JP2023550004A - 融合遺伝子、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ｄｎａワクチン、それらの構築方法及び使用 - Google Patents

融合遺伝子、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ｄｎａワクチン、それらの構築方法及び使用 Download PDF

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Abstract

融合遺伝子、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン、それらの構築方法及び使用。本明細書で提供される免疫ＤＮＡワクチンＺＤ－ｎＣｏｒ１９は、新型コロナウイルスのＲＢＤタンパク質、Ｓ２サブユニットのセグメント３０１～５３８ａａ及びＮタンパク質のセグメント１３８～３６９ａａを標的抗原として使用し、適切な位置に導入された特定の免疫相乗作用分子を有し、したがって、体液性免疫及び細胞性免疫を効率的に同時に誘導することができ、全長Ｓタンパク質及び全長Ｎタンパク質によって引き起こされる可能性があるＡＤＥに付随する安全性の問題を回避することができ、それによって、予防及び治療の二重効果を達成する。

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２０年１１月２０日に出願された中国特許出願第２０２０１１３１０１６０．８号に対する優先権を主張し、その内容の全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。
本発明は、生物医学技術の分野、特に、融合遺伝子、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン（ＺＤ－ｎＣｏｒ１９と命名した）、それらの構築方法及び使用に関する。
新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）は、以前に人体で発見されたことがないコロナウイルスの新しい系統である。新型コロナウイルスによるヒト感染の一般的な徴候として呼吸症状、発熱、咳、息切れ及び呼吸困難が挙げられる。感染は、より重篤な場合、肺炎、重症急性呼吸器症候群、腎不全、更には死亡につながる場合もある。
これまでに、世界中で新型コロナウイルスの累積感染者数は、数千万人に達しており、累積死亡数は、百万人を超えており、新型コロナウイルスは、全人類の生命、健康及び安全性に大きな脅威をもたらしている。しかし、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックは、世界の多くの地域で依然として急速に広がっている。本ウイルスは、非常に伝染性があり、病原性があり、有害であることが確証されている。感染、罹患及び死亡の危険性のある人が世界中で７８億人いる。安全かつ有効なワクチン接種が、ヒトの安全性及び健康を守るための重要な対策であると共に有効な手段であることが国際的に認識されている。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９に対する予防と治療の両方のために使用することができる有効かつ安全なワクチンを開発することが急務である。
現在は、世界的に、異なる開発段階にある２００種近くの新型コロナウイルスワクチンが存在し、そのうちの１０種の新型コロナウイルスワクチンは、第ＩＩＩ相臨床試験中であり（２０２０年１０月１３日現在）、これらには、主に、新型コロナウイルス不活化ワクチン、組換えサブユニットワクチン、アデノウイルスベクターワクチン、弱毒化インフルエンザウイルスベクターワクチン、核酸ワクチン等が含まれる。新型コロナウイルスワクチンの研究開発で段階的な結果が達成されてきたが、予防と治療の両方のために使用することができる新型コロナウイルスワクチン品種（varieties）の開発が依然として急務である。
本発明は、融合遺伝子及び組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン並びにそれらの構築方法及び使用を提供することを目的とする。
本発明の第１の態様では、以下の（１）～（４）の少なくとも２つを含む融合遺伝子が提供される：
（１）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＲＢＤセグメントを発現する遺伝子；
（２）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＳ２サブユニット又はその部分的断片を発現する遺伝子；
（３）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＮタンパク質又はその部分的断片を発現する遺伝子；
（４）ＣＴＢ、ＴＴ、ＰＡＤＲＥ、フォルドン、ＣＰＰＣＰ、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ、ＩＲＥＳ、及びＯＸ４０Ｌからなる群から選択されるアミノ酸断片、又はこれらの組み合わせを発現する遺伝子。
１つの実施の形態では、融合遺伝子は以下の（１）～（４）の少なくとも３つを含む：
（１）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＲＢＤセグメントを発現する遺伝子；
（２）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＳ２サブユニットの残基３０１～５３８を発現する遺伝子；
（３）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＮタンパク質の残基１３８～３６９を発現する遺伝子；
（４）以下のアミノ酸断片：ＣＴＢ、ＴＴ、ＰＡＤＲＥ、フォルドン、ＣＰＰＣＰ、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ、ＩＲＥＳ及びＯＸ４０Ｌを発現する遺伝子。
１つの実施の形態では、ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子とＳ２サブユニットの残基３０１～５３８を発現する遺伝子が連結されて、融合断片を形成し、好ましい実施の形態では、融合断片のヌクレオチド配列は、配列番号６に記載される配列を含み、Ｎタンパク質の残基１３８～３６９を発現する遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載される配列を含む。
別の実施の形態では、融合遺伝子において、
ＣＴＢアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２に記載されており、
ＴＴアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３に記載されており、
ＰＡＤＲＥアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号４に記載されており、
フォルドンアミノ酸断片を発現する遺伝子とＣＰＰＣＰアミノ酸断片を発現する遺伝子が連結されて、合成断片を形成し、合成断片のヌクレオチド配列が配列番号７に記載されており、
フューリン２Ａアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号８に記載されており、
ＥＲＩＳＳアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号９に記載されており、
ＩＲＥＳアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１１に記載されており、及び／又は、
ＯＸ４０Ｌアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１２に記載されている。
１つの実施の形態では、融合遺伝子において、ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子とＳ２サブユニットの残基３０１～５３８を発現する遺伝子が連結されて、融合断片を形成し、融合断片の上流がＣＴＢ、ＴＴ及びＰＡＤＲＥのアミノ酸断片を発現する遺伝子と順次連結され、融合断片の下流がフォルドン、ＣＰＰＣＰ及びフューリン２Ａのアミノ酸断片を発現する遺伝子と順次連結されており、及び／又はＥＲＩＳＳアミノ酸断片を発現する遺伝子が、Ｎタンパク質の残基１３８～３６９を発現する遺伝子の上流に連結され、ＩＲＥＳ及びＯＸ４０Ｌアミノ酸断片を発現する遺伝子が、Ｎタンパク質の残基１３８～３６９を発現する遺伝子の下流に順次連結されている。
好ましい実施の形態では、ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子とＳ２サブユニットの残基３０１～５３８を発現する遺伝子が（Ｇ４Ｓ）２リンカーを発現する遺伝子によって連結され、融合断片の上流とＰＡＤＲＥアミノ酸断片を発現する遺伝子がリンカーＧ６を発現する遺伝子によって連結され、リンカーＧ６を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号５に記載されている。
更に好ましい実施の形態では、融合遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載されている。
本発明の第２の態様では、上記の融合遺伝子を発現させることによって得られる融合タンパク質が提供される。
本発明の第３の態様では、上記の融合遺伝子及びベクターを含む、ＺＤ－ｎＣｏｒ１９と命名した組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンが提供される。
