CN101579528B - 一种hiv复合多表位dna疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HIV复合多表位DNA疫苗，其是以HIV-1衣壳蛋白p24为载体骨架分子，以ER信号肽作为引导序列，包含有HIV基因组中26个高度保守的免疫优势表位，其中包括3个中和抗体表位和23个CTL表位；1个HIV-1分离株共有抗体表位；以及1个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位和1个破伤风毒素B细胞表位；共29个表位的HIV复合多表位DNA疫苗。该疫苗既可用于健康人群的预防接种，也可用于已感染艾滋病病毒人群的免疫治疗，具预防和治疗双重功能。

Description

一种HIV复合多表位DNA疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及一种艾滋病疫苗，特别是涉及一种以HIV抗原表位为基础的新型基因工程治疗预防两用DNA疫苗，以及其构建模式和其应用。

背景技术

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球的迅速蔓延，已成为威胁人类最严重的病毒病之一。联合国艾滋病规划署发表的《2008年全球艾滋病疫情报告》中指出，2007年新增艾滋病病毒感染者为250万人，到2008年，全球共有3320万名艾滋病病毒感染者，其中2250万名感染者分布在撒哈拉沙漠以南的众多非洲国家；亚洲有近500万名感染者；东欧和中亚地区约150万名；拉美地区约170万名；北美、西欧和中东欧地区约200万名。其中绝大多数艾滋病病毒感染者生活在世界欠发达地区。在中国，到2008年9月底，全国累计报告艾滋病病毒感染者26万多例，其中艾滋病病人7.7万余例，死亡3.4万余例。仅2007年，就新增艾滋病病毒感染者5万人，相当于每天有140人被感染。其状况非常令人担忧。目前HIV感染者的药物治疗费用每人每年需要1.2-5.0万美元，这样大的费用即使在发达国家亦难以承受，何况迄今为止尚未见有真正有效的治疗药物。因此，世界各国将目标转向实用化AIDS疫苗的开发。国外投入了大量的资金和人力对艾滋病疫苗以及艾滋病毒的分子生物学和免疫学进行研究，希望早日遏止艾滋病在世界范围内尤其是发展中国家不断加速的蔓延趋势。HIV感染及引起的疾病对卫生组织保健资源和世界经济影响巨大。因此，研制具有良好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗接种健康人群和感染者具有重要的现实意义。

纵观艾滋病疫苗的研究历史，大致分成三个逐渐改进与完善的阶段，各个相邻阶段间存在一定相互交叉。

第一阶段(1984-1993年)：是艾滋病疫苗研究的起始阶段，主要特点是疫苗以单一的蛋白亚单位疫苗(gp120或gp160)为主，以诱导抗体预防病毒感染为主要目标，忽视细胞免疫的作用。

第二阶段(1994-1999年)：特点是强调疫苗的细胞免疫反应，但忽视了体液免疫的作用。

第三阶段(2000年至今)：总结了前两个阶段的教训，疫苗诱导的免疫反应更加注重体液和细胞免疫反应的均衡，伴随着超感染以及其他病毒逃逸细胞免疫现象的发现，有效抗艾滋病疫苗的概念被进一步更新。

在这三个阶段中，全球进行的AIDS候选疫苗的临床实验超过170项。其中进入II期临床研究的不到十分之一。其中的大多数都是小范围的I期临床实验，借以评价不同的HIV抗原和载体系统疫苗的安全性并获得初步的免疫数据。临床试验中测试的疫苗形式包括：

病毒样颗粒化疫苗。病毒样颗粒是利用HIV的GAG等基因自身可以组装成颗粒样结构的特性，在昆虫细胞-杆状病毒表达系统等中表达GAG等基因后分离纯化得到的一种不含病毒核酸的假病毒颗粒。由于它具有很强的免疫原性及很好的安全性，作为HIV的侯选疫苗倍受学者们的重视。至今只有英国生物技术PLC公司HIVp17/p24：Ty-VLP曾进行人体试验。

多肽疫苗。曾进行人体试验的多肽疫苗有Wyeth-Lederle的HIVC4-V3多价多肽疫苗，CIGB的TAB9，法国国家艾滋病研究机构的LIPO-6、LTB-36(gp24E-V3 MN)、LIPO-5、IPO-6T，Cel-Sci的HGP-30，UBI的SynVac、HIV免疫多价多肽疫苗、HIV-1免疫单多肽疫苗、P3C541b脂蛋白疫苗、Biovector Sar的PO-4T。

蛋白亚单位重组疫苗。曾进行人体试验的蛋白亚单位重组疫苗有VaxGen的AIDSVAX B/E，Genentech Inc/VaxGen的AIDSVAX B，GlaxoSmithKline的N/A，法国国家艾滋病研究机构的gp160MN/LAI-2，St Jude儿童研究医院的EnvPro，AVANT免疫治疗公司的LFn-p24，以及高级生物科学实验室的疫苗。

细菌载体重组疫苗。至今曾进行人体试验的细菌载体重组疫苗只有Chiron的Salmonella typhi CVD 908-HIV-1 LAI gp 120(VVG203)，目前已停止试验。

病毒载体疫苗。曾进行人体试验的病毒重组疫苗有法国国家艾滋病研究机构的ALVAC vCP205、ALVAC vCP1521、ALVAC vCP1452、NYVAC-HIVC(vP2010)，Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH(IDT)的MVA.HIVA，Merck的Ad5和MRKAd5 HIV，澳大利亚和泰国疫苗联合协会的rFPV-HIV-B，AlphaVax的AVX 101。

