RU2806556C1 - Искусственный ген, кодирующий белок-иммуноген BSI-COV, рекомбинантная плазмидная ДНК pBSI-COV, обеспечивающая экспрессию целевого гена, и искусственный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, содержащий эпитопы антигенов вируса SARS-CoV-2 и индуцирующий SARS-CoV-2-специфический T-клеточный иммунитет - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Сконструирован искусственный ген bsi-cov, кодирующий искусственный Т-клеточный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2. Создана плазмидная ДНК pBSI-COV, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 4156 п.н., молекулярный вес 2,6 МДа, содержащая указанный целевой ген. Получен искусственный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 длиной 412 а.к.о. Полученная конструкция индуцирует SARS-CoV-2-специфический Т-клеточный иммунитет. Техническим результатом заявляемого изобретения является создание вакцинной конструкции в виде плазмидной ДНК pBSI-COV, которая обеспечивает более длительный индуцирующий SARS-CoV-2-специфический Т-клеточный иммунный ответ. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к плазмидной ДНК pBSI-COV, обеспечивающей экспрессию искусственного гена bsi-cov вируса SARS-CoV-2 в клетках эукариот, и может быть использовано в области биотехнологии, медицины и иммунологии. Плазмида pBSI-COV индуцирует SARS-CoV-2-специфический Т-клеточный ответ у лабораторных животных.

Пандемия COVID-19 стала причиной взрывного развития различных платформ для создания вакцин. В процессе изучения поствакцинального иммунного ответа возникло понимание, что для протективности важны оба звена иммунитета: как гуморальный, так и клеточный. Особый интерес вызывают иммуногены, способные индуцировать Т-клеточный иммунитет против вируса SARS-CoV-2, поскольку было показано, что вирус-специфический клеточный ответ является более пролонгированным и более консервативным, что очень важно для таких быстро меняющих антигенный спектр вирусов, как SARS-CoV-2. Подходящей платформой для индукции клеточного иммунитета являются вакцины на основе нуклеиновых кислот, в частности ДНК. ДНК-вакцины обладают следующими преимуществами: они неинфекционны и легко нарабатываются в больших количествах, при их введении не индуцируется иммунитет против плазмиды-носителя, они способны обеспечить индукцию Т-клеточного иммунитета за счет обеспечения синтеза белка внутри клетки, что приводит к естественной презентации фрагментов эндогенных белков молекулами MHC I и II класса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является ДНК-вакцина ZyCoV-D, разработанная и произведенная индийской компанией Cadila Healthcare Ltd, (международная заявка WO 2021214703, МПК A61K 39/215, опубл. 28.10.2021 г.), одобренная для массового применения в Индии в целях иммунопрофилактики COVID-19 в экстренных условиях. Данная вакцина состоит из векторной плазмиды pVAX1, несущей ген S-белка вируса SARS-CoV-2 с сигнальным пептидом из IgE, и вводится внутрикожно с помощью безыгольного струйного инжектора PharmaJet Tropis. На животных моделях показана безопасность и эффективность данной вакцины: отсутствие встраивания рекомбинантной ДНК в геном, индукция обоих звеньев иммунитета [1, 2]. Однако стоит отметить и то, что иммунный ответ, направленный только на поверхностный белок вируса, со временем становится более слабым в результате множественных мутационных изменений, происходящих в результате эволюции вируса во время персистенции его в популяции. Поэтому использование в составе ДНК-вакцины ZyCoV-D только S-белка не может обеспечить длительного эффективного клеточного ответа, и необходимо включать в состав ДНК-вакцин эпитопы из других белков коронавируса [3]. У людей, переболевших родственным вирусом SARS-CoV, был обнаружен вирус-специфический Т-клеточный иммунитет (против белков S, N, M) спустя более 10 лет после перенесенного заболевания [4].

Поэтому более перспективной является стратегия использования в качестве Т-клеточных иммуногенов также последовательностей, входящих в состав минорных белков вируса, наименее подверженных изменчивости из-за меньшего давления отбора.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание вакцинной конструкции в виде плазмидной ДНК pBSI-COV, которая обеспечивает более стойкий (длительный) индуцирующий SARS-CoV-2-специфический Т-клеточный иммунный ответ за счет включения высоко иммуногенных эпитопов из различных белков SARS-CoV-2 консервативных для разных штаммов этого вируса и рестриктируемых широким спектром аллелей MHC, способных индуцировать специфический цитотоксический и Т-хелперный иммунитет против различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается тем, что создан искусственный ген bsi-cov, кодирующий искусственный Т-клеточный иммуноген BSI-COV, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2 размером 1263 п.н. и содержащий на 5'-конце последовательность Козак CCGCCACC и сайт для эндонуклеазы рестрикции NheI, а на 3'-конце - два стоп-кодона TAATGA и сайт для эндонуклеазы рестрикции ApaI.

