類抗原決定基核酸序列，其中該非治療性抗原決定基經預測顯示於個體之MHC對偶基因上。在一些態樣中，經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由新抗原卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，預測係基於藉由將非治療性抗原決定基之序列輸入至呈現模型中而產生之呈現可能性。在一些態樣中，新抗原卡匣中之至少一個抗原編碼核酸序列的順序係藉由一系列步驟來確定，包含：(a)產生對應於至少一個抗原編碼核酸序列之不同順序的候選新抗原卡匣序列集合；(b)對於每個候選新抗原卡匣序列，基於候選新抗原卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現評分；及(c)選擇與低於預定臨限值之呈現評分相關的候選卡匣序列作為新抗原疫苗之新抗原卡匣序列。
在一些態樣中，上述組合物中之任一者進一步包含奈米顆粒遞送媒劑。在一些態樣中，奈米顆粒遞送媒劑可為脂質奈米粒子(LNP)。在一些態樣中，LNP包含可電離胺基脂質。在一些態樣中，可電離胺基脂質包含MC3樣(二亞油醯基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯)分子。在一些態樣中，奈米顆粒遞送媒劑包封新抗原表現系統。
在一些態樣中，上述組合物中之任一者進一步包含複數種LNP，其中LNP包含：新抗原表現系統；陽離子脂質；非陽離子脂質；以及抑制LNP聚集之結合脂質，其中該複數種LNP中至少約95% LNP：具有非層狀形態；或為電子緻密的。
在一些態樣中，非陽離子脂質為(1)磷脂及(2)膽固醇或膽固醇衍生物之混合物。
在一些態樣中，抑制LNP聚集之結合脂質為聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。在一些態樣中，PEG-脂質結合物選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-腦醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。在一些態樣中，PEG-DAA結合物為選自由以下組成之群的成員：PEG-二癸氧基丙基(C10 )結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12 )結合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14 )結合物、PEG-二棕櫚氧基丙基(C16 )結合物、PEG-二硬脂氧基丙基(C18 )結合物及其混合物。
在一些態樣中，新抗原表現系統完全包封在LNP中。
在一些態樣中，LNP之非層狀形態包含倒六角(H II )或立方體相結構。
在一些態樣中，陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約50 mol%。在一些態樣中，陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約50 mol%。在一些態樣中，陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約40 mol%。
在一些態樣中，非陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約60 mol%。在一些態樣中，非陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約55 mol%。在一些態樣中，非陽離子脂質佔LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約50 mol%。
在一些態樣中，結合脂質佔LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%。在一些態樣中，結合脂質佔LNP中存在之總脂質的約2 mol%至約20 mol%。在一些態樣中，結合脂質佔LNP中存在之總脂質的約1.5 mol%至約18 mol%。
在一些態樣中，大於95%之LNP具有非層狀形態。在一些態樣中，大於95%之LNP為電子緻密的。
在一些態樣中，上述組合物中之任一者進一步包含複數種LNP，其中LNP包含：陽離子脂質，其佔LNP中存在之總脂質之50 mol%至65 mol%；抑制LNP聚集之結合脂質，其佔LNP中存在之總脂質之0.5 mol%至2 mol%；以及非陽離子脂質，其包含：磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中該磷脂佔LNP中存在之總脂質之4 mol%至10 mol%且膽固醇或其衍生物佔LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%；磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中該磷脂佔LNP中存在之總脂質之3 mol%至15 mol%且膽固醇或其衍生物佔LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%；或LNP中存在之總脂質之至多49.5 mol%且包含磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中該膽固醇或其衍生物佔LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%。
在一些態樣中，上述組合物中之任一者進一步包含複數種LNP，其中LNP包含：陽離子脂質，其佔LNP中存在之總脂質之50 mol%至85 mol%；抑制LNP聚集之結合脂質，其佔LNP中存在之總脂質之0.5 mol%至2 mol%；以及非陽離子脂質，其佔LNP中存在之總脂質之13 mol%至49.5 mol%。
在一些態樣中，磷脂包含二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)或其混合物。
在一些態樣中，結合脂質包含聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。在一些態樣中，PEG-脂質結合物包含PEG-二醯甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物或其混合物。在一些態樣中，PEG-DAA結合物包含PEG-二肉豆蔻氧基丙基(PEG-DMA)結合物、PEG-二硬脂醯氧基丙基(PEG-DSA)結合物，或其混合物。在一些態樣中，結合物之PEG部分具有約2,000道爾頓之平均分子量。
在一些態樣中，結合脂質佔LNP中存在之總脂質的1 mol%至2 mol%。
在一些態樣中，LNP包含具有式I結構之化合物：
Figure 02_image001
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前藥或立體異構體，其中：L1 及L2 各自獨立地係-0(C=0)-、-(C=0)0-、-C(=0)-、-0-、-S(0)x -、-S-S-、-C(=0)S-、-SC(=0)-、-Ra C(=0)-、-C(=0) Ra -、-Ra C(=0) Ra -、-OC(=0) Ra -、- Ra C(=0)0-或直接鍵；G1 係C1 -C2 伸烷基、- (C=0)-、-0(C=0)-、-SC(=0)-、- Ra C(=0)-或直接鍵；-C(=0)-、-(C=0)0-、-C(=0)S-、-C(=0) Ra -或直接鍵；G係C1 -C6 伸烷基；Ra 係H或C1-C12烷基；Rla 及Rlb 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 - C12 烷基；或(b) Rla 係H或C1 - C12 烷基，且Rlb 連同其鍵結之碳原子與相鄰Rlb 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 - C12 烷基；或(b) R2a 係H或C1 - C12 烷基，且R2b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R2b 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係(a)： H或C1 - C12 烷基；或(b) R3a 係H或C1 - C12 烷基，且R3b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 - C12 烷基；或(b) R4a 係H或C1 - C12 烷基，且R4b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R4b 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R5 及R6 各自獨立地係H或甲基；R7 係C4-C20烷基；R8 及R9 各自獨立地係C1-C12烷基；或R8 及R9 連同其所附接之氮原子形成5、6或7員雜環；a、b、c及d各自獨立地係1至24之整數；且x係0、1或2。
在一些態樣中，LNP包含具有式II結構之化合物：
Figure 02_image003
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體、前藥或立體異構體，其中：L1 及L2 各自獨立地係-0(C=0)-、-(C=0)0-或碳碳雙鍵；Rla 及Rlb 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) Rla 係H或C1 -C12 烷基，且Rlb 連同其鍵結之碳原子與相鄰Rlb 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R2a 係H或C1 -C12 烷基，且R2b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R2b 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R3a 係H或C1 -C12 烷基，且R3b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R3b 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R4a 係H或C1 -C12 烷基，且R4b 連同其鍵結之碳原子與相鄰R4b 及其鍵結之碳原子共同形成碳碳雙鍵；R5 及R6 各自獨立地係甲基或環烷基；R7 在每次出現時獨立地係H或C1 -C12 烷基；R8 及R9 各自獨立地係未經取代之C1-C12烷基；或R8 及R9 連同其所附接之氮原子形成包含一個氮原子之5、6或7員雜環；a及d各自獨立地係0至24之整數；b及c各自獨立地係1至24之整數；且e係1或2，其限制條件為：Rla 、R2a 、R3a 或R4a 中之至少一者係C1-C12烷基，或L1 或L2 中之至少一者係0(C=0)-或-(C=0)0-；且當a為6時，Rla 及Rlb 並非異丙基或當a為8時並非正丁基。
在一些態樣中，上述組合物中之任一者進一步包含一或多種賦形劑，包含中性脂質、類固醇及聚合物結合脂質。在一些態樣中，中性脂質包含以下中之至少一者：l,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、l,2-二軟脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、l,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)，及l,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些態樣中，中性脂質係DSPC。
在一些態樣中，化合物與中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。
在一些態樣中，類固醇係膽固醇。在一些態樣中，化合物與膽固醇之莫耳比在約2:1至1:1範圍內。
在一些態樣中，聚合物結合脂質係聚乙二醇化脂質。在一些態樣中，化合物與聚乙二醇化脂質之莫耳比在約100:1至約25:1範圍內。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質係PEG-DAG、PEG聚乙烯(PEG-PE)、PEG-丁二醯基-二醯甘油(PEG-S-DAG)、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質具有以下結構III：
Figure 02_image005
或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體，其中：R10 及R11 各自獨立地係含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中烷基鏈視情況間雜有一或多個酯鍵；且z具有在30至60範圍內之均值。在一些態樣中，R10 及R11 各自獨立地係具有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在一些態樣中，平均z為約45。
在一些態樣中，LNP在與聚陰離子核酸混合時自組裝成非雙層結構。在一些態樣中，非雙層結構之直徑在60 nm與120 nm之間。在一些態樣中，非雙層結構之直徑為約70 nm、約80 nm、約90 nm或約100 nm。在一些態樣中，其中奈米顆粒遞送媒劑之直徑為約100 nm。
本文亦揭示一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之組合物中之任一者(諸如本文揭示之基於α病毒或基於ChAd之載體)及醫藥學上可接受之載劑。在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含佐劑。在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含免疫調節因子。在一些態樣中，免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
本文亦揭示一種經分離核苷酸序列或經分離核苷酸序列集合，其包含如上述組合物技術方案中之任一者之新抗原卡匣及獲自序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5之一或多個元件，視情況其中該一或多個元件選自由以下組成之群：用於非結構蛋白質介導之擴增所需之序列、26S啟動子核苷酸序列、poly(A)序列及SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5中闡述之序列之nsP1-4基因，且視情況其中該核苷酸序列係cDNA。在一些態樣中，序列或經分離核苷酸序列之集合包含插入在SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中闡述之序列之位置7544處的本文揭示之新抗原卡匣。在一些態樣中，經分離核苷酸序列進一步包含獲自序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5之一或多個元件之T7或SP6 RNA聚合酶啟動子核苷酸序列5'，及視情況poly(A)序列之一或多個限制位點3'。在一些態樣中，本文揭示之新抗原卡匣插入SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9之位置7563處。在另一態樣中，闡述於SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9中之序列進一步包含插入位置17處之其他腺嘌呤核苷酸。
本文亦揭示一種經分離之核苷酸序列，其包含本文所揭示之新抗原卡匣及本文所揭示之至少一種啟動子。在一些態樣中，經分離之核苷酸序列另外包含基於ChAd之基因。在一些態樣中，基於ChAd之基因係由序列SEQ ID NO: 1獲得，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1中闡述之序列之黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中核苷酸序列為cDNA。
本文亦揭示一種經分離細胞，其包含本文揭示之經分離核苷酸序列，視情況其中該細胞係BHK-21、CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
本文亦揭示一種載體，其包含本文所揭示之經分離之核苷酸序列。
本文亦揭示一種套組，其包含本文所揭示之載體或組合物及使用說明書。
本文亦揭示一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之載體或本文所揭示之醫藥組合物。在一些態樣中，至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列源自患有癌症之個體之腫瘤。在一些態樣中，至少一個MHC I類新抗原編碼核酸序列並非源自患有癌症之個體之腫瘤。
本文亦揭示一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與本文所描述之組合物、載體或醫藥組合物中之任一者。在一些態樣中，該個體表現經預測或已知呈現MHC I類抗原決定基之至少一個HLA對偶基因。在一些態樣中，該個體表現經預測或已知呈現MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該MHC I類抗原決定基序列包含選自由表34中提及之突變組成之群的突變。在一些態樣中，該個體表現經預測或已知呈現MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該MHC I類抗原決定基序列包含選自由表32中提及之突變組成之群的突變。
在一些態樣中，載體或組合物經肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)，或靜脈內(IV)投與。
在一些態樣中，本文所述之方法進一步包含投與一或多種免疫調節因子，視情況其中該免疫調節因子在投與組合物或醫藥組合物之前，與其同時或在其之後投與。在一些態樣中，一或多種免疫調節因子選自由以下組成之群：抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，免疫調節因子係靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，皮下投藥靠近組合物或醫藥組合物投藥部位或非常接近於一或多種載體或組合物引流淋巴結。
在一些態樣中，本文所述之方法進一步包含向該個體投與第二疫苗組合物。在一些態樣中，第二疫苗組合物係在投與上文所述之組合物或醫藥組合物之前投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物係在投與上文所述之組合物或醫藥組合物之後投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物與上文所述之組合物或醫藥組合物相同。在一些態樣中，第二疫苗組合物不同於上文所述之組合物或醫藥組合物。在一些態樣中，第二疫苗組合物包含編碼至少一個抗原編碼核酸序列之黑猩猩腺病毒載體。在一些態樣中，由黑猩猩腺病毒載體編碼之至少一個抗原編碼核酸序列與上述組合物或載體中之任一者之至少一個抗原編碼核酸序列相同。
本文亦揭示一種製造上述組合物中之任一者之一或多種載體的方法，該方法包含：獲得包含主鏈及新抗原卡匣之線性化DNA序列；藉由以下活體外轉錄線性化DNA序列：將線性化DNA序列添加至含有所有必要組分之活體外轉錄反應物以將線性化DNA序列轉錄成RNA，視情況進一步包含將m7g端帽活體外添加至所得RNA；以及使一或多種載體與活體外轉錄反應物分離。在一些態樣中，線性化DNA序列係藉由使DNA質體序列線性化或藉由使用PCR擴增來產生。在一些態樣中，使用以下中之一者產生DNA質體序列：在細菌細胞中的細菌重組或全基因組DNA合成或擴增合成之DNA的全基因組DNA合成。在一些態樣中，使一或多種載體與活體外轉錄反應物分離涉及以下中之一或多者：苯酚氯仿萃取、基於二氧化矽管柱之純化或相似的RNA純化方法。
本文亦揭示一種製造本文所揭示之組合物中之任一者的方法，該方法包含：提供組分用於奈米顆粒遞送媒劑；提供新抗原表現系統；以及提供足以使奈米顆粒遞送媒劑及新抗原表現系統產生製造用於遞送新抗原表現系統之組合物的條件。在一些態樣中，該等條件藉由微流體混合提供。
本文亦揭示一種製造本文揭示之腺病毒載體之方法，該方法包含：獲得包含至少一個啟動子序列及新抗原卡匣之質體序列；將質體序列轉染於一或多種宿主細胞中；以及使腺病毒載體與一或多種宿主細胞分離。
在一些態樣中，分離包含：溶解宿主細胞以獲得包含腺病毒載體之細胞裂解物；以及自細胞裂解物純化腺病毒載體。
在一些態樣中，使用以下中之一者產生質體序列：在細菌細胞中的細菌重組或全基因組DNA合成或擴增合成之DNA的全基因組DNA合成。在一些態樣中，一或多個宿主細胞為CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。在一些態樣中，自細胞溶解物純化腺病毒載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
相關申請案的交叉引用
本申請案主張2018年5月23日申請之美國臨時申請案第62/675,649號及2018年5月23日申請之62/675,559之益處，該等申請案各自出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2019年5月22日，命名為GSO-019_SL.txt且大小為6,925,585位元組。 I . 定義
一般而言，申請專利範圍及本說明書中所用之術語意欲解釋為具有一般熟習此項技術者所理解之普通含義。為了更清楚，某些術語定義如下。在普通含義與所提供之定義之間存在矛盾之情況下，將使用所提供之定義。
如本文所用，術語「抗原」為誘發免疫反應之物質。抗原可為新抗原。抗原可為「共有抗原」，其為在特定群體，例如癌症患者之特定群體之間發現之抗原。
如本文所用，術語「新抗原」為具有至少一個使其不同於相應野生型抗原之改變的抗原，例如經由腫瘤細胞中之突變或特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突變可包括讀框轉移或非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。突變亦可包括剪接變異體。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾可包括異常磷酸化。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾亦可包括蛋白酶體產生之剪接抗原。參見Liepe等人, A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016年10月21日;354(6310):354-358。例示性共有新抗原展示於表A及AACR GENIE結果(SEQ ID NO: 10,755-29,357)中；亦展示各抗原之相應HLA對偶基因。該等共有新抗原適用於經由投藥誘發個體之免疫反應。可經由使用各種診斷方法(例如下文進一步描述之患者選擇方法)鑑別個體以進行投藥。
如本文所使用，術語「腫瘤抗原」係存在於個體之腫瘤細胞或組織而非存在於個體之相應正常細胞或組織中，或源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的多肽的抗原。
如本文所使用，術語「基於抗原之疫苗」係基於一或多種抗原(例如複數種抗原)之疫苗組合物。疫苗可為基於核苷酸(例如基於病毒、基於RNA或基於DNA)之疫苗、基於蛋白質(例如基於肽)之疫苗或其組合。
如本文所用，術語「候選抗原」為產生可代表抗原之序列的突變或其他畸變。
如本文所用，術語「編碼區」為編碼蛋白質之基因的部分。
如本文所用，術語「編碼突變」為在編碼區中出現之突變。
如本文所用，術語「ORF」意指開放閱讀框架。
如本文所用，術語「NEO-ORF」為由突變或其他畸變(諸如剪接)產生之腫瘤特異性ORF。
如本文所用，術語「誤義突變」為引起一個胺基酸至另一個胺基酸之取代的突變。
如本文所使用，術語「無意義突變」係造成終止密碼子之胺基酸之取代或造成移除典型起始密碼子之突變。
如本文所用，術語「讀框轉移突變」為引起蛋白質框架改變之突變。
如本文所用，術語「插入缺失」為一或多個核酸之插入或缺失。
如本文所用，在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語百分比「一致性」係指當出於最大對應性比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列具有指定百分比之相同的核苷酸或胺基酸殘基，如使用下文所描述之序列比較演算法(例如BLASTP及BLASTN或技術人員可用之其他演算法)中之一者或藉由目視檢查所量測。視應用而定，「一致性」百分比可存在於所比較之序列區域上，例如在功能域上，或替代地，存在於有待比較之兩個序列的全長上。
關於序列比較，通常一個序列充當與測試序列比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。接著，序列比較算法根據所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。可替代地，序列相似性或不相似性可藉由組合存在或不存在特定核苷酸，或對於轉譯序列，在所選擇之序列位置(例如序列基元)處之胺基酸來建立。
比較序列之最佳比對可例如藉由以下進行：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；此等算法之電腦化實施方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)；或目視檢查(一般參見Ausubel等人，見下文)。
適合於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法的一個實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。執行BLAST分析之軟體為可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
如本文所用，術語「無終止或通讀」為引起天然終止密碼子移除之突變。
如本文所用，術語「抗原決定基」為通常由抗體或T細胞受體結合之抗原的特異性部分。
如本文所用，術語「免疫原性」為例如經由T細胞、B細胞或兩者引發免疫反應之能力。
如本文所用，術語「HLA結合親和力」、「MHC結合親和力」意指特異性抗原與特異性MHC對偶基因之間結合的親和力。
如本文所用，術語「誘鉺」為用於自樣品富集DNA或RNA之特定序列的核酸探針。
如本文所用，術語「變異體」為個體之核酸與用作對照之參考人類基因組之間的差異。
如本文所用，術語「變異體識別」為通常根據定序之變異體存在的算法確定。
如本文所用，術語「多形現象」為生殖系變異體，亦即在個體之所有攜帶DNA的細胞中發現的變異體。
如本文所用，術語「體細胞變異體」為在個體之非生殖系細胞中產生之變異體。
如本文所用，術語「對偶基因」為基因之形式或基因序列之形式或蛋白質之形式。
如本文所用，術語「HLA型」為HLA基因對偶基因之補體。
如本文所用，術語「無義介導之衰變」或「NMD」為因過早終止密碼子所致的細胞對mRNA之降解。
如本文所用，術語「軀幹突變」為起源於腫瘤發展早期且存在於大部分腫瘤細胞中之突變。
如本文所用，術語「亞純系突變」為起源於腫瘤發展後期且僅存在於腫瘤細胞子集中之突變。
如本文所用，術語「外顯子組」為編碼蛋白質之基因組的子集。外顯子組可為基因組之集合外顯子。
如本文所用，術語「邏輯回歸」為來自統計之二進制資料的回歸模型，其中因變數等於1之機率的邏輯經模型化為因變數之線性函數。
如本文所用，術語「神經網路」為用於分類或回歸之機器學習模型，其由多層線性變換組成，接著為通常經由隨機梯度下降及反向傳播進行訓練之元素級非線性。
如本文所用，術語「蛋白質組」為由細胞、細胞群或個體表現及/或轉譯之全部蛋白質的集合。
如本文所用，術語「肽組」為由MHC-I或MHC-II在細胞表面上呈現之所有肽的集合。肽組可指細胞或細胞集合(例如腫瘤肽組，意味著構成腫瘤之所有細胞的肽組的聯合)之特性。
如本文所用，術語「ELISPOT」意指酶聯免疫吸附斑點分析，其為用於監測人類及動物中之免疫反應的常用方法。
如本文所用，術語「葡聚糖肽多聚體」為在流式細胞測量術中用於抗原特異性T細胞染色之基於葡聚糖的肽-MHC多聚體。
如本文所用，術語「耐受性或免疫耐受性」為對一或多種抗原(例如自身抗原)免疫無反應性的狀態。
如本文所用，術語「中心耐受性」為藉由缺失自身反應性T細胞純系或藉由促進自身反應性T細胞純系分化成免疫抑制性調節性T細胞(Treg)而在胸腺中遭受的耐受性。
如本文所用，術語「外周耐受性」為藉由下調或不激活經受中心耐受性之自身反應性T細胞或促進此等T細胞分化成Treg而在外周遭受的耐受性。
術語「樣品」可包括藉由包括靜脈穿刺、排泄、射精、按摩、活組織檢查、針抽吸、灌洗樣品、刮取、手術切口或干預之手段或此項技術中已知的其他手段自個體獲取之單細胞或多細胞或細胞碎片或體液等分試樣。
術語「個體」涵蓋人類或非人類、無論活體內、離體或活體外、雄性或雌性的細胞、組織或生物體。術語個體包括涵蓋人類之哺乳動物。
術語「哺乳動物」涵蓋人類及非人類，且包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、牛科動物、馬科動物及豬科動物。
術語「臨床因素」係指個體狀況之量度，例如疾病活動或嚴重程度。「臨床因素」涵蓋個體健康狀況之所有標記，包括非樣本標記，及/或個體之其他特徵，諸如(但不限於)年齡及性別。臨床因素可為可在確定條件下評估來自個體之樣品(或樣品群體)或個體而獲得的評分、值或值集合。臨床因素亦可藉由標記及/或其他參數(諸如基因表現代替物)來預測。臨床因素可包括腫瘤類型、腫瘤亞型及吸菸史。
術語「源自腫瘤之抗原編碼核酸序列」係指例如經由RT-PCR直接自腫瘤提取之核酸序列；或藉由腫瘤定序獲得之序列資料，且隨後使用定序資料例如經由此項技術中已知的各種合成或基於PCR之方法合成核酸序列。
術語「α病毒」係指披膜病毒科(Togaviridae)之成員，且為正義單股RNA病毒。α病毒通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯(Sindbis)、羅斯河(Ross River)、馬雅羅(Mayaro)、基孔肯雅(Chikungunya)及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)，或新世界，諸如東部馬腦炎(eastern equine encephalitis)、奧拉(Aura)、摩根堡(Fort Morgan)、或委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)及其衍生病毒株TC-83。α病毒通常為自我複製RNA病毒。
術語「α病毒主鏈」係指允許病毒基因組自我複製之α病毒的最小序列。最小序列可包括用於非結構蛋白質介導之擴增的保守序列、非結構蛋白質1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因、nsP4基因及polyA序列，以及用於亞基因組病毒RNA表現之序列，包括26S啟動子元件。
術語「用於非結構蛋白質介導之擴增的序列」包括熟習此項技術者熟知的α病毒保守序列元件(CSE)。CSE包括(但不限於) α病毒5' UTR、51-nt CSE、24-nt CSE或其他26S亞基因組啟動子序列、19-nt CSE及α病毒3' UTR。
術語「RNA聚合酶」包括催化由DNA模板產生RNA聚核苷酸之聚合酶。RNA聚合酶包括(但不限於)源自噬菌體之聚合酶，包括T3、T7及SP6。
術語「脂質」包括疏水性及/或兩親媒性分子。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。脂質可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯、脂肪及脂溶性維生素。脂質亦可包括二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」包括使用含脂質膜圍繞水性內部形成之小泡樣結構，亦稱為脂質體。脂質奈米粒子包括具有藉由界面活性劑穩定之固體脂質核心的基於脂質之組合物。核心脂質可為脂肪酸、醯基甘油、蠟及此等界面活性劑之混合物。生物膜脂質，諸如磷脂、鞘磷脂、膽汁鹽(牛磺膽酸鈉)及固醇(膽固醇)，可用作穩定劑。脂質奈米粒子可使用限定比率之不同脂質分子形成，包括(但不限於)限定比率之一或多種陽離子脂質、陰離子脂質或中性脂質。脂質奈米粒子可將分子囊封在外膜殼內，且隨後可與靶細胞接觸以將囊封之分子遞送至調節因子宿主細胞細胞溶質。脂質奈米粒子可用非脂質分子修飾或官能化，包括在其表面上。脂質奈米粒子可為單層或多層。脂質奈米粒子可與核酸複合。單層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部。多層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部，或形成或包夾在之間。
縮寫：MHC：主要組織相容複合體；HLA：人類白細胞抗原或人類MHC基因座；NGS：下一代定序；PPV：陽性預測值；TSNA：腫瘤特異性新抗原；FFPE：福馬林固定、石蠟包埋；NMD：無義介導之衰變；NSCLC：非小細胞肺癌；DC：樹突狀細胞。
應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。
除非上下文特別陳述或以其他方式顯而易見，否則如本文中所使用，術語「約」應理解為在此項技術中之正常容限之範圍內，例如在平均值之2個標準差內。約可理解為在陳述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非上下文另有明確說明，否則本文所提供之所有數值均藉由術語約修飾。
本文中未直接定義之任何術語應理解為具有與本發明之技術領域中所理解通常相關的含義。本文論述某些術語，以向從業者描述本發明之態樣的組合物、裝置、方法及其類似物以及如何製造或使用其提供額外的指導。應瞭解，相同事物可以多於一種方式來表達。因此，可替代的措辭及同義詞可用於本文所論述之術語中之任何一或多者。重要性將不在於術語是否在本文中詳述或論述。提供一些同義詞或可取代方法、材料及其類似物。除非明確陳述，否則對一個或數個同義詞或等效物的敍述不排除使用其他同義詞或等效物。包括術語實例在內之實例的使用僅用於說明性目的，且不在本文中限制本發明之態樣的範疇及含義。
出於所有目的，在本說明書正文內引用之所有參考文獻、頒佈專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。II . 鑑別抗原之方法
用於鑑別共有抗原(例如新抗原)之方法包括鑑別可能呈現在腫瘤或免疫細胞(包括專職抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞)之細胞表面上之來自個體之腫瘤，及/或可能為免疫原性的抗原。作為一實例，一個此類方法可包含以下步驟：自個體之腫瘤細胞獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序及/或表現資料，其中該腫瘤核苷酸定序及/或表現資料用於獲得表示抗原集合中之每一者之肽序列的資料(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之共有抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之腫瘤細胞或腫瘤中存在之細胞之腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合。
呈現模型可包含在參考資料集合(亦稱為訓練資料集)上訓練的統計回歸或機器學習(例如深度學習)模型，該參考資料集合包含相應標記集合，其中該參考資料集合獲自複數個不同個體中之每一者，其中視情況一些個體可具有腫瘤，且其中該參考資料集合包含以下中之至少一者：代表來自腫瘤組織之外顯子組核苷酸序列的資料、代表來自正常組織之外顯子組核苷酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之轉錄組核苷酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之蛋白質組序列的資料、代表來自腫瘤組織之MHC肽組序列的資料以及代表來自正常組織之MHC肽組序列的資料。參考資料可另外包含經工程改造以表現隨後暴露於合成蛋白質之預定MHC對偶基因的單對偶基因細胞株、正常及腫瘤人類細胞株、以及新鮮及冷凍原始樣品的質譜資料、定序資料、RNA定序資料、表現譜資料及蛋白質組學資料，及T細胞分析(例如ELISPOT)。在某些態樣中，該參考資料集合包括每種形式之參考資料。
呈現模型可包含至少部分自該參考資料集合導出的特徵集合，且其中該特徵集合包含對偶基因依賴性特徵及對偶基因非依賴性特徵中之至少一者。在某些態樣中，包括每一特徵。
用於鑑別共有抗原之方法亦包括藉由鑑別來自個體之一或多種腫瘤細胞之可能呈現在腫瘤細胞之表面上的一或多種抗原產生用於構建個人化癌症疫苗之輸出。作為一實例，一個此類方法可包含以下步驟：自個體之腫瘤細胞及正常細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序及/或表現資料中之至少一者，其中該核苷酸定序及/或表現資料用於獲得代表藉由比較來自腫瘤細胞之核苷酸定序及/或表現資料與來自正常細胞之核苷酸定序及/或表現資料鑑別之抗原集合中之每一者的肽序列(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之共有抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)，自個體之正常細胞鑑別之肽序列之資料；將抗原中之每一者之肽序列編碼於相應數值載體中，各數值載體包括關於構成肽序列之複數種胺基酸以及肽序列中胺基酸之位置集合之資訊；使用電腦處理器將數值載體輸入深度學習呈現模型以產生抗原集合之呈現可能性的集合，集合中之各呈現可能性代表相應抗原由一或多個II類MHC對偶基因呈現於個體之腫瘤細胞之表面上的可能性，深度學習呈現模型；基於呈現可能性之集合選擇抗原之集合的子集以產生選擇抗原之集合；以及基於所選擇抗原之集合產生用於構建個人化癌症疫苗之輸出。
用於鑑別抗原(包括新抗原)之具體方法為熟習此項技術者已知，例如國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中更詳細描述之方法，該等公開案出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。
本文中揭示一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含進行本文所述之抗原鑑別方法中之任一者的步驟，且進一步包含獲得包含選擇抗原集合之腫瘤疫苗，及向該個體投與腫瘤疫苗。
