CN113004419B

CN113004419B - 普卡那肽的制备方法

Info

Publication number: CN113004419B
Application number: CN201911309821.2A
Authority: CN
Inventors: 吴勇; 黄宗庆; 李晓婉; 赵文杰; 王强; 鲍玲娜
Original assignee: Shanghai Duomirui Biological Technology Co ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Duomirui Biological Technology Co ltd; Shanghai Pharmaceutical Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN113004419A

Abstract

本发明提供了一种式I所示融合蛋白，其中A区段是任选的融合标签、信号肽或者不存在；B区段是SUMO融合标签；C区段是普卡那肽的氨基酸序列。本发明还提供了利用所述融合蛋白以及表达所述融合蛋白的宿主细胞来制备普卡那肽的方法。不同于传统的化学合成的方法，本发明的制备普卡那肽的方法具有周期短、成本低、产量高等优点。A‑B‑C (I)。

Description

普卡那肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域；具体地说，本发明涉及一种普卡那肽的制备方法。

背景技术

普卡那肽(Plecanatide)是尿鸟苷素(Uroguanylin，UGN)的类似物，与鸟苷酸环化酶C(GC-C)受体的天然激动剂尿鸟苷素仅在N末端第三个氨基酸存在差别，将尿鸟苷素中的谷氨酸替换为天冬氨酸，普卡那肽为含有双二硫键连接的16个氨基酸的环状多肽，结构式如式I。

普卡那肽是促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶C(Guanylatecyclase-C，GC-C)受体激动药，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，可用于治疗胃肠功能疾病，如慢性特发性便秘(CIC)和便秘型肠易激综合征(IBS-C)。

中国专利CN201280021221通过固相分段合成肽段A(含6个氨基酸)和肽段B(含8个氨基酸)，液相合成肽段C(含2个氨基酸)后，在液相中将三个肽段缩合形成线性多肽，通过分步去除保护基团和分别环化形成二硫键正确配对的普卡那肽。但固相合成和固液合成方法步骤繁琐、纯化困难，总产率低。

所以急需提供一种周期短、成本低、产量高的普卡那肽制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、周期短、成本低、产量高的普卡那肽制备方法。

在第一方面，本发明提供一种普卡那肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)培养包含式I所示融合蛋白的编码基因的宿主细胞；

(b)从步骤(a)培养的宿主细胞中获得所述融合蛋白；和

(c)任选处理所述融合蛋白，从而得到普卡那肽；

A-B-C (I)

其中，A区段是任选的融合标签、信号肽或者不存在；

B区段是SUMO融合标签；

C区段是普卡那肽的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，A区段是gp55融合标签。

在优选的实施方式中，所述gp55融合标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在优选的实施方式中，所述信号肽可以选自：

信号肽1：MAKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA(SEQ ID NO:10)；

信号肽2：MAKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:11)；

信号肽3：MAKQSTIALALLPLLFTPVTKA(SEQ ID NO:12)；

信号肽4：MAKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ ID NO:13)；

信号肽5：MAFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA(SEQ ID NO:14)；

信号肽6：MAKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(SEQ ID NO:15)；

信号肽7：MAKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:16)；

信号肽8：MAKKRFAIAIAVALALFAFSGSAFA(SEQ ID NO:9)；

优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在优选的实施方式中，所述SUMO融合标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在优选的实施方式中，所述普卡那肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在具体的实施方式中，在式I所示融合蛋白中，A区段是gp55融合标签，B区段是SUMO融合标签，C区段是普卡那肽的氨基酸序列。

在具体的实施方式中，式I所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4中任一项所示；优选地，如SEQ ID NO:2所示。

在具体的实施方式中，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。

在优选的实施方式中，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

在优选的实施方式中，所述哺乳动物细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞。

在优选的实施方式中，所述酵母细胞包括：毕赤酵母、酿酒酵母。

在优选的实施方式中，所述昆虫细胞包括草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9细胞。

在具体的实施方式中，所述原核细胞是来源于细菌的宿主细胞，所述细菌是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；优选大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21(DE3)。

在具体的实施方式中，所述步骤(c)包括对获得的融合蛋白进行酸处理以去除gp55融合标签以及进行酶切处理以去除SUMO标签，从而得到普卡那肽。

在优选的实施方式中，所述酸处理是在55-65℃下，优选60℃下，利用30-40mmol/L盐酸或与其酸度相当的其它酸进行处理，底物浓度为25-35g/L，优选30g/L。

在优选的实施方式中，所述酶处理是利用泛素样特异性蛋白酶1(ULP1酶)，按照1mg底物加入100U-200U的比例加入ULP1酶。

在优选的实施方式中，步骤(c)之后，还可以包括步骤：

(d)验证所得普卡那肽的二硫键正确配对率。

在优选的实施方式中，所述方法还包括将普卡那肽进行二硫键还原并重新生成二硫键。

在另一优选的实施方式中，进行二硫键还原的二硫键还原剂选自下组：DTT、TCEP，或其组合；还原时间为0.5-2h，较佳地，1-1.5h。

在另一优选的实施方式中，所述二硫键的重新生成方法选自下组：

空气氧化法、H₂O₂氧化法、加入GSH-GSSG氧化还原对、或加入半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对，或其组合。