Указанный технический результат достигается также тем, что создана плазмидная ДНК pBSI-COV, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, размер 4154 п.н., молекулярный вес 2,6 МДа, содержащая целевой ген по п.1, кодирующий искусственный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, перед которым находится промотор РНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающий транскрипцию гена в эукариотической системе, и состоящая из следующих фрагментов:

- векторный фрагмент плазмиды pVAX размером 2918 п.н., имеющий координаты 1946-711 и содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7 с координатами 664-682 и размером 19 п.н., ген устойчивости к неомицину/канамицину (NeoR/KanR) с координатами 2381-3175 и размером 795 п.н., точку начала репликации ColE1 ori с координатами 3501-4089 и размером 589 п.н., а также энхансер и промотор цитомегаловируса с координатами 36-619 и размером 584 п.н.;

- фрагмент, имеющий координаты 711-1946 и размер 1236 п.н. и содержащий целевой искусственный ген bsi-cov по п.1.

Указанный технический результат достигается также тем, что создан искусственный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 длиной 412 а.к.о., включающий в себя консервативные эпитопы из S, Е, М, N белков вируса SARS-CoV-2, которые рестриктируются широким спектра аллелей MHC I и MHC II мыши и человека. В состав иммуногена, помимо этого, входят универсальный Т-хелперный эпитоп PADRE и маркерный эпитоп, узнаваемый МКА 29F2.

При иммунизации животных созданными ДНК-конструкциями регистрируется специфический Т-клеточный ответ.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

На фиг. 1а. представлена карта плазмиды pBSI-COV, а на фиг. 1б. - карта белка-иммуногена BSI-COV. На фиг. 2. представлен электрофоретический анализ экспрессии гена bsi-cov в трансфицированных клетках HEK293T в 1% агарозном геле, где:

Дорожка М12 - маркеры молекулярной массы;

Дорожка 1 - продукт, полученный с помощью ОТ-ПЦР из тотальной РНК клеток HEK293T, трансфицированных плазмидой pBSI-COV;

Дорожки 2 - продукт, полученный с помощью ПЦР из тотальной РНК клеток HEK293T, трансфицированных плазмидой pBSI-COV без стадии обратной транскрипции.

На фиг. 3 представлен анализ продукции белка-иммуногена BSI-COV в клетках HEK293T с помощью вестерн-блоттинга, где:

Дорожка 1 - лизат HEK293T, трансфицированных pBSI-COV;

Справа - маркер молекулярных масс Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-rad, США).

На фиг. 4а приведены результаты оценки вирус-специфических Т-лимфоцитов у иммунизированных животных на 31 сутки после начала иммунизации с помощью метода ELISpot.

На фиг. 4б приведены репрезентативные изображения лунок планшетов после проведения анализа ELISpot.

На фиг. 5а приведена доля SARS-CoV-2-специфических цитокин-продуцирующих CD4+и CD8+Т-клеток (по данным ICS и проточной цитометрии).

На фиг. 5б представлены типичные диаграммы, полученные при анализе CD4+и CD8+Т-лимфоцитов с помощью ICS, проточного цитофлуориметра ZE5 и программного обеспечения Everest.

Ниже приведены примеры 1-5 описания заявляемых объектов изобретения.

Пример 1. Дизайн гена bsi-cov

Предсказание Т-клеточных эпитопов было выполнено с использованием программы NetMHCpan-4.1 и базы данных Immune Epitope Database 2.22, IEDB 2.22 (Табл. 1-3).

Таблица 1. Предсказанные с помощью инструмента IEDB 2.22 Th-эпитопы из белков вируса SARS-CoV-2, рестриктируемые различными молекулами MHC II мыши BALB/c (чем ниже значение в крайнем правом столбике, тем более сильное связывание между молекулой MHC II и пептидом). В таблице указаны пептиды со значением Adjusted Rank не выше 10.5.
MHC II Allele	Peptide	Adjusted Rank
H2-IEd	DDQIGYYRRATRRIR	0.11
H2-IEd	NYNYLYRLFRKSNLK	0.17
H2-IEd	VKPSFYVYSRVKNLN	0.33
H2-IAd	EMIAQYTSALLAGTI	2.80
H2-IEd	ASAFFGMSRIGMEVT	4.35
H2-IEd	QYIKWPWYIWLGFIA	7.05
H2-IEd	CFVLAAVYRINWITG	7.30
H2-IEd	GTWLTYTGAIKLDDK	10.15

Таблица 2. Предсказанные с помощью инструмента IEDB 2.22 CTL-эпитопы из белков вируса SARS-CoV-2, рестриктируемые различными молекулами MHC I мыши BALB/c (чем выше значение в крайнем правом столбике, тем более сильное связывание между молекулой MHC I и пептидом). В таблице указаны пептиды со значением Score выше 0.1.
MHC I Allele	Peptide	Score
H-2-Kd	AYSNNSIAI	0.837637
H-2-Kd	QYIKWPWYI	0.738706
H-2-Kd	YYRRATRRI	0.414253
H-2-Ld	LPPLLTDEM	0.384921