１つの実施の形態では、ベクターはｐＺＤＶａｃベクターである。
本発明の第４の態様は、上記の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを構築する方法であって、
１）上記の融合遺伝子を合成する工程と、
２）融合遺伝子をｐＺＤＶａｃベクターに挿入して、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを得る工程と、
を含む、方法も提供される。
本発明の第５の態様では、新型コロナウイルス感染症を予防及び／又は治療するための医薬の調製における上記の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンの使用も本発明の内容に属する。
本発明によって提供される組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンでは、Ｓ１サブユニットのＲＢＤセグメント、Ｓ２のセグメント残基３０１～５３８及びＮタンパク質のセグメント残基１３８～３６９がインフレームで融合しており、標的抗原として発現させられた。さらに、融合遺伝子は他の設計と更に組み合わされ、例えば、標的抗原遺伝子の上流及び下流が、免疫相乗作用分子を発現する遺伝子とそれぞれに連結され、フューリン２Ａプロテアーゼ切断部位が、標的抗原を発現する遺伝子の間に配置される。上記の設計は、本発明によって構築され、得られた組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン（組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ）が、全長Ｓタンパク質及び全長Ｎタンパク質によって引き起こされる可能性があるＡＤＥ関連問題を効果的に回避することができるだけでなく、標的抗原として、Ｓ１タンパク質のみ若しくはＲＢＤのみを使用する場合、又はＳ１タンパク質（ＲＢＤ）及びＮタンパク質のみを使用する場合と比較して、融合遺伝子が発現する融合タンパク質が、新型コロナウイルスのより多くのエピトープをカバーすることができ、より包括的な保護を達成できるということを確実にすることもできる。標的抗原の設計では、ワクチンは、ＲＢＤ、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８及びＮタンパク質の残基１３８～３６９のみを使用し、これは、全長Ｓタンパク質及びＮタンパク質と比べてより小さな断片を有し、ワクチンの構築にとって有益であるだけでなく、細胞への進入をより容易にし、高い発現効率及び高い免疫効果も有する。さらに、フューリン２Ａプロテアーゼ切断部位の存在は、Ｓタンパク質に由来する２つの抗原セグメント（ＲＢＤ及びＳ２サブユニットの残基３０１～５３８）の細胞外分泌を可能にし、それによって、より良好な液性免疫応答を誘導し、一方で、Ｎタンパク質に由来する抗原セグメント（Ｎタンパク質の残基１３８～３６９）は、細胞内で発現して、Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる。したがって、本発明によって構築され、得られたワクチンは、液性免疫応答及びＴ細胞免疫応答を同時に効率的に誘導することができ、これら２つは、ワクチンの免疫保護効果を相乗的に増強する。
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する：
１）高い安全性：本発明のワクチンは、ＤＮＡの形態のＲＮＡワクチンに属し、染色体に組み込まれないので、細胞の悪性形質転換を引き起こさないであろう。さらに、本ワクチンが細胞に入った後、ＲＮＡ転写が大規模に行われる可能性があり、これによって、細胞の急速なアポトーシスがもたらされ、悪性形質転換の可能性が更に回避される。さらに、本ワクチンは、更なるリポソーム、アルミニウムアジュバント等がない、ネイキッドプラスミド生成物であり、更なる非特異的炎症反応を基本的に引き起こさない。したがって、安全性の点から、これは、あらゆるタイプのワクチンの中で最も有利であり、最も保証されている。
２）高効率免疫：本発明のワクチンは、ＤＮＡワクチンとＲＮＡワクチンの二重の利点を兼ね備える高効率免疫ＤＮＡワクチン（（ｉｐＤＮＡワクチン）ＺＤ－ｎＣｏｒ１９）のクラスに属する。検証された結果によって、皮内注射＋電気パルス補助導入を介したワクチン接種（２８日離れた、緊急時は１週間～４週間離れた、２回の注射）を使用することによって、本ワクチンは、粘膜様表面免疫保護効力を効率的に誘導することができ、全身の高効率細胞性免疫応答を誘導することができ、強い表面免疫保護効果を生じさせることができるだけなく、強い深部保護効果も有することが示される。この種の免疫応答は高レベル免疫応答に属し、これは、「急速免疫決定動員（rapid immune decision mobilization）」、「集団軍全滅キャンペーン（group army annihilation campaign）」及び「徹底的な積極的防御クリアランス（active defense clearance in depth）」という特徴を有し、人体に効率的かつ持続的な免疫保護をもたらす。一旦ウイルスによって攻撃されると、表面粘膜レベルでの免疫応答、並びに全身的先天免疫、体液性免疫及び細胞性免疫を含めて、全身的免疫動員が急速かつ効率的に行われて、体に侵入する新型コロナウイルスを急速に死滅させ、かつクリアランスを行い、ウイルスが疾患を引きこすこと及び重大な疾患状態を悪化させることを防止し、生命を守り、様々な後遺症を回避し、体が症状を呈していないか又は軽度の症状しか呈していない間に、ウイルスの効率的な死滅及びクリアランスを完了し、このようにして、健康を急速に回復させることができる。
さらに、本ワクチンの高効率免疫は、ヒトの体内で全身免疫を増強する能力にも反映される。免疫が弱い高齢者及び重大な基礎疾患を有する人々にとって、本ワクチンは、生命を守る優れたワクチンであり、高齢者及び免疫が脆弱な群の生命及び健康を保護するのに役立つ。
３）長時間作用型免疫及び抗変異：本発明のワクチンの高効率免疫保護性に加えて、本ワクチンによって誘導される抗原特異的細胞性免疫は免疫記憶能力を何年も保持するので、本ワクチンは、長時間作用型免疫保護を提供することができるワクチンでもある。さらに、ワクチン設計において、ウイルスの内部Ｎタンパク質の部分的な断片が標的抗原として使用され、これは、非常に安定であり、確証された変異をめったに生じず、したがって、本発明のワクチンは、ウイルスの変異に効果的に抵抗することができるワクチンでもある。一部のワクチンがウイルス表面抗原の大幅な変異によりその免疫保護効力を失った後でさえも、本発明のワクチンは高効率免疫保護を依然として提供することができる。
４）予防と治療の両方のために使用される：本発明のワクチンは、予防的ワクチンとして使用することができるだけでなく、ウイルスについて検査が陽性の人々のための緊急時の免疫療法のために使用することもできる。本ワクチンは、急速に高効率細胞性免疫応答を誘導し、適時かつ効率的に体内のウイルスを取り除き、状態が悪化することを防ぎ、生命を守るのに役立ち、ウイルスによる致死率を低減させることができる。したがって、本発明のワクチンは、本当に生命を保護し、守ることができるワクチンであろう。
５）大規模製造能力及び低費用：本発明のワクチンは、生物発酵生成のために大腸菌原核生物システムを使用することができるので、現存する生物発酵工業システムを使用して新しい工業システムを確立することができ、そのため、ワクチンの生成は巨大な製造能力を築くことができ、費用は相対的に低くなる。したがって、このワクチン品種に対する国内及び国際の需要を満たすことが期待される。
６）高い安定性：ＤＮＡワクチンは、一般に、強い安定性を有し、室温で保存及び輸送することができるが、ＲＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン及びウイルスベクターワクチン、並びに不活化ワクチンは、コールドチェーン輸送を必要とし、これは、他のタイプのワクチン品種と比較して、ＤＮＡワクチンの特別な利点である。提供されるワクチンはＤＮＡワクチンであり、したがって、これは、安定性において非常に大きな利点があり、国家的な新型コロナウイルスワクチンの対外援助品種の中で優れた選択肢になり得る。
７）ブロードマーケット：現在は、新型コロナウイルスに対して、市場に出ている新型コロナウイルスワクチンはなく、したがって、現在の臨床上又は開発中のワクチンの効果を判断することができない。開発中の様々なワクチンを使用して、「複合的な措置（combined boxing）」を行って、ワクチンの補完性を築くことが必要である。本明細書のワクチンは、単独で使用して、新型コロナウイルスからの高効率の保護をもたらすことができるだけでなく、他のタイプのワクチン用に、追加免疫に使用して、他のタイプのワクチンとともに免疫保護の増強をもたらすこともできる。さらに、本明細書で提供されるワクチンは、潜在的なＡＤＥ効果（抗体依存性感染増強）を有する可能性があるいくつかのワクチンが起こり得るＡＤＥ効果を克服し、疾患を悪化させるＡＤＥ効果の重大な問題を回避することを支援することさえできる。
結論として、本明細書で提供されるワクチン（ｉｐＤＮＡワクチン）ＺＤ－ｎＣｏｒ１９は、安全性、高効率、長時間作用、抗変異、高い安定性及び巨大な製造能力という特徴及び利点を有することが期待される。本ワクチンは、効率的な免疫効果を有するＤＮＡワクチンであり、集団における日常の予防、高齢者等の免疫脆弱性群の特定の免疫保護、特定の群の免疫増強、ウイルス曝露後の緊急ワクチン接種、異なるタイプのワクチンの協調的な免疫増強のために、また国家的な対外援助ワクチンとして、使用することができる。予防と治療の両方のための優れたワクチンとして、本ワクチンは、更に開発され、利用されることが期待される。