在另一优选的实施方式中，所述二硫键的重新生成方法为加入普卡那肽2-20倍重量的GSH-GSSG过夜复性，较佳地，3-10倍。

在第二方面，本发明提供式I所示融合蛋白：

A-B-C (I)

其中，A区段是任选的融合标签、信号肽或者不存在；

B区段是SUMO融合标签；

C区段是普卡那肽的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，A区段是gp55融合标签。

在优选的实施方式中，所述信号肽可以选自：

信号肽1：MAKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA(SEQ ID NO:10)；

信号肽2：MAKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:11)；

信号肽3：MAKQSTIALALLPLLFTPVTKA(SEQ ID NO:12)；

信号肽4：MAKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ ID NO:13)；

信号肽5：MAFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA(SEQ ID NO:14)；

信号肽6：MAKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(SEQ ID NO:15)；

信号肽7：MAKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:16)；

信号肽8：MAKKRFAIAIAVALALFAFSGSAFA(SEQ ID NO:9)；

优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在具体的实施方式中，式I所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4中任一所示；优选SEQ ID NO:2所示。

在第三方面，本发明提供第二方面所述的融合蛋白在制备普卡那肽中的应用。

在第四方面，本发明提供一种制备普卡那肽的试剂盒，所述试剂盒包含第二方面所述的融合蛋白、利用该融合蛋白制备普卡那肽的使用说明书，以及任选的利用该融合蛋白制备普卡那肽的其它必需试剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：未加入诱导剂和加入诱导剂IPTG发酵后获得的包涵体对比图，其中，1：未加入诱导剂发酵后获得的包涵体；2：加入诱导剂IPTG发酵后获得的包涵体；M：Marker。

图2：实施例4获得的gp55-sumo-SP304包涵体经过酸处理、酶反应去除融合标签的SDS-PAGE电泳图，其中，1：实施例4获得的gp55-sumo-SP304包涵体加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混悬，终浓度为20g/L，取该混悬液在1号泳道点样；2：经过酸处理条件优化如实施例5-8，采用最佳条件(包涵体浓度为20g/L，盐酸浓度为30mmol/L，酸处理温度为60℃，时间为10h)酸处理后，离心20min(转速为14000rpm)，取离心上清液在2号泳道点样；3：酸处理结束后用1mol/L NaOH调pH8.3后，离心20min(转速为14000rpm)，取离心上清液在3号泳道点样；4：酸处理结束后调pH8.3离心沉淀的重悬液；M：Marker；6：ULP1酶反应底物；7：经过ULP1酶酶切条件优化如实施例10-11，采用最佳条件(按照1mg底物加入100U的比例加入ULP1酶，32℃反应2.5h)酶切后，取该酶切液在7号泳道点样。

图3：温度对酸处理效果的影响，曲线1、2、3、4、5分别是40℃、50℃、60℃、70℃、80℃酸处理HPLC结果。

图4：包涵体浓度对酸处理效果的影响的柱形图，包涵体浓度为10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L，60℃酸处理10h，取样检测，因为底物浓度的差异，产物峰面积分别乘以60、30、20、15、12倍后使其在同一水平上比较。

图5：HCl终浓度对酸处理效果的影响，图A中曲线1，2，3，4分别是酸浓度为20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L时的酸处理HPLC结果，图B是各HCl浓度下产物峰面积的柱形图。

图6：ULP1酶量对酶切效果影响的HPLC图，曲线1，2，3，4，5分别是加入5U、20U、50U、100U、200U的ULP1酶32℃反应2.5h的结果。

图7：通过本发明方法制备的普卡那肽与普卡那肽参比制剂的HPLC对比图。其中曲线1为实施例5获得的包涵体去除融合标签后获得的普卡那肽的HPLC图，曲线2是普卡那肽参比制剂溶解后的HPLC图。

图8：通过本发明方法制备的二硫键正确配对的普卡那肽的质谱图。

图9：肠激酶反应去除SEQ ID No.5的融合标签，酶反应前后与参比制剂的HPLC对比图，其中，曲线1为加入肠激酶反应前样品及中间体的HPLC图谱，曲线2为肠激酶反应1h后的产物的HPLC图谱，曲线3为参比制剂Trulance的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种普卡那肽的制备方法。通过构建表达普卡那肽融合蛋白的基因工程菌，高密度发酵，提取融合蛋白，移除标签，纯化获得普卡那肽。不同于传统的化学合成的方法，本发明通过工程菌发酵获得普卡那肽，具有操作简单、周期短、成本低、产量高的优点。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

本发明的融合蛋白及其制备方法

本发明人发现，将普卡那肽与特定的融合标签制成融合蛋白后，可以通过培养包含该融合蛋白的编码基因的宿主细胞来获得二硫键正确配对的具有生物学活性的普卡那肽。

在具体的实施方式中，本发明的融合蛋白是如式I所示的融合蛋白：

A-B-C (I)