DNA疫苗。曾进行人体试验的DNA疫苗有Vical公司的N/A、ADVAX、VRC4302、VRC-HIVDNA009-00-VP和pGA2/JS2，Cobra的HIVA，Wyeth-Lederle的APL 400-047、GENEVAX-HIV(APL400-003)，Epimmune的EP HIV-1090，FIT BIOTECH的GTU-Nef，澳大利亚和泰国疫苗联合协会的pHIS-HIV-B，以及马萨诸塞大学医学院研制的疫苗。

新型疫苗的研究必须有新的战略，在详尽研究病毒分子结构及其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫应答的分子，激活宿主免疫细胞产生保护性免疫应答(中和抗体及CTL)的分子，从而在病毒基因水平上进行人工剪切修饰及组合，去除抑制免疫应答的组分，保留诱导编码不同的保护性片段，重建成人工疫苗，则可提高免疫效果，抑制病毒突变的免疫逃逸。以抗原表位为基础的DNA疫苗即具备了上述特点。抗原表位是抗原中诱生特异性免疫应答的最基本的结构和功能单位。表位疫苗只把证明可以诱导免疫反应的抗原部分(表位，epitope)用作免疫原(candidate vaccine/vaccine，候选疫苗/疫苗)，去除了免疫无关、免疫抑制及免疫病理等序列。

近几年来，发现AIDS、结核及乙型肝炎等一些慢性疾病的持续性感染中，应用其治疗性疫苗后，可有效调动机体的免疫应答，增强天然免疫力，在控制感染方面发挥重要作用，从而使得疫苗在治疗方面的作用受到人们的广泛关注，成为当前病毒研究的热点。虽然治疗性疫苗在应用上有其局限性，但对某些慢性感染、持续性感染、周期性复发性疾病、肿瘤等的治疗，以及作为某些传染病的辅助治疗，控制微生物感染和提高机体免疫应答能力上，还是有着广阔的发展前景。治疗性疫苗与预防性疫苗相比，不但在免疫机理上不同，且各有其特点，前者的接种对象大多是持续性慢性感染者，或无症状的带毒者，且机体的免疫应答能力低下；后者的接种对象则是广大的易感的健康群体，免疫应答能力正常。另外，二者在组成成分上有所不同，治疗性疫苗不像预防性疫苗那样仅为保护性抗原成分，而是根据需要，对治疗性疫苗的成分作各种最佳组合，且十分强调佐剂的作用。治疗性疫苗是用高度纯化的微生物抗原及能提高机体免疫力的其它成分组合而成，所以其免疫原性强，对免疫系统有较强的刺激作用，且可通过不同途径把微生物抗原提呈给免疫系统，诱导机体免疫力的产生，并可打破免疫耐受，提高机体自身对病原微生物的特异性免疫应答等。另外，导致这些慢性疾病的病原微生物又多为胞内寄生性，免疫物质难以发挥作用，患者的细胞介导免疫(CMI)又多发生缺陷，注射疫苗后，则可通过改善机体的免疫状态，刺激恢复特异性CMI应答，达到根除病原，防止疾病复发的目的。

目前阶段，疫苗的形式仍为DNA疫苗、活载体疫苗。但疫苗的作用机制主要在于激活对不同亚型的HIV感染、具有交叉保护作用的细胞免疫或中和抗体。核酸疫苗不仅能高效诱导免疫应答，而且有明显的治疗作用。随着对核酸疫苗免疫机制认识的不断深入和对核酸疫苗结构及免疫方法的不断改进，这种新型疫苗必将成为有效的治疗性疫苗。DNA疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似。因此，可以表达出与病原体相似的抗原。同时，两者的抗原提呈过程亦相同，因而，可以与自然感染一样诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫。这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的。另外，DNA疫苗引发的免疫应答持久。由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，可以有效持续刺激免疫系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种以HIV抗原表位为基础的新型基因工程治疗预防两用DNA疫苗，以及其构建模式和其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种HIV复合多表位DNA疫苗，其是以HIV-1衣壳蛋白p24为载体骨架分子，以ER信号肽作为引导序列，包含有HIV基因组中26个高度保守的免疫优势表位，其中包括3个中和抗体表位和23个CTL表位；1个HIV-1分离株共有抗体表位；以及1个MHC非限制性的辅助性T淋巴细胞表位和1个破伤风毒素B细胞表位；共29个表位的HIV复合多表位DNA疫苗。同时，对基因启始密码子ATG的前后碱基序列作了设计和调整，使之符合Kozak规则；考虑到宿主细胞表达外源蛋白时对密码子的偏爱性，还对密码子进行了相应的调整，以期获得最佳的免疫效果。

本发明的HIV复合多表位DNA疫苗，其中所述DNA疫苗包含的29个表位为新合成的抗原表位MEGN与前期设计的抗原表位MEG，除包含已申报专利(申请号：03127002.6)的抗原表位MEG外(见下表中表位18-29)，在此基础上新增了17个高度保守的CTL免疫优势表位MEGN(见下表中表位1-17)，中国流行株HIV-1的pol、RT、IN、vpr、tat、gp160和nef以及HIV-2的p24、p17等主要结构及调控蛋白基因。选择上，以保守性、具广泛交叉反应、在病人和动物实验上均经验证的经典优势表位为主；且重点选择HIV非结构蛋白的CTL表位；同时结合国内和亚洲HIV流行的新特点，以GenBank上新近发表的HIV亚型毒株(GenBank登录号：AX149898)为参考对表位进行了调整；其中反转录酶(RT)的两个表位是在产生耐药的病人中仍然出现免疫识别反应的表位；其他的一些结构蛋白和调控蛋白的表位也是具有广泛交叉反应的表位，且考虑到他们结合不同的HLA表型；其中p17表位能被HIV-1和HIV-2感染者交叉识别。所选表位如下表或如SEQ ID No.5～33所示：

