ES2546301T3 - Composición que contiene Leishmania Lip2a - Google Patents
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Abstract
La composición contiene Lip2A Leishmania de una secuencia de ADN, que comprende: a) la secuencia de nucleótidos 778-1231 de la SEQ. NO. 1 b) o una secuencia de nucleótidos capaces de hibridar con la secuencia a) bajo condiciones moderadamente astringentes. La composición sirve para inducir una respuesta immune contra un antígeno en animales immunizados o en grupos celulares.
Description
Composición que contiene Leishmania Lip2a
[0001] Esta invención hace referencia en general a polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos que contienen al menos una parte de una proteína ribosómica ácida de Leishmania infantum llamada Lip2a o una variante de la misma, útil para modificar la respuesta inmune en individuos inmunizados o en grupos celulares. La invención se refiere específicamente a composiciones basadas en compuestos de Leishmania infantum homólogos a las proteínas ribosómicas ácidas, a las que se hace referencia como Lip2a de ahora en adelante, para estimular respuestas inmunes y para ser usadas como vacunas o como productos terapéuticos.
[0002] Las composiciones de la invención son útiles para promover una respuesta humoral o celular en el individuo inoculadocondichascomposiciones.Así,las composicionesde la invenciónsepuedenusarpara eltratamientoo la profilaxis de enfermedades. En concreto, entre otras aplicaciones, las composiciones de la invención que utilizan la proteína Lip2a se pueden usar como adyuvante o como una subunidad en una vacuna para la prevención de la Leishmaniasis o el tratamiento de otras enfermedades.
Antecedentes de la invención
[0003]Las vacunaspuedeninducirinmunidad protectoracontrauna infeccióno enfermedad mediante la generación de una respuesta inmune apropiada en un individuo o paciente que padece tal enfermedad. Actualmente, se hacen avances en el desarrollo de vacunas contra agentes infecciosos e incluso contra determinadas enfermedades, dado que existen muchas técnicas apropiadas para la identificación de antígenos que tienen el potencial de ser usados como agentes capaces de inducir respuestas específicas para combatir las infecciones y enfermedades más comunes tales como infecciones víricas, bacterianas yprotozoarias,o incluso cáncer.
[0004] En la mayoría de los casos, la respuesta inmune inducida por el inmunógeno es débil y por consiguiente la respuesta inmune generada, aunque dirigida contra el antígeno presente en el patógeno, no es lo suficientemente grande como para proporcionar protección. En tales casos, es necesario usar un agente capaz de actuar como adyuvante.
[0005] Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta específica contra una sustancia cuando son inyectados A-antes que dicha sustancia B-en relación con esa sustancia C-en el mismo sitio que esa sustancia o en sitios diferentes. En general, se puede decir que los adyuvantes contribuyen a un aumento de la respuesta inmune de diversas formas: 1-ayudando a que el antígeno sea liberado lentamente por/a el sistema inmunológico; 2-mediante la estimulación y migración de células que presentan el antígeno al lugar de inyección; 3-mediante la estimulación y proliferación de linfocitos; y 4-mejorando la dispersión del antígeno por todo el cuerpo del paciente.
[0006] Esta invención hace referencia a una composición para estimular una respuesta inmune en individuos inmunizados o en grupos celulares, caracterizados por el hecho de que dicha composición consiste en una solución salina que comprende la proteína de Leishmania Lip2a representada por SEQ ID NO:2 o un polipéptido que difiere sólo en sustituciones conservadas de los aminoácidos de la SEQ ID NO:2 de los cuales los grupos de aminoácidos que representan cambios conservados son (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his, o comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de Leishmania Lip2a como se identifica anteriormente, o es representada por la SEQ ID NO:1. Preferiblemente dicha composición es para su uso como vacunas o como productos terapéuticos.
[0007] Las composiciones de la invención son útiles para promover una respuesta humoral o celular en el individuo inoculadocondichascomposiciones.Así,las composicionesde la invenciónsepuedenusarpara eltratamientoo la profilaxis de enfermedades. En concreto, entre otras aplicaciones, las composiciones de la invención que utilizan la proteína Lip2a se pueden usar como adyuvante o como una subunidad en una vacuna para la prevención de la Leishmaniasis o el tratamiento de otras enfermedades.
Antecedentes de la invención
[0008]Las vacunaspuedeninducirinmunidad protectoracontrauna infeccióno enfermedad mediante la generación de una respuesta inmune apropiada en un individuo o paciente que padece tal enfermedad. Actualmente, se hacen avances en el desarrollo de vacunas contra agentes infecciosos e incluso contra determinadas enfermedades, dado que existen muchas técnicas apropiadas para la identificación de antígenos que tienen el potencial de ser usados como agentes capaces de inducir respuestas específicas para combatir las infecciones y enfermedades más comunes tales como, infecciones víricas, bacterianas y protozoarias, o incluso cáncer.
[0009] En la mayoría de los casos, la respuesta inmune inducida por el inmunógeno es débil y por consiguiente la respuesta inmune generada, aunque dirigida contra el antígeno presente en el patógeno, no es lo suficientemente grande como para proporcionar protección. En tales casos, es necesario usar un agente capaz de actuar como adyuvante.
[0010] Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta específica contra una sustancia cuando son inyectados A-antes que dicha sustancia B-en relación con esa sustancia C-en el mismo sitio que esa sustancia o en sitios diferentes. En general, se puede decir que los adyuvantes contribuyen a un aumento de la respuesta inmune de diversas formas: 1-ayudando a que el antígeno sea liberado lentamente por/a el sistema inmunológico; 2-mediante la estimulación y migración de células que presentan antígenos al lugar de inyección; 3-mediante la estimulación y proliferación de linfocitos; y 4-mejorando la dispersión del antígeno portodo el cuerpo del paciente.
[0011] Los aceites, los polímeros, las sales minerales y las bacterias se han usado y son actualmente usados como adyuvantes. Los inmunoestimulantes son sustancias que inducen una respuesta inmune general o temporal cuando se administran junto con el antígeno o de forma independiente. Inmunoestimulantes típicos son, por ejemplo, el adyuvante Freund (AC/IF), BCG (una especie atenuada de Mycobacterium tuberculosis) o una forma inviable de Corynebacterium parvum, entre otros. Los adyuvantes o los inmunoestimulantes sirven para aumentar la respuesta inmune específica por un camino no específico.
[0012]Un serio inconvenienteconla mayoría de los adyuvantesmáspotentes en el uso hasta el presente es su alta toxicidad.Dado queelmecanismodeacción de losadyuvantespuede sermuyvariadoyesunrequisitopara que la respuesta inmune contra la proteína asociada se dirija contra una parte u otra del sistema inmunológico, es de máxima importancia identificar los compuestos capaces de actuar: A-con carácter adyuvante (aumento de la respuesta inmune tanto del tipo humoral a nivel de inmunoglobinas, como de las citocinas de tipo celular específico, preferiblemente CD4+ o CD8+ o CTLs). B-que tengan baja o ninguna toxicidad. C-que estén formados de una sustancia tan pura como sea posible, preferiblemente una proteína que aunque tenga carácter inmunogénico no genere problemas de autoinmunidad y un potencial efecto sombra en el inmunógeno con el que se administra.
[0013] La patente ES 2133236 hace referencia a un gen quimérico que comprende Lip2a. La proteína quimérica resultante se usa para la detección de leishmaniasis. Además, la proteína Lip2a ha sido investigada como comprobador antigénico (Manuel Soto et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol 268; No. 29, p. 21835-21843, 1993), pero no se describe ninguna actividad inmunogénica de la proteína con o sin adyuvante.