其中，A区段可以是任选的融合标签、信号肽或者甚至不存在；B区段是SUMO融合标签；C区段是普卡那肽的氨基酸序列。

在具体的实施方式中，A区段是gp55融合标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述SUMO融合标签的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；所述普卡那肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在优选的实施方式中，式I所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4中任一项所示；优选SEQ ID NO:2所示。

本领域技术人员熟知，哺乳动物来源，特别是人源蛋白往往需要在真核宿主细胞中表达。然而，真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞的培养往往存在产量低、成本高、操作难度大等等缺陷。因此，如果能够在原核宿主细胞中表达哺乳动物来源，特别是是人源蛋白将是非常理想的。本发明人出乎意料地发现，将普卡那肽制成本发明的融合蛋白后，该融合蛋白可以在原核细胞中良好表达，从该融合蛋白获得的表达的普卡那肽能够具备正确配对的二硫键，从而具有生物学活性。因此，本发明的融合蛋白可以在各种宿主细胞中表达，以便获得普卡那肽。例如，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。在优选的实施方式中，所述真核细胞包括哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞；酵母细胞，例如毕赤酵母、酿酒酵母；昆虫细胞，例如草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9细胞；所述原核细胞是来源于细菌的宿主细胞，所述细菌可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌；优选大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21(DE3)。

基于本发明的教导，本领域技术人员可以采用本领域已知的各种技术手段设计本发明的融合蛋白。例如，可以采用各种方式连接本发明融合蛋白中的各区段，例如如果本发明的融合蛋白中A区段是gp55融合标签，B区段是SUMO融合标签，则可以在gp55与SUMO之间设计一个酸处理位点(D↓P)。

基于本发明的教导，本领域技术人员也可以采用本领域已知的各种方式表达本发明的融合蛋白。例如，可以在宿主细胞中导入包含本发明融合蛋白的编码基因的质粒或者将该编码基因整合到宿主细胞的基因组上，并相应培养该宿主细胞。

在上述融合蛋白的基础上，本发明提供了一种普卡那肽的制备方法，所述方法包括培养包含式I所示融合蛋白的编码基因的宿主细胞；从培养的宿主细胞中获得所述融合蛋白；和任选处理所述融合蛋白，从而得到普卡那肽等步骤。

本领域技术人员知晓如何处理得到的融合蛋白，从而得到普卡那肽。例如，如果融合蛋白中包含gp55融合标签以及SUMO标签，可以对获得的融合蛋白进行酸处理以去除gp55融合标签以及进行酶切处理以去除SUMO标签，从而得到普卡那肽。

所述酸处理可以是在55-65℃下，优选60℃下，利用30-40mmol/L盐酸或与其酸度相当的其它酸进行处理，底物浓度事宜为25-35g/L，优选30g/L。

所述酶处理是利用泛素样特异性蛋白酶1(ULP1酶)；优选按照1mg底物加入100U-200U的比例加入ULP1酶。

在通过本发明的方法获得普卡那肽之后，还可以包括验证所得普卡那肽的二硫键正确配对率的步骤。

根据变性和复性的原理，本领域技术人员知晓，加入变性剂使蛋白或多肽的空间结构展开、二硫键打开，经过稀释复性，使多肽和蛋白在低浓度下重新折叠，二硫键重新形成，趋向形成一种天然的、稳定的、二硫键正确配对率提高的产物。因此，在优选的实施方式中，在得到普卡那肽之后，还可以将普卡那肽进行二硫键还原并重新生成二硫键。

在进一步优选的实施方式中，进行二硫键还原的二硫键还原剂选自下组：DTT、TCEP，或其组合；还原时间为0.5-2h，较佳地，1-1.5h。

在具体的实施方式中，所述二硫键的重新生成方法选自下组：

空气氧化法、H₂O₂氧化法、加入GSH-GSSG氧化还原对、或加入半胱氨酸-胱氨酸氧化还原对，或其组合。在另一实施方式中，所述二硫键的重新生成方法为加入普卡那肽2-20倍重量的GSH-GSSG过夜复性，较佳地，3-10倍。

然而，本发明人在对本发明方法制备得到的普卡那肽进行变性和复性(二硫键还原与重新形成)操作后，发现二硫键正确配对率并没有提高；换言之，本发明的方法可以直接得到二硫键正确配对的普卡那肽。

基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解，本发明的融合蛋白可以用来制备普卡那肽。因此，本发明的保护范围也包括直接利用本发明的融合蛋白制备普卡那肽的方法；即，制备普卡那肽的方法可以包括，也可以不包括制备融合蛋白本身的步骤。

进一步地，可以将本发明的融合蛋白制成制备普卡那肽的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的融合蛋白以及利用该融合蛋白制备普卡那肽的使用说明书。该试剂盒还可包含利用该融合蛋白制备普卡那肽的其它必需试剂，例如对融合蛋白进行上述酸处理以及酶切处理所必需的试剂。这些试剂是本领域技术人员熟知并且可以根据具体的融合蛋白可以自主选择的。

