CN103451199B

CN103451199B - 一种hiv-1多表位dna疫苗

Info

Publication number: CN103451199B
Application number: CN201310263257.1A
Authority: CN
Inventors: 周育森; 寇志华; 杨裔; 李军锋; 孙世惠; 赵光宇; 于虹; 郭彦; 陈万荣; 郭晶晶
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2013-06-27
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-06-27
Also published as: CN103451199A

Abstract

本发明公开了一种针对中国HIV主要流行株，并适合于中国人群MHC限制性的，包括env、gag和pol基因上的12个抗原表位编码序列的DNA疫苗，所述疫苗能引起机体显著的体液免疫应答和细胞免疫应答。

Description

一种HIV-1多表位DNA疫苗

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列及其作为DNA疫苗的应用，属于分子生物学和免疫学领域。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。自1981年世界报道首例艾滋病(AIDS)病例以来，短短30年间，艾滋病迅速在全球范围内蔓延扩散，成为当今全球最大的健康危机，也是影响我国公众健康的重要公共卫生问题。近年来，艾滋病感染在我国出现新的流行态势，即发病率逐年增加，感染对象覆盖不同人群，性传播比例增多，尤其是男-男同性恋病人上升显著，变异重组病毒在流行分离株中所占比例增多。如何有效防治HIV感染，降低发病率和病死率是我国面临的紧迫任务。疫苗是控制HIV感染的有效手段，在近30多年的研究工作中，HIV疫苗研发方面也取得了一些重要的进展。一种能够同时诱导体液和细胞免疫的HIV疫苗RV144的临床III期试验表明，该疫苗能够在一定程度上降低HIV的感染，从而降低艾滋病的发生。RV144疫苗采用了金丝雀重组痘病毒初免，重组蛋白疫苗加免的策略，初免的重组金丝雀痘病毒疫苗是一种以金丝雀痘病毒为载体的、表达HIV-1包膜蛋白(Envelope，EnV)gp120和HIV-1B gag蛋白及蛋白酶的重组病毒疫苗，加免的重组蛋白疫苗是HIV-1B/E gp120亚单位疫苗，其III期临床试验结果显示出31.25%的保护效率。但是目前仍然缺乏能够应用于人群的有效疫苗。

我国HIV-1感染形势不容乐观。截止到2012年10月，我国累计报告HIV-1感染者及病人总数达492191人，2012年前十个月新增发病人数及死亡人数与2011年同期相比均呈现增长趋势，且局部地区感染情况尤为严重。一种有效的HIV疫苗应该能诱导针对不同流行株、适用于不同人群，我国流行的HIV病毒与其它国家和地区不同，人群MHC限制性不同。目前还缺乏对我国HIV流行株和中国主要HLA亚型的疫苗，本发明的目的在于提供一种能针对中国多种HIV流行株适用于中国大多数人群MHC限制性的HIV多表位疫苗。

发明内容

本发明利用生物信息学方法，分析、筛选获得了HIV不同分离株和中国人大多数人群MHC限制性的保守表位；将各个表位依照不同的顺序，以不同的“linker”连接，获得包含12个保守性表位的多表位氨基酸序列，然后利用生物信息学方法，预测分析不同序列的免疫原性，基于提供HIV多表位DNA疫苗的发明目的，本发明首先提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多肽。

为使之适于在哺乳动物细胞内表达，通过密码子优化，在本发明的一个优选的技术方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种含有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的真核表达质粒。

在一个优选的技术方案中，所述表达质粒为pJW4303-YY1。

在另一个优选的技术方案中，所述表达质粒为pJW4303-YY2。

所述表达质粒可以在COS-7细胞中有效表达。

本发明提供的含有重组DNA的pJW4303-YY1和pJW4303-YY2免疫小鼠后，可以诱导机体产生针对多种表位的特异性抗体和细胞免疫，因此，本发明还提供了上述质粒在制备DNA疫苗中的应用。