本発明の一例によって提供される組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンにおける標的抗原及び免疫相乗作用分子の連結構造を示す模式図である。 ２重消化したｐＺＤＶａｃ－ＣＣＣＰＯプラスミドのゲル電気泳動の写真である。 ２重消化したｐＵＣ５７－ＣＲＳＮＰプラスミドのゲル電気泳動の写真である。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯの標的遺伝子断片及びベクター骨格の回収及び同定を示すゲル電気泳動の写真である。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯの構築模式図である。 コロニーＰＣＲによる陽性クローンの同定を示すゲル電気泳動の写真である。 少量の陽性クローンから抽出したプラスミドの消化による同定を示すゲル電気泳動の写真である。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯでマウスを免疫化した後に刺激物質としてＮタンパク質を用いた、マウス脾臓細胞におけるサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－４の分泌頻度の棒グラフである。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯでマウスを免疫化した後に刺激物質としてＲＢＤタンパク質を用いた、マウス脾臓細胞におけるサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－４の分泌頻度の棒グラフである。 マウスモデルにおける、組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯによって誘導されるＴ細胞応答のタイプバイアス解析の散布図である。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯによるヒト対象の免疫化の前後に刺激物質としてＮタンパク質及びＲＢＤタンパク質を用いた、ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＦＮ－γの分泌の散布図である。 異なる用量の組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯによるヒト対象の免疫化の前後に刺激物質としてＮタンパク質及びＲＢＤタンパク質を用いた、ヒトＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＦＮ－γの分泌の散布図である。 組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯを使用して異なる免疫化経路及び異なる電気導入条件下でマウスを免疫化することによって誘導される抗体の検出結果の散布図である。 異なる免疫化経路及び異なる電気導入条件下で組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯでマウスを免疫化した後に誘導されるＮ抗原、ＲＢＤ抗原及びＳ２抗原のＥｌｉｓｐｏｔアッセイの結果のバーチャートである。
本発明は、予防的機能と治療的機能の両方を有する組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン（ｉｐＤＮＡワクチン）ＺＤ－ｎＣｏｒ１９、並びにそれらの構築方法及び使用を提供することを目的とし、これらは、以下の技術手段に基づいて大部分は実現される。
アルファウイルスレプリカーゼベースのＤＮＡ（レプリコン）ベクターｐＺＤＶａｃが、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンの構築において使用される。ｐＺＤＶａｃベクターは、以下の改変によって、現存するｐＳＦＶ１プラスミドから得られる：元のＳＰ６プロモーターをヒトサイトメガロウイルスＣＭＶプロモーターに置き換え、ポリアデニル酸テールＳＶ４０ポリ（Ａ）を付加し、ｐＳＦＶ１プラスミドの抵抗性遺伝子を臨床的により良好な安全性を有するカナマイシン抵抗性遺伝子に置き換え、上記の改変が成功した後のレプリコンは最終的に真核生物で発現し、得られたベクターをｐＺＤＶａｃベクター（すなわち、中国特許出願公開第１０５３４３８７４号の特許文献に開示されているｐＳＦＶＫ１）と命名する。本ベクターを使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを調製する冗長なプロセスが回避される。本ベクターは、ＤＮＡプラスミドの形態でヒト及び動物の細胞に直接トランスフェクトすることができ、外来性タンパク質の高レベル発現を達成する。本ベクターは、アルファウイルスベクターがＩ型ＩＦＮの産生を誘導して発現した抗原にアジュバント効果を与えることができる機能を受け継ぎ、これは、免疫原性を増強する効果を有する。
抗原設計における以下の要因が十分に考慮され、最適化された設計スキームが提案される：
（１）現在は、新型コロナウイルスに関する基礎研究はまだほとんどなく、新型コロナウイルスに対して、市場に出ている新型コロナウイルスワクチンはなく、したがって、新型コロナウイルスワクチンの標的抗原の選択のための正確な標準がなく、すなわち、新型コロナウイルス抗原のどのセグメントがワクチン標的抗原としてより有効であるかを決定するための基準がない。したがって、研究者らは、一般に、ＳＡＲＳウイルスワクチンの開発に基づいて新型コロナウイルス抗原を選択し、標的抗原の選択では、研究者らは、一般に、新型コロナウイルスにおいて、全長スパイク糖タンパク質（スパイクタンパク質、Ｓタンパク質、これは、２つのサブユニットＳ１及びＳ２からなる）又はトランケートされたＳタンパク質（Ｓ１サブユニット及びその受容体結合領域ＲＢＤ）形態、及び高度に保存されたヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド）を使用する。抗原性エピトープの大部分を含み、カバレッジがより広い全長Ｓタンパク質を選ぶことがより安全であると一般に考えられており、ＲＢＤは、強力な中和抗体応答及び変異系統に対する起こり得る交差防御を誘導することができる重要な中和ドメイン（ＣＮＤ）を含むことから選ばれており、Ｎタンパク質は、非常に免疫原性であり、特定の抗体だけでなく、特定の細胞傷害性細胞活性も誘導することができる、コロナウイルスの中で保存されているリン酸化タンパク質であり、かつ様々なコロナウイルスの中で非常に保存されているので、変異する可能性が比較的低く、これにより、ウイルスの変異によるワクチンの失敗の危険性を回避することができる（Ｓタンパク質は、ウイルスの中で変異する可能性が高い抗原であり、ウイルスが変異すると、ワクチンの免疫効力に影響を及ぼす可能性がある）ことから選ばれている。その中で、新型コロナウイルスの構造及び患者に感染する機構により、新型コロナウイルスのＳ１サブユニット及びＮタンパク質は、強い免疫応答を誘発し、ワクチン開発のために最もよいウイルス抗原である主要なウイルス抗原であると一般に考えられている。
（２）本発明者らは、新型コロナウイルスの全長Ｓタンパク質及び全長Ｎタンパク質がＡＤＥ付随問題を引き起こす可能性があると考えた。したがって、本発明者らは設計を最適化し、最終的に、Ｓタンパク質のＳ１サブユニットのＲＢＤ、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８及びＮタンパク質の残基１３８～３６９が標的抗原設計のために選ばれると判断した。その中で、Ｓ１サブユニットのＲＢＤは、ワクチン開発に重要な中和領域を含み、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８は、Ｔ細胞エピトープの大部分を含み、Ｎタンパク質の残基１３８～３６９も複数のＴ細胞抗原エピトープを含む。そのような標的抗原設計は、全長Ｓタンパク質及び全長Ｎタンパク質に引き起こされ得るＡＤＥ関連問題を効果的に回避することができるだけでなく、設計された融合タンパク質はより多くの抗原エピトープをカバーし、Ｓ１タンパク質のみを使用するもの又はＲＢＤのみを使用するもの又はＳ１タンパク質（又はＲＢＤ）とＮタンパク質の融合タンパク質を使用するものと比べて、より包括的な保護を達成するということを確実にすることもできる。同時に、本発明の標的抗原の設計では、全長Ｓタンパク質及びＮタンパク質と比べてより小さな断片を有する、ＲＢＤ、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８及びＮタンパク質の残基１３８～３６９が使用される。標的抗原のこの設計は、ワクチンの構築に貢献するだけでなく、ワクチンを細胞に進入しやすくし、高い発現効率及び高い免疫効果も有する。さらに、標的抗原設計では、Ｓタンパク質に由来する２つの抗原セグメント（ＲＢＤ及びＳ２サブユニットの残基３０１～５３８）は分泌性発現のために設計され、これは、より良好な液性免疫応答を誘導することができ、Ｎタンパク質に由来する抗原セグメント（Ｎタンパク質の残基１３８～３６９）は細胞内で発現するように設計され、これは、誘導されたＴ細胞免疫応答を更に増強することができ、したがって、この設計に基づいて構築されるワクチンは、液性免疫応答及びＴ細胞免疫応答を同時に効率的に誘導することができ、これら２つは、本ワクチンの免疫保護効果を相乗的に増強する。
