TW201809274A

TW201809274A - 蛋白質表現強化子序列及其用途

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Publication number: TW201809274A
Application number: TW106125715A
Authority: TW
Inventors: 彼得 M 勞爾; 威廉 G 韓森
Original assignee: 美商艾杜諾生物科技公司
Priority date: 2016-08-01
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2018-03-16
Also published as: EP3491009A1; US20180030457A1; US10526609B2; EP3491009A4; CN109890834A; WO2018026717A1

Abstract

本發明提供強化宿主細胞且尤其細菌物種對融合蛋白之表現的核酸及蛋白質序列，以及其使用方法。雖然在下文中係根據單核球增多性李氏菌對融合蛋白之表現進行描述，但本發明可通用於融合蛋白之表現。

Description

蛋白質表現強化子序列及其用途

本申請案主張2016年8月1日申請之美國臨時專利申請案62/369,663及2016年8月10日申請之美國臨時專利申請案62/373,297的優先權，各專利申請案特此以全文併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。

本發明之背景之以下論述僅為幫助讀者理解本發明而提供，且不承認其描述或構成本發明之先前技術。

根據定義，病原性生物能夠在受感染宿主中引起疾病。為在臨床上使用此類生物體，常常創造減毒疫苗菌株，雖然該等菌株毒力減小或消除，但其仍然保持足以刺激針對相關病原體或異種抗原之所需免疫反應的活力。在包括感染性疾病及惡性疾病在內之許多實驗模型中已證實減毒載體平台引起對編碼之異種抗原具有特異性的保護性反應。

雖然大部分減毒疫苗載體係病毒性的，但已研發細菌疫苗載體平台，用於預防與治療應用。現可獲得許多另外病原性細菌之減毒菌株，且容易對產生重組菌株進行操控提供一種使用細菌作為許多外源蛋白(諸如與感染性疾病及癌症相關之抗原)之有效遞送媒劑的方式。已尤其自李氏菌屬(Listeria)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及耶氏桿菌屬(Yersinia)產生活的減毒細菌疫苗菌株。

調節異種抗原表現之水準可對疫苗之免疫原性具有重要影響。在細菌疫苗載體中，編碼疫苗抗原之異種基因可整合至細菌染色體中或者自質體表現。染色體整合允許最大遺傳穩定性。然而，染色體整合通常每種細菌產生單複本異種抗原，且確保表現足夠抗原以賦予保護性免疫具有挑戰性。在基於質體之表現中，質體之自發損失可產生質體較少之細菌，快速生長超過帶有質體之細菌且變成組織中之主要群體。

本領域中仍然需要提供可提供具有異種抗原之有利表現水準之細菌疫苗菌株以用於治療或預防疾病的系統及方法。

本發明提供強化宿主細胞且尤其細菌物種對融合蛋白之表現的核酸及蛋白質序列，以及其使用方法。雖然下文係根據單核球增多性李氏菌對融合蛋白之表現進行描述，但本發明可通用於融合蛋白之表現。

在第一態樣中，本發明係關於融合蛋白、編碼融合蛋白之核酸分子及自核酸分子表現融合蛋白之方法，其中融合蛋白具有以下結構：A-(B)n-C或A-C-(B)n，其中：A為包含分泌信號序列之胺基酸序列的第一多肽序列；各B獨立地為第二多肽，該第二多肽之序列包含ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)或PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列；及C為包含相關多肽之胺基酸序列，諸如抗原序列之第三多肽序列；且n為介於1與10之間，且較佳介於2與5之間的數值。

在第一態樣之一些實施例中，A用肽鍵連接至(B)n或C，且(B)n用肽鍵連接至C，或各連接獨立地為一或多個胺基酸。在一些實施例中，其中融合蛋白為A-(B)n-C，A之羧基末端用肽鍵或用一或多個胺基酸，例如1-100個、 1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接至(B)n之胺基末端，且(B)n之羧基末端用肽鍵或用一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接至C之胺基末端。在一些實施例中，其中融合蛋白為A-C-(B)n，A之羧基末端用肽鍵或用一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接至C之胺基末端，且C之羧基末端用肽鍵或用一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接至(B)n之胺基末端。

在第一態樣之一些實施例中，n為1、2、3、4或5，較佳為5，且各B進一步包含連接至各B之胺基末端及羧基末端每一者的獨立選擇之裂解胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37)。舉例而言，連接至第一B(B₁)之羧基末端(Cv)的裂解胺基酸序列與連接至第二B(B₂)之胺基末端(Cv’)的裂解序列連接，使得連接為-B₁-Cv-Cv’-B₂-等等。因此，舉例而言，其中n=3之(B)n可表示為Cv1-B1-Cv1’-Cv2-B2-Cv2’-Cv3-B3-Cv3’，其中Cv1、Cv2及Cv3分別表示經由羧基末端連接至B1、B2及B3之胺基末端的裂解胺基酸序列，且Cv1’、Cv2’及Cv3’分別表示經由胺基末端連接至B1、B2及B3之羧基末端的裂解胺基酸序列，其中例如Cv1’之羧基末端連接至Cv2之胺基末端。因此，當融合蛋白為A-(B)n-C時，Cv1之胺基末端連接至A之羧基末端，且Cvn’之羧基末端(n表示強化子序列B之數目，亦即B之羧基末端序列)連接至C之胺基末端，且當融合蛋白為A-C-(B)n時，Cv1之胺基末端連接至C之羧基末端，且Cvn'之羧基末端為融合蛋白之羧基末端，或可在融合蛋白之羧基末端包括額外一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、 1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸。各B1、B2...Bn獨立地為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列，且各Cv1、Cv1’、Cv2、Cv2’...Cvn、Cvn’獨立地選自由以下組成之群：ADGSVK(SEQ ID NO：2)、ASKVA(SEQ ID NO：3)、LSKVL(SEQ ID NO：4)、ASKVL(SEQ ID NO：5)、GDGSIK(SEQ ID NO：6)、ADGSV(SEQ ID NO：7)、LAKSL(SEQ ID NO：8)、ADLAVK(SEQ ID NO：9)、ASVVA(SEQ ID NO：10)、GIGSIA(SEQ ID NO：11)、GVEKI(SEQ ID NO：12)、NAANKG(SEQ ID NO：13)、DGSKKA(SEQ ID NO：14)、GDGNKK(SEQ ID NO：15)、KLSKVL(SEQ ID NO：75)及GDGNK(SEQ ID NO：76)。在一些實施例中，各Cv1、Cv1’、Cv2、Cv2’...Cvn、Cvn’獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6。在一些實施例中，各Cv1、Cv2...Cvn獨立地為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，且各Cv1’、Cv2’...Cvn’獨立地為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(n-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵或一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接至Cv2、Cv3...Cvn之各胺基末端。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(n-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵或1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至Cv2、Cv3...Cvn之各胺基末端。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(n-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵或1個、2個或3個胺基酸連接至Cv2、Cv3...Cvn之各胺基末端。在一較佳實施例中，各Cv1’、Cv2’...Cvn’之胺基末端分別用三個胺基酸序列GSC連接至B1、B2...Bn之羧基末端。在一些實施例中，各B1、B2...Bn為SEQ ID NO：1，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列。在一些實施例中，各B1、B2...Bn為SEQ ID NO：37，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列。在一些實施例中，除非另外指示，否則如本段落中所用，連接係用肽鍵，或用一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接。

在第一態樣之一些實施例中，第三多肽序列C包含超過一個獨立抗原序列。在一些實施例中，C包含一或多個獨立抗原序列，例如1-50個、1-25個、1-20個、1-19個、1-18個、1-17個、1-16個、1-15個、1-14個、1-13個、1-12個、1-11個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個獨立抗原序列。在一些實施例中，各C進一步包含連接至一或多個抗原序列每一者之胺基末端及羧基末端每一者的獨立選擇之裂解胺基酸序列。因此，舉例而言，在C包含3個抗原序列下，C可表示為Cv1-C1-Cv1’-Cv2-C2-Cv2’-Cv3-C3-Cv3’，其中Cv1、Cv2及Cv3分別表示經由羧基末端連接至C1、C2及C3之胺基末端的裂解胺基酸序列，且Cv1’、Cv2’及Cv3’分別表示經由胺基末端連接至C1、C2及C3之羧基末端的裂解胺基酸序列，其中例如Cv1’之羧基末端連接至Cv2之胺基末端。在一些實施例中，各Cv1、Cv1’、Cv2、Cv2’...Cvx、Cvx’(其中x表示抗原序列總數)獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。在一些實施例中，各Cv1、Cv1’、Cv2、Cv2’...Cvx、Cvx’獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。在一些實施例中，各Cv1、Cv2...Cvx獨立地為SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：75，且各Cv1’、Cv2’...Cvx’獨立地為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：76。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(x-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵，或一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至Cv2、Cv3...Cvx之各胺基末端。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(x-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至Cv2、Cv3...Cvx之各胺基末端。在一些實施例中，Cv1’、Cv2’...Cv(x-1)’之各羧基末端分別獨立地用肽鍵，或藉由1個、2個或3個胺基酸連接至Cv2、Cv3...Cvx之各胺基末端。在一些實施例中，C內之各抗原序列獨立地為10-1,000個、10-500個、10-400個、10-300個、10-200個、10-100個、10-90個、10-80個、10-70個、10-60個、10-50個、10-40個或10-30個胺基酸長。

在一些實施例中，融合蛋白A-(B)n-C或A-C-(B)n少於3,000個胺基酸、少於2,000個胺基酸、介於200個與3,000個胺基酸之間、介於200個與2,000個胺基酸之間、介於300個與2,000個胺基酸之間、介於300個與1,500個胺基酸之間或介於300個與1,000個胺基酸之間。

在本發明之第二態樣中，本發明係關於編碼融合蛋白之核酸分子，其中融合蛋白包含(i)第一胺基酸序列，該第一胺基酸序列包含強化子胺基酸序列之一或多個複本，各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)及PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列；及(ii)編碼相關多肽之第二胺基酸序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列連接至第一胺基酸序列之胺基或羧基末端。在一些實施例中，相關多肽包含一或多個獨立抗原序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解序列獨立地選擇且連接至一或多個獨立抗原序列中之至少一個。在一些實施例中，各獨立抗原序列在其胺基末端連接至獨立選擇之裂解序列且在其羧基末端連接至獨立選擇之裂解序列。在一些實施例中，強化子胺基酸序列之一或多個複本為SEQ ID NO：1之一或多個複本。在一些實施例中，強化子胺基酸序列之一或多個複本為SEQ ID NO：37之一或多個複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：1之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：37之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。在一較佳實施例中，第一胺基酸包含SEQ ID NO：1之5個複本或SEQ ID NO：37之5個複本，更佳SEQ ID NO：1之5個複本。

在第二態樣之一些實施例中，強化子胺基酸序列之一或多個複本為SEQ ID NO：1之一或多個複本。在一些實施例中，強化子胺基酸序列之一或多個複本為SEQ ID NO：37之一或多個複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含強化子胺基酸序列之1-5個複本、2-5個複本、3-5個複本、4-5個複本，較佳5個複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：1之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：37之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。在一較佳實施例中，第一胺基酸包含SEQ ID NO：1之5個複本或SEQ ID NO：37之5個複本，更佳SEQ ID NO：1之5個複本。

在第二態樣之一些實施例中，強化子胺基酸序列之各複本藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至強化子胺基酸序列之下一複本。在一些實施例中，第一胺基酸序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第二胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含同框分泌信號序列。在一些實施例中，該分泌信號序列之羧基末端連接至第一胺基酸序列之胺基末端，且第一胺基酸序列之羧基末端連接至第二胺基酸序列之胺基末端。在一些實施例中，該分泌信號序列之羧基末端連接至第二胺基酸序列之胺基末端，且第二胺基酸序列之羧基末端連接至第一胺基酸序列之胺基末端。在此等實施例中，分泌信號序列之羧基末端藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第一或第二胺基酸序列之胺基末端，且第一胺基酸序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第二胺基酸序列。在一些實施例中，分泌信號序列為單核球增多性李氏菌信號序列，在一些實施例中，為ActA信號序列。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含選自由以下組成之群的同框ActA信號序列：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28，或與該序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。

在第二態樣之某些實施例中，第一胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解序列獨立地選擇且連接至一或多個強化子胺基酸序列中之至少一個。在一些實施例中，各強化子胺基酸序列在其胺基末端連接至獨立選擇之裂解序列且在其羧基末端連接至獨立選擇之裂解序列。在一些實施例中，一或多個裂解序列各獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。在一些實施例中，一或多個裂解序列各獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6。在一些實施例中，各強化子序列之胺基末端連接至選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5組成之群的裂解序列之羧基末端，且各強化子序列之羧基末端連接至選自由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6組成之群的裂解序列之胺基末端。在一些實施例中，在本發明之融合蛋白內，強化子序列之胺基末端連接至SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之羧基末端，且強化子序列之羧基末端連接至SEQ ID NO：2之胺基末端；或強化子序列之胺基末端連接至SEQ ID NO：3之羧基末端，且強化子序列之羧基末端連接至SEQ ID NO：6之胺基末端。在一些實施例中，連接至強化子序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接。在一些實施例中，連接至強化子序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接。在一些實施例中，連接至強化子序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個或3個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由胺基末端連接至強化子序列之羧基末端的各裂解序列藉由羧基末端連接至鄰近裂解序列(亦即裂解序列藉由羧基末端連接至下一強化子序列)。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個或3個胺基酸連接。

在第二態樣之一些實施例中，第二胺基酸序列包含超過一個獨立抗原序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含一或多個獨立抗原序列，例如1-50個、1-25個、1-20個、1-19個、1-18個、1-17個、1-16個、1-15個、1-14個、1-13個、1-12個、1-11個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個獨立抗原序列。在一些實施例中，第二胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解序列獨立地選擇且連接至一或多個抗原序列中之至少一個。在一些實施例中，各一或多個獨立抗原序列在其胺基末端連接至獨立選擇之裂解序列且在其羧基末端連接至獨立選擇之裂解序列。在一些實施例中，一或多個裂解序列各獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。在一些實施例中，一或多個裂解序列各獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。在一些實施例中，各抗原序列之胺基末端連接至選自由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：14及SEQ ID NO：75組成之群的裂解序列之羧基末端，且各抗原序列之羧基末端連接至選自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：76組成之群的裂解序列之胺基末端。在一些實施例中，在本發明之融合蛋白內，抗原序列之胺基末端連接至SEQ ID NO：4之羧基末端且抗原序列之羧基末端連接至SEQ ID NO：7之胺基末端；或抗原序列之胺基末端連接至SEQ ID NO：14之羧基末端且抗原序列之羧基末端連接至SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：76之胺基末端；或抗原序列之胺基末端連接至SEQ ID NO：75之羧基末端且抗原序列之羧基末端連接至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：76之胺基末端。在一些實施例中，連接至抗原序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接。在一些實施例中，連接至抗原序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接。在一些實施例中，連接至抗原序列之各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個或3個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由胺基末端連接至抗原序列之羧基末端的各裂解序列藉由其羧基末端連接至鄰近裂解序列(亦即裂解序列藉由其羧基末端連接至下一抗原序列)。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接。在一些實施例中，藉由羧基末端連接至下一裂解序列之胺基末端的各裂解序列藉由肽鍵，或藉由1個、2個或3個胺基酸連接。在一些實施例中，第二胺基酸內之各抗原序列獨立地為10-1,000個、10-500個、10-400個、10-300個、10-200個、10-100個、10-90個、10-80個、10-70個、10-60個、10-50個、10-40個或10-30個胺基酸長。

在第二態樣之一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端連接至第一胺基酸之羧基末端，且第一胺基酸之羧基末端連接至第二胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第一胺基酸序列之羧基末端，且第一胺基酸之胺基末端藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100 個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第二胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至第一胺基酸之羧基末端，且第一胺基酸之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至第二胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個或3個胺基酸連接至第一胺基酸之羧基末端，且第一胺基酸之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個或3個胺基酸連接至第二胺基酸之羧基末端。

在第一態樣之一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端連接至第二胺基酸之羧基末端，且第二胺基酸之胺基末端連接至第一胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第二胺基酸序列之羧基末端，且第二胺基酸之胺基末端藉由肽鍵，或藉由一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸，連接至第一胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵，或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至第二胺基酸之羧基末端，且第二胺基酸之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個、3個、4個或5個胺基酸連接至第一胺基酸之羧基末端。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含分泌信號序列，其中分泌序列之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個或3個胺基酸連接至第二胺基酸之羧基末端，且第二胺基酸之胺基末端藉由肽鍵或藉由1個、2個或3個胺基酸連接至第一胺基酸之羧基末端。

在第二態樣之一些實施例中，融合蛋白少於3,000個胺基酸、少於2,000個胺基酸、介於200個與3,000個胺基酸之間、介於200個與2,000個胺基酸之間、介於300個與2,000個胺基酸之間、介於300個與1,500個胺基酸之間或介於300個與1,000個胺基酸之間。

在相關第三態樣中，本發明係關於自宿主細胞表現相關多肽之方法，該等方法包括：將包含編碼融合蛋白之核酸序列之表現構築體引入宿主細胞，其中融合蛋白如本發明之第一態樣及第二態樣中所述，包括其所有實施例。

在第三態樣之一些實施例中，融合蛋白包含(i)包含強化子胺基酸序列之一或多個複本的第一胺基酸序列，各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)及PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列，其中各複本視情況在各末端由包含如下所述之裂解胺基酸序列之胺基酸序列側接，及(ii)連接至第一胺基酸序列之胺基或羧基末端之相關第二胺基酸序列，其中融合蛋白可操作地連接至一或多個介導宿主細胞中融合蛋白之表現及視情況分泌的調控元件。