[0014] La presente invención describe por primera vez la actividad inmunogénica de la proteína Lip2a sin el uso de adyuvantes.
Resumen de la invención
[0015] La presente invención hace referencia a composiciones para estimular una respuesta inmune en individuos inmunizados o en grupos celulares, caracterizados por el hecho de que dicha composición consiste en una solución salina que comprende proteína de Leishmania Lip2a representada por la SEQ ID NO:2 o un polipéptido que difiere de ella sólo en sustituciones conservadas de los aminoácidos de la SEQ ID NO:2 de los cuales los grupos de aminoácidos que representan cambios conservados son (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his, o comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de Leishmania Lip2a como se identifica anteriormente, o es representada por la SEQ ID NO:1. La presente invención también hace referencia a la capacidad de la proteína Lip2a para inducir una respuesta inmune específica de tipo Th1 cuando se administra a un individuo y para estimular una respuesta de tipo Th1 in vivo y/o en células mononucleares de individuos inmunizados con dicha proteína.
[0016] La presente invención también proporciona un método para producir respuestas inmunes específicas en muestras de células mononucleares mediante la incubación de células con la proteína llamada Lip2a de individuos no inmunizados.
[0017] Una alternativa según la invención para el uso de la proteína Lip2a para producir una respuesta de tipo Th1 es el uso de vectores víricos o ácidos nucleicos que contienen el gen Lip2a y son capaces de dirigir la expresión de la proteína Lip2a en individuos o células transfectadas con la composición de ácidos nucleicos procedentes de la SEQ ID NO 1.
Descripción de la invención
[0018] La presente invención hace referencia en términos generales a un aumento de la respuesta inmune que puede ser de tipo humoral o mediada por células en un individuo inmunizado con Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 o en un cultivo celular con la misma proteína, tanto en células del individuo inmunizado como en células mononucleares de individuos sanos.
[0019] En el contexto de la invención, se declara que Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 es un compuestoinmunoestimulante (uninmunógeno contra el cualseinduceuna respuestainmune)ycuya acción puede iniciarse de por sí sin necesidad de adyuvantes. Generalmente, la respuesta inmune contra un antígeno se puede iniciar o aumentar mediante la administración a la persona inmunizada de una proteína o adyuvante. Los antígenos y agentes inmunoestimulantesson generalmente moléculas de proteínas que proceden de virus, bacterias, parásitos y tumores.Losinmunoestimulantes son moléculasque dirigenlarespuesta delsistema inmunológico en una dirección u otra respecto a las citocinas de tipo Th1 o Th2 o que son mediados por células CD4+ o CD8+.
[0020] En este sentido, en el contexto de esta invención, también se puede incluir la capacidad de usar Lip2a como tratamiento en aquellas enfermedades que requieren un aumentosistemático de interferón-γ. Dentro del contexto de esta invención, se entiende también la iniciación de o inmunoestimulación contra un antígeno a partir de un virus, bacteria,agente infeccioso oantígenotumoral,mediantelaadministracióndedicho antígeno con la proteínaLip2ao derivados de la misma.
[0021] La proteína Lip2a pertenece a un grupo de moléculas de bajo peso molecular de carácter ácido que interactúan con el ribosoma durante la traducción. Éste es un proceso común a organismos de tres reinos: eubacterias, arqueobacterias y eucariotas. La función de estas proteínas es facilitar la interacción entre el ribosoma y algunos factores de traducción solubles (Sánchez-Madrid y colaboradores, 1979; Möller y colaboradores, 1983). Las proteínas ácidas enlazan con la subunidad mayor del ribosoma formando complejos de dos dímeros mediante la interacción con otra proteína que comparte ciertas características con estos dímeros. Esta proteína se denomina proteína ribosómica P0 en eucariotas y L10 en bacterias y arqueobacterias. En los organismos de los dos últimos de estos reinos, los dímeros de proteínas ácidas están formados por el mismo polipéptido, aunque en las bacterias una de las copiassufremodificacionespostraduccionalesdeacetilación (Terhorstycolaboradores,1972).En eucariotas, las proteínas ácidas, también denominadas proteínas P ya que se fosforilan en su forma activa (Wool, 1979; Hasler y colaboradores, 1991) se dividen en dos grupos, P1 y P2, dependiendo del grado de similitud de las secuencias y de la presencia de características dominantes de cada una de ellas. Así en eucariotas, el complejo formado de la unión al ribosoma está compuesto por dos dímeros a su vez compuestos por un polipéptido de cada grupo. En la mayoría de eucariotas, hay sólo una copia de los genes codificantes para las proteínas ácidas de cada grupo, aunque en Saccharomyces cerevisiae (Newton y colaboradores, 1990) y Schizosaccharomyces pombe (Beltrame y Bianchi, 1990), se han descrito dos proteínas ácidas diferentes dentro de cada grupo, cada una de ellas codificada por genes diferentes.
[0022] La proteína Lip2a de Leishmania infantum está compuesta por 106 aminoácidos con un peso molecular de 10,57 kDa (véase SEQ ID NO 2). El análisis de la secuencia de aminoácidos deducido de la secuencia de ADNc L22 indica que la proteína Lip2a posee características comunes a aquellas de las proteínas ribosómicas ácidas del grupo P2 de eucariotas,tales como lassecuenciascarboxi-terminales altamente conservadas,un área muycentralrica en pralinas y alaninas, y un amino-terminal con una secuencia más variable (Soto y colaboradores, 1993).
[0023] Las composiciones conforme a esta invención comprenden un polipéptido que estimula una respuesta humoral fuerte en animales inmunizados con el mismo, incluso en ausencia de adyuvantes y una respuesta inmune de tipo Th1en esplenocitosdeindividuosque hansido ono inmunizados con Lip2a.Este polipéptidoinductorpuede comprender toda o parte de la proteína completa de la Leishmania infantum llamada Lip2a o una proteína ribosómica homóloga total o parcial de otro organismo que tenga una actividad estimulantesimilar.
[0024] Los polipéptidos según la presente invención incluyen variantes de Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 capaces de producir una respuesta Th1 en individuos inmunizados o en células mononucleares en cultivo dada la similitud entre las proteínas de este grupo.Tales variantes incluyen diferentes formas estructurales de la proteína nativa tanto en forma de sal como en forma ácida o inducida por la modificación de aminoácidos, por ejemplo, a través de glicosilación. Los polipéptidos Lip2a expresados en E. coli no se glicosilan mientras que los mismos producidos en levaduras o en células de mamífero son idénticos a aquellos producidos en E. coli, pero pueden diferir estructuralmente y en su capacidad inmunológica debido a la glicosilación. Los sitios de glicosilación son Asn-N-Pro(o Ser). N puede ser cualquier aminoácido excepto Pro.