H-2-Dd	SAPHGVVFL	0.370438
H-2-Ld	WPWYIWLGF	0.355595
H-2-Kd	NWITGGIAI	0.347568
H-2-Ld	TPSGTWLTY	0.32614
H-2-Ld	FPQSAPHGV	0.282244
H-2-Dd	FAPSASAFF	0.242852
H-2-Kd	GFIAGLIAI	0.237561
H-2-Kd	QFAPSASAF	0.218262
H-2-Kd	KHIDAYKTF	0.172696
H-2-Ld	FPRGQGVPI	0.160547
H-2-Ld	NSIAIPTNF	0.148747
H-2-Kd	TWLTYTGAI	0.144436
H-2-Ld	SPDDQIGYY	0.126441
H-2-Ld, H-2-Kd	IAIPTNFTI	0.119486
H-2-Ld	QSAPHGVVF	0.159378
H-2-Kd	NFKDQVILL	0.113114
H-2-Ld	YNYKLPDDF	0.101053

Перечисленные в табл. 1 и 2 пептиды были проанализированы на консервативность для разных штаммов вируса SARS-CoV-2, в частности Ухань, Гамма, Дельта, Омикрон. Для каждого пептида была установлена более чем 87% гомологичность по отношению к белкам указанных штаммов SARS-CoV-2.

Таблица 3. Предсказанные с помощью инструмента IEDB 2.22 CTL-эпитопы из белков вируса SARS-CoV-2, рестриктируемые различными молекулами HLA I. В таблице указаны пептиды со значением Score выше 0.3.
HLA I allele	Peptide	Fragment
HLA-A*03:01, HLA-A*30:01, HLA-A*11:01, HLA-A*31:01	RLFRKSNLK	S1
HLA-A*33:01, HLA-A*31:01,	YNYLYRLFR
HLA-A*02:06, HLA-A*02:01	KLPDDFTGC
HLA-A*33:01	NYLYRLFRK

HLA-A*24:02, HLA-A*23:01	NYNYLYRLF
HLA-A*30:02	SKVGGNYNY
HLA-A*30:02	VGGNYNYLY
HLA-B*08:01	YRLFRKSNL
HLA-B*51:01	LPDDFTGCV
HLA-A*68:02, HLA-A*02:06, HLA-A*02:01	NIADYNYKL
HLA-B*51:01, HLA-B*58:01, HLA-B*57:01, HLA-A*02:06,	IAIPTNFTI	S2
HLA-B*35:01, HLA-B*15:01, HLA-A*30:02	LGAENSVAY
HLA-A*02:06, HLA-A*02:01, HLA-A*02:03, HLA-A*68:02, HLA-A*32:01, HLA-B*08:01	SIIAYTMSL
HLA-B*58:01, HLA-B*57:01, HLA-A*26:01, HLA-B*35:01, HLA-B*53:01	NSIAIPTNF
HLA-A*68:02	SVAYSNNSI
HLA-A*01:01, HLA-A*30:02, HLA-B*35:01, HLA-B*58:01, HLA-A*26:01, HLA-B*57:01	LTDEMIAQY	S3
HLA-B*57:01, HLA-B*58:01, HLA-B*53:01	LAGTITSGW
HLA-B*57:01, HLA-B*58:01, HLA-A*32:01, HLA-B*15:01	GTITSGWTF
HLA-A*02:01, HLA-A*02:03	GLTVLPPLL
HLA-B*35:01	LPPLLTDEM
HLA-A*02:03, HLA-A*68:02, HLA-B*07:02, HLA-B*08:01	MIAQYTSAL
HLA-B*08:01	AQYTSALLA
HLA-A*11:01, HLA-A*03:01, HLA-A*68:01, HLA-A*30:01,	VTYVPAQEK	S4
HLA-B*51:01, HLA-B*07:02, HLA-B*35:01, HLA-B*53:01	FPQSAPHGV
HLA-A*02:06, HLA-A*02:03, HLA-A*02:01, HLA-A*68:02, HLA-B*51:01	VVFLHVTYV
HLA-A*02:03, HLA-A*02:01, HLA-A*02:06	HLMSFPQSA
HLA-B*58:01, HLA-B*57:01, HLA-B*15:01, HLA-B*35:01, HLA-A*32:01	QSAPHGVVF
HLA-B*15:01, HLA-A*30:02	GVVFLHVTY
HLA-A*68:01	MSFPQSAPH
HLA-B*44:03, HLA-B*44:02	QELGKYEQY	S5
HLA-A*24:02, HLA-A*23:01	QYIKWPWYI
HLA-B*44:03, HLA-B*44:02	YEQYIKWPW
HLA-A*02:03, HLA-A*02:06, HLA-A*02:01, HLA-A*68:02	FIAGLIAIV
HLA-B*57:01, HLA-A*32:01	YIKWPWYIW
HLA-A*02:01, HLA-A*02:03, HLA-A*02:06	NLNESLIDL
HLA-A*31:01, HLA-A*30:01, HLA-A*03:01, HLA-A*68:01, HLA-A*33:01	RVKNLNSSR	E