（３）本発明者らは、抗原を単独で使用するＤＮＡワクチン又はウイルスベクターワクチンの免疫原性は不十分である可能性があることも考えた。したがって、構築によって得られる組換え新型コロナウイルスＤＮＡワクチンの免疫原性を更に向上させ、それによって、その免疫保護効力を向上させるために、本発明によって構築されるワクチンにおける標的抗原に適した免疫相乗作用分子もスクリーニングし、決定し、これには以下が含まれる：
（ｉ）コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）：これは、先天免疫を惹起し、ＤＣを活性化し、免疫応答を増強し、細胞中への抗原の移行を支援し、ＴＨ１及びＴＨ２免疫経路を誘導し、かつ粘膜免疫のアジュバントとして作用することができる；
（ｉｉ）破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴＴ）及び汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＲＤＥ）：これらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を増強することができる；
（ｉｉｉ）フォルドン－ＣＰＰＣＰ：フォルドンは、標的タンパク質の非共有結合性オリゴマー化を可能にするドメインである。これは、Ｔ４バクテリオファージのフィブリンのＣ末端に由来し、２７個のアミノ酸からなる。非共有結合性の力によって形成されるオリゴマー化構造は、高い安定性を有する。構造は、温度が７５℃より高いか、又は室温で２％を超えるＳＤＳの状態の場合、脱重合し、脱重合の後、これは、適切な環境で依然として三量体を再形成することができる。ＣＰＰＣＰ（システイン－プロリン－プロリン－システイン－プロリン）は、抗体ヒンジ領域と同様であり、二重特異性抗体及び融合タンパク質に適しており、三量体タンパク質を容易に顆粒化する。このタイプの免疫強化分子は、ワクチンが発現する抗原を多量体及び顆粒に形成させることができ、これは、その免疫原性を更に増強することができる；
（ｉｖ）ＥＲＩＳＳ配列：これは、小胞体挿入シグナル配列、すなわち、ＥＲ挿入シグナル配列（ＥＲＩＳＳ）である、アデノウイルスＥ３リーダー配列であり、これは、小胞体シグナル認識粒子（ＳＲＰ）に結合することができる。ＳＲＰがＥＲ膜の表面上のＳＲＰ受容体に結合することができるという特徴を通じて、融合標的抗原を効果的にＥＲに輸送することができ、ＡＰＣによる抗原のプロセシング及びＭＨＣクラスＩ分子の提示が増強され、それによって、有効な保護的ＣＴＬ産生の誘導を増強する；
（ｖ）ＯＸ４０Ｌ：これは、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナルを提供することができる。
一連の融合遺伝子は、ＲＢＤ、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８及びＮタンパク質の残基１３８～３６９又はこれらの組み合わせを発現する遺伝子のうちのいずれか１つにこれらの免疫強化分子を発現する遺伝子の一部又は全てを組み込むことによって得ることができる。本発明の組換え新型コロナウイルスＤＮＡワクチンを構築し、得るために、これらの融合遺伝子は決められたｐＺＤＶａｃベクターに挿入される。
融合遺伝子は、以下のような様々な組み合わせを含む（以下の説明は、融合遺伝子発現後のタンパク質構造に基づく）：
組み合わせ１：ＲＢＤタンパク質及びＳ２サブユニットの残基３０１～５３８が（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して互いに連結し、次いで、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ（ＴＴ）及び汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ（汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープとＲＢＤタンパク質はＧ６可動性リンカーによって連結している）がＲＢＤタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に順次連結している。驚いたことに、他の連結配列（例えば、破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ、及びコレラ毒素Ｂサブユニット、又は破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、コレラ毒素Ｂサブユニット及び汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ等）と比べて、上記の３つの免疫強化分子の連結配列は、標的抗原の提示及び標的抗原によって誘導される免疫応答の増強により貢献する。
組み合わせ２：フォルドン－ＣＰＰＣＰは、Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８のカルボキシ末端（Ｃ末端）に連結している。フォルドンの機能は抗原を容易に三量体することであり、ＣＰＰＣＰは三量体抗原を更に顆粒化することである。フォルドンとＣＰＰＣＰの組み合わせは、標的抗原が発現した後に、それが多量体化し、顆粒化するのをより容易にする。可溶性抗原と比較して、これはＡＰＣによって貪食されやすく、Ｔｈ細胞、ＣＴＬ細胞及びＢ細胞を同時に活性化することができ、これらは、細胞性免疫と体液性免疫の両方を刺激することができるので、これは、包括的な免疫応答を生じさせることができ、ワクチンの免疫保護効果を大きく増強することができる。この組み合わせでは、本発明者らは、他の連結配列（例えば、ＣＰＰＣＰ－フォルドン）及び他の位置と比べて、２つのアジュバント分子フォルドンとＣＰＰＣＰを組み合わせ、それらをフォルドン－ＣＰＰＣＰの連結配列中のＲＢＤタンパク質とＳ２サブユニットの残基３０１～５３８の融合断片の後に配置することが、発現後にフォルドン及びＣＰＰＣＰを提示するのにより貢献することを予想外に見出した。アジュバント分子フォルドン－ＣＰＰＣＰが融合断片の他の位置に配置される場合、発現後のそれらの分子量が小さいことが理由で、２つのアジュバント分子が抗原タンパク質の中央に容易にカプセル化される可能性がある。したがって、２つのアジュバント分子の空間的構造が提示されず、これらは、発現後に標的抗原を重合し、顆粒化する役割を果たさないであろう。組み合わせ２と組み合わせ１の組み合わせは、スタッキング効果又は相乗効果をもたらすことができる。
組み合わせ３：組み合わせ２に基づくＣＰＰＣＰのカルボキシ末端で、又は組み合わせ１に基づくＳ２サブユニットの残基３０１～５３８のカルボキシ末端で、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ及びＮタンパク質の残基１３８～３６９が順次連結している。その中で、ＥＲＩＳＳは、ＡＰＣによる抗原のプロセシング及びＭＨＣクラスＩ分子による提示を増強することができ、それによって、細胞中で発現するＮタンパク質セグメントのＴ細胞免疫応答を増強する。フューリン２Ａはプロテアーゼ切断部位であり、Ｎタンパク質の残基１３８～３６９を細胞内で独立に発現させて、Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる。
組み合わせ４：組み合わせ３に基づいて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列がＮタンパク質の残基１３８～３６９のＣ末端に連結し、ＩＲＥＳ配列の下流にＯＸ４０Ｌ分子が更に連結しており、これは、Ｔ細胞活性化のための第２のシグナルを送達し、免疫応答を更に刺激し、免疫応答を誘導してＴｈ１タイプの高レベルの免疫応答に変えることができる。
さらに、コザック配列及びシグナルペプチド配列（これは、骨格ベクターに予め加えることもできる）を上記の各組み合わせの融合遺伝子の上流に順次導入することができ、シグナルペプチドは、真核生物の発現に適したシグナルペプチドから選択することができる。
図１は、上記の組み合わせ１～組み合わせ４を組み込む融合遺伝子並びに融合遺伝子の上流のコザック配列及びシグナルペプチド配列を含む、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンにおける標的抗原及び免疫強化分子の連結構造の例を示す。
本発明の好ましい実施形態によって提供される組換え新型コロナウイルスＤＮＡワクチンの構造の設計は、ＤＮＡワクチンの免疫保護効果を向上させるために、標的抗原間で、免疫強化分子間で、及び標的抗原と免疫強化分子の間で、相乗作用を生じさせることができる。同時に、ＤＮＡワクチンは、Ｓタンパク質のセグメント（ＲＢＤ及びＳ２サブユニットの残基３０１～５３８）及びＮタンパク質のセグメント（残基１３８～３６９）をそれぞれ発現するように設計されており、ここで、Ｓタンパク質セグメントは細胞外発現形態であり、Ｎタンパク質セグメントは細胞内発現形態であるので、これらは、良好な液性免疫応答及びＴ細胞免疫応答を同時に誘導することができ、ＤＮＡワクチンの免疫保護効果を更に向上させることができる。
具体例及び添付の図面を参照して、本発明の内容を以下に詳細に記載する。
以下では、或る特定の例示的実施例を簡潔に記載する。当業者が認識すると思われるように、全て本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、記載される実施例を様々な異なる方法で改変することができる。したがって、図面及び説明は、本質的に例示であり、かつ非限定的であると見なされるべきである。
以下の実施例で使用される方法は、別段の指定がない限り従来の方法であり、特定の工程は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook, J., Russell, David W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harborに見出すことができる。