[0025] Los polipéptidos según esta divulgación comprenden secuencias de aminoácidos que no difieren sustancialmente de Lip2a,donde se entiende portal conceptomodificacionesde aminoácidos que sean codificados por secuencias de ADN capaces de formar híbridos con las secuencias de ADN del gen nativo de Lip2a en condicionesno muyrigurosas.Sepuede mostrarfácilmente si estas variaciones en la secuenciade aminoácidos no difieren de Lip2a por su capacidad de estimular esplenocitos de una forma similar o como hace una Lip2a nativa. En general, estas secuencias, que no difieren sustancialmente de la Lip2a nativa, se forman de sustituciones conservadas de aminoácidos o formadas por pequeñas sustituciones o modificaciones, naturales o conseguidas a través de mutagénesis dirigida. En general, los grupos de aminoácidos que representan cambios conservados son
(1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr, (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Dentro del ámbito de esta divulgación hay variantes polipeptidos de Up2a generados por una unión covalente o a través de la construcción de proteínas de fusión con otros grupos químicos o biológicos tales como proteínas que usan procesos químicos o biológicos entre los que se incluyen los métodos de ADN recombinante, por ejemplo, para una purificación mejor omás fácil,mayor estabilidad, o formación de compuestos que contienen varias proteínas Lip2a totales o parciales.
[0026] La proteína Lip2a se puede expresar en E. coli u otras células procarióticas o eucarióticas después de la transformación de estas células con la secuencia genómica del gen Lip2a o un clon total o parcial de ADNc de Lip2a. La secuencia de nucleótidos del ADN del gen Lip2a y de aminoácidos de la proteína codificada se muestra en SEQ ID NO 1 y NO 2 adjuntas. El gen Lip2a se puede aislar del ADN de Leishmania infantum u otras especies de Leishmania u otro organismo mediante la identificación de clones del ADNc de una genoteca de expresión que expresa proteínas del organismo mediante sueros animales altamente reactivos infectados de forma natural con Leishmania infantum o mediante técnicas PCR usando oligonucleótidos específicos.
[0027] Para obtener el gen Lip2a, se rastreó una genoteca de expresión de ADNc de Leishmania infantum con el suero de un perro infectado de forma natural con Leishmania. El análisis de la secuencia de tres de los clones aisladosindicó la existencia de homología enla secuencia con genescodificantespara lasproteínas ribosómicasP2 de tipo ácido. Mientras que los genes mostraron una horología total de la secuencia en la región codificante, las regiones 3' no traducidas eran completamente divergentes. Existen al menos dos genes Lip2a en el genoma de la Leishmania infantum. Estos genes se pueden encontrar agrupados en el genoma del cromosoma XIX. Variantes de la proteína Lip2a pueden aislarse rastreando otras genotecas de expresión de ADNc de otras especies de Leishmania.
[0028] La proteína Lip2a se puede purificar de cultivos de células bacterianas que expresen el gen Lip2a. La proteína se puede purificar de los extractos o de los sobrenadantes dependiendo del vector de expresión utilizado tanto como una proteína en sí o como una proteína de fusión con otra proteína. Los métodos varían aunque la cromatografía de afinidad, ya sea con anticuerpos específicos contra Lip2a o resinas de partículas adaptadas a la proteína sintetizada,mediante la presencia de una diana determinada que permite su unión a la resina, es el método preferido. Específicamente, el gen Lip2a ha sido subclonado en una variante de los vectores de expresión pMAL y de los vectores de expresión pQE31 y la proteína sintetizada Up2a ha sido purificada unida a la proteína MBP en columnas de maltosa, o unida a una cadena de aminoácidos de histidina con el objetivo de identificar su producción y purificación en columnas de NT Ni. De forma similar, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales monoespecíficos para su purificación.Lospolipéptidosparcialesque forman la proteína Lip2a yque forman parte de esta invención pueden sintetizarse a partir de la construcción de clones parciales de Lip2a, conocidos por todos aquellos bien versados en las técnicas de biología molecular.
[0029] Un método alternativo a la presentación de la proteína Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 para individuos por inmunizar o a células de cultivo es la administración de la proteína en forma de ácidos nucleicos que codifican por Lip2a o una parte de la proteína en forma de plásmidos, virus, incluida en liposomas o ligada a polímeros, u otra forma de introducción de la proteína en células diana. Los vectores más usados para la administración del gen como inmunógeno en forma de ADN son los denominados pcADN3 y pRc/CMV bajo el control de promotores específicos en su mayoría de tipo eucariota. Está extensivamente documentado en la literatura que este tipo de inmunización induce preferiblemente una respuesta del tipo Th1.
[0030] La proteína Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 se puede administrar conjuntamente con el antígeno o de forma independiente, al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, un día o dos antes de la administración del antígeno apropiado), en el mismo sitio o en diferentes sitios del animal. En este sentido, la Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 se podría usar para inducir una respuesta humoral o como un adyuvante en las preparaciones de la vacuna con antígenos heterólogos a los de leishmania.
[0031] Dado que la respuesta a la proteína Lip2a puede variar de individuo a individuo dependiendo de si el individuo está infectado o no con Leishmania y por lo tanto haya estadoexpuesto o no a la proteína Lip2a la administración de la proteína podría tener un efecto inmunológico diferente. En términos generales, la proteína Lip2a o los polipéptidos derivados tal y como se define en la reivindicación 1 se administran en formulaciones farmacológicas como una única sustancia en una solución salina o en combinación con portadores fisiológicos apropiados, incluyendo liposomas aniónicos y catiónicos u otros agentes tales como BCG, Bordatella perusis, o ADN y oligonucleótidos 3'purina -5'pirimidina. Los portadores deben ser sustancias no tóxicas. La literatura sobre el uso de adyuvantes o portadores esextensa ydebe elegirseelmás apropiado para la vía de administración deseada.Porejemplo,parala administración oral, se debe elegir un compuesto sólido tal como celulosa o glucosa. La inmunización se puede realizar con una preparación de Lip2a como moléculas separadas o ligadas y en combinación con uno o varios antígenos e incluso citocinas que pueden actuar como inmunoestimulantes. Las vías y frecuencia de administración pueden variar extensamente. Las vías más usadas son intramusculares o subcutáneas, intranasal u oral, con una frecuencia de 3 dosis cada 15 días. La dosis también puede variar mucho dependiendo del estado del individuo y de su tamaño. La dosis de la proteína Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 como de cualquier otro inmunógeno, tiene que ser ajustada de modo que se introduzca una cantidad significativa de interferón gamma u otras citocinas. Normalmente, la dosis puede oscilar entre 10 microgramos y 100 microgramos por 100 gramos de peso del hospedador.
[0032] Otro método alternativo de administración de Lip2a e inducción de una respuesta inmune puede ser la extracción de células (preferiblemente células mononucleares periféricas) de un individuo, estimularlas in vitro con la proteína Lip2a en presencia o no de un antígeno (específico de una enfermedad o infección) para posteriormente reintroducirlas en el paciente con el objetivo de interferir con el proceso patológico. En este contexto la proteína Lip2a tal y como se define en la reivindicación 1 o sus variantes polipeptídicas podrían utilizarse como adyuvante o inmunoestimulante de una respuesta. Estas características de la proteína Lip2a sugieren que esta puede tener un papel para generar una respuesta inmune protectora o terapéutica en pacientes con enfermedades dependientes de la presencia de interferón-γ o parásitos, por ejemplo, leishmaniasis. En este sentido, la presente invención describe sistemas para aumentar o inmunoestimular la respuesta humoral o celular en individuos o células aisladas (macrófagos, monocitos, células B o células dendríticas) procedentes de individuos que han sido inmunizados o no con la proteína Lip2a.La capacidad para estimular la producción de interferón gamma muestra el potencial que tiene Lip2a para ser muy usada en terapias en una amplia gama de aplicaciones que requieren la inducción de una respuesta no específica de esta citocina (no necesariamente leishmaniasis).