本文揭示之方法亦可包括鑑別對子集中之抗原中之至少一者具有抗原特異性的一或多種T細胞。在一些實施例中，鑑別包含在擴增一或多種抗原特異性T細胞之條件下使一或多種T細胞與子集中之一或多種抗原共同培養。在其他實施例中，鑑別包含使一或多種T細胞與包含子集中之一或多種抗原之四聚體在允許T細胞與四聚體之間結合的條件下接觸。在甚至其他實施例中，本文所揭示之方法亦可包括鑑別一或多種經鑑別T細胞之一或多種T細胞受體(TCR)。在某些實施例中，鑑別一或多種T細胞受體包含定序一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列。本文所揭示之方法可進一步包含基因工程改造複數種T細胞以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者；在擴增該複數種T細胞之條件下培養該複數種T細胞；以及將擴增T細胞輸注於個體中。在一些實施例中，基因工程改造複數種T細胞以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者包含將一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列選殖於表現載體中；以及用表現載體轉染該複數種T細胞中之每一者。在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在擴增一或多種經鑑別T細胞之條件下培養一或多種經鑑別T細胞；以及將擴增T細胞輸注於個體中。
本文亦揭示一種經分離T細胞，其對子集中之至少一種選擇抗原具有抗原特異性。
本文亦揭示一種用於製造腫瘤疫苗之方法，其包含以下步驟：自個體之腫瘤細胞獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序及/或表現資料，其中該腫瘤核苷酸定序及/或表現資料用於獲得表示抗原集合中之每一者之肽序列的資料(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之共有抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合；以及製備或已製備包含選擇抗原之集合的腫瘤疫苗。
本文亦揭示一種腫瘤疫苗，其包括藉由進行包含以下步驟之方法選擇之經選擇抗原的集合：自個體之腫瘤細胞獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序及/或表現資料，其中該腫瘤核苷酸定序及/或表現資料用於獲得表示抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各抗原之肽序列(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之共有抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合；以及製備或已製備包含選擇抗原之集合的腫瘤疫苗。
腫瘤疫苗可包括核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。
腫瘤疫苗可包括在腫瘤細胞表面上呈現之一或多個抗原。
腫瘤疫苗可包括在個體中具有免疫原性之一或多個抗原。
腫瘤疫苗可不包含在個體中誘發針對正常組織之自體免疫反應的一或多個抗原。
腫瘤疫苗可包括佐劑。
腫瘤疫苗可包括賦形劑。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的抗原。
本文揭示之方法亦可包括選擇基於呈現模型相對於未選擇之抗原，能夠誘發個體中之腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的抗原。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現給初始T細胞之可能性增加的抗原，視情況其中該APC係樹突狀細胞(DC)。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型，選擇相對於未選擇之抗原經由中心或周邊耐受性受抑制之可能性降低的抗原。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發對個體中之正常組織之自身免疫反應的可能性降低之抗原。
外顯子組或轉錄組核苷酸定序及/或表現資料可藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。
定序可為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
數值可能性集合可藉由至少MHC-對偶基因相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：經預測之MHC對偶基因與抗原編碼肽結合之親和力；經預測之抗原編碼肽-MHC複合物之穩定性；抗原編碼肽之序列及長度；如藉由質譜蛋白質組學或其他手段所評定，在來自表現特定MHC對偶基因之其他個體的細胞中呈現具有類似序列之抗原編碼肽的機率；所討論之個體中特定MHC對偶基因之表現量(例如，如藉由RNA-Seq或質譜法所量測)；在表現特定MHC對偶基因之其他不同個體中由特定MHC對偶基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率；在其他不同個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC對偶基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。
數值可能性集合進一步藉由至少MHC對偶基因非相互作用特徵來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：側接其源蛋白質序列內之新抗原編碼肽的C端及N端序列；在新抗原編碼肽中存在蛋白酶裂解基元，視情況根據腫瘤細胞中相應蛋白酶之表現權衡(如藉由RNA-seq或質譜分析所量測)；如在合適細胞類型中量測之源蛋白質之周轉率；源蛋白質之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中表現最高之特異性剪接變異體(「同種型」)，如藉由RNA-seq或蛋白質組質譜分析所量測，或如根據在DNA或RNA序列資料中偵測之生殖系或體細胞剪接突變之註解預測；蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜分析或免疫組織化學量測)；新抗原編碼肽之源基因之表現(例如如藉由RNA-seq或質譜分析所量測)；在細胞週期之各階段期間新抗原編碼肽之源基因之典型的組織特異性表現；源蛋白質及/或其結構域之特徵之綜合目錄，如在例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中可見；描述含有肽之源蛋白質之結構域特性的特徵，例如：第二或第三結構(例如α螺旋相對於β摺疊)；選擇性剪接；在其他不同個體中自相關新抗原編碼肽之源蛋白質呈現肽之機率；由於技術偏差質譜分析將不會偵測或過度表示肽之機率；各種基因模組/路徑之表現，其提供關於腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之狀態的資訊，如藉由RNASeq所量測(其不必含有肽之源蛋白質)；腫瘤細胞中新抗原編碼肽之源基因之複本數；肽與TAP結合之機率或所量測或所預測之肽對TAP之結合親和力；腫瘤細胞中TAP之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜分析、免疫組織化學量測)；存在或不存在腫瘤突變，包括但不限於：已知癌症驅動基因(諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3)，及編碼參與抗原呈現機制之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中之驅動突變。呈現依賴於腫瘤中經受功能喪失性突變之抗原呈現機制之組分的肽具有降低的呈遞機率；存在或不存在功能性生殖系多形現象，包括(但不限於)：在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中；腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤)；臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌與非鱗狀)；吸菸史；該肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動子突變分層。
至少一個改變可為讀框轉移或非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。
腫瘤細胞可選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病，及T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
本文所揭示之方法亦可包括獲得包含所選擇之新抗原集合或其子集的腫瘤疫苗，視情況另外包含向個體投與該腫瘤疫苗。
經選擇新抗原之集合中之新抗原中的至少一者在呈多肽形式時可包括以下中之至少一者：IC50值小於1000 nM之與MHC的結合親和力，對於MHC I類多肽，長度為8-15個，8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸，對於MHC II類多肽，長度為6-30個，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸，在親本蛋白質序列中之多肽內或多肽附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP傳輸之序列基元。對於MHC II類，存在位於肽內或肽附近促進藉由胞外或溶酶體蛋白酶(例如組織蛋白酶)裂解或HLA-DM催化之HLA結合之序列基元。
本文揭示用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原的方法，其包含執行以下步驟：接收包含與自源自複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料；藉由至少鑑別腫瘤樣品中存在且呈現在與各訓練肽序列相關之一或多個MHC對偶基因上的訓練肽序列集合來獲得訓練資料集；基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集合；及使用訓練蛋白質序列及訓練肽序列訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC對偶基因呈現之複數個數值可能性。
呈現模型可表示以下兩者之間的依賴性：MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與在腫瘤細胞表面上由該對MHC對偶基因中之一特定對偶基因呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘發腫瘤特異性免疫反應之可能性增加而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘發針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於APC各自將在腫瘤細胞中經差異性轉譯後修飾之可能性降低而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
除非另外指明，否則本文方法之實踐將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。此類技術在文獻中已充分解釋。參見例如T.E. Creighton,Proteins : Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.，現行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning : A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第 3 版 . (Plenum Press)第A卷及第B卷(1992)。III . 鑑別新抗原中之腫瘤特異性突變
本文亦揭示用於鑑別某些突變(例如癌細胞中存在之變異體或對偶基因)之方法。具體而言，此等突變可存在於患有癌症之個體之癌細胞的基因組、轉錄組、蛋白質組或外顯子組中，而非個體之正常組織中。用於鑑別對腫瘤具有特異性之新抗原(包括共有新抗原)之具體方法為熟習此項技術者已知，例如國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中更詳細地描述之方法，該等公開案出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。
若腫瘤中之基因突變引起腫瘤中特有之蛋白質的胺基酸序列變化，則認為其可用於免疫靶向腫瘤。有用的突變包括：(1)非同義突變，導致蛋白質中之胺基酸不同；(2)通讀突變，其中終止密碼子經修飾或缺失，導致轉譯在C端具有新穎腫瘤特異性序列之較長蛋白質；(3)剪接位點突變，導致在成熟mRNA中包含內含子且因此導致特有的腫瘤特異性蛋白質序列；(4)染色體重排，在2種蛋白質之接合處產生具有腫瘤特異性序列之嵌合蛋白質(亦即基因融合)；(5)框移突變或缺失，導致具有新穎腫瘤特異性蛋白質序列之新的開放閱讀框架。突變亦可包括非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變中之一或多者。
由例如腫瘤細胞中之剪接位點、讀框轉移、通讀或基因融合突變產生之具有突變之肽或突變多肽可藉由對腫瘤與正常細胞中之DNA、RNA或蛋白質進行定序來鑑別。
突變亦可包括先前鑑別之腫瘤特異性突變。已知腫瘤突變可見於癌症體細胞突變目錄(COSMIC)資料庫。
多種方法可用於偵測個體之DNA或RNA中特定突變或對偶基因的存在。本領域中之進步已提供精確、容易且便宜的大規模SNP基因分型。舉例而言，已描述數種技術，包括動態對偶基因特異性雜交(DASH)、微量盤陣列對角線凝膠電泳(MADGE)、焦磷酸定序、寡核苷酸特異性連接、TaqMan系統以及各種DNA「晶片」技術，諸如Affymetrix SNP晶片。此等方法利用通常藉由PCR擴增靶基因區。仍有其他方法，基於藉由侵入性裂解產生小信號分子，隨後進行質譜法或固定化掛鎖探針及滾環擴增。下文彙總此項技術中已知用於偵測特異性突變之數種方法。
基於PCR之偵測手段可包括同時多重擴增複數個標記。舉例而言，選擇PCR引子以產生大小不重疊且可同時分析之PCR產物為此項技術中所熟知的。可替代地，可用經差異性標記且因此可各自經差異性偵測之引子擴增不同的標記。當然，基於雜交之偵測手段允許樣品中多個PCR產物之差異偵測。此項技術中已其他技術以允許複數個標記之多重分析。
已開發數種方法以便於基因組DNA或細胞RNA中單核苷酸多形現象之分析。舉例而言，單鹼基多形現象可藉由使用特殊化核酸外切酶抗性核苷酸來偵測，如例如Mundy, C. R. (美國專利第4,656,127號)中所揭示。根據該方法，允許與緊靠著多形位點3'之對偶基因序列互補的引子與獲自特定動物或人類之靶分子雜交。若靶分子上之多形位點含有與所存在之特定核酸外切酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，則該衍生物將併入於雜交引子之末端上。此類併入使得引子對核酸外切酶具有抗性，從而允許其偵測。由於樣品之核酸外切酶抗性衍生物的身分為已知的，故引子已對核酸外切酶具有抗性之發現揭露靶分子之多形位點中存在之核苷酸與反應中所用之核苷酸衍生物互補。此方法之優勢在於其不需要判定大量無關序列資料。
可使用基於溶液之方法確定多形位點之核苷酸的身分。Cohen, D.等人 (法國專利2,650,840；PCT申請第WO91/02087號)。如在美國專利第4,656,127號之Mundy方法中，採用與緊靠著多形位點3'之對偶基因序列互補的引子。該方法使用經標記之雙去氧核苷酸衍生物確定該位點之核苷酸的身分，若該核苷酸與多形位點之核苷酸互補，則將併入於引子之末端上。
稱為遺傳位元分析或GBA之替代方法由Goelet, P.等人(PCT申請案第92/15712號)描述。Goelet, P.等人之方法使用經標記之終止子及與多形位點3'序列互補之引子的混合物。所併入的經標記之終止子因此藉由所評估之靶分子之多形位點中存在的核苷酸確定且與其互補。與Cohen等人(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)之方法相比，Goelet, P.等人之方法可為非均相分析，其中引子或靶分子固定於固相。
已描述數種用於分析DNA中多形位點之引子引導的核苷酸併入程序(Komher, J. S.等人, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)；Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)；Syvanen, A.-C.等人, Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppuswamy, M. N.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)；Prezant, T. R.等人, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)；Ugozzoli, L.等人, GATA 9:107-112 (1992)；Nyren, P.等人, Anal. Biochem. 208:171-175 (1993))。此等方法與GBA的不同之處在於其利用併入經標記之去氧核苷酸來區分多形位點處的鹼基。在此類格式中，由於信號與併入之去氧核苷酸之數目成比例，故在同一核苷酸之操作中發生的多形現象可產生與操作之長度成比例的信號(Syvanen, A.-C.等人, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993))。
許多方案直接自數百萬個單獨的DNA或RNA分子中並行獲取序列資訊。即時單分子合成定序技術依賴於螢光核苷酸之偵測，因為其併入至與正定序之模板互補的DNA的新生股中。在一種方法中，將長度為30-50個鹼基之寡核苷酸在5'端共價錨定於玻璃蓋玻片上。此等錨定股執行兩種功能。首先，若模板經組態具有與表面結合之寡核苷酸互補的捕捉尾部，則其充當靶模板股之捕捉位點。其亦充當模板引導之引子延伸的引子，形成序列閱讀的基礎。捕捉引子充當固定位點以便使用多個合成、偵測及化學裂解染料連接子以移除染料之循環進行序列測定。各循環由添加聚合酶/經標記之核苷酸混合物、沖洗、成像及染料之裂解組成。在一替代方法中，聚合酶經螢光供體分子修飾且固定在載玻片上，而各核苷酸用連接至γ-磷酸之受體螢光部分進行顏色編碼。系統偵測經螢光標記之聚合酶與經螢光修飾之核苷酸之間的相互作用，因為核苷酸併入至從頭鏈中。亦存在其他合成定序技術。
可使用任何適合之合成定序平台鑑別突變。如上所述，目前可用四種主要合成定序平台：來自Roche/454 Life Sciences之基因組定序儀、來自Illumina/Solexa之1G分析儀、來自Applied BioSystems之SOLiD系統及來自Helicos Biosciences之Heliscope系統。合成定序平台亦已由Pacific BioSciences及VisiGen Biotechnologies描述。在一些實施例中，將所定序之複數個核酸分子結合於支撐物(例如固體支撐物)。為將核酸固定於支撐物上，可在模板之3'及/或5'端添加捕捉序列/通用引發位點。核酸可藉由將捕捉序列與共價連接於支撐物之互補序列雜交而結合於支撐物。捕捉序列(亦稱為通用捕捉序列)為與連接至支撐物之序列互補的核酸序列，其可雙重充當通用引子。
作為捕捉序列之替代方案，偶合對(諸如抗體/抗原、受體/配體或如例如美國專利申請案第2006/0252077號中所述之抗生物素蛋白-生物素對)之一成員可連接於各片段，以捕捉在用該偶合對之相應第二成員塗佈的表面上。
在捕捉後，可例如藉由單分子偵測/定序來分析序列，例如，如實例及美國專利第7,283,337號中所述，包括模板依賴性合成定序。在合成定序中，表面結合之分子在聚合酶存在下暴露於複數個經標記之核苷酸三磷酸。模板之序列藉由併入至生長鏈之3'端的經標記之核苷酸的順序來確定。此可即時進行或可以分步重複模式進行。對於即時分析，可將不同的光學標記併入各核苷酸且可利用多個雷射刺激併入的核苷酸。
定序亦可包括其他大規模平行定序或下一代定序(NGS)技術及平台。大規模平行定序技術及平台之額外實例為Illumina HiSeq或MiSeq、Thermo PGM或Proton、Pac Bio RS II或Sequel、Qiagen之Gene Reader及Oxford Nanopore MinION。可使用其他類似的當前大規模平行定序技術，以及此等技術之後代。
可利用任何細胞類型或組織來獲得用於本文所述之方法的核酸樣品。舉例而言，DNA或RNA樣品可獲自腫瘤或體液，例如藉由已知技術(例如靜脈穿刺)獲得之血液或唾液。可替代地，可對乾燥樣品(例如頭髮或皮膚)執行核酸測試。另外，可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織具有與腫瘤相同的組織類型。可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織相對於腫瘤具有不同的組織類型。
腫瘤可包括肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病，及T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌中之一或多者。
可替代地，可使用蛋白質質譜法鑑別或驗證與腫瘤細胞上之MHC蛋白質結合之突變肽的存在。肽可自腫瘤細胞或自腫瘤免疫沈澱之HLA分子酸溶離，且隨後使用質譜法鑑別。IV . 抗原
抗原可包括核苷酸或多肽。舉例而言，抗原可為編碼多肽序列之RNA序列。可用於疫苗中之抗原可因此包括核苷酸序列或多肽序列。共有新抗原展示於表A (參見SEQ ID NO:10,755-21,015)中及AACR GENIE結果(參見SEQ ID NO: 21,016-29,357)中。共有抗原展示於表1.2 (參見SEQ ID NO:57-10,754)中。
本文揭示包含藉由本文所揭示之方法鑑別的腫瘤特異性突變的經分離之肽、包含已知腫瘤特異性突變之肽及藉由本文所揭示之方法鑑別的突變多肽或其片段。新抗原肽可描述於其編碼序列之上下文中，其中新抗原包括編碼相關多肽序列之核苷酸序列(例如DNA或RNA)。
本文亦揭示肽，其源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的任何多肽，例如已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中過度表現之任何多肽。可例如在COSMIC資料庫中發現可獲得抗原肽之適合之多肽。COSMIC策劃關於人類癌症體細胞突變之綜合資訊。該肽含有腫瘤特異性突變。
由抗原核苷酸序列編碼之一或多種多肽可包含以下中之至少一者：IC50值小於1000 nM之與MHC的結合親和力，對於MHC I類多肽，長度為8-15個，8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸，在肽內或肽附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP傳輸之序列基元。對於長度為6-30 (6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個胺基酸之MHC II類肽，在肽內或附近存在促進藉由胞外或溶酶體蛋白酶(例如組織蛋白酶)裂解或HLA-DM催化的HLA結合的序列基元。
一或多個抗原可呈現在腫瘤之表面上。
一或多個抗原在患有腫瘤之個體中可具有免疫原性，例如能夠誘發個體中之T細胞反應或B細胞反應。
在疫苗生產背景下，對於具有腫瘤之個體，可不考慮在個體中誘發自體免疫反應之一或多個抗原。
至少一個抗原肽分子之大小可包含但不限於約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120或更多個胺基分子殘基，及可源自其中的任何範圍。在具體實施例中，抗原肽分子等於或小於50個胺基酸。
抗原肽及多肽可為：對於MHC I類，15個殘基或更少的長度且通常由約8個與約11個之間的殘基，尤其9或10個殘基組成；對於MHC II類，6-30個殘基，包括端值。
若需要，可以數種方式設計較長的肽。在一種情況下，當HLA對偶基因上肽之呈現可能性經預測或已知時，較長的肽可由以下任一者組成：(1)個別呈現之具有朝向各相應基因產物之N端及C端延伸2-5個胺基酸的肽；(2)所呈現之肽中之一些或全部與各自之延伸序列的串接。在另一種情況下，當定序揭露腫瘤中所存在之長(＞10個殘基)新抗原決定基序列(例如歸因於產生新穎肽序列之讀框轉移、通讀或內含子包含)時，較長的肽將由以下組成：(3)新穎腫瘤特異性胺基酸之整個延伸段，因此繞過對基於計算或活體外測試選擇最強HLA呈現之較短肽的需要。在兩種情況下，使用較長的肽允許患者細胞進行內源性加工，且可引起更有效的抗原呈現及誘發T細胞反應。
抗原肽及多肽可呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，抗原肽及多肽以比野生型肽更大的親和力呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，抗原肽或多肽之IC50可至少小於5000 nM、至少小於1000 nM、至少小於500 nM、至少小於250 nM、至少小於200 nM、至少小於150 nM、至少小於100 nM、至少小於50 nM或更小。
在一些態樣中，抗原肽及多肽在投與個體時不誘發自體免疫反應及/或引起免疫耐受性。
亦提供包含至少兩個或大於兩個抗原肽之組合物。在一些實施例中，組合物含有至少兩個不同的肽。至少兩個不同的肽可源自相同的多肽。不同的多肽意指肽根據長度、胺基酸序列或兩者而變化。肽源自已知或已發現含有腫瘤特異性突變之任何多肽，或肽源自與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的任何多肽，例如已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中過度表現之任何多肽。可例如在COSMIC資料庫或AACR基因組學證據瘤形成資訊交換(GENIE)資料庫中發現可獲得抗原肽之適合之多肽。COSMIC策劃關於人類癌症體細胞突變之綜合資訊。AACR GENIE彙總及將臨床級癌症基因組資料與來自數萬癌症患者之臨床結果聯繫起來。該肽含有腫瘤特異性突變。在一些態樣中，腫瘤特異性突變為特定癌症類型之驅動突變。
具有所需活性或特性之抗原肽及多肽可經修飾以提供某些所需屬性，例如改善之藥理學特徵，同時增加或至少保留實質上所有未經修飾之肽與所需MHC分子結合及活化合適T細胞之生物活性。舉例而言，抗原肽及多肽可進行各種變化，諸如保守或非保守取代，其中此類變化可在其使用中提供某些優勢，諸如改良之MHC結合、穩定性或呈現。保守取代意謂用生物及/或化學類似的另一胺基酸殘基(例如一個疏水性殘基置換另一個胺基酸殘基或一個極性殘基置換另一胺基酸殘基)置換胺基酸殘基。取代包括以下組合，諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。單胺基酸取代之效應亦可使用D-胺基酸探測。此類修飾可使用熟知的肽合成程序進行，如Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany及Merrifield, The Peptides, Gross及Meienhofer, 編 (N.Y., Academic Press), 第1-284頁 (1979)；及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 第2版 (1984)中所述。
肽及多肽用各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸修飾可在提高肽及多肽之活體內穩定性方面特別有用。穩定性可以多種方式加以分析。舉例而言，肽酶及各種生物介質(諸如人類血漿及血清)已用於測試穩定性。參見例如Verhoef等人, Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986)。肽之半衰期可使用25%人類血清(v/v)分析方便地確定。方案一般如下。彙集之人類血清(AB型，非加熱不活化)在使用之前藉由離心去脂。血清隨後用RPMI組織培養基稀釋至25%且用於測試肽穩定性。在預定時間間隔下，移出少量反應溶液且添加至6%三氯乙酸或乙醇水溶液中。將混濁的反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘，且隨後旋轉集結沈澱的血清蛋白質。隨後使用穩定性特異性層析條件藉由逆相HPLC來判定肽之存在。
肽及多肽可經修飾以提供除改良之血清半衰期以外的所需屬性。舉例而言，肽誘發CTL活性之能力可藉由與含有至少一個能夠誘發T輔助細胞反應之抗原決定基的序列連接來增強。免疫原性肽/T輔助細胞結合物可藉由間隔分子連接。間隔子通常由相對較小的中性分子(諸如胺基酸或胺基酸模擬物)構成，其在生理條件下實質上不帶電。間隔子通常選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔子。應理解，視情況存在之間隔子無需由相同殘基組成，且因此可為雜寡聚物或均寡聚物。當存在時，間隔子將通常為至少一個或兩個殘基，更通常三至六個殘基。可替代地，肽可在無間隔子之情況下連接於T輔助肽。
抗原肽可直接或經由在肽之胺基或羧基端處的間隔子連接於T輔助肽。抗原肽或T輔助肽之胺基端可經醯化。例示性T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流感307-319、瘧疾環子孢子382-398及378-389。
蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製造，包括經由標準分子生物學技術表現蛋白質、多肽或肽；自天然來源分離蛋白質或肽；或化學合成蛋白質或肽。先前已揭示對應於各種基因之核苷酸及蛋白質、多肽及肽序列，且可見於一般熟習此項技術者已知的電腦化資料庫中。一個此類資料庫為位於美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)網站之國家生物技術資訊中心的Genbank及GenPept資料庫。已知基因之編碼區可使用本文所揭示或一般熟習此項技術者應知曉之技術擴增及/或表現。可替代地，蛋白質、多肽及肽之各種市售製劑已為熟習此項技術者所知。
在另一態樣中，抗原包括編碼抗原肽或其部分之核酸(例如多核苷酸)。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA (例如mRNA)、單股及/或雙股、或天然或穩定形式之聚核苷酸，諸如具有硫代磷酸主鏈之聚核苷酸，或其組合，且其可含有或可不含內含子。另一態樣提供一種能夠表現多肽或其部分之表現載體。不同細胞類型的表現載體在此項技術中已熟知且無需過度實驗便可選擇。一般而言，DNA以適當定向插入至表現載體(諸如質體)中且以正確閱讀框架進行表現。若需要，DNA可連接於由所需宿主識別之適當轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，而此類控制件一般可用於表現載體中。載體隨後經由標準技術引入至宿主中。指導可見於例如Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.中。V . 疫苗組合物
本文亦揭示一種能夠引起特異性免疫反應(例如腫瘤特異性免疫反應)之免疫原性組合物，例如疫苗組合物。疫苗組合物通常包含一個或多個抗原，例如使用本文所描述或如表A、表1.2或AACR GENIE結果中所闡述之之方法選擇。疫苗組合物亦可稱為疫苗。
疫苗可含有1至30個肽；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個不同的肽；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽；或12、13或14個不同的肽。肽可包括轉譯後修飾。疫苗可含有1至100或更多個核苷酸序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的核苷酸序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的核苷酸序列；或12、13或14個不同的核苷酸序列。疫苗可含有1至30個抗原序列，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94,95、96、97、98、99、100或更多個不同抗原序列，6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同抗原序列，或12、13或14個不同抗原序列。
在一個實施例中，選擇不同肽及/或多肽或編碼其之核苷酸序列，使得肽及/或多肽能夠與不同MHC分子(諸如不同MHC I類分子及/或不同MHC II類分子)結合。在一些態樣中，一種疫苗組合物包含能夠與最常出現之MHC I類分子及/或不同MHCII類分子締合之肽及/或多肽的編碼序列。因此，疫苗組合物可包含能夠與至少2個較佳的，至少3個較佳的或至少4個較佳的MHC I類分子及/或不同MHC II類分子結合的不同片段。
疫苗組合物能夠引起特異性細胞毒性T細胞反應及/或特異性輔助T細胞反應。
疫苗組合物可另外包含佐劑及/或載劑。有用的佐劑及載劑之實例在下文中給出。組合物可與載劑締合，諸如蛋白質或抗原呈現細胞，諸如能夠將肽呈現於T細胞之樹突狀細胞(DC)。
佐劑為混合至疫苗組合物中增加或以其他方式修飾對抗原之免疫反應的任何物質。載劑可為骨架結構，例如能夠與抗原締合之多肽或多糖。視情況，佐劑為共價或非共價結合的。
佐劑提高對抗原之免疫反應的能力通常顯現為免疫介導性反應之顯著或實質性增加或疾病症狀之減少。舉例而言，體液免疫的增強典型地顯現為針對抗原所產生之抗體力價的顯著增大，且T細胞活性的增強典型地顯現為細胞增殖或細胞性細胞毒性或細胞激素分泌的增強。佐劑亦可改變免疫反應，例如藉由將主要體液或Th反應變為主要細胞或Th反應。
適合之佐劑包括(但不限於) 1018 ISS、礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel載體系統、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF捕獲劑、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila之源自皂素之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)、分支桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物，及其他專用佐劑，諸如Ribi之Detox. Quil或Superfos。諸如弗氏(Freund's)不完全或GM-CSF之佐劑為有用的。先前已描述對樹突狀細胞具有特異性之數種免疫佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。亦可使用細胞介素。數種細胞介素已直接關聯於：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加速樹突狀細胞成熟變為T-淋巴球之有效抗原呈遞細胞(例如GM-CSF、IL-1及IL-4) (美國專利第5,849,589號，其以全文引用的方式特別併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I,等人, J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。
亦已報導CpG免疫刺激性寡核苷酸增強佐劑在疫苗環境中之效應。亦可使用其他TLR結合分子，諸如結合RNA之TLR 7、TLR 8及/或TLR 9。
有用佐劑之其他實例包括(但不限於)經化學修飾之CpG (例如CpR、Idera)、聚(I:C) (例如聚i:CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗體，諸如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕佐泮尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)及SC58175，其可起治療作用及/或充當佐劑。佐劑及添加劑之量及濃度可容易由熟習此項技術者確定而無需過度實驗。額外佐劑包括群落刺激因子，諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
疫苗組合物可包含多於一種不同的佐劑。此外，治療性組合物可包含任何佐劑物質，包括以上各者中之任一者或其組合。亦預期，疫苗及佐劑可一起或以任何適當的順序分開投與。
載劑(或賦形劑)可獨立於佐劑存在。載劑之功能可例如為增加特定突變體之分子量以提高活性或免疫原性、賦予穩定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，載劑可輔助呈現肽至T細胞。載劑可為熟習此項技術者已知的任何適合之載劑，例如蛋白質或抗原呈現細胞。載劑蛋白質可為(但不限於)匙孔螺血氰蛋白、血清蛋白質(諸如轉鐵蛋白)、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，諸如胰島素或棕櫚酸。為用於人類免疫接種，載劑一般為生理學上可接受之載劑，其為人類可接受的且為安全的。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素為適合之載劑。或者，載劑可為葡聚糖，例如瓊脂糖。
細胞毒性T細胞(CTL)識別與MHC分子結合之肽形式的抗原，而非完整外來抗原本身。MHC分子自身位於抗原呈遞細胞之細胞表面上。因此，若存在肽抗原、MHC分子及APC之三聚體複合物，則可能活化CTL。相應地，若不僅使用肽活化CTL，而且另外添加具有相應MHC分子的APC，則其可增強免疫反應。因此，在一些實施例中，疫苗組合物另外含有至少一種抗原呈遞細胞。
抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其設計成靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev . (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J . (2012) 443(3):603-18, Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl . Acids Res . (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J . Virol . (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個新抗原肽之一或多個核苷酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med . (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science . (2016) 352 (6291):1337-41, Lu等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res . (2014) 20( 13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞表現抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。適用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為BCG (Bacille Calmette Guerin)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，適用於抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。V . A . 抗原卡匣