HLA-B*08:01, HLA-A*02:03, HLA-A*02:06, HLA-A*02:01, HLA-A*68:02	YVYSRVKNL
HLA-B*15:01, HLA-A*30:02, HLA-B*57:01, HLA-B*35:01, HLA-A*26:01, HLA-A*30:01, HLA-A*32:01	LVKPSFYVY
HLA-A*02:01, HLA-A*02:06, HLA-A*02:03, HLA-A*68:02	SLVKPSFYV
HLA-A*30:01	SFYVYSRVK
HLA-A*30:01	SSRVPDLLV
HLA-B*57:01, HLA-B*58:01, HLA-B*53:01	LAAVYRINW	M1
HLA-A*02:06, HLA-A*02:01	FVLAAVYRI
HLA-A*33:01	CFVLAAVYR
HLA-A*01:01, HLA-A*30:02, HLA-B*57:01, HLA-A*11:01, HLA-B*58:01, HLA-A*26:01, HLA-B*15:01, HLA-A*03:01	ATSRTLSYY	M2
HLA-B*35:01, HLA-A*30:02, HLA-B*15:01, HLA-A*01:01, HLA-B*57:01, HLA-B*58:01	VATSRTLSY
HLA-A*30:01, HLA-A*11:01, HLA-A*68:01, HLA-A*31:01, HLA-A*03:01	TSRTLSYYK
HLA-A*01:01, HLA-A*30:02	AGDSGFAAY
HLA-A*33:01, HLA-A*31:01	YYKLGASQR
HLA-B*57:01, HLA-B*58:01	ITVATSRTL
HLA-B*07:02, HLA-B*51:01, HLA-B*35:01	FPRGQGVPI	N1
HLA-B*35:01, HLA-A*01:01, HLA-B*53:01,	SPDDQIGYY
HLA-A*01:01, HLA-A*26:01, HLA-A*30:02	SSPDDQIGY
HLA-A*31:01, HLA-A*33:01	GYYRRATRR
HLA-A*31:01, HLA-A*33:01	IGYYRRATR
HLA-A*24:02	YYRRATRRI
HLA-A*11:01, HLA-A*03:01, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*68:01	KTFPPTEPK	N2
HLA-B*35:01, HLA-B*53:01	TPSGTWLTY
HLA-B*44:03, HLA-B*44:02	MEVTPSGTW
HLA-B*15:01, HLA-A*30:02, HLA-A*01:01	LLNKHIDAY
HLA-A*11:01, HLA-A*68:01, HLA-A*31:01, HLA-A*03:01	ASAFFGMSR
HLA-A*24:02, HLA-A*23:01, HLA-B*35:01, HLA-B*15:01	QFAPSASAF
HLA-A*02:03, HLA-A*02:01	GMSRIGMEV
HLA-B*51:01	DPNFKDQVI
HLA-A*02:06, HLA-A*02:03	AQFAPSASA
HLA-A*02:01, HLA-A*32:01	KLDDKDPNF
HLA-B*51:01, HLA-A*68:02	SAFFGMSRI
HLA-A*68:02	EVTPSGTWL
HLA-A*23:01, HLA-A*24:02	KHIDAYKTF
HLA-B*08:01	NFKDQVILL
HLA-B*35:01	FAPSASAFF
HLA-A*68:02	LTYTGAIKL

Предсказанные эпитопы объединили в кластеры, которые совпадают с фрагментами белков S, N, M и E (табл. 4). Данные фрагменты, содержащие также большое количество эпитопов, рестриктируемых широким спектром аллелей HLA II, объединили в одну последовательность. К N-концу спроектированного белка был добавлен эпитоп PADRE, к C-концу - маркерный эпитоп EPFRDYVDRFYKTLR из белка p24 ВИЧ-1, узнаваемый моноклональными антителами 29F2.

Таблица 4. Аминокислотные фрагменты белков вируса SARS-CoV-2, выбранные для включения в последовательность искусственного полиэпитопного белка-иммуногена.
Полипептидная последовательность	В каком белке находится	Локализация в белке
IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFE	S	418-465
SIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI	S	691-720
GLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAA	S	857-893
HLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEK	S	1048-1073
NLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIM	S	1192-1233
SLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV	E	50-75
TLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGL	M	61-90
KEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAY	M	166-196
FPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGK	N	66-100
WPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKK	N	301-375

В результате была спроектирована аминокислотная последовательность искусственного полиэпитопного Т-клеточного белка-иммуногена, получившего название BSI-COV (фиг.1б). Оптимизацию нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок BSI-COV, проводили с помощью программы Jcat (http://www.jcat.de) с учетом кодонов, обеспечивающих наиболее эффективную трансляцию в клетках млекопитающих.

Пример 2. Дизайн плазмиды pBSI-COV

Ген bsi-cov синтезировали в ООО «ДНК-синтез» (Россия). Целевой ген встраивали в вектор pVAX1 (“Thermo Fisher Scientific”, США) по сайтам ApaI и AsuNHI под немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV). Структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием по методу Сэнгера в ЦКП “Геномика” (Россия). В результате была получена ДНК-конструкция, кодирующая искусственный иммуноген BSI-COV, которая была обозначена как pBSI-COV (фиг. 1а).