実施例に記載されている様々な生物物質を得る方法は、特定の開示の目的を達成するために実験的に得る方法を提供するためだけであり、本発明の生物物質の供給源を限定するものではない。実際に、使用される生物物質の供給源は広範囲にわたり、法律及び倫理を破ることなく得ることができる任意の生物物質が、実施例における教示に従って、交換及び使用され得る。
本発明で言及される全てのプライマー及び配列は、従来技術を使用して合成された。
実施例１：組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンＺＤ－ｎＣｏｒ１９の構築
本実施例では、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを構築するために、ｐＺＤＶａｃベクターをＤＮＡワクチンのキャリアとして使用し、新型コロナウイルスのＲＢＤ、Ｓ２サブユニットのセグメント（残基３０１～５３８）及びＮタンパク質のセグメント（残基１３８～３６９）を標的抗原として使用し、コレラ毒素Ｂ、破傷風毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、汎ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ、フォルドン－ＣＰＰＣＰ、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ、ＩＲＥＳ及びＯＸ４０Ｌ（それぞれの対応するヌクレオチド配列を以下の表１に示し、ＲＢＤ及びＳ２サブユニットのセグメント（残基３０１～５３８）は、（Ｇ４Ｓ）２によって連結しており（ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２）、表１のリンカーＧ６は、ＲＢＤとＰＡＲＤＥの間のリンカー配列として示され、Ｎタンパク質のセグメント（残基１３８～３６９）のヌクレオチド配列は、表１にＮＰとして提供される）も免疫相乗作用分子として使用した。構築方法は、以下の工程を特に含む。
１．１．発現ベクター骨格の調製及び同定
ｐＺＤＶａｃ－ＣＣＣＰＯプラスミド（これは、合成遺伝子ＣＴＢ－ＴＴ－ＣＴＬＡ－４＋ＰＤ－Ｌ１細胞外領域－ＰＡＤＲＥ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０ＬをｐＺＤＶａｃベクターにクローニングすることによって得て、その構造はｐＺＤＶａｃ－ＣＴＢ－ＴＴ－ＣＴＬＡ－４＋ＰＤ－Ｌ１細胞外領域－ＰＡＤＲＥ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌであり、対応するヌクレオチド配列は配列番号１に記載されている）をＡｃｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素によって消化し、０．４５％ゲル電気泳動の写真を図２に示し、レーン１及びレーン２は、ＡｃｌＩ及びＸｂａＩでの二重消化後のｐＺＤＶａｃ－ＣＣＣＰＯプラスミドの結果であった。約１２ｋｂの回収された大きな断片はｐＺＤＶａｃ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌであった。回収された断片の再ゲル電気泳動による同定の結果を図４のレーン２に示し、これは、新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを構築するための発現ベクター骨格として使用することができた。
１．２．遺伝子断片の合成及び同定
図１に示すように、ＣＴＢ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－フォルドン－ＣＰＰＣＰ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ（第１の標的遺伝子、略してＣＲＳＮＰと命名した）の遺伝子連結の配列に従って遺伝子合成を行い、第１の標的遺伝子の上流に制限部位ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＰｍｅＩを導入し、第１の標的遺伝子の下流に単一の制限部位ＡｃｌＩを導入し、このようにして、標的遺伝子断片ＣＲＳＮＰを保有する組換えプラスミド（ｐＵＣ５７－ＣＲＳＮＰ組換えプラスミドと命名した）を得た。本工程はBeijing Biomed Gene Co., Ltd.によって行われた。
ＡｃｌＩ及びＸｂａＩ制限酵素（New England Biolabs (NEB) Inc.から購入した）によってｐＵＣ５７－ＣＲＳＮＰ組換えプラスミドを消化し、０．４５％アガロースゲル電気泳動（Biowest社製のレギュラーアガロースＧ－１０）の写真を図３に示し、レーン１にｐＵＣ５７－ＣＲＳＮＰ組換えプラスミドの電気泳動結果を示し、レーン２にＡｃｌＩ及びＸｂａＩでの二重消化後のｐＵＣ５７－ＣＲＳＮＰ組換えプラスミドの電気泳動結果を示した。３．６ｋｂの標的断片を回収する（TIANGEN製のアガロースゲルＤＮＡ回収キット（スピンカラム））ことによって、標的遺伝子断片ＣＲＳＮＰ（図３で矢印によって示され、第１の標的遺伝子断片と命名した）を得た。回収された第１の標的遺伝子断片の再ゲル電気泳動による同定の結果を図４のレーン１に示した。本実施例では、本発明者らは、２つの他の標的遺伝子断片：ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＮＰ（第２の標的遺伝子断片と命名し、これは、免疫相乗作用分子に連結していなかったという点のみにおいて第１の標的遺伝子断片と異なる）及びフォルドン－ＣＰＰＣＰ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＣＴＢ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ（第３の標的遺伝子断片と命名し、これは、免疫アジュバント分子、フォルドン－ＣＰＰＣＰ及びＣＴＢの位置が第１の標的遺伝子断片と異なる）も合成した。
Figure 2023550004000002
Figure 2023550004000003
１．３．組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンの構築
図５に示すように、上記の工程１．１で得られた発現ベクター骨格ｐＺＤＶａｃ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌを工程１．２で得られた第１の標的遺伝子ＣＲＳＮＰにＴ４リガーゼによって連結し、第１の標的遺伝子断片ＣＲＳＮＰを保有する組換え発現ベクターをコロニーＰＣＲによって得て、陽性クローン：ｐＺＤＶａｃ－ＣＴＢ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－フォルドン－ＣＰＰＣＰ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌ（ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドと命名し、融合遺伝子ＣＴＢ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－フォルドン－ＣＰＰＣＰ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌに対応するヌクレオチド配列は配列番号１３に記載されており、上記の表１に示すヌクレオチド配列に加えて、これは、制限部位も含む）をスクリーニングした。組換え発現ベクターは、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンＺＤ－ｎＣｏｒ１９であり、特定の構築工程は以下を含んでいた：
１．３．１．Ｔ４ライゲーション
上記の工程１．１のゲル回収によって得られた発現ベクター骨格ｐＺＤＶａｃ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌ（約１２ｋｂ）を工程１．２のゲル回収によって得られた第１の標的遺伝子断片ＣＲＳＮＰ（約３．６ｋｂ）に連結し、ライゲーション産物を一晩１６℃で得た。本システムを表２に示した。
Figure 2023550004000004
１．３．２．陽性クローンのスクリーニング
１００μＬの安定なコンピテントセルを氷浴に入れた。コンピテントセルを解凍した後、上記の工程１．３．１で得られた１０μＬのライゲーション産物をコンピテントセル懸濁液に加え、軽く混合し、３０分間氷浴に入れ、次いで、４２℃の水浴に直ちに移して９０秒間のヒートショックを行い、次いで、氷浴にすばやく２分間移した。抗生物質を含まない５００μＬの無菌のＬＢ培地を形質転換細胞に加え、均等に混合し、次いで、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、５００μＬの上清を捨てた。１００μＬの形質転換細胞を採取し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に均等に広げ、反転させたペトリ皿中にて３７℃で４８時間培養した。
単一コロニーを選び取り、コロニーＰＣＲによって陽性クローンをスクリーニングした。上流プライマーＦ及び下流プライマーＲをＰＣＲ増幅用に設計した（プライマー配列は、Beijing Biomedによって合成された）：
上流プライマーＦ：ＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＡＴＴ（配列番号１４）；