在又一相關態樣中，本發明係關於一種包含有包含本發明之核酸分子之宿主細胞的組合物，其中宿主細胞表現且視情況分泌融合蛋白。

在某些實施例中，此等核酸分子可包含一或多個介導宿主細胞中融合蛋白之表現的調控元件。此類核酸分子在本文中稱為「融合蛋白表現構築體」。術語「調控元件」意欲包括啟動子、強化子、內部核糖體進入位點(IRES) 及其他表現控制元件(例如轉錄終止信號，諸如聚腺苷酸化信號及聚U序列)。此類調控元件描述於例如Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。調控元件包括指導核苷酸序列在許多類型宿主細胞中組成性表現之元件及指導核苷酸序列僅僅在某些宿主細胞中表現之元件(例如組織特異性序列)。組織特異性啟動子可指導主要在所需相關組織中，諸如肌肉、神經元、骨、皮膚、血液、特定器官(例如肝、胰臟)或特定細胞類型(例如淋巴細胞)中之表現。調控元件亦包括可誘導之元件。

僅僅舉例而言，在李氏菌屬之actA啟動子下之基因表現視稱為PrfA之用於轉譯活化之調控因子而定。相對於培養液生長之李氏菌屬，在actA/PrfA調控下之基因表現經誘導大約為李氏菌屬存在於宿主細胞中時200倍。因此，在某些實施例中，調控序列包含PrfA依賴性單核球增多性李氏菌啟動子。PrfA依賴性啟動子可選自由以下組成之群：inlA啟動子、inlB啟動子、inlC啟動子、hpt啟動子、hly啟動子、plcA啟動子、mpl啟動子及actA啟動子。以下描述誘導其他細菌物種之宿主生物體中基因表現之類似系統。

如上所述，本發明之核酸分子包含第一胺基酸序列，該第一胺基酸序列包含強化子胺基酸序列之一或多個複本，其中各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)及PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列。在多個實施例中，第一胺基酸序列包含呈單個相鄰陣列排列之強化子胺基酸序列之2個、3個、4個、5個或更多個複本，且編碼相關多肽之第二胺基酸序列在第一胺基酸序列之前或之後連接。

在多個實施例中，第一胺基酸序列為ASKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVK(SEQ ID NO：31)；或第一胺基酸序列為ASKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVK(SEQ ID NO：29)；或第一胺基酸序列為ASKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVKTSASKVAESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCGDGSIK(SEQ ID NO：69)；或第一胺基酸序列為ASKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVKTSASKVAPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCGDGSIK(SEQ ID NO：70)；或第一胺基酸序列為ASKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVKTSASKVAESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCGDGSIKLSKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVK(SEQ ID NO：71)；或第一胺基酸序列為ASKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVKTSASKVAPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCGDGSIKLSKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVK(SEQ ID NO：72)；或第一胺基酸序列為ASKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVKTSASKVAESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCGDGSIKLSKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCADGSVKASKVAESNQSVEDKHNEFMLTEYGSCGDGSIK(SEQ ID NO：73)；或第一胺基酸序列為ASKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVKTSASKVAPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCGDGSIKLSKVLPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCADGSVKASKVAPASRAVDDHHAQFLLSEKGSCGDGSIK(SEQ ID NO：74)；或第一胺基酸序列為SEQ ID NO：35；或第一胺基酸序列為SEQ ID NO：33。在一個實施例中，第一胺基酸序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：33。在一個實施例中，第一胺基酸為SEQ ID NO：35。

在本發明之第四態樣中，提供具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內具有1-5個保守胺基酸取代之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，提供具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內具有1-3個保守胺基酸取代之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，多肽具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列。

在本發明之第五態樣中，提供一種多肽，其中多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內具有1-5個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內包含1-3個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽為融合蛋白，該融合蛋白包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內具有1-5個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列或在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37內包含1-3個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。

在第六態樣中，提供一種宿主細胞，其中宿主細胞包含本發明之核酸分子，亦即編碼如本文中描述之融合蛋白之核酸分子，且其中宿主細胞表現融合蛋白。在一些實施例中，宿主細胞表現且分泌融合蛋白。在一些實施例中，核酸分子整合至宿主細胞之基因組中。在一些實施例中，宿主細胞為細菌。在一些實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌。在一些實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌且核酸分子整合至單核球增多性李氏菌之致病性基因中，其中該核酸分子之整合破壞致病性基因之表現或破壞致病性基因之編碼序列。在一些實施例中，致病性基因為actA或inlB。

在第七態樣中，提供一種自宿主細胞表現相關多肽之方法，該方法包括：將包含本發明之核酸分子(亦即編碼如本文中描述之融合蛋白之核酸分子)之表現構築體引入宿主細胞，其中融合蛋白可操作地連接至一或多個介導宿主細胞中融合蛋白之表現及視情況分泌的調控元件。在一些實施例中，核酸分子整合至宿主細胞之基因組中。在一些實施例中，宿主細胞為細菌。在一些實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌。在一些實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌且核酸分子整合至單核球增多性李氏菌之致病性基因中，其中該核酸分子之整合破壞致病性基因之表現或破壞致病性基因之編碼序列。在一些實施例中，致病性基因為actA或inlB。

已開發許多細菌物種用作疫苗，或用作癌症免疫治療劑，且本發明之核酸分子可用於融合蛋白在此類物種中之表現。舉例而言，較佳細菌種類係選自由以下成之群：李氏菌屬、埃希氏桿菌屬、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、分枝桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、桿菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、耶氏桿菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團菌屬(Legionella)、立克次氏體屬(Rickettsia)及衣原體屬(Chlamydia)。此清單不意謂限制性的。最佳地，細菌為兼性胞內細菌，諸如李氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、分枝桿菌屬、軍團菌屬、伯克霍爾德菌屬及布魯氏桿菌屬。在以下描述之某些示例性實施例中，細菌為單核球增多性李氏菌，例如經修飾之單核球增多性李氏菌△actA/△inlB(其中天然actA及 inlB基因已缺失或藉由突變而在功能上缺失之單核球增多性李氏菌)。此清單不意謂限制性的。參見例如WO04/006837；WO04/084936；WO04/110481；WO05/037233；WO05/092372；WO06/036550；WO07/103225；WO07/117371；WO08/109155；WO08/130551；WO08/140812；WO09/143085；WO09/143167；WO10/040135；WO11/060260；及WO14/074635，其各自特此以全文引用的方式併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。細菌物種可為兼性胞內細菌載體。細菌可用於遞送作為融合蛋白之一部分的相關多肽(例如抗原)，以在治療上或預防上用作例如疫苗或用作癌症免疫治療劑。細菌可用於在宿主生物體中將此類相關多肽遞送至抗原呈遞細胞。

在多個實施例中，本發明之核酸分子可在載體上提供至宿主細胞。一般而言，且貫穿本說明書，術語「載體」係指能夠輸送與其連接之另一核酸的核酸分子。載體包括(但不限於)單股、雙股或部分雙股之核酸分子；包含一或多個自由端、無自由端(例如環狀)之核酸分子；包含DNA、RNA或兩者之核酸分子；及本領域中已知之其他多種聚核苷酸。一種類型載體為「質體」，其係指額外DNA區段可諸如藉由標準分子選殖技術插入其中之環狀雙股DNA環。另一種類型載體為病毒載體，其中病毒衍生之DNA或RNA序列存在於載體中以包裝成病毒(例如反轉錄病毒、複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒、複製缺陷型腺病毒及腺病毒相關病毒)。病毒載體亦包括藉由病毒運載以轉染至宿主細胞之聚核苷酸。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。

或者，本發明之核酸分子可在引入宿主細胞後整合至宿主細胞之基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此類核酸分子可整合至細菌之致病性基因中，且該核酸序列之整合破壞致病性基因之表現或破壞致病性基因之編碼序列。僅僅舉例而言，此類致病性基因可為單核球增多性李氏菌actA或inlB。

在某些實施例中，本發明之核酸分子表現為包含同框分泌信號序列之融合蛋白，從而使得融合蛋白由細菌分泌成一或多種可溶多肽。本領域中已知許多示例性信號序列用於細菌、哺乳動物及植物表現系統中。在細菌為單核球增多性李氏菌之情況下，分泌信號序列較佳為單核球增多性李氏菌信號序列，最佳為ActA信號序列。額外ActA或其他連接胺基酸亦可與免疫原性多肽融合表現。在較佳實施例中，本發明之融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28組成之群的同框ActA信號序列或與該序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。

在較佳實施例中，本發明提供一種編碼融合蛋白之核酸序列，該融合蛋白包含：(a)選自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28組成之群的ActA信號序列或與該序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；(b)第一胺基酸序列，其包含(i)複數個(2個、3個、4個、5個或更多個複本)蛋白質表現強化子胺基酸序列，該等強化子胺基酸序列獨立地為ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)或PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列；及(ii)側接各蛋白質表現強化子胺基酸序列之連接胺基酸序列，其中各連接胺基酸序列獨立地選擇且配置以進行蛋白酶體裂解；及(c)相關多肽序列，諸如編碼抗原序列之多肽序列，且最佳包含一或多種腫瘤抗原或感染性疾病抗原；其中融合蛋白自可操作地連接至單核球增多性李氏菌ActA啟動子之核酸序列表現。

在某些實施例中，編碼抗原多肽之核酸序列針對由細菌(例如單核球增多性李氏菌)表現進行密碼子優化。如以下描述，不同生物體經常顯示「密碼子偏好」；亦即，編碼特定胺基酸之既定密碼子出現在遺傳密碼中之程度在生物體之間顯著不同。一般而言，基因含有之密碼子愈稀少，異源蛋白在特定宿主系統內以合理水準表現之可能性愈低。若稀少密碼子成簇出現或在蛋白質之N胺基部分中出現，則此等水準變得更低。在不修飾胺基酸序列下用更緊密地反映宿主系統之密碼子偏好的密碼子置換稀少密碼子可增加功能蛋白表現的水準。以下描述用於密碼子優化之方法。

在一些實施例中，相關多肽序列，諸如編碼如本文中描述之抗原序列之多肽序列，包含一或多個獨立抗原序列。術語「獨立抗原序列」係指包含抗原決定基(例如預測T細胞抗原決定基)且與較長多肽中存在之其他多肽序列的序列不同的多肽序列。僅僅舉例而言，相關多肽序列可包含50個獨立抗原序列、25個獨立抗原序列、20個獨立抗原序列、19個獨立抗原序列、18個獨立抗原序列、17個獨立抗原序列、16個獨立抗原序列、15個獨立抗原序列、14個獨立抗原序列、13個獨立抗原序列、12個獨立抗原序列、11個獨立抗原序列、10個獨立抗原序列、9個獨立抗原序列、8個獨立抗原序列、7個獨立抗原序列、6個獨立抗原序列、5個獨立抗原序列、4個獨立抗原序列、3個獨立抗原序列、2個獨立抗原序列或1個抗原序列。在一些實施例中，一或多個獨立抗原序列包含一或多個新抗原序列。在一些實施例中，一或多個新抗原序列為由罹患癌症之個體中之一或多個腫瘤細胞表現的一或多個新抗原序列。在一些實施例中，一或多個新抗原序列由罹患結腸直腸癌之個體中之一或多個結腸直腸癌細胞表現。

在一個態樣中，本發明之核酸序列，亦即編碼如本文中描述之融合蛋白之核酸序列，用於基於個人化之減毒、雙重缺失之活單核球增多性李氏菌(pLADD)的免疫療法中。在此態樣之一個實施例中，單核球增多性李氏菌為包含編碼融合蛋白之核酸序列之△actA/△inlB菌株，其包含如本文中描述之相關多肽。在一些實施例中，向患有癌症之個體投與pLADD，其中相關多肽包含由個體中一或多個腫瘤細胞表現之一或多個腫瘤相關抗原。在一些實施例中，個體患有結腸直腸癌。

應瞭解本發明之應用不限於在以下描述中闡述或圖式中說明之建構細節及組分佈置。本發明能夠執行除所述實施例之外的實施例且以多種方式實踐及進行。亦應瞭解本文中採用之短語及術語以及摘要係用於達成描述之目的且不應視為限制。

因而，本領域技術人員將瞭解，本發明所基於之概念容易用作設計達成本發明之若干目的之其他結構、方法及系統的基礎。因此重要地，只要不脫離本發明之精神及範疇，認為申請專利範圍包括此類同等建構。

圖1示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH4703、BH5144、BH5150及BH5337之融合蛋白構築體。

圖2描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH4703、BH5144、BH5150及BH5337之融合蛋白表現的胞內西方墨點法結果。

圖3描繪單核球增多性李氏菌菌株BH4203、BH4215、BH5128、BH5132及BH5333之融合蛋白表現的胞內西方墨點法結果。

圖4示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH5624、BH5626、BH5628、BH5630及BH5144之融合蛋白構築體。

圖5描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH5624、BH5626、BH5628、BH5630及BH5144之融合蛋白表現的胞內西方墨點法結果。

圖6示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH5632、BH5634、BH5636、BH5843及BH5337之融合蛋白構築體。

圖7描繪單核球增多性李氏菌菌株BH2869、BH5632、BH5634、BH5636、BH5843及BH5337之融合蛋白表現的胞內西方墨點法結果。

圖8示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株BH5687、BH4017、BH5689、BH5691、BH5693及BH5695之融合蛋白構築體。

圖9示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株BH5687、BH4017、BH5689、BH5691、BH5693及BH5695之融合蛋白表現之胞內西方墨點法結果。

圖10描繪PAP特異性CD8+ T細胞在用BH2869(僅僅ActAN100-PAP)、BH4703(ActAN100*-EGFRvIII-PAP)、BH5144(ActAN100*-Syn1-PAP)及BH5337(ActAN100*-Syn18-PAP)免疫接種後之ELISPOT細胞介素染色結果。

圖11描繪HBV-Pol特異性CD8+ T細胞在用BH5687(ActAN100*-HBV Pol_1-300-HBxAg)、BH5689(ActAN100*-syn1x1- HBVPol_1-300-HBxAg)、BH5691(ActAN100*-syn1x5-HBV Pol_1-300-HBxAg)、BH5693(ActAN100*-syn18x1- HBV Pol_1-300-HBxAg)及BH5695(ActAN100*-syn18x5-HBV Pol_1-300-HBxAg)免疫接種後之ELISPOT細胞介素染色結果。

圖12示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株CR782、CR784、CR789及CR794之融合蛋白構築體。

圖13描繪單核球增多性李氏菌菌株CR782、CR784、CR789及CR794之融合蛋白表現的胞內西方墨點法結果。

圖14示意性描繪單核球增多性李氏菌菌株CRS-207、CR876、CR866、CR788、CR791及CR796之融合蛋白構築體。

圖15描繪單核球增多性李氏菌菌株CRS-207、CR876、CR866、CR788、CR791及CR796之融合蛋白表現的肉汁培養西方墨點法結果。

圖16示意性描繪表現6xHis標記之FopC、與SUMO融合之6xHis標記之FopC及與syn18x5融合之6xHis標記之FopC的大腸桿菌菌株之融合蛋白構築體。

圖17描繪大腸桿菌對6xHis標記之FopC、與SUMO融合之6xHis標記之FopC及與syn18x5融合之6xHis標記之FopC的融合蛋白表現之胞內西方墨點法結果。

圖18示意性描繪在有或者無syn18x5下九種獨立新抗原序列之融合蛋白構築體。

圖19示意性描繪在syn18x5下具有不同數目之獨立新抗原序列之融合蛋白構築體。

本發明係關於用於製備及使用經修飾以增加一或多種異種抗原表現之減毒細菌物種的組合物及方法。本發明可提供用作癌症免疫治療劑之減毒細菌疫苗菌株或減毒菌株，該等菌株具有有利安全特徵，可用於治療或預防具有活的未減毒疫苗不適用之風險-益處特徵的疾病。

應瞭解本發明之應用不限於在以下描述中闡述或圖式中說明之建構細節及組分佈置。本發明能夠執行除所述實施例之外的實施例且以多種方式實踐及進行。亦應瞭解本文中探用之短語及術語以及摘要係用於達成描述之目的且不應視為限制。

1. 定義

用於指示基因突變或包含基因之細菌突變的縮寫如下。舉例而言，縮寫「單核球增多性李氏菌△actA」意謂actA基因部分或全部缺失。△符號(△)意謂缺失。包括上標負號之縮寫(李氏菌屬ActA^-)意謂例如藉助於缺失、點突變或移碼突變，但不限於此等類型突變使actA基因突變。

「投與」在應用於人類、哺乳動物、哺乳動物個體、動物、獸醫學個體、安慰劑個體、研究個體、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時，係指(不限於)外源性配位體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與個體、細胞、組織、器官或生物流體及其類似物接觸。「投與」可指例如治療、藥物動力學、診斷、研究、安慰劑及實驗方法。細胞之治療涵蓋試劑與細胞接觸以及試劑與流體接觸，其中流體與細胞接觸。「投與」亦涵蓋例如細胞用試劑、診斷劑、結合組合物或另一細胞進行活體外及離體治療。

「促效劑」在涉及配位體及受體時，包含刺激受體之分子、分子組合、複合物或試劑組合。舉例而言，粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體之促效劑可涵蓋GM-CSF、GM-CSF之突變蛋白或衍生物、GM-CSF之肽模擬物、模擬GM-CSF之生物功能之小分子或刺激GM-CSF受體之抗體。