Пример 3. Наработка и очистка рекомбинантной плазмиды pBSI-COV

Клетки Escherichia coli Stbl3 трансформировали плазмидой pBSI-COV с помощью хлористого кальция. Наработку плазмидной ДНК для иммунизации проводили в 2.7 л питательной среды LB с добавлением канамицина (25 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Данный набор позволяет очень эффективно очистить препарат плазмидной ДНК от бактериальных эндотоксинов. После очистки структуру плазмиды проверяли рестрикционным анализом, количество и чистоту - спектрофотометрией.

Пример 4. Проверка эффективности экспрессии целевого гена в условиях in vitro

4.1 Трансфекция клеток HEK293T

Перевиваемые клетки почечного эмбрионального эпителия человека HEK-293Т (Human embryonic kidney), получены из коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор». Культуру клеток HEK-293Т культивировали при температуре 37°C, 80% относительной влажности воздуха и 5% содержании CO2. В качестве ростовой среды использовали среду DMEM с добавлением 10% термоинактивированной (30 мин при температуре 56°С) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и антибиотика (гентамицин (50 мкг/мл)). Трансфекцию производили в 12-луночных планшетах с использованием реагента Matra-A, содержащего магнитные частицы, в соответствии с инструкцией производителя. По истечении 48 часов после трансформации клетки снимали с использованием раствора Версена и центрифугировали 5000 об/мин, осадок растворяли в 30 мкл PBS для дальнейшей работы.

4.2 Исследование экспрессии генов на уровне мРНК

Для проведения ОТ-ПЦР из трансфицированных клеток выделяли тотальную РНК с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ экспрессии гена был проведен с помощью обратной транскрипции с ПЦР в одной пробирке набором Биомастер ОТ-ПЦР-Экстра (Биолабмикс, Россия) с использованием специфических праймеров: Ubi-PolyT-F 5’-tttttCGTACGATGGCCAAGTTCGTGGCC-3’ и Ubi-PolyT-R 5’- TTAAACGGGCCCTCATTAGCGCA-3’. Продукты ПЦР были проанализированы в 1% агарозном геле. На электрофореграмме (фиг.2) видно, что размер амплифицированного фрагмента составляет примерно 1250 п.о., что соответствует теоретически рассчитанному фрагменту при использовании указанных специфических праймеров.

4.3 Исследование продукции целевых белков

Лизат трансфицированных клеток исследовали на наличие целевого белка с помощью иммуноблотинга с использованием МКА 29F2 к маркерному эпитопу. Полоса, соответствующая белку с наибольшим весом, соответствует теоретически рассчитанному продукту гена bsi-cov (46 кДа соответственно). Наличие лесенки из дискретных белков свидетельствует об эффективном процессинге Т-клеточных иммуногенов в клетке (фиг. 3).

Пример 5. Иммуногенность ДНК-вакцинной конструкции плазмиды pBSI-COV

5.1 Иммунизация лабораторных животных, подготовка образцов для исследования

Работа с животными проводилась в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». Протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Протокол БЭК №1 от 21.03.2023).

Для оценки иммуногенности созданной конструкции использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г. Мышей разделили на две группы по 7 животных в каждой и иммунизировали группу pBSI-COV 100 мкг плазмиды pBSI-COV в 50 мкл физиологического раствора; группа intact - не иммунизированные мыши. Мышей иммунизировали дважды внутримышечно (в верхнюю часть бедра задней конечности) в дни 0 и 21 с помощью электропорации. Электропорацию проводили с использованием электропоратора CUY21 EDIT II и электродов-пинцетов LF650P5 диаметром 5 мм (BEX CO, LTD., Япония) и предваряющей общей анестезией 2,5% изофлураном. Использовали следующий протокол электропорации: постоянный ток прямоугольной формы прямой и обратной полярности с 3 импульсами с напряжением 12 вольт в течение 30 мс и интервалом 950 мл с ограничением по силе тока в 45 мА [6]. Спустя 10 дней после второй иммунизации у животных были взяты селезенки для исследования иммунного ответа.

Селезенки последовательно измельчали на нейлоновых фильтрах для клеток с диаметром пор 70 и 40 мкм (BD Falcon, США). После лизиса эритроцитов лизирующим буфером (Sigma, США) спленоциты дважды промывали полной средой RPMI и помещали в 1 мл среды RPMI с 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, США). Клетки подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток TC20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