[0033] Como se mostrará en las figuras, citadas más adelante a modo de ejemplo, la proteína Lip2a es capaz de inducir una respuesta humoral fuerte en ratones Balb/c inmunizados con 5 microgramos de la proteína rLip2a en tampón salino por vía intraperitoneal y una pauta de administración de dos dosis con una separación de tres semanasentreellas (21días).Los datos mostraron que se producenvaloresaltos deinmunoglobulinas GyM.Tras la primera dosis, la respuesta fue principalmente de tipo IgM conduciendo a una maduración hacia IgG tras la segunda inoculación. Se observó que el isotipo de IgG más abundante en ratas inmunizadas con la proteína rLip2a correspondía a la inmunoglobina IgG2a aunque IgG1 también se produjo. Se concluye de estos datos que la inmunización con el antígeno de Lip2a genera una respuesta mixta Th1/Th2 , aunque predomina Th1.
[0034] Dado que la naturaleza de esta proteína se conserva con otras de otros organismos, se analizó la especificidad de la respuesta humoral generada tras la inmunización. Se analizó el reconocimiento de los sueros de ratas inmunizadas frente a un grupo de proteínas sintéticas que comprenden la Lip2a. Se observó que los péptidos A4, A5 y A6 fueron reconocidos por los sueros. La región de la proteína contenida en dichos péptidos es específica para las proteínas ácidas de los tripanosomátidos, sin que se detectara ninguna actividad frente al péptido A7, el cual contiene el terminal carboxilo conservado de la proteína.Esta especificidad de respuesta se confirmó cuando se realizó un análisis “Western Blot“ sobre la reactividad de los sueros frente a proteínas ácidas de Leishmania, MBP-Lip2a yMBP-Lip2b,MBP-P2 humana y MBP-P2 de T.cruzi.Hubosolo reconocimiento hacia lasproteínasácidasde parásitos, con una reactividad superior contra MBP-Lip2A, y en ningún caso se generaron anticuerpos contra las proteínas ácidas de los organismos eucariotas superiores testados (conservados con la P2 humana usada en el ensayo). Así, se confirmó que la proteína inmunogénica o el inmunoestimulante no han inducido problemas de autoinmunidad en el hospedador. Además, uno de los péptidos reconocidos por los sueros de animales inmunizados coincidió con el péptido reconocido por los sueros de perros infectados con leishmaniasis viscerocutánea. Esto significa que también en perros, esta región de la proteína es inmunogénica en la infección de forma natural con Leishmania.
[0035] La proteína Lip2a también induce la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones inmunizados. Los resultados obtenidos mostraron que había una relación directa entre la concentración de antígenos y el nivel de proliferación celular inducido. Sorprendentemente, se obtuvieron los mismos resultados cuando se analizó la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones no inmunizados. Con el fin de implicar directamente a la proteína en la proliferación, eliminando la posibilidad de que bacterias contaminantes puedan provocar dicho fenómeno, se analizó la capacidad inhibitoria de un anticuerpo anti-Lip2a generado en un conejo a diluciones diferentes en la proliferación celular. Se observó que mientras que una dilución del suero de 1/100 indujo una reducción en la proliferación tanto para cultivos con Concanavalina A como para los cultivos con el antígeno Lip2a, aunque era siempre superior en el caso de los cultivos inducidos para proliferar con Lip2a, en diluciones más altas (1/500 y 1/1000), la inhibición solo se indujo en cultivos con este antígeno. Este hecho mostró que la inducción proliferativa fue dictada por la proteína Lip2a y no por un contaminante de la misma. El estudio de la cinética de proliferación y los niveles de la proteína en ratones inmunizados con la proteína Lip2a y en ratones no inmunizados indicó que la proteína Lip2a es capaz de inducir la misma cinética de proliferación y alcanzar los mismos niveles independientemente de si los animales han sido inmunizados o no. Esto indica que debería haber células capaces de responder a Lip2a incluso en animales no estimulados sugiriendo que durante su vida los animales han estado expuestos a proteínas que tienen características estructurales o una secuencia similares a la Lip2a. En general, se puede afirmar por los datos obtenidos que la proteína rLip2a posee características inmunogénicas y mitogénicas muy potentes.
[0036] Para caracterizar el tipo de respuesta generada durante las proliferaciones, se analizaron las linfoquinas gamma INF e IL-4 que se producen en los ensayos de proliferación, tanto de esplenocitos de ratas control que no han sido inmunizadas y de ratas inmunizadas. Los resultados mostraron que la proliferación provocada por el antígeno genera un aumento significativo en la secreción de gamma INF en esplenocitos de ratas inmunizadas. De forma similar, se detectó un ligero aumentoenlosnivelesde IL-4 en los cultivos de esplenocitosque proliferaron en presencia del antígeno con respecto a aquellos que proliferan en el medio sin estímulos adicionados. Estos resultados indican que la respuesta generada por el antígeno provoca una proliferación celular que genera un patrón de producción de linfocitos predominantemente de tipo Th1.
[0037] Con el objetivo de determinar el carácter potencial de protección de la Lip2a, se administró la proteína y posteriormente se infectaron los ratones Balb/c con el parásito. Se observó que hubo un retraso en la aparición de la enfermedad y una reducción en las lesiones del tipo cutáneo generadas por infecciones con Leishmania major. un clon total o parcial de ADNc de Lip2a. La secuencia de nucleótidos del ADN del gen Lip2a y de aminoácidos de la proteína codificada se muestra en las SEQ ID NO 1 y NO 2 anexas. El gen Lip2a se puede aislar del ADN de Leishmania infantum uotras especies de Leishmania u otro organismomediante la identificación de clones del ADNc de una genoteca de expresión que expresa proteínas del organismo mediante sueros altamente reactivos de animales infectados de forma natural con Leishmania infantum o mediante técnicas PCR usando oligonucleótidos específicos.
[0038] Para obtener el gen Lip2a,se rastreó una genoteca de expresión de ADNc de Leishmania infantum con suero de un perro infectado de forma natural con Leishmania. El análisis de la secuencia de tres de los clones aislados indicó la existencia de homología en la secuencia con genes codificantes para las proteínas ribosómicas P2 de tipo ácido.Mientras que los genesmostraron una homología total de la secuencia en la región codificante, las regiones 3' no traducidas eran completamente divergentes. Existen al menos dos genes Lip2a en el genoma de la Leishmania infantum. Estos genes se pueden encontrar agrupados en el genoma del cromosoma XIX. Variantes de la proteína Lip2a pueden aislarse rastreando otras genotecas de expresión de ADNc de otras especies de Leishmania.
[0039] La proteína Lip2a se puede purificar a partir de cultivos de células bacterianos que expresen el gen de Lip2a. La proteína se puede purificar a partir de los extractos o de los sobrenadantes dependiendo del vector de expresión utilizado tanto como una proteína en sí o como una proteína de fusión con otra proteína.Los métodos varían aunque la cromatografía de afinidad, ya sea con anticuerpos específicos contra Lip2a o resinas de partículas adaptadas a la proteína sintetizada,mediante la presencia de una determinada diana que permite su unión a la resina, es el método preferido. Específicamente, el gen Lip2a ha sido subclonado en una variante de los vectores de expresión pMAL y de los vectores de expresión pQE31 y la proteína Lip2a sintetizada ha sido purificada unida a la proteína MBP en columnas de maltosa, o unida a una cadena de aminoácidos de histidina con el objetivo de identificar su producción y purificación en columnas de NT Ni. De forma similar, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales monoespecíficos para su purificación.Lospolipéptidosparcialesque forman la proteína Lip2a yque forman parte de esta invención pueden sintetizarse de la construcción de clones parciales de la Lip2a, conocidos por todos aquellos bien versados en las técnicas de biología molecular.