用於選擇一或多個抗原，選殖及構造「卡匣」及其插入於病毒載體中之方法屬於本文所提供之教示內容給出之此項技術中的技能內。「抗原卡匣」意指所選擇之抗原或複數個抗原與轉錄抗原且表現轉錄產物所必需之其他調控元件之組合。抗原或複數個抗原可以允許轉錄之方式可操作地連接於調控組件。該等組件包括可驅動用病毒載體轉染之細胞中之抗原表現的習知調控元件。因此，抗原卡匣亦可含有所選擇之啟動子，其連接於抗原且用其他視情況選用之調控元件定位在重組載體之經選擇病毒序列內。卡匣可包括示於表A及/或AACR GENIE結果中之一或多個新抗原，及/或示於表1.2中之一或多個抗原。
有用的啟動子可為組成型啟動子或經調控(誘發型)啟動子，其將能夠控制有待表現之抗原的量。舉例而言，合乎需要的啟動子為細胞巨大病毒即刻早期啟動子/強化子之啟動子[參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985)]。另一種合乎需要的啟動子包括勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR啟動子/強化子。另一種啟動子/強化子序列為雞細胞質β-肌動蛋白啟動子[T. A. Kost等人, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]。其他適合或合乎需要的啟動子可由熟習此項技術者選擇。
抗原卡匣亦可包括對病毒載體序列異源之核酸序列，包括提供轉錄物之有效聚腺苷酸化(poly(A)、poly-A或pA)之信號的序列及具有功能性剪接供體及受體位點之內含子。本發明之例示性載體中採用之普通poly-A序列源自乳多泡病毒SV-40。poly-A序列一般可在基於抗原之序列之後及在病毒載體序列之前插入於卡匣中。普通內含子序列亦可源自SV-40，且稱為SV-40 T內含子序列。抗原卡匣亦可含有此類內含子，位於啟動子/強化子序列與抗原之間。此等及其他普通載體元件之選擇為習知的[參見例如Sambrook等人, 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual.」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)及其中列舉之參考文獻]且許多此類序列可自商業及工業來源以及Genbank獲得。
抗原卡匣可具有一或多個抗原。舉例而言，給定卡匣可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個抗原。抗原可彼此直接連接。抗原亦可用連接子彼此連接。抗原可相對於彼此呈任一定向，包括N至C或C至N。
如上陳述，抗原卡匣可定位於病毒載體中之任何經選擇缺失之位點中，諸如E1基因區缺失或E3基因區缺失之位點，以及可選擇之其他位點。
抗原卡匣可使用下式描述以描述各元件之有序序列，自5'至3'： (Pa -(L5b -Nc -L3d )X )Z -(P2h -(G5e -Uf )Y )W -G3g
其中P及P2包含啟動子核苷酸序列，N包含MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，L5包含5'連接子序列，L3包含3'連接子序列，G5包含編碼胺基酸連接子之核酸序列，G3包含編碼胺基酸連接子之至少一個核酸序列中之一者，U包含MHC II類抗原編碼核酸序列，其中對於各X，相應Nc係抗原決定基編碼核酸序列，其中對於各Y，相應Uf係抗原編碼核酸序列。該組合物及有序序列可進一步藉由選擇存在元件之數目來定義，例如其中a=0或1，其中b=0或1，其中c=1，其中d=0或1，其中e=0或1，其中f=1，其中g=0或1，其中h=0或1，X=1至400，Y=0、1、2、3、4或5，Z=1至400，且W=0、1、2、3、4或5。
在一個實例中，存在之元件包括其中a=0，b=1，d=1，e=1，g=1，h=0，X=10，Y=2，Z=1，及W=1，其描述其中無其他啟動子存在(亦即僅存在由RNA α病毒主鏈提供之啟動子核苷酸序列)，存在20個MHC I類抗原決定基，各N存在5'連接子，各N存在3'連接子，存在2個MHC II類抗原決定基，存在連接兩個MHC II類抗原決定基之連接子，存在將兩個MHC II類抗原決定基之5'端連接至最終MHC I類抗原決定基之3'連接子的連接子，且存在將兩個MHC II類抗原決定基之3'端連接至RNA α病毒主鏈的連接子。將抗原卡匣之3'端連接至RNA α病毒主鏈之實例包括直接連接至由RNA α病毒主鏈提供之3' UTR元件，諸如3' 19-nt CSE。將抗原卡匣之5'端連接至RNA α病毒主鏈之實例包括直接連接至26S啟動子序列、α病毒5' UTR、51-nt CSE或24-nt CSE。
其他實例包括：其中a=1，其描述其中存在除RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核苷酸序列以外的啟動子；其中a=1且Z大於1，其中存在多個除RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核苷酸序列以外的啟動子，其各自驅動1個或更多個相異MHC I類抗原決定基編碼核酸序列之表現；其中h=1，其描述其中存在分開的啟動子以驅動MHC II類抗原編碼核酸序列之表現；以及其中g=0，其描述MHC II類抗原編碼核酸序列在存在時直接連接於RNA α病毒主鏈。
其他實例包括其中所存在之各MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子，兩者都不具有，或具有兩者。在其中同一抗原卡匣中存在超過一種MHC I類抗原決定基之實例中，一些MHC I類抗原決定基可具有5'連接子及3'連接子兩者，而其他MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。在其中同一抗原卡匣中存在超過一種MHC I類抗原決定基之其他實例中，一些MHC I類抗原決定基可具有5'連接子或3'連接子，而其他MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。
在其中同一抗原卡匣中存在超過一種MHC II類抗原決定基之實例中，一些MHC II類抗原決定基可具有5'連接子及3'連接子兩者，而其他MHC II類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。在其中同一抗原卡匣中存在超過一種MHC II類抗原決定基之其他實例中，一些MHC II類抗原決定基可具有5'連接子或3'連接子，而其他MHC II類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。
啟動子核苷酸序列P及/或P2可與RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核苷酸序列相同。舉例而言，RNA α病毒主鏈所提供之啟動子序列Pn及P2可各自包含26S次基因組啟動子。啟動子核苷酸序列P及/或P2可不同於RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核苷酸序列，以及可彼此不同。
5'連接子L5可為天然序列或非天然序列。非天然序列包括但不限於AAY、RR及DPP。3'連接子L3亦可為天然序列或非天然序列。另外，L5及L3可兩者均為天然序列，兩者均為非天然序列，或一者可為天然的且另一者可為非天然的。對於各X，胺基酸連接子可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。對於各X，胺基酸連接子亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
胺基酸連接子G5對於各Y可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。對於各Y，胺基酸連接子亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
胺基酸連接子G3可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。G3亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
對於各X，各N可編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。對於各X，各N亦可編碼5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。對於各X，各N亦可編碼至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。V . B . 免疫檢查點
本文所描述之載體，諸如本文所描述之C68載體或本文所描述之α病毒載體可包含編碼至少一個抗原之核酸且相同或個別載體可包含編碼至少一個結合及阻斷免疫檢查點分子之活性的免疫調節因子(例如諸如scFv之抗體)之核酸。載體可包含抗原卡匣及一或多個編碼檢查點抑制劑之核酸分子。
可靶向用於阻斷或抑制之說明性免疫檢查點分子包括(但不限於) CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬於CD2家族之分子且在所有NK、γδ及記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括抗體或其抗原結合片段、或其他結合蛋白，其結合且阻斷或抑制以下中之一或多者之活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括曲美單抗(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹單抗、MK-3475 (PD-1阻斷劑)、納武單抗(Nivolumamb) (抗PD1抗體)、CT-011 (抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224 (抗PDL1抗體)、BMS-936559 (抗PDL1抗體)、MPLDL3280A (抗PDL1抗體)、MSB0010718C (抗PDL1抗體)及Yervoy/伊匹單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。抗體編碼序列可使用此項技術中之普通技能經工程改造至諸如C68之載體中。例示性方法描述於Fang等人, Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol . 2005年5月;23(5):584-90. 電子版2005年4月17日中；其以引用的方式併入本文中用於所有目的。V . C . 疫苗設計 及製造的額外考慮 V . C . 1 . 判定覆蓋所有腫瘤次純系之肽集合
軀幹肽，意指由所有或大部分腫瘤次純系呈現之彼等肽，可優先包括於疫苗中。53 視情況，若不存在經預測以高機率呈遞且具有免疫原性之軀幹肽，或若經預測以高機率呈遞且具有免疫原性之軀幹肽的數目足夠小以致額外非軀幹肽可包括於疫苗中，則其他肽可藉由估計腫瘤次純系之數目及身分且選擇肽以使疫苗所覆蓋之腫瘤次純系之數目達到最大而進行優先排序54 。V . C . 2 . 抗原優先排序
在應用所有上述抗原過濾之後，可能仍有比疫苗技術可支撐的更多的候選抗原可用於疫苗包涵。另外，可保留關於抗原分析之各個態樣的不確定性，且候選疫苗抗原之不同特性之間可存在折衷。因此，可考慮整合式多維模型代替選擇過程之各步驟中的預定過濾器，將候選抗原置於具有至少以下軸之空間中且使用整合方法優化選擇。 1. 自體免疫或耐受性之風險(生殖系之風險) (自體免疫之風險較低通常為較佳的) 2. 定序偽影之機率(偽影之機率較低通常為較佳的) 3. 免疫原性之機率(免疫原性之機率較高通常為較佳的) 4. 呈現之機率(呈現之機率較高通常為較佳的) 5. 基因表現(較高表現通常為較佳的) 6. HLA基因之覆蓋率(參與抗原集合呈現之HLA分子數目愈大可降低腫瘤經由HLA分子之下調或突變逃避免疫攻擊的機率) 7. HLA類別之覆蓋率(覆蓋HLA-I及HLA-II兩者可增加治療反應之機率且降低腫瘤逃避之機率)
另外，視情況，若預測抗原由在患者腫瘤之全部或一部分中損失或失活之HLA對偶基因呈現，則可自疫苗接種去除該等抗原之優先排序(例如排除該等抗原)。HLA對偶基因損失可藉由體細胞突變、雜合性缺失或基因座之同型接合缺失發生。用於偵測HLA對偶基因體細胞突變之方法為此項技術中所熟知，例如(Shukla等人，2015)。用於偵測體細胞LOH及同型接合缺失(包括HLA基因座)之方法同樣經充分描述。(Carter等人, 2012；McGranahan等人, 2017；Van Loo等人, 2010)。若質譜資料表明所預測之抗原未被預測之HLA對偶基因呈現，則亦可去除抗原之優先排序。V . D . α 病毒 V . D . 1 . α 病毒生物學
α病毒為披膜病毒科之成員，且為正義單股RNA病毒。成員通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯、羅斯河、馬雅羅、基孔肯雅及塞姆利基森林病毒，或新世界，諸如東部馬腦炎、奧拉、摩根堡、或委內瑞拉馬腦炎及其衍生病毒株TC-83 (Strauss Microbrial Review 1994)。天然α病毒基因組通常約12 kb長，其中前三分之二含有編碼非結構蛋白(nsP)之基因，該等非結構蛋白形成用於病毒基因組自我複製之RNA複製複合物，且最後三分之一含有編碼用於病毒粒子產生之結構蛋白的亞基因組表現卡匣(Frolov RNA 2001)。
α病毒之模型生命週期涉及數個不同步驟(Strauss Microbrial Review 1994, Jose Future Microbiol 2009)。在病毒附著於宿主細胞後，病毒粒子與內飲區室內之膜融合，導致基因組RNA最終釋放至細胞溶質中。以正股定向且包含5'甲基鳥苷酸帽及3' polyA尾部之基因組RNA經轉譯以產生形成複製複合物之非結構蛋白nsP1-4。在感染早期，正股隨後由複合物複製成負股模板。在當前模型中，複製複合物隨著感染進展被進一步加工，使得所得經加工之複合物轉換成將負股轉錄成全長正股基因組RNA以及含有結構基因之26S亞基因組正股RNA。α病毒之數個保守序列元件(CSE)已鑑別為可能在各種RNA複製步驟中起作用，包括：負股模板之正股RNA複製中的5' UTR的互補序列、基因組模板之負股合成複製中的51-nt CSE、負股之亞基因組RNA轉錄中的在nsP與26S RNA之間的接合區中的24-nt CSE、及正股模板之負股合成中的3' 19-nt CSE。
在各種RNA物種複製後，病毒粒子隨後通常在病毒之天然生命週期中組裝。26S RNA經轉譯且所得蛋白質經進一步加工以產生結構蛋白，其包括衣殼蛋白、醣蛋白E1及E2以及兩個小多肽E3及6K (Strauss 1994)。發生病毒RNA之衣殼化，衣殼蛋白通常僅特異性針對所包裝之基因組RNA，隨後病毒粒子組裝且在膜表面出芽。V . D . 2 . 作為遞送載體之 α 病毒
α病毒(包括α病毒序列、特徵及其他元件)可用於產生基於α病毒之遞送載體(亦稱為α病毒載體、α病毒病毒載體、α病毒疫苗載體、自我複製RNA (srRNA)載體或自放大RNA (samRNA)載體)。α病毒先前已經工程改造以用作表現載體系統(Pushko 1997, Rheme 2004)。α病毒提供數種優勢，特別是在可能需要異源抗原表現之疫苗環境中。由於在宿主細胞溶質中自我複製的能力，故α病毒載體一般能夠在細胞內產生高複本數之表現卡匣，從而導致高水準異源抗原產生。另外，載體一般為瞬時的，從而使得生物安全性得以改良以及減少對載體之免疫耐受性的誘發。與其他標準病毒載體(諸如人類腺病毒)相比，公眾一般亦缺乏對α病毒載體預先存在的免疫性。基於α病毒之載體亦一般導致對經感染細胞的細胞毒性反應。在一定程度上，細胞毒性在疫苗環境中對於適當引發對所表現之異源抗原的免疫反應可為重要的。然而，所需細胞毒性之程度可為平衡作用，且因此已開發數種減毒α病毒，包括VEE之TC-83病毒株。因此，本文所述之抗原表現載體之實例可利用α病毒主鏈，其允許高水準之抗原表現、引發對抗原之穩固免疫反應、不引發對載體本身之免疫反應，且可以安全方式使用。此外，抗原表現卡匣可經設計以經由優化載體使用之α病毒序列(包括但不限於源自VEE或其減毒衍生物TC-83之序列)而引發不同水準之免疫反應。
已使用α病毒序列工程改造數種表現載體設計策略(Pushko 1997)。在一個策略中，α病毒載體設計包括在結構蛋白基因下游插入26S啟動子序列元件之第二複本，隨後為異源基因(Frolov 1993)。因此，除天然非結構蛋白及結構蛋白之外，亦產生表現異源蛋白之額外亞基因組RNA。在此系統中，存在用於產生感染性病毒粒子之所有元件，且因此可能發生在未感染細胞中反覆輪表現載體之感染。
另一種表現載體設計利用輔助病毒系統(Pushko 1997)。在此策略中，結構蛋白由異源基因替代。因此，在由仍完整之非結構基因介導病毒RNA之自我複製之後，26S亞基因組RNA提供異源蛋白之表現。傳統上，表現結構蛋白之額外載體隨後諸如藉由細胞株之共轉染以反式供應，以產生感染性病毒。系統詳細描述於USPN 8,093,021中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。輔助載體系統提供限制形成感染性顆粒之可能性的益處，因此提高生物安全性。另外，輔助載體系統減小總載體長度，潛在提高複製及表現效率。因此，本文所述之抗原表現載體之實例可利用結構蛋白由抗原卡匣替代之α病毒主鏈，所得載體降低生物安全問題，同時由於整體表現載體尺寸減小而促進有效表現。V . D . 3 . 活體外 α 病毒產生
α病毒遞送載體一般為正義RNA聚核苷酸。此項技術中熟知的用於產生RNA之便利技術為活體外轉錄IVT。在此技術中，首先藉由熟習此項技術者熟知的技術產生所需載體之DNA模板，包括標準分子生物學技術，諸如選殖、限制性消化、連接、基因合成及聚合酶鏈式反應(PCR)。DNA模板在期望轉錄成RNA之序列的5'端處含有RNA聚合酶啟動子。啟動子包括(但不限於)噬菌體聚合酶啟動子，諸如T3、T7或SP6。DNA模板隨後與適當RNA聚合酶、緩衝劑及核苷酸(NTP)一起培育。所得RNA聚核苷酸可視情況經進一步修飾，包括(但不限於)添加5'帽結構，諸如7-甲基鳥苷或相關結構，且視情況修飾3'端以包括聚腺苷酸(polyA)尾部。RNA可隨後使用本領域中熟知的技術純化，諸如苯酚-氯仿提取。V . D . 4 . 經由脂質奈米粒子遞送
在疫苗載體設計中考慮之一重要態樣為針對載體本身之免疫性(Riley 2017)。此可呈對載體本身(諸如某些人類腺病毒系統)預先存在的免疫性形式，或呈在疫苗投與後對載體產生免疫性之形式。若進行相同疫苗之多次投與(諸如分開的初始及增強劑量)，或若使用相同疫苗載體系統遞送不同抗原卡匣，則後者為重要的考慮因素。
在α病毒載體之情況下，標準遞送方法為先前論述之輔助病毒系統，其以反式提供衣殼、E1及E2蛋白質以產生感染性病毒粒子。然而，重要的是注意E1及E2蛋白質通常為中和抗體之主要靶標(Strauss 1994)。因此，若中和抗體靶向感染性粒子，則使用α病毒載體遞送所關注之抗原至靶細胞的功效可能會降低。
病毒粒子介導之基因遞送的替代方案為使用奈米材料遞送表現載體(Riley 2017)。重要的是，奈米材料媒劑可由非免疫原性材料製成且一般避免引發對遞送載體本身之免疫性。此等材料可包括(但不限於)脂質、無機奈米材料及其他聚合材料。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。材料可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括脂肪、膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯及脂溶性維生素。
脂質奈米粒子(LNP)為有吸引力的遞送系統，因為脂質之兩親媒性使得能夠形成膜及囊泡狀結構(Riley 2017)。一般而言，此等囊泡藉由吸收至靶細胞之膜中且將核酸釋放至細胞溶質中來遞送表現載體。另外，LNP可經進一步修飾或官能化以有助於靶向特定細胞類型。LNP設計中之另一考慮因素為靶向效率與細胞毒性之間的平衡。脂質組合物一般包括陽離子、中性、陰離子及兩性脂質之確定的混合物。在一些情況下，包括特定脂質以防止LNP聚集、防止脂質氧化、或提供有助於額外部分附著之功能性化學基團。脂質組合物可影響整體LNP大小及穩定性。在一實例中，脂質組合物包含二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。MC3及MC3樣脂質組合物可經調配以包括一或多種其他脂質，諸如PEG或PEG結合之脂質、固醇或中性脂質。
直接暴露於血清之核酸載體(諸如表現載體)可具有數種不期望之結果，包括核酸由血清核酸酶降解或游離核酸對免疫系統之脫靶刺激。因此，囊封α病毒載體可用於避免降解，同時亦避免潛在的脫靶影響。在某些實例中，α病毒載體完全囊封在遞送媒劑內，諸如在LNP之含水內部。α病毒載體囊封在LNP內可藉由熟習此項技術者熟知的技術來進行，諸如在微流體液滴生成裝置上進行的微流體混合及液滴生成。此類裝置包括(但不限於)標準T形接頭裝置或流動聚焦裝置。在一實例中，所需脂質調配物(諸如含有MC3或MC3樣之組合物)與α病毒遞送載體及其他所需藥劑並行提供至液滴生成裝置，使得遞送載體及所需藥劑完全囊封在基於MC3或MC3樣之LNP內部。在一實例中，液滴生成裝置可控制所產生之LNP的尺寸範圍及尺寸分佈。舉例而言，LNP之尺寸可在1至1000奈米直徑範圍內，例如1、10、50、100、500或1000奈米。在液滴生成後，囊封表現載體之遞送媒劑可經進一步處理或修飾以使其準備用於投與。V . E . 黑猩猩腺病毒 ( ChAd ) V . E . 1 . 用黑猩猩腺病毒遞送病毒
用於遞送一或多個抗原之疫苗組合物(例如經由抗原卡匣且包括示於表A及/或AACR GENIE結果中之一或多個新抗原，及/或示於表1.2中之一或多個抗原)可藉由提供黑猩猩來源之腺病毒核苷酸序列、多種新穎載體及表現黑猩猩腺病毒基因之細胞株來產生。黑猩猩C68腺病毒(在本文中亦稱為ChAdV68)之核苷酸序列可用於抗原遞送之疫苗組合物中(參見SEQ ID NO:1)。源自C68腺病毒之載體的使用進一步詳細描述於USPN 6,083,716中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
在另一態樣中，本文提供包含黑猩猩腺病毒之DNA序列之重組腺病毒(諸如C68)及以操作方式連結至引導其表現之調節序列的抗原卡匣。重組病毒能夠感染哺乳動物細胞、較佳人類細胞，且能夠在細胞中表現抗原卡匣產物。在此載體中，天然黑猩猩E1基因及/或E3基因及/或E4基因可缺失。抗原卡匣可插入至此等基因缺失位點中之任一者中。抗原卡匣可包括抗原，針對其激活之免疫反應為所需的。
在另一態樣中，本文提供一種經黑猩猩腺病毒(諸如C68)感染之哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供一種新穎的哺乳動物細胞株，其表現黑猩猩腺病毒基因(例如來自C68)或其功能片段。
在另一態樣中，本文提供一種用於將抗原卡匣遞送至哺乳動物細胞中之方法，其包含以下步驟：向細胞中引入有效量之已經工程改造以表現抗原卡匣之黑猩猩腺病毒，諸如C68。
另一態樣提供一種用於在哺乳動物宿主中引發免疫反應以治療癌症之方法。該方法可包含向宿主投與有效量之重組黑猩猩腺病毒，諸如C68之步驟，該重組黑猩猩腺病毒包含抗原卡匣，該抗原卡匣編碼免疫反應靶向之來自腫瘤之一或多個抗原。
亦揭示一種非猿猴哺乳動物細胞，其表現獲自SEQ ID NO:1序列之黑猩猩腺病毒基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5。
亦揭示一種包含黑猩猩腺病毒DNA序列之核酸分子，該黑猩猩腺病毒DNA序列包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之該等黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1序列，缺少選自由以下組成之群的至少一個基因：SEQ ID NO:1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
亦揭示一種載體，其包含獲自SEQ ID NO:1之黑猩猩腺病毒DNA序列及可操作地連接於一或多個調控序列之抗原卡匣，該一或多個調控序列引導卡匣在異源宿主細胞中之表現，視情況其中該黑猩猩腺病毒DNA序列包含至少用於複製及病毒粒子衣殼化所必需之順式元件，該等順式元件側接抗原卡匣及調控序列。在一些態樣中，黑猩猩腺病毒DNA序列包含選自由以下組成之群的基因：SEQ ID NO:1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因序列。在一些態樣中，載體可缺乏E1A及/或E1B基因。
本文亦揭示經本文所揭示之載體轉染之宿主細胞，該載體諸如經工程改造以表現抗原卡匣之C68載體。本文亦揭示經由將本文所揭示之載體引入細胞中而表現其中引入之所選擇之基因的人類細胞。
本文亦揭示一種用於將抗原卡匣遞送至哺乳動物細胞之方法，其包含向該細胞中引入有效量之本文所揭示之載體，諸如經工程改造以表現抗原卡匣之C68載體。
本文亦揭示一種用於產生抗原之方法，其包含將本文所揭示之載體引入哺乳動物細胞中，在適合之條件下培養細胞且產生抗原。V . E . 2 . 表現 E1 之互補細胞株
為產生缺失本文所述之基因中之任一者的重組黑猩猩腺病毒(Ad)，缺失基因區之功能若對於病毒之複製及感染性必不可少，則可藉由輔助病毒或細胞株(亦即互補或包裝細胞株)供應至重組病毒。舉例而言，為產生複製缺陷型黑猩猩腺病毒載體，可使用表現人類或黑猩猩腺病毒之E1基因產物的細胞株；此類細胞株可包括HEK293或其變異體。可遵循產生表現黑猩猩E1基因產物之細胞株的方案(USPN 6,083,716之實例3及4)，以產生表現任何所選擇之黑猩猩腺病毒基因的細胞株。
AAV增強分析可用於鑑別表現黑猩猩腺病毒E1之細胞株。此分析用於鑑別藉由使用例如來自其他物種之其他未表徵之腺病毒的E1基因製備的細胞株中的E1功能。該分析描述於USPN 6,083,716之實例4B中。
所選擇之黑猩猩腺病毒基因(例如E1)可在啟動子之轉錄控制下用於在所選擇之親本細胞株中表現。誘發型或組成型啟動子可用於此目的。在誘發型啟動子中包括可由鋅誘發之綿羊金屬硫蛋白啟動子，或可由糖皮質激素、特別是地塞米松(dexamethasone)誘發之小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。其他誘發型啟動子，諸如以引用的方式併入本文中之國際專利申請案WO95/13392中所鑑別之彼等誘發型啟動子，亦可用於產生包裝細胞株。亦可採用控制黑猩猩腺病毒基因表現之組成型啟動子。
親本細胞可經選擇以產生表現任何所需C68基因之新穎細胞株。此類親本細胞株可為(但不限於) HeLa [ATCC寄存編號CCL 2]、A549 [ATCC寄存編號CCL 185]、KB [CCL 17]、Detroit [例如Detroit 510、CCL 72]及WI-38 [CCL 75]細胞。其他適合之親本細胞株可獲自其他來源。親本細胞株可包括CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a。
表現E1之細胞株可用於產生重組黑猩猩腺病毒E1缺失之載體。使用基本上相同的程序構築之表現一或多種其他黑猩猩腺病毒基因產物的細胞株用於產生缺失編碼彼等產物之基因的重組黑猩猩腺病毒載體。另外，表現其他人類Ad E1基因產物之細胞株亦用於產生黑猩猩重組Ad。V . E . 3 . 作為載體之重組病毒顆粒
本文所揭示之組合物可包含病毒載體，其將至少一個抗原遞送至細胞。此類載體包含黑猩猩腺病毒DNA序列(諸如C68)及可操作地連接於引導卡匣表現之調控序列的抗原卡匣。C68載體能夠在經感染之哺乳動物細胞中表現卡匣。C68載體可功能性缺失一或多個病毒基因。抗原卡匣包含至少一個在一或多個調控序列(諸如啟動子)控制下的抗原。視情況選用之輔助病毒及/或包裝細胞株可向黑猩猩病毒載體供應缺失之腺病毒基因的任何必需產物。
術語「功能性缺失」意指移除或以其他方式改變(例如藉由突變或修飾)足夠量的基因區，使得基因區不再能夠產生一或多種基因表現之功能性產物。可導致功能性缺失之突變或修飾包括但不限於無義突變，諸如引入提前終止密碼子及移除典型及非典型的起始密碼子，改變mRNA剪接或其他轉錄加工之突變，或其組合。若需要，可移除整個基因區。
形成本文所揭示之載體的核酸序列之修飾，包括序列缺失、插入及其他突變，可使用標準分子生物學技術產生且在本發明之範疇內。V . E . 4 . 病毒質體載體之構築
用於本發明之黑猩猩腺病毒C68載體包括重組缺陷型腺病毒，亦即在E1a或E1b基因中功能性缺失且視情況攜帶其他突變(例如其他基因中之溫度敏感性突變或缺失)的黑猩猩腺病毒序列。預期此等黑猩猩序列亦用於形成來自其他腺病毒及/或腺相關病毒序列之雜交載體。由人類腺病毒製備之同源腺病毒載體描述於公開的文獻中[參見例如上文所引用之Kozarsky I及II，及其中列舉之參考文獻，美國專利第5,240,846號]。
在構築用於將抗原卡匣遞送至人類(或其他哺乳動物)細胞之有用黑猩猩腺病毒C68載體中，可將一系列腺病毒核酸序列用於載體。包含最小黑猩猩C68腺病毒序列之載體可與輔助病毒結合使用以產生感染性重組病毒粒子。輔助病毒提供最小黑猩猩腺病毒載體之病毒感染性及繁殖所需的基本基因產物。當在另外的功能性病毒載體中僅產生黑猩猩腺病毒基因之一或多個所選擇之缺失時，可藉由在所選擇之包裝細胞株中繁殖病毒而在病毒載體生產過程中供應缺失的基因產物，該包裝細胞株提供反式缺失之基因功能。V . E . 5 . 重組最小腺病毒
最小的黑猩猩Ad C68病毒為僅含有複製及病毒粒子衣殼化所必需之腺病毒順式元件的病毒粒子。亦即，載體含有腺病毒之順式作用5'及3'反向末端重複(ITR)序列(其充當複製起點)及天然5'包裝/強化子結構域(其含有用於包裝線性Ad基因組所必需的序列及E1啟動子之強化子元件)。參見例如在國際專利申請案WO96/13597中所描述且以引用的方式併入本文中的用於製備「最小」人類Ad載體之技術。V . E . 6 . 其他缺陷型腺病毒
重組複製缺乏型腺病毒亦可比最小黑猩猩腺病毒序列含有更多。此等其他Ad載體可藉由病毒基因區之各個部分的缺失及藉由視情況使用輔助病毒及/或包裝細胞株形成的感染性病毒粒子來表徵。
作為一個實例，適合之載體可藉由使C68腺病毒立即早期基因E1a及延遲早期基因E1b之全部或足夠部分缺失來形成，從而消除其正常的生物功能。當在含有提供相應反式基因產物之功能性腺病毒E1a及E1b基因的黑猩猩腺病毒轉化的互補細胞株上生長時，複製缺陷型E1缺失病毒能夠複製且產生感染性病毒。基於已知腺病毒序列之同源性，預期正如此項技術之人類重組E1缺失腺病毒，所得重組黑猩猩腺病毒能夠感染許多細胞類型且可表現抗原，但除非以極高感染倍率感染細胞，否則無法在不攜帶黑猩猩E1區DNA之大多數細胞中複製。
作為另一個實例，C68腺病毒延遲早期基因E3之全部或一部分可自形成重組病毒之一部分的黑猩猩腺病毒序列消除。
亦可構築具有E4基因缺失之黑猩猩腺病毒C68載體。另一個載體可在延遲早期基因E2a中含有缺失。
亦可在黑猩猩C68腺病毒基因組之晚期基因L1至L5中之任一者中獲得缺失。類似地，中間基因IX及IVa2中之缺失可用於一些目的。可在其他結構性或非結構性腺病毒基因中獲得其他缺失。
上述缺失可單獨使用，亦即腺病毒序列可僅含有E1缺失。可替代地，可以任何組合使用有效破壞或降低其生物活性之完整基因或其部分的缺失。舉例而言，在一個例示性載體中，腺病毒C68序列可缺失E1基因及E4基因，或缺失E1、E2a及E3基因，或缺失E1及E3基因，或在缺失或不缺失E3之情況下缺失E1、E2a及E4基因等等。如上文所論述，此類缺失可與其他突變(諸如溫度敏感性突變)組合使用，以達成所需結果。
將包含抗原之卡匣視情況插入至黑猩猩C68 Ad病毒之任一缺失區中。可替代地，若需要，可將卡匣插入至現有基因區中以破壞該區之功能。V . E . 7 . 輔助病毒
視用於攜帶抗原卡匣之病毒載體的黑猩猩腺病毒基因含量而定，可使用輔助腺病毒或非複製性病毒片段來提供足夠的黑猩猩腺病毒基因序列以產生含有該卡匣之感染性重組病毒粒子。
有用的輔助病毒含有所選擇之腺病毒基因序列，其不存在於腺病毒載體構築體中及/或不由載體轉染之包裝細胞株表現。輔助病毒可為複製缺陷型且除上述序列之外，亦含有多種腺病毒基因。輔助病毒可與本文所述之表現E1之細胞株組合使用。
對於C68，「輔助」病毒可為藉由用SspI剪切C68基因組之C末端形成的片段，其自病毒之左端移除約1300 bp。此經剪切之病毒隨後與質體DNA共轉染至表現E1之細胞株中，由此藉由與質體中之C68序列同源重組形成重組病毒。
輔助病毒亦可形成聚陽離子結合物，如Wu等人, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989)；K. J. Fisher及J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994年4月1日)中所述。輔助病毒可視情況含有報導體基因。許多此類報導體基因為此項技術已知的。與腺病毒載體上之抗原卡匣不同，輔助病毒上報導體基因之存在允許獨立地監測Ad載體及輔助病毒。此第二報導體用於純化後能夠將所得重組病毒與輔助病毒分離。V . E . 8 . 病毒粒子之組裝及細胞株之感染
將腺病毒之經選擇DNA序列、抗原卡匣及其他載體元件組裝於各種中間質體及穿梭載體中，及使用質體及載體製造重組病毒粒子均可使用習知技術實現。此類技術包括cDNA之習知選殖技術、活體外重組技術(例如吉布森組裝(Gibson assembly))、腺病毒基因組之重疊寡核苷酸序列的使用、聚合酶鏈反應及提供所需核苷酸序列之任何適合之方法。採用標準轉染及共轉染技術，例如CaPO4沈澱技術或脂質體介導之轉染方法，諸如脂染胺。所採用之其他習知方法包括病毒基因組之同源重組、瓊脂覆層中病毒之蝕斑、量測信號產生之方法及其類似方法。
舉例而言，在構築及組裝所需含抗原卡匣之病毒載體之後，可在輔助病毒存在下將載體轉染於包裝細胞株中。同源重組發生在輔助序列與載體序列之間，其允許載體中之腺病毒抗原序列複製且包裝至病毒粒子衣殼中，從而產生重組病毒載體粒子。
所得重組黑猩猩C68腺病毒用於將抗原卡匣轉移至所選擇之細胞中。在使用包裝細胞株中生長之重組病毒的活體內實驗中，E1缺失之重組黑猩猩腺病毒在將卡匣轉移至非黑猩猩(較佳人類)細胞中展現效用。V . E . 9 . 重組病毒載體之用途
所得含有抗原卡匣之重組黑猩猩C68腺病毒(藉由使腺病毒載體與輔助病毒或腺病毒載體與包裝細胞株協同製備，如上文所述)因此提供可在活體內或活體外將抗原遞送至個體之有效基因轉移媒劑。
上述重組載體根據公開的基因療法投與人類。攜帶抗原卡匣之黑猩猩病毒載體可投與患者，較佳懸浮於生物相容性溶液或醫藥學上可接受之遞送媒劑中。適合之媒劑包括無菌鹽水。已知為醫藥學上可接受之載劑且為熟習此項技術者所熟知的其他水性及非水性等張無菌注射溶液以及水性及非水性無菌懸浮液可用於此目的。
黑猩猩腺病毒載體係以足以轉導人類細胞且提供足夠水準之抗原轉移及表現的量投與，從而提供治療益處而無過度不良效應或具有醫學上可接受之生理效應，其可由熟習醫藥技術之人員來確定。習知及醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)直接遞送至肝臟、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合投藥途徑。
病毒載體之劑量將主要取決於以下因素，諸如所治療之病況、患者之年齡、體重及健康狀況，且因此可在患者當中變化。劑量將經調節以平衡治療益處與任何副作用，且此類劑量可視採用重組載體之治療應用而變化。可監測抗原表現量以確定劑量投與頻率。
重組複製缺陷型腺病毒可以「醫藥學有效量」投與，亦即在投藥途徑中有效轉染所需細胞且提供所選擇之基因的足夠表現量以提供疫苗益處(亦即一些可量測之保護性免疫水準)的重組腺病毒之量。包含抗原卡匣之C68載體可與佐劑共同投與。佐劑可與載體分開(例如礬)或在載體內編碼，尤其若佐劑為蛋白質。佐劑為此項技術中所熟知。
習知且醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)鼻內、肌肉內、氣管內、皮下、皮內、經直腸、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合或調整投藥途徑，視免疫原或疾病而定。舉例而言，在狂犬病預防中，皮下、氣管內及鼻內途徑為較佳的。投藥途徑主要將取決於所治療之疾病的性質。
可監測對抗原之免疫水準以確定是否需要增強劑。舉例而言，在評定血清中之抗體力價後，可能需要視情況增強免疫。VI . 治療及製造方法
亦提供一種藉由向個體投與一或多個抗原(諸如使用本文所揭示之方法鑑別的複數個抗原)在個體中誘發腫瘤特異性免疫反應、針對腫瘤接種疫苗、治療及或緩解個體之癌症症狀的方法。
在一些態樣中，個體已診斷患有癌症或處於罹患癌症之風險下。個體可為人類、犬、貓、馬或需要腫瘤特異性免疫反應之任何動物。腫瘤可為任何實體腫瘤，諸如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、肺腫瘤、腎臟腫瘤、胃腫瘤、結腸腫瘤、睪丸腫瘤、頭頸部腫瘤、胰腺腫瘤、腦腫瘤、黑素瘤及其他組織器官腫瘤，以及血液腫瘤，諸如淋巴瘤及白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病及B細胞淋巴瘤。
抗原可以足以誘發CTL反應之量投與。
抗原可單獨或與其他治療劑組合投與。治療劑為例如化學治療劑、輻射或免疫療法。可針對特定癌症投與任何適合之治療性治療。
另外，可向個體進一步投與抗免疫抑制劑/免疫刺激劑，諸如檢查點抑制劑。舉例而言，可向個體進一步投與抗CTLA抗體或抗PD-1或抗PD-L1。藉由抗體阻斷CTLA-4或PD-L1可增強患者中對癌細胞之免疫反應。特定言之，已展示在按照疫苗接種方案時CTLA-4阻斷為有效的。
可確定包括於疫苗組合物中之各抗原的最佳量及最佳給藥方案。舉例而言，抗原或其變異體可製備用於靜脈內(i.v.)注射液、皮下(s.c.)注射液、皮內(i.d.)注射液、腹膜內(i.p.)注射液、肌肉內(i.m.)注射液。注射方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.及i.v.。DNA或RNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.及i.v.。疫苗組合物之其他投與方法為熟習此項技術者已知的。
疫苗可經編譯以使得組合物中存在之抗原的選擇、數目及/或量為組織、癌症及/或患者特異性的。舉例而言，肽的準確選擇可根據所指定組織中之親本蛋白質的表現模式來導引或根據患者之突變狀態來導引。選擇可取決於癌症之具體類型、疾病狀態、較早的治療方案、患者免疫狀態及當然患者之HLA單倍型。此外，疫苗可根據特定患者之個人需要而含有個別化組分。實例包括根據抗原在特定患者中之表現改變抗原之選擇或在第一輪或治療方案之後調整二次治療。
可經由使用各種診斷方法(例如下文進一步描述之患者選擇方法)鑑別患者以投與抗原疫苗。患者選擇可涉及鑑別一或多個基因中之突變，或表現模式。在一些情況下，患者選擇涉及鑑別患者之單倍型。各種患者選擇方法可同時進行，例如定序診斷可鑑別患者之突變及單倍型。各種患者選擇方法可依序進行，例如一個診斷性測試鑑別突變且分開的診斷測試鑑別患者之單倍型，且其中各測試可為相同(例如均為高通量定序)或不同(例如一個為高通量定序且另一個為桑格定序)的診斷方法。
對於待用作癌症疫苗之組合物，在正常組織中大量表現之具有類似正常自身肽的抗原可避免或以低量存在於本文所述之組合物中。另一方面，若已知患者之腫瘤表現大量的某一抗原，則用於治療此癌症之各別醫藥組合物可以高量存在且/或可包括超過一種對此特定抗原或此抗原之路徑具有特異性的抗原。
可向已罹患癌症之個體投與包含抗原之組合物。在治療應用中，組合物以足以引發對腫瘤抗原之有效CTL反應且治癒或至少部分遏制症狀及/或併發症之量投與患者。足以實現此目標之量定義為「治療有效劑量」。對此用途有效之量將取決於例如組合物、投藥方式、所治療疾病之階段及嚴重程度、患者之體重及一般健康狀況、以及處方醫師之判斷。應記住，組合物一般可用於嚴重的疾病病況，亦即危及生命或可能危及生命之情形，尤其當癌症已轉移時。在此類情況下，鑒於外來物質之最小化及抗原之相對無毒性，治療醫師可能且可能感覺需要投與實質性過量之此等組合物。