「拮抗劑」在涉及配位體及受體時，包含抑制、抵制、下調受體及/或使受體不敏感之分子、分子組合或複合物。「拮抗劑」涵蓋抑制受體組成性活性之任何試劑。組成性活性為在缺乏配位體/受體相互作用下顯現之活性。「拮抗劑」亦涵蓋抑制或預防受體之刺激(或調節)活性的任何試劑。舉例而言，GM-CSF受體之拮抗劑包括(不暗含任何限制)結合於配位體(GM-CSF)且防止其與受體結合之抗體，或結合於受體且防止配位體與受體結合之抗體，或其中抗體將受體鎖在非活性構形。

如本文所用，關於肽、多肽或蛋白質之「類似物」或「衍生物」係指具有與原始肽、多肽或蛋白質類似或一致的功能，但不一定包含原始肽、多肽或蛋白質之類似或一致胺基酸序列或結構的另一肽、多肽或蛋白質。類似物較佳滿足以下中的至少一個：(a)胺基酸序列與原始胺基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的蛋白劑；(b)藉由在嚴格條件下與編碼原始胺基酸序列之核苷酸序列雜交之核苷酸序列編碼的蛋白劑；及(c)藉由與編碼原始胺基酸序列之核苷酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列編碼的蛋白劑。

如本文所用之「抗原序列(Antigen sequence)」或「抗原序列(antigenic sequence)」係指至少包含最小肽(例如當側接如本文中描述之裂解序列時預測具有免疫原性且結合個體MHC分子之肽)的胺基酸序列，該肽在本發明之融合蛋白例如藉由投與經工程改造以表現及分泌融合蛋白之細菌而遞送至個體時誘發免疫反應。抗原序列可包含腫瘤抗原或感染性疾病抗原。抗原序列包括如本文中描述之已知抗原，包括其任何抗原片段。在抗原序列包含腫瘤抗原之情況下，序列包括新抗原序列，例如藉由使用本領域中已知之方法(例如對來自個體之一或多種癌細胞之生檢進行測序)評估癌細胞所表現之抗原，針對特定個體測定之序列。一般而言，抗原序列可包括全長基因序列或其任何抗原片段，包括最小肽。通常抗原序列為至少約8個胺基酸，例如8-1,000個、8-500個、8-400個、8-300個、8-200個、8-100個、8-90個、8-80個、8-70個、8-60個、8-50個、8-40個、8-30個、10-1,000個、10-500個、10-400個、10-300個、10-200個、10-100個、10-90個、10-80個、10-70個、10-60個、10-50個、10-40 個或10-30個胺基酸長。在一些情況下，融合蛋白可包括超過一個來自全長序列之抗原序列片段，例如來自全長抗原內之一或多個抗原決定基。在一些情況下，融合蛋白可包括超過一個來自不同全長序列之抗原序列片段，例如來自不同全長抗原內之一或多個抗原決定基。在一些情況下，抗原序列包含額外胺基酸以改變肽之親水性或增強包括CD4與CD8 T細胞反應之T細胞反應。用於提高抗原序列之MHC結合之方法可見於例如Andreatta及Nielsen,(2016)Bioinformatics 32(4)：511-7；及Nielsen等人(2003)Protein Sci.,12：1007-17。在一些情況下，抗原序列包含最小肽序列且在其胺基及羧基末端中之任一個或兩個上進一步包含額外胺基酸，例如意欲改變抗原序列之親水性以提高抗原序列之預測MHC結合或者提高對抗原序列之整體反應以誘發CD4與CD8反應的胺基酸。

「抗原呈遞細胞」(APC)為用於將抗原呈遞至T細胞之免疫系統細胞。APC包括樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、邊緣區庫柏法細胞(marginal zone Kupffer cell)、小神經膠質細胞、郎格罕氏細胞(Langerhans cell)、T細胞及B細胞。樹突狀細胞以至少兩種譜系存在。第一譜系涵蓋前驅DC1、脊髓DC1及成熟DC1。第二譜系涵蓋CD34+CD45RA-早期多能祖細胞、CD34+CD45RA+細胞、CD34+CD45RA+CD4+IL-3Rα+前DC2細胞、CD4+CD11c-類漿細胞前驅DC2細胞、淋巴人類DC2類漿細胞衍生DC2及成熟DC2。

「減毒(Attenuation)」及「減毒(attenuated)」涵蓋經修飾以降低對宿主之毒性的細菌、病毒、寄生蟲、感染生物體、朊病毒、腫瘤細胞、感染生物體中之基因及其類似物。宿主可為人類或動物宿主，或器官、組織或細胞。舉例而言(非限制)，細菌可減毒以減少與宿主細胞之結合，減少自一種宿主細胞至另一宿主細胞之傳播，減少細胞外生長或減少宿主細胞中之胞內生長。減毒可藉由量測例如毒性之標記LD50、自器官之清除率或競爭指數來評估(參見例如Auerbuch等人(2001)Infect.Immunity 69：5953-5957)。一般地，減毒使得LD50增加及/或清除率增加至少25%；更一般地，至少50%；最一般地，至少100%(2倍)；正常至少5倍；更正常至少10倍；最正常至少50倍；經常至少100倍；更經常至少500倍；且最經常至少1000倍；通常至少5000倍；更通常至少10,000倍；且最通常至少50,000倍；且最經常至少100,000倍。

「減毒基因」涵蓋介導對宿主之毒性、病狀或毒力、在宿主內之生長或在宿主內之存活的基因，其中基因以減輕、減少或消除毒性、病狀或毒力之方式突變。減少或消除可藉由比較突變基因介導之毒力或毒性與藉由未突變(或親本)基因介導之毒力或毒性來評估。「突變基因」涵蓋基因調控區、基因編碼區、基因非編碼區或其任何組合中之缺失、點突變及移碼突變。

「裂解序列」或「裂解胺基酸序列」係指經配置以藉由宿主細胞蛋白酶體裂解之胺基酸序列。舉例而言(不限於)，此類裂解序列可獨立地選自由以下組成之群：ADGSVK(SEQ ID NO：2)、ASKVA(SEQ ID NO：3)、LSKVL(SEQ ID NO：4)、ASKVL(SEQ ID NO：5)、GDGSIK(SEQ ID NO：6)、ADGSV(SEQ ID NO：7)、LAKSL(SEQ ID NO：8)、ADLAVK(SEQ ID NO：9)、ASVVA(SEQ ID NO：10)、GIGSIA(SEQ ID NO：11)、GVEKI(SEQ ID NO：12)、NAANKG(SEQ ID NO：13)、DGSKKA(SEQ ID NO：14)、GDGNKK(SEQ ID NO：15)、KLSKVL(SEQ ID NO：75)及GDGNK(SEQ ID NO：76)。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含在強化子序列之胺基與羧基末端連接至裂解序列的強化子序列，例如融合蛋白可包含例如以下中的一個或多個：SEQ ID NO：5↓SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3↓SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：4↓SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：8↓SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10↓SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12↓SEQ ID NO：13；及SEQ ID NO：14↓SEQ ID NO：15，其中↓表示與所指示之裂解序列連接的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之強化子序列，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列。此清單不意謂限制性的。在一些實施例中，本發明之融合蛋白包含在抗原序列之胺基與羧基末端連接至裂解序列的多個抗原序列，例如融合蛋白可包含例如以下中的一個或多個：SEQ ID NO：5SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：4SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：4SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：14SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：14SEQ ID NO：76；SEQ ID NO：75SEQ ID NO：2；及SEQ ID NO：75SEQ ID NO：76，其中表示與所指示之裂解序列連接的抗原序列。此清單不意謂限制性的。

「保守修飾之變異體」適用於胺基酸序列與核酸序列。關於特定核酸序列，保守修飾之變異體係指編碼一致胺基酸序列或具有一或多個保守性取代之胺基酸序列的核酸。在一些實施例中，如本文中描述之強化子序列包括具有1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個保守胺基酸取代之該序列。保守性取代之一實例為以下各組之一中的胺基酸換成同一組之另一胺基酸(頒予Lee等人之美國專利第5,767,063號；Kyte及Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)。(1)疏水性：正白胺酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；及(7)小胺基酸：Gly、Ala、Ser。

「有效量」涵蓋(不限於)可改善、逆轉、減輕、預防或診斷醫學病狀或病症之症狀或徵象的量。除非明確或上下文另外規定，否則「有效量」不限於足夠改善病狀之最小量。

術語「強化子序列」或「強化子胺基酸序列」用於描述如本文中描述之獨特胺基酸序列(例如獨立地選自由ESNQSVEDKHNEFMLTEY(SEQ ID NO：1)及PASRAVDDHHAQFLLSEK(SEQ ID NO：37)組成之群的序列或與其具有至少90%一致性或同源性之序列或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列)，已發現該等序列顯著提高包含一個或多個此等強化子胺基酸序列之融合蛋白自細菌或其他生物體的表現及/或分泌。此類強化子序列特別適用於增加融合蛋白內所含之抗原序列的表現及/或分泌。舉例而言，當包含本發明之核酸序列之細菌用作疫苗或癌症免疫治療劑時，與缺乏此類強化子胺基酸序列之融合蛋白相比，由於強化子序列而增加之表現/分泌提高對抗原序列之免疫反應。

「細胞外液」涵蓋例如血清、血漿、血液、組織間隙液、腦脊髓液、分泌流體、淋巴、膽汁、汗、糞便物及尿。「細胞外液」可包含膠體或懸浮液，例如全血或凝固之血液。

在多肽上下文中術語「片段」包括胺基酸序列具有較大多肽之胺基酸序列之至少5個相鄰胺基酸殘基、至少10個相鄰胺基酸殘基、至少15個相鄰胺基酸殘基、至少20個相鄰胺基酸殘基、至少25個相鄰胺基酸殘基、至少40個相鄰胺基酸殘基、至少50個相鄰胺基酸殘基、至少60個相鄰胺基酸殘基、至少70個相鄰胺基酸殘基、至少80個相鄰胺基酸殘基、至少90個相鄰胺基酸殘基、至少100個相鄰胺基酸殘基、至少125個相鄰胺基酸殘基、至少150個相鄰胺基酸殘基、至少175個相鄰胺基酸殘基、至少200個相鄰胺基酸殘基或至少250個相鄰胺基酸殘基的肽或多肽。

「基因」係指編碼寡肽或多肽之核酸序列。寡肽或多肽可為生物學上活性、抗原活性、生物學上惰性或抗原上惰性及其類似特性。術語基因涵蓋例如編碼特定寡肽或多肽之開放閱讀框(ORF)之總和；ORF加編碼內含子之核酸的總和；ORF與可操作地連接之啟動子的總和；ORF與可操作地連接之啟動子及任何內含子的總和；ORF與可操作地連接之啟動子、內含子及啟動子及諸如強化子之其他調控元件的總和。在某些實施例中，「基因」涵蓋調控基因表現所需之呈順式之任何序列。術語基因亦可指編碼涵蓋抗原之肽或肽、寡肽、多肽或蛋白質之抗原活性片段的核酸。術語基因不一定暗示編碼之肽或蛋白質具有任何生物活性，或甚至肽或蛋白質為抗原活性的。編碼不可表現之序列的核酸序列一般視為假基因。術語基因亦涵蓋編碼諸如rRNA、tRNA之核糖核酸或核糖酶之核酸序列。

諸如李氏菌屬之細菌之「生長」涵蓋(不限於)細菌生理功能及與定殖、複製、蛋白質含量增加及/或脂質含量增加相關之基因。除非另外明確或上下文說明，否則李氏菌屬之生長涵蓋細菌在宿主細胞外之生長，以及在宿主細胞內之生長。生長相關之基因包括(不暗示任何限制)介導能量產生(例如糖酵解、克雷伯氏循環(Krebs cycle)、細胞色素)、胺基酸、糖、脂質、礦物質、嘌呤及嘧啶之合成代謝及/或分解代謝、營養運輸、轉錄、轉譯及/或複製之基因。在一些實施例中，李氏菌屬細菌之「生長」係指李氏菌屬細菌之胞內生長，亦即在諸如哺乳動物細胞之宿主細胞內的生長。雖然李氏菌屬細菌之胞內生長可藉由光顯徽術或菌落形成單位(CFU)分析來量測，但生長不受任何量測技術限制。諸如李氏菌抗原之數量、李氏菌核酸序列或李氏菌屬細菌之特定脂質的生化參數可用於評估生長。在一些實施例中，介導生長之基因為特異性介導胞內生長之基因。在一些實施例中，特異性介導胞內生長之基因涵蓋(但不限於)其中基因失活降低胞內生長速率但不可偵測、基本上或略微降低細胞外生長(例如培養液中生長)速率的基因，或其中基因失活降低胞內生長速率之程度大於其降低細胞外生長速率之程度的基因。為提供非限制性實例，在一些實施例中，其中失活降低胞內生長速率之程度大於細胞外生長的基因涵蓋其中失活降低胞內生長達不足正常或最大值之50%，但降低細胞外生長僅僅達最大值之1-5%、5-10%或10-15%的情況。在某些態樣中，本發明涵蓋胞內生長減弱但細胞外生長未減弱之李氏菌屬、胞內生長未減弱且細胞外生長未減弱之李氏菌屬以及胞內生長未減弱但細胞外生長減弱之李氏菌屬。

「親水性分析」係指藉由Kyte及Doolittle之方法分析多肽序列：「A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein」.J.Mol.Biol.157(1982)105-132。在此方法中，給予各胺基酸介於4.6與-4.6之間的疏水性分數。4.6之評分為疏水性最大，且-4.6之評分為親水性最大。接著設定窗口大小。窗口大小為對疏水性分數求平均值且分配給窗口中第一胺基酸之胺基酸數目。計算自胺基酸之第一窗口開始且計算該窗口中所有疏水性分數之平均值。接著窗口往下移一個胺基酸且計算第二窗口中所有疏水性分數之平均值。此模式繼續至蛋白質末端，計算各窗口之平均分數，且將其分配給窗口中之第一胺基酸。接著平均值繪在圖上。y軸表示疏水性分數且x軸表示窗口數目。以下疏水性分數用於20種常見胺基酸。

「經標記」之組合物為可藉由分光光譜法、光化學法、生物化學法、免疫化學法、同位素法或化學法直接或間接偵測。舉例而言，適用標記包括32P、33P、35S、14C、3H、125I、穩定同位素、抗原決定基標籤、螢光染料、電子緻密試劑、受質或例如如用於酶聯免疫分析中之酶，或螢光劑(fluorettes)(參見例如Rozinov及Nolan(1998)Chem.Biol.5：713-728)。

關於融合蛋白產物，「連接」在其用於本文中時係指融合蛋白內本發明之兩個胺基酸序列(例如分泌信號序列及如本文中描述之第一胺基酸序列)經由一個序列之羧基末端與另一個序列之胺基末端的肽鍵直接連接，或可經由一或多個胺基酸(例如1-100個、1-50個、1-20個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸)之「連接序列」的肽鍵連接。本領域的技術人員容易提供產生相關融合蛋白所需之核酸序列，例如其中一或多個胺基酸序列將例如信號序列連接至如本文中描述之包含強化子序列之第一胺基酸序列。在一些情況下，連接本發明之兩個胺基酸序列之一或多個胺基酸序列為用於製備本發明之核酸之限制位點的結果。在限制酶產物接合後，所得核酸序列將剩餘胺基酸序列轉譯成融合蛋白，此類序列在本文中可稱為「限制片段殘基」。此類限制片段殘基為本領域中所熟知，且通常為2個胺基酸。舉例而言，在使用BamHI限制序列之情況下，核酸之所得ggatcc序列在表現為蛋白質融合序列之兩個胺基酸組分之間產生殘餘GS連接。類似地，SpeI限制序列actagt產生殘餘TS連接。

「配位體」係指作為受體之促效劑或拮抗劑的小分子、肽、多肽或膜相關或膜結合分子。「配位體」亦涵蓋並非為促效劑或拮抗劑，且不具有促效或拮抗特性之結合劑。按照慣例，在配位體經膜結合於第一細胞上之情況下，受體通常存在於第二細胞上。第二細胞可與第一細胞具有相同身份(相同名稱)，或其可具有不同身份(不同名稱)。配位體或受體可完全在胞內，亦即，其可存在於胞液、細胞核或一些其他胞內隔室內。配位體或受體可改變其位置，例如自胞內隔室至質膜外面。配位體與受體之複合物稱為「配位體受體複合物」。在配位體及受體與信號傳導路徑相關之情況下，配位體存在於信號傳導路徑之上游位置且受體存在於下游位置。

「核酸」係指呈單股、雙股形式或者多股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合體。核酸之非限制性實例為例如cDNA、mRNA、寡核苷酸及聚核苷酸。特定核酸序列亦可暗含「等位基因變異體」及「剪接變異體」。

「新抗原」或「新抗原序列」係指其中形成新抗原之個體之免疫系統以前未曾識別出的新形成之抗原。新抗原經常與致癌或病毒感染細胞有關。當蛋白質經歷生物化學路徑內進一步修飾，諸如糖基化、磷酸化或蛋白水解或在核酸層面上之突變時，可形成新抗原。藉由改變其他方面正常之蛋白質之結構，隨著產生新的抗原決定子，此過程可產生新抗原決定基(稱為「新抗原決定子」)。此類抗原係新的且對個體中腫瘤細胞或病毒感染細胞可具特異性(例如由於腫瘤細胞中基因內突變之結果)，且為針對腫瘤或病毒之免疫療法提供標靶。在本發明之上下文中，罹患癌症之個體將較佳在癌細胞上表現一或多種新抗原。個體之癌症，亦即腫瘤細胞，可進行生檢及分析，以確定任何新抗原之身份，新抗原可經工程改造成本發明之融合蛋白構築體以達成免疫療法之目的。因此，如本文中描述之融合蛋白可包含一或多種獨立選擇之新抗原，例如1-50種、1-25種、1-20種、1-19種、1-18種、1-17種、1-16種、1-15種、1-14種、1-13種、1-12種、1-11種、1-10種、1-9種、1-8種、1-7種、1-6種、1-5種、1-4種、1-3種、1-2種或1種獨立選擇之新抗原序列。