本发明的融合蛋白在大肠杆菌中的表达形式

大肠杆菌被内膜和外膜隔成3个腔：胞内、周质和胞外，表达的蛋白定位于这三个腔内。大肠杆菌的表达形式根据表达产物的定位一般分为两类：胞内表达和蛋白分泌表达。胞内表达是最主要的表达形式，表达产物以可溶性蛋白和/或不溶性的包涵体形式存在于大肠杆菌体内。

蛋白分泌型表达根据表达场所的不同分为周质分泌表达和胞外分泌表达。周质分泌表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白的信号肽序列的下游而实现，当蛋白分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与细胞外膜之间的周质时，信号肽可被信号肽酶所切割，而获得具有天然一级结构的产物。

在本发明中，宿主细胞所表达的普卡那肽融合蛋白可以是包涵体形式，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；胞内可溶形式，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；周质可溶形式，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；但出于收率等方面的考虑，优选包涵体形式。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次采用大肠杆菌重组表达的方法获得了含有正确二硫键的普卡那肽；

2.相比于现有技术中采用的化学合成方法，本发明方法的有机溶剂使用量少，成本更低；

3.本发明方法的工艺简单，发酵周期短；

4.本发明方法得到的普卡那肽及其融合蛋白产量高。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

缩写

SOB(Super Optimal Broth，优化肉汤培养基)

Kan(Kanamycin，卡那霉素)

LB(Luria-Bertani，肉汤培养基)

PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲液)

Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷)

IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)

SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯凝胶电泳)

ULP1(Ubiquitin-like-specific protease 1，泛素样特异性蛋白酶1)

SUMO(small ubiquitin-related modifier，小分子泛素样修饰物)

检测方法

蛋白质电泳分析

蛋白质在电场中移动的速度，是和它本身所带的电量、电场的强度和运动中所受到的阻力有关。因此，在同一条件下各种蛋白质的移动速度不同。例如人血淸中各种蛋白质等电点不同，在同一pH溶液中移动速度不同，故电泳时能在电泳支持物(如滤纸或琼脂等)上区分出各个蛋白质。经染色后，得到鲜明的色带图谱。

高效液相色谱(HPLC)

色谱柱：Fortis C18，150×4.6mm，3um；

柱温：45℃；

检测波长：215nm；

流速：1.0ml/min；

流动相：A)0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)；

B)0.1％三氟乙酸/乙腈溶液(v/v)；

梯度洗脱方法如下：

实施例1.构建重组表达普卡那肽的基因工程大肠杆菌

1)DNA序列设计

按照大肠杆菌BL21(DE3)的偏好密码子，把普卡那肽(SP304)的氨基酸序列翻译成DNA序列，命名为SP304，并与gp55DA蛋白以及SUMO蛋白融合表达。其中gp55DA与SUMO之间含有一个酸处理位点(D↓P)，由此构成目的基因序列gpSMSP304，并在序列的5’和3’两端分别添加限制性酶切位点为NcoⅠ(C↓CATGG)和BamHⅠ(G↓GATCC)，序列共有695bp。目的基因由上海捷瑞生物合成之后，转入到载体pET28a中，命名为pET28a-gpSMSP304。

所述普卡那肽融合蛋白的核酸序列如下：

CCATGGCAGAGACCAAACCGAAATATAACTACGTTAACAACAAAGAACTGCTCCAGGCGATCATCGACTGGAAAACCGAACTGGCAAACAACAAAGCGCCGAACAAAGTTGTTCGTCAGAACGATACCATTGGTCTGGCCATCATGCTGATCGCAGAAGGCCTGAGCAAACGTTTCAACTTCAGCGGTTACACCCAGAGCTGGAAACAGGAAATGATTGCAGATGGTATCGAAGCGAGCATCAAAGGTCTGCACAACTTCGATGAGACCAAATACAAAAACCCGCATGCATATATCACCCAGGCTTGTTTCAACGCATTTGTTCAGCGTGGTTCCATTGATCCGCCGTCGGACTCTGAAGTGAACCAGGAAGCTAAGCCGGAAGTCAAGCCAGAAGTGAAGCCGGAAACCCATATCAACCTGAAAGTGTCGGATGGTTCTTCTGAGATCTTCTTCAAGATCAAGAAGACCACGCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCGTTCGCTAAACGTCAGGGTAAGGAAATGGACTCTCTGCGTTTCCTGTACGATGGTATTCGTATTCAGGCTGATCAGACCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGATAACGATATCATCGAGGCTCATCGTGAACAGATTGGTGGTAACGATGAATGCGAACTGTGTGTTAACGTTGCATGTACCGGTTGCCTGTAAGGATCC(SEQ ID NO:1)