序号	表位序列	来源	表位性质
				1	VTIKIGGQLK	HIV-1Pol	CTL
2	KMIGGIGGFI	HIV-1Pol	CTL
				3	VLVGPTPVNI	HIV-1Pol	CTL
4	ALTAICDEM	HIV-1RT	CTL
				5	ILKEPVHGV	HIV-1RT	CTL
6	LLWKGEGAV	HIV-1IN	CTL
				7	FPRPWLHSL	HIV-1Vpr	CTL
8	AIIRILQQL	HIV-1Vpr	CTL
				9	RKKRRQRRS	HIV-1Tat	CTL
10	VTVYYGVPVWK	HIV-1Gp160	CTL
				11	KLTPLCVTL	HIV-1Gp160	CTL
12	TMGAASITL	HIV-1Gp160	CTL
				13	SLVDTIAIAV	HIV-1Gp160	CTL
14	FPVRPQVPL	HIV-1Nef	CTL
				15	SLYNTVATL	HIV-2p17	CTL
16	TPYDINQML	HIV-2p24	CTL
				17	TSTVEEQQIW	HIV-2p24	CTL
18	RGPGRAFVTI	HIV-1Env	T
				19	AMQMLKETI	HIV-1Gag	T
20	ELDKWA	HIV-1Env	B
				21	DRVIEVVQGAYRAIR	HIV-1Env	T
22	RILAVERYLKD	HIV-1Env	B
				23	PLTFGWCYKL	HIV-1Nef	T

24	RGPDRPEGIEEEGGERDRDRS	HIV-1Env	B
				25	VLEWRFDSRL	HIV-1Nef	T
26	VIYQYMDDL	HIV-1Pol	T
				27	AKFVAAWTLKAAA	universal	Th
28	RTPKIQV	universal	B
				29	QYIANSKFIGITEL	tetanus toxin	B(TT)

表中所示表位按照表位在HIV基因组上的先后顺序排列，其中HIV-2的3个表位位于全长多表位基因的末端，通过小分子柔性氨基酸Linker连接，全基因化学合成得HIV复合多表位DNA疫苗。

其中抗原表位MEGN基因的特征序列可以为：HIV多表位DNA疫苗基因左侧序列-如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列-HIV多表位DNA疫苗基因右侧序列。

上述的DNA疫苗，全基因序列可以为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列。

上述的DNA疫苗，通过细胞转染试验，证明目的基因有效表达且具有抗原性。

上述的DNA疫苗，通过小鼠免疫试验，表明该疫苗可诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位的特异性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有免疫原性。

上述的DNA疫苗，通过转染人外周血来源DC细胞并与自体人T淋巴细胞共培养，可诱导产生针对所选表位的特异性体液免疫和细胞免疫反应，表明该疫苗在人体中应用的可行性。

上述技术方案具有如下优点：通过详尽了解AIDS病原HIV-1和HIV-2基因组结构及其与感染和免疫紧密相关的抗原表位的基础上，本着平衡免疫应答、并重点加强细胞免疫的原则，在HIV-1的pol、RT、IN、vpr、tat、gp160和nef以及HIV-2的p24、p17等9个基因中甄选了17个T细胞表位(其中包括3个HIV-2CTL表位)。这些表位以保守性、具广泛交叉反应、在病人和动物实验上均经验证的经典优势表位为主，且重点选择HIV非结构蛋白的CTL表位，同时结合国内和亚洲HIV流行的新特点，并以GenBank上新近发表的HIV亚型毒株为参考对表位进行了调整。通过柔性连接肽Linker，将这些表位组合在一起，全基因化学合成后得到新型复合多表位MEGN基因。将此表位基因插入到前期构建并已申报专利的DNA疫苗pVAXI-MEGp24(申请号：03127002.6)中，构建出以HIV P24蛋白为基本骨架、含有29个多表位的新型复合多表位治疗性DNA疫苗pVAXI-MEGNp24。该DNA疫苗重组体转染BHK21细胞，RT-PCR及间接免疫荧光检测表明，目的蛋白成功表达，表达产物可以分别被标准HIV-1阳性血清及抗HIV-1P24的单克隆抗体所识别。该疫苗免疫BALB/c小鼠后进行免疫学指标的检测，结果显示这该疫苗可刺激小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫反应。该疫苗转染人外周血来源的DC细胞，与自体T淋巴细胞共培养，进行免疫学指标检测，结果显示该疫苗可刺激人DC细胞产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，表明该疫苗在人体中应用的可行性。该疫苗既可用于健康人群的预防接种，也可用于已感染艾滋病病毒人群的免疫治疗，具预防和治疗双重功能。该疫苗可用于不同流行株HIV的预防和治疗。可通过任何形式进行人体免疫和治疗，包括注射剂、喷雾剂、微胶囊等，且不限于以上形式。该疫苗可以与任何药物(抗病毒药物、治疗性抗体等)进行联合应用。