對於治療用途，可在偵測或手術移除腫瘤時開始投藥。隨後為增強免疫劑量，直至症狀至少實質上減弱且隨後減弱一段時間。
用於治療性治療之醫藥組合物(例如疫苗組合物)意欲非經腸、局部、經鼻、經口或局部投與。醫藥組合物可非經腸投與，例如靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投與。組合物可在手術切除部位投與以誘發針對腫瘤之局部免疫反應。本文揭示用於非經腸投與之組合物，其包含抗原及疫苗組合物溶解或懸浮於可接受之載劑(例如水性載劑)中之溶液。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.9%生理食鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及其類似物。此等組合物可藉由習知的熟知滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以按原樣使用或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌溶液組合。組合物可含有為接近生理條件而需要的醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
抗原亦可經由脂質體投與，脂質體使其靶向特定的細胞組織，諸如淋巴組織。脂質體亦用於增加半衰期。脂質體包括乳液、泡沫、膠束、不可溶單層、液晶、磷脂分散體、層狀層及其類似物。在此等製劑中，有待遞送之抗原作為脂質體之一部分單獨或與結合於例如淋巴細胞中普遍存在之受體的分子(諸如結合於CD45抗原之單株抗體)或與其他治療性或免疫原性組合物一起併入。因此，用所需抗原填充之脂質體可引導至淋巴細胞之位點，在此脂質體隨後遞送所選擇之治療性/免疫原性組合物。脂質體可由標準的形成囊泡之脂質形成，其一般包括中性及帶負電荷之磷脂及固醇(諸如膽固醇)。脂質之選擇一般藉由考慮例如脂質體大小、脂質體在血流中之酸不穩定性及穩定性來指導。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)；美國專利第4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號中所描述。
對於靶向免疫細胞，待併入至脂質體中之配體可包括例如對所需免疫系統細胞之細胞表面決定子具有特異性的抗體或其片段。脂質體懸浮液可以一定劑量靜脈內、局部、表面等投與，該劑量尤其根據投藥方式、所遞送之肽及所治療疾病之階段而變化。
出於治療或免疫目的，編碼肽及視情況選用之一或多種本文所述之肽的核酸亦可投與患者。多種方法方便地用於將核酸遞送至患者。舉例而言，核酸可以「裸DNA」形式直接遞送。此方法描述於例如Wolff等人, Science 247: 1465-1468 (1990)以及美國專利第5,580,859號及第5,589,466號中。核酸亦可使用彈道式遞送投與，如例如美國專利第5,204,253號中所述。可投與僅包含DNA之粒子。可替代地，DNA可黏附於粒子，諸如金粒子。在存在或不存在電穿孔之情況下，用於遞送核酸序列之方法可包括病毒載體、mRNA載體及DNA載體。
核酸亦可與陽離子化合物(諸如陽離子脂質)複合遞送。脂質介導之基因遞送方法描述於例如9618372WOAWO 96/18372；9324640WOAWO 93/24640；Mannino及Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)；美國專利第5,279,833號；Rose美國專利第5,279,833號；9106309WOAWO 91/06309；及Felgner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)中。
抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其設計成靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev . (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J . (2012) 443(3):603-18, Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl . Acids Res . (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J . Virol . (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個抗原肽之一或多個核苷酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med . (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science . (2016) 352 (6291):1337-41, Lu等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res . (2014) 20( 13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞表現抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。適用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為BCG (Bacille Calmette Guerin)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，適用於抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
投與核酸之手段使用編碼一或多個抗原決定基之袖珍基因構築體。為產生編碼經選擇在人類細胞中表現之CTL抗原決定基(袖珍基因)之DNA序列，逆轉譯抗原決定基之胺基酸序列。使用人類密碼子使用表來指導各胺基酸之密碼子選擇。此等編碼抗原決定基之DNA序列直接鄰接，產生連續多肽序列。為了最佳化表現及/或免疫原性，可將其他元件併入小型基因設計中。可經逆轉譯且包括於袖珍基因序列中之胺基酸序列的實例包括：輔助T淋巴細胞、抗原決定基、前導(信號)序列及內質網滯留信號。另外，可藉由包括鄰近於CTL抗原決定基之合成(例如聚丙胺酸)或天然存在的側接序列來改良CTL抗原決定基之MHC呈遞。藉由組裝編碼袖珍基因之正股及負股的寡核苷酸而將袖珍基因序列轉化成DNA。重疊寡核苷酸(30-100個鹼基長)係在適當條件下使用熟知技術合成、磷酸化、純化及黏接。寡核苷酸之末端係使用T4 DNA連接酶連接。編碼CTL抗原決定基多肽之此合成袖珍基因可隨後選殖至所期望之表現載體中。
可製備經純化之質體DNA以便使用多種調配物注射。其中最簡單的為凍乾DNA在無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中復原。已描述多種方法，且可使用新技術。如上文所指出，核酸宜用陽離子脂質調配。另外，醣脂、促融合脂質體、肽及化合物(統稱為保護、相互作用、非縮合(PINC))亦可與純化的質體DNA複合，以影響諸如以下之變數：穩定性、肌肉內分散或移行至特定器官或細胞類型。
亦揭示一種製造腫瘤疫苗之方法，其包含執行本文揭示之方法之步驟；以及製造包含複數個抗原或該複數個抗原之子集的腫瘤疫苗。
本文所揭示之抗原可使用此項技術中已知之方法製造。舉例而言，製備本文揭示之抗原或載體(例如，包括至少一個編碼一或多個抗原之序列的載體)之方法可包括在適用於表現該抗原或載體之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼該抗原或載體之至少一種聚核苷酸，以及純化該抗原或載體。標準純化方法包括層析技術、電泳、免疫、沈澱、滲析、過濾、濃縮及層析聚焦技術。
宿主細胞可包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、酵母或HEK293細胞。宿主細胞可用一或多個聚核苷酸轉化，該一或多個聚核苷酸包含至少一個編碼本文揭示之抗原或載體之核酸序列，視情況其中經分離聚核苷酸進一步包含可操作地連接於編碼抗原或載體之至少一個核酸序列的啟動子序列。在某些實施例中，經分離之聚核苷酸可為cDNA。VII . 抗原使用及投藥
可使用疫苗接種方案給予個體一或多種抗原。初始疫苗及增強疫苗可用於向個體給藥。初始疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所示之序列)，且增強疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所示之序列)。各載體通常包括具有抗原之卡匣。卡匣可包括約20種抗原，其由間隔子(諸如通常包圍各抗原之天然序列)或其他非天然間隔序列(諸如AAY)分開。卡匣亦可包括MHCII抗原，諸如破傷風類毒素抗原及PADRE抗原，其可視為通用II類抗原。卡匣亦可包括靶向序列，諸如泛素靶向序列。另外，各疫苗劑量可與檢查點抑制劑(CPI)結合(例如同時、之前或之後)投與個體。CPI可包括抑制CTLA4、PD1及/或PDL1之彼等，諸如抗體或其抗原結合部分。此類抗體可包括曲美單抗或德瓦魯單抗(durvalumab)。
初始疫苗可注射(例如肌肉內)於個體。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68)注射(例如總劑量1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 μg RNA、尤其0.1或1 μg範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 μg RNA、尤其10或100 μg範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。
可在初始疫苗接種之後注射(例如肌肉內)疫苗增強劑(增強疫苗)。增強疫苗可在初打後約每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週，例如每4週及/或8週投與。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68)注射(例如總劑量1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 μg RNA、尤其0.1或1 μg範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 μg RNA、尤其10或100 μg範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。
亦可向個體投與抗CTLA-4 (例如曲美單抗)。舉例而言，抗CTLA4可在肌肉內疫苗注射(ChAdV68初打或srRNA低劑量)部位附近皮下投與，以確保引流至同一淋巴結。曲美單抗為CTLA-4之選擇性人類IgG2 mAb抑制劑。目標抗CTLA-4 (曲美單抗)皮下劑量通常為70-75 mg (尤其75 mg)，其劑量範圍為例如1-100 mg或5-420 mg。
在某些情況下，可使用抗PD-L1抗體，諸如德瓦魯單抗(MEDI 4736)。德瓦魯單抗為一種選擇性、高親和力人類IgG1 mAb，其阻斷PD-L1結合於PD-1及CD80。德瓦魯單抗一般每4週以20 mg/kg i.v.投與。
可在疫苗投與之前、期間及/或之後進行免疫監測。除其他參數外，此類監測可告知安全性及功效。
為進行免疫監測，通常使用PBMC。PBMC可在初始疫苗接種之前及在初始疫苗接種之後(例如4週及8週)分離。PBMC可僅在增強疫苗接種之前及在每次增強疫苗接種之後(例如4週及8週)收集。
可評定T細胞反應作為免疫監測方案之一部分。可使用此項技術中已知的一或多種方法量測T細胞反應，諸如ELISpot、細胞內細胞介素染色、細胞介素分泌及細胞表面捕捉、T細胞增殖、MHC多聚體染色或藉由細胞毒性分析。針對疫苗中編碼之抗原決定基的T細胞反應可藉由使用ELISpot分析量測細胞介素(諸如IFN-γ)之誘發而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用流式細胞測量術量測胞內或胞外捕捉之細胞介素(諸如IFN-γ)之誘發而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用MHC多聚體染色量測表現特異性針對抗原決定基/MHC I類複合物之T細胞受體的T細胞群體而自PBMC監測。對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由在3H-胸苷、溴去氧尿苷及羧基螢光素-二乙酸酯-琥珀醯亞胺酯(CFSE)併入後量測T細胞群之離體擴增而自PBMC監測。特異性針對疫苗中編碼之抗原決定基之源自PBMC之T細胞的抗原識別能力及溶解活性可藉由鉻釋放分析或替代性比色細胞毒性分析來功能性評定。VIII . 抗原鑑別 VIII . A . 抗原候選鑑別
已描述關於腫瘤及正常外顯子組及轉錄組之NGS分析的研究方法且將其應用於抗原鑑別空間。6,14,15 可考慮在臨床環境中針對對抗原鑑別之更大敏感性及特異性的某些優化。此等優化可分為兩個領域，亦即與實驗室方法相關之彼等優化及與NGS資料分析相關之彼等優化。優化實例為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於以下各者之方法：國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856，出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。VIII . B . HLA 肽之分離及偵測
在裂解及溶解組織樣品後，使用經典免疫沈澱(IP)方法進行HLA-肽分子之分離(55-58)。澄清的溶解物用於HLA特異性IP。
免疫沈澱係使用與珠粒偶合之抗體來進行，其中抗體特異性針對HLA分子。對於泛I類HLA免疫沈澱，使用泛I類CR抗體；對於II類HLA-DR，使用HLA-DR抗體。在隔夜培育期間，抗體共價連接於NHS-瓊脂糖珠粒。在共價連接後，將珠粒洗滌且等分用於IP。(59, 60) 免疫沈澱反應亦可用未共價連接於珠粒之抗體來進行。通常使用塗佈有蛋白A及/或蛋白G之瓊脂糖或磁性珠粒來完成此，該等珠粒將抗體固定於管柱。下文列舉可用於選擇性地富集MHC/肽複合物之一些抗體。
Figure 108117933-A0304-0001
將澄清的組織溶解物添加至抗體珠粒中進行免疫沈澱。在免疫沈澱後，自溶解物移除珠粒且將溶解物儲存用於額外實驗，包括額外IP。洗滌IP珠粒以移除非特異性結合且使用標準技術自珠粒溶離HLA/肽複合物。使用分子量旋轉管柱或C18分級分離自肽移除蛋白質組分。所得肽藉由SpeedVac蒸發變乾且在一些情況下，在MS分析之前儲存在-20℃下。
乾燥的肽在適於逆相層析之HPLC緩衝液中復原且裝載於C-18微毛細管HPLC管柱上，以便在Fusion Lumos質譜儀(Thermo)中梯度溶離。在Orbitrap偵測器中以高解析度收集肽質量/電荷(m/z)之MS1譜，隨後在所選擇之離子的HCD片段化後，在離子阱偵測器中收集MS2低解析度掃描。另外，可使用CID或ETD片段化方法或三種技術之任何組合來獲得MS2譜，以達到肽之更大的胺基酸覆蓋率。MS2譜亦可在Orbitrap偵測器中以高解析度質量精度量測。
使用Comet (61, 62)對來自各分析之MS2譜進行蛋白質資料庫搜尋，且使用Percolator (63-65)對肽鑑別進行評分。使用PEAKS studio (Bioinformatics Solutions Inc.)來進行額外定序，且可使用其他搜尋引擎或定序方法，包括頻譜匹配及從頭定序(97)。VIII . B . 1 . 支援綜合 HLA 肽定序之 MS 偵測極限研究 .
使用肽YVYVADVAAK，使用裝載於LC管柱上之不同量的肽確定偵測極限。所測試之肽的量為1 pmol、100 fmol、10 fmol、1 fmol及100 amol。(表1) 結果展示於圖24A及24B中。此等結果表明，最低偵測極限(LoD)在埃莫耳範圍(10- 18 )中，動態範圍跨越五個數量級，且信號雜訊比足以在低飛莫耳範圍(10- 15 )定序。表 1
Figure 108117933-A0304-0002
 IX . 呈現模型
呈現模型可用於鑑別在患者中肽呈現之可能性。各種呈現模型為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中之呈現模型，該等公開案出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。X . 訓練模組
訓練模組可用於基於訓練資料組構築一或多個呈現模型，該等模型產生肽序列是否會經與該等肽序列相關聯之MHC對偶基因呈現的可能性。各種訓練模組為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中之呈現模型，該等呈現模型出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。訓練模組可以在獨立對偶基因(per-allele)基礎上構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。訓練模組亦可在存在兩個或或更多個MHC對偶基因之多對偶基因環境中構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。XI . 預測模組
預測模組可用於接收序列資料且使用呈現模型選擇序列資料中之候選抗原。具體言之，序列資料可以為自患者之腫瘤組織細胞提取的DNA序列、RNA序列及/或蛋白質序列。預測模組可以藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之腫瘤組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別含有一或多個突變之部分，由此鑑別出呈突變肽序列之新抗原。預測模組可以藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之腫瘤組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別不恰當表現之候選抗原，由此鑑別出與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之候選抗原。
呈現模組可將一或多個呈現模型應用於經處理之肽序列以估計該等肽序列之呈現可能性。具體而言，預測模組可藉由將呈現模型應用於候選抗原來選擇可能呈現在腫瘤HLA分子上之一或多個候選抗原肽序列。在一個實施方案中，呈現模組選出估計呈現可能性超過預定臨限值之候選抗原序列。在另一實施方案中，呈現模型選出N 個具有最高估計呈現可能性之候選抗原序列(其中N 一般為可以在疫苗中遞送的最大抗原決定基數量)。包括選擇用於給定患者之候選抗原的疫苗可以注射至患者體內以誘發免疫反應。XI . B . 卡匣設計模組 XI . B . 1 綜述
卡匣設計模組可基於選擇用於注射至患者體內之候選肽產生疫苗卡匣序列。各種卡匣設計模組為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中之卡匣設計模組，該等公開案出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。
可以基於由預測模組確定的與超過預定臨限值之呈現可能性相關聯之所選肽產生治療性抗原決定基集合，其中該等呈現可能性係由呈現模型測定。然而，應瞭解，在其他實施例中，可以基於多種方法中之任一種或多種(單獨或組合形式)，例如基於針對患者之HLA I類或II類對偶基因之結合親和力或預測之結合親和力、針對患者之HLA I類或II類對偶基因之結合穩定性或預測之結合穩定性、隨機取樣及類似方法產生治療性抗原決定基之集合。
治療性抗原決定基可對應於自身選擇之肽。除所選肽外，治療性抗原決定基亦可包括C端及/或N端側接序列。N端及C端側接序列可為治療性疫苗抗原決定基在其源蛋白質之背景下之天然N端及C端側接序列。治療性抗原決定基可表示固定長度的抗原決定基。治療性抗原決定基可表示可變長度的抗原決定基，其中抗原決定基之長度可視例如C-側接序列或N-側接序列之長度而改變。舉例而言，C端側接序列及N端側接序列可各自具有2-5個殘基的變化長度，由此產生16種可能的抗原決定基選擇。
卡匣設計模組亦可藉由考慮橫跨該卡匣中一對治療性抗原決定基之間之接合點的接合點抗原決定基之呈現來產生卡匣序列。接合點抗原決定基係由於在該卡匣中串接治療性抗原決定基及連接子序列之過程而在該卡匣中產生的新穎非自身但不相關之抗原決定基序列。接合點抗原決定基之新穎序列不同於該卡匣之治療性抗原決定基本身。
卡匣設計模組可產生降低在患者中呈現接合點抗原決定基之可能性的卡匣序列。具體言之，當將卡匣注射至患者體內時，接合點抗原決定基有可能經患者之HLA I類或HLA II類對偶基因呈現，且分別刺激CD8或CD4 T細胞反應。由於T細胞與接合點抗原決定基之反應沒有治療益處，且可能因抗原競爭而減弱針對該卡匣中所選治療性抗原決定基之免疫反應，故此類反應常常係不合需要的。76
卡匣設計模組可迭代一或多個候選卡匣，且確定與卡匣序列相關聯之接合點抗原決定基之呈現評分低於數字臨限值的卡匣序列。接合點抗原決定基呈現評分係與該卡匣中接合點抗原決定基之呈現可能性相關聯的量，且較高的接合點抗原決定基呈現評分值指示該卡匣之接合點抗原決定基會由HLA I類或HLA II類或兩者呈現之可能性較高。
在一個實施例中，卡匣設計模組可以確定候選卡匣序列中與最低接合點抗原決定基呈現評分相關聯之卡匣序列。
卡匣設計模組可以迭代一或多個候選卡匣序列，確定候選卡匣之接合點抗原決定基呈現評分，且鑑別與低於臨限值之接合點抗原決定基呈現評分相關聯之最佳卡匣序列。
卡匣設計模組可以進一步檢查該一或多個候選卡匣序列以鑑別候選卡匣序列中之接合點抗原決定基中之任一個是否為設計使用該疫苗之給定患者之自身抗原決定基。為實現此目的，卡匣設計模組針對已知資料庫，諸如BLAST檢查接合點抗原決定基。在一個實施例中，卡匣設計模組可經組態以設計避免接合點自身抗原決定基之卡匣。
卡匣設計模組可執行蠻力方法且迭代所有或大部分可能的候選卡匣序列以選擇具有最小接合點抗原決定基呈現評分之序列。然而，由於疫苗容量增加，此類候選卡匣之數量可能極大。舉例而言，對於20個抗原決定基之疫苗容量，卡匣設計模組必須迭代約1018 個可能的候選卡匣，才能確定具有最低接合點抗原決定基呈現評分之卡匣。對於卡匣設計模組在合理的時間量內完成以產生用於患者之疫苗而言，此確定在計算上可能較為繁瑣(就所需之計算處理資源而言)且有時難以處理。另外，考慮到每一候選卡匣的可能接合點抗原決定基，甚至可能更為繁瑣。因此，卡匣設計模組可以基於迭代明顯少於蠻力方法中之候選卡匣序列數量的候選卡匣數量來選擇卡匣序列。
卡匣設計模組可產生隨機產生或至少偽隨機產生的候選卡匣子集，且選擇與低於預定臨限值之接合點抗原決定基呈現評分相關聯之候選卡匣作為卡匣序列。另外，卡匣設計模組可以自該子集中選擇具有最低接合點抗原決定基呈現評分之候選卡匣作為卡匣序列。舉例而言，卡匣設計模組可以針對20個所選抗原決定基的集合產生約1百萬個候選卡匣的子集，且選出具有最小接合點抗原決定基呈現評分之候選卡匣。儘管產生隨機卡匣序列子集並自該子集中選出具有低接合點抗原決定基呈現評分之卡匣序列可能不如蠻力方法好，但其需要明顯較少的計算資源，由此使其實施在技術上為可實行的。另外，相對於此種更高效之技術，執行蠻力法可能僅引起接合點抗原決定基呈現評分之微小或甚至可忽略的改良，因此，由資源分配之觀點看，蠻力法係不值得實施的。卡匣設計模組可藉由將卡匣之抗原決定基序列用非對稱旅行商問題(TSP)公式表示來確定改良之卡匣組態。根據節點清單及每對節點之間之距離，TSP確定與最短總距離相關聯之節點之序列以訪問每個節點恰好一次且返回至原始節點。舉例而言，根據城市A、B及C且已知彼此之間的距離，TSP之解決方案產生一個閉合的城市序列，對於該序列，訪問每個城市恰好一次所行進之總距離係可能途徑當中最短的。TSP之非對稱形式確定當一對節點之間的距離不對稱時節點之最佳序列。舉例而言，自節點A行進至節點B之「距離」可以不同於自節點B行進至節點A之「距離」。藉由使用非對稱TSP解決改良之最佳卡匣，卡匣設計模組可以尋找使所有在該卡匣之抗原決定基之間的接合點之呈現評分降低的卡匣序列。非對稱TSP解決方案指示對應於應當在卡匣中串接抗原決定基以使該卡匣之所有接合點的接合點抗原決定基呈現評分減到最小之次序的治療性抗原決定基序列。相較於隨機取樣方法，經由此方法確定的卡匣序列可以產生具有明顯較少接合點抗原決定基呈現之序列，同時可能需要明顯較少的計算資源，尤其是在所產生的候選卡匣序列數量很大時。不同計算方法及用於優化卡匣設計之比較之說明性實例更詳細地描述於國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中，該等公開案出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。XI . B . 2 共有抗原疫苗序列選擇
用於包涵在共有抗原疫苗中之共有抗原序列及用此類疫苗治療之合適患者可由熟習此項技術者使用本文所提供之詳細揭露內容來選擇。舉例而言，表：A、1.2或AACR GENIE結果可用於序列選擇。在某些情況下，特定突變與HLA對偶基因的組合可為較佳的(例如基於可獲自給定個體之定序資料，其表明各自存在於個體中)且接著組合在一起使用以使用表A或AACR GENIE結果鑑別共有新抗原序列以包涵在疫苗中。例示性突變及其匹配的HLA對偶基因展示於表32及34中。
舉例而言，對於KRAS_G13D，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G13D及C0802之所有列來選擇。
舉例而言，對於KRAS_Q61K或NRAS_Q61K，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61K及A0101；或(2) NRAS Q61K及A0101之所有列來選擇。
舉例而言，對於TP53_R249M，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_R249M及B3512、B3503及B3501中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於CTNNB1_S45P，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S45P以及A0101、A0301、B5701、A6801、A0302及A1101中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
舉例而言，對於CTNNB1_S45F，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S45F以及A0301、A1101及A6801中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於ERBB2_Y772_A775dup，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出ERBB2_Y772_A775dup及B1801之所有列來選擇。
舉例而言，對於KRAS_G12D或NRAS_G12D，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_G12D以及A1101及C0802中之至少一者；或(2) NRAS_G12D以及A1101及C0802中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
舉例而言，對於KRAS_Q61R或NRAS_Q61R，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61R及A0101；或(2) NRAS_Q61R及A0101之所有列來選擇。
舉例而言，對於CTNNB1_T41A，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_T41A以及A0301、A0302、A1101、B1510、C0303及C0304中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於TP53_K132N，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_K132N以及A2402及A2301中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
舉例而言，對於KRAS_G12A，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G12A及A0301之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
舉例而言，對於KRAS_Q61L或NRAS_Q61L，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61L及A0101；或(2) NRAS_Q61L及A0101之所有列來選擇。
舉例而言，對於TP53_R213L，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_R213L以及A0207、C0802及A0201中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於BRAF_G466V，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出BRAF_G466V以及B1501及B1503中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於KRAS_G12V，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G12V以及A0301、A1101、A3101、C0102及A0302中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
舉例而言，對於KRAS_Q61H或NRAS_Q61H，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61H及A0101；或(2) NRAS_Q61H及A0101之所有列來選擇。
舉例而言，對於CTNNB1_S37F，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S37F以及A2301、A2402、B1510、B3906、C0501、C1402及C1403中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於TP53_S127Y，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_S127Y以及A1101及A0301中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於TP53_K132E，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_K132E以及A2402、C1403及A2301中之至少一者之所有列來選擇。
舉例而言，對於KRAS_G12C或NRAS_G12C，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原或共有新抗原編碼序列，其中考慮用於包涵之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_G12C及A0201；或(2) NRAS_G12C及A0201之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。XIII . 實例電腦
電腦可用於計算本文所述之方法中之任一者。熟習此項技術者將認識到電腦可具有不同架構。電腦之實例為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中之電腦，該等公開案出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。XIV . 抗原遞送載體實例
下文為執行本發明之特定實施例之實例。該等實例僅出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已作出努力以確保所使用數字的精確性(例如，量、溫度等)，但一些實驗性誤差及偏差當然應為允許的。
除非另外指明，否則本發明將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、DNA重組技術及藥理學習知方法實施。此類技術在文獻中已充分解釋。參見例如T.E. Creighton,Proteins : Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.，現行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning : A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第 3 版 . (Plenum Press)第A卷及第B卷(1992)。XIV . A . 新抗原卡匣設計
可以經由疫苗接種遞送刺激相應細胞免疫反應之多個I類MHC限制性腫瘤特異性新抗原(TSNA)。在一個實例中，疫苗卡匣經工程改造而以單一基因產物形式編碼多個抗原決定基，其中該等抗原決定基係嵌入其天然的周圍肽序列內或藉由非天然連接子序列隔開。鑑別出會潛在地影響抗原加工及呈現且因此影響TSNA特異性CD8 T細胞反應之量值及廣度的若干設計參數。在本實例中，設計及構築出若干模型卡匣以評價：(1)是否可以針對併入單一表現卡匣中之多個抗原決定基產生穩定T細胞反應；(2)什麼使得最佳連接子置放於表現卡匣內之TSNA之間，引起所有抗原決定基之最佳加工及呈現；(3)該等抗原決定基在卡匣內之相對位置是否影響T細胞反應；(4)卡匣內抗原決定基之數量是否影響針對個別抗原決定基之T細胞反應的量值或品質；(5)添加細胞靶向序列是否改善T細胞反應。
產生兩個讀取結果以評價抗原呈現及對模型卡匣內之標記物抗原決定基具有特異性之T細胞反應：(1)活體外基於細胞之篩選，其允許藉由專門工程改造之報導體T細胞之活化進行衡量，來評估抗原呈現(Aarnoudse等人, 2002；Nagai等人, 2012)；及(2)使用HLA-A2轉殖基因小鼠(Vitiello等人, 1991)，藉由其相應抗原決定基特異性T細胞反應評估卡匣來源之人源抗原決定基之疫苗接種後免疫原性的活體內分析(Cornet等人, 2006； Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。XIV . B . 抗原卡匣設計評估 XIV . B . 1 . 方法與材料 TCR 及卡匣設計及選殖
當藉由A*0201呈現時，所選TCR識別肽NLVPMVATV(PDB# 5D2N)、CLGGLLTMV(PDB#3REV)、GILGFVFTL(PDB#1OGA)、LLFGYPVYV(PDB#1AO7)。構築含有2A肽連接之TCR次單元(β隨後為α)、EMCV IRES及2A連接之CD8次單元(β隨後為α及嘌呤黴素抗性基因)的轉移載體。對開放閱讀框架序列進行密碼子優化且由GeneArt合成。產生用於活體外抗原決定基加工及呈現研究的細胞株
肽係購自ProImmune或Genscript，在含10 mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之水/DMSO(2:8，v/v)中稀釋至10 mg/mL。除非另外指出，否則細胞培養基及補充劑係來自Gibco。熱滅活胎牛血清(FBShi)係來自Seradigm。QUANTI-Luc受質、吉歐黴素(Zeocin)及嘌呤黴素係來自InvivoGen。將Jurkat-Lucia NFAT細胞(InvivoGen)維持在補充有10% FBShi、丙酮酸鈉及100 µg/mL吉歐黴素之RPMI 1640中。轉導後，該等細胞立即另外接受0.3 µg/mL嘌呤黴素。在伊氏培養基(Iscove's Medium，IMDM)加20% FBShi中培養T2細胞(ATCC CRL-1992)。U-87 MG(ATCC HTB-14)細胞係維持在補充有10% FBShi之MEM伊格爾培養基(MEM Eagles Medium)中。
Jurkat-Lucia NFAT細胞含有NFAT誘發性Lucia報導體構築體。Lucia基因在藉由接合T細胞受體(TCR)活化時，將利用腔腸素之螢光素酶分泌至培養基中。此螢光素酶可使用QUANTI-Luc螢光素酶偵測試劑量測。Jurkat-Lucia細胞經慢病毒轉導以表現抗原特異性TCR。HIV源性慢病毒轉移載體係自GeneCopoeia獲得，且表現VSV-G之慢病毒輔助質體(support plasmid)(pCMV-VsvG)、Rev(pRSV-Rev)及Gag-pol(pCgpV)係自Cell Design Labs獲得。
藉由使用40 µl脂染胺及20 µg DNA混合物(以重量計4:2:1:1之轉移質體:pCgpV:pRSV-Rev:pCMV-VsvG)，用脂染胺2000(Thermo Fisher)轉染T75燒瓶中50-80%匯合之HEK293細胞，來製備慢病毒。使用Lenti-X系統(Clontech)濃縮8-10 mL含病毒之培養基，且使病毒再懸浮於100-200 µl新鮮培養基中。使用此體積覆蓋相等體積之Jurkat-Lucia細胞(在不同實驗中使用5×10E4-1×10E6細胞)。在含0.3 µg/ml嘌呤黴素之培養基中培養之後，分類細胞以獲得選殖性。使用裝載肽之T2細胞測試該等Jurkat-Lucia TCR純系之活性及選擇性。活體外抗原決定基加工及呈現分析
常規地使用T2細胞，藉由TCR檢查抗原識別。T2細胞缺乏用於抗原加工之肽轉運蛋白(TAP缺陷型)且不能在內質網中裝載內源性肽以在MHC上呈現。然而，T2細胞可輕易裝載有外源肽。將五種標記肽(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及兩種不相關肽(WLSLLVPFV、FLLTRICT)裝載於T2細胞上。簡言之，對T2細胞計數且用IMDM加1% FBShi稀釋至1×106 個細胞/毫升。添加肽以獲得10 µg肽/1×106 個細胞。隨後在37℃下將細胞培育90分鐘。用IMDM加20% FBShi洗滌細胞兩次，稀釋至5×10E5個細胞/毫升並將100 µL塗鋪至96孔Costar組織培養盤中。對Jurkat-Lucia TCR純系計數並在RPMI 1640加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/毫升，且將100 µL添加至T2細胞中。培養盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。接著以400 g離心培養盤3分鐘且將20 µL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTI-Luc受質係根據說明書製備且以每孔50 µL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。