普卡那肽融合蛋白的氨基酸序列如下：

MAETKPKYNYVNNKELLQAIIDWKTELANNKAPNKVVRQNDTIGLAIMLIAEGLSKRFNFSGYTQSWKQEMIADGIEASIKGLHNFDETKYKNPHAYITQACFNAFVQRGSIDPPSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGNDECELCVNVACTGCL(SEQ ID NO:2)

SEQ ID NO:2为包涵体形式表达的融合蛋白，其中含有gp55融合标签，ULP1酶特异性识别的SUMO融合标签和普卡那肽氨基酸序列；

其中，gp55融合标签的氨基酸序列为：MAETKPKYNYVNNKELLQAIIDWKTELANNKAPNKVVRQNDTIGLAIMLIAEGLSKRFNFSGYTQSWKQEMIADGIEASIKGLHNFDETKYKNPHAYITQACFNAFVQRGSIDPP(SEQ ID NO:6)；

SUMO融合标签的氨基酸序列为：SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ ID NO:7)；

普卡那肽的氨基酸序列为NDECELCVNVACTGCL(SEQ ID NO:8)

2)质粒抽提

把含有质粒pET28a-gpSMSP304的大肠杆菌接种至含有抗生素Kan的10ml液体LB培养基中，37℃，220r/min振荡培养16h。

(1)用4个2ml离心管，12000r/min离心1min，收集全部的菌体；

(2)加入100μl的溶液I，悬浮菌体；加入300μl的溶液Ⅱ，混匀；加入300μl的溶液Ⅲ，混匀，-20℃放置20min，12000r/min离心10min，分别取上清到1.5ml离心管；

(3)加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置时间20min，12000r/min离心10min，取沉淀；

(4)加入1ml的75％乙醇，洗涤沉淀，弃上清；沉淀在37℃烘干后，每管加入50μl去离子水，溶解沉淀。然后把溶解后的各管溶液收集成一管，即为质粒pET28a-gpSMSP304，-20℃保存备用。

3)转化感受态细胞

吸取2μL质粒pET28a-gpSMSP304与感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)混匀后，将其转入预冷的1mm电转杯，电击，然后迅速加入100μL SOB培养液混匀后，将菌液吸入无菌的1.5mL离心管中，37℃振荡培养复苏60min。最后吸取菌液平铺在含有25μg/mL Kan的固体LB培养基平皿上，37℃恒温培养16～20h。

4)工程菌的筛选及培养

挑取重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-gpSMSP304的单菌落，接种在10mL含25μg/mL Kan的液体LB培养基中，37℃，220r/min振荡培养5h。然后以3％(每100ml SM504发酵培养基中加入3ml上述培养物)接种量转接在30mL含25μg/mL Kan的液体SM504培养基中，37℃，220r/min振荡培养3h，向培养物中加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，37℃，220r/min振荡培养16～20h。

用1个2mL离心管收集4mL菌液，于12,000r/min，离心1min，取菌体，用1mL PBS缓冲液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,pH7.4)重悬洗涤一遍，12,000r/min，离心1min，弃上清后，加入1mL PBS缓冲液重悬，在冰上预冷后，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(超声功率400W，工作时间5s，间隔时间10s，工作次数7次)，然后12,000r/min，离心10min。离心后的样品中，沉淀物即为包含有目的蛋白的包涵体。

实施例2.发酵菌种的准备

1)一级种子液制备：

取-20℃保藏的表达普卡那肽融合蛋白的重组大肠杆菌，接种于LB液体培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃，摇床培养6h。

2)二级种子液制备：

一级种子液镜检未染菌后，取一级种子液接种于LB液体培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃，摇床培养12h。

实施例3.发酵培养基和补料培养基的配制

发酵培养基成分：0.5-5g/L葡萄糖，10-25g/L甘油，1.0-5.0g/L柠檬酸铵，5.0-15g/L酵母粗提物，5.0-10g/L硫酸铵，5.0-15g/L氯化钠，5-10g/L磷酸氢二钠，2.0-6.0g/L磷酸二氢钾，0.1-1.0g/L硫酸镁，0-0.03g/L氯化钙，加适量水溶解后，添加3ml微量元素母液。

微量元素母液成分包括：10g/L七水硫酸亚铁，0.5g/L无水合硫酸锰，2.25g/L七水硫酸锌，1.0g/L五水合硫酸钠，0.2g/L硼酸，0.1g/L钼酸铵，5ml/L的6mol/L HCl，用NaOH调节pH为6.5-7.0，定容至3L。

按5‰(w/w)加入消泡剂后，121℃灭菌30min。

补料培养基成分：75％甘油(w/v)和2％MgSO₄(w/v)，或75％葡萄糖，2％MgSO₄(w/v)。

实施例4.发酵过程调控和破胞处理

二级种子镜检未染菌后，按照1％-3％的接种量(每100ml发酵培养基中加入1-3ml二级种子液)接种于3L发酵培养基中。初始发酵参数设定如下：温度：37℃，pH值：6.95，转速：300r/min，通气量：3L/min，罐压：0.1-0.12MPa。通过调节转速、通气量和罐压控制溶氧大于30％。发酵约7h时，溶氧和pH值明显上升开始补料，发酵约12h时，OD₆₀₀为60-120时加入终浓度为0.1-0.3mmol/L IPTG开始诱导。诱导6-18h时结束发酵，得到大量表达普卡那肽融合蛋白的大肠杆菌菌液。