附图说明

图1是本发明实施例多表位基因MEGN的核苷酸与氨基酸序列及注释；

图2是本发明实施例核酸疫苗质粒pVAX1-MEGNp24结构图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明综合利用分子生物学、分子病毒学、分子免疫学、细胞生物学、生物信息学等不同学科知识、技术结合生物信息学模拟、分子设计、表位选择以及基因重组技术，针对引起AIDS的病原体HIV以及艾滋病研究领域的经验、教训和最新研究成果，综合考虑HIV的特性、基因组结构和特点以及与感染和免疫紧密相关的问题，在分子水平上构建了一种针对不同亚型、不同流行株均有治疗和预防作用的新型HIV复合多表位基因工程治疗及预防疫苗pVAX1-MEGNp24。该疫苗通过接种机体，能够诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫反应，达到预防病毒感染或特异杀伤体内游离病毒及病毒感染细胞而清除体内病毒的目的，既可以作为预防性疫苗用于健康人群的免疫接种，也可以作为治疗性疫苗用于已感染HIV或身患AIDS的病人的免疫治疗。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版相关章节进行。

申请号为03127002.6，发明名称为“HIV多表位DNA疫苗及HIV复合多表位DNA疫苗”的中国专利申请的全文内容引用在本申请中。

实施例1HIV多表位DNA疫苗的建立

在前期完成的HIV-1MEGp24表位设计的基础上(中国专利申请号：03127002.6)，进一步应用反向疫苗学理论，经检索权威的美国洛斯阿拉莫斯(Los Alamos)艾滋病毒分子免疫学数据库(HIVMolecular Immunology Database)，并参考了犹他州立大学(The University of Utah)的艾滋病毒表位数据库(HIV Epitope Database，http://lava.genetics.utah.edu/epitopeDBv3/index.cfm)，搜索HIV-1和HIV-2的CTL及CD8T细胞表位(http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/ctl_search)。本着平衡免疫应答、并重点加强特异性细胞免疫(CTL)诱导的设计理念，在HIV-1Env、Gag、Nef、Pol、Rt、Vpr、Tat以及HIV-2p24、p17等主要结构及调控蛋白基的17个高度保守的CTL免疫优势表位。选择上，以保守性、广泛交叉反应、在病人和动物实验上均经验证的经典优势表位为主，且重点选择HIV非结构蛋白的CTL表位，同时结合国内和亚洲HIV流行的新特点，以GenBank上新近发表的HIV亚型毒株(邵一鸣，AX149898，HIV-1 inter-subtype)为参考对表位进行调整。以小分子柔性氨基酸连接，形成一段新的人工多表位序列。进行全基因化学合成。

1、HIV多CTL表位抗原基因(MEGN)的合成

由捷瑞生物工程(上海)有限公司，采用全基因合成的方法进行人工化学合成，并克隆入pMD18-T simple载体，命名为pMD18T-MEGN。

多表位基因MEGN的设计如图1所示。

2、质粒pVAX1-MEGNp24的构建

从pVAX-MEGp24中将MEGp24基因以EcoR I+Xho I双酶切并回收连接入pAAV-MCS中，将pMD18-MEGN上的目的基因片断用Xba I双酶切后，与用相同酶切的pAAV-MEGp24载体片段进行连接，得到中间质粒pAAV-MEGNp24。从pAAV-MEGNp24中将MEGNp24基因以EcoR I+Xho I双酶切并回收连入pVAX1中，得到最终表达质粒pVAX1-MEGNp24。

所获得含有29个表位的核酸疫苗质粒图谱如图2所示。

3、重组表达质粒转染哺乳动物细胞

(1)接种细胞：

将处于对数生长期的BHK-21细胞。贴壁细胞用胰酶消化后，制备成3×10⁵/mL细胞悬液，于3cm细胞培养板上加入3mL细胞悬液，于37℃、5％CO₂下培养过夜。

(2)转染：

取待转染质粒5-10μg，加入无血清1640培养基500μL混匀，温育30分钟，另取脂质体溶液(Lipofectamine)2mg/mL 10μL，加入无血清1640培养基500μL，混匀后温育30分钟，将上述两种溶液逐滴加入，吹气混匀，室温下静置30分钟后，加入转染的BHK-21细胞培养液中，37℃、5％CO₂下培养孵育10-12小时后，补加3mL含10％FBS的1640细胞培养液，37℃、5％CO₂下培养。

将获得的重组表达质粒感染BHK-21细胞。于感染后48h收获细胞，检测目的蛋白的表达。

4、重组表达质粒表达产物的检测

(1)RT-PCR检测pVAX-MEGNp24重组核酸疫苗的转染与表达

重组质粒转染细胞24h～48h，收获细胞，提取细胞总RNA后，进行反转录反应：Oligo dT，1μL；总RNA，8μL；补至15μL。将上述反应体系至于70℃，持续5min后，迅速放入冰浴中，加入M-MLV，1μL；酶抑制剂，1μL；5X10buffer，6μL；dNTP，1.5μL；H₂O补至30μL。该体系至于42℃反应1h，然后至于95℃，作用5min；迅速冰浴后利用特异性引物对FP/RP对cDNA进行PCR反应。

上游引物FP：5′-CTG GTC CCAATG CTT TTA GAA TAG-3′；核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

下游引物RP：5′-CAG CCC ATA TCAACC TAG AAC TTT A-3′；核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在50μL反应体系中进行PCR扩增(10×Ex Taq Buffe 5μL、2.5mM dNTP Mixtμre 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、反转录产物3μL、TaKaRa Ex Taq酶0.25μL、灭菌蒸馏水35.75μL)PCR反应条件：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖电泳观察目的条带扩增情况。