為了測試腺病毒卡匣之標記物抗原決定基呈現，使用U-87 MG細胞作為替代抗原呈現細胞(APC)且用腺病毒載體轉導。收集U-87 MG細胞且以5×10E5個細胞/100 µl塗鋪於96孔Costar組織培養盤中之培養基中。在37℃培育培養盤約2小時。用MEM加10% FBShi將腺病毒卡匣稀釋至MOI 100、50、10、5、1及0且將其以每孔5 µl添加至U-87 MG細胞中。再在37℃下培育培養盤約2小時。對Jurkat-Lucia TCR純系計數且在RPMI加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/毫升，且將其以每孔100 µL添加至U-87 MG細胞中。接著，在37℃及5% CO2下培育培養盤約24小時。以400 g離心培養盤3分鐘且將20 µL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTI-Luc受質係根據說明書製備且以每孔50 µL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。用於免疫原性研究之小鼠品系
轉殖基因HLA-A2.1(HLA-A2 Tg)小鼠係自Taconic Labs, Inc獲得。該等小鼠攜帶由嵌合I類分子組成之轉殖基因，該嵌合I類分子包含人類HLA-A2.1前導序列、α1及α2結構域以及鼠類H2-Kb α3、跨膜及細胞質結構域(Vitiello等人, 1991)。用於此等研究之小鼠係基於C57Bl/6背景的野生型BALB/cAnNTac雌性及同型接合HLA-A2.1 Tg雄性的第一代後代(F1)。腺病毒載體 ( Ad5v ) 免疫接種
經由兩側肌肉內注射至脛前肌中對HLA-A2 Tg小鼠免疫接種1×1010 至1×106 個腺病毒載體病毒粒子。在免疫接種後12天量測免疫反應。淋巴球分離
自新鮮收集的經免疫接種小鼠之脾及淋巴結分離淋巴球。使用GentleMACS組織解離器，根據製造商的說明書，在含有10%胎牛血清以及青黴素及鏈黴素之RPMI(完全RPMI)中解離組織。離體酶聯免疫斑點 ( ELISPOT ) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則(Janetzki等人, 2015)，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將1×105 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤來淬滅反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。離體細胞內細胞因子染色 ( ICS ) 及流式細胞測量術分析
將2-5×106 個細胞/毫升密度的新鮮分離之淋巴細胞與10 μm指定肽一起培育2小時。兩小時之後，添加布雷菲爾德菌素A (brefeldin A)達到5 μg/ml濃度且將細胞與刺激劑一起再培育4小時。刺激之後，用可固定的死活細胞鑑定染料(fixable viability dye) eFluor780，根據製造商之方案標記活細胞，且用以1:400稀釋之抗CD8 APC(純系53-6.7, BioLegend)染色。以1:100使用抗IFNg PE (純系XMG1.2，BioLegend)以用於胞內染色。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Scientific)上收集樣品。使用FlowJo標繪對流式細胞測量術資料且分析。為了評估抗原特異性反應之程度，計算響應於各肽刺激劑的FNg+之CD8+細胞百分比及總IFNg+細胞數量/1×106 個活細胞。XIV . B . 2 . 抗原卡匣設計之活體外評價
作為抗原卡匣設計評價之實例，開發活體外基於細胞之分析以評估在模型疫苗卡匣內之所選人類抗原決定基是否經抗原呈現細胞表現、加工及呈現(圖1)。在識別後，經工程改造成表現五種對明確表徵之肽-HLA組合具有特異性之TCR之一的Jurkat-Lucia報告子T細胞變得活化且將活化T細胞核因子(NFAT)易位至核中，引起螢光素酶報導基因之轉錄活化。藉由生物發光定量個別報導體CD8 T細胞株之抗原刺激。
藉由用表現構築體轉導慢病毒來改良個別Jurkat-Lucia報導體株，該表現構築體包括藉由P2A核糖體跳躍序列(skip sequence)分離以確保等莫耳量轉譯產物之抗原特異性TCRβ及TCRα鏈(Banu等人, 2014)。將第二CD8 β-P2A-CD8 α元件添加至慢病毒構築提供親本報導體細胞株缺乏之CD8輔助受體之表現，因為細胞表面上之CD8對於與標靶pMHC分子之結合親和力至關重要且經由接合其胞質尾區促進信號傳導(Lyons等人, 2006；Yachi等人, 2006)。
在慢病毒轉導之後，使Jurkat-Lucia報告子在嘌呤黴素選擇下擴增，經歷單細胞螢光輔助細胞分類(FACS)且測試單株群之螢光素酶表現。由此得到具有功能性細胞反應的針對特定肽抗原1、2、4及5之穩定轉導之報導體細胞株。(表2)。表 2 ： 活體外T細胞活化分析之研究.如藉由螢光素酶之誘發所量測的肽特異性T細胞識別指示疫苗卡匣抗原之有效加工及呈現。
Figure 108117933-A0304-0003
 *尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞
在另一實例中，將一系列短卡匣、所有標記物抗原決定基併入同一位置(圖2A)中且僅改變分離HLA-A*0201限制性抗原決定基(圖2B)。報導體T細胞分別與U-87抗原呈現細胞(APC)混合，該等抗原呈現細胞經表現此等短卡匣之腺病毒構築體感染，且相對於未感染之對照量測螢光素酶表現。藉由匹配報導體T細胞識別模型卡匣中之全部四個抗原，展示多個抗原之有效加工及呈現。T細胞反應之量值在很大程度上遵循天然及AAY-連接子之類似趨勢。自基於RR-連接子之卡匣釋放的抗原顯示較低螢光素酶誘發(表3)。經設計以破壞抗原加工之DPP-連接子製造的疫苗卡匣引起較低抗原決定基呈現(表3)。表 3 ： 短卡匣中連接子序列之評價.在活體外T細胞活化分析中之螢光素酶誘發指示，除基於DPP之卡匣外，所有連接子均有助於卡匣抗原之有效釋放。僅T細胞抗原決定基(無連接子)=9AA，天然連接子一側=17AA，天然連接子兩側=25AA，非天然連接子=AAY、RR、DPP
Figure 108117933-A0304-0004
 * 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞
在另一實例中，構築另外一系列之短卡匣，該等卡匣除人類及小鼠抗原決定基外，亦含有定位於該卡匣之N或C端上的靶向序列諸如泛素(Ub)、MHC及Ig-κ信號肽（SP）及/或MHC跨膜(TM)基元。(圖3)。當藉由腺病毒載體遞送至U-87 APC時，報導體T細胞再次展示多個卡匣源性抗原之有效加工及呈現。不過，各種靶向特徵對於T細胞反應之量值無明顯影響(表4)。表 4 ： 添加至模型疫苗卡匣之細胞靶向序列的評價.採用活體外活化分析證實，四個HLA-A*0201限制性標記物抗原決定基自模型卡匣有效釋放且靶向序列沒有明顯改善T細胞識別及活化。
Figure 108117933-A0304-0005
 * 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞XIV . B . 3 . 抗原卡匣設計之 活體內評價
作為抗原卡匣設計評價之另一實例，疫苗卡匣經設計以含有5個已知以HLA-A*02:01限制性方式刺激CD8 T細胞的明確表徵之I類人類MHC抗原決定基(圖2A、3、5A)。為了評價活體內免疫原性，將含有該等標記物抗原決定基之疫苗卡匣併入腺病毒載體中並用於感染HLA-A2轉殖基因小鼠(圖4)。此小鼠模型攜帶的轉殖基因部分由人類HLA-A*0201及小鼠H2-Kb組成，因此編碼由人類HLA-A2.1前導序列、連接至鼠類α3之α1及α2結構域、跨膜及細胞質H2-Kb結構域組成的嵌合I類MHC分子(Vitiello等人, 1991)。該嵌合分子允許HLA-A*02:01限制性抗原呈現，同時維持CD8輔助受體與MHC上之α3結構域的物種相配之相互作用。
對與短卡匣，所有標記物抗原決定基均產生比已通常報導的強大約10-50倍之T細胞反應，如藉由IFN-γ ELISPOT所測定(Cornet等人, 2006；Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。在評價的所有連接子中，各自含有藉由天然胺基酸序列側接之極小抗原決定基的25聚體序列多聯體產生最大且最廣泛之T細胞反應(表5)。細胞內細胞介素染色(ICS)及流式細胞測量術分析揭示，抗原特異性T細胞反應係源自於CD8 T細胞。表 5 ：短卡匣中連接子序列之活體內評價. ELISPOT資料指示，HLA-A2轉殖基因小鼠在用1e11腺病毒病毒粒子感染後17天，針對卡匣中之所有I類MHC限制性抗原決定基產生T細胞反應。
Figure 108117933-A0304-0006
在另一實例中，構築一系列長疫苗卡匣並將其併入腺病毒載體中，其緊鄰著原始的5個標記物抗原決定基含有另外16個具有已知CD8 T細胞反應性之HLA-A*02:01、A*03:01及B*44:05抗原決定基(圖5A、B）。該等長卡匣之尺寸近似地模仿最終臨床卡匣設計，且僅抗原決定基相對於彼此之位置係不同的。對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，CD8 T細胞反應在量值及廣度方面係相當的，證實(a)添加更多抗原決定基不會顯著影響針對原始抗原決定基集合之免疫反應的量值，及(b)抗原決定基在卡匣中之位置不影響隨之而來的針對其之T細胞反應(表6)。表 6 ：有關長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價. ELISPOT指示，對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，HLA-A2轉殖基因小鼠在用5e10腺病毒病毒粒子感染後17天，產生之T細胞反應的量值相當。
Figure 108117933-A0304-0007
 *疑似技術失誤引起T細胞反應之缺乏。XIV . B . 4 . 用於免疫原性及毒理學研究之抗原卡匣設計
總體而言，有關模型卡匣評價之發現(圖2 -5，表2-6)證實，對於模型疫苗卡匣，當採用「串珠(string of beads)」法在基於腺病毒之載體的背景下編碼約20個抗原決定基時，實現強力的免疫原性。抗原決定基藉由串接25聚體序列組裝，該等序列各自嵌入在兩側上藉由其天然、周圍肽序列(例如在每一側上之8個胺基酸殘基)側接的極小CD8 T細胞抗原決定基(例如9個胺基酸殘基)。如本文所用，「天然」或「原生」側接序列係指給定抗原決定基在該抗原決定基處於其源蛋白質內之天然存在環境中的N及/或C端側接序列。舉例而言，HCMV pp65 MHC I抗原決定基NLVPMVATV係藉由原生5'序列WQAGILAR側接於其5'端上且藉由原生3'序列QGQNLKYQ側接於其3'端上，由此產生在HCMV pp65源蛋白質內發現的25聚體肽WQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ。天然或原生序列亦可指編碼藉由原生側接序列側接之抗原決定基的核苷酸序列。每個25聚體序列係直接連接至隨後之25聚體序列。在極小CD8 T細胞抗原決定基係大於或小於9個胺基酸之實例中，側接肽長度可以經調整以使得總長度仍為25聚體肽序列。舉例而言，10個胺基酸之CD8 T細胞抗原決定基可以藉由8個胺基酸之序列及7個胺基酸側接。多聯體之後為兩個通用的II類MHC抗原決定基，包括該等抗原決定基係為了刺激CD4 T輔助細胞及改善疫苗卡匣抗原之總體活體內免疫原性。(Alexander等人, 1994；Panina-Bordignon等人, 1989) II類抗原決定基係藉由GPGPG胺基酸連接子(SEQ ID NO:56)連接至最終I類抗原決定基。該兩個II類抗原決定基亦藉由GPGPG胺基酸連接子彼此連接且藉由GPGPG胺基酸連接子側接於C端上。看起來，抗原決定基之位置及數量基本上不影響T細胞識別或反應。靶向序列看起來亦基本上不影響卡匣源性抗原之免疫原性。
作為另一實例，基於用模型卡匣獲得的活體外及活體內資料(圖2-5，表2-6)，產生交替已知在非人類靈長類動物(NHP)、小鼠及人類中具有免疫原性的明確表徵之T細胞抗原決定基的卡匣設計。該全部嵌入天然25聚體序列中的20個抗原決定基之後係存在於所評價的所有模型卡匣中之兩個通用II類MHC抗原決定基(圖6)。使用此卡匣設計在多個物種中研究免疫原性以及藥理學及毒理學研究。XIV . B . 5 . 30 、 40 及50 種 抗原之抗原卡匣設計及評估
設計具有30 (L)、40 (XL)或50 (XXL)個抗原決定基之大抗原卡匣，各自為25個胺基酸長。抗原決定基係用以模擬包括腫瘤抗原之疾病抗原之人類、NHP及小鼠抗原決定基的混合。圖29說明來自各種物種之抗原決定基之一般組織。所使用之模型抗原分別對應於人類、靈長類動物及小鼠模型抗原決定基描述於表37、38及39中。表37、38及39中之每一者描述抗原決定基位置、名稱、最小抗原決定基描述及MHC類別。
將此等卡匣選殖於如所描述之chAd68及α病毒疫苗載體中以評估較長多抗原決定基卡匣之功效。圖30顯示，大抗原卡匣中之每一者自ChAdV載體表現，如藉由西方墨點法由至少一個預期尺寸之主要條帶指示。
如所描述對小鼠免疫接種以評估大卡匣之功效。藉由以下分析抗原決定基AH1 (上圖)及SINNFEKL (下圖)之T細胞反應：用chAd68載體免疫接種之後ICS及四聚體染色(分別為圖31/表40及圖32/表41)及用srRNA載體免疫接種之後ICS (圖33/表42)。使用表現30 (L)、40 (XL)或50 (XXL)個抗原決定基之chAd68及srRNA疫苗載體的免疫接種誘發對模型疾病抗原決定基之CD8+免疫反應。 表37-大卡匣中之人類抗原決定基
Figure 108117933-A0304-0008
 表38-大卡匣中之NHP抗原決定基
Figure 108117933-A0304-0009
 表39-大卡匣中之小鼠抗原決定基
Figure 108117933-A0304-0010
 表40：經ChAd大卡匣處理之小鼠中響應於AH1及SIINFEKL肽之平均IFNg+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準偏差以及p值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
Figure 108117933-A0304-0011
 表41：經ChAd大卡匣處理之小鼠中對應於AH1及SIINFEKL抗原之平均四聚體+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準偏差以及p值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
Figure 108117933-A0304-0012
 表42：經SAM大卡匣處理之小鼠中響應於AH1及SIINFEKL肽之平均IFNg+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準偏差以及p值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
Figure 108117933-A0304-0013
 XV . ChAd 抗原卡匣遞送載體 XV . A . ChAd 抗原卡匣遞送載體之構築
在一個實例中，將黑猩猩腺病毒(ChAd)工程改造成用於抗原卡匣之遞送載體。在另一實例中，基於缺失E1(nt 457至3014)及E3(nt 27,816-31,332)序列的AC_000011.1(來自專利US 6083716之序列2)合成全長ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下的報導基因代替缺失之E1序列。將此純系轉染至HEK293細胞中不會產生感染性病毒。為了確定野生型C68病毒之序列，自ATCC獲得分離株VR-594，傳代，且接著獨立地測序(SEQ ID NO: 10)。當將AC_000011.1序列與野生型ChAdV68病毒之ATCC VR-594序列(SEQ ID NO: 10)相比較時，鑑別出6個核苷酸差異。在一個實例中，基於相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置處經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO: 1)。
在另一實例中，基於缺失E1(nt 577至3403)及E3(nt 27,816-31,332)序列且相應ATCC VR-594核苷酸在四個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.4WTnt.GFP；SEQ ID NO: 11)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.4WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 12)代替缺失之E1序列。
在另一實例中，基於缺失E1(nt 577至3403)及E3(nt 27,125-31,825)序列且相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.5WTnt.GFP；SEQ ID NO: 13)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 2)代替缺失之E1序列。
相關載體在下文描述：
Figure 108117933-A0304-0014
 XV . B . ChAd 抗原卡匣遞送載體測試 XV . B . 1 . ChAd 載體評價之方法及材料 使用脂染胺轉染 HEK293A 細胞
使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)之DNA且將其轉染至HEK293A細胞中。
用PacI消化10 μg質體DNA以釋放病毒基因組。隨後使用GeneJet DNA清除微柱(Thermo Fisher)根據製造商對長DNA片段之說明書純化DNA，且在20 μL經預加熱之水中溶離；在溶離步驟之前將管柱在37度下靜置0.5-1小時。
在轉染之前，將HEK293A細胞以106 個細胞/孔之細胞密度引入6孔培養盤中，保持14-18小時。用每孔1 ml新鮮培養基(含青黴素/鏈黴素及麩胺酸之DMEM-10% hiFBS)覆蓋細胞。在根據製造商的方案，用微升體積(2-4 μl)脂染胺2000兩次轉染中使用每孔1-2 μg之純化DNA。將0.5 ml含有轉染混合物之OPTI-MEM培養基添加至各孔中之1 ml標準生長培養基中且在細胞上保持隔夜。
在37℃下培育經轉染之細胞培養物至少5-7天。若在轉染後第7天未見到病毒蝕斑，則將細胞以1:4或1:6分離，且在37℃下培育以監測蝕斑之產生。可替代地，收集經轉染之細胞且進行3個循環的冷凍及解凍，且使用細胞溶解產物感染HEK293A細胞且培育細胞直至觀察到病毒蝕斑。使用磷酸鈣將 ChAdV68 轉染至 HEK293A 細胞中且產生第三代病毒原液
使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)之DNA且將其轉染至HEK293A細胞中。
在轉染前一天，將HEK293A細胞以106 個細胞/孔接種於6孔盤之5% BS/DMEM/1XP/S、1XGlutamax中。每次轉染需要兩個孔。在轉染前二至四小時，將培養基更換成新鮮培養基。用PacI使ChAdV68.4WTnt.GFP質體線性化。接著，用酚氯仿提取經線性化之DNA且使用十分之一體積之3M乙酸鈉pH 5.3及兩體積之100%乙醇使其沈澱。藉由以12,000xg離心5分鐘使沈澱之DNA集結，隨後用70%乙醇洗滌1次。空氣乾燥集結粒且使其再懸浮於50 µL無菌水中。使用NanoDropTM (ThermoFisher)測定DNA濃度且將體積調整至5 µg DNA/50 µL。
將169 µL無菌水添加至微量離心管中。隨後將5 µL 2M CaCl2 添加至水且藉由移液輕緩地混合。將50 µL DNA逐滴添加至CaCl2 水溶液。接著添加二十六微升2M CaCl2 且藉由用微量移液管移液兩次小心地混合。此最終溶液應當由於250 µL 0.25M CaCl2 中之5 µg DNA組成。接著製備含有250 µL 2XHBS(Hepes緩衝溶液)之第二管。使用連接至Pipet-Aid空氣之2 mL無菌移液管緩慢鼓泡通過2XHBS溶液。同時，逐滴添加於0.25M CaCl2 溶液中之DNA溶液。在添加最終DNA液滴之後，繼續鼓泡約5秒。接著在室溫下培育溶液達20分鐘，隨後添加至293A細胞中。將250 µL DNA/磷酸鈣溶液逐滴添加至前一天以106 個細胞/孔接種於6孔盤中的293A細胞單層中。將細胞放回恆溫箱中且培育隔夜。24小時後更換培養基。72小時後，將細胞以1:6分至6孔盤中。每天藉由光學顯微鏡檢查監測細胞單層之細胞病變效應(CPE)之跡象。轉染後7-10天，觀察到病毒蝕斑且藉由用移液管移取孔中之培養基以使細胞升高來收集細胞單層。將收集之細胞及培養基轉移至50 mL離心管中，隨後進行三輪冷凍解凍(在-80℃及37℃下)。隨後之溶解產物，稱為初代病毒原液，藉由在桌上型離心機(4300Xg)上全速離心來澄清且使用一部分溶解產物(10-50%)感染T25燒瓶中之293A細胞。將感染之細胞培育48小時，隨後在完全CPE下收集細胞及培養基。再次收集細胞，冷凍解凍且澄清，隨後使用第二代病毒原液感染以每個燒瓶1.5×107 個細胞接種之T150燒瓶。在72小時實現完全CPE之後，以與先前病毒原液相同之方式收集且處理培養基及細胞以產生第三代原液。在 293F 細胞中之製造
在8% CO2 之恆溫箱中，在293 FreeStyleTM (ThermoFisher)培養基中生長之293F細胞中產生ChAdV68病毒。感染當天，將細胞稀釋至106 個細胞/毫升，且具有98%活力，且在每個生產週期於1L搖瓶(Corning)中使用400 mL。每次感染使用靶MOI ＞3.3之4 mL第三代病毒原液。將細胞培育48-72小時，直至藉由錐蟲藍量測到活力＜70%。接著，藉由全速桌上型離心機離心來收集及經感染細胞且在1×PBS中洗滌，再離心，且接著使其再懸浮於20 mL之10mM Tris pH7.4中。藉由冷凍解凍3次將細胞集結粒溶解且藉由以4,300Xg離心5分鐘使其澄清。藉由 CsCl 離心純化
藉由CsCl離心純化病毒DNA。進行兩次非連續梯度操作。第一次係自細胞組分中純化出病毒且第二次係自細胞組分進一步優化分離且將缺陷性粒子與感染性粒子分離。
將10 mL之1.2 (26.8g CsCl溶解於92 mL之10 mM Tris pH 8.0中) CsCl添加至異質同晶聚合物管中。接著，使用移液管遞送至管底部，小心地添加8 mL之1.4 CsCl (53g CsCl溶解於87 mL之10 mM Tris pH 8.0中)。將澄清之病毒小心地鋪在該1.2層之頂部上。必要時，再添加10 mM Tris以使各管平衡。接著將該等管置放於SW-32Ti旋轉器中且在10℃下離心2小時30分鐘。接著將該管移至層流櫃中且使用18號針及10 mL注射器抽吸病毒帶。應避免取出污染性宿主細胞DNA及蛋白質。接著用10 mM Tris pH 8.0將該病毒帶稀釋至少2倍且如前所述鋪在如上文所描述之不連續梯度上。如前所述進行操作，不過，此時進行該操作隔夜。次日，小心抽吸病毒帶以避免抽吸出任何缺陷性粒子帶。接著使用Slide-a-LyzerTM 盒(Pierce)針對ARM緩衝液(20 mM Tris pH 8.0、25 mM NaCl、2.5%丙三醇)透析病毒。對此操作進行3次，每次緩衝液交換1h。隨後對病毒等分以在-80℃下儲存。病毒分析
基於1.1×1012 個病毒粒子(VP)之消光係數相當於在OD260 nm下之吸光度值1，藉由使用OD 260分析測定VP濃度。在病毒溶解緩衝液(0.1% SDS、10 mM Tris pH 7.4、1 mM EDTA)中製備腺病毒之兩種稀釋液(1:5及1:10）。一式兩份量測該兩種稀釋液之OD且藉由用OD260值乘以稀釋因子乘以1.1× 1012 VP來量測每毫升VP濃度。
利用病毒原液之限制性稀釋分析來計算感染單位(IU)力價。病毒起初在DMEM/5%NS/1× PS中100倍稀釋且接著，使用10倍稀釋法稀釋至1×10- 7 。接著，將100 µL該等稀釋液添加至在之前至少一小時以3e5個細胞/孔接種於24孔盤中之293A細胞中。一式兩份地執行此操作。培養盤在37℃下在CO2 (5%)培育箱中培育48 h。接著用1×PBS洗滌細胞，且接著用100%冷甲醇(-20℃)固定。接著在-20℃下培育該等盤最少20分鐘。用1×PBS洗滌各孔，接著在室溫下，在1×PBS/0.1% BSA中阻斷1小時。添加兔抗Ad抗體(Abcam, Cambridge, MA)於阻斷緩衝液中之1:8,000稀釋液(每孔0.25 ml)且在室溫下培育1小時。用每孔0.5 mL PBS洗滌各孔4次。每孔添加1000倍稀釋的HRP偶聯之山羊抗兔抗體(Bethyl Labs, Montgomery Texas)且培育1小時，隨後進行最後一輪洗滌。進行5次PBS洗滌且使用於含0.01% H2 O2 之Tris緩衝生理食鹽水中的二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)受質(0.67 mg/mL DAB於50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl)使該等盤顯色。使各孔顯色5分鐘，隨後計數。使用產生每個視野4-40個經染色細胞之稀釋液，在10×下對細胞計數。所用視野係0.32 mm2 柵格，相當於在24孔盤上每個視野有625個柵格。可以藉由每個柵格中經染色細胞之數量乘以每個視野之柵格數量乘以稀釋因子10測定每毫升中感染性病毒之數量。類似地，當用GFP表現性細胞操作時，可以使用螢光而非衣殼染色來測定每毫升中GFP表現性病毒粒子之數量。免疫接種
經兩側肌肉內注射向C57BL/6J雌性小鼠及Balb/c雌性小鼠注射1×108 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積為100μL(每條腿50 μL)。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 ( ELISPOT ) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XV . B . 2 . 在 DNA 轉染之後 ChAdV68 病毒遞送粒子之製造
在一個實例中，將ChAdV68.4WTnt.GFP(圖7)及ChAdV68.5WTnt.GFP(圖8)DNA轉染至HEK293A細胞中且在轉染之後7-10天觀察病毒複製(病毒蝕斑)。使用光學顯微鏡檢查(圖7A及8A)及螢光顯微鏡檢查(圖7B-C及圖8B-C)觀測ChAdV68病毒蝕斑。GFP表示產毒ChAdV68病毒遞送粒子之產生。XV . B . 3 . ChAdV68 病毒遞送粒子擴增
在一個實例中，使ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒在HEK293F細胞中擴增且在轉染之後18天，製備純化之病毒原液(圖9)。定量經純化ChAdV68病毒原液中之病毒粒子數且與使用相同方案製造的5型腺病毒(Ad5)及ChAdVY25(密切相關之ChAdV；Dicks, 2012, PloS ONE 7, e40385)病毒原液相比較。ChAdV68病毒力價與Ad5及ChAdVY25相當(表7)。表 7 .在293F懸浮細胞中產生腺病毒載體
Figure 108117933-A0304-0015
 *SD僅在執行多個生產週期情況下報導XV . B . 4 . 評價在腫瘤模型中之免疫原性
在小鼠免疫原性研究中評價表現小鼠腫瘤抗原之C68載體以證實C68載體引起T細胞反應。在C57BL/6J雌性小鼠中量測針對MHC I類抗原決定基SIINFEKL之T細胞反應且在Balb/c小鼠中量測針對MHC I類抗原決定基AH1-A5(Slansky等人, 2000, Immunity13:529-538)之T細胞反應。如圖15 中所示，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種小鼠之後量測相對於對照之強烈的T細胞反應。當對C57BL/6J或Balb/c小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer時，在免疫接種之後10天，在ELISpot分析中分別觀察到每106 個脾細胞8957個或4019個斑點形成細胞(SFC)之平均細胞免疫反應。
亦在評估ChAdV及抗CTLA4抗體之共同投藥之CT26腫瘤模型中評估腫瘤浸潤性淋巴球。小鼠經植入CT26腫瘤細胞且在植入7天之後用ChAdV疫苗免疫接種且用抗CTLA4抗體(純系9D9)或IgG處理作為對照。在免疫接種12天之後分析腫瘤浸潤性淋巴球。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)及小鼠腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)解離來自各小鼠之腫瘤。經由30微米過濾器過濾解離細胞且使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。藉由MHC-四聚體複合物鑑別抗原特異性細胞且用抗CD8及生存力標記物共同染色。在初免免疫接種12天之後收集腫瘤。
腫瘤內之抗原特異性CD8+ T細胞細胞分別在經ChAdV、抗CTLA4及ChAdV+anti-CTLA4處理之群組中包含佔總存活細胞群之3.3%、2.2%或8.1%之中值(圖41及表45)。用抗CTLA與活性ChAdV免疫接種的組合處理相比於單獨ChAdV及單獨抗CTLA4兩者導致抗原特異性CD8+ T細胞頻率統計顯著增加，從而說明抗CTLA4在與chAd68疫苗共同投與時增加腫瘤內之浸潤性T細胞數目。 表45-CT26腫瘤中之四聚體+浸潤性CD8 T細胞頻率
Figure 108117933-A0304-0016
 XVI . α 病毒抗原卡匣遞送載體 XVI . A . α 病毒遞送載體評價之材料及方法 活體外轉錄以產生 RNA
對於 活體外測試 ： 藉由用PmeI限制性消化使質體DNA線性化，遵循製造商的方案(GeneJet DNA淨化套組, Thermo)進行管柱純化並用作模板。根據製造商的方案，使用RiboMAX大規模RNA生產系統(Promega)，利用m7 G帽類似物(Promega)進行活體外轉錄。根據製造商的方案，使用RNeasy套組(Qiagen)純化mRNA。 對於或體外研究： 產生RNA且由TriLInk Biotechnologies純化且用Enzymatic Cap1封端。RNA 轉染
在轉染之前約16小時，對於96孔以6e4個細胞/孔接種HEK293A細胞且對於24孔以2e5個細胞/孔接種。使用MessengerMAX脂染胺(Invitrogen)且遵循製造商之方案用mRNA轉染細胞。對於96孔，每孔使用0.15 μL脂染胺及10 ng mRNA，且對於24孔，每孔使用0.75 μL脂染胺及150 ng mRNA。GFP表現mRNA(TriLink Biotechnologies)用作轉染對照。螢光素酶分析
使用ONE-Glo螢光素酶分析(Promega)，遵循製造商的方案，在每種條件下於白色壁96孔盤中一式三份進行螢光素酶報導體分析。使用SpectraMax量測發光。qRT-PCR
在轉染後2小時，用新鮮培養基沖洗經轉染之細胞且更換培養基以移除任何未經轉染之mRNA。接著，在各種時間點，將細胞收集於RLT plus溶解緩衝液(Qiagen)中，使用QiaShredder(Qiagen)均質化且使用RNeasy套組(Qiagen)提取RNA，所有操作均遵循製造商的方案。使用Nanodrop (Thermo Scientific)量化總RNA。每次反應使用20 ng總RNA，使用Quantitect Probe One-Step RT-PCR套組(Qiagen)在qTower3 (Analytik Jena)上根據製造商之方案進行qRT-PCR。對於每個探針，一式三份地操作各樣品。肌蛋白或GusB用作參考基因。定製引子/探針係由IDT產生(表8)。表 8 . qPCR引子/探針
Figure 108117933-A0304-0017
 B16 - OVA 腫瘤模型
在C57BL/6J小鼠左下方側腹部中注射105 個B16-OVA細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長3天。CT26 腫瘤模型
在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。免疫接種
對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射10 μg RNA，體積100 μL(每條腿50 μL)。對於Ad5疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射5×1010 個病毒粒子(VP)，體積100 μL(每條腿50 μL)。每週2次，經由腹膜內注射向動物注射250 μg劑量的抗CTLA-4 (純系9D9, BioXcell)、抗PD-1 (純系RMP1-14, BioXcell)或抗IgG (純系MPC-11, BioXcell)。活體內生物發光成像
在每個時間點，經由腹膜內注射向小鼠注射150 mg/kg螢光素受質且在注射之後10-15分鐘，使用IVIS活體內成像系統(PerkinElmer)量測生物發光。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 ( ELISPOT ) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVI . B . α 病毒載體 XVI . B . 1 . α 病毒載體活體外評價
在本發明之一個實施方案中，由基於委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis，VEE)(Kinney, 1986, Virology 152: 400-413)之自我複製RNA(srRNA)載體產生用於抗原表現系統之RNA α病毒主鏈。在一個實例中，編碼位於26S亞基因組啟動子3'端的VEE結構蛋白之序列缺失(VEE序列7544至11,175缺失；編號基於Kinney等人1986；SEQ ID NO: 6)且經抗原序列(SEQ ID NO:14及SEQ ID NO: 4)或螢光素酶報導體(例如VEE-螢光素酶，SEQ ID NO: 15)替換(圖10)。由srRNA DNA載體活體外轉錄RNA，將其轉染至HEK293A細胞中且量測螢光素酶報導體表現。此外，用編碼螢光素酶之(非複製性) mRNA轉染以供比較。當比較23小時量測值與2小時量測值時，對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到srRNA報導體信號有約30,000倍增加(表9)。相比之下，在相同時間段內，mRNA報導體展現＜10倍之信號增加(表9)。表 9 .來自VEE自我複製載體之螢光素酶的表現隨時間增加. 在96孔中用每孔10 ngVEE-螢光素酶srRNA或10 ng非複製性螢光素酶mRNA(TriLinkL-6307)轉染HEK293A細胞。在轉染後各時間量測螢光。螢光素酶表現以相對螢光單位(RLU)報導。每個資料點係3個轉染孔之平均值+/-SD。
Figure 108117933-A0304-0018
在另一實例中，藉由使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)量測編碼螢光素酶之srRNA(VEE-螢光素酶)或編碼多抗原決定基卡匣之srRNA(VEE-MAG25mer)轉染之後的RNA含量來直接確定srRNA之複製。對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到約150倍的RNA增加(表10），而對於VEE-MAG25mer srRNA觀察到30-50倍的RNA增加(表11)。該等資料證實，當轉染至細胞中時，VEE srRNA載體複製。表 10 . VEE-螢光素酶srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測. 用VEE-螢光素酶srRNA(150 ng/孔，24孔)轉染HEK293A細胞且在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於肌動蛋白參考基因使各量測值標準化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。
Figure 108117933-A0304-0019
 表 11 .VEE-MAG25mer srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測.用VEE-MAG25mer srRNA(150 ng/孔，24孔)轉染HEK293細胞且在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於GusB參考基因使各量測值標準化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。圖上的不同線表示2個不同的qPCR引子/探針集，該兩個集合均偵測srRNA之抗原決定基卡匣區。
Figure 108117933-A0304-0020
 XVI . B . 2 . α 病毒載體之活體內評價
在另一實例中，在活體內評價VEE-螢光素酶報導體表現。對小鼠注射10 μg封裝於脂質奈米粒子(MC3)中之VEE-螢光素酶srRNA且在注射後24小時及48小時，以及7天及14天使其成像以測定生物發光信號。在注射後24小時偵測到螢光素酶信號且其隨時間增加，且在srRNA注射之後7天出現峰值(圖11)。XVI . B . 3 . α 病毒載體腫瘤模型評價
在一個實施方案中，為了確定VEE srRNA載體在活體內引導抗原特異性免疫反應，產生表現2種不同I類MHC小鼠腫瘤抗原決定基SIINFEKL及AH1-A5之VEE srRNA載體(VEE-UbAAY，SEQ ID NO: 14)(Slansky等人, 2000, Immunity 13:529-538)。利用B16-OVA黑素瘤細胞株表現SFL(SIINFEKL)抗原決定基，且AH1-A5(SPSYAYHQF；Slansky等人, 2000, Immunity)抗原決定基誘發T細胞靶向由CT26結腸癌細胞株表現之相關抗原決定基(AH1/SPSYVYHQF；Huang等人, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:9730-9735)。在一個實例中，對於活體內研究，藉由使用T7聚合酶(TriLink Biotechnologies)活體外轉錄來產生VEE-UbAAY srRNA且將其封裝於脂質奈米粒子(MC3)中。
在用MC3調配之VEE-UbAAY srRNA免疫接種帶有B16-OVA腫瘤之小鼠之後兩週，觀察到相對於對照，靶向SFL的強烈抗原特異性T細胞反應。在一個實例中，在用SFL肽刺激之後，在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3835個(中值)斑點形成細胞(SFC) (圖12A，表12)且如藉由五聚體染色所量測，1.8%(中值)之CD8 T細胞具有SFL抗原特異性(圖12B，表12)。在另一實例中，共投與抗CTLA-4單株抗體(mAb)及VEE srRNA疫苗引起總體T細胞反應之中度增加，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞的4794.5個(中值)SFC (圖12A，表12)。表 12 .在帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠中VEE srRNA免疫接種後14天ELISPOT及MHCI-五聚體染色分析之結果.