将发酵得到的大肠杆菌菌液离心20min(转速为7000r/min)，离心产生的沉淀混悬于50mM Tris-HCl(pH8.0)，于4℃在匀浆机上750bar-1250bar高压匀浆破胞处理3次。将获得的破胞液离心20min(转速为7000r/min)，离心产生的沉淀混悬于50mM Tris-HCl(pH8.0)，用于清洗破胞产生的包涵体。重复清洗3次后离心，沉淀即为实施例5-8所述包涵体。

实施例5.包涵体酸处理温度

将包涵体混悬于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)或PBS缓冲液中，浓度为20g/L(w/v)，加入终浓度为30mmol/L的HCl，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃加热酸处理至产物不再增加为止。

结果如图3所示，曲线1、2、3、4、5分别是40℃、50℃、60℃、70℃、80℃酸处理HPLC结果。40℃和50℃酸处理，底物反应不完全，70℃和80℃酸处理容易发生过切现象，在60℃酸处理底物可以完全反应且没有过切，故酸处理温度确定为60℃。

实施例6.包涵体酸处理底物浓度

将包涵体混悬于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)或PBS缓冲液中，浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L(w/v)，加入终浓度为30mmol/L的HCl，60℃加热酸处理至产物不再增加为止。取样HPLC检测，因为底物浓度不同，故将峰面积分别乘以60、30、20、15、12倍后使其在同一水平比较，结果如图4，底物浓度为30g/L时酸处理产物量最多，效果最好。

实施例7.包涵体酸处理的酸浓度

将包涵体混悬于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)或PBS缓冲液中，浓度为20g/L(w/v)，加入终浓度为20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L的HCl，60℃加热酸处理至产物不再增加为止。

结果如图5所示，图A中曲线1、2、3、4分别是酸浓度为20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L时的酸处理结果，20-50mmol/L酸处理都没有产生过切现象，目的峰的峰面积如图5-B，HCl浓度为30-40mmol/L时酸处理，产量最多，效果最好。

实施例8.包涵体酸处理终止

将包涵体混悬于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)或PBS缓冲液中，浓度为20g/L(w/v)，加入终浓度为30mmol/L的HCl，60℃加热酸处理至产物不再增加为止。酸处理结束后，将反应液降低至室温，用1mol/L氢氧化钠调节pH至8.30，等电点沉淀gp55融合标签，离心20min(转速为14000rpm)，上清液即含有酸处理后的目的蛋白。将酸处理结束时的样品(未调pH)，调节pH为8.30后离心上清液和离心沉淀分别点样，SDS-PAGE电泳验证。结果如图2的泳道2、3、4，发现调pH后的离心上清主要含有目的产物sumo-SP304，去除了大部分的gp55标签。

实施例9.酶反应中泛素样特异性蛋白酶1(ULP1酶)的浓度

取酸处理后离心上清，按照1mg底物分别加入5U、20U、50U、100U、200U的比例加入ULP1酶，32℃水浴加热，反应至产物不再增加为止。用10％TFA调节pH为2.1终止反应。

结果如图6，曲线1，2，3，4，5分别是加入5U、20U、50U、100U、200U反应2.5h的结果，发现酶量为5U、20U、50U底物反应不完全，酶量100-200U时底物可以完全反应，且不会过切。

实施例10.ULP1酶反应

取酸处理后的样品，按照1mg底物加入100U的比例加入ULP1酶，在32℃，水浴反应至产物不再增加为止。用10％TFA调节pH为2.1终止反应。底物样品和加入100U酶32℃酶反应2.5h的样品SDS-PAGE电泳验证，结果如图2的6、7号泳道，发现底物sumo-SP304基本完全消耗，产生了SUMO融合标签.

实施例11.普卡那肽的纯化

1)超滤

去除融合标签后的普卡那肽溶液经过0.22um水膜过滤后，用孔径为3kD或6kD，材质为聚偏氟乙烯的超滤膜超滤拦截分子量较大的杂质，透出分子量较小的普卡那肽。超滤快结束时加入缓冲液顶洗至不再透出普卡那肽为止。