5.2 Исследование поствакцинального Т-клеточного ответа с помощью ELISpot

Анализ Т-клеточного иммунного ответа проводили с использованием набора Mouse IFN-γ ELISpot HRP (Mabtech, Швеция) в соответствии с инструкциями производителя. Спленоциты пассировали в количестве 2,5*10⁵ клеток/лунку и добавляли среду RPMI с 10% FBS (отрицательный контроль), или смесь пептидов (каждого в концентрации 20 мкг/мл), или конканавалин А (положительный контроль). Клетки инкубировали в течение 20 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Затем планшеты промывали и инкубировали с первичными антителами против IFN-γ. Планшеты снова промывали и затем инкубировали со вторичным антителом, конъюгированным со пероксидазой хрена. После промывки планшеты инкубировали с TMB. Количество клеток, продуцирующих IFN-γ, подсчитывали с использованием ELISpot ридера (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). Спленоциты, выделенные от иммунизированных мышей BALB/c, стимулировали пулом пептидов из последовательности S-белка SARS-CoV-2, рестриктированных главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I (H2-Dd, H-2-Kd и H- 2-Ld) и молекулы MHC класса II (H2-IAd и H2-IEd) мышей BALB/c (табл.5). Пептиды были подобраны в соответствии с эпитопами, входящими в состав иммуногена и предсказанными с использованием инструментов IEDB Analysis Resource и синтезированы AtaGenix Laboratories (Ухань, Китай); чистота пептидов>80%.

Таблица 5. Пептиды из различных белков вируса SARS-CoV-2, использованные для стимуляции спленоцитов мышей BALB/c в ELISpot и ICS.
№п/п	Последовательность пептида	№п/п	Последовательность пептида
1	AYSNNSIAI	10	YYRRATRRIRGGDGK
2	QYIKWPWYI	11	GTWLTYTGAIKLDDK
3	LPPLLTDEM	12	DDQIGYYRRATRRIR
4	SAPHGVVFL	13	VKPSFYVYSRVKNLN
5	WPWYIWLGF	14	CFVLAAVYRINWITG
6	VGGNYNYLYRLFRKS	15	YYRRATRRI
7	YNYKLPDDFTGCVIA	16	TPSGTWLTY
8	YNYLYRLFRKSNL	17	KHIDAYKTF
9	GGNYNYLYRLFRKSN	18	SPDDQIGYY

Данные IFN-γ-ELISpot показали, что через две недели после второй иммунизации наблюдалось формирование Т-клеточного иммунитета у мышей, которым вводили вакцинную конструкцию. В группе, иммунизированной плазмидой pBSI-COV, среднее количество Т-лимфоцитов, секретирующих IFN-γ, в расчете на 10⁶ спленоцитов составляло 315 (фиг. 4а, б). Значения в опытной группе достоверно отличались от контрольной группы.

5.3 Исследование поствакцинального Т-клеточного ответа с помощью ICS и проточной цитофлуориметрии

Для анализа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, реагирующих выбросом IFN-γ при стимуляции вирус-специфическими пептидами, 5*10⁵ клеток пассировали в лунки 96-луночных культуральных планшетов с круглым дном (Jet-BIOFIL, Китай) и стимулировали смесью пептидов, указанной в табл.5. Каждый пептид добавляли в концентрации 20 мкг/мл на лунку и клетки инкубировали в течение 4 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂ и еще 16 ч с брефельдином А (5 мкг/мл, GolgiPlug BD Biosciences). На следующий день клетки окрашивали анти-CD3, конъюгированным с Alexa Fluor 700 (Biolegend, США), анти-CD4, конъюгированным с BV785 (Biolegend, США), и анти-CD8, конъюгированным с FITC (Biolegend, США); фиксировали 1% параформальдегидом в PBS; и пермеабилизировали 0,5% Tween 20 в PBS. Затем клетки окрашивали для выявления внутриклеточных цитокинов анти-IFNγ-APC, анти-IL2-BV421, анти-TNFα-PE и анти-IL4-BV605 (Biolegend, США). Образцы анализировали с использованием проточного цитометра ZE5 (Bio-Rad) и программного обеспечения Everest.

Анализ Т-клеточного ответа с помощью метода ICS показал, что при иммунизации мышей ДНК-вакцинной конструкцией pBSI-COV формируются как CD3+/CD8+, так и CD3+/CD4+лимфоциты, способные продуцировать цитокины после стимуляции вирусными пептидами (фиг.5а,б). Этот факт свидетельствует о формировании выраженного вирус-специфического Т-клеточного ответа. Значения в опытной группе достоверно отличались от контрольной группы.

Повышение продукции после стимуляции пептидами было показано и для цитокинов IL-2, IL-4 и TNF-α, что свидетельствует о формировании сбалансированного вирус-специфического Т-клеточного ответа, очень важного для противовирусной защиты.

Таким образом, преимущество заявляемой вакцинной платформы по сравнению с другими аналогами и прототипом заключается в том, что, несмотря на смену антигенного профиля при появлении нового штамма и уменьшение нейтрализующей активности антител, Т-клеточный ответ, индуцированный искусственным белком-иммуногеном BSI-COV, составленным из консервативных эпитопов различных белков вируса, будет оставаться вирус-специфичным более длительное время. Поэтому ДНК-вакцинная конструкция pBSI-COV, кодирующая ген bsi-cov, может быть полезна в качестве компонента, которые можно сочетать с любой другой вакциной, эффективно индуцирующей актуальный гуморальный ответ (субъединичные, инактивированные вакцины).

Список источников патентной и научно-технической информации.