[0040] Un método alternativo a la presentación de la proteína Lip2a a individuos por inmunizar o a células de cultivo es la administración de la proteína en forma de ácidos nucleicos que codifican para Lip2a o una parte de la proteína en forma de plásmidos, virus, incluyendo en liposomas o unida a polímeros, u otra vía de introducción de la proteína en células diana. Los vectores más usados para la administración del gen como inmunógeno en forma de ADN son los denominados pcADN3 y pRc/CMV bajo el control de promotores específicos en su mayoría de tipo eucariota. Está extensivamente documentado en la literatura que este tipo de inmunización induce preferiblemente una respuesta del tipo Th1.
[0041] La proteína Lip2a se puede administrar conjuntamente junto con el antígeno o de forma independiente, al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, un día o dos antes de la administración del antígeno apropiado), en el mismo o en diferentes sitios del animal.En este sentido,la Lip2a podría ser usada para inducir una respuesta humoral o como adyuvante en las preparaciones de la vacuna con antígenos heterólogos a los de leishmania.
[0042] Dado que la respuesta a la proteína Lip2a puede variar de individuo a individuo dependiendo de si el individuo está infectado o no con Leishmania y por lo tanto haya estado expuesto o no a la proteína Lip2a, la administración de la proteína podría tener un efecto inmunológico diferente. En términos generales, la proteína Lip2a o los polipéptidos derivados se administran en formulaciones farmacológicas como una única sustancia en una solución salina o en combinación con portadores fisiológicos apropiados, incluyendo liposomas aniónicos y catiónicos u otros agentes tales como BCG, Bordatella perusis, o ADN y oligonucleótidos 3'purina -5'pirimidina. Los portadores deben ser sustancias no tóxicas. La literatura sobre el uso de adyuvantes o portadores es extensa y debe elegirse el más apropiado para la vía de administración deseada. Por ejemplo, para la administración oral, se debe elegir un compuesto sólido tal como celulosa o glucosa. La inmunización se puede realizar con una preparación de Lip2a como moléculas independientes o unidas y en combinación con uno o varios antígenos e incluso citocinas que pueden actuar como inmunoestimulantes. Las vías y frecuencia de administración pueden variar extensamente. Las vías más usadas son intramusculares o subcutáneas, intranasal u oral, con una frecuencia de 3 dosis cada 15 días. La dosis tambiénpuede variarmucho dependiendodelestado del individuo ydesu tamaño.La dosis de la proteína Lip2a, como de cualquier otro inmunógeno, tiene que ser ajustada de modo que se introduzca una cantidad significativa de interferón gamma u otras citocinas son inducidas potencialmente. Normalmente, la dosis puede variar entre 10microgramos y 100 microgramos por cada 100 gramos de peso del hospedador.
[0043] Otro método alternativo de administración de la Lip2a e inducción de una respuesta inmune puede ser la extracción de células (preferiblemente células mononucleares periféricas) de un individuo, estimularlas in vitro con la proteína Lip2a en presencia o no de un antígeno (específico de una enfermedad o infección) para posteriormente reintroducirlas en el paciente con el objetivo de interferir en el proceso patológico. En este contexto la proteína Lip2a
o sus variantes polipeptídicas podrían utilizarse como adyuvante o inmunoestimulante de una respuesta. Estas características de la proteína Lip2a sugieren que ésta puede tener un papel en la generación de una respuesta inmunológica protectora o terapéutica en pacientes con enfermedades dependiendo de la presencia de interferón-γo parásitos, por ejemplo, leishmaniasis. En este sentido, la presente invención describe sistemas para aumentar o inmunoestimular la respuesta humoral o celular en individuos o células aisladas (macrófagos, monocitos, células B o células dendríticas) procedentes de individuos que han sido inmunizados o no con la proteína Lip2a. La capacidad para estimular la producción de interferón gamma muestra el potencial que tiene la Lip2a para ser muy usada en terapias en una amplia gama de aplicaciones que requieren la inducción de una respuesta no específica para esta citocina (no necesariamente leishmaniasis).
[0044] Como se mostrará en las figuras, citadas más adelante a modo de ejemplo, la proteína Lip2a es capaz de inducir una respuesta humoral fuerte en ratones Balb/c inmunizados con 5 microgramos de la proteína rLip2a en tampón salino por vía intraperitoneal y una pauta de administración de dos dosis con una separación de tres semanasentreellas (21días).Los datos mostraron que se producenvaloresaltos deinmunoglobulinas GyM.Tras la primera dosis, la respuesta fue principalmente de tipo IgM conduciendo a una maduración hacia IgG tras la segunda inoculación. Se observó que el isotipo de IgG más abundante en ratas inmunizadas con la proteína rLip2a correspondía a la inmunoglobina IgG2a aunque IgG1 también se produjo. Se concluye de estos datos que la inmunización con el antígeno Lip2a genera una respuesta mixta Th1/Th2, aunque predomina Th1.
[0045] Dado que la naturaleza de esta proteína se conserva con otras de otros organismos, se analizó la especificidad de la respuesta humoral generada tras la inmunización. Se analizó el reconocimiento de los sueros de ratas inmunizadas frente a un grupo de proteínas sintéticas que comprenden Lip2a. Se observó que los péptidos A4, A5 y A6 fueron reconocidos por los sueros. La región de la proteína contenida en dichos péptidos es específica para las proteínas ácidas de los tripanosomatidos, sin ninguna actividad detectada frente al péptido A7, el cual contiene el terminal carboxilo conservado de la proteína. Esta especificidad de respuesta se confirmó cuando se realizó un análisis "Western Blot" sobre la reactividad de los sueros frente a proteínas ácidas de Leishmania, MBP-Lip2a y MBP-Lip2b, MBP-P2 humana y MBP-P2 de T. cruzi. Hubo sólo reconocimiento hacia las proteínas ácidas de parásitos, con una reactividad superior contra MBP-Lip2A, y en ningún caso se generaron anticuerpos contra las proteínas ácidas de los organismos eucariotas superiores analizados (conservados con la P2 humana usada en el ensayo). Así, se confirmó que la proteína inmunogénica o el inmunoestimulante no han inducido problemas de autoinmunidad en el hospedador. Además, uno de los péptidos reconocidos por los sueros de animales inmunizados coincidió con el péptido reconocido por los sueros de perros infectados con leishmaniasis viscerocutánea. Esto significa que también en perros, esta región de la proteína es inmunogénica en la infección natural con Leishmania.