在啟動子及編碼mRNA之核酸的上下文中，「可操作地連接」意謂啟動子可用於開始該核酸之轉錄。

術語「序列一致性百分比」及「序列一致性%」係指藉由比較或比對兩個或更多個胺基酸或核酸序列所發現的序列相似性百分比。可藉由比對序列直接比較兩個分子之間的序列資訊，計算兩個比對序列之間的精確匹配值，除以較短序列之長度且結果乘以100，來確定一致性百分比。用於計算一致性百分比之算法為Smith-Waterman同源性搜尋演算法(參見例如Kann及Goldstein(2002)Proteins 48：367-376；Arslan等人，(2001)Bioinfoimatics 17：327-337)。

「醫藥學上可接受之賦形劑」或「診斷學上可接受之賦形劑」係指可用於(亦即調配)例如包含如本文中描述之核酸之細菌的賦形劑以用於治療或診斷用途。此類賦形劑包括(但不限於)無菌蒸餾水、鹽水、磷酸鹽緩衝溶液、基於胺基酸之緩衝液或碳酸氫鹽緩衝溶液。所選賦形劑及所用賦形劑之量將視用途而定，例如用於治療或診斷用途之投與模式(例如經口、靜脈內、皮下、經皮、皮內、肌肉內、黏膜、非經腸、器官內、損害內、鼻內、吸入、眼內、肌肉內、血管內、結節內、皮上劃痕、直腸、腹膜內或多種熟知投藥途徑之任一種或組合)。

在提及多肽或核酸時，「純化」及「分離」意謂多肽中基本上不存在其在自然界中相關聯之其他生物大分子。在一些實施例中，如本文中描述之本發明之核酸分子及融合蛋白為經分離之核酸分子或融合蛋白。如本文所用之術語「純化」意謂所鑑別之多肽或核酸經常佔按重量計所存在之多肽的至少50%，更經常佔至少60%，通常佔至少70%，更通常佔至少75%，最通常佔至少80%，常常佔至少85%，更常佔至少90%，最常佔至少95%，且照慣例佔至少98%或更大。水、緩衝劑、鹽、清潔劑、還原劑、蛋白酶抑制劑、穩定劑(包括諸如白蛋白之附加蛋白質)及賦形劑以及分子量小於1000之分子的重量一般不用於確定多肽純度。參見例如頒予Covacci等人之美國專利第6,090,611號中純度之論述。

「肽」係指短胺基酸序列，其中胺基酸藉由肽鍵彼此連接。肽可自由存在或結合於另一部分，諸如大分子、脂質、寡醣或多醣及/或多肽。在肽併入多肽鏈中之情況下，術語「肽」仍然可用於特指短胺基酸序列。「肽」可藉由肽鍵或一些其他類型鍵連接至另一部分。肽長度為至少兩個胺基酸且長度一般小於約25個胺基酸，其中最大長度隨慣例或上下文而變。術語「肽」及「寡肽」可互換使用。

「蛋白質」一般係指包含多肽鏈之胺基酸序列。蛋白質亦可指多肽之三維結構。「變性蛋白」係指具有一些殘餘三維結構之部分變性多肽，或可替代地，係指基本上隨機之三維結構，亦即全部變性。本發明涵蓋多肽變異體之試劑及使用多肽變異體之方法，例如涉及糖基化、磷酸化、硫酸化、形成二硫鍵、去醯胺、異構化、信號或前導序列加工中之裂解點、共價及非共價結合之輔因子、氧化變異體及其類似物。描述二硫化物連接之蛋白質之形成(參見例如Woycechowsky及Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4：533-539；Creighton等人，(1995)Trends Biotechnol.13：18-23)。

「重組」在用於提及例如核酸、細胞、動物、病毒、質體、載體或其類似物時，指示藉由引入外源性非天然核酸、改變天然核酸或藉由自重組核酸、細胞、病毒、質體或載體完全或部分衍生進行修飾。重組蛋白係指例如自重組核酸、病毒、質體、載體或其類似物衍生之蛋白質。「重組細菌」涵蓋其中基因組藉由重組方法，例如經由突變、缺失、插入及/或重排進行工程改造之細菌。「重組細菌」亦涵蓋經修飾以包括重組基因組外核酸，例如質體或第二染色體之細菌，或其中存在之基因組外核酸改變的細菌。

「樣品」係指來自人類、動物、安慰劑或研究樣品之樣品，例如細胞、組織、器官、流體、氣體、氣溶膠、漿液、膠體或凝結物質。「樣品」可在活體內測試，例如不自人類或動物移除，或其可在活體外測試。可在例如藉由組織學方法加工之後，測試樣品。「樣品」亦係指例如包含流體或組織樣品之細胞或與流體或組織樣品分離之細胞。「樣品」亦可指自人類或動物新鮮獲取之細胞、組織、器官或流體，或經加工或儲存之細胞、組織、器官或流體。

「可選擇標記物」涵蓋允許選擇或排除含有可選擇標記物之細胞的核酸。可選擇標記物之實例包括(不限於)例如：(1)編碼抵抗另外有毒之化合物(例如抗生素)之產物或編碼對另外無害化合物(例如蔗糖)之敏感度的核酸；(2)編碼在受體細胞中另外缺乏之產物的核酸(例如tRNA基因、營養缺陷型標記物)；(3)編碼抑制基因產物之活性之產物的核酸；(4)編碼容易鑑別之產物的核酸(例如表型標記物，諸如β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、細胞表面蛋白、抗原決定基標籤、FLAG標籤)；(5)可藉由雜交技術，例如PCR或分子標誌鑑別之核酸。

在提及配位體/受體、核酸/互補核酸、抗體/抗原或其他結合對(例如細胞介素與細胞介素受體)時，「特異性」或「選擇性」結合指示確定蛋白質及其他生物製劑之異源群體中該蛋白質存在之結合反應。因此，在規定條件下，指定配位體結合於特定受體且不大量結合於樣品之存在之其他蛋白質。特異性結合亦可意謂例如所涵蓋方法之來源於抗體之抗原結合位點的結合化合物、核酸配位體、抗體或結合組合物以比任何其他結合化合物之親和力經常大至少25%、更經常大至少50%、最經常大至少100%(2倍)、正常至少大10倍、更正常至少大20倍且最正常至少大100倍的親和力結合於其標靶。

在一典型實施例中，抗體將具有大於約10⁹公升/莫耳之親和力，如例如藉由Scatchard分析測定(Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)。熟練技術人員認識到，一些結合化合物可特異性地結合於超過一個標靶，例如抗體特異性結合於其抗原，經由抗體之寡醣結合於凝集素，及/或經由抗體之Fc區結合於Fc受體。

細菌之「傳播」涵蓋「細胞至細胞傳播」，亦即如例如藉由囊泡介導，細菌自第一宿主細胞傳輸至第二宿主細胞。關於傳播之功能包括(但不限於)例如形成肌動蛋白尾、形成偽足樣延長及形成雙膜空泡。

如本文所用之術語「個體」係指人類或非人類生物體。因此，本文所述之方法及組合物適用於人類與獸醫學疾病。在某些實施例中，個體為「患者」，亦即針對疾病或病狀接受醫療護理之活的人類。此包括正針對病狀徵象進行調查且未界定為患病之人。

重組酶之「標靶位點」為由重組酶識別、結合及/或起作用之核酸序列或區域(參見例如頒予Graham等人之美國專利第6,379,943號；Smith及Thorpe(2002)Mol.Microbiol.44：299-307；Groth及Calos(2004)J.Mol.Biol.335：667-678；Nunes-Duby等人(1998)Nucleic Acids Res.26：391-406)。

「治療有效量」定義為試劑或醫藥組合物足夠顯示患者益處，亦即減少、預防或改善所治療之病狀之症狀的量。當藥劑或醫藥組合物包含診斷劑時，「診斷有效量」定義為足夠產生信號、影像或其他診斷參數之量。醫藥調配物之有效量將根據諸如以下因素而化：個體之敏感度、個體之年齡、性別及體重以及個體之特異質反應(參見例如頒予Netti等人之美國專利第5,888,530號)。

「治療(Treatment)」或「治療(treating)」(關於病狀或疾病)係獲得有益或所需結果，包括且較佳為臨床結果之方法。出於本發明之目的，關於疾病之有益或所需結果包括(但不限於)以下一個或多個：改善與疾病有關之病狀、治癒疾病、減輕疾病嚴重程度、延遲疾病進展、延遲疾病復發、減輕與疾病有關之一或多種症狀、增加罹患疾病之人的生活品質及/或延長存活。同樣，出於本發明之目的，關於病狀之有益或所需結果包括(但不限於)以下一個或多個：改善病狀、治癒病狀、減輕病狀嚴重程度、延遲病狀進展、延遲病狀復發、減輕與病狀有關之一或多種症狀、增加罹患病狀之人的生活品質及/或延長存活。

「疫苗」涵蓋預防性疫苗，包括用於預防疾病復發之疫苗。疫苗亦涵蓋治療性疫苗，例如向包含與疫苗所提供之抗原或抗原決定基有關之病狀或病症的哺乳動物投與之疫苗。

「免疫原性」在該術語用於本文中時意謂抗原能夠引起抗原特異性體液或T細胞反應(CD4+及/或CD8+)。可用多種方式選擇一或多種抗原或其衍生物用於本發明之疫苗組合物中，該等方式包括評估所選細菌成功表現及分泌重組抗原之能力；及/或重組抗原開始抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞反應之能力。如以下所論述，為最終選擇可用於特定細菌遞送媒劑之抗原，重組抗原之此等屬性較佳與完整疫苗平台之能力組合(意謂針對所選抗原選擇的細菌表現系統)，以開始先天免疫反應以及針對重組表現之抗原的抗原特異性T細胞反應。合適抗原之最初確定可藉由選擇所選細菌宿主(例如李氏菌屬)成功重組表現且為免疫原性的抗原或抗原片段來進行。

可藉由西方墨點法，使用偵測重組產生之抗原序列的抗體或使用偵測所包括之與抗原一起表現為融合蛋白之序列(「標籤」)的抗體，直接偵測重組抗原之表現。舉例而言，抗原可與李氏菌屬ActA蛋白質之N末端部分一起表現為融合物，且針對與ActA之成熟N末端18個胺基酸對應之合成肽 (ATDSEDSSLNTDEWEEEK(SEQ ID NO：77))培養的抗ActA抗體可用於偵測所表現之蛋白質產物。

用於測試抗原之免疫原性之分析法在本文中予以描述且為本領域所熟知。舉例而言，藉由所選細菌重組產生之抗原可視情況經構築以含有編碼八胺基SIINFEKL(SEQ ID NO：38)肽(亦稱SL8及卵白蛋白257-264)之核苷酸序列，其與抗原之羧基末端同框定位。諸如C端SL8抗原決定基之組合物充當替代品(i)以證明重組抗原正自N末端至C末端完全表現；及(ii)使用活體外抗原呈遞分析法，證明抗原呈遞細胞經由MHC I級路徑呈遞重組抗原之能力。此類呈遞分析法可使用經選殖之C57BL/6衍生之樹突狀細胞株DC2.4以及B3Z T細胞雜交瘤細胞株進行，如以下所描述。

或者或另外，可使用如以下描述之ELISPOT分析法測試免疫原性。ELISPOT分析法最初發展用於列舉分泌B細胞之抗原特異性抗體，但後來適宜執行多種任務，尤其在單細胞層面上識別及列舉產生細胞介素之細胞。可自接種適當細菌疫苗之動物收穫脾，且經分離之脾細胞與或不與來源於細菌疫苗所表現之一或多種抗原的肽一起培育隔夜。固定抗體捕獲任何分泌之IFN-γ，因此允許隨後量測分泌之IFN-γ，且評估對疫苗之免疫反應。

2. 重組表現系統-「疫苗平台」

已研發許多細菌物種用作疫苗，且該等細菌物種可用於本發明中，包括(但不限於)福氏痢疾桿菌(Shigella flexneri)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、小腸結腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)或分枝桿菌屬(Mycobacterium)物種，較佳為單核球增多性李氏菌。此清單不意謂限制性的。參見例如WO04/006837；WO07/103225；及WO07/117371，其各自特此以全文引用的方式併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。用於疫苗組合物中之細菌載體可為兼性胞內細菌載體。細菌可用於在宿主生物體中將本文中描述之多肽遞送至抗原呈遞細胞。如本文中描述，單核球增多性李氏菌為表現本發明之抗原提供較佳疫苗平台。

重組載體係使用本領域中已知之標準技術製備，且含有可操作地連接至編碼標靶抗原之核苷酸序列的合適控制元件。參見例如Plotkin等人(編輯)(2003)Vaccines，第4版，W.B.Saunders,Co.,Phila.,PA.；Sikora等人(編輯)(1996)Tumor Immunology Cambridge University Press,Cambridge,UK；Hackett及Harn(編輯)Vaccine Adjuvants,Humana Press,Totowa,NJ；Isaacson(編輯)(1992)Recombinant DNA Vaccines,Marcel Dekker,NY,NY；Morse等人(編輯)(2004)Handbook of Cancer Vaccines,Humana Press,Totowa,NJ；Liao等人(2005)Cancer Res.65：9089-9098；Dean(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2：227-236；Arlen等人(2003)Expert Rev.Vaccines 2：483-493；Dela Cruz等人(2003)Vaccine 21：1317-1326；Johansen等人(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.50：413-417；Excler(1998)Vaccine 16：1439-1443；Disis等人(1996)J.Immunol.156：3151-3158。描述肽疫苗(參見例如McCabe等人(1995)Cancer Res.55：1741-1747；Minev等人(1994)Cancer Res.54：4155-4161；Snyder等人(2004)J.Virology 78：7052-7060)。

亦可使用裸DNA載體及裸RNA載體提供抗原表現平台。此等含有核酸之疫苗可藉由基因槍、電穿孔、細菌菌影、微球體、微粒、脂質體、聚陽離子型奈米粒子及其類似物投與(參見例如Donnelly等人(1997)Ann.Rev.Immunol.15：617-648；Mincheff等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39：125-132；Song等人(2005)J.Virol.79：9854-9861；Estcourt等人(2004)Immunol.Rev.199：144-155)。可獲得例如經由基因槍、皮內、肌肉內及電穿孔方法投與裸核酸之試劑及方法。核酸疫苗可包含鎖核酸(LNA)，其中LNA允許功能部分附接至質體DNA，且其中功能部分可為佐劑(參見例如Fensterle等人 (1999)J.Immunol.163：4510-4518；Strugnell等人(1997)Immunol.Cell Biol.75：364-369；Heitoughs等人(2003)Nucleic Acids Res.31：5817-5830；Trimble等人(2003)Vaccine 21：4036-4042；Nishitani等人(2000)Mol.Urol.4：47-50；Tuting(1999)Curr.Opin.Mol.Ther.1：216-225)。核酸疫苗可與促進不成熟樹突狀細胞遷移至疫苗之試劑及促進成熟DC遷移至其中可能發生致敏之引流淋巴結的試劑組合使用，其中此等試劑涵蓋MIP-1α及Flt3L(參見例如Kutzler及Weiner(2004)J.Clin.Invest.114：1241-1244；Sumida等人(2004)J.Clin.Invest.114：1334-1342)。

減毒與共生微生物已成功地用作疫苗抗原之載劑，但抗原之細菌載劑視情況經減毒或殺死，但在代謝上為活性(KBMA)。可調節用於調配物之運載菌株之遺傳背景、選擇用於實現減毒之突變類型及免疫原之固有特性以最佳化所引起之免疫反應的程度及品質。認為使細菌載劑刺激之免疫反應最佳化的一般因素包括：載劑之選擇；特定背景菌株、減毒突變及減毒水準；減毒表現型之穩定及最佳給藥之確定。其他考慮之抗原相關因素包括：抗原之固有特性；表現系統、抗原顯現形式及重組表現型之穩定；調節分子之共表現及接種疫苗時程。

疫苗平台之一較佳特徵為開始先天免疫反應以及針對重組表現之抗原之抗原特異性T細胞反應的能力。舉例而言，表現本文中描述之抗原的單核球增多性李氏菌可誘發肝內1型干擾素(IFN-α/β)及趨化介素及細胞介素之下游級聯。響應於此肝內免疫刺激，NK細胞及抗原呈遞細胞(APC)募集至肝臟。在某些實施例中，本發明之疫苗平台在遞送疫苗平台至個體後24小時誘發選自由以下組成之群之細胞介素及趨化介素中一或多種及較佳所有各者的血清濃度增加：IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNFα及MCP-1；且誘發針對疫苗平台表現之一或多種抗原的CD4+及/或CD8+抗原特異性T細胞反應。在其他實施例中，本發明之疫苗平台亦誘發存在之不成熟肝NK細胞之成熟，如藉由小鼠模型系統中諸如DX5、CD11b及CD43之活化標記物上調所證明，或藉由使用用作標靶細胞之51Cr標記之YAC-1細胞量測的NK細胞介導之細胞溶解活性所證明。

在多個實施例中，本發明之疫苗及免疫原性組合物可包含經組態以表現本發明之融合蛋白的單核球增多性李氏菌。單核球增多性李氏菌用作疫苗載體之能力已在Wesikirch等人，Immunol.Rev.158：159-169(1997)中評論。單核球增多性李氏菌之自然生物學之許多所需特徵使得其成為有吸引力的應用於治療疫苗之平台。主要基本原理為單核球增多性李氏菌之胞內生命週期能夠有效刺激CD4+及CD8+ T細胞免疫性。響應於感染後與單核球增多性李氏菌大分子之相互作用，觸發多種病原體相關分子模式(PAMP)受體，包括TLR(TLR2、TLR5、TLR9)及核苷酸結合寡聚結構域(NOD)，使先天免疫效應子全活化且釋放Th-1極化細胞介素，對針對所表現之抗原的CD4+及CD8+ T細胞反應發揮深遠影響。