Figure 108117933-A0304-0021
 *應注意 ， 自Vax 組中小鼠 #6 得到的結果由於三個重複孔之間變化較大而自分析排除。
在另一實施方案中，為反映臨床方法，在B16-OVA及CT26小鼠腫瘤模型中進行異源初免/增強免疫，其中帶有腫瘤之小鼠先用表現相同抗原卡匣之腺病毒載體(Ad5-UbAAY)免疫接種，隨後在Ad5-UbAAY初免之後14天，用VEE-UbAAY srRNA疫苗增強免疫。在一個實例中，藉由Ad5-UbAAY疫苗誘發抗原特異性免疫反應，由此在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞7330個(中值)SFC(圖13A ，表13)且藉由五聚體染色量測到2.9%(中值)之CD8 T細胞靶向SFL抗原(圖13 C，表13)。在另一實例中，在VEE-UbAAY srRNA增強免疫之後2週，B16-OVA模型中仍維持T細胞反應，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3960個(中值)SFL特異性SFC(圖13 B，表13）且藉由五聚體染色量測到3.1%(中值)之CD8T細胞靶向SFL抗原(圖13 D，表13）。表 13 .用Ad5疫苗初免及srRNA增強免疫進行異源初免/增強免疫之後B16-OVA小鼠之免疫監測.
Figure 108117933-A0304-0022
在另一實施方案中，在Ad5-UbAAY初免及VEE-UbAAY srRNA增強免疫之後，在CT26小鼠模型中觀察到類似結果。在一個實例中，在Ad5-UbAAY初免(第14天)之後觀察到AH1抗原特異性反應且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均5187個SFC(圖14 A，表14)且在VEE-UbAAY srRNA增強免疫(第28天)之後於ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均3799個SFC(圖14 B，表14)。表 14 .在CT26腫瘤小鼠模型中異源初免/增強免疫之後的免疫監測.
Figure 108117933-A0304-0023
 XVII . ChAdV / srRNA 組合腫瘤模型評價
在鼠類CT26腫瘤模型中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。XVII . A ChAdV / srRNA 組合腫瘤模型評價之方法及材料 腫瘤注射
對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。腫瘤細胞注射之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組(28-40隻小鼠/組)且開始治療。在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。研究組詳細地描述於表15中。 表15-ChAdV/srRNA組合腫瘤模型評價研究組
Figure 108117933-A0304-0024
 免疫接種
對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射10 μgVEE-MAG25mer srRNA，體積100 μL(每條腿50 μL)。對於C68疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射1×1011 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積100 μL(每條腿50 μL)。每週2次，經由腹膜內注射對動物注射250 μg劑量的抗PD-1(純系RMP1-14，BioXcell)或抗IgG(純系MPC-11，BioXcell)。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 ( ELISPOT ) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVII . B 在 CT26 腫瘤模型中 ChAdV / srRNA 組合之評價
在CT26小鼠腫瘤模型中評價ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫或VEE-MAG25mer srRNA同源初免/增強免疫疫苗之免疫原性及功效。對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。注射腫瘤細胞之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組且開始治療。研究組詳細地描述於表15中且較粗略地描述於表16中。 表16-初免/增強免疫研究組
Figure 108117933-A0304-0025
在初始疫苗接種之後14天收集脾進行免疫監測。一週兩次獲取腫瘤及體重量測值且監測存活情況。在所有活性疫苗組中觀察到強烈的免疫反應。
在第一次免疫接種之後14天，在ELISpot分析中，在分別免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer(ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(ChAdV+PD-1/第4組)、VEE-MAG25mer srRNA(srRNA/第5組與第7組之組合之中值)或VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中觀察到每106 個脾細胞10,630個、12,976個、3319個或3745個斑點形成細胞(SFC)之中值細胞免疫反應(圖16及表17)。相比之下，疫苗對照(第1組)或疫苗對照與抗PD-1之組合(第2組)分別展現每106 個脾細胞296個或285個SFC之中值細胞免疫反應。 表17-在CT26腫瘤模型中之細胞免疫反應
Figure 108117933-A0304-0026
與ELISpot資料相符，在第一次免疫接種之後14天，免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer(ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(ChAdV+PD-1/第4組)、VEE-MAG25mer srRNA(srRNA/第5組與第7組之組合之中值)或VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中分別有5.6%、7.8%、1.8%或1.9%之CD8 T細胞(中值)在細胞內細胞介素染色(ICS)分析中展現抗原特異性反應(圖17及表18）。免疫接種疫苗對照或疫苗對照與抗PD-1之組合的小鼠分別顯示0.2%及0.1%之抗原特異性CD8反應。 表18-在CT26腫瘤模型中之CD8 T細胞反應
Figure 108117933-A0304-0027
在CT26結腸腫瘤模型中量測所有組之腫瘤生長情況，且到開始治療後21天(注射CT-26腫瘤細胞之後28天)，出現腫瘤生長。在開始治療後21天，基於較大腫瘤尺寸(＞2500 mm3 )處死小鼠；因此，僅呈現前21天以避免分析偏差。ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫+抗PD-1(第4組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫(第5組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫+抗PD-1(第6組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第7組)及VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫+抗PD-1(第8組)在21天時的平均腫瘤體積分別為1129、848、2142、1418、2198及1606 mm3 (圖18 及表19)。疫苗對照疫苗對照與抗PD-1之組合的平均腫瘤體積分別為2361或2067 mm3 。基於該等資料，用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA(第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(第4組)、VEE-MAG25mer srRNA/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(第6組)及VEE-MAG25mer srRNA/VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(第8組)之疫苗治療在21天時引起腫瘤生長減慢，明顯不同於對照(第1組)。 表19-第21天量測之CT26模型之腫瘤尺寸
Figure 108117933-A0304-0028
在CT-26腫瘤模型中，在開始治療後，監測存活情況35天(注射CT-26腫瘤細胞之後42天)。在小鼠疫苗接種4個測試組合之後，觀察到存活率提高。在疫苗接種之後，利用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫與抗PD-1之組合(第4組；相對於對照組1，P＜0.0001)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫與抗PD-1之組合(第8組；相對於對照組1，P=0.0006)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第3組；相對於對照組1，P=0.0003)VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫與抗PD-1之組合(第6組；相對於對照組1，P=0.0016)之小鼠的存活率分別為64%、46%、41%及36%(圖19及表20)。其餘治療組[VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫(第5組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第7組)及單獨抗PD-1(第2組)]的存活率與對照組1無明顯不同(≤14%)。 表20-CT26模型中之存活率
Figure 108117933-A0304-0029
總之，相對於對照，ChAdV68.5WTnt.MAG25mer及VEE-MAG25mer srRNA引起針對由疫苗編碼之小鼠腫瘤抗原的強烈T細胞反應。向帶有腫瘤之小鼠投與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免及VEE-MAG25mer srRNA增強免疫且共投與或不共投與抗PD-1、投與VEE-MAG25mer srRNA初免及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫與抗PD-1之組合或投與VEE-MAG25mer srRNA同源初免增強免疫與抗PD-1之組合使存活率提高。XVIII . 非人類靈長類動物研究
在非人類靈長類動物(NHP)中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。材料及方法
向各NHP中肌肉內(IM)注射初免疫苗以起始研究(疫苗初免)。亦向各NHP中肌肉內注射一或多種增強免疫疫苗(疫苗增強免疫)。根據表中概述之組，投與每劑兩側注射液且在下文概述。免疫接種
對Mamu-A*01印度恆河猴兩側免疫接種以LNP-1或LNP-2調配之1×1012 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(每側注射5×1011 個病毒粒子)、30 μg VEE-MAG25MER srRNA、100 μg VEE-MAG25mer srRNA或300 μgVEE-MAG25mer srRNA。在初始疫苗接種後指定時間之時，經肌肉內投與30 μg、100 μg或300 μg VEE-MAG25mer srRNA。免疫監測
在初始疫苗接種後指定時間之時，使用淋巴球分離培養基(Lymphocyte Separation Medium，LSM；MP Biomedicals)及LeucoSep分離管(Greiner Bio-One)分離PBMC且使其再懸浮於含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。對於研究中的每隻猴，使用ELISpot或流式細胞測量方法量測T細胞反應。藉由使用離體酶聯免疫斑點(ELISpot)分析量測諸如IFN-γ之細胞介素之誘發來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基之T細胞反應。ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用猴IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將200,000個PBMC與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。
藉由使用流式細胞測量術量測諸如IFN-γ之細胞內細胞介素之誘發來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基的特異性CD4及CD8 T細胞反應。由兩種方法得到的結果指示，以抗原特異性方式誘發針對抗原決定基之細胞介素。恆河猴之免疫原性
本研究亦設計用於(a)評價30 µg及100 µg劑量VEE-MAG25mer srRNA以同源初免/增強免疫形式與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之組合的免疫原性及初步安全性；(b)比較在使用LNP1相對LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應；及(c)評價針對VEE-MAG25mer srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種之T細胞反應的動力學。
此研究組係在Mamu-A*01印度恆河猴中進行以展示免疫原性。選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之抗原。將Mamu-A*01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻獼猴/組)且經兩側IM注射投與編碼包括多個Mamu-A*01限制性抗原決定基之模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA載體。研究組如下所述。表 21 ：印度恆河猴之非GLP免疫原性研究
Figure 108117933-A0304-0030
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週及第10週收集PBMC以供免疫監測。結果
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週及10週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測周邊血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應。動物在第4週及第8週接受30 µg或100 µg劑量且以LNP1或LNP2調配之VEE-MAG25mer srRNA之增強免疫接種，如表21中所描述。標繪在各免疫監測時間點下針對全部六個抗原決定基之組合免疫反應(圖20 A-D及表22-25)。
在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30 µg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 170、14、15、11、7、8、14、17、12個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 A)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100 µg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 108、-3、14、1、37、4、105、17、25個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 B)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP2 (100 µg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC -17、38、14、-2、87、21、104、129、89個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 C)。負值係各抗原決定基/動物之相對於放血前值之標準化的結果。
在初始ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 1218、1784、1866、973、1813、747、797、1249及547個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20B)。免疫反應顯示出預期之型態，其中在初始免疫接種之後約2 -3週量測到峰值免疫反應，隨後在4週之後免疫反應縮減。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後5週(亦即，在用VEE-MAG25mer srRNA第一增強免疫之後1週)量測到每106 個PBMC 1813個SFC之組合的抗原特異性細胞免疫反應(六個抗原決定基組合)。在用VEE-MAG25mer srRNA第一增強免疫之後1週(第5週)量測到之免疫反應與針對ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免免疫接種(第3週)量測到之峰值免疫反應相當(圖20 D)。分別在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後9週(亦即，用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫之後1週)量測到每106 個PBMC 1249個SFC之組合的抗原特異性細胞免疫反應(六個抗原決定基組合)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫之後1週(第9週)量測到之免疫反應比臨在增強免疫接種之前量測到之免疫反應高約2倍(圖20 D)。表 22 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30 µg)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM(第1組)
Figure 108117933-A0304-0031
 表 23 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100 µg)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM(第2組)
Figure 108117933-A0304-0032
 表 24 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100 µg)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM(第3組)
Figure 108117933-A0304-0033
 表 25 ：對於ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
Figure 108117933-A0304-0034
 印度恆河猴中之非 RNA 劑量範圍研究 ( 較高劑量 )
本研究亦設計用於(a)評價300 µg劑量VEE-MAG25mer srRNAat以同源初免/增強免疫或異源初免/增強免疫形式與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之組合的免疫原性及初步安全性；(b)比較在使用300 µg劑量LNP1與LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應；及(c)評價針對VEE-MAG25mer srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種之T細胞反應的動力學。
此研究組係在Mamu-A*01印度恆河猴中進行以展示免疫原性。在諸如恆河猴之非人類靈長類動物物種中之疫苗免疫原性係在人體中疫苗效力之最佳預測器。此外，選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之抗原。將Mamu-A*01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻獼猴/組)且經兩側IM注射投與編碼包括多個Mamu-A*01限制性抗原之模型抗原的ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA。研究組如下所述。
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21週、第22週、第23週或24週收集PBMC以供第1組(異源初免/增強免疫)之免疫監測。在初始免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週或第15週收集PBMC以供第2組及第3組(同源初免/增強免疫)之免疫監測。表 26 ：印度恆河猴之非GLP免疫原性研究
Figure 108117933-A0304-0035
 結果
用ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer免疫接種Mamu-A*01印度恆河猴。在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21週、第22週、第23週或第24週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測周邊血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應(圖21及表27)。動物在第4週、第12週及第20週接受用使用LNP2調配物之VEE-MAG25mer srRNA增強免疫接種。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21週、第22週、第23週或第24週量測到每106 個PBMC 1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828或3043個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖21)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫接種之後1週(第13週)量測到之免疫反應比在臨增強免疫接種之前(第12週)量測到之免疫反應高約3倍。在用VEE-MAG25mer srRNA第三增強免疫接種之後1週(第21週)量測到之免疫反應比在臨增強免疫接種之前(第20週)量測到之免疫反應高約3倍，類似於針對第二增強免疫觀測到之反應。
Mamu-A*01印度恆河猴亦用使用兩種不同LNP調配物(LNP1及LNP2)之VEE-MAG25mer srRNA免疫接種。在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週或第15週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測周邊血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應(圖22及23，表28及29)。動物在第4週及第12週接受用使用各別LNP1或LNP2調配物之VEE-MAG25mer srRNA增強免疫接種。在用VEE-MAG25mer srRNA-LNP2免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第13週、第14週、第15週量測到每106 個PBMC 168、204、103、126、140、145、330、203及162個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖22)。在用VEE-MAG25mer srRNA-LNP1免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週量測到每106 個PBMC 189、185、349、437、492、570、233、886、369及381個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖23)。表 27 ：對於用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初打疫苗接種各抗原決定基之每106 個PBMC之平均光點形成細胞(SFC)數±SEM(第1組)
Figure 108117933-A0304-0036
 表 28 ：對於用VEE-MAG25mer srRNA-LNP2 (300 µg)初打疫苗接種各抗原決定基之每106 個PBMC之平均光點形成細胞(SFC)數±SEM(第2組)
Figure 108117933-A0304-0037
 表 29 ：對於用VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (300 µg)初打疫苗接種各抗原決定基之每106 個PBMC之平均光點形成細胞(SFC)數±SEM(第3組)
Figure 108117933-A0304-0038
 srRNA 劑量範圍研究
在本發明之一個實施方案中，可在mamu A01印度恆河猴中進行srRNA劑量範圍研究以鑑別用於NHP免疫原性研究之srRNA劑量。在一個實例中，可藉由IM注射向Mamu A01印度恆河猴投與編碼包括多個mamu A01限制性抗原決定基之模型抗原的srRNA載體。在另一實例中，可靠近IM疫苗注射部位投與抗CTLA-4單株抗體以靶向一組動物中之疫苗引流淋巴結。可在初始疫苗接種之後每2週收集PBMC以供免疫監測。研究組描述於下文中(表30)。表 30 ： 印度恆河猴中之非GLP RNA劑量範圍研究
Figure 108117933-A0304-0039
 * 待以高劑量≤300 μg測定之srRNA之劑量範圍。印度恆河猴中之免疫原性研究
在mamu A01印度恆河猴(NHP)中進行疫苗研究以說明使用抗原載體之免疫原性。圖34說明疫苗接種策略。三組NHP經免疫接種ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer且免疫接種檢查點抑制劑抗CTLA-4抗體伊匹單抗(第5組及第6組)或不免疫接種檢查點抑制劑(第4組)。該抗體經靜脈內(第5組)或皮下(第6組)投與。三角形指示第0週及第32週之chAd68疫苗接種(1e12 vp/動物)。圓形表示第0週、第4週、第12週、第20週、第28週及第32週之α病毒疫苗接種。
呈現在經免疫接種之NHP中對應於單獨chAd-MAG免疫接種(圖35及表31A)、IV遞送之chAd-MAG免疫接種與檢查點抑制劑(圖36及表31B)，以及SC遞送之chAd-MAG免疫接種與檢查點抑制劑(圖37及表31C)的CD8+抗抗原決定基反應之時程。結果表明，chAd68載體有效激活靈長類動物中之CD8+反應，α病毒載體有效增強chAD68疫苗初免反應，檢查點抑制劑無論IV還是SC遞送均增幅初免及增強免疫反應，且在疫苗接種後再投與chAd載體以有效增強免疫反應。表 31A ：用chAd-MAG給藥之恆河猴中之CD8+抗抗原決定基反應(第4組).展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
Figure 108117933-A0304-0040
 表 31B ：IV遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應.(第5組).展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
Figure 108117933-A0304-0041
 表 31C ：SC遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應.(第6組).展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
Figure 108117933-A0304-0042
 印度恆河猴中之記憶表型
恆河猴經免疫接種具有或不具有抗CTLA4之ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫方案，且再次用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer加打。在最終ChAdV68投藥之後11個月評估各組(研究第18個月)。如圖38及表43所描述進行之ELISpot顯示在免疫接種前(左圖)及18個月之後(右圖)如藉由ELISpot所量測之對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基之細胞反應。對限制性抗原決定基之反應的偵測表明，抗原特異性記憶反應由ChAdV68/samRNA疫苗方案產生。
為評估記憶，使用雙色Mamu-A*01四聚體標記監測識別在疫苗中編碼之4種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基的CD8+ T細胞，其中各抗原由獨特的雙陽性組合表示，且允許鑑別單個樣品內之所有4個抗原特異性群體。藉由用細胞表面標誌物CD45RA及CCR7共同染色來進行記憶細胞表型。圖39及表44展示識別四種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基之記憶T細胞之組合四聚體染色及CD45RA/CCR7共同染色的結果。T細胞表型亦藉由流式細胞量測術評估。圖40展示在研究第18個月時四個Mamu-A*01四聚物+CD8+ T細胞群體之總和內記憶細胞類型之分佈。記憶細胞表徵如下：CD45RA+CCR7+=初始，CD45RA+CCR7-=效應(Teff)，CD45RA-CCR7+=中央記憶(Tcm)，CD45RA-CCR7-=效應記憶(Tem)。總體而言，結果表明，在最後一次增強免疫之後至少一年偵測到記憶反應，從而表明持久的免疫性，包括效應、中央記憶及效應記憶群體。 表43在初免前及記憶評估時間點(第18月)各動物之每106 個PBMC的平均斑點形成細胞(SFC).