[0046] La proteína Lip2a también induce la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones inmunizados. Los resultados obtenidos mostraron que había una relación directa entre la concentración de antígenos y el nivel de proliferación celular inducido. Sorprendentemente, se obtuvieron los mismos resultados cuando se analizó la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones no inmunizados. Con el fin de implicar directamente a la proteína en la proliferación, eliminando la posibilidad de que bacterias contaminantes puedan provocar dicho fenómeno, se analizó la capacidad inhibitoria de un anticuerpo anti-Lip2a generado en un conejo a diluciones diferentes en la proliferación celular. Se observó que mientras una dilución serosa de 1/100 indujo una reducción en la proliferación tanto para cultivos con Concanavalina A como para cultivos con el antígeno Lip2a, aunque era siempre superior en el caso de cultivos inducidos para proliferar con Lip2a, en diluciones más altas (1/500 y 1/1000), la inhibición sólo se indujo en cultivos con este antígeno. Este hecho mostró que la inducción proliferativa fue dictada por la proteína Lip2a y no por un contaminante de la misma. El estudio de la cinética de proliferación y los niveles de la proteína en ratones inmunizados con la proteína Lip2a y en ratones no inmunizados indicó que la proteína Lip2a es capaz de inducir la misma cinética de proliferación y alcanzar los mismos niveles independientemente de si los animales han sido inmunizados o no. Éste indica que debería haber células capaces de responder a Lip2a incluso en 25 animales no estimulados sugiriendo que durante su vida los animales han estado expuestos a proteínas que tienen características estructurales o una secuencia similares a Lip2a.En general, se puede afirmar por los datos obtenidos que la proteína rLip2a tiene características inmunogénicas y mitogénicasmuy potentes.
[0047] Para caracterizar el tipo de respuesta generado durante las proliferaciones, se analizaron las linfoquinas gamma INF e IL-4 que se producen en los ensayos de proliferación, tanto de esplenocitos de ratas control que no han sido inmunizadas como de ratas inmunizadas. Los resultados mostraron que la proliferación provocada por el antígeno genera un aumento significativo en la secreción de gamma INF en esplenocitos de ratas inmunizadas. De forma similar, se detectó un ligero aumentoenlosnivelesde IL-4 en los cultivos de esplenocitosque proliferaron en presencia del antígeno con respecto a aquéllos que proliferan en el medio sin estímulos adicionados. Estos resultados indican que la respuesta generada por el antígeno provoca una proliferación celular que genera un modelo de producción de linfocitos predominantemente de tipo Th1.
[0048] Con el objetivo de determinar el carácter potencial de protección de la Lip2a, se administró la proteína y posteriormente se infectaron los ratones Balb/C con el parásito. Se comprobó que hubo un retraso en la aparición de la enfermedad y una reducción en las lesiones del tipo cutáneo generadas por infecciones con Leishmania major.
Descripción de las figuras
[0049] A continuación se describe la invención con referencia a las figuras adjuntas, donde:
La Figura 1 describe el sistema usado para el aislamiento del gen Lip2a de Leishmania infantum y en cuyo genoma
hay dos copias de este gen.
La Figura 2 muestra la expresión (ARN) del gen de la proteína Lip2a en Leishmania infantum.
La Figura 3 muestra la expresión de la proteína Lip2a en cultivos bacterianos de E. coli transformados con el vector de expresión pMal que contiene la proteína de fusión MBP-Lip2a y su purificación y reconocimiento de la proteína Lip2a porsueros de animales infectados de forma natural con Leishmania. La Figura 4 muestra la especificidad de la respuesta inmune a Lip2a de sueros de animales infectados de forma natural por Leishmania. La Figura 5muestra la localización dentro de la proteína de los antígenos determinantes reconocidos por los sueros de los animales infectados de forma natural por Leishmania infantum. La Figura 6 muestra que la proteína Lip2a es homóloga de las proteínas ribosómicas ácidas P2 de otros organismos eucariotas. La Figura 7 muestra que la proteína Lip2a es capaz de inducir una respuesta humoral después de la inoculación de los ratones. La Figura 8 muestra la especificidad de la respuesta frente a péptidos de la Lip2a de sueros de animales Balb/c inoculados con Lip2a y la especificidad de lossueros de ratones inmunizados frente a las proteínas de la familia P2. La Figura 9 muestra que la proteína es capaz de inducir una respuesta proliferativa en esplenocitos de animales inmunizados y no inmunizados. La Figura 10 muestra que la proteína Lip2a confiere un cierto grado de protección y retrasa la aparición de síntomas de infección por Leishmania major.
[0050] Con referencia a la figura 1, se rastreó una genoteca de expresión de ADNc de Leishmania infantum con el suero de un perro infectado de forma natural con Leishmania. Para caracterizar las secuencias de ADN contenidas en los fagos aislados, los insertos de ADNc contenidos en ellos fueron clonados y ordenados en el plásmido pUC18. El análisis de la secuencia de tres de los clones aislados (L 21, L 22 y L 23) indicó la existencia de homología de la secuencia con los genes codificantes para las proteínas ribosómicas ácidas eucariotas del tipo P2. Los ADNcs L21 y L22 tenían una secuencia idéntica a lo largo de su longitud, siendo L22 (454 nt) el mayor en ambos casos. Cuando la secuencia del clon L22 se comparó con aquella del clon L31, se observaron diferencias significativas: mientras la homología de la secuencia de los clones L22 y L31 era completa en la región codificante, las regiones 3' no traducidas fueron absolutamente divergentes.La proteína se denominó Lip2a.
[0051] Con el fin de estudiar la organización de los genes Lip2a, se realizaron análisis Southern Blot. En la sección A de la figura 1 semuestra el resultado de la hibridación delinserto del clonL22 frente alosfiltrosquecontenían ADN de L. infantum digerido con diversas enzimas de restricción (B = Bam H I; H = Hind III; P = Pst I). El patrón obtenido del uso de L 22 como una sonda indica que hay al menos dos genes Lip2a, ya que aparecen dos bandas de hibridación en el carril Pst I, una enzima que no presenta una secuencia de corte en el ADNc L 22. Estos genes se encuentran agrupados en el genoma, ya que sólo se obtuvo una banda de hibridación en los carriles de ADN digeridos con el resto de enzimas de restricción usadas. De hecho, y como se puede deducir del patrón de hibridación obtenido tras hibridar el inserto del clon L 22 para filtros que contenían cromosomas de Leishmania independientes en campo pulsado, los genes Lip2a se localizan en un único cromosoma (banda cromosómica XIX) (secciones B-C).
[0052] Con el fin de definir en detalle la secuencia y organización de los genes codificantes para la proteína ácida Lip2a de Leishmania, se usó el inserto de clon L22 para rastrear una genoteca genómica de este parásito, construido en el vector de reemplazamiento EMBL-3. Se aisló un fago positivo, denominado L22g. El mapa de restricción del fago (D), al igual que los datos para la secuencia que se detallan después, mostraron que había dos genes codificantes para la proteína Lip2a, formados por dos unidades organizadas en tándem. La secuencia del fragmento SalIde 2,8 Kb delfago L22gque contenía losgenesresponsables delADNcL22 se muestra enla SEQ ID NO 1 adjunta. La zona de codificación de los dos genes no mostraron diferencias excepto dos transiciones que no conllevan cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; al contrario, las zonas 5' y 3' que no son traducidas son completamente diferentes.
[0053] Los estudios de hibridación sobre el ARN de Leishmania en filtros, que utilizan el inserto del clon L22 como sonda, mostraron que el tamaño de las transcripciones de los genes Lip2a era 0,6 Kb (véase figura 2-A). Estos ARN mensajeros están polidenilatados.Como se muestra en la figura 2 (panel A, carriles 1 y 2),se produjeron cambios en la intensidad de las bandas de hibridación obtenidas, según si el ARN se obtuvo de cultivos de promastigotes creciendo en la fase estacionaria o logarítmica. De esto se deduce que la expresión de los genes de la proteína ácida Lip2a de Leishmania es mayor en la fase logarítmica. Este tipo de regulación en la expresión de genes de las proteínas ácidas también ha sido descrito en levaduras (Newton y colaboradores, 1990, Saenz-Robles, 1990). El tratamiento de choque térmico, inducido por la incubación de cultivos de promastigotes en la fase logarítmica durante 2 horas a 42° C también condujo a una reducción en los niveles de las transcripciones de las proteínas ácidas del parásito (panel A, carril 4). Por otro lado, y como se muestra en el carril 2 (panel A), la hibridación obtenida en el carril de amastigotes axénicos fue hasta 6 veces inferior que en el carril de ARN extraído de promastigotes.Losdatosparecen indicarqueelmodo de expresión de losgenes Lip2a de Leishmaniaestá unido al estado metabólico celular (Soto y colaboradores, 1993).