扩增结果表明，转染质粒pVAX-MEGNp24的BHK-21细胞扩增出700bp目的片段，与预期相符，而转有质粒pCS对照的细胞中未能扩增到任何基因片段。证明特异性的目的基因在真核细胞中进行了转录。

(2)间接免疫荧光鉴定表达产物

在6×30mm培养板中放入盖玻片，传代培养BHK21细胞。次日，在500mL无血清MEM中加入10mg欲转染的质粒，混匀。另取500mL无血清MEM，加入10mL转染试剂(Lipofectin Reagent)，混匀。将含有质粒的500mL MEM逐滴加入含有转染试剂的500mLMEM中，轻轻混匀，室温静置30分钟。将长成40％-60％单层BHK21细胞的培养液MEM吸出，用无血清MEM洗两次，加入上述含脂质体包裹的质粒的1mL MEM，于37℃、5％CO₂感作16-18小时后补加3mL含5％小牛血清MEM，继续培养48小时。以上操作均需在无菌条件下进行。

取出盖玻片，PBS(pH7.2)漂洗一次，冷丙酮固定10-15分钟。PBS洗涤3次，与HIV-1阳性血清(1∶300)反应1.5小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG反应1.5小时。PBS洗涤3次，在载玻片上滴一滴甘油缓冲液(50％甘油PBS)，将载有细胞的盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下，波长495nm处观察和拍照。

间接免疫荧光(IFA)检测显示，转染重组核酸疫苗质粒pVAXI-MEG-p24的BHK21细胞，在核周围及细胞浆中出现与特异性荧光抗体发生反应的黄绿色荧光，而对照质粒pVAXI转染的细胞看不到黄绿色荧光。结果说明，构建的核酸疫苗质粒表达了MEG-p24蛋白。

实施例2HIV复合多表位DNA疫苗小鼠免疫实验研究

1、实验分组、小鼠免疫及采样

将BALB/c雌性小鼠20只随机分2组，每组10只，分别为pVAX1空质粒对照组、pVAX-MEGNp24质粒免疫组。免疫分三次进行，间隔14d。每次向小鼠的双侧胫前肌注射100μg rDNA(溶于100μL无菌生理盐水中)。于二免后2周取血，置4℃过夜，5000rpm离心10min，收集血清，-20℃保存备检测用。第3次免疫后第10d摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测细胞因子；同时无菌取其脾脏制备脾细胞悬液，分别用于特异性CTL活性测定、淋巴细胞转化实验和Th1/Th2类细胞因子检测。

2、CTL活性检测

(1)脾脏单淋巴细胞悬液制备

断头处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，在六孔板中加入4mL淋巴细胞分离液，轻轻研磨小鼠脾脏至淋巴细胞分离液中，用尼龙网过滤至10mL离心管中(液体容易挥发，操作时应尽量迅速)，在离心前覆盖上大约200μL的1640培养基。800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，吸出淋巴细胞层，再加入5mL 1640培养基，250g离心10min，弃上清，加入1mL 1640重悬细胞，计数。调细胞数至2×10⁷个/mL，备用。

(2)脾细胞特异性CTL活性检测

制备免疫小鼠的脾细胞悬液，调整细胞浓度至5×10⁷个/mL，RPMI 1640培养并加入hIL-2至终浓度100U/mL，继续培养2d，即为效应细胞。

将H-2d限制性HIV识别表位多肽与H22细胞在37℃5％CO₂培养箱共孵育2h，制备成相应肽标记的靶细胞。

将H-2d限制性HIV识别表位多肽及无关对照肽AGCKNFFWKTFTSC为体外刺激原，与小鼠的脾细胞于37℃，5％CO₂培养箱共孵育2h，加入丝裂霉素C至终浓度为40mg/L，培养2h后用PBS洗涤细胞4次，以除掉丝裂霉素。制备成相应肽标记的刺激细胞。制备免疫小鼠的脾细胞悬液，调整细胞浓度至5×10⁷个/mL。靶细胞和刺激细胞各1mL加入60mm细胞培养皿，补加2mLRPMI1640，培养24h后加入IL-2至终浓度10μg/mL，继续培养5天。2000r/min离心5min。沉淀以RPMI1640悬浮，调整细胞浓度至10⁷个/mL。作为效应细胞。以乳酸脱氢霉释放法检测CTL反应。96微孔板上划分好样品、自然释放及最大释放孔，效靶细胞比例(E/T)为20∶1、50∶1、100∶1，每孔补加RPMI1640至200μL，每组设3个复孔，效靶细胞于37℃5％CO2共同孵育4h，取上清50μL，加入LDH作用底物50μL，室温、闭光反应30min后加50μL终止液终止反应，490nm下测吸光度，计算公式如下：

杀伤活性(％)＝(实验孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值-效应细胞自然释放孔OD值)/(最大释放管孔OD值-靶细胞自然释放管孔OD值)×100％

结果表明：在3种效靶比(100∶1、50∶1、25∶1)下，HIV rDNA疫苗能诱导免疫小鼠产生针对HIV-1 H-2d限制性非结构蛋白及p17蛋白CTL表位的特异性CTL杀伤活性(与对照组相比，p＜0.05)。pVAX-MEGNp24特异性CTL杀伤效率在三免时能达到80％。