下流プライマーＲ：ＡＡＧＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１５）。
ＰＣＲシステム（２５μＬ）は以下の通りとした：１２．５μＬの２×ＰＣＲミックス（Beijing Biomedから購入した）；１１．５μＬのｄｄＨ２Ｏ；０．５μＬのＦ（１０μＭ）及び０．５μＬのＲ（１０μＭ）。ライゲーション産物が形質転換されたコロニーのＰＣＲ増幅のためのＰＣＲ反応条件は、９５℃５分間、１サイクル；９４℃３０秒、５５℃３０秒、及び７２℃５０秒、３５サイクル；並びに７２℃７分間とした。０．４５％アガロースＤＮＡゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を解析し、結果を図６に示し、レーン１～レーン５は異なる単一コロニーのＰＣＲの結果であった。
１．３．３．プラスミド抽出及び陽性クローンの制限酵素消化による同定
コロニーＰＣＲによってスクリーニングした陽性コロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に画線し、反転させたペトリ皿中にて３７℃で一晩培養した。次いで、単一クローンを選び取り、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む１．５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養し、次いで、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＬＢ培地に得られた菌液を１：５０の比で接種し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。無菌環境で、１２ｍＬの菌液を採取し、１．２ｍＬの菌液＋０．６ｍＬの６０％グリセロールの比に基づいて、グリセロール細菌に調製した。残りの菌液を遠心分離して、プラスミドを抽出し、これを、それぞれＡｃｌＩ及びＸｂａＩを用いた単一消化及び二重消化によって同定した。単一消化システム及び二重消化システムを以下の表３及び表４に示す。
Figure 2023550004000005
Figure 2023550004000006
上記の表３又は表４の酵素消化システムに従って試料を混合し、短時間遠心分離して、試料及び酵素（複数の場合もある）をチューブの底部に沈ませた。この遠心チューブを３７℃の水浴に入れ、２時間インキュベートした。期待されるサイズのバンドを０．４５％アガロースゲル電気泳動で同定し、同定の結果を図７に示し、レーン１～レーン３は、それぞれ、図６のコロニーＰＣＲによってスクリーニングされた陽性クローン１、２、及び４由来のプラスミドの結果であり、レーン４～レーン６は、それぞれ、陽性クローン１、２、及び４由来のプラスミドのＡｃｌＩ単一消化の結果であり、レーン７～レーン９は、それぞれ、陽性クローン１、２、及び４由来のプラスミドのＸｂａＩ単一消化の結果であり、レーン１０～レーン１２は、それぞれ、陽性クローン１、２及び４由来のプラスミドのＡｃｌＩ及びＸｂａＩ二重消化の結果であり、これらは、約１２ｋｂのサイズのバンド及び約３．６ｋｂのサイズのバンドを含み、これにより、組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ、すなわち、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンが構築されたことが証明された。
本実施例では、第２の標的遺伝子（ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＮＰ）を保有する組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＮＰ（空ベクターｐＺＤＶａｃが骨格ベクターとして使用され、対照プラスミド１と命名した）及び第３の標的遺伝子（フォルドン－ＣＰＰＣＰ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＣＴＢ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ）を保有する組換えプラスミドｐＺＤＶａｃ－フォルドン－ＣＰＰＣＰ－ＴＴ－ＰＡＲＤＥ－Ｇ６－ＲＢＤ－（Ｇ４Ｓ）２－Ｓ２－ＣＴＢ－フューリン２Ａ－ＥＲＩＳＳ－ＮＰ－ＩＲＥＳ－ＯＸ４０Ｌ（対照プラスミド２と命名した）を工程１．３の方法と同様の方法で構築した。
実施例２：マウスモデルにおけるｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドによって誘導される免疫原性
本実施例では、上記の実施例１で構築され、得られたｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを使用して、マウスモデルで誘導されるその免疫原性効果を検証した。これは、以下の工程を特に含む。
２．１．２０匹の６週齢～８週齢のＳＰＦ雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.から購入した）を各群に５匹のマウスで４群に無作為に分け、筋肉内注射＋電気パルス刺激によって３回免疫化し、免疫化の間隔は７日とした。実験群及び用量を表５に示す。
Figure 2023550004000007
２．２．最後の免疫化から２週間後にマウスを屠殺し、脾臓リンパ球を単離した。新型コロナウイルスのＮタンパク質及びＲＢＤタンパク質で刺激しながら２０時間培養した後、MabTechのマウスＩＦＮ－γ及びＩＬ－４ ＥＬＩＳＰＯＴプレートの説明書に従って免疫学的検出を行った。異なるタンパク質刺激物質下でのサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－４の分泌頻度検出の統計的結果をそれぞれ図８及び図９に示した（ｐ＜０．０５は統計的に有意である）。抗原特異的Ｔ細胞免疫応答バイアスの統計的結果を図１０に示した。
図８～図１０に示す結果は、異なる用量のｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドが、免疫化後のマウスでＮ抗原及びＲＢＤ抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができ、Ｔｈ１タイプ応答を示すＩＦＮ－γだけでなく、Ｔｈ２タイプ応答を示すＩＬ－４も分泌することができ、Ｔｈ１タイプサイトカインＩＦＮ－γの分泌頻度がＴｈ２タイプサイトカインＩＬ－４のものよりも有意に高いことを示した。この結果は、ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドによって誘導されるＴ細胞免疫応答がＴｈ１にバイアスされており、０．３μｇ群及び１０μｇ群と比較して、１μｇが最適な免疫用量であることを示した。
上記の工程２．１及び工程２．２で示したものと同じ方法に従って、対照プラスミド１及び対照プラスミド２による６週齢～８週齢のＳＰＦ雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化によって誘導される免疫原性をそれぞれ検出した。結果は、対照プラスミド１及び対照プラスミド２によって誘導される免疫原性効果が、ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドによって誘導されるものほど良好でないことを示した。
実施例３：ヒトにおけるｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドの免疫原性の検出
本実施例では、実施例１で構築され、得られたｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを使用してヒト対象を免疫化し、人体で誘導される免疫原性効果を検証した。これは、以下の工程を含む。
３．１．選択された１５人の志願者（治験に参加するための志願者に署名した、志願者ユニット（applicant unit）の内部職員）を各群に５人で３群に無作為に分けた。免疫化の間隔は２８日とし、免疫化は３回行った。１回目の免疫化の前、２回目の免疫化から１４日後及び３回目の免疫化から２１日後に、ＥＬＩＳＰＯＴ検出のために、志願者からＰＢＭＣを採取した。最初の２回の免疫化は筋肉内注射＋電気パルス刺激とし、３回目の免疫化は皮内注射＋電気パルス刺激とした。実験群及び用量を以下の表６に示す。
Figure 2023550004000008
３．２．志願者から得られた新鮮なＰＢＭＣを取り出し、新型コロナウイルスのＮタンパク質及びＲＢＤタンパク質を用いて２０時間にわたって刺激及び培養し、MabTech社のヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴプレートの説明書に従って免疫学的検出を行った。３回の免疫化後の異なるタンパク質刺激物質下でのサイトカインＩＦＮ－γの分泌頻度検出の統計的結果を図１１に示した（ｐ＜０．０５は統計的差異が有意であることを意味し、ｐ＜０．０１は統計的差異が非常に有意であることを意味する）。異なる用量を用いた３回の免疫化応答の統計的結果を図１２に示した（ｐ＜０．０５は統計的差異が有意であることを意味し、ｐ＜０．０１は統計的差異が非常に有意であることを意味する）。