1. Dey A., Chozhavel Rajanathan T.M., Chandra H., Pericherla H.P.R., Kumar S., Choonia H.S., Bajpai M., Singh A.K., Sinha A., Saini G., Dalal P., Vandriwala S., Raheem M.A., Divate R.D., Navlani N.L., Sharma V., Parikh A., Prasath S., Sankar Rao M., Maithal K. Immunogenic potential of DNA vaccine candidate, ZyCoV-D against SARS-CoV-2 in animal models. Vaccine. 2021 Jul 5;39(30):4108-4116. doi: 10.1016/j.vaccine.2021.05.098.

2. Khobragade A., Bhate S., Ramaiah V., Deshpande S., Giri K., Phophle H., Supe P., Godara I., Revanna R., Nagarkar R., Sanmukhani J., Dey A., Rajanathan T.M.C., Kansagra K., Koradia P.; ZyCoV-D phase 3 Study Investigator Group.Efficacy, safety, and immunogenicity of the DNA SARS-CoV-2 vaccine (ZyCoV-D): the interim efficacy results of a phase 3, randomised, double-blind, placebo-controlled study in India. Lancet. 2022 Apr 2;399(10332):1313-1321. doi: 10.1016/S0140-6736(22)00151-9.

3. Safavi A., Kefayat A., Mahdevar E., Abiri A., Ghahremani F. Exploring the out of sight antigens of SARS-CoV-2 to design a candidate multi-epitope vaccine by utilizing immunoinformatics approaches. Vaccine. 2020 Nov 10;38(48):7612-7628. doi: 10.1016/j.vaccine.2020.10.016.

4. Ng O.W., Chia A., Tan A.T., Jadi R.S., Leong H.N., Bertoletti A., Tan Y.J. Memory T cell responses targeting the SARS coronavirus persist up to 11 years post-infection. Vaccine. 2016 Apr 12;34(17):2008-14. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063.

5. Bazhan S.I., Antonets D.V., Starostina E.V., Ilyicheva T.N., Kaplina O.N., Marchenko V.Y., Volkova O.Y., Bakulina A.Y., Karpenko L.I. In silico design of influenza a virus artificial epitope-based T-cell antigens and the evaluation of their immunogenicity in mice. J Biomol Struct Dyn. 2022 Apr;40(7):3196-3212. doi: 10.1080/07391102.2020.1845978.

6. Kisakov D.N., Kisakova L.A., Borgoyakova M.B., Starostina E.V., Taranov O.S., Ivleva E.K., Pyankov O.V., Zaykovskaya A.V., Shcherbakov D.N., Rudometov A.P., Rudometova N.B., Volkova N.V., Gureev V.N., Ilyichev A.A., Karpenko L.I. Optimization of In Vivo Electroporation Conditions and Delivery of DNA Vaccine Encoding SARS-CoV-2 RBD Using the Determined Protocol. Pharmaceutics. 2022 Oct 22;14(11):2259. doi: 10.3390/pharmaceutics14112259.

7. Международная заявка WO2021214703, МПК A61K 39/215, опубл. 28.10.2021 г.(прототип).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="pBSI-COV.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2023-04-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>State Research Center of Virology and

Biotechnology &quot;Vector&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Искусственный ген, кодирующий

белок-иммуноген BSI-COV, рекомбинантная плазмидная ДНК pBSI-COV,

обеспечивающая экспрессию целевого гена, и искусственный

полиэпитопный белок-иммуноген BSI- COV, содержащий эпитопы антигенов

вируса SARS-CoV-2 и индуцирующий SARS-CoV-2-специфический

Т-клеточный иммунитет </InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>4154</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..4154</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>unsure</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1947..4154</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>map</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>pVAX sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>unsure</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..710</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>map</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>pVAX sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>gene</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>711..1946</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>gene</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>gene of artificial multi-epitope T cell

immunogen</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gactcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattg

actagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacat

aacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgta

tgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcc

cacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggc

ccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagt

catcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgg

ggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttc

caaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatat

aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactat

agggagacccaagctggctagcgccgccaccatggccaagttcgtggccgcctggaccctgaaggccgcc

gccaagaagaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctgga

acagcaacaacctggacagcaaggtgggcggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaagagcaa

cctgaagcccttcgagagcatcatcgcctacaccatgagcctgggcgccgagaacagcgtggcctacagc

aacaacagcatcgccatccccaccaacttcaccatcggcctgaccgtgctgccccccctgctgaccgacg

agatgatcgcccagtacaccagcgccctgctggccggcaccatcaccagcggctggaccttcggcgccgg

cgccgcccacctgatgagcttcccccagagcgccccccacggcgtggtgttcctgcacgtgacctacgtg

cccgcccaggagaagaacctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtaca

tcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcat

gagcctggtgaagcccagcttctacgtgtacagccgcgtgaagaacctgaacagcagccgcgtgcccgac

ctgctggtgaccctggcctgcttcgtgctggccgccgtgtaccgcatcaactggatcaccggcggcatcg

ccatcgccatggcctgcctggtgggcctgaaggagatcaccgtggccaccagccgcaccctgagctacta

caagctgggcgccagccagcgcgtggccggcgacagcggcttcgccgcctacttcccccgcggccagggc

gtgcccatcaacaccaacagcagccccgacgaccagatcggctactaccgccgcgccacccgccgcatcc

gcggcggcgacggcaagtggccccagatcgcccagttcgcccccagcgccagcgccttcttcggcatgag

ccgcatcggcatggaggtgacccccagcggcacctggctgacctacaccggcgccatcaagctggacgac

aaggaccccaacttcaaggaccaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagaccttccccc

ccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggagcccttccgcgactacgtggaccgcttctacaagac

cctgcgctaatgagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatct

gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaa

atgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacag

caagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctactggg

cggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctg

caaagtaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagag

acaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgg

agaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtc

agcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgag

gcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaag

cgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgc

cgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattc

gaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatg

atctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccga

cggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttt

tctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtg

atattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccga

ttcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctg

atgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggcacttttcggggaaa

tgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataa

ccctgataaatgcttcaataatagcacgtgctaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaaga

tcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgt

agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa

ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggct

tcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactc

tgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg

tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggtt

cgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgaga

aagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag

cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgac

ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctt

tttacggttcctgggcttttgctggccttttgctcacatgttctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1263</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1263</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>gene</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>16..1251</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>gene</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bsi-cov</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctagcgccgccaccatggccaagttcgtggccgcctggaccctgaagg

ccgccgccaagaagaacatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgc

ctggaacagcaacaacctggacagcaaggtgggcggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaag

agcaacctgaagcccttcgagagcatcatcgcctacaccatgagcctgggcgccgagaacagcgtggcct

acagcaacaacagcatcgccatccccaccaacttcaccatcggcctgaccgtgctgccccccctgctgac

cgacgagatgatcgcccagtacaccagcgccctgctggccggcaccatcaccagcggctggaccttcggc

gccggcgccgcccacctgatgagcttcccccagagcgccccccacggcgtggtgttcctgcacgtgacct

acgtgcccgcccaggagaagaacctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagca

gtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgacc

atcatgagcctggtgaagcccagcttctacgtgtacagccgcgtgaagaacctgaacagcagccgcgtgc

ccgacctgctggtgaccctggcctgcttcgtgctggccgccgtgtaccgcatcaactggatcaccggcgg

catcgccatcgccatggcctgcctggtgggcctgaaggagatcaccgtggccaccagccgcaccctgagc

tactacaagctgggcgccagccagcgcgtggccggcgacagcggcttcgccgcctacttcccccgcggcc

agggcgtgcccatcaacaccaacagcagccccgacgaccagatcggctactaccgccgcgccacccgccg

catccgcggcggcgacggcaagtggccccagatcgcccagttcgcccccagcgccagcgccttcttcggc

atgagccgcatcggcatggaggtgacccccagcggcacctggctgacctacaccggcgccatcaagctgg

acgacaaggaccccaacttcaaggaccaggtgatcctgctgaacaagcacatcgacgcctacaagacctt

cccccccaccgagcccaagaaggacaagaagaagaaggagcccttccgcgactacgtggaccgcttctac

aagaccctgcgctaatgagggccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>412</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..412</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MAKFVAAWTLKAAAKKNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNY

NYLYRLFRKSNLKPFESIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTIGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG

TITSGWTFGAGAAHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIA

GLIAIVMVTIMSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLKEI

TVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKWPQIAQF

APSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKEP

FRDYVDRFYKTLR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (5)

1. Искусственный ген bsi-cov, используемый для создания вакцины против вируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный Т-клеточный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 размером 1263 п.н. и содержащий на 5'-конце последовательность Козак CCGCCACC и сайт для эндонуклеазы рестрикции NheI, а на 3'-конце - два стоп-кодона TAATGA и сайт для эндонуклеазы рестрикции ApaI.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBSI-COV, имеющая размер 4154 п.н., молекулярный вес 2,6 МДа и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащая целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, перед которым находится промотор РНК-полимеразы фага Т7, обеспечивающий транскрипцию гена в эукариотической системе, и состоящая из следующих фрагментов:

- векторный фрагмент плазмиды pVAX размером 2918 п.н., имеющий координаты 1946-711 и содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7 с координатами 664-682 и размером 19 п.н., ген устойчивости к неомицину/канамицину NeoR/KanR с координатами 2381-3175 и размером 795 п.н., точку начала репликации ColE1 ori с координатами 3501-4089 и размером 589 п.н., а также энхансер и промотор цитомегаловируса с координатами 36-619 и размером 584 п.н.;

- фрагмент, имеющий координаты 711-1946 и размер 1236 п.н. и содержащий целевой искусственный ген bsi-cov по п. 1.

3. Полиэпитопный белок-иммуноген BSI-COV, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 длиной 412 а.к.о., включающий в себя консервативные эпитопы из S, E, M, N белков вируса SARS-CoV-2, универсальный Т-хелперный эпитоп PADRE и маркерный эпитоп, связывающийся с известными МКА 29F2, и индуцирующий вирус-специфический Т-клеточный иммунитет.