最近，已研發單核球增多性李氏菌菌株作為異源蛋白質之有效胞內遞送媒劑，將抗原遞送至免疫系統以誘發針對不允許注射致病劑之臨床病狀(諸如癌症及HIV)之免疫反應。參見例如美國專利第6,051,237號；Gunn等人，J.Immunol.,167：6471-6479(2001)；Liau等人，Cancer Research,62：2287-2293(2002)；美國專利第6,099,848號；第WO 99/25376號；第WO 96/14087號；及美國專利第5,830,702號，其各自特此以全文引用的方式併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。表現淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)抗原之重組單核球增多性李氏菌疫苗亦已顯示誘發針對抗原之保護性的細胞介導之免疫(Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92：3987-3991(1995)。

已產生適用於免疫原性組合物的單核球增多性李氏菌之減毒且殺死但在代謝上活性之形式(WO04/006837；WO04/084936；WO04/110481；WO05/037233；WO05/092372；WO06/036550；WO07/103225；WO07/117371；WO08/109155；WO08/130551；WO08/140812；WO09/143085；WO09/143167；WO10/040135；WO11/060260；及WO14/074635)，其各自特此以全文引用的方式併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。單核球增多性李氏菌之ActA蛋白質足夠促進負責胞內運動之肌動蛋白募集及聚合事件。人類安全研究已報導，經口投與actA/plcB缺失之單核球增多性李氏菌之減毒形式未在成年人中引起嚴重後遺症(Angelakopoulos等人，Infection and Immunity,70：3592-3601(2002))。亦已描述單核球增多性李氏菌之其他類型減毒形式(參見例如WO 99/25376及美國專利第6,099,848號，其描述表現異種抗原之李氏菌屬之營養缺陷型減毒菌株)。

在某些實施例中，用於本發明之疫苗組合物中之單核球增多性李氏菌為活的減毒菌株，其包含actA及/或inlB之減毒突變，及較佳actA及inlB所有或一部分缺失(本文中稱為「Lm△actA/△inlB」)，且含有編碼包含相關抗原之融合蛋白之表現的重組DNA。含有抗原之融合蛋白較佳在細菌表現序列之控制下且穩定地整合至單核球增多性李氏菌基因組中。因此此類單核球增多性李氏菌疫苗菌株未採用真核轉錄或轉譯元件。

本發明亦涵蓋至少一種調控因子，例如啟動子或轉錄因子減毒之李氏菌屬。以下係關於啟動子。ActA表現藉由兩種不同啟動子調控(Vazwuez-Boland等人(1992)Infect.Immun.60：219-230)。InlA及InlB表現一起藉由五種啟動子調控(Lingnau等人(1995)Infect.Immun.63：3896-3903)。轉錄因子prfA為例如hly、plcA、ActA、mpl、prfA及iap之許多單核球增多性李氏菌基因轉錄所需。PrfA之調控特性藉由例如PrfA依賴性啟動子(PinlC)及PrfA-盒介導。在某些實施例中，本發明提供編碼ActA啟動子、inlB啟動子、PrfA、PinlC、PrfA盒及其類似物中至少一種失活、突變或缺失的核酸(參見例如Lalic Mullthaler等人(2001)Mol.Microbiol.42：111-120；Shetron-Rama等人(2003)Mol.Microbiol.48：1537-1551；Luo等人(2004)Mol.Microbiol.52：39-52)。可藉由Gly145Ser突變、Gly155Ser突變或Glu77Lys突變使PrfA具組成性活性(參見例如Mueller及Freitag(2005)Infect.Immun.73：1917-1926；Wong及Freitag(2004)J.Bacteriol.186：6265-6276；Ripio等人(1997)J.Bacteriol.179：1533-1540)。

減毒可藉由例如熱處理或化學修飾來實現。減毒亦可藉由調節例如新陳代謝、細胞外生長或胞內生長之核酸的遺傳修飾、編碼毒力因子(諸如李氏菌prfA、actA、李氏菌溶胞素(LLO)、附著介導因子(例如內化素，諸如inlA或inlB)、mpl、磷脂醯膽鹼磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI PLC；plcA基因))之核酸的遺傳修飾、上述各者之任何組合及其類似物來實現。減毒可藉由比較減毒李氏菌屬之生物機能與適當親本李氏菌屬顯示之對應生物機能來評估。

在其他實施例中，本發明提供一種李氏菌屬，其藉由用諸如交聯劑、補骨脂素、氮芥、順鉑、大體積加合物、紫外光、γ輻射、其任何組合及其類似物之核酸靶向劑處理來減毒。通常，藉由交聯劑之一個分子產生的損害涉及雙螺旋雙股之交聯。本發明之李氏菌屬亦可藉由使例如uvrA、uvrB、uvrAB、uvrC、uvrD、uvrAB、phrA之至少一種核酸修復基因及/或例如recA之介導重組修復之基因突變來減毒。此外，本發明提供一種李氏菌屬，其藉由核酸靶向劑與使核酸修復基因突變來減毒。另外，本發明涵蓋用諸如補骨脂素之感光性核酸靶向劑及/或諸如補骨脂素之感光性核酸交聯劑處理，接著暴露於紫外光。

適用於本發明之減毒李氏菌屬描述於例如美國專利公開案第2004/0228877號及第2004/0197343號以及PCT公開案WO04/006837；WO04/084936；WO04/110481；WO05/037233；WO05/092372；WO06/036550；WO07/103225；WO07/117371；WO08/109155；WO08/130551；WO08/140812；WO09/143085；WO09/143167；WO10/040135；WO11/060260；及WO14/074635中，其各自以全文引用的方式併入本文中。用於評估李氏菌屬之特定菌株是否具有所需減毒之多種分析法提供於例如美國專利公開案第2004/0228877號、第2004/0197343號及第2005/0249748號中，其各自以全文引用的方式併入本文中。

在其他實施例中，用於本發明之疫苗組合物中之單核球增多性李氏菌為來源於Lm△actA/△inlB之殺死但在代謝上活性(KBMA)之平台，且亦缺失uvrA與uvrB、編碼核苷酸切除修復(NER)路徑之DNA修復酶之基因，且含有編碼融合蛋白之表現之重組DNA。相關抗原較佳在細菌表現序列之控制下且穩定地整合至單核球增多性李氏菌基因組中。藉由合成補骨脂素、S-59及長波紫外光之組合處理，KBMA平台對光化學失活極其敏感。雖然殺死，但KBMA單核球增多性李氏菌疫苗仍可短暫表現其基因產物，允許其逃避吞噬溶酶體且誘發功能性細胞免疫且避免野生型WT Lm及牛痘病毒攻擊。

在某些實施例中，減毒或KBMA單核球增多性李氏菌疫苗菌株包含組成性活性prfA基因(本文中稱為PrfA*突變體)。PrfA為一種在細胞內活化之轉錄因子，其誘發適當工程改造之疫苗菌株中毒力基因及編碼之異種抗原(Ag)的表現。如上所述，actA基因之表現對PrfA起反應，且actA啟動子為PrfA反應性調控元件。包括prfA G155S等位基因可賦予活減毒或KBMA疫苗以顯著提高之疫苗效力。較佳PrfA突變體描述於2009年5月18日申請之標題為包含PRFA*突變體李氏菌屬之組合物及其使用方法(COMPOSITIONS COMPRISING PRFA* MUTANT LISTERIA AND METHODS OF USE THEREOF)的WO2009/143085中，該案之全文特此併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。

3. 抗原構築體

本發明之融合蛋白之抗原部分較佳包含編碼在疫苗平台內可操作以支持分泌之分泌序列的核酸、本發明之一或多個強化子序列及待表現之抗原。在細菌平台之情況下，所得融合蛋白可操作地連接至細菌疫苗平台表現融合蛋白所需之調控序列(例如啟動子)。本發明不限於分泌之多肽及肽抗原，且亦涵蓋未自李氏菌屬或其他細菌分泌或不可自李氏菌屬或其他細菌分泌之多肽及肽。但較佳地，當細菌疫苗菌株接種至接受者中時抗原呈可溶性分泌形式由該菌株表現。

可用於本發明之抗原的實例(不限於)列於以下表中。標靶抗原亦可為包含以下表1中所列之若干抗原之免疫活性部分的片段或融合多肽。本發明之融合蛋白可包含超過一種抗原序列。此清單不意謂限制性的。

合適抗原為本領域中已知之其他生物體包括(但不限於)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactia)(B組鏈球菌)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrheae)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、沙門氏菌物種(Salmonella species)(包括傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌)、腸道沙門氏菌(enterica)(包括幽門螺旋桿菌(Helicobactor pylori)、福氏痢疾桿菌及其他D群志賀氏菌屬物種)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumonia)、梭菌物種(Clostridium species)(包括艱難梭菌(C.difficile))、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及創傷弧菌(V.vulnificus)。此清單不意謂限制性的。

以下表2揭示用於表現及分泌相關融合蛋白多肽之信號肽的許多非限制性實例，諸如抗原序列。信號肽傾向於含有三個結構域：帶正電N末端(1-5個殘基長)；中心疏水性結構域(7-15個殘基長)；及中性但極性C端結構域。

在以下描述之某些示例性實施例中，融合蛋白在其胺基端融合至單核球增多性李氏菌ActA或LLO蛋白質之胺基端部分，此允許在接種宿主內融合蛋白自細菌表現及分泌。ActA信號序列為MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA(SEQ ID NO：41)；LLO信號序列為 MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTE(SEQ ID NO：42)。構築體中所用天然信號序列較佳不進行修飾。

抗原可表現為融合至單核球增多性李氏菌ActA蛋白質之胺基末端部分的單個多肽，該蛋白質包含其分泌信號序列且允許在宿主細胞內自細菌表現及分泌融合蛋白。此ActA片段可包含至少ActA之開始59個膠基酸，或與至少ActA之開始59個胺基酸至少約80%序列一致性、至少約85%序列一致性、至少約90%序列一致性、至少約95%序列一致性或至少約98%序列一致性的序列。在一些實施例中，經修飾之ActA包含至少ActA之開始100個胺基酸，或與至少ActA之開始100個胺基酸至少約80%序列一致性、至少約85%序列一致性、至少約90%序列一致性、至少約95%序列一致性或至少約98%序列一致性的序列。ActA之100殘基N末端片段具有以下序列(SEQ ID NO：25)：

在此序列中，第一殘基描繪成纈胺酸；該多肽藉由李氏菌屬，在此位置中用甲硫胺酸合成。因此，亦可使用Val₁Met取代形式。

本發明之融合蛋白可包含一或多個與ActA(或其他分泌信號序列，諸如LLO)、強化子序列、裂解序列或抗原序列不相關聯之額外胺基酸殘基。因此，舉例而言，分泌信號序列可連接至第一胺基酸序列(包含強化子序列)或第二胺基酸序列(包含抗原序列)且第一胺基酸序列可藉由與融合蛋白之表現或分泌、裂解或抗原性質無關之胺基酸殘基連接至第二胺基酸序列。連接此等序列之此等任選胺基酸殘基各可為一或多個胺基酸，例如1-100個、1-50個、1-25個、1-20個、1-25個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、 1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸。此外，其中融合蛋白包含超過一個強化子序列，且各強化子序列描述為在胺基末端與羧基末端連接至裂解序列，將裂解序列連接至強化子序列的可為肽鍵，或一或多個胺基酸，諸如1-100個、1-50個、1-25個、1-20個、1-25個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸。此外，其中融合蛋白包含超過一個抗原序列，且各抗原序列描述為在胺基末端與羧基末端連接至裂解序列，將裂解序列連接至抗原序列的可為肽鍵，或一或多個胺基酸，諸如1-100個、1-50個、1-25個、1-20個、1-25個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸。舉例而言，包含分泌信號序列、包含一或多個在胺基末端與羧基末端連接至裂解序列之強化子胺基酸序列的第一胺基酸序列及包含一或多個在胺基末端與羧基末端連接至裂解序列之抗原序列的第二胺基酸序列的本發明融合蛋白可表示為包含(分泌信號序列)-L₁-[第一胺基酸序列]-L₂-[第二胺基酸序列]或(分泌信號序列)-L₃-[第二胺基酸序列]-L₄-[第一胺基酸序列]之多肽結構。進一步舉例而言，其中融合蛋白包括兩個強化子胺基酸序列及兩個抗原序列，此可表示為(分泌信號序列)-L₁-[(裂解序列1)-L₅-(強化子序列1)-L₆-(裂解序列1')-L₇-(裂解序列2)-L₈-(強化子序列2)-L₉-(裂解序列2')]-L₂-[(裂解序列3)-L₁₀-(抗原序列1)-L₁₁-(裂解序列3')-L₁₂-(裂解序列4)-L₁₃-(抗原序列2)-L₁₄-(裂解序列4')]或(分泌信號序列)-L₃-[(裂解序列3)-L₁₀-(抗原序列1)-L₁₁-(裂解序列3')-L₁₂-(裂解序列4)-L₁₃-(抗原序列2)-L₁₄-(裂解序列4')]-L₄-[(裂解序列1)-L₅-(強化子序列1)-L₆-(裂解序列1')-L₇-(裂解序列2)-L₈-(強化子序列2)-L₉-(裂解序列2')]。在此等實例中，各L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇、L₈、L₉、L₁₀、L₁₁、L₁₂、L₁₃及L₁₄獨立地選自由以下組成之群：直接鍵(亦即肽鍵)或一或多個與分泌信號序列、強化子序列、裂解序列或抗原序列無關之額外連接胺基酸殘基。在一些實施例中，各L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、 L₇、L₈、L₉、L₁₀、L₁₁、L₁₂、L₁₃及L₁₄為直接鍵或1-100個、1-50個、1-25個、1-20個、1-25個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個或1個胺基酸。在一些實施例中，各L₁、L₂、L₃、L₄、L₅、L₆、L₇、L₈、L₉、L₁₀、L₁₁、L₁₂、L₁₃及L₁₄為直接鍵、1個或2個胺基酸。在一些實施例中，任一或多個此等連接為用於製備編碼融合蛋白之核酸序列的限制位點之結果。應瞭解本實例可用於具有額外強化子或抗原序列之融合蛋白，亦即可包含L₁、L₂……L_m此類連接，其中編號按需要續接Lm以描述融合蛋白。在一些實施例中，如本文中描述之整個融合蛋白少於3,000個胺基酸、少於2,000個胺基酸、介於200個與3,000個胺基酸之間、介於200個與2,000個胺基酸之間、介於300個與2,000個胺基酸之間、介於300個與1,500個胺基酸之間或介於300個與1,000個胺基酸之間。

本發明之構築體亦可包含一或多個額外非ActA殘基，位於經修飾之ActA之C末端殘基與抗原序列之間，或當抗原序列與第一胺基酸序列之胺基末端融合時介於經修飾之ActA之C末端殘基與第一胺基酸序列之間。在以下序列中，藉由包括BamH1位點而添加的兩個殘基(Gly-Ser)使ActA-N100延伸(此外，亦可使用Val₁Met取代形式)(SEQ ID NO：26)：

稱為ActAN100*之經修飾之ActA可分別包含以下序列SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28或由其組成，當藉由李氏菌屬表現時按照Val₁Met取代之論述，不同之處僅僅在於第一胺基酸(破折號指示缺失且粗體字指示相對於ActAN100之取代)：

用於抗原構築體之DNA及蛋白質序列如下：當在李氏菌屬中表現時，表現ActAn100*蛋白質SEQ ID NO：28之DNA(SEQ ID NO：36)(小寫字母，無下劃線：actA啟動子；小寫字母，下劃線：限制位點；大寫字母，粗體：ActAN100*序列，後面插入測試構築體)：

與Syn1之5個複本的融合得到以下序列(SEQ ID NO：43)(小寫字母，無下劃線：actA啟動子；大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：限制位點；大寫字母，下劃線：Syn1x5)：

當在李氏菌屬中表現時此轉譯成以下蛋白質序列(SEQ ID NO：44)(大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：藉由限制位點增加之殘基；大寫字母，下劃線：Syn1x5)：

與Syn2之5個複本的融合得到以下序列(SEQ ID NO：45)(小寫字母，無下劃線：actA啟動子；大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：限制位點；大寫字母，下劃線：Syn2x5)：

當在李氏菌屬中表現時此轉譯成以下蛋白質序列(SEQ ID NO：46)(大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：藉由限制位點增加之殘基；大寫字母，下劃線：Syn2x5)：

與Syn18之5個複本的融合得到以下序列(SEQ ID NO：47)(小寫字母，無下劃線：actA啟動子；大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：限制位點；大寫字母，下劃線：Syn18x5)：

當在李氏菌屬中表現時此轉譯成以下蛋白質序列(SEQ ID NO：48)(大寫字母，粗體：ActAN100*序列；小寫字母，下劃線：藉由限制位點增加之殘基；大寫字母，下劃線：Syn18x5)：

或者，抗原序列較佳表現為融合至單核球增多性李氏菌LLO蛋白質之經修飾之胺基末端部分，該蛋白質允許在接種宿主內融合蛋白自細菌表現及分泌。在此等實施例中，抗原構築體可為包含啟動子可操作地連接至編碼融合蛋白之核酸序列之聚核苷酸，其中融合蛋白包含(a)經修飾之LLO及(b)一或多個在經修飾之LLO序列後之將表現為融合蛋白的抗原決定基。LLO信號序列為MKKIMLVFIT LILVSLPIAQ QTEAK(SEQ ID NO：39)。在一些實施例中，啟動子為hly啟動子。在一些實施例中，融合蛋白包含(c)強化子胺基酸序列之一或多個複本，各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：37，或與其具有至少90%一致性或同源性之序列，或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列。