Figure 108117933-A0304-0043
 ND=由於技術排除未測定 表44來自存活CD8+細胞之Mamu-A*01四聚體陽性%
Figure 108117933-A0304-0044
 XIX . 鑑別 MHC / 肽標靶反應性 T 細胞及 TCR
鑑別標靶反應性T細胞及TCR之表A、AACR GENIE結果及/或表1.2中所描述之一或多種抗原/HLA肽對 (參見SEQ ID NO: 57-29,357及下文) 。
可自患者之血液、淋巴結或腫瘤分離T細胞。可例如藉由分類抗原-MHC四聚體結合細胞或藉由分類在T細胞與抗原脈衝之抗原呈現細胞之共培養物中刺激的經活化之細胞富集T細胞以獲得抗原特異性T細胞。此項技術中已知用於抗原特異性T細胞鑑別之各種試劑，包括裝載抗原之四聚體及其他基於MHC之試劑。
可藉由對抗原特異性T細胞之TCR單細胞定序鑑別抗原相關之α-β (或γ-δ) TCR二聚體。可替代地，可進行對抗原特異性T細胞之批量TCR定序且可使用此項技術中已知之TCR配對方法確定具有高匹配機率之α-β對。
可替代地或另外，抗原特異性T細胞可經由活體外激活來自健康供體之初始T細胞來獲得。可藉由抗原脈衝之抗原呈現細胞重複刺激獲自PBMC、淋巴結或臍帶血之T細胞以激活有抗原經歷之T細胞的分化。隨後可如上文針對來自患者之抗原特異性T細胞所述類似地鑑別TCR。XX . 鑑別共有新抗原
吾等使用一系列步驟鑑別共有新抗原。吾等自COSMIC資料庫獲得一系列分類為「經體細胞突變」之常見驅動突變。對於每個突變，吾等生成候選新抗原決定基(8至11-聚體肽)，使用100個TPM，且對所有經模型化之HLA對偶基因操作吾等EDGE預測模型(對藉由MS/MS定序之HLA呈現肽訓練的深度學習模型，如國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中所描述，該等公開案出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中)。應注意，各肽含有至少一個突變胺基酸且並非自體肽。吾等隨後記錄具有EDGE評分＞0.001之HLA對偶基因的任何肽。結果展示於表A中。因此鑑別到總計10261個共有新抗原序列且描述於SEQ ID NO: 10,755-21,015中。展示各序列之相應HLA對偶基因。
進一步分析表A中提供之初始清單之在患者群體中的新抗原/HLA發生率之水準。「抗原/HLA發生率」經計算為在給定群體中之抗原頻率(A)乘以在給定群體中之HLA對偶基因頻率(B)。抗原/HLA發生率亦可係指突變/HLA發生率或新抗原/HLA發生率。作為此分析之部分，對於各突變，在TCGA中獲得其在常見腫瘤類型中之(A)頻率且以其在腫瘤類型之中的最高頻率記錄。(B)對於EDGE中之各HLA對偶基因，記錄HLA對偶基因頻率TCGA (主要為高加索人群體)。HLA對偶基因頻率更詳細地描述於出於所有目的以引用之方式併入本文中之Shukla, S. A.等人 (Nat . Biotechnol . 33 , 1152-1158 2015)中。新抗原/HLA發生率經計算為(A)乘以(B)。表A中使用此方法獲得之＞0.1%發生率之任何新抗原決定基/HLA均鑑別為「最常見1」 (2387/10261)。
另外，吾等表徵大型患者樣品組中癌症驅動突變之發生率，該等患者樣品代表與可能的臨床研究相關之晚期癌症患者群體。使用公開發佈之AACR Genie v4.1資料集進行EDGE預測，該資料集具有在範圍介於50至500種基因之NGS癌症基因面板上定序之超過40,000名患者，來自主要學術癌症中心，包括Dana-Farber、Johns Hopkins、MD Anderson、MSKCC及Vanderbilt。吾等選擇肺癌、微衛星穩定結腸癌及胰臟癌中之鹼基取代及插入缺失突變，且需要在多個基因面板中之覆蓋率。吾等分析與吾等EDGE抗原呈現預測模型中所涵蓋之超過90個I類HLA對偶基因中之每一者成對的每個新抗原肽且記錄HLA呈現評分之EDGE機率＞0.001之抗原決定基及相應HLA對偶基因。吾等隨後測定EDGE評分＞0.001之彼等肽之新抗原/HLA發生率，該發生率經計算為A*B，其中A係在三種腫瘤類型之中突變之最高頻率且B係HLA對偶基因頻率。吾等藉由檢驗來自TCGA群體之HLA對偶基因及列表顯示各HLA對偶基因之頻率，由此使用代表美國群體之HLA對偶基因頻率(Shukla, S. A.等人)。分析中顯示新抗原/HLA發生率＞0.01%之肽及相應HLA對偶基因描述於SEQ ID NO:21,016-29,357中且稱為AACR GENIE結果。XXI . 驗證共有新抗原呈現
使用靶向質譜分析方法進行候選共有新抗原之質譜分析(MS)驗證。接近500個冷凍切除肺、結腸直腸及胰臟腫瘤樣品經均勻化且用於HLA/肽複合物之RNASeq轉錄組定序及免疫沈澱。藉由分析轉錄組生成各樣品之肽標靶清單，藉此鑑別如AACR Genie v4.1資料集中所定義之復發性癌症驅動突變且評估RNA表現量。隨後將抗原呈現之EDGE模型應用於突變序列及表現資料以對靶向清單之肽優先排序。在質譜分析之前使用尺寸排阻溶離且收集HLA分子之肽以分離呈現肽。使具有相同胺基酸序列之合成重標記肽與各樣品共同裝載以進行靶向質譜分析。吾等使用重標記肽與實驗肽之共同溶離以及碎斷圖示之分析驗證候選抗原決定基。質譜分析方法更詳細地描述於出於所有目的以全文引用之方式併入本文中的Gillete等人 (Nat Methods . 2013年1月;10(1):28-34)中。下表32概述以此方式驗證，具有足夠發生率以供進一步考慮之來自驅動突變之共有新抗原抗原決定基，以及樣品腫瘤類型及相關HLA對偶基因。
Figure 108117933-A0304-0045
 * 當預測同一肽由患者之多個HLA對偶基因呈現且由MS/MS偵測時，推斷其由藉由EDGE之最高評分HLA對偶基因呈現或在評分足夠接近時由兩個對偶基因呈現
吾等進一步評估相對於未偵測到肽之突變之MS資料以便評估用於治療之具有特異性HLA之針對目標患者，例如需要患者具有至少一個呈現包含於疫苗卡匣中之新抗原之經驗證或預測之HLA對偶基因。
舉例而言，就KRAS而言，吾等計數其中偵測到或未偵測到特定HLA對偶基因之KRAS抗原決定基肽之患者樣品數目。(當預測同一肽由患者之多個HLA對偶基因呈現且由MS/MS偵測時，推斷其由藉由EDGE之最高評分HLA對偶基因呈現或在評分足夠接近時由兩個對偶基因呈現)。結果呈現於表33中。基於此等結果，預期若干常見HLA對偶基因不會呈現給定KRAS新抗原且出於此實例中疫苗卡匣設計及患者選擇之選擇標準的目的可排除此等KRAS新抗原/HLA對。舉例而言，針對特異性疫苗卡匣之表34 (參見下文XXII部分)基於在17個測試樣品中未偵測到肽而不包括經預測之新抗原/HLA對G12D/A*02:01，且類似地基於在9個測試樣品中未偵測到肽而不包括G12V/A*02:01。相比之下，基於在1/5測試樣品中偵測到肽而將新抗原/HLA對G12D/A*11:01視為驗證，且類似地基於在2/6個測試樣品中偵測到肽而將G12V/A*11:01視為驗證。
此等結果強調鑑別相關新抗原/HLA對以獲得用於患者選擇中之適當HLA類型選擇以便用共有新抗原疫苗(諸如描述於表34中之共有新抗原疫苗)治療的重要性。具體而言，在此情況下出於選擇標準之目的排除若干常見KRAS新抗原/HLA對，因為MS資料表明共有新抗原疫苗將不太可能向具有該經預測之KRAS新抗原/HLA對(例如G12D/A*02:01或G12V/A*02:01)之患者提供益處。表 33
Figure 108117933-A0304-0046
 XXII . A . 選擇共有新抗原用於疫苗卡匣
構築含有20個共有新抗原之疫苗卡匣(「GO-005」)。表34描述經選擇用於卡匣之新抗原之特徵。將藉由質譜分析在腫瘤細胞之表面上直接偵測到之共有新抗原(如上文表32中所述)包括於卡匣中且將抗原決定基之HLA添加至突變之合格HLA清單。若存在腫瘤呈現(例如識別新抗原之腫瘤浸潤性淋巴球(TIL))之有力文獻證據，則將在吾等分析中未獨立檢驗為呈現之新抗原視為經驗證且將其添加至卡匣。基於靶向此新抗原之授受細胞療法造成患有CRC之患者中腫瘤消退之文獻證據(Tran等人N Engl J Med . 2016年12月8日; 375(23): 2255-2262.)將由HLA-C*08:02呈現之KRAS G12D視為經驗證且將其添加。具有經驗證HLA對偶基因之新抗原佔20個槽位中之6個。
另外，使用經預測為由腫瘤細胞呈現但尚未藉由MS驗證之較罕見新抗原以補充初始集合。鑒於吾等在EDGE評分與藉由靶向質譜分析(MS)驗證實驗(參見上述XXI部分)偵測到候選共有新抗原肽之機率之間觀測到之強烈依賴性，將具有高EDGE評分之突變優先包括為經預測之新抗原。展示EDGE評分與藉由靶向MS偵測到候選共有新抗原肽之機率之間的相關性的結果展示於圖25中。具體而言，剩餘槽位填充有EDGE HLA呈現評分為至少0.3且在NSCLC、CRC及胰臟癌中具有最高累積新抗原/HLA發生率的經預測新抗原。對於卡匣中之各槽位，需要組合HLA頻率為至少5-10% (例如存在11%具有HLA對偶基因B1501或B1503之美國群體)。值得注意的是，因為KRAS及NRAS在密碼子12、13及61附近具有相同卡匣序列，所以併入普遍的NRAS突變不需要槽位。經驗證之HLA、EDGE評分為至少0.3之經預測之HLA、經預測之HLA之平均EDGE評分，以及三個癌症群體中之新抗原/HLA發生率亦呈現於表34中。表 34 ：選擇疫苗卡匣 GO - 005 中之共有新抗原
Figure 108117933-A0304-0047
另外，吾等確定具有至少一個經鑑別(亦即驗證或預測)為呈現至少一個包含於共有新抗原疫苗GO-005中之共有新抗原之HLA對偶基因的總患者人口且使其與不可知患者是否具有經鑑別對偶基因之具有突變之患者人口比較。根據表34之GO-005疫苗卡匣，為估計GO-005靶向患者人口，吾等自AACR Genie收集患者突變資料。因為此類患者不具有匹配的HLA對偶基因，所以吾等自TCGA群體對HLA對偶基因取樣且使其與AACR Genie資料集配對。隨後鑒於腫瘤類型，將來自AACR Genie之具有匹配突變及HLA之任何患者標記為陽性，且不符合準則之任何患者標記為陰性。陽性百分比提供表35中每種腫瘤類型之可定址總患者群體。
自表35可容易地瞭解，僅攜帶特定突變之患者之子集亦攜帶可能將彼突變呈現為新抗原之HLA對偶基因。具有突變但無合適HLA對偶基因之患者不大可能受益於療法。作為一實例，鑒於估計約60%之胰臟癌患者攜帶合適的突變/新抗原，此等患者超過2/3不攜帶相應的HLA對偶基因。因此，如提出之考慮相關突變及HLA對偶基因之疫苗接種將僅以可獲益之彼等患者為目標。因此，藉由經驗證或經高評分預測之HLA考慮抗原決定基呈現係確定共有新抗原疫苗之可能功效的重要步驟。 表35：目標群體中之新抗原/HLA發生率
Figure 108117933-A0304-0048
 XXII . B . 共有新抗原疫苗卡匣序列選擇
選擇用於包涵在共有新抗原疫苗中之共有新抗原序列。
對於KRAS_G13D，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G13D及C0802之所有列來選擇。
對於KRAS_Q61K或NRAS_Q61K，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61K及A0101；或(2) NRAS Q61K及A0101之所有列來選擇。
對於TP53_R249M，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_R249M以及B3512、B3503及B3501中之至少一者之所有列來選擇。
對於CTNNB1_S45P，參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S45P以及A0101、A0301、B5701、A6801、A0302及A1101中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
對於CTNNB1_S45F，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S45F以及A0301、A1101及A6801中之至少一者之所有列來選擇。
對於ERBB2_Y772_A775dup，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出ERBB2_Y772_A775dup及B1801之所有列來選擇。
對於KRAS_G12D或NRAS_G12D，可參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_G12D以及A1101及C0802中之至少一者；或(2) NRAS_G12D以及A1101及C0802中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
對於KRAS_Q61R或NRAS_Q61R，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61R及A0101；或(2) NRAS_Q61R及A0101之所有列來選擇。
對於CTNNB1_T41A，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_T41A以及A0301、A0302、A1101、B1510、C0303及C0304中之至少一者之所有列來選擇。
對於TP53_K132N，參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_K132N以及A2402及A2301中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
對於KRAS_G12A，參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G12A及A0301之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
對於KRAS_Q61L或NRAS_Q61L，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61L及A0101；或(2) NRAS_Q61L及A0101之所有列來選擇。
對於TP53_R213L，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_R213L以及A0207、C0802及A0201中之至少一者之所有列來選擇。
對於BRAF_G466V，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出BRAF_G466V以及B1501及B1503中之至少一者之所有列來選擇。
對於KRAS_G12V，參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出KRAS_G12V以及A0301、A1101、A3101、C0102及A0302中之至少一者之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。
對於KRAS_Q61H或NRAS_Q61H，可參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_Q61H及A0101；或(2) NRAS_Q61H及A0101之所有列來選擇。
對於CTNNB1_S37F，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出CTNNB1_S37F以及A2301、A2402、B1510、B3906、C0501、C1402及C1403中之至少一者之所有列來選擇。
對於TP53_S127Y，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_S127Y以及A1101及A0301中之至少一者之所有列來選擇。
對於TP53_K132E，參考表A或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出TP53_K132E以及A2402、C1403及A2301中之至少一者之所有列來選擇。
對於KRAS_G12C或NRAS_G12C，可參考表A 32或AACR GENIE結果選擇用於包涵在疫苗中之共有新抗原編碼序列，其中考慮之各相關序列係藉由鑑別列出(1) KRAS_G12C及A0201；或(2) NRAS_G12C及A0201之所有列來選擇。舉例而言，參見示於表32中之相關序列。XXIII . 評估共有新抗原之 T 細胞識別
吾等評估新抗原是否誘發患者中之免疫反應。吾等自患有肺腺癌之患者獲得解離之腫瘤細胞。對腫瘤細胞定序以確定患者之HLA且鑑別突變。患者表現HLA-A*1101且吾等鑑別腫瘤中之KRAS G12V突變。同時，吾等分類及擴增來自腫瘤之CD45+細胞，其表示腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)。用突變之肽HLA-A*11:01四聚體對擴增之TIL染色以評估患者中此突變之免疫原性。圖26展示對CD8+細胞之流式細胞量測術選通策略(左圖)及藉由KRAS-G12V/ HLA-A*11:01四聚體對CD8+細胞之染色(右圖)。大部分(超過66%)之CD8+ T細胞展現與KRAS G12V:HLA*1101四聚體之結合，從而表明CD8+ T細胞識別新抗原之能力且表明對新抗原預先存在之免疫反應。
另外，吾等評估能夠識別共有新抗原之健康供體之初始T細胞組庫中T細胞前驅體之存在。富集周邊血液單核細胞(PBMC)以獲得初始CD8+ T細胞且用MHC多聚體染色，該等MHC多聚體呈現存在於疫苗卡匣GO-005: 2 KRAS G12V肽、G12C肽及CTNNB1_S45P肽抗原決定基中之若干共有新抗原候選者。對HLA-肽結合細胞分類、擴增且證實新抗原之特異性。偵測所有測試突變之前驅體(表36)。亦進行對新抗原-特異性T細胞之TCR定序。圖27說明一般TCR定序策略及工作流程。圖28展示用於KRAS-G12V/ HLA-A*11:01四聚體之TCR定序策略之代表性實例。TCR定序策略揭示多株反應，每個肽/MHC及每個供體鑑別之中值為73 (範圍為25至987)個純系型(表36)。因此，初始T細胞組庫分析表明，預期此等新抗原在藉由疫苗接種投與時誘發選擇患者中之免疫反應。 表36-新抗原反應性初始T細胞前驅體之評估
Figure 108117933-A0304-0049
 XXIV . 選擇共有新抗原及患者群體
使用本文所描述之表34、表A、表1.2或AACR GENIE結果中所提供之一或多種抗原(SEQ ID NO: 57-29,357)調配如本文所述之疫苗組合物。向患者投與疫苗，例如以治療癌症。在某些情況下，例如使用伴隨診斷或通常使用之癌症基因面板NGS分析(諸如FoundationOne、FoundationOne CDx、Guardant 360、Guardant OMNI或MSK IMPACT)選擇患者。例示性患者選擇標準在下文描述。例示性共有新抗原疫苗組合物GO-005靶向描述於表34中之突變。患者選擇
藉由考慮腫瘤基因表現、體細胞突變狀態及患者HLA類型進行用於共有新抗原疫苗接種之患者選擇。具體而言，若： (a)患者攜帶經預測或已知呈現包括於疫苗中之抗原決定基之HLA對偶基因且患者腫瘤表現具有抗原決定基序列之基因，或 (b)患者攜帶經預測或已知呈現包括於疫苗中之抗原決定基之HLA對偶基因，且患者腫瘤攜帶產生抗原決定基序列之突變，或 (c)與(b)相同，且亦需要患者腫瘤表現具有高於某一臨限值(例如1 TPM或10 TPM)之突變的基因，或 (d)與(b)相同，且亦需要患者腫瘤表現高於某一臨限值(例如在RNA層面觀測到之至少1突變讀段)之突變 (e)與(b)相同，且亦需要(c)及(d)中之額外準則 (f)上述中之任一者，且亦視情況需要在腫瘤中未偵測到呈現HLA對偶基因之損失，則患者視為適用於疫苗療法。
藉由現有方法中之任一者在RNA或蛋白質層面量測基因表現，該等現有方法包括RNASeq、微陣列、PCR、奈米串、ISH、質譜分析或IHC。藉由若干方法確立基因表現陽性之臨限值，該等方法包括：(1)在各種基因表現量下由HLA對偶基因呈現抗原決定基之預測機率，(2)如藉由質譜分析所量測之基因表現與HLA抗原決定基呈現之相關性，及/或(3)在各種水準下表現該基因之患者獲得之疫苗接種的臨床益處。進一步擴大患者選擇，需要包括於疫苗中之超過1個抗原決定基，例如至少2個、3個、4個或5個抗原決定基為陽性。
藉由現有方法中之任一者評估體細胞突變狀態，該等方法包括外顯子組定序(NGS DNASeq)、靶向外顯子組定序(基因面板)、轉錄組定序(RNASeq)、桑格定序、基於PCR之基因分型分析(例如Taqman或液滴式數位PCR)、基於質譜之方法(例如藉由Sequenom)，或熟習此項技術者已知之任何其他方法。
使用所描述方法中之任一者(例如藉由質譜分析)鑑別其他新共有新抗原。將此等新近鑑別之共有新抗原併入本文所描述之疫苗卡匣中。
先前驗證之新抗原另外驗證為由其他HLA對偶基因呈現且告知疫苗卡匣之新抗原選擇及/或擴大潛在的可治療群體。
包括新的新抗原允許擴大可定址腫瘤類型(例如EGFR突變之NSCLC)或包括具有新腫瘤類型之患者。XXV . 鑑別共有抗原
吾等使用三個計算步驟鑑別基於共有抗原基因之標靶：第一，吾等使用可經由基因型-組織表現(GTEx)項目[1]獲得之資料鑑別在大部分正常組織中具有低或無表現之基因。吾等自基因型-組織表現(GTEx)項目(型式V7p2)獲得彙總之基因表現資料。此資料集包含來自多於700名個體之超過11,000個死後樣品及超過50個不同組織類型。使用RNA-seq量測表現且根據GTEx標準管線(https://www.gtexportal.org/home/documentationPage)計算處理。使用同功異型物表現總和計算基因表現，該等同功異型物表現總和係使用RSEM v1.2.22 [2]計算。
接著，吾等使用來自癌症基因組圖譜(TCGA)研究網路：http://cancergenome.nih.gov/鑑別彼等基因中在癌症樣品中異常表現之基因。吾等檢測可獲自TCGA (資料版本6.0)之超過11,000個樣品。
最後，在此等基因中，吾等使用深度學習模型鑑別可能由MHC I類蛋白呈現為細胞表面抗原之肽，該深度學習模型針對藉由MS/MS定序之HLA呈現肽訓練，如出於所有目的以全文引用之方式併入本文中之國際專利申請案第PCT/US2016/067159號中所描述。
為鑑別常見腫瘤抗原(CTA；共有抗原)，吾等試圖定義排除在正常組織中表現之基因的準則，該等準則嚴格到足以確保腫瘤特異性，但將考慮可能存在之偽影，諸如讀段偏差。若基因符合以下準則，則其適合用於包涵為CTA：作為大腦、心臟或肺之一部分之各器官中的中值GTEx表現為每百萬小於0.1個轉錄物(TPM)，沒有一個樣品超過5 TPM。其他必要器官中之中值GTEx表現小於2 TPM，沒有一個樣品超過10 TPM。忽略分類為非必要器官(睪丸、甲狀腺及小唾液腺)之器官的表現。若基因在至少30個樣品中在TCGA中之表現超過10 TPM，則將其視為在腫瘤樣品中表現。基於文獻綜述，吾等亦添加基因MAGEB4及MAGEB6。
吾等亦添加基因CTAG1A/CTAG1B (NY-ESO-1)。因為使用TCGA資料版本6.0中之計算方法對其表現之定量不精確，所以吾等依賴於考慮多點映射讀段，可在TCGA舊存檔(https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive)中獲得之RSEM計算。
吾等隨後檢測在TCGA樣品中剩餘基因之表現分佈。在吾等檢測已知CTA，例如基因之MAGE家族時，吾等觀測到此等基因在對數空間中之表現一般藉由雙峰式分佈表徵。此分佈包括在較低表現值附近之左側模式及在較高表現量下之右側模式(或厚尾部)。此表現圖案與生物模型一致，在該生物模型中，在許多樣品中可在基線下偵測到一些最小表現且在經歷表觀遺傳失調之腫瘤子集中觀測到較高基因表現。吾等審查在TCGA樣品中各基因之表現分佈且捨棄其中吾等僅觀測到單峰分佈且無顯著右側尾部之彼等。例如，若少數基因可能在不能在GTEx中獲得之組織中表現，則藉由手動處理消除少數基因。此產生59個基因之集合。參見表35。在表35中，X用於指示其中在至少1%之病例中以超過10 TPM表現基因之癌症。表 35 ：癌症亞型中表現量之分析
Figure 108117933-A0304-0050
為鑑別可能由MHC I類蛋白呈現為細胞表面抗原之肽，吾等使用滑動窗將此等蛋白質中之每一者剖析成其組成性8-11個氨基酸序列。吾等使用HLA肽呈現深度學習模型處理此等肽及其側接序列以計算在TCGA中針對此基因觀測到之在第99.9個百分點表現量下呈現各肽之機率。若藉由吾等模型計算之肽的分位數呈現歸一化機率大於0.001，則吾等將其視為可能被呈現(亦即候選標靶)。
為優先排序可能與給定適應症有關之基因，吾等選擇以下基因：其中在至少0.98%之癌症病例中以至少10 TPM之含量表現基因。 結果展示於表1.2中。鑑別到總計10698個共有抗原序列。展示各序列之相應HLA對偶基因。表 A
參考序列表，SEQ ID NO. 10,755-21,015。為了清晰起見，經預測為與具有EDGE評分＞0.001之HLA對偶基因之給定HLA對偶基因肽相關的各肽經分配唯一的SEQ ID.NO.。上述序列識別符中之每一者與以下各者相關：肽之胺基酸序列、HLA亞型、對應於肽之基因名稱、與肽相關之突變，以及肽:HLA對之發生率大於0.1% (標註為「1」)還是小於0.1% (標註為「0」)。
表A以其全文揭示於2018年5月23日申請之美國臨時申請案第62/675,559號，該申請案以全文引用之方式併入本文中。AACR GENIE 結果
參考序列表，SEQ ID NO. 21,016-29,357。為了清晰起見，經預測為與具有EDGE評分＞0.001且發生率＞0.1%之HLA對偶基因之給定HLA對偶基因肽相關的各肽經分配為唯一的SEQ ID.NO.。上述序列識別符中之每一者與以下各者相關：基因名稱及對應於肽之突變、HLA亞型，以及肽之胺基酸序列。表 1 . 2
參考序列表，SEQ ID NO. 57-10,754。經預測之共有抗原與在至少0.98%癌症案例中以至少10 TPM之含量表現之基因相關。上述序列識別符中之每一者與以下各者相關：基因名稱、肽之胺基酸序列、Ensembl ID及相應HLA對偶基因。某些序列
本文所提及之載體、卡匣及抗體在下文描述且參考SEQ ID NO .。
Figure 108117933-A0304-0051
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關於以下描述及隨附圖式將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢，其中：
圖 ( Figure / FIG .) 1 說明活體外T細胞活化分析之研究。示意性展示該分析，其中將疫苗卡匣遞送至抗原呈現細胞引起獨特肽抗原之表現、加工及MHC限制性呈現。經工程改造成具有匹配特定肽-MHC組合之T細胞受體的報導體T細胞經活化，引起螢光素酶表現。
圖 2A 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示在相對於彼此相同之位置中串接的五個I類MHC限制性抗原決定基(抗原決定基1至5)，繼之以兩個通用的II類MHC抗原決定基(MHC-II)。使用不同連接子產生各種迭代。在一些情況下，T細胞抗原決定基彼此直接連接。在其他情況下，T細胞抗原決定基側接於其天然序列之一側或兩側上。在其他迭代中，T細胞抗原決定基藉由非天然序列AAY、RR及DPP連接。
圖 2B 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示有關嵌入該等短卡匣中之T細胞抗原決定基的序列資訊。
圖 3 說明對添加至模型疫苗卡匣中之細胞靶向序列之評價。該等靶向卡匣用泛素(Ub)、信號肽(SP)及/或跨膜(TM)結構域延伸該短卡匣設計，特徵在於緊鄰該五個標記物人類T細胞抗原決定基(抗原決定基1至5)以及兩個小鼠T細胞抗原決定基SIINFEKL（SII）及SPSYAYHQF（A5），且使用非天然連接子AAY-或天然連接子側接兩側上的T細胞抗原決定基(25聚體)。
圖 4 說明對短卡匣中連接子序列之活體內評價。A)使用HLA-A2轉殖基因小鼠進行疫苗卡匣之活體內評價的實驗設計。
圖 5A 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示長卡匣之設計需要用25聚體天然序列中所包含之另外的熟知T細胞I類抗原決定基(抗原決定基6至21)隔開的包含在25聚體天然序列中之五個標記物I類抗原決定基(抗原決定基1至5)(連接子=天然側接序列)，及兩個通用的II類抗原決定基(MHC-II0，其中僅I類抗原決定基之相對位置變化。
圖 5B 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示有關所用T細胞抗原決定基之序列資訊。
圖 6A 說明臨床前IND授權研究(IND-enabling study)之最終卡匣設計且顯示最終卡匣之設計包含在25聚體天然序列中所包含之20個I類MHC抗原決定基(連接子=天然側接序列)以及2個通用II類MHC抗原決定基，該20個I類MHC抗原決定基由6個非人類靈長類動物(NHP)抗原決定基、5個人類抗原決定基、9個鼠類抗原決定基構成。
圖 6B 說明臨床前IND授權研究之最終卡匣設計且顯示呈現於非人類靈長類動物、小鼠及人類來源之I類MHC上的所用T細胞抗原決定基之序列資訊，以及2個通用II類MHC抗原決定基PADRE及破傷風類毒素之序列。
圖 7A 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。
圖 7B 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。
圖 7C 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。
圖 8A 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。
圖 8B 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。
圖 8C 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。
圖 9 說明病毒粒子製造方案。
圖 10 說明α病毒源性VEE自我複製型RNA(srRNA)載體。
圖 11 說明在用VEE-螢光素酶srRNA接種C57BL/6J小鼠之後的活體內報導體表現。顯示出在各種時間點用VEE-螢光素酶srRNA免疫接種C57BL/6J小鼠(每隻小鼠10 μg，兩側肌肉內注射，MC3封裝)之後的代表性螢光素酶信號圖像。
圖 12A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3 LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 μg VEE-螢光素酶srRNA(對照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。藉由IFN-γ ELISPOT評估SIINFEKL特異性T細胞反應且以每106 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數報導。線表示中值。
圖 12B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3 LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 μg VEE-螢光素酶srRNA(對照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。藉由MHCI-五聚體染色評估SIINFEKL特異性T細胞反應，以五聚體陽性細胞佔CD8陽性細胞之百分比報導。線表示中值。
圖 13A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 13B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA增強免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 13C 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 13D 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA增強免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 14A 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/增強免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/增強免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 14B 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)增強免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/增強免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/增強免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天及在用srRNA增強免疫後6天(初免之後第21天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。
圖 15 說明ChAdV68引起針對小鼠中小鼠腫瘤抗原之T細胞反應。對小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer，且在C57BL/6J雌性小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基SIINFEKL(OVA)之T細胞反應並在Balb/c小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基AH1-A5之T細胞反應。呈現在ELISpot分析中量測的每106 個脾細胞之平均斑點形成細胞(SFC)數。誤差條表示標準差。
圖 16 說明在CT26腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的細胞免疫反應。使用ELISpot量測來自每組之6隻小鼠之脾細胞中抗原特異性IFN-γ的產生。結果呈現為每106 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較(Dunnett's multiple comparison)測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。
圖 17 說明在CT26腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的CD8 T細胞反應。使用ICS量測CD8 T細胞中抗原特異性IFN-γ的產生且結果呈現為抗原特異性CD8 T細胞佔總CD8T細胞之百分含量。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較(Dunnett's multiple comparison)測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。
圖 18 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/增強免疫、srRNA/ChAdV異源初免/增強免疫或srRNA/srRNA同源初免/增強免疫進行免疫接種之後的腫瘤生長情況。亦示出與在初免及增強免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/增強免疫之比較。每週兩次量測腫瘤體積且呈現研究之前21天之平均腫瘤體積。在研究起始時每組22-28隻小鼠。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。P值使用鄧尼特氏測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。
圖 19 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/增強免疫、srRNA/ChAdV異源初免/增強免疫或srRNA/srRNA同源初免/增強免疫進行免疫接種之後的存活情況。亦示出與在初免及增強免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/增強免疫之比較。P值使用對數等級檢定測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.01。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。
圖 20 說明使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在第一增強免疫接種(每組6隻恆河猴)1、2、3、4、5、6、8、9或10週之後，使用ELISpot針對VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (30 µg) (圖 20A )、VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100 µg) (圖 20B )或VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100 µg) (圖 20C )同源初免/增強免疫或ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫組(圖 20D )在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基的抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。相對於在放血前(第0週)之水準歸一化各動物之值。
圖 21 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種之後4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24週，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。
圖 22 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15週之後，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP2同源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。
圖 23 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15週之後，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP1同源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。
圖 24A 及圖 24B 展示由Promega's動態範圍標準產生之實例肽光譜。
圖 25 展示EDGE評分與藉由靶向MS偵測到候選共有新抗原肽之機率之間的相關性。
圖 26 展示來自用突變肽HLA-A*11:01四聚體染色之患者之擴增TIL。展示對CD8+細胞之流式細胞量測術選通策略(左圖)及藉由KRAS-G12V/ HLA-A*11:01四聚體對CD8+細胞之染色(右圖)。
圖 27 說明一般TCR定序策略及工作流程。
圖 28 展示使用KRAS-G12V/ HLA-A*11:01四聚體之代表性實例之TCR定序策略。
圖 29 說明具有30個(L)、40個(XL)或50個(XXL)抗原決定基之大抗原卡匣之各種物種的模型抗原決定基之一般組織。
圖 30 展示ChAd載體表現長卡匣，如由使用識別為所有卡匣所共用之序列之抗II類(PADRE)抗體的上述西方墨點法指示。HEK293細胞經表現不同大小之大卡匣之chAd68載體(chAd68-50XXL、chAd68-40XL及chAd68-30L)感染。感染設定在0.2之MOI下。在感染二十四小時後，將蛋白酶體抑制劑MG132添加至一組感染孔(由正號指示)。另一組經病毒處理之孔未用MG132處理(由負號指示)。未感染之HEK293細胞(293F)用作陰性對照。在感染四十八小時後，收集細胞集結粒且藉由SDS/PAGE電泳及使用兔抗II類PADRE抗體之免疫墨點法分析。將HRP抗兔抗體及ECL化學發光基質用於偵測。
圖 31 展示藉由ICS對AH1 (頂部)及SIINFEKL (底部)偵測之經chAd68大卡匣免疫接種之小鼠中之CD8+免疫反應。資料呈現為對模型抗原決定基佔總CD8細胞之百分比的IFNg+細胞。
圖 32 展示在chAd68大卡匣疫苗接種後對LD-AH1+ (頂部)及Kb-SIINFEKL+ (底部)四聚體之CD8+反應。資料呈現為對模型四聚體肽複合物具有反應性之總CD8細胞之百分比。藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得*p＜0.05，**p＜0.01。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
圖 33 展示藉由ICS對AH1 (頂部)及SIINFEKL (底部)偵測之經α病毒大卡匣處理之小鼠中之CD8+免疫反應。資料呈現為對模型抗原決定基佔總CD8細胞之百分比的IFNg+細胞。藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
圖 34 說明用於評估恆河猴中含有抗原卡匣之載體之免疫原性的疫苗策略。三角形指示第0週及第32週之chAd68疫苗接種(1e12 vp/動物)。圓形表示第0週、第4週、第12週、第20週、第28週及第32週之α病毒疫苗接種。方塊表示抗CTLA4抗體之投藥。
圖 35 展示用單獨chAd-MAG給藥之恆河猴中之CD8+抗抗原決定基反應之時程(第4組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。
圖 36 展示用IV遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應之時程(第5組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。
圖 37 展示用SC遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊派利單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應之時程(第6組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。
圖 38 展示藉由ELISpot量測之由ChAdV68/samRNA疫苗方案產生之抗原特異性記憶反應。結果呈現為個體點圖，其中各點表示單個動物。展示免疫接種前基線(左圖)及初免後18個月時的記憶反應(右圖)。
圖 39 展示藉由使用組合四聚體染色及CD45RA/CCR7共同染色之流式細胞量測術的抗原特異性CD8+ T細胞之記憶細胞表型。
圖 40 展示在研究第18個月時四個Mamu-A*01四聚物+CD8+ T細胞群體之總和內記憶細胞類型之分佈。記憶細胞表徵如下：CD45RA+CCR7+=初始，CD45RA+CCR7-=效應(Teff)，CD45RA-CCR7+=中央記憶(Tcm)，CD45RA-CCR7-=效應記憶(Tem)。
圖 41 展示識別CT26腫瘤攜帶小鼠中之CT26腫瘤抗原AH1之CD8+ T細胞的頻率。P值使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較測試測定；**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；aCTLA4=抗CTLA4抗體，純系9D9。
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Claims (167)

  1. 一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含： 該抗原表現系統， 其中該抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a)載體主鏈，其中該主鏈包含： (i)至少一個啟動子核苷酸序列，及 (ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及 (b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含： (i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含： (I)至少一個腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含： (A) MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基， (B)視情況存在之5'連接子序列，及 (C)視情況存在之3'連接子序列； (ii)視情況存在之可操作地連接於該抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及 (iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列； (iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之核酸序列；以及 (v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中該第二poly(A)序列係該載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
  2. 一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含： 該抗原表現系統， 其中該抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a)載體主鏈，其中該主鏈包含： (i)至少一個啟動子核苷酸序列，及 (ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及 (b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含： (i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含： (I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個彼此線性連接之腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含： (A) KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 19,831之MHC I類， (B) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 14,954之MHC I類抗原決定基， (C) KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,749及19,865組成之群的MHC I類抗原決定基，及 (D) KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,976、19,979、19,779、11,495及19,974組成之群的MHC I類抗原決定基， 其中該等腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含I類抗原決定基編碼核酸序列，視情況其中各MHC I抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基，及 其中該等腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含； (A)視情況存在之5'連接子序列，及 (B)視情況存在之3'連接子序列； (ii)視情況存在之可操作地連接於該抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及 (iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列； (iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之核酸序列；以及 (v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中該第二poly(A)序列係該載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