2)反向浓缩

色谱柱：SF-PRP512B填料自装柱；

柱体积：15ml；

检测波长：215nm，280nm；

流速：10ml/min；

收集体积：10ml/管；

流动相：A)0.1％三氟乙酸/水溶液(v/v)；

B)0.1％三氟乙酸/50％乙醇(v/v)水溶液；

梯度洗脱方法如下：

CV	A％	B％
			5	100	0
5	50	50
			20	0	100
5	0	100

取浓度较高的几管合并后旋蒸去除乙醇，HPLC检测。

结果如图7所示。本发明方法制备的包涵体gp55-sumo-SP304，通过去除融合标签后获得了不同二硫键配对形式的普卡那肽(曲线1)，与参比制剂(曲线2)进行HPLC图谱对比，发现保留时间为9.30处的色谱峰与参比制剂基本重合，经过质谱确认(如图8，m/z(M+H)²⁺＝841.76，m/z(M+H)³⁺＝561.73)，推算该峰分子量为1681.92与参比制剂的理论分子量一致，因此本发明通过重组表达的方法成功制备出了二硫键正确配对的普卡那肽。经过质谱验证保留时间为8.49，9.78和10.20处的峰分子量也与参比制剂分子量一致，但由于保留时间不同，推测分别为不同二硫键配对形式的普卡那肽以及构象异构体。通过去除融合标签，超滤和反相浓缩等步骤后，每升发酵液可获得1237.25mg普卡那肽的二硫键异构体混合物，其中含有148.47mg二硫键正确配对的普卡那肽，与化学合成的方法相比产量高，成本低且有机试剂使用更少。

实施例12.制备胞内可溶形式以及周质可溶形式的融合蛋白

本发明人重复了实施例1-11，其区别在于所述融合蛋白为胞内可溶形式的融合蛋白以及周质可溶形式的融合蛋白。

胞内可溶形式表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其含有SUMO融合标签和普卡那肽氨基酸序列

SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGNDECELCVNVACTGCL(SEQ ID NO:3)。

周质可溶形式表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其含有信号肽序列、SUMO融合标签和普卡那肽氨基酸序列。

MAKKRFAIAIAVALALFAFSGSAFASDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGNDECELCVNVACTGCL(SEQ IDNO:4)；其中信号肽序列为MAKKRFAIAIAVALALFAFSGSAFA(SEQ ID NO:9)。

本发明人发现，采用胞内可溶形式的融合蛋白以及周质可溶形式的融合蛋白均能够获得二硫键正确配对的普卡那肽。

对比例1

1)本发明人重复了实施例1-11的方法，获得了以包涵体形式表达的普卡那肽融合蛋白，其氨基酸序列为下述SEQ ID NO:5。

MAETKPKYNYVNNKELLQAIIDWKTELANNKAPNKVVRQNDTIGLAIMLIAEGLSKRFNFSGYTQSWKQEMIADGIEASIKGLHNFDETKYKNPHAYITQACFNAFVQRGSIDPPSAGDDDDKNDECELCVNVACTGCL(SEQID NO:5)

SEQ ID NO:5序列中含有gp55融合标签，肠激酶特异性识别序列DDDDK和普卡那肽氨基酸序列，但不含有ULP1酶识别的SUMO融合标签。

2)酸处理去除gp55融合标签

将包涵体混悬于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)或PBS缓冲液中，浓度为20g/L(w/v)，加入终浓度为30mmol/L的HCl，于60℃加热酸处理至产物不再增加为止，用1mol/L NaOH调pH为8.3，离心20min(转速为14000rpm)，上清液即含有酸处理后产生的中间体，沉淀中含有大部分未被切除的包涵体和切除的gp55融合标签。

3)肠激酶反应去除中间体的融合标签

各取250ul酸处理结束调pH8.3的离心上清，分别加入0ul、5ul、10ul、20ul、40ul肠激酶，加入100ul缓冲母液后用水补齐至500ul，酶反应至产物不再增加。每隔0.5h取样，终止反应后用RP-HPLC立即检测。经过肠激酶酶切中间体，并没有产生目的产物普卡那肽。

酶反应的结果如图9所示，其中曲线1为加入0ul肠激酶反应的对照组的HPLC图，曲线2为加入20ul的肠激酶反应的实验组的HPLC图，曲线3为参比制剂的HPLC图。通过三个样品HPLC图的对比，发现在底物中加入肠激酶后并没有反应产生目的产物普卡那肽。说明含有肠激酶特异性识别序列的SEQ ID NO:5，不能通过肠激酶反应获得普卡那肽，而含有SUMO融合标签的SEQ ID NO:1可以通过ULP1酶反应获得普卡那肽。因此，SUMO融合表达普卡那肽具有独特优势。

讨论：

重组大肠杆菌在不同培养条件下，对外源基因的表达量存在差别，外源基因的构建对表达的融合蛋白的处理纯化等方面也存在很大不同，本发明构建了具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的质粒，并将了含有所述质粒的重组大肠杆菌作为表达普卡那肽融合蛋白的工程菌，通过高密度发酵，提取融合蛋白，移除标签，纯化获得普卡那肽。