在一些實施例中，經修飾之LLO包含LLO之約開始441個胺基酸之修飾形式，本文中稱為LLO-N441。LLO-N441具有以下序列(SEQ ID NO：40)：

在此序列中，PEST基元(KENSISSMAPPASPPASPK，SEQ ID NO：67)可藉由用以下序列置換而在功能上缺失(破折號指示缺失且粗體字指示取代)：KE-----------------，或其完全缺失。此僅僅意欲示例性的。

因為由一種生物體編碼之序列不一定針對在所選疫苗平台菌株中表現最佳而密碼子最佳化，因此本發明亦提供藉由針對由諸如單核球增多性李氏菌之細菌表現而密碼子最佳化進行改變的核酸。

在多個實施例中，為提供最佳密碼子，改變至少1%之任何非最佳密碼子，更正常改變至少5%，最正常改變至少10%，經常改變至少20%，更經常改變至少30%，最經常改變至少40%，一般改變至少50%，更一般改變至少60%，最一般改變至少70%，理想改變至少80%，更理想改變至少90%，最理想改變至少95%，且照慣例針對李氏菌屬表現，100%任何非最佳密碼子進行密碼子最佳化(表3)。

本發明供應許多李氏菌屬物種及菌株，用於製造或工程改造本發明之疫苗平台。本發明之李氏菌屬不受以下表中揭示之物種及菌株限制。

適用於本發明，例如適用作疫苗或核酸來源之李氏菌屬菌株

抗原靶向專門抗原呈遞細胞(APC)上之內吞受體亦代表一種提高疫苗效力之有吸引力的策略。此類靶向APC之疫苗具有將外源性蛋白質抗原指導至囊泡之卓越能力，有效加工抗原用於主要組織相容性複合物I類及II類呈遞。有效靶向不僅需要對在APC表面上大量表現之受體具有高特異性，而且能夠快速內化且負載至含有抗原加工機制元件之隔室內。在此等實施例中，本發明之抗原呈包括免疫原性多肽及所需內吞靶向受體部分之融合構築體形式提供。合適APC內吞受體包括DEC-205、甘露糖受體、CLEC9、Fc受體。此清單不意謂限制性的。靶向受體部分可與抗原多肽藉由重組或使用化學交聯來偶合。

4. 治療組合物

本文所述之組合物，例如經工程改造以表現如本文中描述之融合蛋白為疫苗或癌症免疫治療劑的細菌，可單獨或與醫藥學上可接受之賦形劑組合以足夠誘發適當免疫反應之量投與宿主。免疫反應可包含(不限於)特異性免疫反應、非特異性免疫反應、特異性免疫反應與非特異性免疫反應、先天反應、初級免疫反應、適應性免疫、次級免疫反應、記憶免疫反應、免疫細胞活化、免疫細胞增殖、免疫細胞分化及細胞介素表現。本發明之疫苗或癌症免疫治療劑可儲存，例如冷凍、凍乾、呈懸浮液、呈細胞漿液或與固體基質或凝膠基質複合。

在某些實施例中，在向個體投與有效劑量之含有本發明之免疫原性融合蛋白的疫苗以引發免疫反應之前或之後，投與第二疫苗。此在本領域中稱為「引發-加強」方案，亦即其中第一次投與之疫苗引發免疫反應，且第二次投與之疫苗加強反應。在此類方案中，本發明之組合物及方法可用作「引發」遞送、「加強」遞送或「引發」遞送與「加強」遞送。

舉例而言，由編碼及表現抗原多肽之殺死但在代謝上活性之李氏菌屬構成的第一疫苗可作為「引發」遞送，且由編碼抗原多肽之減毒(活或殺死但在代謝上活性)李氏菌屬構成的第二疫苗可作為「加強」遞送。然而，應瞭解每次引發及加強無需均利用本發明之方法及組合物。更確切些，本發明涵蓋其他疫苗模態與本發明之細菌疫苗方法及組合物一起使用。以下為合適混合引發-加強方案之實例：DNA(例如質體)疫苗引發/細菌疫苗加強；病毒疫苗引發/細菌疫苗加強；蛋白質疫苗引發/細菌疫苗加強；DNA引發/細菌疫苗加強加蛋白質疫苗加強；細菌疫苗引發/DNA疫苗加強；細菌疫苗引發/病毒疫苗加強；細菌疫苗引發/蛋白質疫苗加強；細菌疫苗引發/細菌疫苗加強加蛋白質疫苗加強等等。此清單不意謂限制性的。

引發疫苗及加強疫苗可藉由相同途徑或藉由不同途徑投與。術語「不同途徑」涵蓋(但不限於)身體上之不同部位，例如經口、非經口、經腸、非經腸、經直腸、結節內(淋巴結)、靜脈內、動脈、皮下、肌肉內、腫瘤內、腫瘤周圍、輸注、黏膜、鼻、腦脊髓間隔或腦脊髓液中等等的部位，以及藉由不同方式，例如經口、靜脈內及肌肉內。

有效量之引發或加強疫苗可以一劑給與，但不侷限於一劑。因此，投與可為二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次投與疫苗。在本發明之方法中疫苗或多種疫苗投與超過一次的情況下，投與可間隔一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、六分鐘、七分鐘、八分鐘、九分鐘、十分鐘或更多分鐘之時間間隔，約一小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、六小時、七小時、八小時、九小時、十小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時之間隔等等。在小時之背景下，術語「約」意謂加或減30分鐘內之任何時間間隔。投與亦可間隔一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其組合之時間間隔。本發明不限於時間間隔相等之給藥間隔，亦涵蓋非相等間隔之給藥，諸如由在1天、4天、7天及25天投與組成之引發時程，僅僅舉出非限制性實例。

在某些實施例中，加強接種疫苗之投與可在開始引發接種疫苗後約5天開始；在開始引發接種疫苗後約10天開始；在開始引發接種疫苗之投與後約15天、約20天、約25天、約30天、約35天、約40天、約45天、約50天、約 55天、約60天、約65天、約70天、約75天、約80天、約6個月及約1年開始。引發及加強接種疫苗中之一者或兩者較佳包含遞送本發明之組合物。

「醫藥學上可接受之賦形劑」或「診斷學上可接受之賦形劑」包括(但不限於)無菌蒸餾水、鹽水、磷酸鹽緩衝溶液、基於胺基酸之緩衝液或碳酸氫鹽緩衝溶液。所選賦形劑及所用賦形劑之量將視投與模式而定。投與可為經口、靜脈內、皮下、經皮、皮內、肌肉內、黏膜、非經腸、器官內、損害內、鼻內、吸入、眼內、肌肉內、血管內、結節內、皮上劃痕、經直腸、腹膜內或多種熟知投藥途徑之任一種或組合。投與可包含注射、輸注或其組合。在一較佳實施例中，投與為靜脈內投與。

藉由非經口途徑投與本發明之疫苗及癌症免疫治療劑可避免耐受性。本領域中已知用於靜脈內、皮下、肌肉內、腹膜內、經口、黏膜、經由尿路、經由生殖道、經由胃腸道或藉由吸入投與的方法。

對於特定患者而言有效量可視諸如所治療之病狀、患者整體健康、投與途徑及劑量以及副作用嚴重程度之因素而變。可獲得關於治療及診斷方法之指南(參見例如Maynard等人(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。

本發明之細菌可以一劑或多劑投與，其中各劑包含至少每公斤體重100個細菌細胞或更多；在某些實施例中，每公斤體重1000個細菌細胞或更多；正常每公斤體重至少10,000個細胞；更正常至少100,000個細胞；最正常至少一百萬個細胞；經常至少一千萬個細胞；更經常至少1億個細胞；通常至少十億個細胞；一般至少100億個細胞；照慣例至少1000億個細胞；及有時至少1萬億個細胞。本發明提供以上劑量，其中細菌投與單位為菌落形成單位(CFU)，在補骨脂素處理前之CFU當量，或其中單位為細菌細胞數目。

本發明之細菌可以一劑或多劑投與，其中各劑量包含介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)10⁷與2×10¹⁵CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)10⁷與10¹¹CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)10⁸與10¹⁰CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)10⁷與10⁸CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)2×10⁷與2×10⁸CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)5×10⁷與5×10⁸CFU之間；介於每70kg體重(或每1.7平方米表面積；或每1.5kg肝重)10⁸與10⁹CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10⁸與2×10⁹CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)5×10⁸至5×10⁹CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)10⁹與10¹⁰CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10⁹與2×10¹⁰CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)5×10⁹與5×10¹⁰CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)10¹¹與10¹²CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10¹¹與2×10¹²CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)5×10¹¹與5×10¹²CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積)10¹²與10¹³CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10¹²與2×10¹³CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)5×10¹²與5×10¹³CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)10¹³與10¹⁴CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10¹³與2×10¹⁴CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)5×10¹³與5×10¹⁴CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)10¹⁴與10¹⁵CFU之間；介於每70kg(或每1.7平方米表面積或每1.5kg肝重)2×10¹⁴與2×10¹⁵CFU之間等等，濕重。

亦提供一或多個以上劑量，其中劑量經由每天注射一次、每兩天注射一次、每三天注射一次、每四天注射一次、每五天注射一次、每六天注射一次或每七天注射一次，其中注射時程維持例如僅僅一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、兩週、三週、四週、五週或更長時間。本發明亦涵蓋以上劑量與時程之組合，例如相對較大之初始細菌劑量後面為相對較小之後續劑量，或相對較小之初始劑量後面為大劑量。

本發明可利用例如一次/週、兩次/週、三次/週、四次/週、五次/週、六次/週、七次/週、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次及其類似時程之給藥時程。給藥時程涵蓋歷時例如一週、兩週、三週、四週、五週、六週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月及十二個月之總時段的給藥。

提供以上給藥時程之循環。循環可約例如每七天、每14天、每21天、每28天、每35天、42天、每49天、每56天、每63天、每70天重複及其類似循環。非給藥間隔可存在於循環之間，其中間隔可為約例如七天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天重複及其類似循環。在此背景下，術語「約」意謂加或減一天、加或減兩天、加或減三天、加或減四天、加或減五天、加或減六天或者加或減七天。

本發明涵蓋一種投與細菌，例如李氏菌屬之方法，該方法係經口。亦提供一種投與李氏菌屬之方法，該方法係經靜脈內。此外，提供一種投與李氏菌屬之方法，該方法係經口、肌肉內、靜脈內、皮內及/或皮下。本發明供應李氏菌屬細菌或李氏菌屬細菌之培養物或懸浮液，其藉由在基於肉或含有來源於肉或動物產品之多肽的培養基中生長來製備。本發明亦供應李氏菌屬細菌或李氏菌屬細菌之培養物或懸浮液，其藉由在不含肉或動物產品之培養基中生長來製備，藉由在含有植物多肽之培養基上生長來製備，藉由在不基於酵母產品之培養基上生長來製備，或藉由在含有酵母多肽之培養基上生長來製備。

與額外治療劑共同投與之方法為本領域中所熟知(Hardman等人(編輯)(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,NY；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner及Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA)。

亦可使用有益於引起細胞溶解T細胞反應之額外試劑。此類試劑在本文中稱為載劑。此等包括(不限於)B7共刺激分子、介白素-2、干擾素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗劑、OX-40/OX-40配位體、CD40/CD40配位體、沙莫司亭(sargramostim)、左旋咪唑、牛痘病毒、卡介苗(BCG)、脂質體、明礬、弗氏完全或不完全佐劑、解毒內毒素、礦物油、表面活性物質(諸如脂質卵磷脂(lipolecithin))、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽及油或碳氫化合物乳液。用於誘發優先於抗體反應刺激細胞溶解T細胞反應之T細胞免疫反應的載劑為較佳，不過亦可使用刺激兩種類型反應之載劑。在試劑為多肽之情況下，可投與多肽本身或編碼多肽之聚核苷酸。載劑可為細胞，諸如抗原呈遞細胞(APC)或樹突狀細胞。抗原呈遞細胞包括諸如巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞之細胞類型。其他專門抗原呈遞細胞包括單核細胞、邊緣區庫柏法細胞、小神經膠質細胞、郎格罕氏細胞、交錯樹突狀細胞、卵泡樹突狀細胞及T細胞。亦可使用兼性抗原呈遞細胞。兼性抗原呈遞細胞之實例包括星形細胞、濾泡細胞、內皮及纖維母細胞。載劑可為經轉型以表現多肽或遞送後來在接種個體之細胞中表現之聚核苷酸的細菌細胞。可添加諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之助劑以增加疫苗觸發、提高或延長免疫反應之能力。如下額外物質亦為潛在助劑：細胞介素、趨化介素及細菌核酸序列，如CpG、toll樣受體(TLR)9促效劑以及針對TLR 2、TLR 4、TLR 5、TLR 7、TLR 8、TLR9之額外促效劑，包括脂蛋白、LPS、單磷醯基脂質A、脂胞壁酸、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)及其他類似免疫調節劑，其可分開或與所述組合物組合使用。佐劑之其他典型實例包括合成佐劑QS-21，其包含自皂樹皮樹之樹皮純化之均質皂角苷及小棒狀桿菌(McCune等人，Cancer,1979；43：1619)。應瞭解佐劑進行最佳化。換言之，熟練技術人員可進行常規實驗以確定使用之最佳佐劑。

在本發明之一個實施例中，本發明之細菌結合一或多種選自由以下組成之群的額外醫藥活性組分投與：免疫檢查點抑制劑(例如CTLA-4、PD-1、Tim-3、Vista、BTLA、LAG-3及TIGIT路徑拮抗劑；PD-1路徑阻斷劑；PD-L1抑制劑；包括(不限於)抗PD-1抗體納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)或皮利珠單抗(pidilizumab)；PD-1抑制劑AMP-224；抗CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)；及抗PD-L1抗體BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736或阿維單抗(avelumab))；TLR促效劑(例如CpG或單磷脂醯基脂質A)；誘發先天免疫之失活或減毒細菌(例如失活或減毒單核球增多性李氏菌)；經由Toll樣受體(TLR)、經由(NOD)樣受體(NLR)、經由基於視黃酸可誘導基因(RIG)之I樣受體(RLR)、經由C型凝集素受體(CLR)或經由病原體相關分子模式(PAMP)介導先天免疫活化之組合物；及化學治療劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑選自由以下組成之群：CTLA-4路徑拮抗劑、PD-1路徑拮抗劑、Tim-3路徑拮抗劑、Vista路徑拮抗劑、BTLA路徑拮抗劑、LAG-3路徑拮抗劑及TIGIT路徑拮抗劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗BTLA抗體、抗B7-H3抗體、抗CD70抗體、抗CD40抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、抗OX40抗體、抗KIR抗體或抗LAG-3抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑選自由以下組成之群：納武單抗、派姆單抗、皮利珠單抗、PDR001、MEDI0680、REGN2810、AMP-224、伊匹單抗、BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736及阿維單抗。在一些實施例中，TLR促效劑為CpG或單磷醯基脂質A。

在本發明之一個實施例中，本發明之細菌結合STING促效劑投與。此投與可分開，或可較佳作為單一醫藥組合物之一部分。環狀二核苷酸(CDN)環狀二AMP(藉由單核球增多性李氏菌及其他細菌產生)及其類似環狀二GMP及環狀-GMP-AMP由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP)，其結合於稱為干擾素基因刺激因子(STING)之病原體識別受體(PRR)。STING為宿主哺乳動物細胞之細胞質中活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB信號傳導軸，從而誘發強烈活化先天免疫之IFN-β及其他基因產物的銜接蛋白。現在認識到STING為宿主細胞溶質監督路徑之組分(Vance等人，2009)，其感測胞內病原體之感染且反應，誘發IFN-β產生，從而發展由抗原特異性CD4⁺及CD8⁺ T細胞以及病原體特異性抗體組成的適應性保護性病原體特異性免疫反應。環狀嘌呤二核苷酸之實例相當詳細地描述於例如美國專利7,709458及7,592,326；專利申請案WO2007/054279、WO2014/093936及WO2014/189805；以及Yan等人，Bioorg.Med.Chem Lett.18：5631(2008)中。

在本發明之一個實施例中，本發明之細菌結合選自由以下組成之群的一或多種免疫檢查點抑制劑投與：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗BTLA抗體、抗B7-H3抗體、抗CD70抗體、抗CD40抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、抗OX40抗體、抗KIR抗體或抗LAG-3抗體。在一些實施例中，本發明之細菌結合抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體投與。

治療劑之有效量為減少或改善症狀正常至少10%、更正常至少20%、最正常至少30%、通常至少40%、更通常至少50%、最通常至少60%、經常至少70%、更經常至少80%及最經常至少90%、照慣例至少95%、更照慣例至少99%及最照慣例至少99.9%的量。

本發明之試劑及方法提供一種疫苗，其僅僅包含一次接種疫苗；或包含第一次接種疫苗；或包含至少一次加強接種疫苗；至少兩次加強接種疫苗；或至少三次加強接種疫苗。可利用關於加強接種疫苗之指南。參見例如Marth(1997)Biologicals 25：199-203；Ramsay等人(1997)Immunol.Cell Biol.75：382-388；Gherardi等人(2001)Histol.Histopathol.16：655-667；Leroux-Roels等人(2001)ActA Clin.Belg.56：209-219；Greiner等人(2002)Cancer Res.62：6944-6951；Smith等人(2003)J.Med.Virol.70：增刊1：S38-S41；Sepulveda-Amor等人(2002)Vaccine 20：2790-2795)。