3、Th1/Th2类细胞因子的检测

参照eBioscience公司Human Th1/Th2 cytometric ELISA assaykits使用说明书操作；所得数据以ΔX±SD表示，并进行统计学分析(t检验)。

结果表明：pVAX-MEGNp24接种BALB/c小鼠后，对脾细胞培养上清和血清中Th1类细胞因子(IFN-γ和IL-2)、Th2类细胞因子(IL-4和IL-10)含量进行了检测，证实候选DNA疫苗对体液免疫水平和细胞免疫水平都有增强作用。

实施例3HIV复合多表位DNA疫苗人体外活细胞免疫效果研究

1、样品采集：

EDTA抗凝血采集后6小时内送实验室处理，筛选献血员遗传背景为HLA-0201。

2、人PBMC分离：

(1)将抗凝血转移至50mL离心管，用1640培养基稀释(1∶3)。

(2)将50mL离心管加入15mL Ficoll淋巴细胞分层液。

(3)将稀释的血液缓慢加到分层液表面，注意不要破坏液面。

(4)20℃700g离心30分钟。

(5)将分层液上面的淋巴细胞层吸至50mL离心管中，注意勿吸到红细胞层。

(6)加入1640培养基40mL，颠倒混匀。600g离心10分钟。

(7)倒掉上清，分散细胞团后重复洗涤一次。

(8)20℃600g离心10分钟，倒掉上清，分散细胞团，用完全1640培养基调整细胞浓度为3×10⁶/mL。

3、PBMC来源DC细胞的诱导：

(1)将新分离的PBMC转移至24孔细胞培养板中，每孔3×10⁶个细胞。

(2)37℃5％CO2孵育2小时，促进单核细胞贴壁。注意，培养过程中请勿晃动培养板。

(3)吸取上清液，将未吸附的细胞冻存于液氮中。

(4)加入完全RPMI 1640培养，洗涤贴壁细胞。

(5)加入含有5％FCS的CRPMI 1640(CRPMI 1640中主要包括：RPMI 1640，4mM L-glutamine，100μM nonessential amino acids，1mM sodium pyruvate，50μM 2-ME，10mM HEPES，50μg/mLgentamycin)以及rhGM-CSF(100ng/mL)，rhIL-4(200ng/mL)。

(6)置于37℃5％CO2孵育3天。

4、转染DC细胞：

(1)吸取细胞悬液，20℃ 700g离心15分钟。

(2)倒掉上清液，加入RPMI 1640培养基，洗涤一次，700g离心15分钟。

(3)倒掉上清液，重复洗涤一次。

(4)倒掉上清液，加入RPMI 1640培养基，并计数，调整细胞浓度至1.6×106/mL。

(5)在400μL RPMI 1640培养基中加入4μg质粒DNA，并加入12μL TransFast reagent，室温放置15min。

(6)将600μL细胞悬液(含有1×10⁶个DC细胞)加入到DNA/liposome混合液中，37℃5％CO2孵育1小时。

(7)吸取细胞悬液，以RPMI 1640培养基，洗涤两次。

5、诱导DC细胞成熟：

(1)用含有5％FCS的CRPMI 1640重悬新转染的DC细胞，并转移至24孔细胞培养板中，每孔3×10⁶个细胞。

(2)加入rhIL-1(10ng/mL)，rhIL-6(10ng/mL)，rhTNF-α(20ng/mL)和PGE2(500ng/mL)。

(3)37℃5％CO2孵育2天。

(4)以流式方法检测DC细胞表面CD86，HLA-DR，CD83的表达变化。

6、成熟DC细胞与自体淋巴细胞共培养：

将诱导成熟的DC细胞浓度调整至1×10⁶/mL，与自体淋巴细胞1∶3比例混合，于37℃5％CO₂共培养7天。7天后，在每份样品加入多肽刺激物，使单肽终浓度4μg/mL，继续培养20小时。

7、培养上清中细胞因子检测：

参照eBioscience公司Human Th1/Th2 cytometric ELISA assaykits使用说明书操作；所得数据以ΔX±SD表示，并进行统计学分析(t检验)。

结果表明：pVAX-MEGNp24能够增强共培养上清中Th1类细胞因子(IL-2)、Th2类细胞因子(IL-4)的表达分泌水平，证实候选DNA疫苗对体液免疫水平和细胞免疫水平都有增强作用。

8、CTL活性检测：

将HLA-0201限制性HIV识别表位多肽AIIRILQQL，LLWKGEGAV，ILKEPVHGV，VLVGPTPVNI，KLTPLCVTL，SLYNTVATL与T2细胞在37℃5％CO₂培养箱中共孵育2小时，制备成相应肽标记的靶细胞。

其余步骤参照实施例2。

结果表明：pVAX-MEGNp24表现出较高水平的特异性的CTL杀伤活性，在效靶比30∶1时杀伤率高达12±3.3％。在效靶比为30∶1，10∶1和3∶1时，杀伤率均显著高于对照组(P＜0.01)。

9、IFN-γ检测：

(1)向共培养物中加入Brefeldin A，继续培养20小时。

(2)收获细胞，用含有0.1％azide的FACS缓冲液洗涤一次，分别加入单抗PE-CD4及PE-CD8，震荡混匀后4℃避光30分钟。

(3)利用Cytofix/Cytoperm kit进行细胞膜的固定及穿孔。

(4)分别加入单抗PE-IFN-γ，4℃避光30分钟，流式细胞仪检测。

结果表明：pVAX-MEGNp24能够显著提高机体的细胞免疫应答能力，能够有效提高CD4+T以及CD8+T细胞分泌表达IFN-γ。

上述实验表明，本发明设计的新型HIV复合多表位DNA疫苗具有良好的抗原性和免疫原性，能够诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位及衣壳蛋白P24的特异性体液免疫和细胞免疫反应。同时，该疫苗转染人外周血来源DC细胞后，与自体人T淋巴细胞共培养后，可刺激细胞产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，表明疫苗在人体中应用的可行性。