[0054] Según la figura 3, en el panel A (línea 1), la expresión de la proteína Lip2a se muestra en un cultivo bacteriano de E. coli transformado con el vector de expresión pMAI-cRI que contiene el gen Lip2a y su purificación (línea 2). El peso molecular de la proteína purificada corresponde a una proteína de fusión MBP-Lip2a. MBP significa la proteína de unión a maltosa de E. coli que se utiliza para formar la proteína de fusión con Lip2a. El panel B muestra el reconocimiento de la proteína Lip2a por una colección de sueros de animales con leishmania infectados de forma natural.
[0055] Conforme a la figura 4, se analizó la especificidad de la respuesta humoral generada contra Lip2a mediante la medida de la reactividad de los sueros obtenidos a partir de perros infectados con Leishmania frente a las proteínas homólogas de otras especies. En el caso de la proteína ácida Lip2a, se analizó la respuesta de sueros caninos positivos contra otra proteína ácida de Leishmania, LiP2b, las proteínas ácidas humanas P1 y P2 y la P2 de T. cruzi, expresadas todas como proteínas de fusión después de su clonación en el vector pMAL-cRI. En el panel A de la figura,semuestra elresultado de laincubacióndeunconjunto de suerosobtenidos a partirdeperrosinfectados con Leishmania contra las proteínas ácidas descritas previamente. Solo las proteínas de fusión MBP-Lip2a y MBP-Lip2b (líneas 2 y 3) fueron reconocidas, indicando que los anticuerpos producidos contra las proteínas ácidas durante el proceso de leishmaniasis se dirigen específicamente contra las proteínas ácidas de Leishmania. En el panel B de la figura, se muestra que el suero de un paciente con lupus eritematoso sistémico reaccionó a las proteínas expresadas de las tres especies. Este resultado indicó que las proteínas ácidas de Leishmania contienen el determinante antigénico contra el que se origina la respuesta humoral durante la enfermedad de Chagas y en procesos humanos autoinmunes, localizado en el extremo carboxilo de la proteína. Sin embargo, la falta de reactividad contra las proteínas ácidas humanas o aquellas de T. cruzi en los sueros de perros infectados con Leishmania muestra que no hay anticuerpos dirigidos contra el extremo C-terminal de estas proteínas en sueros de animales con leishmaniasis.
[0056] Con el fin de localizar los determinantes antigénicos de Lip2a, se sintetizaron péptidos que solapan 5 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína Lip2a. La Figura 5 muestra la secuencia de péptidos y los valores de densidad óptica obtenidos cuando estos péptidos se analizan en ensayos de FAST-ELISA frente a sueros de perros infectados. Solo se obtuvieron valores positivos frente al péptido A6. La falta de reactividad obtenida después de probar los sueros de animales infectados con Leishmania frente al péptido A-7, que contiene la secuencia C-terminal conservada en proteínas ácidas de eucariotas, confirmó que esta zona no genera ninguna respuesta humoral durante la infección con el parásito.
[0057] Con el fin de ser capaz de analizar el potencial inmunogénico o inmunoestimulante de la Lip2a de Leishmania, se clonó el inserto del clon L22 en el vector de expresión eucariota PQE-31. La inducción de cultivos bacterianos transformados con el plasma recombinante pQE-Lip2a produjo la sobreexpresión de una proteína que correspondía aLip2aexpresada enlaforma recombinante,denominadarLip2a.La Figura 6muestraelresultado de la expresión y posterior purificación de la proteína a partir de 500 ml de cultivo, inducido por IPTG, mediante cromatografía de afinidad en columnas de NT-Ni. Las bacterias fueron solubilizadas en 8 M urea y sonicadas. Las proteínas marcadoras de peso molecular (carril M). Las proteínas de E. coli sin transformación por el vector de expresión pQE-31 (carril 1). Las proteínas de E. coli transformadas con el vector de expresión pQE-31 (carril 2). La proteína se purificó a partir de la fracción soluble (carril 3).
[0058] La proteína expresada en el vector pQE-31 incluye la proteína Lip2a y aquellos aminoácidos que se incluyeron durante el proceso de clonación. La proteína Lip2a está compuesta por 106 aminoácidos y está comprendida entre los aminoácidos 39 y 144 (SEQID NO 3) y tiene un peso molecular de 10.57 kDa. (véase SEQ ID NO 3 de ahora en adelante).
[0059] El análisis de la secuencia de aminoácidos deducido de la secuencia ADNc L22 indicó que la proteína Lip2a tiene características comunes con proteínas ribosómicas ácidas del grupo P2 de eucariotas. La comparación de la proteína Lip2a de Leishmania deducida de la secuencia de nucleótidos muestra una identidad de 89.62% con su homóloga de Leishmania donovani (RLA2 LEIDO), una identidad de 81.13% con su homóloga de Leishmania brasiliensis (RLA2 LEIBRE), de 61.46% con su homóloga de Trypanosoma cruzi (RLA2 TRiCR), de 43.47% con su homóloga de seres humanos (RLA2 humano) y 51.87% con Lip2b de Leishmania infantum (RLA2 LEIIN). La mayor homología se muestra en el amino y el carboxilo terminales. La proteína tiene una zona central muy flexible rica en prolinas y anilinas. En la figura de secuencia (véase más adelante) se muestran con una barra vertical los aminoácidos que son idénticos en las cuatro proteínas Lip2a, Lip2b de Leishmania, la TcP2 homóloga de Trypanosoma cruzi (RLA2 TRiCR) y la HuP2 homóloga humana (RLA2 HUMAN).
[0060] Un total de 12 ratones BALB/C fueron inoculados con 5 microgramos de la proteína rLip2a soluble en una tampón salino.La vía de inoculación fue intraperitoneal, y la pauta de inmunización fue de dos dosisseparadas entre si por tressemanas (21 días).Se sacó sangre a los ratones los días 0,7 y 28 y se analizaron los respectivos sueros. La Figura 7 (panel A) muestra los títulos de las inmunoglobulinas G y M presente en el suero de ratones en los días 7 y 28, lo que indica que después de la primera dosis la respuesta fue principalmente IgM, con una maduración hacia IgG después de la segunda inoculación. Dado que las citocinas relacionadas con una respuesta de tipo Th1 producen una respuesta principalmente IgG2a y las citocinas secretadas por la sobrepoblación de linfocitos ayudantes Th estimulan una respuesta IgG1, se analizaron los títulos de los subtipos más abundantes de IgG generados después de las dos dosis de antígenos. La Figura 7B muestra que el isotipo de IgG más abundante en ratones inmunizados con la proteína rLip2a correspondía a la inmunoglobulina IgG2 tras la primera dosis y que la Th2 aumenta después de la segunda dosis. Se concluye que la inmunización de este antígeno genera una
respuesta de tipo mixta Th1/Th2, aunque la respuesta es principalmente Th1 en las primeras semanas de inmunización. Las proteínas usadas en este estudio fueron purificadas de endotoxinas mediante columnas de polimixina.