図１１の結果は、免疫化前のものと比較して、２回目及び３回目の免疫化後に強い細胞性免疫応答を誘導することができ、ＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＦＮ－γの分泌頻度が、それぞれＮタンパク質及びＲＢＤタンパク質を刺激物質として使用した場合に非常に有意に増加し、３回目の免疫後のサイトカインＩＦＮ－γの分泌頻度が、刺激物質としてＮタンパク質を使用した場合に２回目の免疫後のものよりも高く、２回目の免疫後のサイトカインＩＦＮ－γの分泌頻度が、刺激物質としてＲＢＤタンパク質を使用した場合に３回目の免疫後のものよりも高いことを示した。図１２の結果は、異なる用量群のスポットの数が、免疫化前のものと比較して免疫化後に有意に増加し、これは、特異的な細胞性免疫が各用量で効果的に誘導され得ることを示している一方で、Ｎタンパク質及びＲＢＤタンパク質を刺激物質として使用した場合に、２回目の免疫化後の用量群の間でスポットの数に有意な差（ｐ＝０．０３４３、これは、低用量、中用量及び高用量の３つの用量群の間の分散解析の結果である）があることを示している。高用量群及び低用量群と比較して、中用量群の免疫効果はより良好であり、スポットの数は、３回目の免疫化後にそれほど増加しないことが分かった。したがって、ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを新しいコロナウイルスＤＮＡワクチンとして使用する場合、中用量での２回の免疫化（例えば、２回の免疫化の間は２８日）を使用することができる。
さらに、本実施例でスクリーニングした１５人の志願者に、ワクチン注射後に、定期的な経過観察及び身体検査（少なくとも３か月）を行い、全ての志願者は、いかなる不快感も示さず、これは、本発明によって提供されるｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドは、ワクチンとして使用する場合に良好な安全性プロファイルを有することを予備的に示す。
実施例４：ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドの免疫経路及び電気導入条件
本実施例では、実施例１で構築され、得られたｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを使用して、異なる免疫化経路（筋肉内注射又は皮内注射）を介して、及び異なる電気導入条件下でマウスを免疫化して、異なる免疫化経路を介して、及び異なる電気導入条件下で誘導される免疫応答の強度を評価した。これは、以下の工程を特に含む。
４．１．以下の表７に示す群に従って、４０匹の健康な６週齢～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Viton Leverから購入した）をそれぞれ各群に８匹のマウスで５群に無作為に分けた。それぞれ、筋肉内注射又は皮内注射＆電気導入（１Ｈｚ×６回、０．５ｃｍの電極針間隔）によるマウスの左後肢へのシングルポイント投与によって、各群のマウスを免疫化した。処理なしでブランク対照群を設定し、他の群のマウスに１μｇ／マウスのｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを与えた。投薬日を０日目と数え、それぞれ０日目及び２１日目に５群のマウスを２回免疫化した。
Figure 2023550004000009
４．２．抗体検出のために、最後の免疫化から２週間後に血清を採取した。具体的には、血清抗体（ＲＢＤ ＩｇＧ）検出のためのACRO Biosystemsの抗体検出キットを使用した。マウス血清を１：１００で希釈し、陽性の判断は、ＯＤ４５０ｎｍ＞０．１の吸光度値とした。最後の免疫化から２週間後に、各群のマウスを屠殺し、MabTechのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴプレートの説明書に従ってＥＬＩＳＰＯＴ検出（ＩＦＮ－γ）を行った。ＥＬＩＳＰＯＴ実験のスポット数の表し方は、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６脾細胞とした。実験用のウェルを陽性と判断するための判断基準は、実験用のウェルのスポットの数＞陰性対照ウェルの平均スポット値＋２ＳＤとした。各マウスの陽性スポットの数についての計算方法は、以下の通りであった：１匹のマウスの脾臓細胞について５つの複製ウェルを作り、少なくとも３ウェルが陽性である場合、このマウスのデータは妥当であると考えられ、このマウスのスポットの数＝実験用のウェルのスポットの平均数－陰性対照ウェルのスポットの数である。マウスの各群におけるスポットの数の計算方法は以下の通りであった：群のそれぞれの有効なマウスのデータを平均し、平均±標準偏差として表した。データの統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェアで行い、２つ群の間の差異はスチューデントのｔ検定で解析し、複数の群の間の差異は、一元配置分散分析で比較した。ｐ＜０．０５は差異が統計的に有意であることを意味し、ｐ＜０．０１は差異が非常に有意であることを意味する。
抗体検出の結果を図１３に示した。ｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドは、異なる経路（筋肉内注射及び皮内注射）を介するか又は異なる電気導入条件下でマウスを免疫化した後に抗体応答を誘導することができることが分かった。ブランク対照群と比較して、筋肉内注射群（６０Ｖ、５０ｍｓ、１Ｈｚ×６回、０．５ｃｍの電極針間隔及び１２０Ｖ／ｃｍの電界の強度）によって誘導された抗体レベルは、統計的に異なっており、皮内注射群ａ（６０Ｖ、５０ｍｓ、１Ｈｚ×６回、０．５ｃｍの電極針間隔、１２０Ｖ／ｃｍの電界の強度）によって誘導された抗体レベルもブランク対照群のものと統計学的に有意に異なっており、一方で、皮内注射群ｂ（３６Ｖ、５０ｍｓ）及び皮内注射群ｃ（３６Ｖ、１０ｍｓ）によって誘導された抗体レベルは、ブランク対照群と比較して統計的に有意な差はなかった。これらの結果は、筋肉内注射及び皮下注射の条件下では、３６Ｖの電圧及び５０ｍｓのパルス幅を用いる電気導入条件と比較して、電気導入条件が６０Ｖの電圧、５０ｍｓのパルス幅である場合に比較的より良好な免疫効果を有することを示した。さらに、同じ電気導入条件下で、皮内注射群ａによって誘導された抗体レベルは、筋肉内注射群のものと統計的に異なっていなかったが、一般に、筋肉内注射経路を介したｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドによる免疫化は、比較的より良好な体液性免疫効果を有していた。
ＥＬＩＳＰＯＴ試験の結果を図１４に示した。ｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドは、異なる経路（筋肉内注射及び皮内注射）で、及び異なる電気導入条件下でマウスを免疫化した後に、Ｎ抗原、ＲＢＤ抗原及びＳ２抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができることが分かった。実験群（筋肉内注射群、皮下注射群ａ、皮下注射群ｂ、皮下注射群ｃ）は全てブランク対照群と統計的に有意に異なっていた。その中で、様々な電気導入条件下の皮内注射による免疫化によって誘導されるＮ抗原、ＲＢＤ抗原及びＳ２抗原特異的Ｔ細胞免疫応答が、筋肉内注射による免疫化によるものと異なっていた。
要約すれば、結果は、本発明によって提供されるｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドワクチンが、異なる免疫化経路を介して、及び異なる電気導入条件下で刺激を受けたマウスにおいて、強い特異的なＴ細胞免疫応答を誘導することができ、筋肉内注射群と皮内注射群の間で誘導される細胞性免疫応答に有意な差がないことを示した。提供されるｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドワクチンは、電圧６０Ｖ及びパルス幅５０ｍｓの条件下で液性免疫応答を誘導するという点から、比較的より良好な誘導効果を有しており、一般に、筋肉内に投与されるワクチンは、比較的より良好な液性免疫応答をもたらした。したがって、本発明によって提供されるｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドは、ワクチンとして使用する場合に良好な細胞性免疫応答及び液性免疫応答を誘導することができ、かつワクチン接種の良好な保護効果を発揮することができ、これは、上記の実施例２及び実施例３の結果と矛盾がない。
実施例５：免疫攻撃試験
本実施例では、上記の実施例４のワクチン免疫化方法（筋肉内注射又は皮下注射＆電気導入（６０Ｖ、５０ｍｓ、１Ｈｚ×６回、０．５ｃｍの電極針間隔、１２０Ｖ／ｃｍの電界の強度））に従って、ｐＳＦＶＫ１－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミドを使用してｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス又はアカゲザルを免疫化し、陰性対照群を設定し、これに生理食塩水を与えた。投薬日を０日目と数え、各群の動物をそれぞれ０日目及び２１日目に２回免疫化し、最後の免疫化から２週間後に、各群の動物を攻撃感染した（新型コロナウイルスの液体）。各群の動物における肺のウイルス負荷及び肺の病的状態の低減を研究し、肺のウイルス負荷の低減（２ｌｏｇ以上）及び肺の病態の改善は、有効性評価の基本的な要件であった。結果は、陰性対照群の動物が、攻撃感染後に、新型コロナウイルス感染症の典型的な臨床症状（例えば、発熱、嗜眠、体重減少、及び更には死亡）を示したが、その一方で、免疫化群の動物の少なくとも４／５は保護され、新型コロナウイルス感染症の典型的な臨床症状のいずれも示さず、肺のウイルス負荷が低減し（２ｌｏｇ以上）、肺の病態が有意に改善することを示した。これらの結果は、本発明によって提供される組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンＺＤ－ｎＣｏｒ１９が有効性及び安全性を有することを示す。