本发明还提供了一种药物制剂，所述制剂含有pJW4303-YY1或pJW4303-YY2及制药学上可接受的助剂。所述助剂可以是缓冲液、防腐剂、赋形剂、分散剂、助溶剂、增溶剂、表面活性剂等。

在一个优选的技术方案中，所述制剂为注射制剂。

本发明所述的HIV多表位疫苗与目前报道的HIV多表位疫苗相比具有以下优势：①所设计的HIV多表位疫苗能够在一定程度上解决疫苗对于易于变异的HIV保护性问题，所选择的表位为在不同HIV分离株中保守的T细胞表位，其中的gp160上的序列不但包含Th表位和CTL表位，还包含能诱导广谱中和活性的B细胞表位，因此其诱导的免疫应答能够针对多种HIV流行株，可以有效预防和治疗多种HIV感染；②适于中国大多数人群使用，MHC限制性是影响疫苗发挥有效的免疫应答的重要因素，由于中国人群MHC与欧美等其他人群有着显著的不同，所选择的表位必须能被大多数不同的HLA亚型的人群所识别，本发明选择的表位可以被不同的HLA亚型分子所识别；③HIV多表位疫苗中的表位排列顺序和Linker的序列使得各个表位能够以合适的构象表达，从而诱导机体产生针对不同表位的免疫应答，不同表位的排列顺序和Linker是影响疫苗发挥免疫原性的关键因素，本研究通过对各个表位的顺序和Linker的优化，获得了优化的表位连接序列和方式；④所设计和构建的DNA疫苗能够在体内外有效表达，免疫后能诱导较强的体液免疫和细胞免疫。

说明书附图

图1HIV多表位DNA疫苗的酶切鉴定；

图2HIV多表位DNA疫苗在COS7中的表达鉴定；

图3HIV多表位DNA疫苗诱导的血清特异性抗体；

图4HIV多表位DNA疫苗诱导的细胞免疫。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的权利要求的保护范围内。

一、制备实施例

1.候选表位筛选及多表位DNA疫苗设计

于HIV Databases（www.hiv.lanl.gov/content/index.）获取HIV-1中国主要流行株（CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B）env、gag和pol基因上的表位，通过blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.）筛选出所有序列保守且符合中国人群优势MHC限制性的表位，最终获得12条候选表位，见表1。

表1.筛选的HIV表位序列及特征

序列编号	基因位置	起止位点	MHC-限制性
				SEQ ID NO:5	p17	18-26	A3,A11,DR01/15
SEQ ID NO:6	p17	28-36	A24
				SEQ ID NO:7	p24	61-73	A2,A11,DR01/09/15
SEQ ID NO:8	p24	128-136	A2,A24
				SEQ ID NO:9	p24	135-142	A2,A3,DR01/09/15
SEQ ID NO:10	p24	143-151	A2
				SEQ ID NO:11	gp160	32-45	A2,A3,A11
SEQ ID NO:12	gp160	107-116	A2,A11,DR01015
				SEQ ID NO:13	pol	177-188	A3,A11
SEQ ID NO:14	gp160	197-214	DR01/07/09
				SEQ ID NO:15	gp160	206-233	DR01/07/09/15
SEQ ID NO:16	gp160	217-232	DR01/15

利用柔性连接序列GGGS将上表中12个候选表位进行串联构建多表位重组序列yy1，调整表位位置后构建多表位重组序列yy2，两段序列的氨基酸序列如下（SEQ ID NO简化为Seq）：

yy1:

Seq14Seq15Seq16GGGS Seq8Seq9Seq10GGGS Seq7GGGS Seq5K Seq6GGGS Seq12GGGS Seq11GGGS Seq13

yy2:

Seq14Seq15Seq16GGGS Seq13GGGS Seq11GGGS Seq12GGGSSeq5GGGS Seq6GGGS Seq7GGGS Seq8GGGS Seq9GGGS Seq10