  3. 一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含： 該抗原表現系統， 其中該抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a)載體主鏈，其中該主鏈包含： (i)至少一個啟動子核苷酸序列，及 (ii)至少一個聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及 (b)抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含： (i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含： (I)至少20個彼此線性連接之腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列，其包含： (A) KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 19,831之MHC I類， (B) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼包含序列SEQ ID NO: 14,954之MHC I類抗原決定基， (C) KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,749及19,865組成之群的MHC I類抗原決定基，及 (D) KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該KRAS_G12V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼選自由SEQ ID NO: 19,976、19,979、19,779、11,495及19,974組成之群的MHC I類抗原決定基， (E) KRAS_G13D MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (F) KRAS_Q61K MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (G) TP53_R249M MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (H) CTNNB1_S45P MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (I) CTNNB1_S45F MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (J) ERBB2_Y772_A775dup MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (K) KRAS_Q61R MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (L) CTNNB1_T41A MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (M) TP53_K132N MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (N) KRAS_Q61L MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (O) TP53_R213L MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (P) BRAF_G466V MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (Q) KRAS_Q61H MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (R) CTNNB1_S37F MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (S) TP53_S127Y MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (T) TP53_K132E MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， (U) KRAS_G12C MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，及 其中該等腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者包含； (A)視情況存在之5'連接子序列，及 (B)視情況存在之3'連接子序列； (ii)視情況存在之可操作地連接於該抗原編碼核酸序列之第二啟動子核苷酸序列；以及 (iii)視情況存在之至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列； (iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子序列(SEQ ID NO: 56)之核酸序列；以及 (v)視情況存在之至少一個第二poly(A)序列，其中該第二poly(A)序列係該載體主鏈之天然poly(A)序列或外源性poly(A)序列。
  4. 一種用於遞送抗原表現系統之組合物，其包含： 該抗原表現系統， 其中該抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a)載體主鏈，其中該載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體係ChAdV68載體，或α病毒載體，視情況其中該α病毒載體係委內瑞拉馬腦炎病毒載體；以及 (b)整合在26S啟動子核苷酸序列與poly(A)序列之間的抗原卡匣，其中該抗原卡匣包含： (i)至少一個抗原編碼核酸序列，其包含： (I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個彼此線性連接之腫瘤特異性及MHC I類抗原編碼核酸序列，且其各自包含： (A) MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其中該MHC I類抗原決定基編碼核酸序列編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基，且其中該等MHC I類抗原決定基中之至少一者係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群， (B) 5'連接子序列，其中該5'連接子序列編碼該MHC I類抗原決定基之天然N端胺基酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽， (C) 3'連接子序列，其中該3'連接子序列編碼該MHC I類抗原決定基之天然C端酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽，及 其中該抗原卡匣可操作地連接於該26S啟動子核苷酸序列，其中該等MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間的多肽，且其中各MHC I類抗原編碼核酸序列之每個3'端連接於除該抗原卡匣中之最終MHC I類抗原編碼核酸序列之外的後續MHC I類抗原編碼核酸序列之5'端；以及 (ii)至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列，其包含： (I) PADRE MHC II類序列(SEQ ID NO:48)， (II)破傷風類毒素MHC II類序列(SEQ ID NO:46)， (III)第一核酸序列，其編碼連接該PADRE MHC II類序列及該破傷風類毒素MHC II類序列之GPGPG胺基酸連接子序列， (IV)第二核酸序列，其編碼GPGPG胺基酸連接子序列，該GPGPG胺基酸連接子序列將該至少兩種MHC II類抗原編碼核酸序列之5'端連接至該等腫瘤特異性MHC I類抗原編碼核酸序列， (V)視情況存在之第三核酸序列，其編碼該至少兩種MHC II類抗原編碼核酸序列之3'端處的GPGPG胺基酸連接子序列。
  5. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該抗原卡匣之各元件的有序序列描述於下式中，自5'至3'包含： Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g 其中P包含該第二啟動子核苷酸序列，其中a = 0或1， N包含該等MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之一者，其中c = 1， L5包含該5'連接子序列，其中b = 0或1， L3包含該3'連接子序列，其中d = 0或1， G5包含該至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列中之一者，其中e = 0或1， G3包含該至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列中之一者，其中g = 0或1， U包含該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列中之一者，其中f = 1， X = 1至400，其中對於各X，相應Nc 係抗原決定基編碼核酸序列，及 Y=0、1或2，其中對於各Y，相應Uf 係抗原編碼核酸序列。
  6. 如請求項5之組合物，其中對於各X，該相應Nc 係不同的MHC I類抗原決定基編碼核酸序列。
  7. 如請求項5或6之組合物，其中對於各Y，該相應Uf 係不同的MHC II類抗原編碼核酸序列。
  8. 如請求項5至7中任一項之組合物，其中 a = 0，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2， 該至少一個啟動子核苷酸序列係由該主鏈提供之單一26S啟動子核苷酸序列， 該至少一個聚腺苷酸化poly(A)序列係由該主鏈提供之至少100個連續A核苷酸之poly(A)序列， 各N編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基， L5係天然5'連接子序列，其編碼該MHC I抗原決定基之天然N端胺基酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽， L3係天然3'連接子序列，其編碼該MHC I抗原決定基之天然核末端酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少3個胺基酸長之肽， U係PADRE II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之每一者， 該載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體係ChAdV68載體，或α病毒載體，視情況其中該α病毒載體係委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)載體，且 該MHC I類抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間的多肽。
  9. 如前述請求項中任一項之組合物，該組合物進一步包含奈米顆粒遞送媒劑。
  10. 如請求項9之組合物，其中該奈米顆粒遞送媒劑係脂質奈米粒子(LNP)。
  11. 如請求項10之組合物，其中該LNP包含可電離胺基脂質。
  12. 如請求項11之組合物，其中該等可電離胺基脂質包含MC3樣(二亞油醯基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯)分子。
  13. 如請求項9至12中任一項之組合物，其中該奈米顆粒遞送媒劑包封該抗原表現系統。
  14. 如請求項1至3、5至7或9至13中任一項之組合物，其中該抗原卡匣整合在該至少一個啟動子核苷酸序列與該至少一個poly(A)序列之間。
  15. 如請求項1至3、5至7或9至14中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列可操作地連接於該抗原編碼核酸序列。
  16. 如請求項1至3、5至7或9至15中任一項之組合物，其中該一或多種載體包含一或多種+-股RNA載體。
  17. 如請求項16之組合物，其中該一或多種+-股RNA載體包含5' 7-甲基鳥苷(m7g)端帽。
  18. 如請求項16或17之組合物，其中該一或多種+-股RNA載體係藉由活體外轉錄製備。
  19. 如請求項1至3、5至7或9至18中任一項之組合物，其中該一或多種載體在哺乳動物細胞內係自我複製的。
  20. 如請求項1至3、5至7或9至19中任一項之組合物，其中該主鏈包含至少一個奧拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅斯河病毒(Ross River virus)、勝利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)或馬雅羅病毒(Mayaro virus)之核苷酸序列。
  21. 如請求項1至3、5至7或9至19中任一項之組合物，其中該主鏈包含至少一個委內瑞拉馬腦炎病毒之核苷酸序列。
  22. 如請求項20或21之組合物，其中該主鏈至少包含用於非結構蛋白質介導之擴增的序列、26S啟動子序列、poly(A)序列、非結構蛋白質1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因及nsP4基因，其由該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅斯河病毒、該勝利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬雅羅病毒之該核苷酸序列編碼。
  23. 如請求項20或21之組合物，其中該主鏈至少包含用於非結構蛋白質介導之擴增的序列、26S啟動子序列及poly(A)序列，其由該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅斯河病毒、該勝利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬雅羅病毒之該核苷酸序列編碼。
  24. 如請求項22或23之組合物，其中用於非結構蛋白質介導之擴增的序列選自由以下組成之群：α病毒5' UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S次基因組啟動子序列、19-nt CSE、α病毒3' UTR或其組合。
  25. 如請求項22至24中任一項之組合物，其中該主鏈不編碼結構病毒粒子蛋白質衣殼E2及E1。
  26. 如請求項25之組合物，其中該抗原卡匣代替結構病毒粒子蛋白質插入該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅斯河病毒、該勝利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬雅羅病毒之該核苷酸序列內。
  27. 如請求項20或21之組合物，其中該委內瑞拉馬腦炎病毒包含序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5。
  28. 如請求項20或21之組合物，其中該委內瑞拉馬腦炎病毒包含該序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5，其進一步包含在鹼基對7544與11175之間的缺失。
  29. 如請求項28之組合物，其中該主鏈包含以SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7所闡述之序列。
  30. 如請求項28或29之組合物，其中該抗原卡匣嵌入位置7544處以取代如該序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5中所闡述之鹼基對7544與11175之間的缺失。
  31. 如請求項26至30之組合物，其中該抗原卡匣之該插入提供包含該等nsP1-4基因及該至少一個抗原編碼核酸序列之多順反子RNA的轉錄，其中該nsP1-4基因及該至少一個抗原編碼核酸序列位於分開的開放閱讀框架中。
  32. 如請求項1至3、5至7或9至19中任一項之組合物，其中該主鏈包含至少一個黑猩猩腺病毒載體之核苷酸序列。
  33. 如請求項32之組合物，其中該黑猩猩腺病毒載體係ChAdV68載體。
  34. 如請求項1至3、5至7或9至33中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列係由該主鏈編碼之天然26S啟動子核苷酸序列。
  35. 如請求項1至3、5至7或9至33中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列係外源性RNA啟動子。
  36. 如請求項1至3、5至7或9至35中任一項之組合物，其中該第二啟動子核苷酸序列係26S啟動子核苷酸序列。
  37. 如請求項1至3、5至7或9至35中任一項之組合物，其中該第二啟動子核苷酸序列包含多個26S啟動子核苷酸序列，其中各26S啟動子核苷酸序列提供該等分開的開放閱讀框架中之一或多者的轉錄。
  38. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體各自大小係至少300 nt。
  39. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體各自大小係至少1 kb。
  40. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體各自大小係2 kb。
  41. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體各自大小係5 kb。
  42. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼由腫瘤細胞上之MHC I類呈現之多肽序列或其部分。
  43. 如請求項1至3、5至7或9至42中任一項之組合物，其中各抗原編碼核酸序列直接彼此連接。
  44. 如請求項1至3、5至7或9至43中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者利用編碼連接子之核酸序列連接於不同抗原編碼核酸序列。
  45. 如請求項44之組合物，其中該連接子連接兩個MHC I類序列或將MHC I類序列連接於MHC II類序列。
  46. 如請求項45之組合物，其中該連接子選自由以下組成之群：(1)至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長之連續甘胺酸殘基；(2)至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長之連續丙胺酸殘基；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸，丙胺酸，酪胺酸(AAY)；(5)至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基長之共同序列，其由哺乳動物蛋白酶體有效處理；以及(6)一或多個天然序列，其側接衍生自來源之同源蛋白質之抗原，且長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或2-20個胺基酸殘基。
  47. 如請求項44之組合物，其中該連接子連接兩個MHC II類序列或將MHC II類序列連接於MHC I類序列。
  48. 如請求項47之組合物，其中該連接子包含序列GPGPG。
  49. 如請求項1至3、5至7或9至48中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列之至少一個序列可操作地或直接連接於分離或連續的序列，該序列提高該至少一個抗原編碼核酸序列之表現、穩定性、細胞遷移、處理及呈現，及/或免疫原性。
  50. 如請求項49之組合物，其中該分離或連續序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如該泛素序列在位置76處含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、主要組織相容性I類序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白及主要組織相容性II類序列；視情況其中該經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。
  51. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼多肽序列或其部分，該多肽序列或其部分相對於經轉譯之相應野生型核酸序列具有對其相應MHC對偶基因增加之結合親和力。
  52. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼多肽序列或其部分，該多肽序列或其部分相對於該經轉譯之相應野生型核酸序列具有對其相應MHC對偶基因增加之結合穩定性。
  53. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼多肽序列或其部分，該多肽序列或其部分相對於該經轉譯之相應野生型核酸序列具有在其相應MHC對偶基因上增加之呈現可能性。
  54. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個改變包含點突變、讀框轉移突變、非讀框轉移突變、缺失突變、插入突變、剪接變異體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
  55. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該腫瘤選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、成人急性淋巴母細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
  56. 如請求項1至3、5至7或9至55中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸序列。
  57. 如請求項1至3、5至7或9至55中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列包含至少11-20個、15-20個、11-100個、11-200個、11-300個、11-400個、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或至多400個核酸序列。
  58. 如請求項1至3、5至7或9至55中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列包含至少2-400個核酸序列且其中該等抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由該腫瘤細胞表面上之MHC I類呈現之多肽序列或其部分。
  59. 如請求項4或8之組合物，其中該等抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由該腫瘤細胞表面上之MHC I類呈現之多肽序列或其部分。
  60. 如前述請求項中任一項之組合物，其中當向個體投與且轉譯時，由該至少一個抗原編碼核酸序列編碼之抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，從而導致靶向該腫瘤細胞表面上之該等抗原中之至少一者的免疫反應。
  61. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列在向該個體投與且經轉譯時，該等MHC I類或II類抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，導致靶向該腫瘤細胞表面上之該等抗原中之至少一者的免疫反應，且視情況其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之每一者之表現由該至少一個啟動子核苷酸序列驅動。
  62. 如請求項1至3、5至7或9至61中任一項之組合物，其中各MHC I類抗原編碼核酸序列編碼長度在8與35個胺基酸之間，視情況長度為9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸的多肽序列。
  63. 如請求項1至3、5至7或9至62中任一項之組合物，其中存在該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列。
  64. 如請求項1至3、5至7或9至62中任一項之組合物，其中存在該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且包含至少一個包含至少一個改變之MHC II類抗原編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。
  65. 如請求項1至3、5至7或9至64中任一項之組合物，其中該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列係12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸長。
  66. 如請求項1至3、5至7或9至65中任一項之組合物，其中存在該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且包含至少一個通用MHC II類抗原編碼核酸序列，視情況其中該至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
  67. 如請求項1至3、5至7或9至66中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列或該第二啟動子核苷酸序列係誘發性的。
  68. 如請求項1至3、5至7或9至66中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列或該第二啟動子核苷酸序列係非誘發性的。
  69. 如請求項1至3、5至7或9至68中任一項之組合物，其中該至少一個poly(A)序列包含該主鏈中天然存在之poly(A)序列。
  70. 如請求項1至3、5至7或9至68中任一項之組合物，其中該至少一個poly(A)序列包含相對於該主鏈為外源之poly(A)序列。
  71. 如請求項1至3、5至7或9至70中任一項之組合物，其中該至少一個poly(A)序列可操作地連接於該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。
  72. 如請求項1至3、5至7或9至71中任一項之組合物，其中該至少一個poly(A)序列為至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個或至少90個連續A核苷酸。
  73. 如請求項1至3、5至7或9至71中任一項之組合物，其中該至少一個poly(A)序列係至少100個連續A核苷酸。
  74. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗原卡匣進一步包含以下中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體入口序列(IRES)序列、編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列、編碼弗林裂解位點之核苷酸序列，或5'或3'非編碼區中已知增強mRNA的核輸出、穩定性或轉譯效率的序列，其可操作地連接於該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。
  75. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗原卡匣進一步包含報導體基因，其包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變異體、分泌型鹼性磷酸酶、螢光素酶、螢光素酶變異體或可偵測肽或抗原決定基。
  76. 如請求項75之組合物，其中該可偵測肽或抗原決定基係選自由以下組成之群：HA標籤、Flag標籤、His標籤或V5標籤。
  77. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體進一步包含一或多個編碼至少一個免疫調節因子之核酸序列。
  78. 如請求項77之組合物，其中該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  79. 如請求項78之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段係Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、呈單特異性或連接在一起呈多特異性的單結構域抗體(sdAb) (例如駱駝科抗體結構域)，或全長單鏈抗體(例如具有由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。
  80. 如請求項78或79之組合物，其中該抗體之該等重鏈及輕鏈序列係由自裂解序列分隔開之連續序列，諸如2A或IRES；或該抗體之該等重鏈及輕鏈序列藉由可撓性連接子(諸如連續甘胺酸殘基)連接。
  81. 如請求項77之組合物，其中該免疫調節因子係細胞介素。
  82. 如請求項81之組合物，其中該細胞介素係IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其每一者之變異體中之至少一者。
  83. 如請求項1至3、5至7或9至82中任一項之組合物，其中該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列係藉由進行以下步驟選擇： (a)自該腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料； (b)將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由一或多個該等MHC對偶基因呈現在該腫瘤之該腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及 (c)基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組所選擇之抗原，該等抗原用於產生該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列。
  84. 如請求項4或8之組合物，其中該等MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之每一者藉由進行以下步驟選擇： (a)自該腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料； (b)將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由一或多個該等MHC對偶基因呈現在該腫瘤之該腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及 (c)基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組所選擇之抗原，該等抗原用於產生至少20個MHC I類抗原編碼核酸序列。
  85. 如請求項83之組合物，其中該所選擇之抗原集合的數目為2-20個。
  86. 如請求項83至85之組合物，其中該呈現模型表示以下因素之間的依賴性： (a)該等MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；及 (b)由在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的該對MHC對偶基因中之一特定對偶基因呈現在該腫瘤細胞表面上之可能性。
  87. 如請求項83至86之組合物，其中選擇該所選擇之抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原呈現在該腫瘤細胞表面上之可能性增加的抗原，視情況其中該等所選擇之抗原已驗證為由一或多個特異性HLA對偶基因呈現。
  88. 如請求項83至87之組合物，其中選擇該經選擇之抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發個體中之腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的抗原。
  89. 如請求項83至88之組合物，其中選擇該所選擇之抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現給初始T細胞的可能性增加之抗原，視情況其中該APC係樹突狀細胞(DC)。
  90. 如請求項83至89之組合物，其中選擇該所選擇之抗原集合包含基於該呈現模型，選擇相對於未經選擇之抗原經由中心或周邊耐受性受抑制之可能性降低的抗原。
  91. 如請求項83至90之組合物，其中選擇該所選擇之抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發對個體中之正常組織之自身免疫反應的可能性降低之抗原。
  92. 如請求項83至91之組合物，其中外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對該腫瘤組織進行定序而獲得。
  93. 如請求項92之組合物，其中該定序係下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
  94. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗原卡匣包含由該抗原卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。
  95. 如請求項94之組合物，其中至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。
  96. 如請求項94或95之組合物，其中每個連接抗原決定基序列為非自身的。
  97. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少5%之群體中存在之至少一個HLA對偶基因呈現。
  98. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該等MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中每個抗原/HLA對在群體中的抗原/HLA發生率為至少0.01%。
  99. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該等MHC I類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中每個抗原/HLA對在群體中的抗原/HLA發生率為至少0.1%。
  100. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該抗原卡匣不編碼包含經轉譯之野生型核酸序列之非治療性MHC I類或II類抗原決定基核酸序列，其中預測該非治療性抗原決定基呈現於該個體之MHC對偶基因上。
  101. 如請求項100之組合物，其中該經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由該抗原卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。
  102. 如請求項94至101之組合物，其中該預測係基於藉由將該非治療性抗原決定基之序列輸入至呈現模型中而產生之呈現可能性。
  103. 如請求項94至102中任一項之組合物，其中該抗原卡匣中之該至少一個抗原編碼核酸序列之順序係藉由一系列包含以下之步驟測定： (a)產生一組候選抗原卡匣序列，其對應於該至少一個抗原編碼核酸序列之不同次序； (b)對於每個候選抗原卡匣序列，基於該候選抗原卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現評分；及 (c)選擇與低於預定臨限值之呈現評分相關的候選卡匣序列作為抗原疫苗之抗原卡匣序列。
  104. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
  105. 如請求項104之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  106. 如請求項104或105之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含免疫調節因子。
  107. 如請求項106之醫藥組合物，其中該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  108. 一種經分離核苷酸序列或經分離核苷酸序列集合，其包含如前述組合物請求項中任一項之抗原卡匣及一或多個獲自序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5之元件，視情況其中該一或多個元件選自由以下組成之群：用於非結構蛋白質介導之擴增所需要的序列、26S啟動子核苷酸序列、poly(A)序列及SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5中闡述之序列之nsP1-4基因，且視情況其中該核苷酸序列係cDNA。
  109. 如請求項108之經分離核苷酸序列，其中該序列或經分離核苷酸序列集合包含插入SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中闡述之序列之位置7544處的如前述組合物請求項中任一項之抗原卡匣。
  110. 如請求項108或109之經分離核苷酸序列，其進一步包含： 獲自該序列SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5之該一或多個元件之T7或SP6 RNA聚合酶啟動子核苷酸序列5'；以及 視情況存在之該poly(A)序列之一或多個限制位點3'。
  111. 如請求項108之經分離核苷酸序列，其中如前述組合物請求項中任一項之抗原卡匣插入SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9之位置7563處。
  112. 一種載體或載體集合，其包含如請求項108至111之核苷酸序列。
  113. 一種經分離細胞，其包含如請求項108至112之核苷酸序列或經分離核苷酸序列集合，視情況其中該細胞係BHK-21、CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
  114. 一種套組，其包含如前述組合物請求項中任一項之組合物及使用說明書。
  115. 一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與如前述組合物請求項中任一項之組合物或如請求項104至107中任一項之醫藥組合物。
  116. 如請求項115之方法，其中該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列源自該患有癌症之個體之腫瘤。
  117. 如請求項115之方法，其中該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列並非源自該患有癌症之個體之該腫瘤。
  118. 一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與如前述組合物請求項中任一項之組合物或如請求項104至107中任一項之醫藥組合物。
  119. 如請求項115至118中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該MHC I類抗原決定基之至少一個HLA對偶基因。
  120. 如請求項115至118中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該MHC I類抗原決定基之至少一個HLA對偶基因，且其中該MHC I類抗原決定基包含選自由表34中所提及之突變組成之群的突變。
  121. 如請求項115至118中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該MHC I類抗原決定基之至少一個HLA對偶基因，且其中該MHC I類抗原決定基包含選自由表32中所提及之突變組成之群的突變。
  122. 如請求項115至121中任一項之方法，其中該組合物經肌肉內(IM)、皮內(ID)、皮下(SC)或靜脈內(IV)投與。
  123. 如請求項115至121中任一項之方法，其中該組合物經肌肉內投與。
  124. 如請求項115至123中任一項之方法，該方法進一步包含投與一或多種免疫調節因子，視情況其中在投與該組合物或醫藥組合物之前、與其同時或在其之後投與該免疫調節因子。
  125. 如請求項124之方法，其中該一或多種免疫調節因子選自由以下組成之群：抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  126. 如請求項124或125之方法，其中該免疫調節因子係靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。
  127. 如請求項126之方法，其中該皮下投藥靠近該組合物或醫藥組合物投藥部位或極接近於一或多個載體或組合物引流淋巴結。
  128. 如請求項115至127中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第二疫苗組合物。
  129. 如請求項128之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項115至127中任一項之組合物或醫藥組合物之前投與。
  130. 如請求項128之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項115至127中任一項之組合物或醫藥組合物之後投與。
  131. 如請求項129或130之方法，其中該第二疫苗組合物係與如請求項115至127中任一項之組合物或醫藥組合物同時投與。
  132. 如請求項129或130之方法，其中該第二疫苗組合物不同於如請求項115至127中任一項之組合物或醫藥組合物。
  133. 如請求項132之方法，其中該第二疫苗組合物包含編碼至少一個抗原編碼核酸序列之黑猩猩腺病毒載體。
  134. 如請求項133之方法，其中由該黑猩猩腺病毒載體編碼之該至少一個抗原編碼核酸序列與前述組合物請求項中任一項之至少一個抗原編碼核酸序列相同。
  135. 一種製造如前述組合物請求項中任一項之一或多種載體的方法，該方法包含： (a)獲得包含主鏈及抗原卡匣之線性化DNA序列； (b)藉由以下步驟活體外轉錄該線性化DNA序列：將該線性化DNA序列添加至活體外轉錄反應物，該反應物含有將該線性化DNA序列轉錄成RNA之所有所需組分，視情況進一步包含將m7g端帽活體外添加至所得RNA；以及 (c)自該活體外轉錄反應物分離該一或多種載體。
  136. 如請求項135之製造方法，其中該線性化DNA序列係藉由使DNA質體序列線性化或藉由使用PCR擴增來產生。
  137. 如請求項136之製造方法，其中該DNA質體序列係使用以下中之一者產生；在細菌細胞中的細菌重組或全基因組DNA合成或擴增合成之DNA的全基因組DNA合成。
  138. 如請求項135之製造方法，其中自該活體外轉錄反應物分離該一或多種載體涉及以下中之一或多者：苯酚氯仿萃取、基於二氧化矽管柱之純化，或相似的RNA純化方法。
  139. 一種製造如前述組合物請求項中任一項之組合物以用於遞送該抗原表現系統的方法，該方法包含： (a)提供用於該奈米顆粒遞送媒劑之組分； (b)提供該抗原表現系統；以及 (c)提供足以使該奈米顆粒遞送媒劑及抗原表現系統產生該組合物以用於遞送該抗原表現系統的條件。
  140. 如請求項139之製造方法，其中該等條件藉由微流體混合提供。
  141. 一種評估患有癌症之個體之方法，其包含以下步驟： a)判定或已判定： 1) 該個體是否具有經預測或已知呈現基於抗原之疫苗中所包括之抗原的HLA對偶基因，及 以下中之一或兩者： 1) 個體之腫瘤是否表現與該抗原相關之基因， 2) 該個體之腫瘤是否具有與該抗原相關之突變， b)根據(a)之結果確定或已確定當個體表現HLA對偶基因，個體之腫瘤表現基因，或/及個體之腫瘤具有突變時，該個體係利用基於抗原之疫苗之療法的候選者， 其中該抗原包含至少一個選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群的MHC I類抗原決定基序列，及 c)視情況向該個體投與，已投與該基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 該至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列。
  142. 一種評估患有癌症之個體之方法，其包含以下步驟： a)判定或已判定該個體是否表現： 1) A0301 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12A突變， 2) A0201 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12C突變， 3) C0802 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12D突變，或 4) A0301 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因或A3101 HLA對偶基因或C0102 HLA對偶基因或A0302 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12V突變，及 b)根據(a)之結果判定或已判定當該個體為以下情況時，該個體係利用基於抗原之疫苗之療法的候選者， 1) A0301對偶基因，該個體之腫瘤表現KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12A突變， 2) A0201對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12C突變， 3) C0802 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12D突變，或 4) A0301 HLA對偶基因或A1101 HLA對偶基因或A3101 HLA對偶基因或C0102 HLA對偶基因或A0302 HLA對偶基因，該個體之腫瘤表現該KRAS基因，且該個體之腫瘤具有KRAS_G12V突變，及 c)視情況向該個體投與，已投與該基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1)至少一個MHC I類抗原決定基，其分別包含該KRAS_G12A突變、該KRAS_G12C突變、該KRAS_G12D突變或該KRAS_G12V突變，或 2) MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，其編碼該至少一個MHC I類抗原決定基，該至少一個MHC I類抗原決定基分別包含該KRAS_G12A突變、該KRAS_G12C突變、該KRAS_G12AD突變或該KRAS_G12V突變。
  143. 如請求項141或142之方法，其中步驟(a)及/或(b)包含自已處理來自該個體之樣品之第三方獲得資料集。
  144. 如請求項141或142之方法，其中步驟(a)包含自該個體獲得樣品且使用選自由以下組成之群的方法分析該樣品：外顯子組定序、目標外顯子組定序、轉錄組定序、桑格定序(Sanger sequencing)、基於PCR之基因分型分析、基於質譜法之方法、微陣列、奈米串、ISH及IHC。
  145. 如請求項143或144之方法，其中該樣品包含腫瘤樣品、正常組織樣品或該腫瘤樣品及該正常組織樣品。
  146. 如請求項145之方法，其中該樣品係選自組織、體液、血液、腫瘤生檢、脊髓液及針抽出物。
  147. 如請求項141或143至146中任一項之方法，其中該基因選自由以下組成之群：表34中發現之基因中之任一者。
  148. 如請求項141或143至146中任一項之方法，其中該基因選自由以下組成之群：表32中發現之基因中之任一者。
  149. 如請求項141至148中任一項之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：肺癌、微衛星穩定型結腸癌及胰臟癌。
  150. 如請求項141至149中任一項之方法，其中該HLA對偶基因之HLA頻率為至少5%。
  151. 如請求項141至150中任一項之方法，其中該至少一個MHC I類抗原決定基由該HLA對偶基因呈現在與該個體之腫瘤相關之細胞上。
  152. 如請求項141至151中任一項之方法，其中該基於抗原之疫苗包含抗原表現系統。
  153. 如請求項152之方法，其中該抗原表現系統包含如請求項1至103中任一項之抗原表現系統中之任一者。
  154. 如請求項141至151中任一項之方法，其中該基於抗原之疫苗包含如請求項104至107中任一項之醫藥組合物中之任一者。
  155. 一種用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， 其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群。
  156. 如請求項155之方法，其中該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列源自該患有癌症之個體之腫瘤。
  157. 如請求項155之方法，其中該至少一個MHC I類抗原編碼核酸序列並非源自該患有癌症之個體之該腫瘤。
  158. 一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，向該個體，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， 其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群。
  159. 如請求項155至158中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因。
  160. 如請求項155至158中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表34中提及之突變組成之群的突變。
  161. 如請求項155至158中任一項之方法，其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表32中提及之突變組成之群的突變。
  162. 一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， 其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列係選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因。
  163. 一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， 其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表34中提及之突變組成之群的突變，且其中該個體表現表34中所示與表34中所示之相應突變匹配之至少一個HLA對偶基因(例如KRAS_G13D及C0802)。
  164. 一種用於誘發個體之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與基於抗原之疫苗，其中該基於抗原之疫苗包含： 1) 至少一個MHC I類抗原決定基，或 2) 編碼該至少一個MHC I類抗原決定基之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列， 其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列選自由SEQ ID NO: 57-29,357組成之群，且其中該個體表現經預測或已知呈現該至少一個MHC I類抗原決定基序列之至少一個HLA對偶基因，且其中該至少一個MHC I類抗原決定基序列包含選自由表32中提及之突變組成之群的突變。
  165. 如請求項155至164中任一項之方法，其中該基於抗原之疫苗包含抗原表現系統。
  166. 如請求項165之方法，其中該抗原表現系統包含如請求項1至103中任一項之抗原表現系統中之任一者。
  167. 如請求項155至164中任一項之方法，其中該基於抗原之疫苗包含如請求項104至107中任一項之醫藥組合物中之任一者。
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