[0061] Teniendo en cuenta la naturaleza conservada de esta proteína, se necesitaba un estudio sobre la especificidad de la respuesta humoral generada tras la inmunización. Con este objetivo, se analizó el reconocimiento de los sueros de ratones inmunizados (sueros obtenidos el día 28) frente a los péptidos sintéticos. La figura 8-A ilustra los resultados obtenidos, mostrando el reconocimiento de los sueros de ratones inmunizados hacia tres de los péptidos, A4-A6. La región de proteína contenida en dichos péptidos es específica para las proteínas ácidas de las trypanosmatidas, sin haberse detectado reactividad contra el péptido A7, que contiene el carboxilo terminal conservado de la proteína. Esta especificidad de respuesta fue confirmada cuando se llevó a cabo el análisis "Western Blot" para analizar la reactividad de los sueros contra las proteínas ácidas de Leishmania, MBP-Lip2a y MBP-Lip2b, MBP-P2 humana y MBP-P" de T. cruzi. Solo se obtuvo reconocimiento hacia las proteínas ácidas de parásitos,siendo la reactividad más elevada cuando se genera contra MBP-Lipsa (panel B, línea 2) y en ningún caso se generaron anticuerpos contra las proteínas ácidas de eucariotas superiores (conservadas con la P2 humana usada en el ensayo). Finalmente, se puede señalar que uno de los péptidos reconocidos coincidió con el péptido reconocido por elsuero de los perros afectados por leishmaniasis viscerocutánea.
[0062] Se extrajeron los bazos de los ratones que habían sido inmunizados dos semanas después de la última inmunización y se analizó su proliferación contra las diversas concentraciones de antígenos. Los resultados tabulados en la figura 9-A muestran los valores (en cpm) de timidina tritiada incorporados en los esplenocitos de ratones inmunizados después de 96 horas. Los valores obtenidos mostraron que había una relación directa entre la concentración de antígeno y la proliferación celular. Sorprendentemente, se obtuvieron los mismos resultados cuando se analizó la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones no inmunizados. Este resultado indica que la proteína Lip2a posee características inmunogénicasmuy potentes.
[0063] con el fin de implicar directamente a la proteína de proliferación, eliminando la posibilidad de que contaminantes bacterianos pudieran estar provocando dicho fenómeno, se analizó el efecto de la presencia de un anticuerpo anti-Lip2a generado en un conejo. Los paneles B y C de la figura 9 muestran el efecto sobre la proliferación de diferentes diluciones del anticuerpo. Así, mientras que la dilución 1/100 provocó una reducción en la proliferación inducida por un mitógeno (Concanavalin A, -ConA) y por el antígeno, aunque era siempre mayor en este último caso, diluciones más altas (1/500 y 1/1000) solo condujeron a una reducción en la proliferación inducida por el antígeno.
[0064] Para caracterizar el tipo de respuesta generada, se analizaron las linfoquinas gamma INF e IL-4 producidas en los ensayos de proliferación, tanto de los esplenocitos de ratones control como de ratones inmunizados. En la tabla indicada acontinuaciónse muestranlosresultadosobtenidos.Estosindicanque la proliferación provocada por el antígeno genera un aumento significativo en la secreción de gamma INF, especialmente en los esplenocitos de ratones inmunizados. De forma similar, se detectó un ligero aumento en los niveles de IL-4 en los cultivos de esplenocitos que proliferaron en presencia del antígeno con respecto a aquellos que proliferaron en el medio sin estímulos añadidos. Estos resultados indican que la respuesta generada por el antígeno provoca una proliferación celular que conlleva la producción de un patrón de linfoquinas donde predomina el tipo Th1. Estos resultados sugieren que la proteína Lip2a puede ser usada como un adyuvante o como una subunidad en una vacuna y por tanto puede ser relevante para el tratamiento y/o prevención de enfermedades presente en animales y seres humanos.
- IL-4 (pg/ml)
- gamma INF (ng/ml)
- Inmunizados
- ConA 99 8.4
- Lip2a
- 80 5.8
- Promedio
- 40 0.5
- Controles
- ConA 98 6.1
- Lip2a
- 61 1.2
- Promedio
- 13 0.4
[0065] Se administraron tres dosis de 5 microgramos de Lip2a en PBS en intervalos de 15 días a un grupo de cuatro ratones BALB/C (5 microgramos por ratón). Una semana después de la última dosis, fueron infectados con 5 x 104 promastigotos de una cepa infecciosa de L. major en la almohadilla plantar de la pata derecha tanto de ratones inmunizados como de aquellos controles (que únicamente recibieron PBS). El tamaño de la lesión en la pata se medía semanalmente, obteniéndose los resultados que se muestran en la Figura 10. Los resultados obtenidos indicaron que la inmunización de la proteína Lip2a provocaba un retraso en la aparición de lesiones de dos semanas, sin aumentar el tamaño de la lesión hasta la semana 5 en los ratones inmunizados, mientras que en los controles no inmunizados, las lesiones aparecían a partir de la tercera semana. Además, la inflamación provocada por la infección en ratones inmunizados esmenor que en los controles, hasta igualarse a partir de la semana 8.
SEQ ID NO:1 del fragmento Sal 1 -Sal 1 L22g. La secuencia nucleótida de los clones de ADNc L22 y L31 se
muestra en negrita.
SEQ ID NO:2. Secuencia de nucleótidos del gen Lip2a que codifica la proteína Lip2a y la secuencia de aminoácidos de la proteína Lip2a.
Secuencia de aminoácidos de la proteína Lip2a (SEQ ID NO 2) expresada en el vector PQE-31 (SEC. ID. NO. 3)
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Composición para estimular una respuesta inmune en individuos inmunizados o en grupos celulares, caracterizada porque que dicha composición consiste en una solución salina que comprende
- -
- la proteína de Leishmania Lip2a representada por la SEQ ID NO:2 o por un polipéptido que difiere solo por sustituciones conservadas de los aminoácidos de la SEQ ID NO:2 de los cuales los grupos de aminoácidos que representan cambios conservados son (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his, o
- -
- un ácido nucleico que codifica la proteína de Leishmania Lip2a como se ha identificado anteriormente, o representado por la SEQ ID NO:1.
-
- 2.
- Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque esta comprende además un adyuvante tal como perlas biodegradables, ISS (es decirsecuencias de inmunoestimulantes), BCG, o liposomas.
-
- 3.
- Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque comprende además almenos un antígeno.
-
- 4.
- Método para estimular in vitro una respuesta inmune en células mononucleares inmunizadas o no con la proteína Lip2a representada por la SEQ ID NO:2, caracterizado porque comprende la incubación de dichas células mononucleares con la composición según la reivindicación 1.
-
- 5.
- Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha incubación comprende además al menos un antígeno.
-
- 6.
- Método según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque dichas células mononucleares son células mononucleares periféricas.
-
- 7.
- Uso de la composición tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de un medicamento para estimular una respuesta inmune in vivo frente a un antígeno.
-
- 8.
- Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque dicha composición se administra a un individuo en presencia de almenos un antígeno.
-
- 9.
- Uso de la composición tal y como se define en la reivindicación 1, para la producción de un adyuvante en una vacuna para la prevención de Leishmaniasis.
-
- 10.
- Uso de la composición tal y como se define en la reivindicación 1, para la producción de una vacuna para la prevención de Leishmaniasis, caracterizada porque dicha composición se usa como una subunidad de dicha vacuna.
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