本发明所制备的重组DNA疫苗，具有预防和治疗双重功能，既可用于健康人群的预防接种，达到预防病毒感染的目的，也可用于已感染艾滋病病毒人群的免疫治疗，达到特异杀伤体内游离病毒及病毒感染细胞而清除体内病毒的目的，具有良好的发展前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120>一种HIV复合多表位DNA疫苗及其应用

<130>KHP09112594.1

<160>33

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>657

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tctagaccaa tggtcacaat aaagataggg gggcaattaa aggcagctgc aaaaatgata     60

gggggaattg gaggtttcat cggaggcgga gtattagtag gacctacacc tgtcaacata    120

ggaggcggag cattaacagc aatttgtgat gaaatggcag ctgcaattct aaaagaacca    180

gtacatggag tagcagctgc actactctgg aaaggtgaag gggcagtagc agctgcattt    240

cctagaccat ggcttcatag cttaggaggc ggagccataa taagaatcct gcaacaactg    300

ggaggcggaa ggaagaagcg aagacagcga cgaagcgctg ccgctgtcac agtctattat    360

ggggtacctg tatggaaagg aggcggtaag ttgaccccac tctgtgtcac tttagctgga    420

agcactatgg gcgcggcgtc aataacgctg gctgccgcta gtctggttga taccatagca    480

atagcagtag cagctgcatt tccagtcaga cctcaggtac ctttagcagc tgcaagcctg    540

tacaacaccg tcgccaccct ggcagctgca accccctacg acatcaacca gatgctggca    600

gctgcaacca gcaccgtcga ggagcagcag atctgggcag ctgcaatcga ttctaga       657

<210>2

<211>1935

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccaccatgg gaatgcaggt gcagatccag agcctgtttc tgttgttgct gtgggtgccc     60

gggtccagag gaaggggacc agggagagca tttgttacaa tagccaagtt cgtggctgcc    120

tggaccctga aggctgccgc tggaggcgga cgcaccccca agatccaggt ggcagctgca    180

cagtacatca aggctaatag caaattcatc ggaatcaccg agctgggatc catgtaccct    240

atagtgcaaa acctccaggg gcaaatggta catcagccca tatcacctag aactttaaat    300

gcatgggtaa aagtagtaga agagaaagct tttagcccag aagtaatacc catgttttca    360

gcattatcag aaggagccac cccacaagat ttaaacacca tgctaaacaa agtgggggga    420

catcaagcag caatgcaaat gttaaaagaa accatcaatg aagaagctgc agaatgggat    480

agattgcatc cagtgcatgc agggccagtt gcaccaggcc agatgagaga accaagagga    540

agtgacatag caggaactac tagtactctt caggagcaaa taggatggat gacaaataat    600

ccacctatcc cagtaggaga aatctataaa agatggataa tcctgggatt aaataaaata    660

gtaagaatgt atagccctac ctgcattctg gacataagac aaggaccaaa ggaacccttt    720

agagactatg tagaccggtt ctataagact ctaagagccg agcaagcttc acaagatgta    780

aaaaattgga tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccagattg taagactatt    840

ctaaaagcat tgggaccagc agctacacta gaagaaatga tgacagcatg tcagggagtg    900

gggggaccca gccataaagc aagaattttg gctgaatcta gaccaatggt cacaataaag    960

ataggggggc aattaaaggc agctgcaaaa atgatagggg gaattggagg tttcatcgga   1020

ggcggagtat tagtaggacc tacacctgtc aacataggag gcggagcatt aacagcaatt   1080

tgtgatgaaa tggcagctgc aattctaaaa gaaccagtac atggagtagc agctgcacta   1140

ctctggaaag gtgaaggggc agtagcagct gcatttccta gaccatggct tcatagctta   1200

ggaggcggag ccataataag aatcctgcaa caactgggag gcggaaggaa gaagcgaaga   1260

cagcgacgaa gcgctgccgc tgtcacagtc tattatgggg tacctgtatg gaaaggaggc   1320

ggtaagttga ccccactctg tgtcacttta gctggaagca ctatgggcgc ggcgtcaata   1380

acgctggctg ccgctagtct ggttgatacc atagcaatag cagtagcagc tgcatttcca   1440

gtcagacctc aggtaccttt agcagctgca agcctgtaca acaccgtcgc caccctggca   1500

gctgcaaccc cctacgacat caaccagatg ctggcagctg caaccagcac cgtcgaggag   1560

cagcagatct gggcagctgc aatcgattct agagccatgc aaatgttaaa agagaccatc   1620

gcagctgcag aattagataa atgggcagca gctgcagata gggttataga agtagtacaa   1680

ggtgcttata gagctattcg cgcagctgca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag   1740

gatgcagctg caccactgac ctttggatgg tgctacaagc tagcagctgc aaggggaccc   1800

gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag acagagacag atccgcagct   1860

gcagtgttag agtggaggtt tgacagccgc ctagcagctg cagtcatcta tcaatacatg   1920

gatgatttgt agtaa                                                    1935

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctggtcccaa tgcttttaga atag                            24