可藉由與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合，將治療劑之調配物製備成例如凍乾粉劑、漿液、水溶液或懸浮液形式，進行儲存(參見例如Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(編輯)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

「疫苗」涵蓋預防性疫苗。疫苗亦涵蓋治療性疫苗，例如向包含與疫苗所提供之抗原或抗原決定基有關之病狀或病症的哺乳動物投與之疫苗。已研發許多細菌物種用作疫苗，且該等細菌物種可用於本發明中，包括(但不限於)福氏痢疾桿菌、大腸桿菌、單核球增多性李氏菌、小腸結腸炎耶氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌或分枝桿菌屬物種。此清單不意謂限制性的。參見例如WO04/006837；WO04/084936；WO04/110481；WO05/037233；WO05/092372；WO06/036550；WO08/109155；WO08/130551；WO08/140812；WO09/143085；WO09/143167；WO10/040135；WO11/060260；WO07/103225；WO07/117371；及WO14/074635，其各自特此以全文引用的方式併入，包括所有表、圖及申請專利範圍。用於疫苗組合物中之細菌載體可為兼性胞內細菌載體。細菌可用於在宿主生物體中將本文中描述之多肽遞送至抗原呈遞細胞。如本文中描述，單核球增多性李氏菌為表現本發明之抗原提供較佳疫苗平台。

實例

以下實例用於闡明本發明。此等實例絕不意欲限制本發明之範疇。

實例1：實例中使用之通用方法

所有合成表現/分泌強化子都在稱為ActAN100*之李氏菌屬蛋白質ActA之經修飾胺基末端結構域下游且在ActA啟動子控制下經工程改造成轉譯融合物。合成此等全長(五個複本)啟動子-強化子序列且針對在李氏菌屬中表現，藉由DNA2.0(Menlo Park,CA)進行密碼子最佳化。使用標準基於限制酶之選殖方法，將此等全長前導序列次選殖至pPL2穿梭載體之衍生物中，與一組以前證實序列之抗原形成轉譯融合物；IglC、PAP(33-386)、間皮素(35-622)、間皮素(35-609)及兩個HBV抗原Pol(1-300)與X-Ag之融合物。在XL1-Blue細胞(Agilent,Santa Clara,CA)中，使用T4 DNA連接酶(NEB,Ipswich,MA)進行初始選殖步驟。pINT載體允許自大腸桿菌菌株SM10(自製感受態細胞，Zymo Research，Irvine CA)結合至李氏菌屬，且促進在tRNA ^Arg基因座進行位點特異性整合。在李氏菌屬疫苗菌株Lm11(△actA△inlB)中評估所有強化子。對於具有較少複本之強化子，PCR用於擴增適當長度產物(Phusion聚合酶，NEB，Ipswich MA)。經由純化管柱(Qiagen,Germantown,MD)淨化PCR產物，使用限制酶及證實之序列選殖。對表現/分泌及免疫原性進行評估之所有菌株均展示於表1中。

西方墨點法

自甘油儲液接種之李氏菌屬菌株的隔夜培養物(1ml)在腦心浸液培養液(BD)中在30℃下生長，不震盪。DC2.4細胞儲存在液氮中含10% DMSO之胎牛血清(FBS)中。在感染前一天，將DC2.4細胞(每小瓶4×10⁶個細胞)解凍，用不含抗生素之完全RPMI培養基(RPMI、10% FBS、非必需胺基酸、L-麩胺醯胺、丙酮酸鈉、HEPES緩衝液及2-巰基乙醇)沖洗一次，再懸浮於相同培養基中，以每孔1.5×10⁵個細胞接種於24孔盤中，且在37℃(5% CO₂)下培育隔夜。

上述隔夜細菌培養物在不含抗生素之完全RPMI培養基中1：200(5μl於1ml中)稀釋，且藉由重複吸移充分混合。將培養基自前一天塗鋪之DC2.4細胞吸出，且隔夜培養稀釋液(300μl；3×10⁶個細菌)用於感染含有DC2.4細胞之個別孔(感染複數為20)。使感染在37℃(5% CO₂)下進行1小時，藉由抽吸移除上清液，孔用PBS(2ml)沖洗一次，且添加含有50μg/ml慶大黴素之完全RPMI培養基(2ml)。感染在37℃(5% CO₂)下又培育七小時。

對於用於以下實例中之西方點墨法，除非另外指示，否則藉由抽吸移除培養基且細胞用PBS(1ml)洗滌且藉由添加溶解緩衝液(100μl具有還原劑之1X LDS緩衝液；Life Technologies)及物理破環來收集。將溶解產物轉移至1.5ml管中，在95℃下培育10分鐘，渦旋，且儲存在-20℃下。對於基於培養液之西方墨點分析，如以下實例中所指示，李氏菌屬菌株之隔夜培養物(1ml)在酵母培養基(YNG)培養液中在37℃下在約200rpm震盪下生長隔夜。接著藉由對細菌離心來分離培養基。將培養基之等分試樣(50μl)轉移至另一管中，且添加4X負載染料(20μl；Novex)且添加10X還原劑(8μl；Novex)。將樣品在95℃下培育10分鐘，渦旋，且儲存在-20℃下。

等分試樣(20μl)在4-12% Bis-Tris PAGE凝膠上在1X MES緩衝液(Invitrogen)中跑動且轉移至0.45μm硝化纖維膜以進行偵測。膜在Odyssey阻斷緩衝液(Li-Cor)中在室溫下阻斷1小時。使用識別與各抗原之N末端融合的ActA蛋白質之成熟18個胺基酸胺基末端的A18K多株兔抗體(1：4,000稀釋)來偵測異種抗原。關於每個樣品負載之細菌數目，組成性表現之李氏菌屬p60蛋白質用作對照物，且使用小鼠單株p60抗體(1：4,000；AdipoGen Life Sciences)偵測。使用1：10,000稀釋的區別標記之山羊抗小鼠及山羊抗兔(分別為IRDyes 800CW及680RD；Odyssey)二級抗體。所有抗體均在具有0.2% Tween之Odyssey阻斷緩衝液中稀釋。膜與初級抗體一起在4℃下培育隔夜，用含有0.1% Tween之PBS洗滌三次，每次洗滌歷時五分鐘，接著與二級抗體一起在室溫下培育1小時。將膜再洗滌四次，最後一次僅僅用PBS洗滌，接著使用Li-Cor Odyssey系統掃描。

用Li-Cor Image Studio軟體定量西方墨點。將個別抗原或p60亮帶在代表適當信號之影像(亦即對於ActAN100*或p60，分別680nm或800nm波長掃描)上成盒，且測定各盒內之總強度。強度量測值輸出至Excel，其中計算ActAN100*強度與p60強度之比率。

免疫原性實驗

使細菌培養物在YNG培養基中在37℃下震盪生長隔夜至平穩期。次日，培養物在無菌HBSS中稀釋至約2.5×10⁷CFU/mL之濃度。6-8週齡Balb/c小鼠(n=5)藉由在側尾靜脈中靜脈注射200μL體積，接受如以下實例中指示之近似劑量(例如5×10⁶CFU)。免疫接種後七天，收穫脾，且製備單細胞懸浮液以藉由IFNγ ELISpot分析進行T細胞分析。每孔4×10⁵個脾細胞用PAP肽匯集物或僅用培養基(未受刺激對照物)刺激隔夜，該PAP肽匯集物由94種重疊11個胺基酸之15聚體肽構成。次日，藉由IFNγ ELISpot定量PAP特異性T細胞反應，且使用GraphPad Prism進行雙尾未配對t檢驗分析，確定統計顯著性，其中P<0.05。類似分析用於評估表現HBV Pol_1-300-HBxAg之菌株之免疫原性，在用HBV-Pol_140-148刺激下，藉由IFNγ ELISpot評估HBV-Pol_140-148特異性T細胞反應。

所用序列

EGFRvIII序列之單一重複單元及其合成syn1、syn2及syn18修飾用於以下實例中。下劃線為用作EGFRvIII序列中控制序列之完整EGFRvIII重複單元及syn1、syn2及syn18中之剩餘部分。EGFRvIII新抗原HLA-A2限制之T細胞抗原決定基以粗體展示。Syn1改變跨越整個EGFRvIII T細胞抗原決定基之重複單元中21個胺基酸中之13個。Syn2缺失基礎重複單元中之相同13個胺基酸(描繪成破折號)。Syn18改變重複單元中21個胺基酸中之15個。變異體旨在避免與人類基因組中任何蛋白質之顯著同源性，如BLASTp搜尋所確定。此等序列中包括胺基末端(ASKVL)(SEQ ID NO：5)及羧基末端(ADGSVK)(SEQ ID NO：2)蛋白酶體裂解序列(斜體字)。

EGFRvIII ASKVL PASRALEEKKGNYVVTDHGSC ADGSVK(SEQ ID NO：17)

syn1 ASKVL PASRAVDDHHAQFLLSEKGSC ADGSVK(SEQ ID NO：29)

syn2 ASKVL PASRA-------------_GSCADGSVK(SEQ ID NO：30)

syn18 ASKVLESNQSVEDKHNEFMLTEYGSC ADGSVK(SEQ ID NO：31)

「5複本」Syn1(SEQ ID NO：33)、Syn 2(SEQ ID NO：34)及Syn18(SEQ ID NO：35)序列與5複本EGFRvIII構築體(SEQ ID NO：32)之比對：

實例2：EGFRvIII、Syn1、Syn2及Syn18表現強化子序列對PAP表現之作用

如以下實例中所示，當與EGFRvIII、syn1及syn18表現強化子序列融合時，癌症抗原修復性酸性磷酸酶(PAP)之表現顯著增強。

測試以下構築體。如圖1所示，ActAN100*(SEQ ID NO：28，黑色所示)與四種不同重複單元之五複本同框融合，後面為人類PAP之殘基33-386。

BH2869：無強化子序列

BH4703：5x EGFRvIII(積木圖案)

BH5144：5x syn1(對角交叉影線)

BH5150：5x syn2(水平交叉影線)，

BH5337：5x syn18(棋盤圖案)

PAP_33-386核酸序列(SEQ ID NO：51)：

PAP_33-386蛋白質序列(SEQ ID NO：52)：

小鼠樹突狀細胞株DC2.4用Lm△actA/△inlB感染，其中融合蛋白插入染色體tRNA^Arg基因座中。七小時後，將細胞洗滌，溶解，在SDS-PAGE上跑動，且轉移至硝化纖維。西方墨點用針對ActA蛋白質之胺基末端培養之兔多株抗體探測，且表現水準相對於李氏菌屬P60蛋白質標準化，其與受感染細胞中之細菌數相關。研究與臨床菌株表現高水準之融合構築體。使用P60表現將表現標準化，其與受感染細胞中之細菌數相關。最低表現構築體之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。

圖2顯示融合蛋白表現之胞內西方墨點結果。在完整重複單元下融合蛋白表現之有效加強得到提高，且由於間隔子(裂解)序列而未顯著增強(參見泳道5，使用syn2之構築體)。由ActAN100*-syn18-PAP_33-386構成之融合蛋白產生最高蛋白質表現(泳道6，菌株BH5337)。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例3：EGFRvIII、Syn1、Syn2及Syn18強化子序列對IglC表現之作用

如以下實例中所示，當與EGFRvIII、syn1及syn18表現強化子序列融合時，來自土拉熱弗朗西絲氏菌之感染性疾病抗原IglC之表現亦得到增強。

用於實例2中之PAP序列未在ActAN100*融合系統中正常良好表現。本實例如實例2中進行；然而，IglC置換PAP，作為在ActAN100*融合系統中正常良好表現之抗原的表現增強測試。

IglC核酸序列(SEQ ID NO：49)：

IglC蛋白質序列(SEQ ID NO：50)：

ActAN100*與包括EGFRvIII、syn1、syn2、syn18之四種不同重複單元之五複本及來自土拉熱弗朗西絲氏菌之感染性疾病抗原IglC同框融合。圖3描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法。再次，由ActAN100*-syn18-IglC構成之融合蛋白產生最高蛋白質表現(泳道6，菌株BH5333)。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例4：強化子序列複本數對Syn1表現PAP之作用

當與PAP融合時，增加syn1重複單元之複本數逐步增加水準。本實例如實例2中進行；然而，syn1強化子序列之複本數在0至5之間變化。圖4示意性展示用於本實例之分子構築體。ActAN100*(黑色)與syn1(對角交叉影線)之零個、一個、兩個、三個、四個或五個複本及腫瘤抗原PAP_33-386同框融合。

圖5描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法。在未添加syn1重複單元之任何複本下，未偵測到PAP融合蛋白(泳道2)。在具有單syn1重複單元之構築體(BH5624，泳道3)與具有重複單元之5個複本之構築體(BH5144，泳道7)之間觀測到表現增加40倍。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例5：強化子序列複本數對Syn18表現PAP之作用

當與PAP融合時，增加syn18重複單元之複本數逐步增加水準。本實例如實例2中進行；然而，syn18強化子序列之複本數在0至5之間變化。圖6示意性展示用於本實例之分子構築體。ActAN100*(黑色)與syn18(棋盤圖案)之零個、一個、兩個、三個、四個或五個複本及腫瘤抗原PAP_33-386同框融合。

圖7描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法。在未添加syn18重複單元之任何複本下，偵測到低水準PAP融合蛋白(泳道2)。在無syn18重複單元之構築體(BH2869，泳道2)與具有重複單元之5個複本之構築體(BH5337，泳道7)之間觀測到表現增加82倍。在具有單個syn18重複單元之構築體(BH5632，泳道3)與具有重複單元之5個複本之構築體(BH5337，泳道7)之間觀測到表現增加51倍。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例6：強化子序列複本數對Syn1及Syn18表現HBV聚合酶-HBxAg雙抗原融合物之作用

當與PAP融合時，增加syn1重複單元之複本數逐步增加水準。本實例如實例2中進行。圖8示意性展示用於本實例之分子構築體。ActAN100*(黑色)與EGFRvIII(積木圖案)同框融合及與syn1(對角交叉影線圖案)或syn18(棋盤圖案)之五個複本及HBV聚合酶-HBxAg雙抗原同框融合，各抗原來自B型肝炎病毒。

具有C端SL8肽之HBV pol_1-300-HBxAg雙抗原核酸序列(SEQ ID NQ：53)：

具有C端SL8肽之HBV Pol_1-300-HBxAg雙抗原蛋白質序列(SEQ ID NO：54)：

圖9描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法。由ActAN100*-Syn18x5-Pol-HBxAg構成之融合蛋白與無合成表現強化子(泳道7，菌株BH5695)相比，使表現增加近500倍。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例7：強化子序列複本數對PAP免疫原性之作用

雌性B10.Br小鼠(每組n=5)靜脈內接種5×10⁶cfu BH2869(僅ActAN100-PAP)、BH4703(ActAN100*-EGFRvIIIx5-PAP)、BH5144(ActAN100*-Syn1x5-PAP)及BH5337(ActAN100*-Syn18x5-PAP)(根據圖1中之圖)。7天後藉由胞內細胞介素染色(ELISPOT)測定PAP特異性T細胞反應，且在圖10中描繪成每個脾IFN-γ陽性PAP特異性CD8+ T細胞之絕對數目。結果表示為每4×10⁵個細胞之平均斑點形成細胞(SFC)。最高PAP特異性免疫原性由具有最高表現之菌株誘發，其中BH5337誘發最高PAP特異性免疫反應。

實例8：強化子序列複本數對HBV-Pol免疫原性之作用

雌性小鼠(每組n=5)靜脈內接種1×10⁶cfu BH5687(ActAN100*-HBV Pol_1-300-HBxAg)、BH5689(ActAN100*-syn1x1-HBV Pol_1-300-HBxAg)、BH5691(ActAN100*-syn1x5-HBV Pol_1-300-HBxAg)、BH5693(ActAN100*-syn18x1-HBV Pol_1-300-HBxAg)及BH5695(ActAN100*-syn18x5-HBV Pol_1-300-HBxAg)(根據圖8中之圖)。7天後藉由胞內細胞介素染色(ELISPOT)測定HBV-Pol特異性T細胞反應，且在圖11中描繪成每個脾IFN-γ陽性PAP特異性CD8+ T細胞之絕對數目。結果表示為每4×10⁵個細胞之平均斑點形成細胞(SFC)。當與BH5687比較時，BH5689、BH5691及BH5695誘發統計上較高之免疫反應(且BH5693趨向於更高)。

實例9：強化子序列取向對Syn18及Syn1表現PAP之作用

syn18x5或syn1x5序列增強表現，不管其連接至抗原之胺基末端或是羧基末端。本實例如實例2中進行；然而，syn18x5或syn1x5強化子序列連接至PAP_33-386抗原序列之胺基末端或羧基末端。圖12示意性展示用於本實例之分子構築體。ActAN100*(黑色)與連接至腫瘤抗原PAP_33-386之胺基末端或羧基末端的syn18(棋盤圖案)或syn1(對角交叉影線圖案)之五個複本同框融合。

圖13描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法。對於syn18x5與syn1x5，以可比水準偵測到PAP融合蛋白，不管此等連接至PAP抗原之胺基末端(泳道2及4，CR782及CR789)或是連接至PAP抗原之羧基末端(泳道3及5，CR784及CR794)。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例10：強化子序列對Syn1x5及Syn18x5表現間皮素抗原融合物之作用

間皮素抗原隨syn18x5連接至間皮素_35-609之胺基末端或羧基末端及syn1x5連接至間皮素_35-609之胺基末端而增加。本實例如實例2中進行。圖14示意性展示用於本實例之分子構築體。ActAN100*(黑色)與間皮素_35-622抗原、連接至間皮素_35-622抗原之胺基末端的syn18(棋盤圖案)之五個複本或連接至腫瘤抗原間皮素_35-609之胺基末端或羧基末端的syn1(對角交叉影線圖案)或syn18之五個複本同框融合。