以上两段氨基酸序列经真核密码子优化后于南京金斯瑞公司合成相对应双链DNA序列，获得含有上述两条基因序列的克隆质粒pUC57-YY1和pUC57-YY2。

2．多表位重组DNA的构建及鉴定

2.1材料

表位、多肽及质粒

质粒片段及试验用多肽均由南京金斯瑞公司合成。

真核表达载体质粒pJW4303为江苏泰州海源蛋白质生物工程有限公司产品（Jiangsu Taizhou Haiyuan Protein Biotech,Co.,Ltd,China）。

动物

实验所用BALB/C小鼠购自军事医学科学院实验动物中心

主要仪器：

水平电泳仪（北京六一仪器厂），酶联仪（Thermo，Multiskan MK3），高速离心机（HITACHI,CR22GⅢ）。

主要试剂：

限制性内切酶、T4连接酶购自TAKARA公司，Dh5α感受肽购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自Southern Biotech公司，ELISPOT试剂盒（小鼠IFN-γ，IL-4）购自BD公司，DNA转染试剂购自Roche公司，抗gp120抗体购自abcam公司。

3.1多表位重组DNA的构建

将含有目的基因的克隆质粒pUC57-YY1和pUC57-YY2经BamH I和EcoR I双酶切，获得目的基因YY1和YY2；在T4连接酶作用下，分别连接至同样双酶切并回收的真核表达质粒pJW4303，转化至大肠杆菌DH5α；挑选克隆，经BamHI和EcoRI双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳120V20分钟后观测结果（图1），出现大小约500bp条带，经过进一步测序鉴定，证实质粒成功构建，获得DNA疫苗pJW4303-YY1和pJW4303-YY2。

4.多表位重组DNA体外表达检测

提前16小时将非洲绿猴肾细胞（COS-7细胞）接种于6孔板中，细胞浓度约为10⁶/孔。转染前更换孔内培养液为无血清DMEM培养基，按2ug/孔将质粒加入孔内进行转染，48小时后收集细胞上清经ELISA法检测蛋白表达（图2）。结果显示，转染了目的质粒的细胞上清中蛋白含量与对照细胞上清中蛋白含量有统计学意义。

二、应用实施例：

多表位重组DNA疫苗免疫BALB/C小鼠

雌性BALB/C小鼠，5-6周龄，购买于军事医学科学院实验动物中心，随机分配到不同的实验组中，按实验设计对动物进行多表位重组DNA疫苗免疫，共免疫3次，每只小鼠经肌肉途径接种8μg溶于100μL的无菌无热源PBS的DNA疫苗，并分别在初免后的的第28天和60天加强免疫1次，同时设空载体对照和PBS对照。分别于初免后的0天、26天、44天和76天收集血清标本，用于抗体效价检测；于90天处死小鼠，并制备脾脏单细胞悬液用于细胞免疫应答检测。

HIV多表位DNA疫苗pJW4303-YY1和pJW4303-YY2多表位DNA疫苗免疫动物后，通过ELISA法检测动物血清抗体效价实现对疫苗引起的体液免疫应答水平的评价，通过ELISPOT试验实现对疫苗引起的细胞免疫应答水平的评价。ELISA结果（图3）显示动物经多表位DNA疫苗免疫后，其体内多肽特异性抗体滴度能达到10³，远高于对照组动物抗体水平。

ELISPOT结果（图4）表明多表位DNA疫苗能显著引起动物体内细胞因子（IFN-γ和IL-4）的分泌和释放。

Claims

1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多肽。

2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。

3.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的真核重组表达质粒。

4.根据权利要求3所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒为真核表达载体pJW4303经BamHI和EcoRI双酶切后，在T4连接酶作用下连接入如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒为真核表达载体pJW4303经BamHI和EcoRI双酶切后，在T4连接酶作用下连接入如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4或5所述的表达质粒在制备HIV疫苗中的应用。

7.一种药物制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求4或5所述的质粒及制药学上可接受的助剂。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂为注射制剂。