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cagcccatat caacctagaa cttta                           25

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 PoL

<400>5

Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys

1               5                   10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 PoL

<400>6

Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile

1               5                   10

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 PoL

<400>7

Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile

1               5                   10

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 RT

<400>8

Ala Leu Thr Ala Ile Cys Asp Glu Met

1               5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 RT

<400>9

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val

1               5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 IN

<400>10

Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val

1               5

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Vpr

<400>11

Phe Pro Arg Pro Trp Leu His Ser Leu

1               5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Vpr

<400>12

Ala Ile Ile Arg Ile Leu Gln Gln Leu

1               5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Tat

<400>13

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Ser

1               5

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>HIV-1 Gp160

<400>14

Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys

1               5                   10

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Gp160

<400>15

Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu

1               5

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Gp160

<400>16

Thr Met Gly Ala Ala Ser Ile Thr Leu

1               5

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 Gp160

<400>17

Ser Leu Val Asp Thr Ile Ala Ile Ala Val

1               5                   10

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Nef

<400>18

Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu

1               5

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-2 p17

<400>19

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1               5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-2 p24

<400>20

Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu

1               5

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-2 p24

<400>21

Thr Ser Thr Val Glu Glu Gln Gln Ile Trp

1               5                   10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 Env

<400>22

Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile

1               5                   10

<210>23

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Gag

<400>23

Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile

1               5

<210>24

<211>6

<212>PRT

<213>HIV-1 Env

<400>24

Glu Leu Asp Lys Trp Ala

1               5

<210>25

<211>15

<212>PRT

<213>HIV-1 Env

<400>25

Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Tyr Arg Ala Ile Arg

1               5                   10                  15

<210>26

<211>11

<212>PRT

<213>HIV-1 Env

<400>26

Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp

1               5                   10

<210>27

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 Nef

<400>27

Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu

1               5                   10

<210>28

<211>21

<212>PRT

<213>HIV-1 Env

<400>28

Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg

1               5                   10                  15

Asp Arg Asp Arg Ser

            20

<210>29

<211>10

<212>PRT

<213>HIV-1 Nef

<400>29

Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu

1               5                   10

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>HIV-1 Pol

<400>30

Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu

1               5

<210>31

<211>13

<212>PRT

<213>universal

<400>31

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1               5                   10

<210>32

<211>7

<212>PRT

<213>universal

<400>32

Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val

1               5

<210>33

<211>14

<212>PRT

<213>tetanus toxin

<400>33

Gln Tyr Ile Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1               5                   10

Claims (7)

1.一种HIV复合多表位DNA疫苗，其特征在于，该DNA疫苗编码蛋白是以HIV-1衣壳蛋白p24为载体骨架分子，以ER信号肽作为引导序列，所述DNA疫苗编码蛋白包含的29个表位为新合成的抗原表位MEGN与前期设计的抗原表位MEG，所述抗原表位MEG为下表所列表位18-29；所述抗原表位MEGN为HIV基因组中17个高度保守的CTL免疫优势表位，如下表1-17所示：

  序号   表位序列   来源   表位性质   1   VTIKIGGQLK   HIV-1PoL   CTL   2   KMIGGIGGFI   HIV-1PoL   CTL 3 VLVGPTPVNI HIV-1PoL CTL   4   ALTAICDEM   HIV-1RT   CTL   5   ILKEPVHGV   HIV-1RT   CTL   6   LLWKGEGAV   HIV-1IN   CTL   7   FPRPWLHSL   HIV-1Vpr   CTL   8   AIIRILQQL   HIV-1Vpr   CTL 9 RKKRRQRRS HIV-1Tat CTL   10   VTVYYGVPVWK   HIV-1Gp160   CTL   11   KLTPLCVTL   HIV-1Gp160   CTL   12   TMGAASITL   HIV-1Gp160   CTL 13 SLVDTIAIAV HIV-1Gp160 CTL   14   FPVRPQVPL   HIV-1Nef   CTL   15   SLYNTVATL   HIV-2p17   CTL   16   TPYDINQML   HIV-2p24   CTL   17   TSTVEEQQIW   HIV-2p24   CTL   18   RGPGRAFVTI   HIV-1Env   T

19 AMQMLKETI HIV-1Gag T   20   ELDKWA   HIV-1Env   B   21   DRVIEVVQGAYRAIR   HIV-1Env   T   22   RILAVERYLKD   HIV-1Env   B 23 PLTFGWCYKL HIV-1Nef T 24 RGPDRPEGIEEEGGERDRDRS HIV-1Env B 25 VLEWRFDSRL HIV-1Nef T   26   VIYQYMDDL   HIV-1Pol   T   27   AKFVAAWTLKAAA   universal   Th   28   RTPKIQV   universal   B 29 QYIANSKFIGITEL tetanus toxin B(TT)

编码表位按照氨基端至羧基端的顺序依次为18、27、28、29、1～17、19～26，通过小分子柔性氨基酸Linker连接，全基因化学合成得HIV复合多表位DNA疫苗。

2.如权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1或2所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有抗原性。

4.如权利要求1或2所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有免疫原性。

5.权利要求1或2所述的DNA疫苗在制备健康人群的预防接种疫苗中的应用。

6.权利要求1或2所述的DNA疫苗在制备已感染艾滋病病毒人群的免疫治疗疫苗中的应用。

7.如权利要求5或6所述的应用，所述疫苗为注射剂、喷雾剂或微胶囊。

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