間皮素_35-622核酸序列(SEQ ID NO：55)：

間皮素_35-622蛋白質序列(SEQ ID NO：56)：

間皮素35-609核酸序列(SEQ ID NO：57)：

間皮素_35-609蛋白質序列(SEQ ID NO：58)：

圖15描繪融合蛋白表現之肉汁培養西方墨點法。由ActAN100*-Stn18x5-間皮素_35-622構成之融合蛋白的融合蛋白表現水準高於CRS-207對照構築體。由ActAN100*-Syn18x5-間皮素_35-622、ActAN100*-間皮素_35-622-Syn18x5或ActAN100*-Syn1x5-間皮素_35-609構成之融合蛋白的表現水平亦高於CRS-207對照。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.d.：未偵測出。此概述於以下表中：

實例11：強化子序列對大腸桿菌中FopC抗原之表現的作用

編碼有或無標籤之重組蛋白之質體轉變成T7表現勝任大腸桿菌(NEB)。蛋白質包括在羧基末端經6xHis標記且無胺基末端融合搭配物或在胺基末端具有SUMO標籤或syn18x5標籤的FopC。所得菌落用於接種具有抗生素的LB培養液(1ml)，且培養物在震盪下在37℃下培育，直至其達到約0.5之OD₆₀₀。藉由將培養物之等分試樣(100μl)離心來收集未誘發之樣品。添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)(0.5mM)，且培養物在震盪下在37℃下再培育兩小時。藉由將培養物之等分試樣(50μl)離心來收集誘發之樣品。未誘發與誘發之樣品再懸浮於溶解緩衝液(100μl具有還原劑之1X LDS緩衝液；Novex)中，在95℃下培育10分鐘，渦旋且儲存在-20℃下。

等分試樣(5μl)在4-12% Bis-Tris PAGE凝膠上在1X MES緩衝液(Invitrogen)中跑動且轉移至0.45μm硝化纖維膜以進行偵測。在轉移之後，膜在水中短暫沖洗，與REVERT總蛋白染劑一起培育5分鐘(5ml；Li-Cor)，用洗滌溶液短暫沖洗兩次，接著使用Li-Cor Odyssey系統掃描。在成像後，膜用水短暫沖洗，接著在室溫下在Odyssey阻斷緩衝液(Li-Cor)中阻斷1小時。使用多株抗polyHis抗體(1：4,000稀釋；Sigma #H1029)偵測6xHis標記之重組蛋白。山羊抗小鼠(IRDye 680RD；Odyssey)二級抗體以1：10,000稀釋使用。所有抗體均在具有0.2% Tween之Odyssey阻斷緩衝液中稀釋。膜與初級抗體一起在4℃下培育隔夜，用含有0.1% Tween之PBS洗滌三次，每次洗滌歷時五分鐘，接著與二級抗體一起在室溫下培育1小時。膜再洗滌四次，最後一次僅僅用PBS洗滌，接著使用Li-Cor Odyssey系統掃描。

用Li-Cor Image Studio軟體定量西方墨點。將個別含有His之亮帶在代表800nm信號之影像上成盒，且測定各盒內之總強度。未標記之fopC-6xHis核酸序列(SEQ ID NO：59)：

未標記之fopC-6xHis蛋白質序列(SEQ ID NO：60)：

SUMO fopC-6xHis核酸序列(SEQ ID NO：61)：

SUMO fopC-6xHis蛋白質序列(SEQ ID NO：62)：

Syn18x5 fopC-6xHis核酸序列(SEQ ID NO：63)：

Syn18x5 fopC-6xHis蛋白質序列(SEQ ID NO：64)：

syn18x5序列增強大腸桿菌中FopC抗原之表現。圖16示意性展示用於本實例之分子構築體。FopC在羧基末端用6xHis標籤(黑色)標記，且在無胺基末端融合搭配物下表現，或與SUMO(波形線)或者與syn18(棋盤圖案)同框融合。

圖17描繪融合蛋白表現之胞內西方墨點法，其中墨點之第二複本已經調整以允許目測泳道2中之未標記之FopC蛋白質。表現水準相對於總蛋白質墨點上之匹配亮帶(底部墨點)標準化。與FopC融合之Syn18x5之表現大於SUMO融合之FopC。此概述於以下表中：

實例12：李氏菌屬中連接至強化子序列之羧基或胺基末端之多個新抗原序列的表現

本實例類似於實例2中所述進行。製備構築體以在李氏菌屬中表現，其中融合蛋白包含ActAN100*、包含來自個體之9個分開的預測新抗原序列的多肽且有或無syn18 x 5強化子序列。此等構築體展示於圖18中，其中在呈現時，syn18x5序列介於ActAN100*序列與包含9個抗原序列之序列之間。各新抗原序列編號為1-9，且側接各新抗原之裂解序列表示為A(SEQ ID NO：7)、B(SEQ ID NO：14)、C(SEQ ID NO：76)、C2(SEQ ID NO：15)或D(SEQ ID NO：4)。在BH5998及BH6000中，各預測新抗原序列為最小肽，而在另外四種菌株中，各新抗原序列為包含各最小肽序列之25個胺基酸。菌株BH5990及BH6002包括裂解序列，而BH5992及BH6008在各新抗原序列之間缺乏裂解序列。在各構築體對內(有及無Syn18x5)，Syn18x5顯示表現比無強化子序列之菌株高。含有側接各新抗原之裂解序列之菌株顯示表現比無裂解序列之菌株高。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用；n.c.：未計算(分母為0)。此概述於以下表中：

製備額外構築體以在李氏菌屬中表現，其中融合蛋白包含連接至syn18 x 5強化子序列之ActAN100*，其連接至包含至多19個來自一名個體之分開的預測新抗原序列(BH6609-19新抗原、BH6619-16新抗原、BH6613-14新抗原、BH6615-12新抗原及BH6617-10新抗原)及9個來自另一個體之分開的預測新抗原序列(BH6035)的多肽。此等構築體展示在圖19中，其中各新抗原序列編號為1-19或1-9，其中裂解序列側接各新抗原，其中裂解序列表示為A(SEQ ID NO：7)、B(SEQ ID NO：14)、C(SEQ ID NO：76)、D(SEQ ID NO：4)、A2(SEQ ID NO：2)或D2(SEQ ID NO：75)。各新抗原序列為具有個體突變序列之預測新抗原，其中突變在25個胺基酸序列中間。表現與無融合蛋白構築體之李氏菌屬菌株相比，且證明包含多個抗原序列之多肽表現融合蛋白。最低表現構築體之基於ActA/p60比率之相對表現任意設定在1；n.a.：不適用。此概述於以下表中：

本領域技術人員容易瞭解，本發明非常適合實現目標且獲得所提及之目標及優點，以及其中固有之目標及優點。本文中提供之實例代表較佳實施例，為示例性的，且不意欲限制本發明之範疇。

本領域技術人員將顯而易見在不脫離本發明之範疇及精神下可對本文中揭示之本發明進行不同取代及修改。

在說明書中提及之所有專利及公開案均指示本發明所屬領域之一般技術者的水準。所有專利及公開案均以引用的方式併入本文中，引用程度如同各個別公開案特定且個別地指示以引用的方式併入一般。

本文中例示性描述之本發明適合在缺乏本文中未特定揭示之任何要素、限制下實施。因此，舉例而言，在本文中之各情況下，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中之任一個可替換為另外兩個術語中的任一個。已採用之術語及表述用作描述而非限制之術語，且不意欲在使用此類術語及表述時排除所示及所述特徵或其部分之任何等效內容，而是認識到在申請之本發明的範疇內可進行多種修改。因此，應瞭解雖然已藉由較佳實施例及任選特徵特定揭示本發明，但本領域技術人員可採取本文中揭示之概念的修改及變化，且此類修改及變化視為在如隨附申請專利範圍所界定之本發明之範疇內。

在以下申請專利範圍內闡明其他實施例。

<110> 美商艾杜諾生物科技公司勞爾彼得 M韓森威廉 G

<120> 蛋白質表現強化子序列及其用途

<130> ADR-1009

<150> US 62/369,663

<151> 2016-08-01

<150> US 62/373,297

<151> 2016-08-10

<160> 77

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

<210> 16

<400> 16 000

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 18

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 乳酸乳球菌

<400> 19

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 炭疽桿菌

<400> 20

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 21

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 22

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 炭疽桿菌

<400> 23

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> 金黃色葡萄球菌

<400> 24

<210> 25

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

<210> 26

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

<210> 27

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

<210> 28

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

<210> 29

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

<210> 31

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

<210> 32

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

<210> 33

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

<210> 34

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

<210> 35

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

<210> 36

<211> 485

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

<210> 39

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

<210> 40

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

<210> 41

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

<210> 42

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

<210> 43

<211> 971

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

<210> 44

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

<210> 45

<211> 776

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

<210> 46

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

<210> 47

<211> 971

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

<210> 48

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

<210> 49

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

<210> 50

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

<210> 51

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

<210> 52

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

<210> 53

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

<210> 54

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

<210> 55

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 55

<210> 56

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 56

<210> 57

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 57

<210> 58

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 58

<210> 59

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

<210> 60

<211> 533

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

<210> 61

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 61

<210> 62

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 62

<210> 63

<211> 2154

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 63

<210> 64

<211> 717

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 64

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 65

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 枯草桿菌

<400> 66

<210> 67

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 67

<210> 68

<400> 68 000

<210> 69

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 69

<210> 70

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 70

<210> 71

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 71

<210> 72

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 72

<210> 73

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 73

<210> 74

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 74

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 75

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 76

<210> 77

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 77

Claims

一種編碼融合蛋白之核酸分子，其中該融合蛋白包含(i)第一胺基酸序列，該第一胺基酸序列包含強化子胺基酸序列之一或多個複本，各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列及SEQ ID NO：37或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列；及(ii)編碼所關注之多肽之第二胺基酸序列，該第二胺基酸序列連接至該第一胺基酸序列之胺基末端或羧基末端。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，該核酸分子進一步包含一或多個介導宿主細胞中該融合蛋白之表現及視情況分泌的調控元件。
如申請專利範圍第2項之核酸分子，其中該調控元件包含單核球增多性李氏菌( Listeria monocytogenes) actA啟動子。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該所關注之多肽包含腫瘤抗原。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該第一胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解胺基酸序列係經獨立地選擇且連接至該一或多個強化子胺基酸序列中之至少一個。
如申請專利範圍第5項之核酸分子，其中各強化子胺基酸序列在其胺基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列且在其羧基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列。
如申請專利範圍第6項之核酸分子，其中該第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：1之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本或SEQ ID NO：37之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。
如申請專利範圍第7項之核酸分子，其中連接至強化子胺基酸序列之各裂解胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該第一胺基酸序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：33。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該第一胺基酸序列為SEQ ID NO：35。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之核酸分子，其中該第二胺基酸序列包含一或多個獨立抗原序列。
如申請專利範圍第11項之核酸分子，其中該第二胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解胺基酸序列係經獨立地選擇且連接至該一或多個抗原序列中之至少一個。
如申請專利範圍第12項之核酸分子，其中各獨立抗原序列在其胺基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列且在其羧基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列。
如申請專利範圍第13項之核酸分子，其中連接至抗原序列之各裂解胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之核酸分子，其中該融合蛋白包含分泌信號序列。
如申請專利範圍第15項之核酸分子，其中該分泌信號序列之羧基末端連接至該第一胺基酸序列之胺基末端，且該第一胺基酸序列之羧基末端連接至該第二胺基酸序列之胺基末端。
如申請專利範圍第15項之核酸分子，其中該分泌信號序列之羧基末端連接至該第二胺基酸序列之胺基末端，且該第二胺基酸序列之羧基末端連接至該第一胺基酸序列之胺基末端。
如申請專利範圍第16項之核酸分子，其中該分泌信號序列為單核球增多性李氏菌分泌信號序列。
如申請專利範圍第18項之核酸分子，其中該分泌信號序列為ActA或LLO分泌信號序列。
如申請專利範圍第19項之核酸分子，其中該ActA信號序列由選自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28組成之群的序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列編碼，或該LLO信號序列由選自由SEQ ID NO：40、序列SEQ ID NO：67缺失之SEQ ID NO：40及序列SEQ ID NO：67替換為KE之SEQ ID NO： 40組成之群的序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列編碼。
如申請專利範圍第19項之核酸分子，其中該分泌信號序列為SEQ ID NO：28，或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
一種宿主細胞，其包含整合至該宿主細胞之基因組中的如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之核酸分子，其中該宿主細胞表現該融合蛋白。
如申請專利範圍第22項之宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌。
如申請專利範圍第23項之宿主細胞，其中該細菌為單核球增多性李氏菌。
如申請專利範圍第24項之宿主細胞，其中該核酸分子整合至單核球增多性李氏菌之致病性基因中，其中該核酸分子之整合破壞該致病性基因之表現或破壞該致病性基因之編碼序列。
如申請專利範圍第25項之宿主細胞，其中該致病性基因為 actA或 inlB。
一種組合物，該組合物包含如申請專利範圍第22項至第26項中任一項之宿主細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種自宿主細胞表現所關注之多肽之方法，該方法包括：將包含如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之核酸分子的表現構築體引入該宿主細胞中，其中該融合蛋白可操作地連接至一或多個介導該宿主細胞中該融合蛋白之表現及視情況分泌的調控元件。
如申請專利範圍第28項之方法，其中該宿主細胞為細菌。
如申請專利範圍第29項之方法，其中該宿主細胞為單核球增多性李氏菌。
如申請專利範圍第30項之方法，其中該表現構築體整合至該單核球增多性李氏菌之基因組中。
如申請專利範圍第31項之方法，其中該表現構築體整合至該單核球增多性李氏菌之致病性基因中，且該核酸分子之整合破壞該致病性基因之表現或破壞該致病性基因之編碼序列。
如申請專利範圍第32項之方法，其中該致病性基因為單核球增多性李氏菌 actA或 inlB。
一種融合蛋白，其包含：第一胺基酸序列，該第一胺基酸序列包含強化子胺基酸序列之一或多個複本，各強化子胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列及SEQ ID NO：37或對其具有1-5個保守胺基酸取代之序列；及(ii)編碼所關注之多肽之第二胺基酸序列，該第二胺基酸序列連接至該第一胺基酸序列之胺基末端或羧基末端。
如申請專利範圍第34項之融合蛋白，其中該所關注之多肽包含腫瘤抗原。
如申請專利範圍第34項之融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解胺基酸序列係經獨立地選擇且連接至該一或多個強化子胺基酸序列中之至少一個。
如申請專利範圍第36項之融合蛋白，其中各強化子胺基酸序列在其胺基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列且在其羧基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列。
如申請專利範圍第37項之融合蛋白，其中該第一胺基酸序列包含SEQ ID NO：1之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本或SEQ ID NO：37之1個複本、2個複本、3個複本、4個複本或5個複本。
如申請專利範圍第38項之融合蛋白，其中連接至強化子胺基酸序列之各裂解胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。
如申請專利範圍第34項之融合蛋白，其中該第一胺基酸序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：33。
如申請專利範圍第34項之融合蛋白，其中該第一胺基酸序列為SEQ ID NO：35。
如申請專利範圍第34項至第41項中任一項之融合蛋白，其中該第二胺基酸序列包含一或多個獨立抗原序列。
如申請專利範圍第42項之融合蛋白，其中該第二胺基酸序列包含一或多個裂解胺基酸序列，其中各裂解胺基酸序列係經獨立地選擇且連接至該一或多個抗原序列中之至少一個。
如申請專利範圍第43項之融合蛋白，其中各獨立抗原序列在其胺基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列且在其羧基末端連接至經獨立選擇之裂解胺基酸序列。
如申請專利範圍第44項之融合蛋白，其中連接至抗原序列之各裂解胺基酸序列獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76。
如申請專利範圍第34項至第41項中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含分泌信號序列。
如申請專利範圍第46項之融合蛋白，其中該分泌信號序列之羧基末端連接至該第一胺基酸序列之胺基末端，且該第一胺基酸序列之羧基末端連接至該第二胺基酸序列之胺基末端。
如申請專利範圍第46項之融合蛋白，其中該分泌信號序列之羧基末端連接至該第二胺基酸序列之胺基末端，且該第二胺基酸序列之羧基末端連接至該第一胺基酸序列之胺基末端。
如申請專利範圍第47項之融合蛋白，其中該分泌信號序列為單核球增多性李氏菌分泌信號序列。
如申請專利範圍第49項之融合蛋白，其中該分泌信號序列為ActA或LLO分泌信號序列。
如申請專利範圍第50項之融合蛋白，其中該ActA信號序列由選自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28組成之群的序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列編碼，或該LLO信號序列由選自由SEQ ID NO：40、序列SEQ ID NO：67缺失之SEQ ID NO：40及序列SEQ ID NO：67替換為KE之SEQ ID NO：40組成之群的序列或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列編碼。
如申請專利範圍第50項之融合蛋白，其中該分泌信號序列為SEQ ID NO：28，或與其具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
一種如申請專利範圍第34項至第52項中任一項之融合蛋白之用途，其用於製備治療有需要之個體之癌症或病毒性疾病的藥劑，其中該所關注之多肽包含在該個體中存在之癌細胞或病毒感染細胞上存在之一或多個獨立抗原序列。
如申請專利範圍第53項之用途，其中該融合蛋白自包含如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之核酸分子之宿主細胞表現。
如申請專利範圍第54項之用途，其中該宿主細胞為如申請專利範圍第22項至第26項中任一項之宿主細胞。