要約すれば、上記の実施例の結果は、本発明によって構築され、得られた組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン（すなわち、ｐＺＤＶａｃ－ＣＲＳＮＰＯ組換えプラスミド）が、自然免疫応答及び抗原特異的細胞性免疫応答を含めて、動物レベルの免疫学的機能試験において高効率免疫応答を効果的に誘導することができることを示し、このことにより、本ワクチンが、大きな発展可能性がある新しいタイプのコロナウイルスＤＮＡワクチンであることが証明される。本ワクチンを使用してヒト対象を免疫化した後に、３つの用量群（１００μｇ、３００μｇ、５００μｇ）全てで高レベルの自然免疫応答及び抗原特異的細胞性免疫応答を誘導することができること、並びに３００μｇの用量群で最高レベルの免疫応答が誘導されることが見出された。試験に参加した全てのヒト対象は、定期的な経過観察及び身体検査の間、発熱、アレルギー、頭痛、全身の脱力感等のいかなる明白な有害反応もなかった。異なる免疫化経路を介して、及び異なる電気導入条件下で誘導される免疫応答の強度を比較することによって、本発明によって提供される組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンが、筋肉内注射及び皮下注射を介して接種することができ、両方とも良好な特異的なＴ細胞免疫応答及び液性免疫応答を誘導することができることが示される。免疫攻撃試験の結果は、本発明の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンが良好な安全性及び免疫保護効果を有することも示す。上記の結果は全て、本発明によって構築されるワクチンが、高レベルの免疫応答を誘導することができ、同時に、非常に穏やかで、安全なワクチンの一種であることを予備的に確証する。
本明細書に記載の例は、（一例としての）例示のみを目的とし、当業者によって行われる様々な改変又は変更も本特許出願の本質的な範囲内に含まれるべきである。
本発明は、融合遺伝子及び融合遺伝子に基づく組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン並びにそれらの構築方法及び使用を提供し、組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンは、産業用途に適した、新型コロナウイルス感染症を予防及び治療する二重効果を有する。

Claims (10)

  1. 以下の（１）～（４）の少なくとも２つを含む融合遺伝子：
    （１）新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＲＢＤセグメントを発現する遺伝子；
    （２）前記新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＳ２サブユニット又はその部分的断片を発現する遺伝子；
    （３）前記新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のＮタンパク質又はその部分的断片を発現する遺伝子；
    （４）ＣＴＢ、ＴＴ、ＰＡＤＲＥ、フォルドン、ＣＰＰＣＰ、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ、ＩＲＥＳ、及びＯＸ４０Ｌからなる群から選択されるアミノ酸断片、又はこれらの組み合わせを発現する遺伝子。
  2. 以下の（１）～（４）の少なくとも３つを含む、請求項１に記載の融合遺伝子：
    （１）前記新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９の前記ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子；
    （２）前記新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９の前記Ｓ２サブユニットの残基３０１～５３８を発現する遺伝子；
    （３）前記新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９の前記Ｎタンパク質の残基１３８～３６９を発現する遺伝子；
    （４）以下のアミノ酸断片：ＣＴＢ、ＴＴ、ＰＡＤＲＥ、フォルドン、ＣＰＰＣＰ、フューリン２Ａ、ＥＲＩＳＳ、ＩＲＥＳ及びＯＸ４０Ｌを発現する遺伝子。
  3. 前記ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子と前記Ｓ２サブユニットの前記残基３０１～５３８を発現する遺伝子が連結されて、融合断片を形成し、
    好ましくは、前記融合断片のヌクレオチド配列が配列番号６に記載される配列を含み、前記Ｎタンパク質の前記残基１３８～３６９を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１０に記載される配列を含む、請求項２に記載の融合遺伝子。
  4. （１）前記ＣＴＢアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号２に記載されており、
    （２）前記ＴＴアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号３に記載されており、
    （３）前記ＰＡＤＲＥアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号４に記載されており、
    （４）前記フォルドンアミノ酸断片を発現する遺伝子と前記ＣＰＰＣＰアミノ酸断片を発現する遺伝子が連結されて、合成断片を形成し、前記合成断片のヌクレオチド配列が配列番号７に記載されており、
    （５）前記フューリン２Ａアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号８に記載されており、
    （６）前記ＥＲＩＳＳアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号９に記載されており、
    （７）前記ＩＲＥＳアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１１に記載されており、及び／又は、
    （８）前記ＯＸ４０Ｌアミノ酸断片を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１２に記載されている、
    請求項１～３いずれか一項に記載の融合遺伝子。
  5. 前記ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子と前記Ｓ２サブユニットの前記残基３０１～５３８を発現する遺伝子が連結されて、融合断片を形成し、前記融合断片の上流がＣＴＢ、ＴＴ及びＰＡＤＲＥの前記アミノ酸断片を発現する遺伝子と順次連結され、前記融合断片の下流がフォルドン、ＣＰＰＣＰ及びフューリン２Ａのアミノ酸断片を発現する遺伝子と順次連結されており、及び／又は、
    前記ＥＲＩＳＳアミノ酸断片を発現する遺伝子が、前記Ｎタンパク質の前記残基１３８～３６９を発現する遺伝子の上流に連結され、前記ＩＲＥＳ及びＯＸ４０Ｌアミノ酸断片を発現する遺伝子が、前記Ｎタンパク質の前記残基１３８～３６９を発現する遺伝子の下流に順次連結されており、
    好ましくは、前記ＲＢＤセグメントを発現する遺伝子と前記Ｓ２サブユニットの前記残基３０１～５３８を発現する遺伝子が（Ｇ４Ｓ）２リンカーを発現する遺伝子によって連結され、前記融合断片の上流と前記ＰＡＤＲＥアミノ酸断片を発現する遺伝子がリンカーＧ６を発現する遺伝子によって連結され、前記リンカーＧ６を発現する遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号５に記載されており、
    更に好ましくは、前記融合遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１３に記載されている、
    請求項２～４のいずれか一項に記載の融合遺伝子。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合遺伝子の発現から得られる融合タンパク質。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合遺伝子、及びベクターを含む、ＺＤ－ｎＣｏｒ１９と命名した組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン。
  8. 前記ベクターがｐＺＤＶａｃベクターである、請求項７に記載の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン。
  9. 請求項７又は８に記載の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを構築する方法であって、
    １）請求項１～５のいずれか一項に記載の融合遺伝子を合成する工程と、
    ２）前記融合遺伝子をｐＺＤＶａｃベクターに挿入して、前記組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチンを得る工程と、
    を含む、方法。
  10. 新型コロナウイルス感染症を予防及び／又は治療するための医薬の調製において使用される、請求項７又は８に記載の組換え新型コロナウイルス高効率免疫ＤＮＡワクチン。
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