不同于传统的化学合成的方法，本发明通过大肠杆菌发酵获得普卡那肽，具有操作更简便，发酵周期短、成本低、产量高的优点。

本发明涉及的序列：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海多米瑞生物技术有限公司

上海医药工业研究院

<120> 普卡那肽的制备方法

<130> P2019-2035

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 695

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccatggcaga gaccaaaccg aaatataact acgttaacaa caaagaactg ctccaggcga 60

tcatcgactg gaaaaccgaa ctggcaaaca acaaagcgcc gaacaaagtt gttcgtcaga 120

acgataccat tggtctggcc atcatgctga tcgcagaagg cctgagcaaa cgtttcaact 180

tcagcggtta cacccagagc tggaaacagg aaatgattgc agatggtatc gaagcgagca 240

tcaaaggtct gcacaacttc gatgagacca aatacaaaaa cccgcatgca tatatcaccc 300

aggcttgttt caacgcattt gttcagcgtg gttccattga tccgccgtcg gactctgaag 360

tgaaccagga agctaagccg gaagtcaagc cagaagtgaa gccggaaacc catatcaacc 420

tgaaagtgtc ggatggttct tctgagatct tcttcaagat caagaagacc acgccgctgc 480

gtcgtctgat ggaagcgttc gctaaacgtc agggtaagga aatggactct ctgcgtttcc 540

tgtacgatgg tattcgtatt caggctgatc agaccccgga agatctggac atggaggata 600

acgatatcat cgaggctcat cgtgaacaga ttggtggtaa cgatgaatgc gaactgtgtg 660

ttaacgttgc atgtaccggt tgcctgtaag gatcc 695

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Met Ala Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Ala

20 25 30

Pro Asn Lys Val Val Arg Gln Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met

35 40 45

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr

50 55 60

Gln Ser Trp Lys Gln Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile

65 70 75 80

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala

85 90 95

Tyr Ile Thr Gln Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gln Arg Gly Ser Ile

100 105 110

Asp Pro Pro Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val

115 120 125

Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp

130 135 140

Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg

145 150 155 160

Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser

165 170 175

Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro

180 185 190

Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu

195 200 205

Gln Ile Gly Gly Asn Asp Glu Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys

210 215 220

Thr Gly Cys Leu

225

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser

20 25 30

Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met

35 40 45

Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe

50 55 60

Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu

65 70 75 80

Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly

85 90 95

Gly Asn Asp Glu Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys

100 105 110

Leu

<210> 4

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Met Ala Lys Lys Arg Phe Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Phe Ala Phe Ser Gly Ser Ala Phe Ala Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

20 25 30

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

35 40 45

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

50 55 60

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

65 70 75 80

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

85 90 95

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

100 105 110

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asn Asp Glu Cys Glu Leu

115 120 125

Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

130 135

<210> 5

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Met Ala Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Ala

20 25 30

Pro Asn Lys Val Val Arg Gln Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met

35 40 45

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr

50 55 60

Gln Ser Trp Lys Gln Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile

65 70 75 80

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala

85 90 95

Tyr Ile Thr Gln Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gln Arg Gly Ser Ile

100 105 110

Asp Pro Pro Ser Ala Gly Asp Asp Asp Asp Lys Asn Asp Glu Cys Glu

115 120 125

Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

130 135

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Met Ala Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Gln Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Ala

20 25 30

Pro Asn Lys Val Val Arg Gln Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met

35 40 45

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr

50 55 60

Gln Ser Trp Lys Gln Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile

65 70 75 80

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala

85 90 95

Tyr Ile Thr Gln Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gln Arg Gly Ser Ile

100 105 110

Asp Pro Pro

115

<210> 7

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu

1 5 10 15

Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser

20 25 30

Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met

35 40 45

Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe

50 55 60

Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu

65 70 75 80

Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly

85 90 95

Gly

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Asn Asp Glu Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Met Ala Lys Lys Arg Phe Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Phe Ala Phe Ser Gly Ser Ala Phe Ala

20 25

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Met Ala Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe

1 5 10 15

Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala

20

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Met Ala Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe

1 5 10 15

Ala Thr Val Ala Gln Ala

20

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Met Ala Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Pro Val Thr Lys Ala

20

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

Met Ala Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Met Ala Phe Lys Phe Lys Lys Lys Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala

1 5 10 15

Phe Met Ser Ile Ser Met Phe Ser Ala Thr Ala Ser Ala

20 25

<210> 15

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

Met Ala Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu

1 5 10 15

Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala

20 25

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

Met Ala Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Ser Ala Ser Ala

20

Claims

1.一种普卡那肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 培养包含融合蛋白的编码基因的宿主细胞，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示；

(b) 从步骤(a)培养的宿主细胞中获得所述融合蛋白。

2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(c) 处理所述融合蛋白，从而得到普卡那肽。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)包括对获得的融合蛋白进行酸处理以去除gp55融合标签以及进行酶切处理以去除SUMO标签，从而得到普卡那肽。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)之后，还包括步骤：

(d) 验证所得普卡那肽的二硫键正确配对率。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将普卡那肽进行二硫键还原并重新生成二硫键。

8. 一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

9.权利要求8所述的融合蛋白在制备普卡那肽中的应用。

10.一种制备普卡那肽的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求8所述的融合蛋白、利用该融合蛋白制备普卡那肽的使用说明书。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含利用该融合蛋白制备普卡那肽的其它必需试剂。